專利名稱：檢測核酸的系統(tǒng)和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請一般涉及檢測生物分子的方法和系統(tǒng)，特別是涉及檢測樣品中核酸的方法 和系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
核酸的擴(kuò)增可以與多種測定聯(lián)合進(jìn)行。此類測定可以是定性的，例如當(dāng)用于評估 生物樣品時(shí)。然而，通過檢測靶核酸的擴(kuò)增，可改善多種生物學(xué)應(yīng)用，而無需麻煩的印跡技 術(shù)或光學(xué)方法通常所需的昂貴且易損壞的設(shè)備因此，仍然需要改進(jìn)檢測樣品中核酸的方法。發(fā)明概述根據(jù)第一實(shí)施方案，提供了檢測樣品中靶核酸的方法，其包括通過將樣品加熱至第一溫度，解鏈樣品，其中樣品包含與靶核酸的至少一部分雜交的引物；包含第一和第二區(qū)域的雜交探針，其中第一區(qū)域與靶核酸的至少一部分雜交，且 第二區(qū)域不與靶核酸雜交，且其中第二區(qū)域包含可檢測的標(biāo)記；和聚合酶和具有核酸外切酶活性的酶，其中聚合酶在雜交的探針的方向上延伸雜交 的引物，且酶的核酸外切酶活性切割雜交的探針，由此釋放包含探針的第二區(qū)域和可檢測 標(biāo)記的探針片段；和其中，第一溫度高于引物和存在于樣品中的雙鏈核酸的Tm ；隨后，通過將溫度降至低于第一溫度的第二溫度，將樣品退火，以便使引物和雜交 探針與樣品中靶核酸的單鏈部分各自雜交；和隨后，通過使聚合酶在第三溫度下延伸與靶核酸雜交的引物，延長引物；使酶的核酸外切酶活性切割雜交探針，由此釋放探針片段；任選地重復(fù)解鏈、退火和延長至少一次；將樣品與固相支持體的表面接觸，其中固相支持體的表面包含一個(gè)或多個(gè)與探針 片段第二區(qū)域的至少一部分雜交的捕獲探針；使捕獲探針在第四溫度下與存在于樣品中的探針片段的至少一部分雜交，其中第 四溫度低于第二和第三溫度；以及檢測固相支持體表面上的標(biāo)記；其中雜交探針的至少一部分與雜交探針的另一部分雜交，由此形成折疊結(jié)構(gòu)，且 其中，所述折疊結(jié)構(gòu)的解鏈溫度(Tm)低于第三溫度但高于第四溫度。根據(jù)第二實(shí)施方案，提供了檢測樣品中靶核酸的試劑盒，其包含
雜交探針，其包含與靶核酸的至少一部分雜交的第一區(qū)域和包含可檢測標(biāo)記的第 二區(qū)域，其中第二區(qū)域不與靶核酸雜交，且其中，當(dāng)與靶核酸雜交時(shí)，核酸外切酶能夠切割 雜交探針，由此產(chǎn)生包含第二區(qū)域和可檢測標(biāo)記的探針片段；固相支持體，其包含位于其表面上的捕獲探針，其中所述捕獲探針與探針片段的 第二區(qū)域雜交；任選地，引物，其與靶核酸的至少一部分雜交；以及任選地，聚合酶和具有核酸外切酶活性的酶，其中聚合酶在雜交的探針方向上延 伸雜交的引物，且酶的核酸外切酶活性切割雜交的探針，由此釋放包含探針的第二區(qū)域和 可檢測標(biāo)記的探針片段；其中，所述雜交探針的至少一部分與該雜交探針的另一部分雜交，由此形成折疊 結(jié)構(gòu)，且其中折疊結(jié)構(gòu)的解鏈溫度(Tm)低于完整的雜交探針與靶核酸雜交時(shí)所形成的雙鏈 體的解鏈溫度，且高于探針片段與捕獲探針雜交時(shí)所形成的雙鏈體的解鏈溫度。附圖簡要說明本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解下文所述的附圖僅僅是出于示例的目的。所述附圖并非 是用來以任何方式限制本文教義的范圍。圖IA是設(shè)計(jì)使用能形成折疊結(jié)構(gòu)的雜交探針的測定的組成和步驟的示意圖，其 中可將雜交探針可與靶序列雜交，雜交的探針的一部分經(jīng)切割形成標(biāo)記的探針片段，且其 中可在表面(如利用電極表面)上捕獲和檢測標(biāo)記的探針片段。圖IB是顯示預(yù)測的Tm為61. 7°C的雜交探針的預(yù)測的折疊結(jié)構(gòu)的圖解。圖2是顯示電化學(xué)信號的柱狀圖，所述信號是由具有圖IB所示的核苷酸序列的雜 交探針在不同的時(shí)間和溫度下經(jīng)40個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR) 循環(huán)后產(chǎn)生的。圖3A是顯示預(yù)測的Tm為43. 9°C的雜交探針的預(yù)測的折疊結(jié)構(gòu)的圖解。圖3B是顯示電化學(xué)信號的柱狀圖，所述信號是由具有圖3A所示的核苷酸序列的 雜交探針產(chǎn)生的。圖4是顯示預(yù)測的、為34. 2°C的雜交探針的預(yù)測的折疊結(jié)構(gòu)的圖解，其中該雜交 探針與圖3A所示的探針的差異在于從圖3A所示的探針中移除了 6個(gè)3’核苷酸。圖5A是顯示由具有圖3A所示的核苷酸序列的雜交探針產(chǎn)生的電化學(xué)信號的柱狀 圖。圖5B是顯示由具有圖4所示的核苷酸序列的雜交探針產(chǎn)生的電化學(xué)信號的柱狀 圖。圖6A是顯示預(yù)測的Tm為53. 1°C的雜交探針的預(yù)測的折疊結(jié)構(gòu)的圖解，其中該探 針與圖3A所示的探針的預(yù)測的3’端6個(gè)堿基雙鏈區(qū)域相比，具有預(yù)測的3’端9個(gè)堿基的 雙鏈區(qū)域。圖6B是顯示由具有圖3A所示的核苷酸序列的雜交探針產(chǎn)生的電化學(xué)信號的柱狀 圖。圖6C是顯示由具有圖6A所述的核苷酸序列的雜交探針產(chǎn)生的電化學(xué)信號的柱狀 圖。圖7A是顯示由具有下述核苷酸序列的雜交探針產(chǎn)生的電化學(xué)信號的柱狀圖
