專利名稱：：微生物酶途徑的實(shí)時(shí)監(jiān)測的制作方法孩吏生物酶途徑的實(shí)時(shí)監(jiān)觀寸交叉引用本申請要求2006年12月29號提交的60/882834號美國臨時(shí)申請的優(yōu)先權(quán)，此申請通過引用在此引入。
背景技術(shù)：
：生物體內(nèi)沿酶途徑的電子流受到多種因素的控制。這些因素包括，例如在該途徑中各個(gè)點(diǎn)的底物濃度以及酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的正和負(fù)反饋。特別是，特定目標(biāo)產(chǎn)物可能對于細(xì)胞是毒性的，從而起到負(fù)向調(diào)節(jié)其自身產(chǎn)生的調(diào)節(jié)因子的作用。這對于，例如某些醇類(如乙醇和丁醇)是正確的。生物體內(nèi)發(fā)酵或合成途徑的特定產(chǎn)物，如醇類，具有商業(yè)價(jià)值。當(dāng)由微生物產(chǎn)生時(shí)，這類化合物通過培養(yǎng)該微生物而大量產(chǎn)生。然而，預(yù)期的目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率是隨著時(shí)間而變化的，先增加，然后下降，原因是細(xì)胞從指數(shù)生長轉(zhuǎn)為停滯以及毒性產(chǎn)物的積聚抑制其產(chǎn)生。在更長的時(shí)間內(nèi)將培養(yǎng)物控制在目標(biāo)產(chǎn)物維持高產(chǎn)的狀態(tài)中是有益的，從而增加具有商業(yè)價(jià)值的產(chǎn)物的總體產(chǎn)量。
發(fā)明內(nèi)容在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種重組核酸分子，其包含可操作地與編碼自持的(self-contained)發(fā)光報(bào)道體的核苷酸序列連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控核苷酸序列，其中該轉(zhuǎn)錄調(diào)控核苷酸序列調(diào)節(jié)指示細(xì)胞內(nèi)發(fā)酵或合成途徑的目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)生的基因的表達(dá)。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控核苷酸序列是細(xì)菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控核苷酸序列，其中該轉(zhuǎn)錄調(diào)控核苷酸序列調(diào)節(jié)編碼沿所述途徑的酶的基因的表達(dá)，且報(bào)道體表達(dá)的變化與目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)生的變化正相關(guān)?；蛘撸诒景l(fā)明的另一實(shí)施方式中，報(bào)道體表達(dá)的變化與目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)生的變化負(fù)相關(guān)。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，報(bào)道體的表達(dá)隨目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)生的增加而增加或者減少。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，報(bào)道體的表達(dá)隨目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)生的減少而增加或者減少。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，目標(biāo)產(chǎn)物是終產(chǎn)物。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，終產(chǎn)物是丙酮、乙醇或丁醇。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，目標(biāo)產(chǎn)物是酸中間體。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，酸中間體是乙酸、丁酸或乳酸。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述途徑是厭氧途徑。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，所述途徑是發(fā)酵途徑。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述途徑是選自糖原異生、糖酵解、恩特納-杜多羅夫途徑或非氧化性戊糖磷酸途徑的底物利用途徑。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，細(xì)菌將己糖、戊糖或氨基酸轉(zhuǎn)化成酸或醇。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述基因編碼沿由乙酰輔酶A產(chǎn)生丁醇的途徑或沿該途徑的分支的酶。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，所述基因編碼丁醇脫氫酶、丁醛脫氫酶、乙醇脫氬酶、酸性醛脫氫酶、乙酰乙酸脫羧酶、丁酸激酶、磷酸丁酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶、乙酸激酶、脂酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶或丁基輔酶轉(zhuǎn)移酶。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控核苷酸序列來自梭菌屬(C7o血W—、大腸桿菌(E.coli)、運(yùn)動發(fā)酵單胞菌(Z,wo&fc)或釀酒酵母(6".cereWW—。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述自持的發(fā)光報(bào)道體是發(fā)光的。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，發(fā)光報(bào)道體包括熒光素酶。在本發(fā)明的再進(jìn)一步的實(shí)施方式中，熒光素酶來自鞘翅目(Coleoptera)、光桿菌屬(尸/^or/mW—、弧菌(Vibrio)、G謹(jǐn)w'a、雙翅目(Diptera)、海腎屬(Renilla)。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，自持的發(fā)光報(bào)道體包括熒光報(bào)道體。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，熒光報(bào)道體包括綠色焚光蛋白("GFP")。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，自持的發(fā)光報(bào)200780040257.8說明書第3/66頁道體包括磷光性報(bào)道體。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種包含自持的報(bào)道構(gòu)建體的細(xì)胞，當(dāng)合成或發(fā)酵途徑已被誘導(dǎo)或抑制以影響該途徑中目標(biāo)產(chǎn)物的濃度時(shí)該報(bào)道構(gòu)建體給出指示。在另一方面中，本發(fā)明提供了包含重組核酸分子的細(xì)胞，該重組核酸分子包含可操作地與編碼自持的發(fā)光報(bào)道體的核苷酸序列連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控核苷酸序列，其中該轉(zhuǎn)錄調(diào)控核苷酸序列調(diào)節(jié)指示細(xì)胞內(nèi)發(fā)酵或合成途徑的目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)生的基因的表達(dá)。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，細(xì)胞為梭菌屬、大腸桿菌、運(yùn)動發(fā)酵單胞菌或釀酒酵母。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述細(xì)胞中途徑的目標(biāo)產(chǎn)物是終產(chǎn)物。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，細(xì)胞中途徑的終產(chǎn)物是丁醇。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，基因編碼丁醇脫氫酶、丁^脫氫酶、乙醇脫氫酶、酸性醛脫氫酶、乙酰乙酸脫羧酶、丁酸激酶、磷酸丁酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶、乙酸激酶、脂酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氬酶或丁基輔酶A轉(zhuǎn)移酶。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，所述細(xì)胞包含包括可操作地與編碼自持的發(fā)光報(bào)道體的核苷酸序列連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控核苷酸序列的基因，其中該轉(zhuǎn)錄調(diào)控核苷酸序列調(diào)節(jié)丁醛脫氫酶的表達(dá)，且所述細(xì)胞另外包含可操作地與編碼自持的發(fā)光報(bào)道體的核苷酸序列連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控核苷酸序列的另一基因，其中該轉(zhuǎn)錄調(diào)控核香酸序列調(diào)節(jié)丁醇脫氬酶的表達(dá)。