專利名稱：用于定向生物標志物信號放大的熒光方法和材料的制作方法
交叉參考
本申請要求2006年10月6日申請的美國臨時申請No.60/825,615的優(yōu)先權(quán)，該臨時申請在此引入作為參考。
背景技術(shù)：
熒光雜交探針已發(fā)展成為DNA和RNA的序列特異性檢測的一種重要工具。由附加的熒光標記(或染料)產(chǎn)生的信號可被實時監(jiān)測且能提供簡單、快速和可靠的檢測生物靶標和事件的方法。從微陣列和實時PCR到熒光原位雜交(FISH)中都可看到其應(yīng)用的例子。
近期在多發(fā)色團研究領(lǐng)域中，尤其關(guān)于偶聯(lián)的聚合物(CPs)的研究，已經(jīng)突出顯示了這些材料在顯著改善此類方法的檢測靈敏度方面的潛力(Liu and Bazan，Chem.Mater.，2004)。這些材料的集光結(jié)構(gòu)可以制成水溶性的且適合放大多種探針標記的熒光輸出量(參見2003年6月20日申請的美國專利申請No.10/600,286，以及Gaylord，Heeger，and Bazan，Proc.Natl.Acad.Sci.，2002，以上文件均在此完整引入作為參考)。
陽離子CPs尤其顯示出對帶相反電荷的核酸的強親和性，保證了從光激發(fā)的聚合物(集光供體)到熒光標記的探針/靶標對的能量傳遞所需的距離。與直接激發(fā)的單獨染料相比，光輸出量可以增加75倍(Liu andBazan，J.Am.Chem.Soc.，2005)。信號放大無論對同源還是異源檢測形式都會增加很多優(yōu)勢。
這些結(jié)果顯示CPs在核酸診斷領(lǐng)域中很有應(yīng)用前景，在樣品量十分少時尤其如此。但是，已經(jīng)有擴增(或復(fù)制)核酸靶標的方法存在，即PCR。相比之下，在蛋白質(zhì)識別領(lǐng)域中并不存在擴增靶標物質(zhì)的這樣的簡單方法。因此，CP應(yīng)用導(dǎo)致的信號增強在本領(lǐng)域中具有重要意義。
染料標記的抗體在諸如免疫組化、蛋白質(zhì)陣列、ELISA試驗和流式細胞分析等應(yīng)用中常規(guī)用于檢測蛋白質(zhì)靶標。將CP材料整合到這些方法學(xué)中可使這些試驗的性能具有顯著的提升，可達到原先常規(guī)染料無法達到的檢測水平。
發(fā)明內(nèi)容
一般來講，在一個方面，一種測定方法包括提供被懷疑含有靶標生物分子的樣本，提供與信號產(chǎn)生發(fā)色團偶聯(lián)并且能夠與靶標生物分子互相作用的傳感器，提供偶聯(lián)的聚合物，包括但并不局限于
其中該聚合物與傳感器靜電相互作用，并且在激發(fā)時能夠?qū)⒛芰總鬟f至傳感器信號發(fā)色團，在傳感器可結(jié)合至靶標生物分子(如果存在)上的條件下將樣本在溶液中與傳感器和多發(fā)色團接觸，向該樣本施加能夠激發(fā)多發(fā)色團的光源，以及檢測是否從信號發(fā)色團上發(fā)出光來。
在一個實施方式中，R基團是磺酸基團。在另一個實施方式中，傳感器是一種生物分子，例如蛋白質(zhì)、核酸或抗體。
在另一個實施方式中，傳感器可包括與多個信號發(fā)色團偶聯(lián)的多個傳感器，其中多個發(fā)色團中的至少兩個在從多發(fā)色團能量傳遞時能發(fā)射不同波長的光。
一般來講，在另一個方面，提供了一種多發(fā)色團復(fù)合物，其包含偶聯(lián)到至少一種生物分子上的多發(fā)色團。生物分子可包括但并不局限于傳感器生物分子、生物偶聯(lián)物和靶標生物分子。復(fù)合物的多發(fā)色團更進一步地偶聯(lián)至信號發(fā)色團上，且包括下述結(jié)構(gòu)
其中CP1、CP2、CP3和CP4是任選地被取代的偶聯(lián)的聚合物區(qū)段或寡聚結(jié)構(gòu)，它們彼此相同或不同。在一個實施方式中，偶聯(lián)的聚合物是陽離子偶聯(lián)聚合物。在另一種實施方式中，偶聯(lián)的聚合物是陰離子偶聯(lián)聚合物。在一個更進一步的實施方式中，偶聯(lián)的聚合物是電荷中性的偶聯(lián)的聚合物。在一個實施方式中，CP1、CP2、CP3和CP4是芳香族重復(fù)單元，選自苯、萘、蒽、芴、噻吩、呋喃、吡啶和噁二唑，每個任選地被取代，并且其中CP3和CP4可含有一個或多個可通過連接體連接的獨特生物偶聯(lián)位點。
在一個替代的實施方式中，多發(fā)色團包括生物偶聯(lián)位點，該生物偶聯(lián)位點包括但并不局限于馬來酰亞胺、硫醇、琥珀酰亞胺酯(NHS酯)、胺、疊氮化物化學(xué)、羧基/EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亞胺鹽酸鹽、磺基-SMCC(磺基琥珀酰亞胺基4-[N-馬來酰亞胺基甲基]環(huán)己烷-1-羧酸酯)、胺/BMPH(N-[β-馬來酰亞胺基丙酸]酰肼·TFA)、以及磺基-SBED磺基琥珀酰亞胺基[2-6-(生物素酰氨基)-2-(對-疊氮基苯甲酰氨基)-己酰氨基]-乙基-1，3′-二硫代丙酸酯。
復(fù)合物的多發(fā)色團具有如下結(jié)構(gòu)
其中R1是加溶基，包括但并不局限于乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-烷氧基銨鹽和ω-烷氧基磺酸鹽等。
可替代地，在另一個實施方式中，復(fù)合物的多發(fā)色團具有如下結(jié)構(gòu)
其中R1是加溶基，選自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。在具體的實施方式中，該1和2可包括具有如下結(jié)構(gòu)的a-g連接基團
*＝用于共價連接至不飽和骨架上的位點 另外，3可以是具有如下結(jié)構(gòu)的h基團
L＝連接體 A＝生物偶聯(lián)位點 *＝用于共價連接至不飽和骨架上的位點 在另一個實施方式中，復(fù)合物的多發(fā)色團可具有如下結(jié)構(gòu)
其中R1是加溶基，包括但并不局限于乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。
在另一個實施方式中，復(fù)合物的多發(fā)色團可具有如下結(jié)構(gòu)
其中R1是加溶基，選自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。
在另一個實施方式中，復(fù)合物的多發(fā)色團具有如下結(jié)構(gòu)
其中R1是加溶基，包括乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基、和ω-磺酸鹽烷氧基。
一般地，在另一個方面，提供了一種用于鑒定靶標生物分子的多發(fā)色團復(fù)合物，其包含多發(fā)色團、共價連接至該多發(fā)色團的傳感器生物分子、共價連接至該多發(fā)色團的信號產(chǎn)生發(fā)色團，其中信號發(fā)色團能夠接受在多發(fā)色團激發(fā)時來自多發(fā)色團的能量，并且傳感器生物分子能夠與靶標生物分子相互作用。在一個實施方式中，信號發(fā)色團和傳感器生物分子都通過多個連接體共價連接至多發(fā)色團上。在一個替代實施方式中，信號發(fā)色團和傳感器生物分子都通過三官能化連接體共價連接至多發(fā)色團上，該三官能化連接體共價連接多發(fā)色團、信號發(fā)色團和傳感器生物分子。
在一個實施方式中，連接體具有連接化學(xué)部分，包括但并不局限于馬來酰亞胺/硫醇、琥珀酰亞胺酯(NHS酯)/胺、疊氮化物化學(xué)部分、羧基/EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亞胺)鹽酸鹽/胺、胺/磺基-SMCC(磺基琥珀酰亞胺基4-[N-馬來酰亞胺基甲基]環(huán)己烷-1-羧酸酯)/硫醇、胺/BMPH(N-[β-馬來酰亞胺基丙酸]酰肼·TFA)/硫醇。在一個特定的實施方式中，該多發(fā)色團是偶聯(lián)的聚合物，例如聚陽離子偶聯(lián)的聚合物。
一般地，在另一個方面，提供了一種測定方法，包括以下步驟提供懷疑含有靶標生物分子的樣本；提供包含多發(fā)色團、共價連接的信號發(fā)色團和共價連接的傳感器生物分子的多發(fā)色團復(fù)合物，其中信號發(fā)色團能夠在多發(fā)色團激發(fā)后接受來自多發(fā)色團的能量，并且傳感器生物分子能夠與靶標生物分子相互作用；在傳感器生物分子可結(jié)合至靶標生物分子(如果存在)的條件下，將樣本在溶液中與多發(fā)色團復(fù)合物接觸；向樣本施加能夠激發(fā)發(fā)色團的光源，以及檢測是否從信號發(fā)色團上發(fā)出光來。在一個具體的實施方式中，多發(fā)色團是偶聯(lián)的聚合物，例如聚陽離子偶聯(lián)的聚合物。
一般地，在另一個方面，提供了一種測定方法，包括以下步驟提供懷疑含有靶標生物分子的樣本；提供偶聯(lián)至信號發(fā)色團并且能夠與靶標生物分子相互作用的第一生物偶聯(lián)物；提供與多發(fā)色團偶聯(lián)的第二生物偶聯(lián)物，其中該發(fā)色團包含如下結(jié)構(gòu)
其中CP1、CP2、CP3和CP4是任選地被取代的偶聯(lián)的聚合物區(qū)段或寡聚結(jié)構(gòu)，它們彼此相同或不同，其中第二生物偶聯(lián)物可結(jié)合至第一生物偶聯(lián)物，并且在這種結(jié)合后，多發(fā)色團的激發(fā)能夠?qū)⒛芰總鬟f至信號發(fā)色團，在第一生物偶聯(lián)物可結(jié)合至靶標生物分子(如果存在)的條件下將樣本在溶液中與第一生物偶聯(lián)物接觸，將該溶液與第二生物偶聯(lián)物接觸，向樣本施加能夠激發(fā)發(fā)色團的光源，以及檢測是否從信號發(fā)色團上發(fā)出光來。在一個實施方式中，CP1、CP2、CP3和CP4是芳香族重復(fù)單元，包括但并不局限于苯、萘、蒽、芴、噻吩、呋喃、吡啶和噁二唑，每個任選地被取代，并且其中CP3和CP4可含有一個或多個通過連接體連接的獨特生物偶聯(lián)位點。在一個具體的實施方式中，多發(fā)色團是偶聯(lián)的聚合物，例如聚陽離子偶聯(lián)的聚合物、陰離子偶聯(lián)的聚合物和/或電荷中性的偶聯(lián)的聚合物。
在一個相關(guān)的實施方式中，多發(fā)色團具有生物連接位點，包括但并不局限于馬來酰亞胺、硫醇、琥珀酰亞胺酯(NHS酯)、胺、疊氮化物化學(xué)部分、羧基/EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亞胺鹽酸鹽、磺基-SMCC(磺基琥珀酰亞胺基4-[N-馬來酰亞胺基甲基]環(huán)己烷-1-羧酸酯)、胺/BMPH(N-[β-馬來酰亞胺基丙酸]酰肼·TFA)、以及磺基-SBED磺基琥珀酰亞胺基[2-6-(生物素酰氨基)-2-(對-疊氮基苯甲酰氨基)-己酰氨基]-乙基-1，3′-二硫代丙酸酯。
在一個具體的實施方式中，多發(fā)色團具有如下結(jié)構(gòu)
其中R1是加溶基，選自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。
在另一個實施方式中，多發(fā)色團具有如下結(jié)構(gòu)
其中R1是加溶基，選自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。
在一個更進一步的實施方式中，1和2可包括一個或多個具有如下結(jié)構(gòu)的a-g連接基團
*＝用于共價連接至不飽和骨架的位點 在一個實施方式中，3是具有如下結(jié)構(gòu)的基團h
L＝連接體 A＝生物偶聯(lián)位點 *＝用于共價連接至不飽和骨架的位點 在另一個實施方式中，復(fù)合物的多發(fā)色團具有如下結(jié)構(gòu)
其中R1是加溶基，包括但并不局限于乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。
在另一個實施方式中，復(fù)合物的多發(fā)色團具有如下結(jié)構(gòu)
其中R1是加溶基，包括但并不局限于乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。
在另一個實施方式中，復(fù)合物的多發(fā)色團具有如下結(jié)構(gòu)
其中R1是加溶基，包括但并不局限于乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。在一個具體的實施方式中，該多發(fā)色團是偶聯(lián)的聚合物，例如聚陽離子偶聯(lián)的聚合物、陰離子偶聯(lián)的聚合物和/或電荷中性的偶聯(lián)的聚合物。
在一個實施方式中，第一和第二生物偶聯(lián)物中的至少一個是抗體。在一個特定的實施方式中，第一和第二生物偶聯(lián)物都是抗體。
一般地，在另一個方面，提供了一種測定方法，包括以下步驟提供懷疑含有靶標生物分子的樣本；提供包含共價連接的第一生物偶聯(lián)物的多發(fā)色團；提供包含能夠與靶標分子相互作用的傳感器生物分子、信號發(fā)色團以及能夠與第一生物偶聯(lián)物結(jié)合的共價連接的第二生物偶聯(lián)物的傳感器生物分子復(fù)合物，其中在這種結(jié)合后，多發(fā)色團的激發(fā)能夠?qū)⒛芰總鬟f給信號發(fā)色團；在傳感器生物分子可結(jié)合至靶標生物分子(如果存在)的條件下將樣本在溶液中與傳感器生物分子復(fù)合物接觸；將溶液與多發(fā)色團接觸；向樣本施加能夠激發(fā)發(fā)色團的光源；以及檢測是否從信號發(fā)色團上發(fā)出光來。在一個具體的實施方式中，多發(fā)色團是偶聯(lián)的聚合物，例如聚陽離子偶聯(lián)聚合物、陰離子偶聯(lián)聚合物和/或電荷中性偶聯(lián)聚合物。
在一個實施方式中，第一和第二生物偶聯(lián)物包括但并不局限于蛋白質(zhì)、抗體和核酸、在一個相關(guān)的實施方式中，第一生物偶聯(lián)物是鏈親和素或生物素，傳感器生物分子是一種抗體，并且在第一生物偶聯(lián)物是生物素時，第二生物偶聯(lián)物是鏈親和素，或者在第一生物偶聯(lián)物是鏈親和素時是生物素。在另一個實施方式中，第一生物偶聯(lián)物是鏈親和素或生物素，傳感器生物分子是一種核酸，并且在第一生物偶聯(lián)物是鏈親和素時第二生物偶聯(lián)物是生物素，或者在第一生物偶聯(lián)物是鏈親和素時為生物素。
一般地，在另一個方面，提供一種用于鑒定生物分子的生物識別復(fù)合物。該復(fù)合物可包含生物偶聯(lián)物、共價連接至該生物偶聯(lián)物的信號發(fā)色團、共價連接至該生物偶聯(lián)物的多發(fā)色團，其中多發(fā)色團的激發(fā)能夠?qū)⒛芰總鬟f至信號發(fā)色團上。