GTTACTTCGTTCGATTG TC ▼ TGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGT (SEQ ID NO. 5)其中該探針具有與靶核酸的靶序列不互補(bǔ)的19mer (鏈節(jié))核苷酸序列。圖7B是顯示由具有下述的核苷酸序列的雜交探針產(chǎn)生的電化學(xué)信號的柱狀圖CTTCGTTCGATTG TC ▼ TGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGT(SEQ ID NO. 6)其中該探針具有與靶核酸的靶序列不互補(bǔ)的15mer核苷酸序列。圖7C是顯示由具有下述的核苷酸序列的雜交探針產(chǎn)生的電化學(xué)信號的柱狀圖TCGTTCGATTG TC ▼ TGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGT(SEQ ID NO. 7)其中該探針具有與靶核酸的靶序列不互補(bǔ)的13mer核苷酸序列。圖8A是顯示用于禽流感的雜交探針的預(yù)測折疊結(jié)構(gòu)的圖解，所述探針具有 44.0°C的預(yù)測的Tm。圖8B是顯示由具有圖8A所示的核苷酸序列的禽流感DNA雜交探針產(chǎn)生的PCR后 電化學(xué)信號的柱狀圖。圖9A是顯示用于禽流感的第二雜交探針的預(yù)測折疊結(jié)構(gòu)的圖解，所述探針具有 45.3°C的預(yù)測的Tm。圖9B是顯示由具有圖9A所示的核苷酸序列的第二禽流感DNA雜交探針產(chǎn)生的 PCR后電化學(xué)信號的柱狀圖。

圖10是顯示雜交探針的示意圖，其中折疊結(jié)構(gòu)是分子內(nèi)三鏈體。圖IlA和IlB是顯示堿基配對結(jié)構(gòu)的圖解，所述堿基配對當(dāng)具有質(zhì)子化的胞嘧啶 (C+)核堿基的三鏈體形成時(shí)(圖11A)以及當(dāng)用假異胞嘧啶核堿基(pseudoisocytosine nucleobase，也稱為J或J堿基)取代質(zhì)子化的胞嘧啶核堿基時(shí)(圖11B)發(fā)生。圖12是密封的電化學(xué)室的示意圖，其可用于測量溫度的升高。各種實(shí)施方案的描述出于解釋本說明書的目的，使用下列定義，且只要適當(dāng)，以單數(shù)使用的術(shù)語也包括 復(fù)數(shù)，反之亦然。當(dāng)下文闡述的任何定義與該詞語在任何其他文獻(xiàn)包括以參考方式并入本 文的任何文獻(xiàn)中的用法矛盾時(shí)，出于理解本說明書和其相關(guān)的權(quán)利要求的目的，以下文闡 述的定義為準(zhǔn)，除非明確規(guī)定了相反的含意(例如為了理解最初使用術(shù)語的文獻(xiàn))。除非另 有說明或者使用“和/或”明顯不合適，本文中“或”意指“和/或”。除非另有說明或者使用 “一個(gè)或多個(gè)”明顯不合適，本文中“a”意指一個(gè)或多個(gè)(one or more)?！鞍?comprise) ”、 “包含(comprises) ”、“包含(comprising) ”、“包括(include) ”、“包括(includes) ”以及“包 括(including)”可交換使用，且并非意圖限制。此外，如果一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的描述使 用了術(shù)語“包含(comprising) ”，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，在一些特定的情況下，可選擇
使用術(shù)語“基本上由......組成”和/或“由......組成”來描述所述一個(gè)實(shí)施方案或多
個(gè)實(shí)施方案。如本文所用的，“捕獲探針”指表面結(jié)合的(surface bound)核堿基多聚體。捕獲 探針可以是核酸(如DNA或RNA)、核酸類似物(如鎖核酸(locked nucleic acid, LNA))、 核酸模擬物(如肽核酸(peptide nucleic acid, PAN))或嵌合體。
7
如本文所用的，“嵌合體”指包含兩個(gè)或多個(gè)連接的亞單位的核堿基多聚體，所述 亞單位選自不同類別的亞單位。例如，PNA/DNA嵌合體可包含連接于至少一個(gè)2’ -脫氧核 糖核酸亞單位的至少一個(gè)PNA亞單位(對于有關(guān)PAN/DNA嵌合體制備的示例性方法和組合 物，參閱W096/40709)。嵌合體示例性的組成亞單位選自PNA亞單位、天然存在的氨基酸亞 單位、DNA亞單位、RNA亞單位、LNA亞單位和其他核酸類似物或模擬物的亞單位。如本文所用的，“翼(flap) ”指經(jīng)設(shè)計(jì)可測定靶核酸的雜交探針中與該靶核酸不互 補(bǔ)的一部分。如本文所用的，“雜交探針”是核堿基多聚體，其可在該探針與互補(bǔ)鏈雜交的位點(diǎn) 受到酶的核酸外切酶活性的切割，所述雜交探針包含與樣品中所關(guān)注的靶核酸的至少一部 分互補(bǔ)的核堿基序列。只要雜交探針通過核酸外切酶活性是可切割的，它可以是寡核苷酸、 寡核苷酸類似物或嵌合體。在某些實(shí)施方案中，核堿基多聚體可以是包含除了一個(gè)LNA亞 單位以外的所有DNA亞單位的嵌合體。在某些實(shí)施方案中，核堿基多聚體含有位于距離經(jīng) 設(shè)計(jì)與靶核酸雜交的雜交探針的那部分的5’端(向3’端)一個(gè)亞單位處的單個(gè)LNA亞單 位。如本文所用的，“核堿基多聚體”指包含一系列包含亞單位的連接的核堿基。適宜 多聚體的非限制性實(shí)例包括寡脫氧核苷酸、寡核糖核苷酸、肽核酸、核酸類似物、核酸模擬 物和嵌合體。如本文所用的，“肽核酸”或“PAN”指包含兩個(gè)或多個(gè)PAN亞單位的任何聚核堿 基鏈(polynucleobase)或聚堿基鏈的區(qū)段，包括但不限于在下列美國專利中稱為肽核酸 或作為肽核酸而請求保護(hù)的任何聚核堿基鏈或聚核堿基鏈的區(qū)段5，539，082,5, 527，675、 5，623，049、5，714，331、5，718，262、5，736，336、5，773，571、5，766，855、5，786，461、 5，837，459,5, 891，625,5, 972，610,5, 986，053,6, 107，470 和 6，357，163。