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供包含產(chǎn)生具有商業(yè)價(jià)值的量的合成或發(fā)酵途徑的目標(biāo)產(chǎn)物和發(fā)光報(bào)道體的細(xì)胞的培養(yǎng)物。在另一方面中，本發(fā)明提供了一種方法，包括(a)培養(yǎng)包含重組核酸分子的細(xì)胞，該重組核酸分子包含可纟喿作地與編碼發(fā)光才艮道體的核苷酸序列連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控核苷酸序列，其中該轉(zhuǎn)錄調(diào)控核苷酸序列調(diào)節(jié)指示細(xì)胞內(nèi)發(fā)酵或合成途徑的目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)生的基因的表達(dá)，從而報(bào)道體的光發(fā)射指示目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)生；(b)測量培養(yǎng)物中報(bào)道體發(fā)射的光；以及(c)根據(jù)發(fā)射的光給出的目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)生的信號改變培養(yǎng)條件以調(diào)節(jié)目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)生。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，發(fā)光報(bào)道體是自持的。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，目標(biāo)產(chǎn)物是終產(chǎn)物。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，目標(biāo)產(chǎn)物是酸中間體。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，對發(fā)射的光進(jìn)行實(shí)時(shí)測量。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，發(fā)射的光隨目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)生的增加而增加或者減少。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，發(fā)射的光隨目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)生的減少而增加或者減少。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，細(xì)胞在包括窗口的培養(yǎng)容器中培養(yǎng)，且通過該窗口測量光。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，細(xì)胞在培養(yǎng)物中包括至少一個(gè)光傳感器的培養(yǎng)容器內(nèi)培養(yǎng)，該光傳感器可以檢測發(fā)射的光并直接地或者遠(yuǎn)程地發(fā)信號給檢測器。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，細(xì)胞在包括使培養(yǎng)液連續(xù)流過檢測液流中的發(fā)射光的光傳感器的裝置的培養(yǎng)容器內(nèi)培養(yǎng)。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，如果目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)生下降，則改變培養(yǎng)條件以恢復(fù)目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)生，這些活動包括移除目標(biāo)產(chǎn)物、添加營養(yǎng)素、稀釋培養(yǎng)物或移除細(xì)胞。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種方法，包括(a)在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)重組細(xì)胞以產(chǎn)生目標(biāo)產(chǎn)物，其中該細(xì)胞包含產(chǎn)生光信號的報(bào)道構(gòu)建體，該信號的強(qiáng)度指示目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)生；(b)在多個(gè)不同的時(shí)間對培養(yǎng)物內(nèi)的信號強(qiáng)度進(jìn)行隨時(shí)間的連續(xù)監(jiān)測，以指示這些時(shí)間內(nèi)目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)生水平；以及(c)響應(yīng)于目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)生的變化而改變培養(yǎng)條件，從而將目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)生置于期望的水平。在另一方面中，本發(fā)明提供被軟件監(jiān)測和控制的培養(yǎng)物，該軟件包括(a)接收有關(guān)細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物狀態(tài)的信息的代碼；(b)確定是否以及如何改變培養(yǎng)條件以優(yōu)化目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)生的代碼；(c)和傳送改變培養(yǎng)條件的指令的代碼。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，該代碼確定細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物的狀態(tài)。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供包括(a)培養(yǎng)細(xì)胞的容器、(b)檢測容器內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)物的光的光子檢測器和(c)響應(yīng)于檢測器檢測到的光而改變培養(yǎng)條件的計(jì)算機(jī)控制的裝置的系統(tǒng)。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述系統(tǒng)進(jìn)一步包括將光子轉(zhuǎn)換為電子和將與電子轉(zhuǎn)換為光子的轉(zhuǎn)換裝置。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，所述系統(tǒng)進(jìn)一步包括發(fā)酵室，該發(fā)酵室包括至少一個(gè)窗口或能夠直接或遠(yuǎn)程發(fā)信號給檢測器的至少一個(gè)培養(yǎng)物內(nèi)的光傳感器，或者包括培養(yǎng)物取樣，連續(xù)流檢測器，從而培養(yǎng)液流經(jīng)測量光的檢測器/傳感器。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述系統(tǒng)進(jìn)一步包括響應(yīng)于來自指示目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)生量的電腦的信號而將目標(biāo)產(chǎn)物從容器中移除的計(jì)算機(jī)控制裝置。在另一方面中，本發(fā)明提供了基本由丁醇組成的，并含有來自莧屬植物、或甜高粱或兩者的痕微量成分，且基本沒有石油副產(chǎn)物的組合物。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種商業(yè)方法，包括在至少生產(chǎn)用于制造生物燃料的生物工程細(xì)胞的第一公司和從事石油煉制的第二公司之間建立合資企業(yè)；經(jīng)營該合資企業(yè)，其中第一公司提供生產(chǎn)生物燃料的專有生物工程菌抹的使用許可，第二公司贊助致力于生物燃料生產(chǎn)的合資企業(yè)的研究和開發(fā)，以及第二公司購買該合資企業(yè)生產(chǎn)的生物燃料。通過引用引入在本說明書中提到的所有出版物和專利申請?jiān)谶@里通過引用引入，就象各單個(gè)出版物或?qū)＠暾執(zhí)貏e地和單獨(dú)地表明通過引用引入一樣。本發(fā)明的新特征在所附的權(quán)利要求中特別列出。參考以下對采用了本發(fā)明的原理的說明性實(shí)施方式的詳細(xì)描述以及附圖可以獲得對本發(fā)明的特點(diǎn)及優(yōu)勢的更好的理解，附圖中圖l顯示了丙酉同丁醇才炎菌(C/oWnWw附acWo6"/y/Zcwm)中在成酸(acidogenic)或成溶劑(solventogenic)階段活化的多種生化途徑。