在一個實施方式中，生物偶聯(lián)物可包括但并不局限于抗體或鏈親和素。在一個具體的實施方式中，該多發(fā)色團是偶聯(lián)的聚合物，例如聚陽離子偶聯(lián)聚合物、陰離子偶聯(lián)聚合物和/或電荷中性偶聯(lián)聚合物。
一般地，在一個方面，提供了一種測定方法，包括以下步驟提供懷疑含有靶標生物分子的樣本；提供包含生物偶聯(lián)物、共價連接至生物偶聯(lián)物的信號發(fā)色團以及共價連接至生物偶聯(lián)物的多發(fā)色團的生物識別復(fù)合物，其中多發(fā)色團的激發(fā)能夠?qū)⒛芰總鬟f給信號發(fā)色團；在生物偶聯(lián)物可結(jié)合至靶標生物分子或靶標相關(guān)生物分子(如果存在)的條件下將樣本在溶液中與生物識別復(fù)合物接觸；向該溶液施加能夠激發(fā)發(fā)色團的光源；以及檢測是否從信號發(fā)色團上發(fā)出光來。在一個具體的實施方式中，多發(fā)色團是偶聯(lián)的聚合物，例如聚陽離子偶聯(lián)聚合物、陰離子偶聯(lián)聚合物和/或電荷中性偶聯(lián)聚合物。
一般地，在另一個方面，提供了一種用于鑒定靶標生物分子的生物識別復(fù)合物，其包含生物偶聯(lián)物、共價連接至該生物偶聯(lián)物的多發(fā)色團、以及共價連接至該多發(fā)色團的信號發(fā)色團，其中多發(fā)色團的激發(fā)能夠?qū)⒛芰總鬟f給信號發(fā)色團。在一個實施方式中，該生物偶聯(lián)物是抗體。在另一個實施方式中，該生物偶聯(lián)物是鏈親和素。在一個具體的實施方式中，多發(fā)色團是偶聯(lián)的聚合物，例如聚陽離子偶聯(lián)聚合物、陰離子偶聯(lián)聚合物和/或電荷中性偶聯(lián)聚合物。
一般地，在另一個方面，提供了一種測定方法，包括以下步驟提供懷疑含有靶標生物分子的樣本；提供包含生物偶聯(lián)物復(fù)合物的生物識別復(fù)合物，該生物偶聯(lián)物復(fù)合物包含生物偶聯(lián)物、共價連接至生物偶聯(lián)物的多發(fā)色團、以及共價連接至多發(fā)色團的信號發(fā)色團，其中多發(fā)色團的激發(fā)能夠?qū)⒛芰總鬟f給信號發(fā)色團；在生物偶聯(lián)物可結(jié)合至靶標生物分子或靶標相關(guān)生物分子(如果存在)的條件下將樣本在溶液中與生物識別復(fù)合物接觸；向該溶液施加能夠激發(fā)發(fā)色團的光源；以及檢測是否從信號發(fā)色團上發(fā)出光來。在一個具體的實施方式中，多發(fā)色團是偶聯(lián)的聚合物，例如聚陽離子偶聯(lián)聚合物、陰離子偶聯(lián)聚合物和/或電荷中性偶聯(lián)聚合物。
在另一個方面，提供的方法是此處公開的一系列方法中的任何方法，其中通過靶標生物分子的檢測來檢測基因的表達。
在另一個方面，提供的方法是此處公開的一系列方法中的任何方法，其中檢測靶標生物分子提供的結(jié)果可用于診斷患者的疾病狀態(tài)。在一個實施方式中，診斷疾病的方法包括以下步驟檢查或分析關(guān)于樣本中是否存在靶標生物分子的數(shù)據(jù)；以及給患者、醫(yī)務(wù)人員或醫(yī)療衛(wèi)生管理者提供一個結(jié)論；該結(jié)論是基于檢查和分析有關(guān)疾病診斷的數(shù)據(jù)而作出的。在一個相關(guān)的實施方式中，提供結(jié)論包括經(jīng)由網(wǎng)絡(luò)傳輸數(shù)據(jù)。
一般地，在另一個方面，提供了用于鑒定靶標生物分子的試劑盒。在一個實施方式中，試劑盒包括多發(fā)色團、共價連接至該多發(fā)色團的傳感器生物分子、共價連接至多發(fā)色團的信號發(fā)色團，其中信號發(fā)色團在多發(fā)色團激發(fā)時能夠接受來自于多發(fā)色團的能量，并且傳感器生物分子能夠與靶標生物分子相互作用。在一個具體的實施方式中，該試劑盒還包括一種基質(zhì)。
引入?yún)⒖? 在本說明書中提及的所有出版物和專利申請都在此引入作為參考，如同每個單獨的出版物或?qū)＠暾埍惶貏e地和單獨地在此引入作為參考一樣。
所附的權(quán)利要求書中詳細地說明了本發(fā)明的新特征。參考以下闡述說明性實施方式的詳細描述和附圖將會更好地理解本發(fā)明的特征和優(yōu)點，在這些說明性實施方式中應(yīng)用本發(fā)明的原理，在附圖中 圖1.本發(fā)明一個實施方式中的多發(fā)色團的靜電結(jié)合示意圖。
圖2.FITC標記抗體的直接激發(fā)圖，闡明放大的染料發(fā)射(左)，和本發(fā)明一個實施方式的多發(fā)色團的結(jié)構(gòu)示意圖(右)。
圖3.Cy3標記抗體的直接激發(fā)圖，闡明放大的染料發(fā)射(左)，和本發(fā)明一個實施方式的多發(fā)色團的結(jié)構(gòu)示意圖(右)。
圖4.本發(fā)明一個實施方式中生物偶聯(lián)的多發(fā)色團的示意圖。
圖5.偶聯(lián)至抗體(左)或染料(右)的多發(fā)色團的示意圖。
圖6.偶聯(lián)至染料標記的可與第一抗體結(jié)合的第二抗體的多發(fā)色團的示意圖。
圖7.與鏈親和素偶聯(lián)的多發(fā)色團的示意圖，該鏈親和素用于結(jié)合染料標記的和生物素標記的第一抗體(左)或染料標記的或生物素標記的核酸(右)。
圖8.偶聯(lián)至與染料偶聯(lián)的抗體的多發(fā)色團(左)和偶聯(lián)至與染料偶聯(lián)的鏈親和素的多發(fā)色團(右)的示意圖。
圖9.本發(fā)明一個實施方式中多發(fā)色團的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖10.本發(fā)明一個實施方式中具有生物偶聯(lián)位點的單體的示意圖。
圖11.本發(fā)明一個實施方式的單體的合成途徑示意圖。
圖12.本發(fā)明另一個實施方式的單體的合成途徑示意圖。
圖13.通過連接體(左)或通過三官能化連接體(右)生物偶聯(lián)至染料和生物分子上的多發(fā)色團的示意圖。
圖14.同時偶聯(lián)至染料和抗體上的多發(fā)色團(左)以及同時偶聯(lián)至染料和蛋白質(zhì)上的多發(fā)色團(右)的示意圖。
圖15.用兩種染料標記的DNA探針的單一和多重檢測圖。
圖16.連接至染料和第二抗體的多發(fā)色團的示意圖，該第二抗體對于針對蛋白質(zhì)的第一抗體是特異性的。
圖17.連接至染料和用于結(jié)合第二抗體上生物素的鏈親和素的多發(fā)色團的示意圖。顯示第二抗體對于針對蛋白質(zhì)的第一抗體是特異性的。
圖18.本發(fā)明一個實施方式中偶聯(lián)的聚合物多發(fā)色團的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖19.本發(fā)明另外的實施方式中偶聯(lián)的聚合物多發(fā)色團的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖20.本發(fā)明實施方式中各種芳香族單元的結(jié)構(gòu)的示意圖。
圖21.具有馬來酰亞胺生物偶聯(lián)位點的偶聯(lián)的聚合物多發(fā)色團的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖22.顯示一個代表性邏輯裝置實例的流程圖。
圖23.顯示一個代表性試劑盒實例的示意圖。
圖24.本發(fā)明一個實施方式的紅外(IR)光譜分析圖。
圖25.本發(fā)明一個實施方式的光譜圖。
圖26.本發(fā)明一個實施方式的熒光光譜圖。
圖27A.本發(fā)明一個實施方式中與生物素化有關(guān)的結(jié)構(gòu)的示意圖。
圖27B.本發(fā)明的生物素-親和素結(jié)合試驗的示意圖。
圖27C.本發(fā)明一個實施方式中關(guān)于生物素-親和素結(jié)合試驗的熒光光譜圖。
圖28.本發(fā)明另一個實施方式的紅外(IR)光譜分析圖。
圖29.本發(fā)明另一個實施方式的光譜圖。
圖30A.對照聚合物結(jié)構(gòu)的示意圖。
圖30B.涉及本發(fā)明一個實施方式的實驗性聚合物結(jié)構(gòu)的示意圖。
圖30C.關(guān)于所述對照和實驗性聚合物的熒光光譜圖。
圖31A.關(guān)于本發(fā)明一個實施方式的對照聚合物和實驗性聚合物結(jié)構(gòu)的示意圖。
圖31B.關(guān)于對照和實驗性聚合物的熒光試驗示意圖。
圖32A.本發(fā)明聚合物的一個實施方式的熒光光譜圖。
圖32B.顯示本發(fā)明一個實施方式的熒光光譜校正值的圖。
圖33A.本發(fā)明一個實施方式的聚合物的熒光信號強度圖。
圖33B.涉及本發(fā)明一個實施方式的聚合物的信號放大圖。
圖34.本發(fā)明另一個實施方式的光譜圖。
圖35A.本發(fā)明的生物素-親和素結(jié)合試驗的示意圖。
圖35B.本發(fā)明一個實施方式的熒光素發(fā)射圖。
圖36A.涉及本發(fā)明一個實施方式的聚合物結(jié)構(gòu)的示意圖。
圖36B.涉及本發(fā)明一個實施方式的聚合物的熒光試驗的示意圖。
圖36C.本發(fā)明聚合物的一個實施方式的熒光光譜圖。
發(fā)明詳述 盡管帶電的多發(fā)色團結(jié)構(gòu)和基本靜電相互作用能夠有效地放大染料標記的抗體信號，但是更加定向的多發(fā)色團結(jié)合方法可保證更低的背景和改善信號。多發(fā)色團材料可直接偶聯(lián)(共價連接)至抗體和/或染料，在試驗中提供增加的控制(多發(fā)色團-染料間距)。基本上，信號染料與放大聚合物緊密偶聯(lián)。此外，多發(fā)色團的偶聯(lián)并不局限于染料或抗體；而是多發(fā)色團可以偶聯(lián)至任何種類的生物分子上，包括蛋白質(zhì)(諸如親和素/鏈親和素)、核酸、親和性配體、糖類、脂類、肽、以及酶的底物。這些形式可應(yīng)用于一系列廣泛的應(yīng)用中，諸如DNA微陣列、FISH試驗、PCR試驗，也包括上述的基于蛋白質(zhì)的檢測應(yīng)用。聚合物材料的性質(zhì)進一步允許使用單一激發(fā)波長(激光、濾光片等)放大一種以上的染料。這就使得同時檢測多個靶標(多重)成為可能。關(guān)于多發(fā)色團及其應(yīng)用的詳情公開如下，每個在此引入作為參考美國專利申請序列號No.11/329,495，2006年1月10日申請，以US 2006-0183140 A1公布；美國專利申請序列號No.11/329,861，2006年1月10日申請，以US2006-0216734 A1公布；美國專利申請序列號No.11/344,942，2006年1月31日申請，以US 2006-0204984 A1公布；美國專利申請序列號No.10/648,945，2003年8月26日申請，以US 2004-0142344 A1公布；美國專利申請序列號No.10/600,286，2003年6月20日申請，以US2004-0219556 A1公布；美國專利申請序列號No.10/666,333，2003年9月17日申請，以US 2005-0059168 A1公布；和美國專利申請序列號No.10/779,412，2004年2月13日申請，以US 2005-0003386 A1公布。
在進一步詳細描述本發(fā)明之前，應(yīng)當理解本發(fā)明并不局限于描述的特定的方法學(xué)、裝置、溶液或器具等，因為這些方法、裝置、溶液或器具當然可發(fā)生變化。同樣應(yīng)當理解此處使用的術(shù)語僅用于描述特定實施方式的目的，并非有意限制本發(fā)明的范圍。
除非本文清楚指出為其他意思，使用單數(shù)形式“一個”和“一種”包括復(fù)數(shù)形式的所述內(nèi)容。例如，提及“一個聚集傳感器”包括多個聚集傳感器，提及“一種探針”包括多種探針，以此類推。另外，使用具體的復(fù)數(shù)形式的內(nèi)容，諸如“二”、“三”等，除非文本清楚指出其他意思，應(yīng)當理解是同一主題的較大數(shù)目。
諸如“聯(lián)結(jié)”、“附加”、“偶聯(lián)”以及“連接”的術(shù)語在此處可互換使用，并且涵蓋直接以及間接的聯(lián)結(jié)、附加、連接或偶聯(lián)，除非文本清楚指出其他意思；在一個實例中，短語“偶聯(lián)的聚合物”按照本領(lǐng)域的常規(guī)含意來使用，指的是含有一系列不飽和鍵的聚合物，并且文中指出術(shù)語“偶聯(lián)”應(yīng)當理解為不僅是單純的或直接的或間接的聯(lián)結(jié)、附加或連接。
當述及數(shù)值范圍時，應(yīng)當理解在述及的該范圍上限和下限之間的每個介于中間的整數(shù)值和每個分數(shù)，以及在這些數(shù)值之間的每個亞范圍，也被具體公開。任何范圍的上限和下限可獨立地被包括在該范圍內(nèi)或被排除在該范圍之外，并且當上下限兩者中的任何一個、兩個都被包括在內(nèi)或都不包括時，每個范圍也被涵蓋在本發(fā)明之內(nèi)。當一個被討論的數(shù)值具有內(nèi)在的限值時，例如當一個組分可以用濃度從0至100％來表示，或當一種水溶液的pH可為1至14時，那些內(nèi)在的限值就被具體地公開了。當一個數(shù)值被明確地述及時，應(yīng)當理解那些與所述數(shù)值大約相同數(shù)量或量的數(shù)值也處于本發(fā)明的范圍之內(nèi)，基于它們的范圍也處于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。當一個組合被公開時，該組合內(nèi)元素的每個亞組合也同樣被具體地公開且處于本發(fā)明范圍之內(nèi)。相反地，當不同元素或元素組被公開時，其組合也同樣被公開。當一項發(fā)明的任何元素被公開為具有多個替代物時，每個替代物單獨地或與其他替代物任意組合地被排除的本發(fā)明的實例也同樣在此處公開；一項發(fā)明的一個以上的元素可具有此類的排除，并且具有此類排除的元素的所有組合由此被公開。
除非另外定義或文中清楚指出為別的意思，此處使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的同樣的含意。盡管任何與此處描述的類似或等同的方法和材料可以用于本發(fā)明的實踐或測試，現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法和材料。
所有此處提及的出版物在此引入作為參考，目的是公開和描述引用的參考文件的具體材料和方法學(xué)。提供此處所述的出版物僅僅因為它們的公開早于本申請的申請日。而不應(yīng)理解為承認由于在先的發(fā)明，本發(fā)明不早于此公開內(nèi)容。
定義 在描述本發(fā)明時，將采用下述術(shù)語，并且定義如下。