為 了避免任何疑 義，PNA是核酸模擬物，而不是核酸或核酸類似物。因?yàn)镻NA不是由核苷酸形成的，所以它 不是核酸。為了避免疑義，PNA寡聚體可以包括包含一個(gè)或多個(gè)連接于骨架的氨基酸側(cè)鏈 的多聚體。如本文所用的，“支持體”或“固相支持體”或“固相載體”指任何固相材料。固相支 持體包含諸如“樹脂”、“合成支持體”、“固相”、“表面”、“膜”和/或“支持體”的術(shù)語。固相支 持體可由有機(jī)多聚體如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚氧乙烯(polyethyleneoxy) 和聚丙烯酰胺以及它們的共聚物和接枝物(grafts)組成。固相支持體也可以是無機(jī)物，如 玻璃、硅石、可控孔度玻璃(controlled-pore-glas^CPG)或反相硅石。固相支持體的構(gòu)型 可以是珠、球、微粒、顆粒、凝膠、膜或表面的形式。表面可以為平面、基本上平面或非平面。 固相支持體可以是多孔的或非多孔的，以及可以具膨脹或非膨脹特性。固相支持體可以以 孔(well)、凹陷(depression),^ (tube)、槽(channel)、圓柱體(cylinder)或其他的容器 (container)、器皿(vessel)、特征部件(feature)或區(qū)域(location)的形式成形。如本文所用的，“靶核酸”指所關(guān)注的核酸分子。樣品可以包含多于一種的核酸分 子。PCR產(chǎn)物電化學(xué)檢測的測定公開于恰好與本申請同一日提交的美國臨時(shí)專利申請 第60/877，610號(Docket卷號70043. 0036USP1)中。該測定由具有例如15mer 5，翼的 雜交探針組成，所述15mer 5’翼與靶核酸不互補(bǔ)但與電極限制的捕獲探針互補(bǔ)。這種5’翼包含電化學(xué)標(biāo)記。在PCR過程中，包含該5’翼的探針片段由具有核酸外切酶活性的酶如 Taq聚合酶切割。探針片段隨后與電極限制的捕獲探針雜交，產(chǎn)生信號。發(fā)現(xiàn)完整的(即 未切割的)雜交探針不像探針片段一樣有效地與捕獲探針雜交。這種現(xiàn)象可在單容器測定 (one pot assay)中監(jiān)控PCR，而無需從完整的雜交探針中分離探針片段。在本文所述測定中，完整的或未切割的雜交探針可形成折疊結(jié)構(gòu)，該折疊結(jié)構(gòu)的 解鏈溫度(Tm)低于完整的雜交探針與靶核酸雜交時(shí)所形成的雙鏈體的解鏈溫度而高于探 針片段與捕獲探針雜交時(shí)所形成的雙鏈體的解鏈溫度。不期望限于任何理論，認(rèn)為在探針 片段與捕獲探針雜交的溫度時(shí)的完整雜交探針的折疊結(jié)構(gòu)基本上抑制了完整的雜交探針 與電極表面上的捕獲探針的雜交，由此，改善了測定的信噪比。1.用包含5’翼的雜交探針進(jìn)行的PCR測定圖IA是設(shè)計(jì)測定的組成和步驟的示意圖，該測定利用能形成折疊結(jié)構(gòu)的雜交探 針，其中可將雜交探針與靶核酸雜交，且其中雜交的探針的一部分經(jīng)切割形成可以在表面 (如電極表面)上被捕獲和檢測的標(biāo)記的探針片段?？紤]到此測定模式，設(shè)計(jì)和評估一組 具有多種預(yù)測的1值(如83.51、61.71、54.31或46°0的雜交探針。具有最高！^ = 83.5°C)的雜交探針對應(yīng)于5’翼的15mer區(qū)域和探針的余部之間的完美匹配。其他的探針 包含導(dǎo)致較低Tm值的錯誤匹配。利用2006年7月17日提交的美國專利申請第11/488，439 號所述的切割的雜交探針和完整的雜交探針的HPLC分離，評估PCR過程中這些探針的切割 效率。用 7% ACN+93% TEAA 平衡來自 Waters 公司的 HPLC 柱 XTerroMSC 18(2. 5mmX 50mm)。 分三步進(jìn)行梯度洗脫(0. 3ml/min，60C)步驟1 7% ACN+93% TEAA，7分鐘(min)。步驟2 10% ACN+90% TEAA，10 分鐘。步驟 3 35% ACN+65% TEAA，10 分鐘。(ACN-乙腈；TEAA-0. IM 三乙醇胺-乙酸，PH 6.8)。用于折疊結(jié)構(gòu)的具有Tm為61. 7°C的雜交探針表現(xiàn)出了 30%的 切割效率，其被選擇用來進(jìn)行PCR電化學(xué)檢測。圖IB圖解預(yù)測的Tm為61. 7°C的雜交探針的預(yù)測的折疊結(jié)構(gòu)。這種雜交探針依照 圖IA所示的測定適合檢測李斯特氏桿菌(Listeria)單細(xì)胞發(fā)生hlyA基因。圖IB所示的 探針具有如下序列TAGGACTACCAGGGGTTTTCt GCCTGCAAGTCCTAAGACGCCA (SEQ ID NO. 1)其中，粗體所示的核堿基表示5’翼，▼符號表示預(yù)期核酸外切酶活性切割占優(yōu)勢的 位點(diǎn)。依照圖IA所示的測定，利用這種包含5’鋨電化學(xué)標(biāo)簽的雜交探針，進(jìn)行李斯特氏 桿菌單細(xì)胞發(fā)生hlyA基因片段(即靶核酸)的PCR。PCR反應(yīng)在95°C運(yùn)行10分鐘，隨后在 補(bǔ)充了 6mM MgCl2 的 PCR 緩沖液 A (Applied Biosystems,目錄號N808_0228)中進(jìn)行 40 個(gè) 循環(huán)(95°C 15秒，63°C 1分鐘)。引物和探針的濃度分別為200nM和400nM。這種雜交探針 具有與探針內(nèi)部局部互補(bǔ)的19-mer的5 ’翼(參見圖IB)。在PCR過程中，在退火-延伸溫 度(即66°C )時(shí)，因?yàn)闇y定溫度高于預(yù)測的折疊結(jié)構(gòu)的Tm，所以雜交探針應(yīng)該是基本上未 折疊的。這可使雜交探針與靶核酸雜交。一旦雜交，具有核酸外切酶活性的酶切割雜交的 雜交探針，由此在PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生探針片段。PCR完成后，將樣品的溫度降低至41°C， 以使探針片段與捕獲探針雜交。在這些條件下，仍然存在于樣品中的任何完整的(即未切 割的)雜交探針形成了如圖IB所示的預(yù)測的折疊結(jié)構(gòu)，以致表面結(jié)合捕獲探針基本上接觸