催化特定反應(yīng)階段的酶用如下字母表示(A)甘油醛-3-磷酸脫氫酶;(B)丙酮酸-鐵氧還蛋白氧化還原酶；(C)NADH-鐵氧還蛋白氧化還原酶；(D)NADPH-鐵氧還蛋白氧化還原酶；(E)NADH紅素氧還蛋白氧化還原酶；(F)氫化酶；(G)磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶)(/^a，CAC1742);(H)乙酸激酶(w/b4，CAC1743);(I)乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶(硫解酶)(岀7,CAP0078和CAC2873);(J)3-羥基丁酰輔酶A脫氬酶；(K)巴豆酸酶(3-羥基丁酰輔酶A脫水酶，(3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶)(M(i,CAC2708);(L)丁酰輔酶A脫氫酶(6cd,CAC2711);(M)磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶(磷酸丁酰轉(zhuǎn)移酶)(pA，CAC3076);(N)丁酸激酶(ZmA:,CAC3075和CAC1660);(0)乙醛脫氬酶(可能CAP0162和W/^,CAP0035);(P)乙醇脫氫酶(a^W,CAP0162;W/^，CAC3298;和^Z/l4，CAC3299);(Q)丁醛脫氫酶(at/Ae/,CAP0162和ac//^,CAP0035);(R)丁醇脫氫酶(禍e7,CAP0162;禍e,CAP0035;禍，CAP0059;涵萬，CAC3298;W/^,CAC3299;和CAC3392);(S)丁酸-乙酰乙酸輔酶A-轉(zhuǎn)移酶(乙酰乙酰輔酶A:乙酸/丁酸:輔酶A轉(zhuǎn)移酶)("/a,CAP0163(A)和c砂，CAP0164(B));(T)乙酰乙酸脫羧酶0&，CAP0165);(U)丙酮酸脫羧酶(^/c，CAP0025)。選擇的酶詳列于表1中。其它酶可在容易得到的參考材料，如基因組研究所(TheInstituteforGenomicresearch)的網(wǎng)i占(www.tigr.org)中找到。具體實(shí)施方式1.引言本發(fā)明提供了提高來自生物體的具有商業(yè)價(jià)值的產(chǎn)物的總產(chǎn)量-尤其是來自微生物培養(yǎng)物的產(chǎn)量-的方法和材料。該方法通過帶有提供報(bào)道體系統(tǒng)的生物體實(shí)現(xiàn)，該報(bào)道體系統(tǒng)實(shí)時(shí)地指示導(dǎo)致所需產(chǎn)物產(chǎn)生的生化途徑的狀態(tài)。操作者利用該信息(利用實(shí)時(shí)信息)改變培養(yǎng)條件，以將該途徑"保持(poise)"在理想的目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)生狀態(tài)。這可能包括提高產(chǎn)率并在一段時(shí)間內(nèi)使其維持。因此，例如，如果報(bào)道體系統(tǒng)表明產(chǎn)物的產(chǎn)率正在下降，操作者可以通過例如，添加底物或養(yǎng)分、稀釋培養(yǎng)物、移除細(xì)胞、移除毒性產(chǎn)物或改變環(huán)境條件(如攪拌速度、氣壓或溫度)而改變培養(yǎng)條件以增加產(chǎn)率。這一過程可以由包括接收和處理有關(guān)培養(yǎng)物狀態(tài)信息、執(zhí)行確定是否以及如何改變培養(yǎng)條件以改變目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率的算法和將指令發(fā)送至執(zhí)行裝置的計(jì)算機(jī)代碼；和執(zhí)行改變培養(yǎng)條件的指令的裝置的計(jì)算機(jī)操控系統(tǒng)進(jìn)行。生化途徑的狀態(tài)由催化底物朝向或背離產(chǎn)生目標(biāo)產(chǎn)物的反應(yīng)的酶的產(chǎn)生水平反映。從酶產(chǎn)生的絕對速率以及該速率的變化可以獲取有用的信息。例如，催化前體轉(zhuǎn)化為目標(biāo)產(chǎn)物的酶處于高產(chǎn)生水平表明產(chǎn)物正以高水平產(chǎn)生。酶的產(chǎn)生水平隨時(shí)間提高也表明目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)生增加。相反，低水平的酶產(chǎn)量或酶產(chǎn)生率的降低分別表明目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)生的低水平或目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)生率的降低。另一方面，將底物從目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)生導(dǎo)向其它途徑的酶的高產(chǎn)率或產(chǎn)率增加表明目標(biāo)的產(chǎn)生較低或下降。不理想的產(chǎn)生水平提供了介入這一過程以將條件改變?yōu)橛欣谔岣吣繕?biāo)產(chǎn)物產(chǎn)生的條件的理由。本發(fā)明的報(bào)道構(gòu)建體提供了無需直接測量酶的活性而測量信號酶的產(chǎn)生水平的方法。在這些構(gòu)建體中，調(diào)節(jié)系統(tǒng)中信號酶表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控核苷酸序列與報(bào)道基因連接，因此調(diào)控序列調(diào)節(jié)報(bào)道基因的表達(dá)。這樣，報(bào)道體的表達(dá)水平就反映了系統(tǒng)中信號酶的表達(dá)水平。本發(fā)明的一個(gè)方面是控制培養(yǎng)條件來保持培養(yǎng)物而將途徑保持在理想的輸出水平。這部分地涉及到在反應(yīng)進(jìn)程中測量啟動子的活性和足夠快地報(bào)告測量結(jié)果以使得在培養(yǎng)條件明顯改變之前對培養(yǎng)條件發(fā)生作用以調(diào)節(jié)途徑的活性。因此，對培養(yǎng)條件的監(jiān)測和調(diào)節(jié)實(shí)時(shí)進(jìn)行。對報(bào)道基因進(jìn)行選擇以產(chǎn)生能夠?qū)崟r(shí)測量的報(bào)道體信號。^^T，目的的特別有用的一類報(bào)道體是發(fā)射光的一類。特別地，本發(fā)明預(yù)期使用發(fā)光蛋白，熒光素酶。光可以很容易地以電子方式測量，并且電子信號的讀取很方便。本發(fā)明預(yù)期使用這些方法監(jiān)測合成或發(fā)酵途徑的任何產(chǎn)物的產(chǎn)生。但是，該方法在由微生物產(chǎn)生用作燃料的溶劑中特別有用。特別是，本發(fā)明預(yù)期使用本發(fā)明的方法調(diào)節(jié)丙酮丁醇梭菌(C.ace勵(lì)w(y/Zcwm)、拜氏梭菌(CZe(/en'wcA:")、略紫色梭菌(C.戸m.ce訓(xùn))和糖基丁醇4麥菌(C.sacc/^ro6w(y"cwm)中丁醇(一種高伯、值的生物燃料)的產(chǎn)生。2.產(chǎn)生需要的目標(biāo)產(chǎn)物的酶途徑2.1途徑、產(chǎn)物和信號酶本發(fā)明可用于監(jiān)測和調(diào)節(jié)生化途徑(通常，但并不是專門限于體內(nèi)途徑)以產(chǎn)生目標(biāo)化合物。生化途徑是一種生物化合物轉(zhuǎn)化成另一種生物化合物的一系列酶反應(yīng)或其他反應(yīng)。本發(fā)明預(yù)期特別監(jiān)測和調(diào)節(jié)發(fā)酵或合成的生化途徑。本發(fā)明既能用在原核系統(tǒng)也能用在真核系統(tǒng)中。生化途徑"目標(biāo)產(chǎn)物"是由生物體或體外系統(tǒng)產(chǎn)生的化合物，其中該產(chǎn)物是由該途徑產(chǎn)生的希望的化合物。目標(biāo)產(chǎn)物可以是途徑的"終產(chǎn)物"。途徑終產(chǎn)物是由生物體或體外系統(tǒng)產(chǎn)生的化合物，其中因?yàn)闆]有將該化合物轉(zhuǎn)化成另一種化合物的酶，該化合物的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化是不可能的。例如，因?yàn)榛蚪M中沒有編碼這種酶的基因，微生物中的進(jìn)一步酶促轉(zhuǎn)化是不可能的。梭菌中終產(chǎn)物的例子包括以下溶劑丙酮、丁醇和乙醇。目標(biāo)產(chǎn)物也可以是生化途徑中間體，其中該化合物的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化是可能的。在梭菌中，途徑中間體包括"酸中間體"。在梭菌處于成酸培養(yǎng)階段時(shí)，該酸中間體(乙酸和丁酸)在培養(yǎng)基中積累。隨后在成溶劑階段中，這些酸中間體將被再吸收并用來合成溶劑。另一種酸中間體(乳酸)在梭菌在限鐵和高pH條件下培養(yǎng)時(shí)在培養(yǎng)基中積累。其表達(dá)提供了有關(guān)系統(tǒng)中目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)生的信息的酶被稱為"指示"該產(chǎn)物的/^,也被稱為"信號騰^。^t不產(chǎn)物是途徑終產(chǎn)物時(shí)，任一種將途徑中間體轉(zhuǎn)化成另一中間體或者轉(zhuǎn)化成終產(chǎn)物本身的酶可以是信號酶。一般來說，比起那些合成途徑更上游的酶來說，作為途徑最后一步的酶是較好的終產(chǎn)物產(chǎn)生的信號酶。例如，在丙酮丁醇梭菌中，催化丁醛還原成丁醇(圖1,步驟R)的脫氫酶代表可用的信號酶，因?yàn)樗鼈兊谋磉_(dá)量直接表明丁醇的產(chǎn)率。因此，來自與這一啟動子可操作地連接的報(bào)道體的信號下降表明應(yīng)該改變培養(yǎng)條件以提高丁醇產(chǎn)率。在產(chǎn)生終產(chǎn)物的最后反應(yīng)的中間體很少或不分流到其它方向的途徑中時(shí)，催化途徑中的最后中間體的產(chǎn)生(終產(chǎn)物之前的2步)的酶也起到良好的信號酶的作用。