“烷基”指含1至24個碳原子的支鏈的、非支鏈的或環(huán)形的飽和烴基，任選地在一個或多個位置被取代，并且包括多環(huán)化合物。烷基基團的實例包括任選地被取代的甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、新戊基、正己基、正庚基、正辛基、正癸基、己基辛基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等，以及環(huán)烷基基團，諸如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基、金剛烷基和降冰片基(norbomyl)等。術(shù)語“低級烷基”指含1至6個碳原子，優(yōu)選1至4個碳原子的烷基基團。取代的烷基基團上的取代基的例子包括羥基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、-NO2、鹵素、鹵代烷基、雜烷基、羧基烷基、胺、酰胺、硫醚和-SH。
“烷氧基”指“-O烷基”基團，其中烷基如上述定義?！暗图壨檠趸被鶊F意指含有一至六個，優(yōu)選地一至四個碳原子的烷氧基。
“烯基”指2至24個碳原子的支鏈、非支鏈或環(huán)形烴基，其含有至少一個碳碳雙鍵，任選地在一或多個位點被取代。烯基的實例包括乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基(烯丙基)、1-甲基乙烯基、環(huán)丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、異丁烯基、1，4-丁二烯基、環(huán)丁烯基、l-甲基丁-2-烯基、2-甲基丁-2-烯-4-基、異戊二烯基、戊-1-烯基、戊-3-烯基、1，1-二甲基烯丙基、環(huán)戊烯基、己-2-烯基、1-甲基-1-乙基烯丙基、環(huán)己烯基、庚烯基、環(huán)庚烯基、辛烯基、環(huán)辛烯基、癸烯基、十四烯基、十六烯基、二十烯基、二十四烯基等。此處優(yōu)選的烯基含有2至12個碳原子。術(shù)語“低級烯基”意指含有2至6個碳原子，優(yōu)選2至4個碳原子的烯基基團。術(shù)語“環(huán)烯基”意指有3至8個碳原子，優(yōu)選5至6個碳原子的環(huán)形烯基基團。取代的烯基基團上的取代基的例子包括羥基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、-NO2、鹵素、鹵代烷基、雜烷基、胺、硫醚和-SH。
“烯氧基”指“-O烯基”基團，其中烯基如上述定義。
“烷基芳基”指與芳基基團共價連接的烷基基團。優(yōu)選地，該烷基是一種低級烷基。烷基芳基基團的實例包括苯甲基、苯乙基、苯丙基、1-芐基乙基、苯丁基、2-苯甲基丙基等。
“烷基芳氧基”指“-O烷基芳基”基團，其中烷基芳基如上述定義。
“炔基”指2至24個碳原子的支鏈或非支鏈烴基，其含有至少一個-C≡C-三鍵，任選地在一個或多個位點被取代。炔基的實例包括乙炔基、正丙炔基、異丙炔基、炔丙基、丁-2-炔基、3-甲基丁-1-炔基、辛炔基、癸炔基等。此處優(yōu)選的炔基含有2至12個碳原子。術(shù)語“低級炔基”意指含有2至6個，優(yōu)選2至4個碳原子，以及一個-C＝C-三鍵的炔基基團。取代的炔基基團上的取代基的實例包括羥基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、-NO2、鹵素、鹵代烷基、雜烷基、胺、硫醚和-SH。
此處提及的“抗體”在最廣泛的意義上使用，具體包括單克隆抗體(包括全長的單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片斷(例如Fab、F(ab′)2和Fv)，只要它們對選定抗原表現(xiàn)出結(jié)合活性或親和性即可。
此處使用的“抗原”指任何能夠引發(fā)免疫應(yīng)答的物質(zhì)。
“酰胺”指-C(O)NR′R″，其中R′和R″獨立地選自氫、烷基、芳基、和烷基芳基。
“胺”指-N(R′)R″基團，其中R′和R″獨立地選自氫、烷基、芳基、和烷基芳基。
“芳基”指具有至少一個環(huán)的芳香基團，該環(huán)具有偶合的pi電子系統(tǒng)，包括碳環(huán)、雜環(huán)、橋連和/或多環(huán)芳基基團，并可任選地在一個或多個位點處被取代。典型的芳基基團含有1至5個芳香環(huán)，這些環(huán)可以是稠合和/或連接的。芳基基團的例子包括苯基、呋喃基、唑基(azolyl)、硫代呋喃基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、聯(lián)苯基、茚基、苯并呋喃基、吲哚基、萘基、喹啉基、異喹啉基、喹唑啉基、吡啶并吡啶基(pyridopyridinyl)、吡咯并吡啶基(pyrrolopyridinyl)、嘌呤基、四氫化萘基(tetralinyl)等。任選取代的芳基基團的例子包括烷基、烷氧基、烷基羧基、烯基、烯氧基、烯羧基、芳基、芳氧基、烷基芳基、烷基芳氧基、稠合的飽和或不飽和的任選取代的環(huán)、鹵素、鹵代烷基、雜烷基、-S(O)R、磺?；?、-SO3R、-SR、-NO2、-NRR′、-OH、-CN、-C(O)R、-OC(O)R、-NHC(O)R、-(CH2)nCO2R或-(CH2)nCONRR′，其中n為0-4，且其中R和R′獨立地是H、烷基、芳基或烷基芳基。
“芳氧基”指″-O芳基″基團，其中芳基如上述定義。
“碳環(huán)”指任選取代的含有至少一個環(huán)的化合物，且其中所有環(huán)原子都是碳，并且可以是飽和的或不飽和的。
“碳環(huán)芳基”指任選取代的芳基基團，其中環(huán)原子是碳。
“鹵代”或“鹵素”指氟代、氯代、溴代或碘代。鹵化物指鹵素的陰離子形式。
“鹵代烷基”指在一個或多個位點處被鹵素取代的烷基基團，包括僅被一種類型的鹵素原子取代的烷基基團以及被混合的不同類型的鹵素原子取代的烷基基團。鹵代烷基基團的例子包括三鹵代甲基基團，例如三氟甲基(trfiluoromemyl)。
“雜烷基”指一種烷基基團，其中一個或多個碳原子和相連接的氫原子被任選取代的雜原子替換，包括僅被一種類型的雜原子取代的烷基以及被混合的不同類型的雜原子取代的烷基基團。雜原子包括氧、硫和氮。如此處所使用的，氮雜原子和硫雜原子包括氮和硫的任何氧化形式，以及具有四個共價鍵的氮的任何形式，包括質(zhì)子化形式。任選取代的雜原子指用烷基、芳基、烷基芳基或羥基來替換連接在氮原子上的一個或多個氫。
“雜環(huán)”指含有至少一個飽和或不飽和的環(huán)的化合物，該環(huán)具有至少一個雜原子且任選地在一個或多個位點上被取代。典型的雜環(huán)基團含有1至5個環(huán)，其可以是稠合的和/或連接的，其中每個環(huán)含有五個或六個原子。雜環(huán)基團的實例包括哌啶基、嗎啉基和吡咯烷基。任選取代的雜環(huán)基團的示例性取代基對于烷基或芳基在環(huán)碳處，對于雜烷基在雜原子處。
“雜環(huán)芳基”指在至少一個芳香環(huán)上有至少1個雜原子的芳基基團。雜環(huán)芳基基團的例子包括呋喃基、噻吩基、吡啶基、噠嗪基、吡咯基、N-低級烷基-吡咯并、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、四嗪基、三唑基、四唑基、咪唑基、聯(lián)吡啶基、三吡啶基、四吡啶基、吩嗪基、菲羅啉基(phenanthrolinyl)、嘌呤基等。
“烴基”指含有1至大約20個碳原子的烴基取代基，包括支鏈的、非支鏈的和環(huán)形的種類以及飽和的和不飽和的種類，例如烷基基團、亞烷基基團、烯基基團、烷基芳基基團、芳基基團等。術(shù)語“低級烴基”意指有一個至六個碳原子，優(yōu)選一至四個碳原子的烴基基團。
“取代基”指用以取代連接在碳或氮上的一個或多個氫的基團。取代物的例子包括烷基、亞烷基、烷基羧基、烷氧基、烯基、烯基羧基、烯氧基、芳基、芳氧基、烷基芳基、烷基芳氧基、-OH、酰胺、甲酰胺、羧基、磺?；?、＝O、＝S、-NO2、鹵素、鹵代烷基、稠合的飽和的或不飽和的任選取代的環(huán)、-S(O)R、-SO3R、-SR、-NRR′、-OH、-CN、-C(O)R、-OC(O)R、-NHC(O)R、-(CH2)nCO2R或-(CH2)nCONRR′，其中n是0-4，并且其中R和R′獨立地是H、烷基、芳基或烷基芳基。取代也包括用任選取代的雜原子代替碳原子和一個或多個連接的氫原子。
“磺?；敝?S(O)2R，其R是烷基、芳基、-C(CN)＝C-芳基、-CH2CN、烷基芳基或胺。
“硫代酰胺”指-C(S)NR′R″，其R′和R″獨立地選自鹵素、烷基、芳基和烷基芳基。
“硫醚”指-SR，其中R是烷基、芳基或烷基芳基。
此處所用的術(shù)語“結(jié)合對”指以比樣本中其他成分更高的親和力互相特異性結(jié)合在一起的第一和第二分子。結(jié)合對中成員之間的結(jié)合典型地是非共價的。結(jié)合對的例子包括免疫結(jié)合對(例如任何半抗原或抗原化合物與相應(yīng)抗體或其結(jié)合部分或其片斷組合，例如洋地黃毒苷和抗洋地黃毒苷、熒光素和抗熒光素、二硝基酚和抗二硝基酚、溴脫氧尿苷和抗溴脫氧尿苷、小鼠免疫球蛋白和山羊抗小鼠免疫球蛋白)和非免疫結(jié)合對(例如生物素-親和素、生物素-鏈親和素、激素[例如甲狀腺素和氫化可的松]-激素結(jié)合蛋白、受體-受體激動劑或拮抗劑(例如乙酰膽堿受體-乙酰膽堿或其類似物)IgG-蛋白A、凝集素-碳水化合物、酶-酶輔因子、酶-酶抑制物、和互補的能形成核酸雙鏈的多核苷酸對)等。結(jié)合對中的一個或兩個成員可與其他分子偶聯(lián)。
術(shù)語“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在此處可互換使用，指的是任何長度的核苷酸的聚合形式，并可包含核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、其類似物、或其混合物。這些術(shù)語僅指分子的一級結(jié)構(gòu)。由此，這些術(shù)語包括三鏈、雙鏈和單鏈的脫氧核糖核酸(“DNA””)，以及三鏈、雙鏈和單鏈的核糖核酸(“RNA”)。它也包括修飾的(例如通過烷基化和/或通過戴帽反應(yīng))和未修飾形式的多核苷酸。這些術(shù)語的其他詳情以及堿基配對形成的詳情可見2006年1月31日申請的美國申請序列號No.11/344,942，該申請在此引入作為完整性的參考。
“互補”或“基本互補”指核苷酸或核酸之間，例如，傳感器肽核酸和靶標多核苷酸之間，雜交或堿基配對的能力。一般地，互補核苷酸是A和T(或A和U)，或C和G。當一條鏈的堿基(最佳比對和比較以及具有適當?shù)牟迦牖蛉笔?與另一條鏈的至少大約80％，通常至少大約90％至95％，以及更優(yōu)選大約98％至100％的堿基配對時，兩條單鏈多核苷酸或PNAs就被稱作基本互補。
或者，當一個多核苷酸或PNA將在選擇性雜交條件下與其互補物雜交時就存在基本互補性。典型地，當在至少14至25個堿基的延伸長度上至少有大約65％，優(yōu)選地至少大約75％，更優(yōu)選地至少大約90％互補時，選擇性雜交就會發(fā)生。參見M.Kanehisa Nucleic Acids Res.12203(1984)。
“優(yōu)先結(jié)合”或“優(yōu)先雜交”指與樣本中的非互補聚合物相比，一種多核苷酸或PNA與樣本中其互補物結(jié)合的傾向增加。
多核苷酸雜交條件典型地包括小于大約1M的鹽濃度，更常見地小于大約500mM和優(yōu)選地小于大約200mM。在肽核酸和多核苷酸之間雜交的情況中，雜交可在含有少量鹽或無鹽的溶液中進行。雜交溫度可低至5℃，但典型地高于22℃，更典型地高于大約30℃，優(yōu)選地超過大約37℃。較長片斷的的特異性雜交可能需要較高的雜交溫度。其他因素可能影響雜交的嚴格性，包括堿基組成和互補鏈的長度，有機溶劑的存在和堿基錯配的程度，所用參數(shù)的組合比任何單獨一個參數(shù)的絕對值更加重要。其他可以控制的雜交條件包括緩沖液類型和濃度，溶液pH，用于降低背景結(jié)合的封閉試劑如重復(fù)序列或封閉蛋白質(zhì)溶液的存在和濃度，去污劑類型和濃度，諸如能夠提高多核苷酸相對濃度的聚合物的分子，金屬離子和它們的濃度，螯合劑和它們的濃度，以及其他本領(lǐng)域已知的條件。
此處的“多重”指多種分析物可以被同時測定的試驗或其他分析方法。
“具有”是類似于“包含”和“包括”的開放式用語，包括其它元素被包括在內(nèi)的情況和沒有包括在內(nèi)的情況。
“任選的”或“任選地”意思是后面描述的事件或狀況可能發(fā)生或可能不發(fā)生，并且該描述包括該事件或狀況發(fā)生的情況以及沒有發(fā)生的情況。
此處公開的本發(fā)明一般地涉及包括多發(fā)色團和信號發(fā)色團的測定和復(fù)合物，信號發(fā)色團通過增強的信號放大作用來用于鑒定靶標生物分子或與靶標分子相關(guān)聯(lián)的生物分子。
一般地，在一個方面，本發(fā)明包括多發(fā)色團向傳感器上的染料的能量傳遞，該傳感器可以是生物分子，包括生物偶聯(lián)物(例如，抗體)。
在一個實施方式中，用一種方法改變關(guān)于核酸傳感器測定的形式，如Gaylord，Heeger，and Bazan，J.Am.Chem.Soc.，2003所述。具體而言，多發(fā)色團的信號放大可以基于非特異性靜電結(jié)合事件，以顯示雜交事件。任何建立的多發(fā)色團可以被選作供體，一種或多種染料，優(yōu)選地具有高效能量傳遞歷史的染料，例如熒光素和Cy3，可以被選作受體。可以預(yù)想染料可直接偶聯(lián)至傳感器分子上。如圖1示意性地顯示的，傳感器可以是溶液中或底物上的生物分子(例如，抗體)，在其上可加上多發(fā)色團。在圖1顯示的實施方式中，染料可共價連接至(生物偶聯(lián)至)一種抗體(Y形結(jié)構(gòu))，抗體具有凈負電荷。陽離子多發(fā)色團(用波狀線顯示)的加入可以導(dǎo)致該多發(fā)色團和抗體之間的靜電結(jié)合，使多發(fā)色團和染料緊密接近。由此可以滿足熒光共振能量傳遞(FRET)所需的距離，并且用光(顯示為hv)激發(fā)聚合物導(dǎo)致染料發(fā)射放大?？梢韵胂蠖喟l(fā)色團可在染料不具備顯著吸收的波長下激發(fā)。在一個實施方式中，染料可在比多發(fā)色團發(fā)射更長的波長下發(fā)射。在使用中可以想到一種測定方法包括以下步驟提供懷疑含有靶標生物分子的樣本；提供偶聯(lián)至信號發(fā)色團且能夠與該靶標生物分子相互作用的傳感器；提供與傳感器靜電作用并且在激發(fā)時能夠傳遞能量至傳感器信號發(fā)色團的多發(fā)色團；在傳感器可結(jié)合至靶標生物分子(如果存在)的條件下將樣本在溶液中與傳感器和多發(fā)色團接觸；接著，該方法可包括向樣本施加能夠激發(fā)多發(fā)色團的光源，以及檢測是否從信號發(fā)色團上發(fā)出光來。