9不到5’翼。這種測定的電化學(xué)測量結(jié)果顯示于圖2中。40個(gè)PCR循環(huán)后，將陽性(pos)反應(yīng)混 合物和無模板對照(ntc)反應(yīng)混合物置于夾于兩個(gè)加熱板之間的電化學(xué)池中。本實(shí)驗(yàn)中所 用的電化學(xué)池顯示于圖12中。如圖12所示，這種池包括直徑為2mm的工作電極(working electrode, WE)和計(jì)算器電極(counter electrode, CE)。金計(jì)算電極(CE)是通過在具 有Cr粘附層的硅石晶片上噴鍍涂覆2000埃厚度的金層而制成的。參比電極(reference electrode)是0. 5mm直徑的Ag/AgCl金屬絲。如從圖2所示的結(jié)果中所觀察到的，完整雜 交探針雜交的效率比切割的探針片段低20-30倍。2.用包含相互作用的5’和3’翼的雜交探針進(jìn)行的PCR測定具有可用于測定禽流感病毒RNA的互補(bǔ)的5’和3’翼的雜交探針具有如下序列CTTCGTTCGATTG TC▼ TGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGTC AATCG (SEQ ID NO 2)其中以粗體顯示的核堿基表示5’和3’翼Λ·符號表示預(yù)期核酸外切酶活性的切割
占優(yōu)勢的位點(diǎn)。這種探針的折疊結(jié)構(gòu)的預(yù)測Tm為43. 9°C。圖3A顯示了這種雜交探針的預(yù) 測的折疊結(jié)構(gòu)。使用這種雜交探針，進(jìn)行PCR測定。在環(huán)境反應(yīng)混合液(master mix)中進(jìn)行 40個(gè)PCR循環(huán)(60°C下進(jìn)行延伸和退火)后，將溫度轉(zhuǎn)變?yōu)?8°C。環(huán)境反應(yīng)混合液包括 IOOmM KClUOOmM Tris (pH 8)、8mM MgCl2UOOyM dntps 以及 0. 3 單位 / μ L 金牌酶(gold ampliTaq)。在此溫度下，在雜交的雜交探針上通過核酸外切酶活性產(chǎn)生的探針片段，可與 表面結(jié)合捕獲探針(Tm = 32°C)退火。在這些條件下，仍然存在于樣品中的任何完整的(即 未切割的)雜交探針應(yīng)該形成圖3A所示的預(yù)測的折疊結(jié)構(gòu)(Tm = 43. 9°C )，以使表面結(jié)合 捕獲探針基本上接觸不到5’翼。圖3B是顯示在圖3A所示的雜交探針PCR后，在各種時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)生于表面電極上的 電化學(xué)信號的柱狀圖。在存在10000拷貝的靶核酸和不存在靶核酸(無靶對照或NTC)的 兩種情況下進(jìn)行PCR。如圖3B所示，電化學(xué)數(shù)據(jù)表明兩種測定的雜交效率有約100倍的區(qū) 別。用另一個(gè)具有如下核堿基序列的探針重復(fù)這種測定CTTCGTTCGATTG TC▼ TGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGT (SEQ ID NO 3)其中粗體所示的核堿基表示5’翼，▼符號表示預(yù)期核酸外切酶活性的切割占優(yōu)勢 的位點(diǎn)。圖4顯示這種雜交探針的預(yù)測的折疊結(jié)構(gòu)。這種折疊結(jié)構(gòu)的Tm*34.2°C。對5mM MgCl2介質(zhì)進(jìn)行所有的Tm和mFold分析，所述媒介對應(yīng)于環(huán)境反應(yīng)混和液的離子強(qiáng)度。如與圖4所示的雜交探針?biāo)M(jìn)行的比較，利用圖3A所示的雜交探針進(jìn)行PCR測 定，以比較電化學(xué)測定的效率。圖5A是顯示用圖3A所示的雜交探針進(jìn)行的PCR測定的電 化學(xué)信號的柱狀圖。圖5B是顯示用圖4所示的雜交探針進(jìn)行的PCR測定的電化學(xué)信號的 柱狀圖。圖5A所示的結(jié)果顯示，與圖4所示的雜技探針相比，圖3A所示的雜交探針的辨別 力高2-3倍。3. 3’翼長度的影響為了闡明3’翼長度對折疊結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響，進(jìn)行另外的實(shí)驗(yàn)。這些實(shí)驗(yàn)所用的 雜交探針包括圖3所示的探針，所述探針具有長度為6個(gè)核堿基的3’翼和相似的探針，所
10述相似探針具有長度為9個(gè)核堿基的延長的3’翼。具有較長的9個(gè)核堿基的3’翼的雜交 探針的結(jié)構(gòu)具有如下序列CTTCGTTCGATTG TC ▼ TGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGT CAATCGAAC (SEQ ID NO 4)這種探針具有圖6A所示的預(yù)測的折疊結(jié)構(gòu)，且其預(yù)測的Tm為53. 1°C。上文粗體 所示的核堿基表示5’翼和3’翼，▼符號表示預(yù)期核酸外切酶活性切割占優(yōu)勢的位點(diǎn)。在這 種雜交探針中，鄰近所示的切割位點(diǎn)的加下劃線的C核堿基是LNA亞單位。雜交探針的所 有其他亞單位都是DNA。具有長度為9個(gè)核堿基的3’翼的探針具有約為53. 1°C的預(yù)測的解鏈溫度，而具有 較短的6個(gè)核堿基的3’翼探針的預(yù)測的解鏈溫度約為43. 9°C。進(jìn)行圖3A和圖6A所示的 雜交探針的PCR測定后，電化學(xué)檢測結(jié)果分別顯示于圖6B和圖6C中。在金粉表面于32°C 下，進(jìn)行PCR后雜交反應(yīng)的電化學(xué)分析。