例如，當(dāng)丙酮丁醇梭菌在成溶劑階段中時(shí)，因?yàn)樗杏擅府a(chǎn)生的丁醛隨后被轉(zhuǎn)化成丁醇，丁醛脫氫酶(圖l，步驟Q)起到理想的信號酶的作用。因此，丁醛脫氬酶合成率將直接指示丁醇的產(chǎn)率。類似地，在目標(biāo)產(chǎn)物是生化途徑中間體的情況中，催化此中間體產(chǎn)生的酶也可以是良好的信號酶。例如，在丙酮丁醇梭菌中，乙酸激酶或丁酸激酶成為理想的信號酶，因?yàn)樗鼈兊暮铣陕蕦⒎謩e表明酸中間體乙酸和丁酸的產(chǎn)率(圖1,步驟H和N)。在用于形成目標(biāo)產(chǎn)物的中間體沒有分流到其它途徑的情況中，催化這些反應(yīng)(生化途徑上行的兩步)的酶也可以是良好的信號酶。例如在丙酮丁醇核_菌中，磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶和磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶分別成為監(jiān)測乙酸和丁酸產(chǎn)生的良好的信號酶(圖1,步驟G和M)。徑使用的酶也是信號酶。例如，在丙酮丁醇梭菌中，乙酰乙酰輔酶A:乙酸/丁酸:輔酶A轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體分別把乙酸和丁酸重循環(huán)為乙酰輔酶A和丁酰輔酶A(圖1,步驟S)。乙酰乙酰輔酶A:乙酸/丁酸:輔酶A轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體中的任一亞基用作信號酶表明該酸中間體的重循環(huán)率。該信號的出現(xiàn)表明培養(yǎng)物從酸中間體積累的成酸階段向酸中間體被微生物重吸收并隨后轉(zhuǎn)化為溶劑的成溶劑階段轉(zhuǎn)變。因此，來自這一酶的信號的增加表明對于目標(biāo)產(chǎn)物的持續(xù)產(chǎn)生來說不需要改變培養(yǎng)條件。反過來說，將中間體從目標(biāo)途徑分流到其它途徑的酶也可以作為信號酶，因?yàn)樵撔盘柕某霈F(xiàn)和隨后信號強(qiáng)度的任何增強(qiáng)都表明目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率的降低，從而表明可能需要采取矯正行動。例如，在丙酮丁醇梭菌中，如果酸中間體是需要的目標(biāo)產(chǎn)物，那么來自丁醛脫由此隨著酸中間體^皮重吸收用于溶劑產(chǎn)生，酸中間體的積累停止且實(shí)際上減少。2.2^f吏用分支點(diǎn)酶作為信號酶使用占據(jù)發(fā)酵途徑中緊接著出現(xiàn)將底物抽離所述途徑的分支點(diǎn)以上或以下的位置的酶不能與進(jìn)一步沿著需要的發(fā)酵途徑的酶一樣提供信息，除非生物體經(jīng)過基因工程使竟?fàn)幫緩街械拿覆槐磉_(dá)或表達(dá)下調(diào)。例如，在丙酮丁醇梭菌中，如果編碼竟?fàn)幫緩降拿?例如乙醛脫氫酶)的基因被下調(diào)或刪除，從而使得更多的乙酰輔酶A用于產(chǎn)生丁醇而不是產(chǎn)生乙醇，則使用乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶可以提供更多的有關(guān)丁醇產(chǎn)生的信息。2.3利用信號酶測定培養(yǎng)物的生存力可以把報(bào)道體置于代謝途徑的更上游，盡管這樣不能為特定產(chǎn)物的產(chǎn)生提供信號，但可用于提供有關(guān)培養(yǎng)物在碳和電子流方面的整體狀態(tài)的信息，而因此提供機(jī)體健康狀況的信息。例如，在丙酮丁醇梭菌中，使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(圖1,步驟A)作為信號酶與使用丁基途徑(butylicpathway)中更下游的酶(如丁醛脫氫酶)(圖1,步驟Q)不同，它不能為丁醇的產(chǎn)生提供清晰的信息。然而，使用如甘油醛-3-磷酸脫氬酶的酶將給出培養(yǎng)基的整體代謝率的信息，其隨后可以用作控制培養(yǎng)物的培養(yǎng)基給料速度的途徑。類似地，硫解酶(乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶，圖1，步驟I)也可用于提供有關(guān)培養(yǎng)物的整體狀態(tài)的信息。2.4發(fā)酵途徑發(fā)酵途徑是厭氧進(jìn)行的代謝途徑，其中，如在有氧條件下的氧化磷酸化所發(fā)生的，有機(jī)分子而不是氧起到最終電子受體的作用。糖酵解是細(xì)菌(丙酮丁醇梭菌(C.acWo"cZww)和大腸桿菌)和酵母中廣泛存在的發(fā)酵途徑的例子。在糖酵解期間，細(xì)胞將如葡萄糖的單糖轉(zhuǎn)化成丙酮酸，并凈生成ATP和NADH。至少95%的丙酮酸在再生成NAD+(繼續(xù)糖酵解和ATP產(chǎn)生的必備條件)的短途徑中消耗。這些NAD+再生系統(tǒng)的廢物或終產(chǎn)物被稱為發(fā)酵產(chǎn)物。根據(jù)生物體和培養(yǎng)條件的不同，丙酮酸最終轉(zhuǎn)化成如有機(jī)酸(曱酸、乙酸、乳酸、丙酮酸、丁酸、琥珀酸、二羧酸、己二酸和氨基酸)和中性溶劑(乙醇、丁醇、丙酮、1，3-丙二醇、2,3-丙二醇、乙醛、丁醛、2,3-丁二醇)的終產(chǎn)物。TIGR的綜合微生物資源(CMR)根據(jù)發(fā)酵終產(chǎn)物在其圖冊(atlas)中列出了9種類型的發(fā)酵途徑同型乳酸(乳酸)、異型乳酸(乳酸)、乙醇、丙酸、混合(曱酸和乙酸)、丁二醇、丁酸、氨基酸和曱烷生成。本發(fā)明的方法可用于任何以上發(fā)酵途徑中。本發(fā)明中描述的發(fā)酵途徑可以是自然發(fā)生的，也可以進(jìn)行工程化。溶劑是一類由微生物產(chǎn)生的、具有特殊的商業(yè)價(jià)值的終產(chǎn)物。它們包^",例如醇類(乙醇、丁醇、丙醇、異丙醇、1，3-丙二醇、2,3-丙二醇，2，3-丁二醇、丙三醇)、酮類(丙酮)和醛類(乙醛、丁醛)。圖1顯示了丙酮丁醇梭菌中丙酮、丁醇和乙醇溶劑的產(chǎn)生。2.5梭菌中的溶劑產(chǎn)生1912-1914年期間Weizmann在尋找可以用來生產(chǎn)丁二烯或異戊二烯而以此來供應(yīng)發(fā)展中的合成橡膠市場的丁醇或異戊醇的發(fā)酵源時(shí)，首次鑒定了細(xì)菌丙酮丁醇梭菌(JonesD.T.和Woods,D.R.Acetone-butanolfermentationrevisited.Microbio.Rev.50:484-524,1986)。丙酮丁醇梭菌以大致3:6:1的比例同時(shí)產(chǎn)生溶劑丙酮、丁醇和乙醇(ABE)。在丙酮丁醇梭菌的發(fā)酵過程中也生成氫和二氧化碳。合成丁醇的梭菌的不同種是已知的，它們主要通過產(chǎn)生的溶劑的類型和比例進(jìn)行區(qū)分。拜氏梭菌(異名為丁酸桿菌(C.k^;/z'cwm))產(chǎn)生與丙酮丁醇梭菌大致相同比例的溶劑，且在一些拜氏梭菌菌抹中產(chǎn)生異丙酉事而不是丙酮(George,H.A.等，Acetone,isopropanol,andbutanolproductionbyC7oWnW謂6ez).e簡'cA:"(syn.C7oWnWwm6w^/i'cwm)andC7o5^n't/Zwm.Jwn2w"6w(yn.cwm.Appl.Environ,Microbiol.45:1160-1163,1983)。糖基丁醇梭菌是通過糖分解(saccharolytic)工業(yè)菌林的遺傳和生理特性鑒定的梭菌屬的種的建議名稱(Keis,S.等,EmendeddescriptionsofClostridiumacetobutylicum,andClostridiumbeijerinckiianddescriptionsofClostridiumsaccharoperbutylacetonicumsp.nov.andClostridiumsaccharobutylicumsp.nov.Intl.J.System.Evol.Microbio.51:2095-2103,2001)。金黃丁酸梭菌(Ca"ra""^(yn'cwm)除丁醇外還產(chǎn)生丙酮和異丙醇(George,H.A.，同上)。假破傷風(fēng)梭菌(C.^A^omor;/mw)產(chǎn)生幾乎等摩爾量的丁醇和乙醇，<旦不產(chǎn)生其它溶劑(Gottwald,M.等，F(xiàn)ormationofn隱butanolfromD-glucosebystrainsof"C7c^rW謹(jǐn)Wanomorp/mm"group.Appl.Environ.Microbio.48:573-576，1984)。丙酮丁醇梭菌批培養(yǎng)物的溶劑產(chǎn)生通過2個(gè)階段進(jìn)行。在指數(shù)生長階段發(fā)生的稱為成酸階段的第一階段中，丙酮丁醇梭菌產(chǎn)生氫、二氧化碳、乙酸和丁酸。培養(yǎng)基中酸的積累使pH值降低。當(dāng)培養(yǎng)基中丁酸的未離解濃度達(dá)到約9mM時(shí)發(fā)生向第二個(gè)階段或成溶劑階萃殳的過〉度(Hiisemann，M.H.W.和E.T.P叩outsakis.SolventogenesisinC7oWnW畫ac"o6w(y/Zc訓(xùn)fermentationsrelatedtocarboxylicacidandprotonconcentrations.Biotechnol.Bioeng.32:843-852，1988)。這一階段在丙酮丁醇梭菌達(dá)到早靜止期時(shí)開始(Davies,R.和StephensonM.Studiesontheacetone-butylalcoholfermentation.I.NutritionalandotherfactorsinvolvedinthepreparationofactivesuspensionsofC7ostrW畫Biochem.J.35:1320-1331,1941)。在這里，丙酮、丁醇和乙醇伴隨著酸的重吸收和碳水化合物的不斷消耗而合成，從而培養(yǎng)物的pH值升高。氫和二氧化碳連續(xù)生成。