從圖1顯示的實施方式產(chǎn)生的數(shù)據(jù)的一個實例呈現(xiàn)在圖2中。如圖顯示，F(xiàn)ITC標記的小鼠抗人CD22抗體可以被直接激發(fā)(下線，標為FITC)，或通過激發(fā)靜電結(jié)合的多發(fā)色團(圖2所示的結(jié)構(gòu)，右側(cè))并且隨后經(jīng)由FRET能量傳遞而間接激發(fā)(上線，標為被聚合物放大的信號)。該實驗的細節(jié)包括直接激發(fā)FITC標記的小鼠抗人CD22抗體(下線，標為FITC，496nm激發(fā)，[FITC標記的小鼠抗人CD22抗體]＝1ng/mL)，和在2mL 1X SSPE中多發(fā)色團放大的染料發(fā)射(上線，380nm激發(fā)，[多發(fā)色團]＝1x10-6M，以重復(fù)單元計，RU)。供體多發(fā)色團的結(jié)構(gòu)顯示于圖的右邊。有利地，與直接激發(fā)相比，在存在多發(fā)色團的情況下的能量傳遞導(dǎo)致染料信號強度放大5倍。
圖3顯示了圖1顯示的實施方式產(chǎn)生的第二個數(shù)據(jù)的實例。在這里，該圖顯示了直接(下線，標為Cy3，540nm激發(fā))和間接(上線，380nm激發(fā))激發(fā)Cy3標記的驢抗小鼠第二抗體的光學(xué)報告信號的比較。實驗條件類似于先前實驗的條件，但是使用了一半的體積。供體多發(fā)色團結(jié)構(gòu)顯示于圖3的右側(cè)。多發(fā)色團放大的染料強度比直接染料激發(fā)的強度大10倍。
如此處所公開的，帶電的多發(fā)色團與染料標記的抗體之間的靜電結(jié)合是提高檢測靈敏度例如生物分子靶標的靈敏度的一個可行的手段。在更進一步的實施方式中，共價連接多發(fā)色團至染料/生物分子(例如，抗體)復(fù)合物提供了幾個優(yōu)勢，包括降低的背景和提高的能量傳遞。在直接連接至生物分子的例子中，生物識別事件，而不是靜電結(jié)合事件，應(yīng)當管理多發(fā)色團的存在。在這種方式下，多發(fā)色團與生物分子的非特異性結(jié)合可以被消除，減少任何由多發(fā)色團本身產(chǎn)生的背景發(fā)射。上述生物分子包括但并不局限于蛋白質(zhì)、肽、親和性配體、抗體、抗體片斷、糖、脂類和核酸(如雜交探針和/或適體)。
在直接連接至染料或生物分子/染料復(fù)合物的例子中，供體-受體距離可以固定，而非依靠靜電結(jié)合的強度，并且能量傳遞效率可被顯著地提高。這對于提高染料信號和減少與供體-受體交叉聯(lián)系(cross-talk)相關(guān)的背景熒光具有重要意義。此例中的交叉聯(lián)系是指多發(fā)色團(供體)與染料(受體)發(fā)射峰之間的重疊。由于距離太遠而無法產(chǎn)生能量傳遞的非特異結(jié)合的多發(fā)色團對背景熒光(或交叉聯(lián)系)有貢獻。供體和受體之間較短的(固定的)距離不但能夠促進直接染料放大，而且能大大猝滅供體發(fā)射。這就導(dǎo)致在受體發(fā)射波長上有較少的供體發(fā)射，由此減少或甚至消除了對交叉聯(lián)系校正的需要。
一般地，在另一個方面，本發(fā)明包括多發(fā)色團與親和性配體(親和性配體描述為對另一生物分子具有親和性的生物分子)的生物偶聯(lián)。圖4顯示了一類物質(zhì)，其中多發(fā)色團(用波狀線顯示)連接至染料、生物分子、或生物分子/染料復(fù)合物(標為X)。與多發(fā)色團的連接可經(jīng)由多發(fā)色團上作為生物偶聯(lián)位點的第一功能性連接體A連接，該位點能與第二功能性連接體A’共價連接，A’又連接至生物分子和/或染料上(參見X)。這種排列可以固定多發(fā)色團和X之間的距離，因此保證了僅多發(fā)色團和X之間的特異性相互作用?？梢灶A(yù)想該實施方式中的生物分子組分X可以是此處公開的多種生物分子中的任意一種，包括但并不局限于抗體、蛋白質(zhì)、親和性配體或核酸。
可以預(yù)想本文中的X可以是，但并不局限于，染料、熒光蛋白、納米材料(例如Quantum Dot)、染料和產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的分子之間的偶聯(lián)物、熒光蛋白和產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的分子之間的偶聯(lián)物、納米材料(例如Quantum Dot)和產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的分子之間的偶聯(lián)物、鏈親和素、親和素、酶、酶底物、酶底物的類似物、受體、受體的配體、受體的配體類似物、DNA、RNA、修飾的核酸、DNA適體、RNA適體、修飾的核酸適體、肽適體、抗體、抗原、噬菌體、細菌或任何兩種上述成分的偶聯(lián)物。
A-A’和B-B’的連接化學(xué)包括，但并不局限于，馬來酰亞胺/硫醇、琥珀酰亞胺酯(NHS酯)/胺、疊氮化物化學(xué)、羧基/EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亞胺鹽酸鹽/胺、胺/磺基-SMCC(磺基琥珀酰亞胺基4-[N-馬來酰亞胺基甲基]環(huán)己烷-1-羧酸酯)/硫醇、和胺/BMPH(N-[β-馬來酰亞胺基丙酸]酰肼·TFA)/硫醇。
在另一個方面，本發(fā)明包括標記的多發(fā)色團。圖5顯示了兩個標記的多發(fā)色團的實例。在一個實施方式中，在左側(cè)，顯示多發(fā)色團(以波狀線顯示)與抗體偶聯(lián)，該抗體可以是，例如，1°或2°抗體。例如，在一個試驗中，多發(fā)色團和抗體的偶聯(lián)物可以作為報告物。多發(fā)色團用光(未顯示)激發(fā)可導(dǎo)致多發(fā)色團的發(fā)射，顯示出抗體(1°或2°)的存在。在圖5右側(cè)顯示的另一個實施方式中，多發(fā)色團用染料例如發(fā)色團標記。在此例中，在顯示的FRET過程里，多發(fā)色團可起到供體的作用，染料可起到受體的作用。在此處，多發(fā)色團可起到集光者的作用，多發(fā)色團激發(fā)之后是經(jīng)由FRET過程將激發(fā)傳送給染料。這就導(dǎo)致了放大的染料發(fā)射(與直接染料激發(fā)相比)。在一個實施方式中，供體多發(fā)色團的熒光可被猝滅(例如＞90％猝滅)。
一般地，在另一個方面，本發(fā)明包括一種測定靶標生物分子或標記的靶標生物分子的方法。如圖6所示，在一個實施方式中，多發(fā)色團(以波狀線顯示)可連接至第一生物偶聯(lián)物(顯示為一個Y形的物體)，例如針對第二個染料標記的生物偶聯(lián)物(例如1°抗體)特異性的2°抗體。在此處，1°和2°抗體之間的識別事件將導(dǎo)致供體多發(fā)色團和受體染料之間的距離縮短。經(jīng)過該識別事件后，用光(顯示為hv)激發(fā)供體多發(fā)色團將導(dǎo)致向受體染料的FRET(顯示為彎曲的箭頭)，并且觀察到放大的染料發(fā)射(與直接激發(fā)染料相比)。在使用中，可以預(yù)想一種測定方法可包括提供懷疑含有靶標生物分子的樣本，提供偶聯(lián)至信號發(fā)色團并且能夠與靶標生物分子相互作用的第一生物偶聯(lián)物，例如1°抗體。接下來提供偶聯(lián)至多發(fā)色團的第二生物偶聯(lián)物，例如2°抗體，其中第二生物偶聯(lián)物可結(jié)合至第一生物偶聯(lián)物上并且其中在該結(jié)合后多發(fā)色團的激發(fā)能夠?qū)⒛芰總鬟f至信號發(fā)色團。接下來，該方法包括在第一生物偶聯(lián)物能夠結(jié)合至靶標生物分子(如果存在)的條件下，在溶液中將樣本和第一生物偶聯(lián)物接觸，并且將溶液與第二生物偶聯(lián)物接觸。該方法接著包括向至靶標生物分子或標記的靶標生物分子施加光源，其中該光源能夠激發(fā)多發(fā)色團，隨后檢測是否從信號發(fā)色團發(fā)射出光來。
一般地，在另一個方面，本發(fā)明包括一種使用多發(fā)色團和傳感器生物分子復(fù)合物測定樣本的方法。如圖7左側(cè)所示，多發(fā)色團(以波狀線顯示)可偶聯(lián)至第一生物偶聯(lián)物，例如鏈親和素(SA)，其對生物素有極強的親和性。在圖7左側(cè)，傳感器生物分子(例如可以是1°或2°抗體的抗體)同時偶聯(lián)至染料和第二生物偶聯(lián)物(例如生物素部分)。經(jīng)過第一和第二生物偶聯(lián)物(例如SA和生物素)之間的生物識別事件后，多發(fā)色團和染料緊密靠近，并且供體多發(fā)色團的激發(fā)將導(dǎo)致向受體染料的FRET。染料發(fā)射將指示第一生物偶聯(lián)物的存在(例如抗體)。與直接染料激發(fā)相比，當通過FRET間接激發(fā)時將會觀察到染料信號強度的放大。
在如圖7右側(cè)顯示的另一個實施方式中，傳感器生物分子，例如核酸，同時偶聯(lián)至染料和第一生物偶聯(lián)物(例如生物素部分)上。經(jīng)過第二生物偶聯(lián)物(例如SA)和第一生物偶聯(lián)物(例如生物素)之間的生物識別事件后，多發(fā)色團和染料緊密靠近，并且供體多發(fā)色團的激發(fā)將導(dǎo)致向受體染料的FRET。與直接染料激發(fā)相比，當通過FRET間接激發(fā)時將會觀察到染料信號強度的放大。染料發(fā)射將指示傳感器生物分子(例如核酸)的存在。
應(yīng)用圖7所示實施方式的方法可包括以下步驟提供懷疑含有靶標生物分子的樣本；提供包含共價連接的第一生物偶聯(lián)物(例如SA)的多發(fā)色團；提供包含能夠與靶標生物分子相互作用的傳感器生物分子、信號發(fā)色團、和共價連接的能與第一生物偶聯(lián)物結(jié)合的第二生物偶聯(lián)物的傳感器生物分子復(fù)合物，其中在該結(jié)合后，多發(fā)色團的激發(fā)能將能量傳遞至信號發(fā)色團。該方法進一步包括以下步驟在傳感器生物分子能結(jié)合至靶標生物分子(如果存在)的條件下，在溶液中將樣本和傳感器生物分子復(fù)合物接觸；將溶液與多發(fā)色團接觸；對樣本施加能夠激發(fā)多發(fā)色團的光源；以及檢測是否從信號發(fā)色團發(fā)射出光來。
一般地，在另一個方面，本發(fā)明提供一種用于鑒定靶標生物分子的生物識別復(fù)合物，其包含生物偶聯(lián)物、信號發(fā)色團和多發(fā)色團。圖8顯示了直接偶聯(lián)至染料標記的生物偶聯(lián)物如抗體的多發(fā)色團(左側(cè))。圖8進一步顯示了一個替代實施方式，其中多發(fā)色團偶聯(lián)至染料標記的SA(右側(cè))。在左側(cè)所示的實施方式中，生物偶聯(lián)物(顯示為Y形)與染料和多發(fā)色團之間的共價連接確保了供體多發(fā)色團和受體染料緊密靠近。在生物偶聯(lián)物如抗體和它的靶標如抗原之間的生物識別事件后，供體多發(fā)色團的激發(fā)將導(dǎo)致向受體染料的FRET。在圖8右側(cè)所示的一個替代實施方式中，多發(fā)色團和染料仍然保持固定的足夠近的距離。這樣，在如SA和生物素部分之間的結(jié)合事件后，供體多發(fā)色團的激發(fā)將導(dǎo)致向受體染料的FRET。在圖8所示的每個實施方式中，多發(fā)色團的激發(fā)導(dǎo)致放大的染料發(fā)射。
圖9顯示了CP結(jié)構(gòu)的一個非限制實例。骨架可主要由芴-亞苯基重復(fù)單元組成并充當FRET過程中的供體。CP由R1和R2基團功能化。二者都可起到使具有親水基團的CP溶解的作用，包括但并不局限于季胺或PEG-型官能團，而R2也可以通過能量水平修飾調(diào)節(jié)光學(xué)性質(zhì)。以位點A功能化的第三共聚單體苯基基團允許與染料或生物分子生物偶聯(lián)。連接體A可以是，但并不局限于馬來酰亞胺、硫醇、琥珀酰亞胺酯(或NHS-酯)、胺、疊氮化物、生物素、親和素/鏈親和素、或可與生物分子或染料上的A’連接體反應(yīng)的其他配體-受體(例如，參見圖4)。
一種允許合成圖9的示例性聚合物的獨特單體顯示于圖10中。該單體具有兩個適合于Suzuki偶聯(lián)的位點(參見Liu and Bazan，J.Am.Chem.Soc.，2005；Liu and Bazan，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，2005；Bazan，Liu，美國臨時申請No.60/666,333，申請于2003年9月17日)，以及重要地，一個允許生物偶聯(lián)的位點A。位點A可以是生物偶聯(lián)位點本身，或前體，諸如鄰苯二甲酰亞胺(被保護的胺)。
圖11和圖12顯示了幾個適合的單體合成的實例。圖11示意性地顯示了具有鄰苯二甲酰亞胺官能團的單體的合成，鄰苯二甲酰亞胺作為被保護的胺。圖12顯示了具有馬來酰亞胺的單體的合成，馬來酰亞胺可生物偶聯(lián)至硫醇。
合成用于聚合作用的兩個單體結(jié)構(gòu)的實例如下。第一步是一步合成用保護的胺(鄰苯二甲酰亞胺的形式)功能化的單體，用于生物偶聯(lián)至琥珀酰亞胺酯，第二步是四步合成用馬來酰亞胺功能化的單體，用于生物偶聯(lián)至硫醇。
N-4’-(3”，5”-二溴苯氧基)丁基鄰苯二甲酰亞胺或1-(4’-鄰苯二甲酰亞胺基丁氧基)3，5-二溴苯。在己烷中再結(jié)晶3，5-二溴苯酚(970mg，3.85mmol)。去除溶劑后，加入N-(4-溴丁基)鄰苯二甲酰亞胺(1.38g，4.89mmol)、K2CO3(1.88g，13.6mmol)、18-冠-6(53mg，0.20mmol)和丙酮(20mL)。回流1小時，然后倒入100mL水中。使用二氯甲烷(4×30mL)萃取水相。合并有機相，用水、飽和NaHCO3和鹽水洗滌，然后用MgSO4干燥，過濾。溶劑的去除產(chǎn)生白色固體，通過柱層析(4∶1己烷∶CH2Cl2)純化，接著在己烷中再結(jié)晶，產(chǎn)生無色針狀物(650mg，87％)。
N-甲氧羰基馬來酰亞胺。馬來酰亞胺(2.00g，20.6mmol)和N-甲基嗎啉(2.08g，20.6mmol)在乙酸乙酯中冷卻至0℃。滴加氯甲酸甲酯(1.4mL，20.7mmol)產(chǎn)生白色沉淀。溶液在0℃攪拌1小時，隨后濾除固體。濃縮濾過液產(chǎn)生粉紅色的油狀物，后用柱層析(洗脫液3∶1己烷∶乙酸乙酯)純化，產(chǎn)生淡黃色晶體。
N-(ω-羥己基)馬來酰亞胺。將6-氨基-1-己醇和飽和NaHCO3(20mL)冷卻至0℃。在攪拌下分批加入N-甲氧羰基馬來酰亞胺。固體不會完全溶解。在0℃攪拌30分鐘(大部分固體在20分鐘后溶解)，然后去除冰浴且再攪拌30分鐘，此時溶液呈淡粉紅色。用水三倍稀釋該液體并用氯仿(3×40mL)洗滌，MgSO4干燥，過濾，且通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑。