由于3’翼長度的增加，具有長度為9個(gè)核堿基的 3’翼的探針具有預(yù)測的更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)(即更高的折疊Tm)，這顯然產(chǎn)生了更好的辨別能力。4.5’翼長度的影響為了測定5’翼長度對測定性能的影響，進(jìn)行另外的實(shí)驗(yàn)。對于這些實(shí)驗(yàn)而言，評 估針對禽流感病毒的具有19mer、15mer、13mer 5’翼的雜交探針。這些探針不包括3’翼。 所述探針具有如下核苷酸序列19-mer 5，翼GTTACTTCGTTCGATTG TC^ TGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGT (SEQ ID NO 5)15-mer 5'翼CTTCGTTCGATTG TC▼ TGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGT(SEQ ID NO 6)13-mer 5'翼 TCGTTCGATTG TC ▼ TGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGT(SEQ ID NO 7)在這些序列中，上文粗體所示的核堿基表示5’翼，▼符號表示預(yù)期核酸外切酶活
性切割占優(yōu)勢的位點(diǎn)。在這些雜交探針中，鄰近所示的切割位點(diǎn)的加有下劃線的C核堿基 是LNA亞單位。這些雜交探針的所有其他亞單位都是DNA。在使用每種具有19mer、15mer和13mer 5’翼的雜交探針進(jìn)行PCR后，電化學(xué)檢測 的結(jié)果分別顯示于圖7A、7B和7C中。對于19mer、15mer和13mer 5，翼，將PCR后混合物 在金電極上分別于4rC、35°C、31°C (即比每種預(yù)測的折疊結(jié)構(gòu)的預(yù)測的TJS 8°C)下雜 交。從這些結(jié)果中可以觀察到，具有13mer 5’翼的雜交探針比具有更長的15mer和19mer 5’翼的雜交探針表現(xiàn)處更好的測定性能。5.另外的禽流感PCR測定進(jìn)行兩個(gè)另外的禽流感PCR測定，這兩個(gè)測定針對禽流感病毒血凝素基因的不同 區(qū)域。用導(dǎo)致折疊結(jié)構(gòu)的預(yù)測Tm為約44-45°C的3’翼，設(shè)計(jì)兩種雜交探針。這兩者探針的 預(yù)測的折疊結(jié)構(gòu)顯示于圖8A和圖9A中。作為這些測定的靶核酸的模板是長度為約100個(gè) 堿基的合成的DNAs。在比探針片段/捕獲探針雜交物的預(yù)測的TJS 10-14°C的溫度下，利
11用環(huán)境反應(yīng)混和液，在金電極上，進(jìn)行PCR后雜交/檢測。這些實(shí)驗(yàn)所用的第一雜交探針的核堿基序列為CATGCTACTCAACA C ▼ AGTTACCATATTCCAATTCACTTTTCATAATTGCT G GTTGAGTA(SEQ IDNO 8)對于折疊結(jié)構(gòu)而言，這種雜交探針的預(yù)測的解鏈點(diǎn)(Tm)為44. 0°C。這種探針的預(yù) 測的折疊結(jié)構(gòu)示于圖8A中。與這種探針一起使用的捕獲探針是具有下文所示結(jié)構(gòu)的15mer 寡聚體GTGTTGAGTAGCATG(SEQ ID NO 9)這些實(shí)驗(yàn)所用的第二雜交探針的核堿基序列如下ACACGTGTACCTTA C ▼ TGCAGACAAAGAATCCACTCAAAAGGCAATGGTA CAC (SEQ ID NO 10)對于折疊結(jié)構(gòu)而言，這種雜交探針的預(yù)測的解鏈點(diǎn)(折疊Tm)為45.2°C。這種探 針的預(yù)測的折疊結(jié)構(gòu)示于圖9A中。與這種雜交探針一起使用的捕獲探針具有下文所示的 結(jié)構(gòu)GTAAGGTACACGTGT(SEQ ID NO 11)對于這兩種雜交探針而言，上文以粗體所示的核堿基表示5’和3’翼，▼符號表示 預(yù)期核酸外切酶活性的切割占優(yōu)勢的位點(diǎn)。在這些雜交探針中，加下劃線的A(第一探針) 和加下劃線的T(第二探針)核堿基，是LNA亞單位，其鄰近所示的切割位點(diǎn)。這些雜交探 針的所有其他亞單位都是DNA。在本文所討論的PCR測定中使用這些雜交探針和捕獲探針。使用第一雜交探針的 禽流感DNA的PCR后電化學(xué)檢測顯示于圖8B中。使用第二雜交探針的禽流感DNA的PCR 后電化學(xué)檢測顯示于圖9B中。盡管上文中公開了采用莖環(huán)構(gòu)象的雜交探針，但也可以使用折疊時(shí)采用其他構(gòu) 型的雜交探針。此類結(jié)構(gòu)包括發(fā)夾(hairpin)、內(nèi)環(huán)(internalloop)、凸起(bulge)、分枝 (branched)、苜蓿葉形(cloverlfeaf)和偽節(jié)(pesudoknot)結(jié)構(gòu)?？捎糜趯?shí)施本文所公開 的方法和試劑盒的的其他折疊結(jié)構(gòu)的實(shí)例，可見于美國專利第7，118，860B2號中。6.包含三鏈體結(jié)構(gòu)的雜交探針在某些實(shí)施方案中，雜交探針可采用分子內(nèi)三鏈體構(gòu)象?？尚纬煞肿觾?nèi)三鏈體結(jié) 構(gòu)的雜交探針的實(shí)例如下文所示TTJJT AGA TCCTT -[探針序列]-AAGGA (SEQ ID NO 12)在上述序列中，“J”表示假胞嘧啶核堿基，“探針序列”表示經(jīng)設(shè)計(jì)使序列與靶核酸 特異性地雜交的探針的一部分?？梢灶A(yù)見，這種通用構(gòu)象的雜交探針可采用與圖10所示的折疊結(jié)構(gòu)相同的分子 內(nèi)三鏈體構(gòu)象，其中“一”表示Hoogsteen氫鍵，“ · ”沃森-克里克堿基對(Watson-Crick base pairs)，“環(huán)”包含探針中與靶核酸雜交的一部分(即“探針序列”)。