在丙酮丁醇梭菌以批培養(yǎng)生長時(shí)，取決于稀釋率和培養(yǎng)基組成，可以產(chǎn)生不同比例的酸和溶劑(美國專利第5,063,156號)。添加乙酸或丙酸不影響成溶劑的開始，但會增加產(chǎn)生的溶劑的總濃度(Hiisemann,M.H.W.和E.T.Papoutsakis.SolventogenesisinC7oWnW訓(xùn)ac^o6w一c畫fermentationsrelatedtocarboxylicacidandprotonconcentrations.Biotechnol.Bioeng.32:843-852,1988)。也可以通過用CO氣體攪動培養(yǎng)基改變?nèi)軇┊a(chǎn)量。這引起丁酸產(chǎn)生途徑的逆轉(zhuǎn)，導(dǎo)致丁酸的攝取而使其不能隨后提供作為丙酮產(chǎn)生的底物(Hartmanis,M.G.N.等，UptakeandactivationofacetateandbutyrateinC7oWnWwwac"o6w(y/Zcwm.Appl.Microbiol.Biotechnol.20:66-71,1984)。改變發(fā)酵溫度也會影響丁醇和溶劑的產(chǎn)量。在用三種不同的產(chǎn)溶劑菌抹進(jìn)行的批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，溶劑產(chǎn)量在30。C和33。C下相當(dāng)穩(wěn)定地保持在31%左右，但在37。C時(shí)下降到23-25%(McCutchan,W.N.矛口Hickey，R.J.Thebutanol-acetonefermentations,Ind.Fement.1:347-388，1954)。在最近使用丙酮丁醇梭菌NCIB852的研究中也得到類似的結(jié)果，溶劑產(chǎn)量從25。C時(shí)的29%減少到40。C時(shí)的24%,盡管發(fā)酵時(shí)間隨溫度升高而縮短(McNeil,B.和Kristiansen,B.,EffectoftemperatureupongrowthrateandsolventproductioninbatchculturesofC7oWnWwmace,o6w(y/Zcwm.BiotechLett.7:499-502，1985)。溶劑產(chǎn)量的下降明顯反映了丙酮產(chǎn)生的減少，而丁醇的產(chǎn)量卻不受影響。在連續(xù)培養(yǎng)中，丙酮丁醇梭菌可以保持在三個(gè)不同的穩(wěn)定代謝狀態(tài)中。中性pH值下葡萄糖生長的成酸狀態(tài)，低pH值下以葡萄糖生長的成溶劑狀態(tài)和在中性pH值和高NAD(P)H供應(yīng)條件下生長的成醇狀態(tài)(Girbal，L.等,RegulationofmetabolicshiftsinC7oWnWwm//函ATCC824,FEMSMicrobiol.Rev.17:287-297，1995)。成酸培養(yǎng)物隨著pH值的降低、乙酸和/或丁酸濃度的降低而轉(zhuǎn)變?yōu)槌扇軇顟B(tài)，具有生長限制量的磷酸或硫酸，但具有充足的氮源及碳源(Bahl,H.Andersch，W和GottschalkG.ContinuousproductionofacetoneandbutanolbyC7oW"Wwmac"o6w一.cwminatwo-stagephosphatelimitedchemostat.Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.15:201-205,1982;Bahl，H.和GottschalkG.,ParametersaffectingsolventproductionbyC7oWnWwmac"oZw一'cwmincontinuousculture,p.215-223.WangD.I.C.和Scott.C.D.(ed.),BiotechnologyandbioengineeringSymposiumno.14,SixthSymposiumonBiotechnologyforFuelsandChemicals,JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,1984)。成溶劑的生理信號誘導(dǎo)所有催化溶劑產(chǎn)生的末端酶的生物合成，同時(shí)伴隨著成酸酶的活性的下降(Andersch,W.,Hubert,B.和Gottschalk，G.Levelofenzymesinvolvedinacetate,butyrate,acetoneandbutanolformationbyC7oWnW/wmac"o6w(y/Zc調(diào).Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.18:327-332,1983.Rogers,P.GeneticsandbiochemistryofC7oj/廠W謂relevanttodevelopmentoffermentationprocesses.Adv.Appl.Microbiol.31:1-60，1986)。2.6作為成溶劑選擇和工程的模型的丙酮丁醇梭菌可以用常規(guī)的突變方法處理丙酮丁醇梭菌，比如使用烷基化劑，如甲基磺酸乙酯(EMS)、N-甲基N，-硝基N-亞硝基胍(NG)、ICR191、亞硝酸、硝基p查啉-N-氧化物和三乙撐三聚氰酰胺，并通過在較高丁醇濃度下生長、對烯丙醇的抗性或者對纖維素酶、木聚糖酶活或淀粉酶活性進(jìn)行選擇。通過這此策略，已經(jīng)識別了調(diào)控突變體，以及溶劑產(chǎn)生增加、具有對高溶劑濃度的更高耐性、酸產(chǎn)生下降和具有更高的淀粉樣(amolytic)活性的突變體(美國專利第4,757,010號；Rogers,P.和Palosaari,N.C7oW廠Wwwace/o6啤/z'cwmmutantsthatproducebutyraldehydeandalteredquantitiesofsolvents.Appl.Env.Microbio.53:2761-2766,1987)。探索低G+C革蘭氏陽性生物體(如丙酮丁醇梭菌)中同源基因的過表達(dá)和異源基因的表達(dá)的研究落后于高G+C生物體(如大腸桿菌)的研究，因?yàn)榈虶+C革蘭氏陽性菌在密碼子選擇、氨基酸使用和堿基含量在遺傳上都截然不同。因此，他們需要設(shè)計(jì)新的載體并排列和使用合適的調(diào)控序列(丙酮丁醇梭菌的GC含量是29%,而大腸桿菌的GC含量是50。/。)。這些已經(jīng)達(dá)到，且低G+C革蘭氏陽性生利第6,737,245號；轉(zhuǎn)座子，美國專利第7,056,728號；噬菌體，ReidS.J.等，TransformationofC7oW"Wwmace^6w(y/z'cwmProtoplastswithBacteriophageDNA.ApplEnvironMicrobiol.1983Jan;45(l):305-307)。因此，對于本發(fā)明方法，丙酮丁醇梭菌是很有吸引力的宿主生物體。2.7丙酮丁醇梭菌中的丁醇產(chǎn)生對于丙酮丁醇梭菌的丁醇產(chǎn)生，用于監(jiān)測丁醇生產(chǎn)率的最合適的酶是W/^(CAC3298),醛-醇脫氫酶(圖1,步驟R);CAC3392,NADH依賴性丁醇脫氬酶(圖1，步驟R);(CAP0059),醇脫氫酶(圖l,步驟R)和(CAP0162),醇脫氫酶/乙醛脫氫酶(圖1,步驟10)。在下面正向信號酶的章節(jié)中會詳細(xì)描述它們的屬性。2.7.1丁酸(丁醇產(chǎn)生)途徑對于丁醇產(chǎn)生，葡萄糖首先通過糖酵解方式轉(zhuǎn)化為丙酮酸。甘油醛-3-磷酸脫氫酶催化最后的酶步驟-甘油醛-3-磷酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸(圖1,步驟A)。接下來，丙酮酸-鐵氧還蛋白氧化還原酶將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，同時(shí)失去一分子二氧化碳(圖1，步驟B)。然后兩個(gè)乙酰輔酶A分子由乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶0/n7，(好u解酶),CAP0078;和CAC2873)轉(zhuǎn)化為乙酰乙酰輔酶A,同時(shí)產(chǎn)生一個(gè)游離的輔酶A基團(tuán)(圖1，步驟I)。乙酰乙酰輔酶A通過3-羥基丁酰輔酶A脫氬酶(/^《CAC2708)轉(zhuǎn)化為3-羥基丁酰輔酶A((3-羥基丁酰輔酶A),此過程需要NADH氧化為NAD+(圖1,步驟J)。然后3-羥基丁酰輔酶A由巴豆酸酶(cw,CAC2712)轉(zhuǎn)換為巴豆酰輔酶A,同時(shí)失去一分子水(圖1,步驟K)。丁酰輔酶A脫氫酶0^/,CAC2711)將巴豆酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丁酰輔酶A，同時(shí)NADH氧化為NAD+(圖1,步驟L)。丁醛脫氬酶(^//^,CAP0035,和^/&/,CAP0162)和NADH將丁酰輔酶A還原成丁醛(圖1,步驟Q)。最后，丁搭由脫氬酶—e，CAP0035,涵e7，CAP0162,禍，CAP0059,涵ACAC3299,W/lS,CAC3298和CAC3392)和NADPH轉(zhuǎn)化為丁醇(圖1，步驟R)。成溶劑的開始階段，丁酸和乙酸被丙酮丁醇梭菌重吸收并由"/a/c《/Z)復(fù)合體(乙酰乙酰輔酶A:乙酸/丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶)分別轉(zhuǎn)化為丁酰輔酶A和乙酰輔酶A(圖1，步驟S)。然后這些中間體可以流向丁基途徑。成溶劑開始時(shí)丁醇并不終止，因?yàn)槎□?磷酸轉(zhuǎn)化為丁酸是丙酮丁醇梭菌可用的提供ATP的幾種機(jī)制之一(圖1，步驟N)。在成溶劑階段中產(chǎn)生的丁醇被"/fl/c砂復(fù)合體(乙酰乙酰輔酶A:乙酸/丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶)重循環(huán)為丁酰輔酶A(圖1,步驟S)。