1-(6’-溴己氧基)-3，5-二溴苯。3，5-二溴苯酚在己烷中再結(jié)晶。去除溶劑后，加入1，6-二溴己烷、K2CO3、18-冠-6和丙酮?；亓?小時，然后倒入100mL水中。使用二氯甲烷(4×30mL)萃取水相。合并有機相，用水、飽和NaHCO3和鹽水洗滌，然后用MgSO4干燥，過濾。去除溶劑產(chǎn)生灰白色固體，用柱層析純化，產(chǎn)生白色固體。
1-(6’-(6”馬來酰亞胺基己氧基)己氧基)-3，5-二溴苯。將N-(ω-羥己基)馬來酰亞胺、-(6’-溴己氧基)-3，5-二溴苯、K2CO3、18-冠-6和丙酮回流1小時，然后傾倒入100mL水中。使用二氯甲烷(4×30mL)萃取水相。合并有機相，用水、飽和NaHCO3和鹽水洗滌，然后用MgSO4干燥，過濾。去除溶劑產(chǎn)生粗物質(zhì)，用柱層析純化產(chǎn)生純產(chǎn)物。
一般地，在另一個方面，本發(fā)明提供一種用于鑒定靶標生物分子的多發(fā)色團復(fù)合物，其包含多發(fā)色團、傳感器生物分子和信號發(fā)色團。如圖13所示，在一個實施方式中，多發(fā)色團可同時生物偶聯(lián)至染料和生物分子例如生物識別分子上?？捎玫纳锓肿影ǖ⒉痪窒抻诳贵w、親和性配體、核酸、蛋白質(zhì)、納米材料或酶底物。接近多發(fā)色團共價連接染料的優(yōu)點已在上面描述。通過將受體染料和生物識別分子都連接至多發(fā)色團上，有兩個優(yōu)點，通過固定供體-受體距離，保證受體處于供體多發(fā)色團的附近(反之亦然)，并且也提高了指示出生物識別事件的多發(fā)色團結(jié)合的特異性。這些共價復(fù)合物可通過此處所述的單體和連接化學(xué)制備。
如圖13左側(cè)所示，在一個實施方式中，多發(fā)色團(波狀線)經(jīng)過連接體官能團A-A’可生物偶聯(lián)至染料X上，經(jīng)過連接體官能團B-B’可生物偶聯(lián)至生物分子Y上。在如圖12右側(cè)所示的一個替代實施方式中，多發(fā)色團可通過三功能化連接體經(jīng)過連接體官能團A-A’、B-B’和C-C’生物偶聯(lián)至染料X和生物分子Y上。在圖13中所示的實施方式中，該X可以是，但并不局限于，染料、熒光蛋白、納米材料(例如Quantum Dot)、染料和產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的分子之間的偶聯(lián)物、熒光蛋白和產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的分子之間的偶聯(lián)物、或納米材料(例如Quantum Dot)和產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的分子之間的偶聯(lián)物。該Y可以是，但并不局限于，鏈親和素、親和素、酶、酶底物、酶底物類似物、受體、受體的配體、受體的配體類似物、DNA、RNA、修飾的核酸、DNA適體、RNA適體、修飾的核酸適體、肽適體、抗體、抗原、噬菌體、細菌或任何上述兩種成分的偶聯(lián)物。
用于A-A’、B-B’和C-C’的連接化學(xué)可包括，但并不局限于，馬來酰亞胺/硫醇、琥珀酰亞胺酯(NHS酯)/胺、疊氮化物化學(xué)、羧基/EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亞胺鹽酸鹽/胺、胺/磺基-SMCC(磺基琥珀酰亞胺基4-[N-馬來酰亞胺基甲基]環(huán)己烷-1-羧酸酯)/硫醇、和胺/BMPH(N-[β-馬來酰亞胺基丙酸]酰肼·TFA)/硫醇。三功能連接體諸如可商購的磺基-SBED磺基琥珀酰亞胺基[2-6-(生物素酰氨基)-2-(對-疊氮基苯甲酰氨基)-己酰氨基]-乙基-1，3′-二硫代丙酸酯可以在X、Y和多發(fā)色團之間的三向連接中發(fā)揮很好的功能。
在使用中，圖13顯示的實施方式可以是一種鑒定靶標生物分子的多發(fā)色團復(fù)合物，其中該復(fù)合物包含多發(fā)色團、共價連接至該多發(fā)色團的信號發(fā)色團和共價連接至該多發(fā)色團的傳感器生物分子。該復(fù)合物中的信號發(fā)色團能夠接受多發(fā)色團激發(fā)時來自多發(fā)色團的能量，該傳感器生物分子能夠與靶標生物分子相互作用?？梢灶A(yù)想該生物分子可包括但并不局限于抗體、蛋白質(zhì)、親和性配體、肽或核酸。
一般地，在另一個方面，本發(fā)明提供一種用于鑒定生物分子的生物識別復(fù)合物，其中該復(fù)合物包含生物偶聯(lián)物、多發(fā)色團和信號發(fā)色團。在圖14左側(cè)顯示的一個實施方式中，多發(fā)色團同時偶聯(lián)至生物偶聯(lián)物如抗體(1°或2°)和染料上。供體多發(fā)色團與受體染料之間的共價連接保證了緊密接近。供體多發(fā)色團的激發(fā)導(dǎo)致向該受體染料的FRET。當該生物偶聯(lián)物是抗體時，如果該抗體結(jié)合至它的靶標(例如抗原)上，在供體多發(fā)色團激發(fā)后就會通過染料發(fā)射顯示出來。在圖14右側(cè)顯示的一個替代實施方式中，多發(fā)色團可同時偶聯(lián)至SA和染料上。同樣，供體多發(fā)色團與受體染料之間的共價連接保證了緊密接近，供體多發(fā)色團的激發(fā)導(dǎo)致向該受體染料的FRET。該SA復(fù)合物可用于標記或檢測生物素標記的生物分子諸如生物素化的抗體或核酸。多發(fā)色團激發(fā)后向染料標記的FRET將會大大增強檢測信號(即更高的靈敏度)。
圖16顯示了雙標記的多發(fā)色團(以波狀線顯示)的一個實例，它同時生物偶聯(lián)至受體染料和2°抗體(Y形結(jié)構(gòu))上。在一個試驗中，未標記的1°抗體可結(jié)合至抗原，例如靶標蛋白質(zhì)(顯示為黑色三角形)。加入偶聯(lián)至多發(fā)色團并且進一步偶聯(lián)至染料的2°抗體，可特異性地與1°抗體結(jié)合。與直接激發(fā)結(jié)果相比，多發(fā)色團的光學(xué)激發(fā)可引起向染料的能量傳遞和染料發(fā)射放大。
圖17顯示了本發(fā)明一個實施方式的夾心型復(fù)合物的一個實例。在此，多發(fā)色團復(fù)合物由生物偶聯(lián)至染料和生物分子如鏈親和素(SA)的多發(fā)色團(以波狀線顯示)組成。未標記的1°抗體結(jié)合到靶標蛋白(顯示為黑色三角形)上后，生物素標記的2°抗體與1°抗體特異性結(jié)合。在一個分離的步驟中，多發(fā)色團復(fù)合物的加入將導(dǎo)致生物素和鏈親和素之間的特異性結(jié)合，與直接激發(fā)染料相比，多發(fā)色團激發(fā)將導(dǎo)致放大的染料發(fā)射。染料發(fā)射產(chǎn)生的信號將指示靶標蛋白的存在。
在一個進一步的方面，本發(fā)明提供供體能量向多個受體傳遞的多重化技術(shù)。通過在FRET系統(tǒng)中應(yīng)用多發(fā)色團作為供體，也包括能夠多重化的優(yōu)點。一個供體可將能量傳遞至幾個染料；由此在有一個激發(fā)源的情況下，可以監(jiān)測多個染料的強度。當不同類型的細胞可通過蛋白質(zhì)-抗體識別事件被監(jiān)測時，這可用于包括但并不局限于細胞成像(即免疫組化)的應(yīng)用。
在一個實施方式中，兩種染料標記的抗體可與一種生物材料例如培養(yǎng)的細胞系孵育?？贵w可以識別在其表面表達靶標蛋白的細胞并且僅特異性地結(jié)合至這些蛋白質(zhì)上。通過使用不同染料標記這兩種抗體，就有可能同時監(jiān)測兩種不同蛋白質(zhì)或不同細胞類型的表達。典型地，這將需要兩次掃描或成像，每次都用正確的激發(fā)波長。作為分析前的最后一個步驟，將這兩個圖像互相重疊。通過使用同時偶聯(lián)至染料和多發(fā)色團的抗體，對兩個染料可使用一種激發(fā)波長，并且一張圖像將包括來自于兩種抗體的每一個的數(shù)據(jù)組。
該實施方式的一個相關(guān)實例顯示于圖15中，其顯示了一個供體多發(fā)色團將能量傳遞至熒光素標記的DNA探針(點線)、能量傳遞至德克薩斯紅標記的DNA探針(短劃線)、和能量傳遞至兩種探針(實線)的發(fā)射光譜。另外，兩種染料直接激發(fā)產(chǎn)生的光譜顯示為朝向圖15底部的實線。在這三個例子中均看到顯著的染料放大。另外，每種染料均觀察到強烈的信號，無論是否存在其他染料，顯示出良好的多重化潛力?？梢韵胂竦鞍踪|(zhì)診斷的平行結(jié)果。
考慮到用于多重化分析的潛力，可以想象多發(fā)色團可連接至多種染料上，包括，但并不局限于，熒光素、6-FAM、羅丹明、德克薩斯紅、四甲基羅丹明、羧基羅丹明、羧基羅丹明6G、羧基對甲氨基酚、羧基羅丹明110、Cascade Blue、Cascade Yellow、香豆素、
Cy-Chrome、藻紅蛋白、PerCP(多甲藻素葉綠素-a蛋白)、PerCP-Cy5.5、JOE(6-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基熒光素)、NED、ROX(5-(和-6)-羧基-X-羅丹明)、HEX、Lucifer Yellow、MarinaBlue、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、AlexaFluor.RTM.350、Alexa
430、Alexa
488、Alexa
532、Alexa
546、Alexa
568、Alexa
594、Alexa
633、Alexa
647、Alexa
660、Alexa
680、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸、BODIPY.RTM.FL、
FL-Br2、
530/550、
558/568、
564/570、
576/589、
581/591、
630/650、
650/665、
R6G、
TMR、
TR、其偶聯(lián)物、和其組合。
可以想到此處描述的本發(fā)明可用于提高任一種商業(yè)化檢測的靈敏度，其包括但并不局限于OraQuick Rapid HIV-1/2抗體檢測，由OraSure Technologies，Inc.(Bethlehem，PA)生產(chǎn)，是FDA批準的用于口腔液體樣本的HIV診斷測試。該檢測在短至20分鐘的時間內(nèi)可提供超過99％準確性的篩查結(jié)果。
多發(fā)色團 集光多發(fā)色團系統(tǒng)可有效傳遞能量至鄰近的發(fā)光物質(zhì)。能量傳遞機制包括，例如共振能量傳遞(Forster(或熒光)共振能量傳遞，F(xiàn)RET)、量子電荷交換(Dexter能量傳遞)和類似機制。但是典型地，這些能量傳遞機制都處于相對較近的范圍內(nèi)，并且集光多發(fā)色團系統(tǒng)緊密靠近信號發(fā)色團對于高效能量傳遞是必需的。當集光多發(fā)色團系統(tǒng)的發(fā)色團個體數(shù)目較大時可產(chǎn)生發(fā)射的放大；與熒光團直接被泵浦光激發(fā)相比，當入射光(“泵浦光”)處于可被集光多發(fā)色團系統(tǒng)吸收并傳遞至熒光團的波長時，來自于熒光團的發(fā)射強度更強。
本發(fā)明使用的多發(fā)色團可以是電荷中性的、陽離子的或陰離子的。在一些實施方式中，多發(fā)色團是聚陽離子多發(fā)色團。
在多發(fā)色團是聚陽離子的實施方式中，它們可以與含有多個陰離子基團的生物分子如多糖、多核苷酸、肽、蛋白質(zhì)、抗體等相互作用。在一些實施方式中，多發(fā)色團可與靶標抗體或多核苷酸靜電作用，并且通過抗體抗原識別或傳感器多核苷酸和靶標多核苷酸之間的雜交，使不帶電的傳感器多核苷酸上的信號發(fā)色團接近以便于能量接收。任何能吸收光和優(yōu)選地發(fā)射或傳遞能量的聚陽離子多發(fā)色團可在描述的本方法中使用?？墒褂玫亩喟l(fā)色團的例子包括偶聯(lián)的聚合物(CP)、飽和聚合物或以任意可行方式合并多個發(fā)色團的樹狀聚合物、和半導(dǎo)體納米材料(SCNCs)。該CP、飽和聚合物和樹狀聚合物可制備成合并多個陽離子物質(zhì)或可以衍生化以使它們在合成后為聚陽離子形式；通過在它們表面加入陽離子物質(zhì)可使半導(dǎo)體納米材料成為聚陽離子形式。在一些實施方式中，聚陽離子多發(fā)色團不是按照其在激發(fā)時傳遞能量的能力來檢測，因此涉及此類檢測方案的方法不需要多發(fā)色團發(fā)射或傳遞能量。
在一些實施方式中，多發(fā)色團是CP。在一個具體的實施方式中，CP包含一定量的一種類型的“低帶隙重復(fù)單元”，使聚合物在大約450nm至大約1000nm的范圍內(nèi)具有吸收。低帶隙重復(fù)單元在聚合前可表現(xiàn)或不表現(xiàn)這種吸收，但在合并入偶聯(lián)的聚合物之后確實能引入這種吸收。這種吸收特征允許聚合物在多種設(shè)置下在產(chǎn)生較少背景熒光的波長下被激發(fā)，這些設(shè)置包括分析生物樣本和成像和/或檢測分子。CP吸收向較低能量和較長波長的轉(zhuǎn)移因此允許更靈敏和更可靠的方法。另外，許多可商購的儀器中加入了在此波長下工作的成像部件，至少部分原因是為避免此類問題。例如，在擴增反應(yīng)中進行實時檢測的熱循環(huán)儀和微陣列閱讀儀都在此區(qū)域內(nèi)工作。提供在這個區(qū)域內(nèi)吸收的聚合物可使檢測方法適應(yīng)這些形式，也允許進行全新的方法。
整合入能夠降低帶隙的重復(fù)單元可產(chǎn)生具有這些特征的偶聯(lián)的聚合物。產(chǎn)生能在這些波長下吸收光的聚合物的任選取代的種類的例子包括2，1，3-苯并噻二唑、苯并硒二唑(benzoselenadiazole)、苯并碲二唑(benzotellurodiazole)、萘并硒二唑(naphthoselenadiazole)、4，7-二(噻吩-2-基)-2，1，3-苯并噻二唑、方酸染料(squaraine dyes)、喹喔啉、低帶隙商業(yè)化染料、石蠟和氰基取代的石蠟和其異構(gòu)體。關(guān)于合適的多發(fā)色團的組成、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和合成方面的詳情可見于2005年1月10日提交的美國臨時申請No.60/642,901和2006年1月10日提交、現(xiàn)以US 2006-0183140 A1公布的美國專利申請序列號No.11/329,495中，兩者均在此引入作為參考。
多發(fā)色團可被描述為一組共價結(jié)合的發(fā)色團單元或發(fā)色團的共價集合體。多發(fā)色團可包括，但并不局限于，線性結(jié)構(gòu)，諸如偶聯(lián)的聚合物(CPs)和樹狀結(jié)構(gòu)(Wang，Gaylord，and Bazan，Adv.Mater.，2004，Wang，Hong，and Bazan，Org.Lett.，2005。