這種類型的三 鏈體結(jié)構(gòu)公開于 Petrovet al. , “ The Triplex-Hairpin Transition in Cytosine-Rich DNA(富含胞嘧啶的DNA中的三鏈發(fā)夾轉(zhuǎn)換)“，Biophysical Journal, Vol. 87， 3954-3973 (December 2004)中。這些結(jié)構(gòu)涉及T · *A—T和C · G—C+三鏈體的形成，其 中C+表示在N3位置質(zhì)子化的胞嘧啶殘基。參考圖11和Egholm et al.，“ EfficientpH—independent sequence-specific DNA bindng bypseudoisocytosine-containing bis-PNA (通過含假異胞嘧啶的雙PNA進(jìn)行有效的非pH依賴性的序列特異性DNA結(jié)合)〃， Nucl. Acids Res.，Vol. 23，No. 2. 217-222(1995)，當(dāng)需要質(zhì)子化的胞嘧啶核堿基(C+)產(chǎn)生 三鏈體時(shí)，可用假異胞嘧啶來取代。以此方式，可以以不依賴PH的方式形成三鏈體結(jié)構(gòu)。在上文所示的序列和圖10所示的結(jié)構(gòu)中，用假異胞嘧啶取代那些要被質(zhì)子化的 胞嘧啶核堿基。因此，在所示的位置用J堿基取代C+允許三鏈體在生理pH下形成。預(yù)期 形成分子內(nèi)三鏈體的雜交探針形成穩(wěn)定的折疊結(jié)構(gòu)(即三鏈體結(jié)構(gòu))，所述結(jié)構(gòu)基本上抑 制它們與表面結(jié)合捕獲探針的相互作用。7.標(biāo)記、探針和引物任何已知的電化學(xué)部分可用作雜交探針切割部分上的標(biāo)記?？墒褂玫氖纠缘?電化學(xué)標(biāo)記包括雙(2，2' -二吡啶基)咪唑基氯化鋨(II)[鹽]。這種標(biāo)記具有相對Ag/ AgCl的0. 165的優(yōu)良Etl，并具有用于合成和純化的良好的溶解性。其他示例性的標(biāo)記包 括二茂鐵以及于2006年7月17日提交的美國專利申請第11/488，439號公開的標(biāo)記。此 外，電化學(xué)標(biāo)記可以是任何可將電子轉(zhuǎn)運(yùn)到到電極或從電極轉(zhuǎn)運(yùn)電子的部分。示例性的 電化學(xué)標(biāo)記包括過渡金屬配合物。適合的過渡金屬配合物包括，例如釕2+(2，2' -二吡 啶)3 (Ru (bpy) 32+)、釕 2+ (4，4 ‘ - 二甲基-2，2 ‘ _ 二吡啶)3 (Ru (Me2-bpy) 32+)、釕 2+ (5，6- 二 甲基-1，10-鄰菲羅啉)3 (Ru (Me2-Phen) 32+)、鐵 2+ (2，2 ‘ - 二吡啶)3 (Fe (bpy) 32+)、鐵 2+ (5-氯 鄰菲羅啉)3 (Fe (5-Cl-phen) 32+)、鋨 2+(5_ 氯鄰菲羅啉)3 (Os (5-Cl-phen) 32+)、鋨 2+(2，2 ‘ -二 吡啶)2(咪唑基)、二氧化錸1+膦以及二氧化錸1+吡啶(ReO2(Py)41+)。一些可用作介質(zhì)的 陰離子復(fù)合物是Ru (bpy) ((SO3) 2-bpy) 22—和Ru (bpy) ((CO2) 2-bpy) 22—，一些可用作介質(zhì)兩性 離子復(fù)合物是 Ru (bpy) 2 ((SO3) 2-bpy)和 Ru (bpy) 2 ((C02) 2-bpy)，其中(SO3) 2_bpy2-是 4， 4' - 二磺酸 _2，2' -二吡啶，(0)2)2^^72-是4，4' - 二羧基 _2，2' - 二吡啶。吡啶、二 吡啶(bypyridine)和鄰菲羅啉基的適宜的取代衍生物與上文所述的任何金屬一起也可以 用于復(fù)合物中。除其他的以外，適宜的取代衍生物包括但不限于4-氨基吡啶、A-二甲基吡 啶、4-乙酰吡啶、4-硝基吡啶、4，4' - 二氨基_2，2' -二吡啶、5，5' - 二氨基_2，2' -二 吡啶、6，6' - 二氨基 _2，2' -二吡啶、4，4' -二乙二胺 _2，2' -二吡啶、5，5' - 二乙二 胺 _2，2' -二吡啶、6，6' -二乙二胺 _2，2' -二吡啶、4，4' - 二羥基 _2，2' -二吡啶、 5,5' - 二羥基 _2，2' -二吡啶、6，6' - 二羥基 _2，2' -二吡啶、4，4'，4〃 -三氨基 _2， 2'，2〃 -四吡啶、4，4'，4〃 -三乙二胺 _2，2'，2〃 -四吡啶、4，4'，4〃 -三羥基-2， 2'，2'-四吡啶、4，4'，4〃 -三硝基 _2，2'，2〃 -四吡啶、4，4'，4〃 -三苯基 _2，2'， 2 “-四吡啶、4，7_ 二氨基-1，10-鄰菲羅啉、3，8_ 二氨基-1，10-鄰菲羅啉、4，7_ 二乙二 胺-1，10-鄰菲羅啉、3，8- 二乙二胺-1，10-鄰菲羅啉、4，7- 二羥基-1，10-鄰菲羅啉、3， 8- 二羥基-1，10-鄰菲羅啉、4，7- 二硝基-1，10-鄰菲羅啉、3，8- 二硝基-1，10-鄰菲羅啉、 4，7- 二苯基-1，10-鄰菲羅啉、3，8- 二苯基-1，10-鄰菲羅啉、4，7- 二波胺-1，10-鄰菲羅啉 (4,7-disperamine-l, 10-phenanthroline)、3，8_ 二波胺-1，10-鄰菲羅啉、二吡啶[3，2_a 2'，2' -c]吩嗪，以及 6，6' -二氯 _2，2' -二吡啶。盡管上文對電化學(xué)檢測進(jìn)行了舉例說明，但公開的方法也適用于通過其他的檢測 技術(shù)如熒光檢測進(jìn)行核酸檢測。而且，雜交探針上的可檢測標(biāo)記可以是能被檢測和/或定 量的任何部分。示例性的標(biāo)記包括電化學(xué)標(biāo)記、發(fā)光(如熒光、發(fā)光、化學(xué)發(fā)光)標(biāo)記和比色標(biāo)記。本文所用的引物可以具有任何類型的長度和構(gòu)型。例如，引物的長度可以是從18 到約30個(gè)亞單位或從20到25個(gè)亞單位。引物并非限于DNA或RNA寡核苷酸，但它們必須 是通過聚合酶可延伸的。也可以使用更長或更短的引物。