2.7.2提供丁醇產(chǎn)生的正反饋的信號酶可以使用操縱子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控核苷酸序列來監(jiān)測成溶劑的開始，so/操縱子是在丙酮丁醇梭菌ATCC824的pSOLl巨大質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)的。sol操縱子控制三個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，它們分別是"c/ZlE",CAP0035(醛-醇脫氬酶)，"/4，CAPO163(A)和,，CAP0164(B)(丁酸-乙酰乙酸輔酶A-轉(zhuǎn)移酶亞基A和B),這些基因的表達(dá)在成溶劑開始時(shí)增加大約10倍(Feustel,L.等，CharacterizationanddevelopmentoftworeportergenesystemsforC7oWW畫,totoy/Zc亂Appl.Environ.Microbiol.70:798-803,2004)。pSOLl巨大質(zhì)粒上還有"&,CAP0165(乙酰乙酸脫羧酶)，其轉(zhuǎn)錄在成溶劑起始時(shí)也上升大約10倍(Feustel，L.等，同上)。利用操縱子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控核苷酸序列對于監(jiān)測溶劑產(chǎn)生的后期階段不是很理想的，因?yàn)閊//le"(丁醛/醇脫氫酶)的基因產(chǎn)物只在成溶劑的起始過程中是有活性的。在溶劑合成的后面部分中，另一醛-醇脫氫酶^Z/lS(在其自身單順反子操縱子上發(fā)現(xiàn))替代發(fā)揮作用(Petersen,D.J.等,Molecularcloningofanalcohol(butanol)dehydrogenasegeneclusterfromC/oWnWwmace,o6啤/ZctwzATCC824.J.Bacteriol.173:1831-1834，1991;Sauer,U.和P.Diirre.DifferentialinductionofgenesrelatedtosolventformationduringtheshiftfromacidogenesistosolventogenesisincontinuouscultureofCYoWrW謂/Zc亂FEMSMicrobiol.Lett.125:115-120,1995)。因此，腿5操縱子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控核苷酸序列可能是與報(bào)道基因連接的更合適的序列，特別因?yàn)?c/;^編碼的醛-醇脫氫酶被認(rèn)為是丁醇高產(chǎn)量的原因(Feustel，L.等，同上)。其他用于監(jiān)測丁醇產(chǎn)生的目標(biāo)轉(zhuǎn)錄調(diào)控核普酸序列包括CAC3392(NADH依賴性丁醇脫氫酶)和CAP0059(醇脫氫酶)，因?yàn)檫@些基因編碼丁醇產(chǎn)生的最后步驟(丁醛還原為丁醇)中使用的酶。此外，因?yàn)槎是距丁醇一步的酶促步驟且不存在丁醛的重循環(huán)機(jī)制，所以也可以使用(CAP0162,醇脫氬酶/乙醛脫氫酶)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控核苷酸序列。然而，CAC3299(NADH依賴性丁醇脫氫酶A)不是監(jiān)測丁醇產(chǎn)生的合適選擇，因?yàn)樗谥笖?shù)增長期中表達(dá)，且一旦培養(yǎng)物的pH值開始下降，它就達(dá)到最大(Feustel等，同上)。2.7.3利用分支點(diǎn)上/下游的酶作為信號酶對于丙酮丁醇梭菌中的丁醇產(chǎn)生，在向竟?fàn)幫緩酵七M(jìn)的酶已經(jīng)被刪除或下調(diào)的情況下，緊接著分支點(diǎn)上/下游的酶可以用作信號酶。例如，如果丙酮產(chǎn)生途徑中的酶(如乙酰乙酸脫羧酶)被刪除(圖1,步驟T),那么緊挨著此分支點(diǎn)上游的酶(乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶)(圖l，步驟I)可以用于監(jiān)測丁醇產(chǎn)生。類似地，此分支點(diǎn)下游的酶(3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶、巴豆酸酶和丁酰輔酶A脫氫酶)(圖1,步驟J、K、L)也可以被用來監(jiān)測丁醇產(chǎn)生。2.7.4提供丁醇產(chǎn)生的負(fù)反饋的信號酶沿包括磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶(pA，CAC3076)和丁酸激酶(/n/A:,CAC1660和buk,CAC3075)(圖1,步驟M和N)的丁酸途徑的酶活性給出了丁酰輔酶A底物偏離丁基途徑的信號。這些酶中之一的轉(zhuǎn)錄調(diào)控核酸序列可以與報(bào)道基因連接以表明丁醇產(chǎn)生可能下降。假定需要通過丁醇途徑在成溶劑過程中連續(xù)生成ATP,這些轉(zhuǎn)錄調(diào)控核苷酸序列的使用可能不是最理想的。其它幾個(gè)竟?fàn)幫緩娇梢詫⒅虚g體抽離丁基途徑，且編碼相應(yīng)酶的基因可作為監(jiān)測丁醇產(chǎn)生的有用的轉(zhuǎn)錄調(diào)控核苷酸序列。乳酸脫氫酶可以將丙酮酸還原成乳酸(圖l,步驟U)。除了在鐵限制和高pH值條件下外，丙酮丁醇梭菌中的乳酸產(chǎn)生是極少的，所以監(jiān)測丙酮酸旁路可能是不必要的(Bahl，H.等，NutritionalfactoraffectingtheratioofsolventsproducedbyClostridiumacetobutylicum.Appl.Environ.Microbiol.52:169-172,1986)。丙酮酸脫羧酶可以將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醛(圖1,步驟U)。乙酰輔酶A可以^皮抽出以生成乙酸(圖1,步驟G和H)。乙酰輔酶A也可以被抽出以生成乙醇(圖1，步驟O和P)。利用乙酰乙酰輔酶A:乙酸/丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶和乙酰乙酸脫羧酶可以4巴乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙酮(圖1,步驟S和T)。2.7.5多重信號酶的使用在用于丁醇產(chǎn)生的丙酮丁醇梭菌批培養(yǎng)中，可以將幾個(gè)使用帶有不同發(fā)射光譜的熒光素酶的構(gòu)建體引入各種不同途徑中以顯示發(fā)酵的進(jìn)程。使用磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶CAC1742,圖1,步驟G)、乙酸激酶(wL4,CAC1743,圖1,步驟H)、磷酸丁酰基轉(zhuǎn)移酶(pA，CAC3076,圖1,步驟M)或丁酸激酶(CAC1660和buk,CAC3075,圖1，步驟N)的調(diào)控序列的構(gòu)建體為培養(yǎng)物的成酸階段的起始和活力提供信號。然后這一構(gòu)建體的信號強(qiáng)度可以用來保持培養(yǎng)物以獲得理想的酸濃度和細(xì)胞量。這一構(gòu)建體信號強(qiáng)度的下降伴隨著利用丁基途徑中酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控核苷酸序列的構(gòu)建體信號的出現(xiàn)，表明向成溶劑的過渡正在發(fā)生。如果需要，還可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件來延遲或促進(jìn)這種過渡。一旦培養(yǎng)物處于成溶劑階段，利用丁基酶轉(zhuǎn)錄調(diào)控核苷酸序列的構(gòu)建體的信號強(qiáng)度隨后可以用來監(jiān)測和控制培養(yǎng)物的這個(gè)階段以獲得最大的溶劑產(chǎn)生?；蛘?，在用于丁醇產(chǎn)生的丙酮丁醇梭菌批培養(yǎng)中，可以利用帶有相同熒光素酶的幾個(gè)構(gòu)建體。這種方式是可能的，因?yàn)闊晒馑孛傅妮椛涔庾V是pH依賴性的，在酸性環(huán)境中發(fā)生光譜紅移(Feustel，L.制的酶(如磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶(/A,CAC3076，圖1，步驟M))的轉(zhuǎn)錄調(diào)控核普酸序列，將在成酸階段開始時(shí)觀察到熒光素酶信號。隨著pH值的降低，發(fā)射峰將從pH6.8的560mm平移到約pH5的617nm。如果第二構(gòu)建體使用在成溶劑開始后表達(dá)的基因(如^//L8)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控核苷酸序列，那么隨著/A構(gòu)建體產(chǎn)生的熒光素酶衰變或失活，將出現(xiàn)信號強(qiáng)度的下降和發(fā)射光譜的平移。然后，隨著成溶劑的繼續(xù)，出現(xiàn)熒光素酶信號強(qiáng)度的增加，同時(shí)在中性pH值下觀察到發(fā)射峰的連續(xù)回移。在用于丁醇產(chǎn)生的丙酮丁醇梭菌連續(xù)培養(yǎng)物中，可以將幾個(gè)使用帶有不同發(fā)射光i普的熒光素酶的構(gòu)建體引入各種不同途徑中以顯示發(fā)酵的狀態(tài)。