圖18顯示了作為線性多發(fā)色團的CP的通常結(jié)構(gòu)。在一個實施方式中，該CP可由Liu和Bazan的美國專利申請序列號No.10/666,333“構(gòu)象柔性陽離子偶聯(lián)聚合物”(Conformationally Flexible CationicConjugated Polymers)的表1和表2或方案1中所述的單元組成，也包括此處圖10所示的含有一個或多個獨特生物偶聯(lián)位點的單體。該CP優(yōu)選地含有至少大約0.01mol％的生物偶聯(lián)位點，并且可含有至少大約0.02mol％、至少大約0.05mol％、至少大約0.1mol％、至少大約0.2mol％、至少大約0.5mol％、至少大約1mol％、至少大約2mol％、至少大約5mol％、至少大約10mol％、至少大約20mol％或至少大約30mol％。CCP可含有最多100mol％的生物偶聯(lián)位點，可含有大約99mol％或更少、大約90mol％或更少、大約80mol％或更少、大約70mol％或更少、大約60mol％或更少、大約50mol％或更少、或大約40mol％或更少。
在圖18中，單元CP1、CP2、CP3和CP4是任選被取代的偶聯(lián)聚合物區(qū)段或寡聚結(jié)構(gòu)，并且它們可以彼此相同或不同。CP1、CP2、CP3和CP4可為芳香重復(fù)單元并可選自苯、萘、蒽、芴、噻吩、呋喃、吡啶和噁二唑，每個任選地被取代。另外，CP3和CP4可含有一個或多個獨特的生物偶聯(lián)位點，由的連接體L連接，如圖3h所示。這些生物偶聯(lián)位點可以是，但并不局限于，馬來酰亞胺、硫醇、琥珀酰亞胺酯(NHS酯)、胺、疊氮化物化學(xué)、羧基/EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亞胺鹽酸鹽、磺基-SMCC(磺基琥珀酰亞胺基4-[N-馬來酰亞胺基甲基]環(huán)己烷-1-羧酸酯)、胺/BMPH(N-[β-馬來酰亞胺基丙酸]酰肼·TFA)、或磺基-SBED磺基琥珀酰亞胺基[2-6-(生物素酰氨基)-2-(對-疊氮基苯甲酰氨基)-己酰氨基]-乙基-1，3′-二硫代丙酸酯，它們可以在如圖13的X、Y和CP之間作為三向連接體。
典型的芳香族重復(fù)單元顯示于Liu和Bazan的美國專利申請序列號No.10/666,333“構(gòu)象柔性的陽離子偶聯(lián)聚合物”的表1中，代表性聚合物區(qū)段和寡聚結(jié)構(gòu)顯示于表2中。
圖18含有CP3和CP4，其可以是有角度的連接體(間位形式)，并且可以是具有5至20個原子的單環(huán)或多環(huán)任選取代的芳基基團。CP3和CP4單元可以均勻地或隨機地沿聚合物主鏈分布。
CP1、CP2、CP3和CP4中的每一個任選地在一個或多個位置處被一個或多個基團取代，這些基團選自--R1--A、--R2-B、--R3--C和-R4--D，這些基團可以經(jīng)由橋接官能團--E--和--F--連接在一起，前提是整個聚合物必須被多個陽離子、陰離子、或電荷中性的水溶性基團取代。
R1、R2、R3和R4獨立地選自烷基、烯基、烷氧基、炔基、芳基、烷基芳基、芳基烷基和聚環(huán)氧烷，每個任選地被取代，其可含有一個或多個雜原子，或可能不存在。R1、R2、R3和R4可獨立地選自C1-22烷基、C1-22烷氧基、C1-22酯、具有1至大約22個碳原子的聚環(huán)氧烷、具有1至大約22個碳原子的環(huán)狀冠醚，或不存在。優(yōu)選地，R1、R2、R3和R4可選自具有1至大約12個碳原子的直鏈或支鏈烷基基團，或具有1至大約12個碳原子的烷氧基基團。應(yīng)當理解，一個以上的官能團可以連接到如通式所示的環(huán)的一個或多個位置上。
A、B、C和D獨立地選自H、--SiR′R″R″′、--N+R′R″R″′、胍基、組氨酸、聚胺、吡啶基團和锍基團。R′、R″和R″′獨立地選自氫、C1-12烷基和C1-12烷氧基和C3-12環(huán)烷基。優(yōu)選地，R′、R″和R″是低級烷基或低級烷氧基基團。
E和F獨立地選自缺無、--O--、--S--、--C(O)--、--C(O)O--、--C(R)(R′)--、--N(R′)--和--Si(R′)(R″)，其中R′和R″如上述定義。
X是O、S、Se、--N(R′)--或--C(R′)(R″)--，并且Y和Z獨立地選自--C(R)＝和--N＝，其中R、R′和R″如上述定義。
圖19顯示了一個由含有芴單元和芳香族單元1、2和3的骨架組成的CP。單元1和2可以是、但并不局限于，顯示于圖20中的結(jié)構(gòu)。單元3含有生物偶聯(lián)位點。R1官能團被標為加溶基，可以是，但并不局限于，帶電的烷基官能團(如(CH2)nNMe3Br，或(CH2)nSO3Na)或親水基團(如乙二醇單元，(OCH2CH2)n)。
來自于圖19的π-偶合的單元1、2和3包括Liu和Bazan的美國專利申請序列號No.10/666,333“構(gòu)象柔性的陽離子偶聯(lián)聚合物”的表1和2和方案1中描述的那些物質(zhì)。圖20顯示了可能存在于如圖19所示的普通CP結(jié)構(gòu)內(nèi)的π-偶合的單元的幾個具體實例，用星號表示共價結(jié)合至CP骨架的位點。這些單元包括以典型的對位形式(a、b和e)或以間位形式(c和d)連接至CP骨架的苯單元，間位形式允許在CP骨架內(nèi)具有更好的柔性。這些單元可被改變電子結(jié)構(gòu)的部分功能化(b、d和e)，包括供體基團(烷氧基或乙二醇單元)和吸電子基團(氟)或用親水性乙二醇單元或帶電基團如季胺或磺酸酯改善水溶性(e)。也包括諸如噻吩(f)和苯并噻二唑基團(g)的單元，其可以起到改變電子結(jié)構(gòu)的作用。這些單元好可以像上述那樣被功能化。單元h含有特異性生物偶聯(lián)位點A，例如馬來酰亞胺，其經(jīng)由連接體L例如烷氧基共價結(jié)合至π-偶合的區(qū)段上，并且可以以鄰位、對位或間位的形式被整合至CP骨架上。
特定聚合物結(jié)構(gòu)的幾種變體包括顯示于圖21中的那些，其含有一定百分比的經(jīng)由醚和烷氧基連接體連接的具有馬來酰亞胺或琥珀酰亞胺酯生物偶聯(lián)位點的單元。
本發(fā)明有用的偶聯(lián)聚合物包括但并不局限于以下所述
抗原-抗體相互作用 抗原和抗體之間的相互作用與其他非共價蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用相同。一般地，抗原和抗體之間存在四種類型的結(jié)合相互作用(i)氫鍵，(ii)分散力，(iii)Lewis酸和Lewis堿之間的靜電力，和(iv)疏水相互作用。某些物理力對抗原抗體結(jié)合有貢獻，例如表位形狀與不同抗體結(jié)合位點的適配或互補。此外，其他材料和抗原可與抗體交叉反應(yīng)，由此競爭可以獲得的自由抗體。
抗原抗體之間結(jié)合的親和常數(shù)和特異性的測定是決定免疫測定效率的一個關(guān)鍵因素，不僅可用于評價最好的抗原和抗體制備物以備使用，而且一旦確定基本的免疫測定設(shè)計就可用于維持質(zhì)量控制。
抗體 抗體分子屬于一個稱為免疫球蛋白的血漿蛋白家族，它們的基本組件免疫球蛋白折疊或域，被以各種形式應(yīng)用于免疫系統(tǒng)和其他生物識別系統(tǒng)的許多分子中。一個典型的免疫球蛋白具有四個多肽鏈，含有一個稱為可變區(qū)的抗原結(jié)合區(qū)和一個稱為恒定區(qū)的非可變區(qū)。
天然的抗體和免疫球蛋白通常是大約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白，由兩個相同的輕(L)鏈和兩個相同的重(H)鏈組成。每個輕鏈通過一個共價二硫鍵與一個重鏈連接，但不同免疫球蛋白同種型的重鏈之間二硫鍵的數(shù)目不同。每個重鏈和輕鏈也具有規(guī)律地隔開的鏈內(nèi)二硫橋。每個重鏈在一端具有一個可變區(qū)(VH)，緊隨著幾個恒定區(qū)。每個輕鏈在一端具有一個可變區(qū)(VL)，在另一端有一個恒定區(qū)。輕鏈的恒定區(qū)和重鏈的第一恒定區(qū)對齊，并且輕鏈可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)對齊。
按照它們重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，免疫球蛋白可分成不同的類別。至少有五(5)個主要的免疫球蛋白類別IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中幾個可進一步分成亞類(同種型)，例如IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2。不同類別的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)象眾所周知。有關(guān)抗體結(jié)構(gòu)、功能、使用和制備方面更詳盡的信息在2006年2月14日授權(quán)的美國專利No.6,998,241中有討論，其完整內(nèi)容在此引入作為參考。
夾心測定 抗體或多抗體夾心測定是本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的，包括1984年12月4日授權(quán)的美國專利No.4,486,530和其中提及的參考文獻所公開的那些。圖6、7、8和14顯示的結(jié)構(gòu)可直接按照描述的使用或以各種夾心形式使用。夾心形式或夾心測定是指使用連續(xù)的識別事件來建立起多種生物分子的層，并且使用報告元件來顯示特定生物分子的存在。一個標準的實例是抗體的連續(xù)使用。在這些測定中，第一抗體結(jié)合靶標，第二抗體結(jié)合第一抗體，第三抗體可結(jié)合第二抗體，以此類推。每一個接續(xù)的層都可加上額外的報告基團。另一個策略是重復(fù)加入兩個(或多個)可互相識別的組分的交替層，或兩個以上的鏈識別關(guān)系的組分，其包含一個或兩個多聚結(jié)構(gòu)形式的組分。在這樣的設(shè)置中，每個多聚結(jié)構(gòu)中的一個或多個官能團可用報告基團標記且未被占據(jù)的官能團可作為其他組分的識別位點，并且這個系統(tǒng)將隨后提供一個信號放大的平臺。這種方法的一個典型實例是使用鏈親和素-報告分子偶聯(lián)物和生物素化的抗鏈親和素抗體。在此類測定中，生物素化的傳感器分子(核酸或抗體)可用于結(jié)合靶標生物分子，其隨后被含有鏈親和素-報告分子偶聯(lián)物和生物素化抗鏈親和素抗體的檢測系統(tǒng)識別。通過連續(xù)幾輪生物素化抗體與標記的鏈親和素復(fù)合物的相互作用，就可以建立起這種情況中的夾心結(jié)構(gòu)，以實現(xiàn)信號放大。通過多發(fā)色團與生物素化抗體或鏈親和素報告分子復(fù)合物額外偶聯(lián)，可能進一步增加信號輸出?；旧?，這種類型的信號放大系統(tǒng)中多發(fā)色團的整合可進一步放大信號至更高的水平。
通過直接整合集光多發(fā)色團到常用的識別元件中，圖6、7、8、14、16和17中描述的生物素化聚合物復(fù)合物可用于創(chuàng)建光學(xué)增強的夾心試驗。多發(fā)色團偶聯(lián)的結(jié)構(gòu)的優(yōu)點也可以直接應(yīng)用于第一靶標識別元件而無需連續(xù)的識別元件。例如，如圖14所示，第一抗體可直接偶聯(lián)至多發(fā)色團-染料復(fù)合物上。這種復(fù)合物可用于直接探查是否存在靶標生物分子。
多核苷酸 擴增的靶標多核苷酸可進行擴增后處理。例如，在一些例子中，可能需要在雜交之前把靶標多核苷酸片斷化來提供更易接近的區(qū)段。核酸的片斷化可通過任何能產(chǎn)生適合所進行試驗的大小的片斷的方法來實現(xiàn)；適當?shù)奈锢怼⒒瘜W(xué)和酶方法在本領(lǐng)域中眾所周知。
擴增反應(yīng)可以在至少在部分擴增循環(huán)中允許傳感器多核苷酸與擴增產(chǎn)物雜交的條件下進行。當以此種模式進行測定時，該雜交事件的實時檢測可以通過監(jiān)測擴增中的光發(fā)射來實現(xiàn)。
實時PCR產(chǎn)物分析(和相關(guān)的實時逆轉(zhuǎn)錄PCR)提供了一種眾所周知的實時PCR監(jiān)測技術(shù)，該技術(shù)已應(yīng)用于許多應(yīng)用中，其可以修改用于此處描述的方法(參見，Laurendeau et al.(1999)″TaqMan PCR-basedgene dosage assay for predictive testing in individuals from a cancer familywith INK4 locus haploinsufficiency″Clin Chem 45(7)982-6；Laurendeau etal.(1999)″Quantitation of MYC gene expression in sporadic breast tumorswith a real-time reverse transcription-PCR assay″Clin Chem59(12)2759-65；和Kreuzer et al.(1999)″LightCycler technology for thequantitation of bcr/abl fusion transcripts″Cancer Research 59(13)3171-4，以上所有內(nèi)容均在此引入). 樣本 原則上，樣本可以是任何懷疑含有能夠在聚集傳感器上引發(fā)聚集反應(yīng)的聚集物的材料。在一些實施方式中，樣本可以是任何來源的生物材料，其包含能夠從活的生命體(包括細胞、組織或體液)直接或間接獲得的多核苷酸，以及由該生命體留下的沉積物，包括病毒、支原體和化石。樣本可整體或部分地包含由合成手段制備的聚集物。典型地，獲得的樣本為主要為水性的介質(zhì)或分散于主要為水性的介質(zhì)中。樣本的非限制實例包括血液、尿、精液、奶、痰、粘液、口腔拭子、陰道拭子、直腸拭子、抽出液、針吸活檢組織、例如通過手術(shù)或尸檢獲得的組織切片、血漿、血清、脊髓液、淋巴液、皮膚外分泌物、呼吸道、消化道、和泌尿生殖道、淚液、唾液、腫瘤、器官、體外細胞培養(yǎng)組分樣本(包括但并不局限于細胞在細胞培養(yǎng)基中生長產(chǎn)生的條件培養(yǎng)液、推斷被病毒感染的細胞、重組細胞、和細胞組分)、和包含多核苷酸序列的重組庫。
樣本可為已知含有聚集物或其替代物的陽性對照樣本。也可使用陰性對照樣本，盡管預(yù)期其不含有聚集物，但懷疑其含有聚集物(經(jīng)由一種或多種試劑的污染)或另一能夠產(chǎn)生假陽性的組分，并且其檢測是為了確認在特定試驗中使用的試劑沒有被靶標多核苷酸所污染，以及確定給定的一組試驗條件是否產(chǎn)生假陽性(樣本中即使沒有多核苷酸也產(chǎn)生陽性信號)。