雜交探針中與靶核酸結(jié)合的區(qū)域的長度可以是從8到30個(gè)亞單位，而雜交探針中 不與靶核酸結(jié)合的區(qū)域(即5’翼)的長度可以是2-40個(gè)亞單位或從8到30個(gè)亞單位。也 可以使用具有比上文列舉的那些區(qū)域更長或更短的區(qū)域的雜交探針。PCR引物經(jīng)設(shè)計(jì)可結(jié)合并產(chǎn)生任何期望長度的擴(kuò)增的產(chǎn)物，通常長度為至少30或 至少50個(gè)核苷酸且最多200、300、500、1000或更多個(gè)核苷酸。探針和引物可以以任何適宜 的濃度提供。例如，提供的正向和反向引物的濃度通常小于或等于500nM，如20nM-500nm， 或50-500nM，或100_500nM，或50_200nM。提供的探針的濃度通常小于或等于ΙΟΟΟηΜ，如 20nM-500nm,或50_500nM，或100_500nM，或50_200nM。NTPs、酶、引物和探針濃度的示例性 條件也可見于美國專利第5，538，848號中，或利用商購(例如可從Applied Biosystems, Foster City，CA獲得)的反應(yīng)組分來實(shí)現(xiàn)，所述美國專利整體被通過引用的方式并入本 文。也可以以陣列的形式使用多種互補(bǔ)的捕獲探針，所述探針的每種都具有特征序 列。例如，可用與不同雜交探針片段雜交的捕獲寡核苷酸的陣列定位和捕獲許多離散的檢 測區(qū)中的單個(gè)標(biāo)簽序列。本文所述方法可用于實(shí)時(shí)檢測靶核酸。例如，固相支持體可與其中正發(fā)生核酸擴(kuò) 增的溶液以及PCR過程中受到監(jiān)控的過程(即實(shí)時(shí)檢測)接觸。可選地，固相支持體可與 PCR過程完成后的溶液接觸(即終點(diǎn)檢測)。在某些實(shí)施方案中，可在PCR過程中(實(shí)時(shí)) 以及該過程完成后(終點(diǎn))監(jiān)控PCR測定。PCR測定可利用傳統(tǒng)PCR模式以及Fast PCR模 式、不對稱PCR模式和異步PCR模式來進(jìn)行。本文所述的方法適用于均相PCR測定，其中檢測到雜交探針的探針片段的表面雜 交指示樣品中存在靶核酸。盡管前述的說明書講述了本發(fā)明的原理，但通過參考出于說明目的而提供的實(shí)施 例，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過閱讀本說明書應(yīng)當(dāng)理解，在沒有偏離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍的情況下， 可以在形式和細(xì)節(jié)上做出各種變化。
1權(quán)利要求
檢測樣品中靶核酸的方法，所述方法包括通過將所述樣品加熱至第一溫度，使所述樣品解鏈，其中所述樣品包含與所述靶核酸的至少一部分雜交的引物；包含第一和第二區(qū)域的雜交探針，其中所述第一區(qū)域與所述靶核酸的至少一部分雜交，且所述第二區(qū)域不與所述靶核酸雜交，且其中所述第二區(qū)域包含可檢測標(biāo)記；和聚合酶和具有核酸外切酶活性的酶，其中所述聚合酶在雜交的探針的方向上延伸雜交的引物，且所述酶的核酸外切酶活性切割所述雜交的探針，由此釋放包含所述探針第二區(qū)域和所述可檢測標(biāo)記的探針片段；和其中所述第一溫度高于所述引物和存在于所述樣品中的雙鏈核酸的Tm；隨后，通過將溫度降低至低于所述第一溫度的第二溫度，使所述樣品退火，以便使所述引物和所述雜交探針與所述樣品中的靶核酸的單鏈部分各自雜交；和隨后通過使所述聚合酶在第三溫度下延伸與所述靶核酸雜交的引物，延長所述引物；使所述酶的核酸外切酶活性切割所述雜交探針，由此釋放所述探針片段；任選地重復(fù)解鏈、退火和延長至少一次；將所述樣品與固相支持體的表面接觸，其中所述固相支持體的表面包含一個(gè)或多個(gè)與所述探針片段的第二區(qū)域的至少一部分雜交的捕獲探針；使所述捕獲探針在第四溫度下與存在于所述樣品中的所探針片段的至少一部分雜交，其中所述第四溫度低于所述第二和第三溫度；以及檢測所述固相支持體表面上的標(biāo)記；其中所述雜交探針的至少一部分與所述雜交探針的另一部分雜交，由此形成折疊結(jié)構(gòu)，且其中所述折疊結(jié)構(gòu)的解鏈溫度(Tm)低于所述第三溫度且高于所述第四溫度。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述聚合酶和所述具有核酸外切酶活性的酶是同一 分子。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述折疊結(jié)構(gòu)的解鏈溫度(Tm)是41°C至66°C。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述折疊結(jié)構(gòu)的解鏈溫度(Tm)是58°C至63°C。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在相應(yīng)折疊結(jié)構(gòu)中，所述捕獲探針基本上接觸不到 所述探針片段中與所述捕獲探針雜交的的第二區(qū)域。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第三溫度高于或等于所述第二溫度且小于所述 第一溫度。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第二溫度和所述第三溫度相同。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述雜交探針還包含鄰近所述第一區(qū)域且與所述第 二區(qū)域相對的第三區(qū)域，其中所述第三區(qū)域不與所述靶核酸雜交。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中將所述雜交探針的第二區(qū)域和第三區(qū)域都與所述雜 交探針的另一部分雜交以形成所述的折疊結(jié)構(gòu)。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述第三區(qū)域的至少一部分與所述第二區(qū)域的至 少一部分雜交以形成所述的折疊結(jié)構(gòu)。