來自利用磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(p&,CAC1742，圖1,步驟G)、乙酸激酶OL4，CAC1743，圖1,步驟H)、磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶(p^，CAC3076，圖1,步驟M)或丁酸激酶(^^,CAC1660和6i，CAC3075,圖1,步驟N)的調(diào)控序列的構(gòu)建體信號的出現(xiàn)表明培養(yǎng)物的參數(shù)正偏離將培養(yǎng)物維持在成溶劑階段所需要的參數(shù)。然后可以采取行動來調(diào)整培養(yǎng)條件使培養(yǎng)物返回到成溶劑階段。因?yàn)槌掷m(xù)地需要通過丁酸激酶活性的ATP合成，利用來自磷酸丁酰基轉(zhuǎn)移酶(ptb)或丁酸激酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列可能不是最理想。表1選擇的中參與成酸或成溶劑的丙酮丁醇梭菌酶<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>2.8丁酸途徑對于丙酮丁醇梭菌丁酸產(chǎn)生，最適合于監(jiān)測丁酸生產(chǎn)率的酶是乙酸激酶(acL4，CAC1743，圖1,步驟H)和丁酸激酶0^:CAC1660和6w&CAC3075，圖1，步驟N)。它們的性質(zhì)將在下面正向信號酶的章節(jié)中更詳細(xì)地闡述。丁酸產(chǎn)生途徑如下。首先葡萄糖通過糖酵解轉(zhuǎn)化為丙酮酸。甘油醛-3-磷酸脫氫酶催化最后的酶促步驟-甘油醛-3-磷酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸(圖1，步驟A)。接下來，丙酮酸-鐵氧還蛋白氧化還原酶將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A,同時(shí)失去一分子二氧化碳(圖1，步驟B)。然后兩個(gè)乙酰輔酶A分子由乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶(7h7,(石危解酶)，CAP0078，和CAC2873，圖1，步驟I)縮合為乙酰乙酰輔酶A,同時(shí)產(chǎn)生一個(gè)游離的輔酶A基團(tuán)。3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶(M^/,CAC2708，圖1，步驟J^巴乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為3-羥基丁酰輔酶A(P-羥基丁酰輔酶A),此過程需要把NADH氧化為NAD+。然后3-羥基丁酰輔酶A由巴豆酸酶(cr,，CAC2712,圖l,步驟K)轉(zhuǎn)化為巴豆酰輔酶A，同時(shí)失去一分子水。丁酰輔酶A脫氫酶(6c《CAC2711，圖1,步驟L)將巴豆酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丁酰輔酶A,同時(shí)NADH氧化為NAD+。丁酰輔酶A被磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶(/7^,CAC3076,圖1,步驟M)磷酸化以生成丁?；姿帷Ｗ詈蠖□；姿嵊啥∷峒っ?CAC1660和6mA:，CAC3075，圖l,步驟N)轉(zhuǎn)化成丁酸，同時(shí)生成一分子ATP。2.8.1.為丁酸產(chǎn)生提供正反饋的信號酶在成酸過程中，編碼負(fù)責(zé)分別催化乙酸和丁酸產(chǎn)生的最后步驟的酶(乙酸激酶(ad圖1,步驟H)和丁酸激酶fZwk，圖1，步驟N))的基因的表達(dá)是高的(Durre,P.等,TranscriptionalregulationofsolventogenesisinC7os^nWww"c^o6w(y//cww.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.4:295-300，2002)。因此，它們的轉(zhuǎn)錄調(diào)控核香酸序列為構(gòu)建信號酶構(gòu)建體的理想選擇。此外，由于乙酸激酶和丁酸激酶各自的底物(乙酰-磷酸和丁酰-磷酸)不是竟?fàn)幏磻?yīng)的底物，生成這些中間體化合物的酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控核苷酸序列也可以用來監(jiān)測成酸狀態(tài)，特別是由于這些酶(磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(^a,圖1,步驟G)和磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶(pA,圖1,步驟M))在成酸過程中也是高表達(dá)的。2.8.2為丁酸產(chǎn)生提供負(fù)反饋的信號酶幾個(gè)竟?fàn)幫緩侥軌驅(qū)⒅虚g體抽離丁酸途徑。乳酸脫氫酶可以把丙酮酸還原成乳酸(圖l,步驟U)。丙酮酸脫羧酶可以4巴丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙醛(圖l,步驟U)。由此，將丙酮酸抽離以形成乙醇。乙酰輔酶A可以:帔抽離而生成乙酸(圖1,步驟G和H)。乙酰輔酶A還可以被抽離以生成乙醇(圖1，步驟O和P)。乙酰乙酰-輔酶A:乙酸/丁酸-輔酶A轉(zhuǎn)移酶和乙酰乙酸脫羧酶可以將乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙酮(圖1,步驟S和T)。丁酰輔酶A也可以被分流以產(chǎn)生丁醇(圖1，步驟Q和R)。此外，丁酸可以#1乙酰乙酰-輔酶A:乙酸/丁酸-輔酶A轉(zhuǎn)移酶重循環(huán)為丁酰-輔酶A,并由此分流到丁醇合成(圖1,步驟S)。用于構(gòu)建體中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控核苷酸序列的兩個(gè)最合適的來源是乙酰乙酰-輔酶A:乙酸/丁酸-輔酶A轉(zhuǎn)移酶和丁醛脫氫酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控核苷酸序列。乙酰乙酰-輔酶A:乙酸/丁酸-輔酶A轉(zhuǎn)移酶(圖1,步驟S)把重吸收的丁酸轉(zhuǎn)化成隨后可以分流到丁基途徑的丁酰-輔酶A。丁醛脫氬酶(圖l，步驟R)是丁基途徑中的第一個(gè)酶，且將丁酰-輔酶A還原成丁醛-丁醇的中間前體。轉(zhuǎn)錄調(diào)控核苷酸序列的替代來源是將丁酰-輔酶A還原成丁醛的丁酰-輔酶A脫氫酶(圖1，步驟Q)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控核苷酸序列，丁醛是距丁醇一步的底物且不能被抽離以竟?fàn)幚没蛟傺h(huán)。2.9乙醇合成途徑另一實(shí)施方式中，操作者利用本發(fā)明的方法調(diào)節(jié)乙醇的產(chǎn)生。對于乙醇產(chǎn)生，葡萄糖首先通過糖酵解轉(zhuǎn)化為丙酮酸。甘油醛-3-磷酸脫氬酶催化最后的酶促步驟-甘油醛-3-磷酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸(圖1,步驟A)。由于梭菌是極少數(shù)擁有丙酮酸脫羧作用的細(xì)菌屬中的一個(gè)，由此丙酮酸可以流向兩個(gè)分離的成乙醇途徑。在一個(gè)途徑中，通過丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰-輔酶A,同時(shí)失去一分子二氧化碳(圖1,步驟B)。然后乙酰-輔酶A被乙醛脫氫酶(圖l，步驟0)和NADH轉(zhuǎn)化成乙醛。最后，乙醛被脫氫酶Oi/ls,CAC3298;Z^/l4,CAC3299及可能的c^/^7,CAP0162和CAP0035，圖1，步驟P)和NADH還原成乙醇。在另一條途徑中，丙酮酸被丙酮酸脫羧酶脫羧(圖1，步驟U)而形成乙醛，然后乙醛被脫氫酶(^Z/lS，CAC3298;M/l4,CAC3299;及可能的a^e厶CAP0162和CAP0035,圖l，步驟P)和NADH還原成乙醇。2.9.1為乙醇產(chǎn)生提供正反饋的信號酶可以通過設(shè)計(jì)具有與報(bào)道基因連接的脫氫酶轉(zhuǎn)錄調(diào)控核苷酸序列的構(gòu)建體而直接監(jiān)測乙醇產(chǎn)生。盡管這些酶是成乙醇途徑中最后的酶且對于乙醛中間體沒有其它竟?fàn)幱猛?，但由于脫氫酶也用于丁基途徑中以將丁醛還原為丁醇，這種方法可能提供與乙醇的實(shí)際產(chǎn)生不成比例的信號?；蛘撸部梢酝ㄟ^利用各自使用相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控核苷酸序列的兩個(gè)構(gòu)建體同時(shí)監(jiān)測丙酮酸脫羧酶和乙酪活性來更好地測量乙醇產(chǎn)生。2.9.2為乙醇產(chǎn)生提供負(fù)反饋的信號酶幾個(gè)竟?fàn)幫緩娇梢詫⒅虚g體抽離乙醇途徑。乳酸脫氫酶可以將丙酮酸還原為乳酸(圖1，步驟U)。乙酰-輔酶A也可以;陂抽離以生成乙酸(圖l，步驟G和H)。乙酰-輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶也可以把乙酰-輔酶A轉(zhuǎn)化為乙酰乙酰-輔酶A(圖1,步驟I)。從這里，乙酰-輔酶A可被轉(zhuǎn)化成丙酮(圖1，步驟S和T)、丁酸(圖1，步驟J、K、L、M和N)或丁醇(圖1，步驟J、K、L、Q和R)?？梢杂昧姿徂D(zhuǎn)乙酰酶(圖1,步驟G)和乙酰-輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶(圖1，步驟I)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控核苷酸序列來設(shè)計(jì)信號酶構(gòu)建體，以監(jiān)測乙酰輔酶A底物與成乙醇途徑的偏離。除非培養(yǎng)條件為鐵限制或高pH值，可能沒有必要監(jiān)測丙酮酸旁路。2.10丙酮途徑在另一實(shí)施方式中，操作者使用本方明的方法調(diào)節(jié)丙酮的產(chǎn)生。