樣本可被稀釋、溶解、懸浮、提取或進行其他處理來溶解和/或純化存在的任何靶標多核苷酸或使之能夠接近擴增方案中使用的試劑或接近檢測試劑。當樣本含有細胞時，細胞可被裂解或通透化來釋放細胞內(nèi)的多核苷酸。一步通透化緩沖液可用來裂解細胞，在裂解后允許直接進行進一步的步驟，例如聚合酶鏈反應(yīng)。
信號發(fā)色團 在一些實施方式中，可采用信號發(fā)色團或熒光團，例如來接收從激發(fā)態(tài)的光活性單元傳遞的能量，或與標記的探針交換能量，或用于多個能量傳遞方案中。此處描述的本發(fā)明可用的熒光團包括任何能吸收適當波長的能量和發(fā)射或傳遞能量的物質(zhì)。對于多重試驗，多種不同的熒光團可用于可檢測地不同的發(fā)射光譜。典型的熒光團包括熒光染料、半導(dǎo)體納米晶體、鑭系金屬螯合物和綠色熒光蛋白。
熒光染料的例子包括熒光素、6-FAM、羅丹明、德克薩斯紅、四甲基羅丹明、羧基羅丹明、羧基羅丹明6G、羧基對甲氨基酚、羧基羅丹明110、Cascade Blue、Cascade Yellow、香豆素、
Cy-Chrome、藻紅蛋白、PerCP(多甲藻素葉綠素-a蛋白)、PerCP-Cy5.5、JOE(6-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基熒光素)、NED、ROX(5-(和-6)-羧基-X-羅丹明)、HEX、Lucifer Yellow、Marina Blue、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、AlexaFluor.RTM.350、Alexa
430、Alexa
488、Alexa
532、Alexa
546、Alexa
568、Alexa
594、Alexa
633、Alexa
647、Alexa
660、Alexa
680、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸、BODIPY.RTM.FL、
FL-Br2、
530/550、
558/568、
564/570、
576/589、
581/591、
630/650、
650/665、
R6G、
TMR、
TR、其偶聯(lián)物、和其組合。鑭系金屬螯合物的例子包括銪螯合物、鋱螯合物和釤螯合物。
多種熒光半導(dǎo)體納米材料(″SCNCs″)在本領(lǐng)域中眾所周知；制造和使用半導(dǎo)體納米材料的方法描述于PCT公開No.WO 99/26299，1999年5月27日公布，發(fā)明人為Bawendi等；1999年11月23日授予Weiss等人的USPN 5,990,479；和Bruchez et al.，Science 2812013，1998。半導(dǎo)體納米材料可具有非常窄的發(fā)射譜帶和非常明確的峰值發(fā)射波長，允許使用大量不同的SCNC在同一試驗中作為信號發(fā)色團，任選地與其他非SCNC類型的信號發(fā)色團組合使用。
多核苷酸特異性染料的例子包括吖啶橙、吖啶同型二聚體、放線菌素D、7-氨基放線菌素D(7-AAD)、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶(ACMA)、BOBOTM-1碘化物(462/481)、BOBOTM-3碘化物(570/602)、BO-PROTM-1碘化物(462/481)、BO-PROTM-3碘化物(575/599)、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚二乳酸鹽(DAPI，乳酸鹽)、二氫乙錠(氫乙錠)、二氫乙錠(氫乙錠)、二氫乙錠(氫乙錠)、溴化乙錠、二疊氮氯化乙錠、乙錠同型二聚體-1(EthD-1)、乙錠同型二聚體-2(EthD-2)、一疊氮溴化乙錠(EMA)、碘化己錠(hexidium iodide)、Hoechst 33258、Hoechst33342、Hoechst 34580、Hoechst S769121、羥芪巴脒(hydroxystilbamidine)、甲磺酸酯、JOJOTM-1碘化物(529/545)、JO-PROTM-1碘化物(530/546)、LOLOTM-1碘化物(565/579)、LO-PROTM-1碘化物(567/580)、NeuroTraceTM 435/455、NeuroTraceTM 500/525、NeuroTraceTM 515/535、NeuroTraceTM 530/615、NeuroTraceTM 640/660、OliGreen、
ssDNA、
dsDNA、POPOTM-1碘化物(434/456)、POPOTM-3碘化物(534/570)、PO-PROTM-1碘化物(435/455)、PO-PROTM-3碘化物(539/567)、碘化丙錠、
Light、
Green I、
Green II、
Gold、
101、
102、
103、
DX、TO-
-1、TO-
-3、TO-
-5、
-1、
-3、YO-
-1(噁唑黃)、YO-
-3、
-1、
-3、TO、
Blue、
Green、
Orange、
9、
BC、
40、
41、
42、
43、
44、
45、
Blue、
11、
12、
13、
14、
15、
16、
20、
21、
22、
23、
24、
25、
Green、
80、
81、
82、
83、
84、
85、
Orange、
17、
59、
60、
61、
62、
63、
64、
Red、紡錘菌素、遠霉素、吖啶橙、3，4-苯并芘、噻唑橙、TOMEHE、柔紅霉素、吖啶、戊基-TOTAB、和丁基-TOTIN。不對稱花青染料可作為多核苷酸特異性染料使用。其他感興趣的染料包括那些描述于下述文獻中染料Geierstanger，B.H.and Wemmer，D.E.，Annu.Rev.Vioshys.Biomol.Struct.1995，24，463-493，by Larson，C.J.and Verdine，G.L.，Bioorganic ChemistryNucleic Acids，Hecht，S.M.，Ed.，OxfordUniversity PressNew York，1996；pp 324-346，和Glumoff，T.andGoldman，A.Nucleic Acids in Chemistry and Biology，2nd ed.，Blackburn，G.M.and Gait，M.J.，Eds.，Oxford University PressOxford，1996，pp375-441。多核苷酸特異性染料可為嵌入式染料，且可以是對雙鏈多核苷酸特異性的。其他染料和熒光團在www.probes.com(MolecularProbes，Inc.)中有描述。
術(shù)語“綠色熒光蛋白”指天然的多管水母(Aequorea)綠色熒光蛋白和突變形式，二者均被鑒定能呈現(xiàn)改變的熒光特征，包括改變的激發(fā)和發(fā)射最大值，以及不同形狀的激發(fā)和發(fā)射光譜(Delagrave，S.et al.(1995)Bio/Technology 13151-154；Heim，R.et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9112501-12504；Heim，R.et al.(1995)Nature 373663-664)。Delgrave等人分離了克隆的維多利亞多管水母(Aequorea victoria)GFP突變體，其具有紅移激發(fā)光譜。Bio/Technology 13151-154(1995)。Heim，R.等人報道了一個突變體(Tyr66突變?yōu)镠is)，其具有藍色熒光(Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)USA 9112501-12504)。
基質(zhì) 在一些實施方式中，試驗組分可置于基質(zhì)上?；|(zhì)可包括多種材料，不論是生物學(xué)的、非生物學(xué)的、有機的、無機的，或上述任一種的組合。例如，基質(zhì)可為聚合的Langmuir Blodgett膜、功能化的玻璃、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO2、SiN4，、改性硅、或多種凝膠或聚合物中的任一種，諸如(聚)四氟乙烯、聚偏二氟乙烯、聚苯乙烯、交聯(lián)的聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚乳酸、聚乙醇酸、丙交酯乙交酯共聚物、聚酐、聚(甲基丙烯酸甲酯)、乙烯乙酸乙烯酯共聚物、聚硅氧烷、聚二氧化硅、乳膠、葡聚糖聚合物、環(huán)氧樹脂(epoxies)、聚碳酸酯、或其組合。可使用導(dǎo)電聚合物和光導(dǎo)材料。
基質(zhì)可為平面結(jié)晶的基質(zhì)，諸如基于二氧化硅的基質(zhì)(例如玻璃、石英，或類似物)，或例如用于半導(dǎo)體和微處理器工業(yè)的結(jié)晶基質(zhì)，諸如硅、砷化鎵、摻雜銦的GaN和類似物，并且包括半導(dǎo)體納米晶體。
基質(zhì)可采用光電二極管、光電傳感器諸如光電半導(dǎo)體芯片或光電薄膜半導(dǎo)體、或生物芯片的形式。基質(zhì)上探針的定位可以尋址；這可以通過高度密集的形式完成，且位置可以微米尋址或納米尋址。
二氧化硅氣凝膠也可被用作基質(zhì)，且可通過本領(lǐng)域已知的方法制備。氣凝膠基質(zhì)可用作自由直立基質(zhì)或作為另一種基質(zhì)材料的表面涂層。
基質(zhì)可采用任何形式，并且典型地是板、薄片、珠、小球、盤、顆粒、微粒、納米顆粒、鏈、沉淀、任選多孔的凝膠、薄層、管、球、容器、毛細管、墊、片、膜、小片、多孔板或皿、光纖等等?；|(zhì)可為剛性或半剛性的任意形式?；|(zhì)可含有凸起或凹陷的區(qū)域，試驗組分定位于此?；|(zhì)表面可使用眾所周知的技術(shù)蝕刻，以提供理想的表面特征，例如溝槽、V-溝、階式(mesa)結(jié)構(gòu)等等。
基質(zhì)表面可由與基質(zhì)相同的材料構(gòu)成或可由不同材料制成，并且可通過化學(xué)或物理方法偶聯(lián)至基質(zhì)表面。這些偶聯(lián)的表面可由任何材料構(gòu)成，例如聚合物、塑料、樹脂、多糖、二氧化硅或基于二氧化硅的材料、碳、金屬、無機玻璃、膜、或上述列出的任何基質(zhì)材料。表面可以任選地為透明的并可具有Si-OH官能性，諸如二氧化硅表面上存在的那些。
可以選擇基質(zhì)和/或其任選的表面，來為所用的合成方法和/或檢測方法提供適當?shù)奶匦?。基質(zhì)和/或表面可以是透明的，以允許基質(zhì)暴露于來自多個方向的光?；|(zhì)和/或表面可以具有反射“鏡”結(jié)構(gòu)，以增加光的回收。
基質(zhì)和/或其表面一般地對它在使用中暴露的條件有抗性，或被處理為具有抗性，并且能任選地被處理，以在暴露于這些條件后去除任何抗性材料。
可以使用任何適當?shù)姆椒?，將多核苷酸探針制造在基質(zhì)上或附著在基質(zhì)上，例如美國專利No.5,143,854，PCT公開No.WO 92/10092，1990年12月6日提交的美國專利申請No.07/624,120(現(xiàn)已放棄)，F(xiàn)odoret al.，Science，251767-777(1991)，和PCT公開No.WO 90/15070)中描述的方法。使用機械合成策略合成這些陣列的技術(shù)在例如PCT公開No.WO 93/09668和美國專利No.5,384,261中均有描述。
另外的技術(shù)包括諸如那些在PCT公開No.PCT/US93/04145中描述的基于珠子的技術(shù)，和諸如那些在美國專利No.5,288,514中描述的基于針的方法。
適合將傳感器多核苷酸附著在基質(zhì)上的其它流動槽和點樣方法在1992年11月20日提交的美國專利申請No.07/980,523和美國專利No.5,384,261中描述。試劑通過以下方法被傳送至基質(zhì)(1)在預(yù)定區(qū)域上設(shè)定的槽內(nèi)流動，或(2)在預(yù)定區(qū)域上“點樣”。在將要保護的基質(zhì)的部分上可使用諸如親水性或疏水性涂層的保護性涂層(取決于溶劑的性質(zhì))，有時與在其他區(qū)域有利于反應(yīng)劑溶液濕潤的其他材料組合。以此種方式，進一步防止了流動的溶液流出指定的流動路徑之外。
典型的分配器包括任選機器控制的微量移液器、噴墨打印機、一套試管、多歧管、一套移液器，等等，以便于將多種試劑先后或同時被傳送至反應(yīng)區(qū)域。
基質(zhì)或其區(qū)域可被編碼，以便可以確定所查詢的位于基質(zhì)或區(qū)域中的傳感器的身份。任何適當?shù)木幋a方案都可采用，例如光學(xué)碼、RFID標簽、磁性碼、物理碼、熒光碼、和組合碼。
激發(fā)和檢測 任何儀器，如果它能夠提供能激發(fā)聚集傳感器同時短于待檢測發(fā)射波長的波長，都能用于激發(fā)?？缮藤彽难b置可提供適當?shù)募ぐl(fā)波長以及適當?shù)臋z測元件。
激發(fā)源的例子包括寬帶UV光源，諸如帶有合適濾光片的氘燈，白光源輸出，諸如經(jīng)過單色光鏡來提取出所需波長的氙燈或氘燈，連續(xù)波長(cw)氣體激光器，固態(tài)二極管激光器，或任何脈沖激光器。發(fā)射光可通過任何適當裝置或技術(shù)來檢測；許多適當?shù)姆椒ㄔ诒绢I(lǐng)域內(nèi)眾所周知。例如，熒光計或分光光度計可被用于檢測待測樣本在多發(fā)色團被激發(fā)時是否發(fā)出信號發(fā)色團所特有的波長的光來。
物質(zhì)的組合物 還提供了此處描述的任何分子的任何形式的物質(zhì)組合物。此處描述的多發(fā)色團和包含多發(fā)色團的復(fù)合物可以以純化和/或分離的形式提供。多發(fā)色團和包含多發(fā)色團的復(fù)合物可以以晶體形式提供。
多發(fā)色團和包含多發(fā)色團的復(fù)合物可以在溶液中提供，該溶液可以是主要為水的溶液，其可包含一種或多種此處描述的額外溶液組分，包括但不限于額外的溶劑、緩沖液、生物分子、多核苷酸、熒光團等。多發(fā)色團和包含多發(fā)色團的復(fù)合物在溶液中以一定濃度存在，在該濃度下來自于第一光活性單元的第一發(fā)射在不存在生物分子靶標或與其相關(guān)的生物分子的情況下可被檢測到。溶液可包含如此處所述的額外的組分，包括標記的探針，諸如熒光標記的抗體或多核苷酸，它們對于一類生物分子靶標或其相關(guān)生物分子是特異性的，用于多發(fā)色團和包含多發(fā)色團的復(fù)合物。
多發(fā)色團和包含多發(fā)色團的復(fù)合物可以以膜的形式提供。物質(zhì)的組合物可通過任何此處描述的性質(zhì)來要求保護，包括根據(jù)提出的結(jié)構(gòu)、通過合成方法、通過吸收和/或發(fā)射光譜、通過元素分析、通過NMR光譜、或通過任何其他性質(zhì)或特征。