11.如權(quán)利要求5所述的方法，其中將所述雜交探針的第二區(qū)域的至少一部分與所述 雜交探針的另一部分雜交以形成所述的折疊結(jié)構(gòu)。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述聚合酶是熱穩(wěn)定酶。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述熱穩(wěn)定酶是Taq聚合酶。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述固相支持體的表面包含電極，且其中所述可檢 測標(biāo)記是可以將電子轉(zhuǎn)運(yùn)到所述電極或者從所述電極轉(zhuǎn)運(yùn)電子的部分。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述可檢測標(biāo)記是二茂鐵部分。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述固相支持體的表面包含金。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述固相支持體包含多個(gè)形成流體槽的交叉板，其 中所述板的至少某些表面包含捕獲探針，且其中將所述樣品與固相支持體的表面接觸包括 使所述樣品流經(jīng)所述流體槽。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述板的表面包含電極。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述交叉板的表面包含捕獲探針。
20.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述折疊結(jié)構(gòu)包含分子內(nèi)三鏈體結(jié)構(gòu)。
21.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在連續(xù)循環(huán)中多次進(jìn)行解鏈、退火和延長。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中檢測所述固相支持體表面上的標(biāo)記在最后一次解 鏈、退火和延長循環(huán)后發(fā)生。
23.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品在解鏈、退火和延長過程中與所述固相支 持體的表面接觸，且其中檢測在所述方法過程中和/或最后一次解鏈、退火和延長循環(huán)后 多次發(fā)生。
24.檢測樣品中靶核酸的試劑盒，其包含雜交探針，其包含與所述靶核酸的至少一部分雜交的第一區(qū)域和包含可檢測標(biāo)記的第 二區(qū)域，其中所述第二區(qū)域不與所述靶核酸雜交，且其中，當(dāng)與所述靶核酸雜交時(shí)，核酸外 切酶可以切割所述雜交探針，由此產(chǎn)生包含所述第二區(qū)域和所述可檢測標(biāo)記的探針片段；固相支持體，其包含位于其表面上的捕獲探針，其中所述捕獲探針與所述探針片段的 第二區(qū)域雜交；任選地，引物，其與所述靶核酸的至少一部分雜交；以及任選地，聚合酶和具有核酸外切酶活性的酶，其中所述聚合酶在雜交的探針的方向上 延伸雜交的引物，且所述酶的核酸外切酶活性切割所述雜交的探針，由此釋放包含所述探 針第二區(qū)域和所述可檢測標(biāo)記的探針片段；其中所述雜交探針的至少一部分與所述雜交探針的另一部分雜交，由此形成折疊結(jié) 構(gòu)，且其中所述折疊結(jié)構(gòu)的解鏈溫度(Tm)低于所述雜交探針與所述靶核酸雜交時(shí)所形成的 雙鏈體的解鏈溫度且高于所述探針片段與所述捕獲探針雜交時(shí)所形成的雙鏈體的解鏈溫 度。
25.如權(quán)利要求24所述的試劑盒，其中所述固相支持體的表面包含電極，且其中所述 可檢測標(biāo)記是可以將電子轉(zhuǎn)運(yùn)到所述電極或從所述電極轉(zhuǎn)運(yùn)電子的部分。
26.如權(quán)利要求25所述的試劑盒，其中所述可檢測標(biāo)記是電活化二茂鐵部分。
27.如權(quán)利要求25所述的試劑盒，其中所述固相支持體的表面包含金。
28.如權(quán)利要求24所述的試劑盒，其中所述試劑盒包含聚合酶和具有核酸外切酶活性 的酶。
29.如權(quán)利要求25所述的試劑盒，其中所述聚合酶和具有核酸外切酶活性的酶是同一 分子。
30.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述聚合酶是熱穩(wěn)定酶。
全文摘要
本發(fā)明描述了檢測樣品中靶核酸的方法和試劑盒。待分析的樣品可以包括與靶核酸的至少一部分雜交的引物、具有與靶核酸的至少一部分雜交的第一區(qū)域和具有可檢測標(biāo)記的第二區(qū)域的探針、延伸雜交的引物的聚合酶以及包含能切割雜交的雜交探針由此產(chǎn)生標(biāo)記的探針片段的核酸外切酶活性的酶。雜交探針的至少一部分與其另一部分雜交由此形成折疊結(jié)構(gòu)。該方法包括解鏈樣品、降低樣品的溫度以便使引物和探針與樣品中單鏈靶核酸的至少一部分各自雜交、延長引物以及釋放標(biāo)記的探針片段?？蓪悠放c包含與標(biāo)記的探針片段雜交的表面結(jié)合捕獲探針的固相支持體接觸。隨后檢測標(biāo)記。
文檔編號C12Q1/68GK101978070SQ200780036279
公開日2011年2月16日 申請日期2007年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月29日
發(fā)明者克瑞斯蒂恩·斯卡博, 尤金·斯拜爾, 維薩里昂·埃瓦薩韋利 申請人:應(yīng)用生物系統(tǒng)公司