對于丙酮的產(chǎn)生，葡萄糖首先通過糖酵解方式轉(zhuǎn)化成丙酮酸。甘油醛-3-磷酸脫氬酶催化最后的酶促步驟-甘油醛-3-磷酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸(圖1,步驟A)。接下來，通過丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰-輔酶A,同時(shí)失去一分子二氧化碳(圖l，步驟B)。然后，兩個(gè)乙酰輔酶A分子通過乙酰-輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶(A〖/,(碌l解酶)，CAP0078,和CAC2873)縮合成乙酰乙酰-輔酶A,并產(chǎn)生一個(gè)游離的輔酶A基團(tuán)(圖1,步驟I)。乙酰乙酰-輔酶A通過乙酰乙酰-輔酶A:乙酸/丁酸CoA轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化為乙酰乙酸(圖1,步驟S)。乙酰乙酸通過乙酰乙酸脫羧酶轉(zhuǎn)化為丙酮，并產(chǎn)生一分子的二氧化碳(圖1，步驟T)。2.10.1為丙酮產(chǎn)生提供正反饋的信號酶在pSOLl巨大質(zhì)粒上存在"&,CAP0165(乙酰乙酸脫羧酶，圖1，步驟T)，其由自己的啟動子沿w/操縱子的相反方向轉(zhuǎn)錄。乙酰乙酸脫羧酶的轉(zhuǎn)錄發(fā)生在成溶劑階段起始時(shí)且酶活性在整個(gè)成劑階段都是穩(wěn)定的(Gerischer，U.和Durre，P.mRNAanalysisoftheac/cgeneregionofC7oWnW謂duringtheshifttosolventogenesis.J.Bact.174:426-433，1992)。此外，乙酰乙酸脫羧酶是丙酮途徑中最后的酶。因此，利用at/c的轉(zhuǎn)錄調(diào)控核苷酸序列來監(jiān)測丙酮產(chǎn)生是理想的。對于批培養(yǎng)的丙酮產(chǎn)生，乙酰乙酰-輔酶A:乙酸/丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶的亞基可能是有用的，因?yàn)樗鼘⒊伤犭A段產(chǎn)生的終產(chǎn)物乙酸轉(zhuǎn)化成乙酰-輔酶A,乙酰-輔酶A可以作為乙酰-輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶的底物以生成乙酰乙酰-輔酶A。而后，乙酰乙酰-輔酶A:乙酸/丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶可以將乙酰乙酰-輔酶A轉(zhuǎn)化成乙酰乙酸-丙酮合成途徑中最后的中間體(圖1,步驟S、I、S、T)。類似地，在連續(xù)成溶劑培養(yǎng)中，乙酰乙酰-輔酶A:乙酸/丁酸CoA轉(zhuǎn)移酶的活性可以提供乙酰乙酸產(chǎn)生率的信息，并因此間接提供丙酮產(chǎn)生率的信息。2.10.2為丙酮生產(chǎn)提供負(fù)反饋的信號酶多個(gè)竟?fàn)幫緩娇梢詫⒅虚g體抽離丙酮途徑。乳酸脫氫酶可以將丙酮酸還原成乳酸(圖1，步驟U)。不過，這一過程很少出現(xiàn)，除非是在鐵限制和高pH值條件下。乙酰-輔酶A可以被抽離以生成乙酸(圖1,步驟G和H)。乙酰-輔酶A還可以;帔抽離以生成乙醇(圖1，步驟O和P)。被乙酰乙酸脫羧酶轉(zhuǎn)化成丙酮的底物乙酰乙酰-輔酶A還可以#皮乙酰乙酰-輔酶A:乙酸/丁酸CoA轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化成丁酰輔酶A-產(chǎn)生丁酸或丁醇的中間體(圖1，步驟J、K、L,然后分別朝向M和N或Q和R的分支點(diǎn))。可利用/人乙酰乙酰-輔酶A進(jìn)一步沿著丁酸/丁基途徑的酶的活性，因?yàn)檫@將提供無法用于產(chǎn)生丙酮的中間體和目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)生的信息(圖1,步驟J、K、L、M、N、Q和R)。利用丁酸/丁基途徑中分支點(diǎn)前的酶(3-羥基丁酰-輔酶A、巴豆酸酶和丁酰-輔酶A脫氬酶(圖1，步驟J、K和L))可以^是供所有時(shí)間(成酸和成溶劑)有關(guān)底物分流的信息，這與分支點(diǎn)之后的酶(圖l，步驟M、N、Q和R)相反，分支點(diǎn)之后的酶提供關(guān)于培養(yǎng)中特定發(fā)酵階段的信息。因此，使用3-羥基丁酰-輔酶A、巴豆酸酶和丁酰輔酶A脫氫酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控核苷酸序列是優(yōu)選的。應(yīng)該記住的是，丁酸可以被乙酰乙酰-輔酶A:乙酸/丁酸CoA轉(zhuǎn)移酶重循環(huán)為乙酰乙酸，其可以作為產(chǎn)生丙酮的底物。因此，基于羥基丁酰-輔酶A、巴豆酸酶和丁酰輔酶A脫氬酶、；粦酸轉(zhuǎn)丁酰酶和丁酸激酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控核苷酸序列的信號酶可能提供太高的信號(圖1，步驟J、K、L、M和N)。2.11其他微生物的成溶劑成乙醇有機(jī)體，如運(yùn)動發(fā)酵單胞菌和釀酒酵母，將一分子葡萄糖發(fā)酵成兩分子乙醇和兩分子二氧化碳。這需要兩個(gè)酶促步驟。首先丙酮酸脫羧酶將丙酮酸裂解為乙醛和二氧化碳。然后乙醇脫氫酶通過將氫等價(jià)物從NADH傳遞給乙醛而產(chǎn)生NAD+，由此產(chǎn)生乙醇。運(yùn)動發(fā)酵單胞菌是在植物汁液和蜂蜜中常見的細(xì)菌，其依靠恩特納-杜多羅夫(Entner-Doudoroff)途徑作為發(fā)酵途徑。這一較短途徑中每葡萄糖分子只產(chǎn)生一個(gè)ATP。運(yùn)動發(fā)酵單胞菌擁有兩個(gè)醇脫氫酶的同工酶，其在發(fā)酵過程中催化乙醛還原為乙醇，伴隨著NADH氧化成NAD+。釀酒酵母的乙醇產(chǎn)生是眾所周知的，并由每分子的葡萄糖凈生產(chǎn)兩分子的ATP。運(yùn)動發(fā)酵單胞菌和釀酒酵母都可作為其他微生物中產(chǎn)生乙醇的異源基因的來源。2.11.1大腸桿菌的溶劑合成大腸桿菌天然地不具有丙酮酸脫羧酶，因此當(dāng)它在厭氧條件下生長時(shí)，與混合酸一起生成最少的乙醇(25mM葡萄糖上發(fā)酵生長產(chǎn)生6.5mM乙醇、8.2mM乙酸、6.5mM乳酸、0.5mM琥詢酉臾以及約lmM曱酸，剩余10.4mM殘留葡萄糖)(Brau&Sahm(1986a)Arch.Microbiol.144:296-301,(1986b)Arch.Microbiol.146:105-110)。當(dāng)由運(yùn)動發(fā)酵單胞菌克隆的編碼醇脫氫酶II(^Z/i^)和丙酮酸脫羧酶(pdc)的基因被引入大腸桿菌中并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)時(shí)，初始濃度為25mM的葡萄糖被完全轉(zhuǎn)化產(chǎn)生最多41.5mM乙醇，而幾乎不形成酸。其他研究人員對這項(xiàng)工作做了詳細(xì)論述(Conway等，(1987a)J.Bacteriol.169:2591-2597;Neale等，(1987)NucleicAcidsRes.15:1752-1761;Ingram和Conway[1988]Appl.Environ.Microbiol.54:397-404;Ingram等，(1987)Appl.Environ.Microbiol.53:2420-2425)。在厭氧和好氧條件下，乙醇產(chǎn)生的程度與運(yùn)動發(fā)酵單胞菌成乙醇基因的表達(dá)水平直接相關(guān)。因此，使用適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄調(diào)控核苷酸序列可以設(shè)計(jì)相當(dāng)于成乙醇異源構(gòu)建體的信號酶構(gòu)建體，然后用于保持培養(yǎng)物以提高乙醇的生產(chǎn)率和數(shù)量。該技術(shù)并不局限于大腸桿菌，因?yàn)殡S后的研究表明，這一方法可以一般地應(yīng)用于另夕卜兩個(gè)腸道細(xì)菌菊歐文氏菌(五nWm'ac/^，aw^emO和植生克雷伯菌C^7efeZe〃ap/cm"co/a)中以提高從己糖、戊糖和蔗糖混合物產(chǎn)生乙醇的產(chǎn)量(Tolan和Finn.Appl.Environ.Microbiol.53:2033-2038,2039-2044,1987;Beall等，1993;Ingram和Conway,1988;Wood和Ingram,1992)。2.12合成途徑合成途徑一詞包括產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物(也稱為天然產(chǎn)物，如脂肪族、芳香族和雜芳族有機(jī)酸、生物堿、薛類化合物、聚酮類、酚類、環(huán)烯醚萜類、類固醇類、皂戒類、肽類、揮發(fā)油、樹脂和香脂)的天然的、預(yù)先存在的途徑。此外，合成途徑還包括通過遺傳工程、細(xì)胞融合、接合或其他手段全部或部分引入到有4幾體中的途徑。例如，通過利用編碼來自運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的異源蛋白(醇脫氫酶II和丙酮酸脫羧酶)的質(zhì)粒將成乙醇途徑引入大腸桿菌中?；蛘叽竽c桿菌中萜(tepenoid)途徑通過源自植物黃花蒿(JWem^'a朋肌aL)的合成紫穗槐-4,11-二烯合成酶基因的表達(dá)與釀酒酵母的曱羥戊酸類異戊二烯途^至4禺聯(lián)而進(jìn)^亍工禾呈^b(Martin,V.J.J.等,EngineeringamevalonatepathwayinEscherichiacoliforproductionofterpenoids.NatureBiotech.21:796-802,2003;美國專利申請發(fā)明者P·R·康塔格申請人:鈷技術(shù)有限公司