在一些實施方式中，可在樣本中檢測基因的表達。在一個進一步的實施方式中，檢測生物分子靶標或與其相關(guān)的生物分子的測量結(jié)果可用于診斷患者的疾病狀態(tài)。在另一個實施方式中，本發(fā)明的檢測方法可進一步包括診斷疾病狀態(tài)的方法。在一個相關(guān)的實施方式中，診斷疾病的方法可包括檢查和分析關(guān)于生物分子靶標或與其相關(guān)的生物分子是否存在的數(shù)據(jù)，并對患者、醫(yī)務(wù)人員或醫(yī)療衛(wèi)生管理者提出結(jié)論，該結(jié)論是基于檢查和分析關(guān)于疾病診斷的數(shù)據(jù)而作出的。檢查和分析此類數(shù)據(jù)可通過使用此處描述的計算機或其他數(shù)字裝置和網(wǎng)絡(luò)來得到協(xié)助?？梢灶A(yù)想關(guān)于此類數(shù)據(jù)的信息可通過網(wǎng)絡(luò)來傳遞。
在實踐本發(fā)明的方法的過程中，任選地使用許多分子生物學(xué)的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)眾所周知且在例如下述的出版物中闡述Ausubel et al.(Eds.)Current Protocols in Molecular Biology，Volumes I，II，and III，(1997)，Ausubel et al.(Eds.)，Short Protocols in Molecular BiologyA Compendiumof Methods from Current Protocols in Molecular Biology，5th Ed.，JohnWiley & Sons，Inc.(2002)，Sambrook et al.，Molecular CloningALaboratory Manual，3rd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2000)，and Innis et al.(Eds.)PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications，Elsevier Science & Technology Books(1990)，以上所有出版物均在此引入作為參考。
圖22是一個流程圖，顯示了一個代表性邏輯裝置實例，通過該裝置可實現(xiàn)檢查和分析關(guān)于本發(fā)明的數(shù)據(jù)。此類數(shù)據(jù)可與受試者的疾病、紊亂或狀況相關(guān)。圖22顯示了一個連接至儀器820的計算機系統(tǒng)(或數(shù)字裝置)800，它們與多發(fā)色團和多發(fā)色團復(fù)合物824一起使用，例如用來產(chǎn)生結(jié)果。可以把計算機系統(tǒng)800理解為一個可以讀取來自介質(zhì)811和/或網(wǎng)絡(luò)接口805的指令的邏輯裝置，網(wǎng)絡(luò)接口805可以任選地連接至具有固定介質(zhì)812的服務(wù)器809。圖22顯示的系統(tǒng)包括CPU801、磁盤驅(qū)動器803、光輸出裝置如鍵盤815和/或鼠標816和任選的監(jiān)視器807?？赏ㄟ^示出的通訊介質(zhì)與當?shù)鼗蜻h程的服務(wù)器809實現(xiàn)數(shù)據(jù)通訊。通訊介質(zhì)可包括任何傳輸和/或接收數(shù)據(jù)的手段。例如通訊介質(zhì)可以是網(wǎng)絡(luò)連接、無線連接或因特網(wǎng)連接。可以預(yù)想關(guān)于本發(fā)明的數(shù)據(jù)可通過此類網(wǎng)絡(luò)或連接來傳輸。
在一個實施方式中，計算機可讀介質(zhì)包括適合傳輸生物學(xué)樣本分析結(jié)果的介質(zhì)。該介質(zhì)可包括關(guān)于患者的疾病狀況或狀態(tài)的結(jié)果，其中此結(jié)果是使用此處描述的方法獲得的。
試劑盒 還提供了包含用于實施所述方法的試劑的試劑盒。
在一些實施方式中，試劑盒包含多種試劑，該試劑包括多發(fā)色團或多發(fā)色團復(fù)合物，生物偶聯(lián)物，例如抗體，和其他此處描述的組分。
試劑盒可以任選地含有一種或多種下述物質(zhì)一種或多種標記物，其可整合到多發(fā)色團或多發(fā)色團復(fù)合物中；和一個或多個基質(zhì)，其可以含有或不含有陣列，等等。
試劑盒的組分可容納在外包裝中。關(guān)于使用試劑盒進行所述方法的說明可與外包裝一起提供，并且可以任何固定介質(zhì)來提供。說明可放在外包裝內(nèi)或外包裝以外，并且可印在構(gòu)成外包裝的任何表面的內(nèi)部或外部，使得說明清晰可見。試劑盒可以是多重形式，用于檢測一種或多種不同靶標生物分子或與其相關(guān)的生物分子。
如此處所述并且如圖23中所示，在一些實施方式中，試劑盒903可包括容器或外包裝902用來容納各種組分。如圖23所示和此處所述，在一個實施方式中，試劑盒903包含一種或多種多發(fā)色團或多發(fā)色團復(fù)合物試劑905，并且任選地提供基質(zhì)900。如圖23所示和此處所述，試劑盒903可以任選地包括說明901?？梢韵氲皆噭┖?03的其他實施方式，其中組分包括多種額外的此處描述的物質(zhì)。
實施例 實施例1. 使用聚合物-染料偶聯(lián)的抗體的夾心ELISA方法的總體方案 1.向96孔聚氯乙烯(PVC)微孔板的每孔中加入大約50μL抗體溶液(20μg/mL，在PBS中)，以此使未標記的抗體結(jié)合至每孔的底部。PVC將結(jié)合大約100ng/孔(300ng/cm2)。使用的抗體量取決于各個試驗。
2.在4℃下過夜孵育微孔板來確保完全結(jié)合。
3.用PBS漂洗微孔兩次。
4.微孔板上剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點必須通過用封閉緩沖液孵育而達到飽和。向孔中添加含0.02％疊氮化鈉的3％BSA/PBS至頂部。在室溫潮濕氣氛下孵育2小時至過夜。
5.用PBS漂洗微孔兩次。
6.向孔中加入50μL抗原(或樣本)溶液(抗原溶液必須滴定)。所有稀釋須在封閉緩沖液(3％BSA/PBS)中進行。在室溫潮濕氣氛下孵育至少2小時。
7.用PBS洗板四次。
8.加入過量的聚合物-染料-第二抗體偶聯(lián)物(實例A或C)或生物素標記的抗體。
9.在室溫潮濕氣氛下孵育2小時或更長時間。
10.更換幾次PBS漂洗。
11.當在步驟8中使用生物素標記的抗體時，加入鏈親和素-聚合物-染料偶聯(lián)物(實例B或D，在含有1M NaCl的PBS中)，并且在室溫潮濕氣氛下孵育2小時或更長時間。
12.用ELISA讀板儀在目標波長下測量光密度。
對于定量結(jié)果，將未知樣本的信號與標準曲線比較。每次試驗都必須運行標準品以確保準確性。
在該ELISA試驗中，第一抗體分子可結(jié)合于微孔板孔的側(cè)面和底部。當含有靶標分子的樣本加入到孔中時，固定的第一抗體將僅捕獲這些靶標，而樣本中其余的組分將被洗去。與常用的熒光標記抗體相比，由于它們更高的集光能力和它們能獲得更好能量傳遞效率的同一分子內(nèi)設(shè)計，所述的聚合物-染料-第二抗體偶聯(lián)物可發(fā)出比常規(guī)方案更強的信號(10-100倍)。這些優(yōu)點也可以轉(zhuǎn)化為具有更高靈敏度的測定。當進一步把聚合物-染料-第二抗體偶聯(lián)物與其他具有信號放大功能部分的第二抗體(例如辣根過氧化物酶標記的抗體)相比，聚合物-染料-第二抗體偶聯(lián)物可提供一步過程(無需額外的酶底物)來達到信號放大的目的。也可以預(yù)期所述偶聯(lián)物的成本效率(無論是時間還是材料)具有更好的市場接受性。
實施例2. 用聚合物-染料偶聯(lián)的抗體標記的微陣列的總體方案 1.制備總RNA或mRNA。
2.使用T7-oligo(dT)引物來實現(xiàn)一步循環(huán)或兩步循環(huán)cDNA合成。
3.清洗雙鏈cDNA。
4.使用IVT(體外轉(zhuǎn)錄)擴增試劑盒將生物素標記的核糖核苷酸整合到cRNA中。
5.將cRNA片斷化。
6.在芯片上雜交cRNA片斷。
7.洗掉殘余的cRNA，并且用鏈親和素-聚合物-染料偶聯(lián)物(實例B或D)對芯片染色。
8.洗掉芯片上殘余的試劑。
9.掃描微陣列。
在微陣列方法學(xué)的常規(guī)實踐中，將生物素標記的核苷酸整合至cRNA序列中是隔離鏈親和素藻紅蛋白偶聯(lián)物和生物素化抗鏈親和素抗體用于放大的信號報告的手段。由于鏈親和素藻紅蛋白偶聯(lián)物生產(chǎn)的復(fù)雜性，批間差異是顯著的。因此，鏈親和素-聚合物-染料偶聯(lián)物可為鏈親和素藻紅蛋白偶聯(lián)物的一個非常好的替代物。況且，此前的出版物已經(jīng)證明，通過它的集光和能量傳遞功能部分，多發(fā)色團可將熒光信號放大高達75倍。有理由預(yù)期，鏈親和素-聚合物-染料偶聯(lián)物可具有等同于或優(yōu)于藻紅蛋白的表現(xiàn)。
本發(fā)明優(yōu)選的實施方式已經(jīng)在此顯示并描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當明了這些實施方式只是作為例子提供。在不背離本發(fā)明的前提下本領(lǐng)域技術(shù)人員將會想到許多變動、變化和替代。應(yīng)當理解在實施本發(fā)明中可采用此處描述的本發(fā)明實施方式的多種替代方案?？梢灶A(yù)期下面的權(quán)利要求限定了本發(fā)明的范圍，因此涵蓋這些權(quán)利要求的范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)以及它們的等同物。
實施例3. 具有胺官能團的陽離子偶聯(lián)聚合物CA001的合成
1-(4’-鄰苯二甲酰亞氨基丁氧基)-3，5-二溴苯在己烷中再結(jié)晶3，5-二溴苯酚(970mg，3.85mmol)。去除溶劑后，加入N-(4-溴丁基)鄰苯二甲酰亞胺(1.38g，4.89mmol)、K2CO3(1.88g，13.6mmol)、18-冠-6(53mg，0.20mmol)和丙酮(20mL)?；亓?小時，然后倒入100mL水中。使用二氯甲烷(4×30mL)萃取水相。合并有機相，用水、飽和NaHCO3和鹽水洗滌，然后用MgSO4干燥，過濾。溶劑的去除產(chǎn)生白色固體，通過柱層析(4∶1己烷∶CH2Cl2)純化，接著在己烷中再結(jié)晶，產(chǎn)生無色針狀物(650mg，87％)。1H NMR(CDCl3)7.860(m，2H)；7.733(m，2H)；7.220(t，J＝1.6Hz，1H)；6.964(d，J＝2.0Hz，2H)；3.962(t，J＝6.0Hz，2H)；3.770(t，J＝6.6Hz，2H)；1.846(m，4H)。
[(2，7-{9，9-二(4’-(磺酸鈉)丁基)}芴-交替共聚-1，4-{2，5-二氟}亞苯基)-共聚-(2，7-{9，9-二(4’-(磺酸鈉)丁基)}芴-交替共聚-3，5-1-{4’-鄰苯二甲酰亞胺基丁氧基)亞苯基)]共聚物在一個100mL的裝備有水套回流冷凝器的圓底燒瓶中，2，7-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧雜硼雜環(huán)戊烷-2-基)-9，9-二(6′-溴己基)芴(1.001g，1.34mmol)、1，4-二溴-2，5-二氟苯(346.6mg，1.274mmol)、1-(4’-鄰苯二甲酰亞胺基丁氧基)-3，5-二溴苯(30.8mg，0.068mmol)、碳酸鉀(2.15g，15.5mmol)和四(三苯基膦)鈀(0)(37.2mg，0.032mmol)在THF(45mL)和水(15mL)中的溶液經(jīng)由四個冷凍-抽氣-融解循環(huán)脫氣，在第三和第四輪脫氣后引入氬。然后將溶液在氬氣氛下加熱回流48小時。冷卻后，將溶液滴加至40mL攪拌的甲醇中，以沉淀聚合物，離心收集。然后用甲醇潷析和洗滌(兩次)以去除低分子量組分，產(chǎn)生淺黃色蓬松粉末(500mg，62％)。1H NMR(CD2Cl2)7.912-7.419(m，8H)；3.322(t，J＝7.4Hz，4H)；2.120(br s，4H)；1.693(t，J＝7.0Hz，4H)；1.237(br s，4H)；1.153(br s，4H)；0.788(br s，4H).Mn 17K，PDI 2.1。
[(2，7-{9，9-二(6’-(N，N，N-三甲基溴化銨)己基)}芴-交替共聚-1，4-{2，5-二氟}亞苯基)-共聚-(2，7-{9，9-二(6’-(N，N，N-三甲基溴化銨)己基)}芴-共聚-alt-3，5-1-{4’-鄰苯二甲酰亞胺基丁氧基)亞苯基)]共聚物將三甲胺(1mL)減壓濃縮至[(2，7-{9，9-二(6’-溴己基)}芴-交替共聚-1，4-{2，5-二氟}亞苯基)-共聚-(2，7-{9，9-二(6’-溴己基)}芴-共聚-alt-3，5-1-{4’-鄰苯二甲酰亞胺基丁氧基)亞苯基)]共聚物(130mg，0.215mmol)在THF(10mL)中的溶液中。將溶液攪拌24h，此時聚合物從溶液中沉淀出來。加入甲醇(50mL)溶解聚合物，然后另外1mL的三甲胺減壓濃縮至反應(yīng)瓶中。再攪拌24小時，然后在減壓狀態(tài)下去除所有溶劑和多余的三甲胺，產(chǎn)生淡黃色膜(140mg，90％)。1H NMR(D2O)7.871-7.423(m，8H)；3.148(m，4H)；2.970(br s，18H)；2.116(br s，4H)；1.525(br s，4H)；1.119(br s，8H)；0.681(br s，4H)。
CA001，[(2，7-{9，9-二(6’-(N，N，N-三甲基溴化銨)己基)}芴-交替共聚-1，4-{2，5-二氟}亞苯基)-共聚-(2，7-{9，9-二(6’-(N，N，N-三甲基溴化銨)己基)}芴-交替共聚-3，5-1-{4’-氨基丁氧基)亞苯基)]共聚物將肼一水合物(73.1mg，1.46mmol)、[(2，7-{9，9-二(6’-(N，N，N-三甲基溴化銨)己基)}芴-交替共聚-1，4-{2，5-二氟}亞苯基)-共聚-(2，7-{9，9-二(6’-(N，N，N-三甲基溴化銨)己基)}芴-交替共聚-3，5-1-{4’-鄰苯二甲酰亞胺基丁氧基)亞苯基)]共聚物(100mg，0.137mmol)在甲醇(10mL)中的溶液回流5小時。冷卻至室溫后，向溶液中加入0.9mL 1M HCl，然后再回流2小時。產(chǎn)生的溶液在50％甲醇水溶液中透析，然后蒸發(fā)至干。
確定了一種評估功能化單體整合至最終聚合物結(jié)構(gòu)中的方法。在聚合反應(yīng)過程中胺官能團作為鄰苯二甲酰亞胺被保護以防止催化劑污染。該保護基在紅外(IR)光譜中具有獨特的特征，在圖24中顯示為實線。顯示的峰對應(yīng)于僅有鄰苯二甲酰亞胺保護基才呈現(xiàn)的獨特的C＝O峰。鄰苯二甲酰亞胺基后續(xù)的脫保護(產(chǎn)生自由的胺)產(chǎn)生CA001 IR特征，缺少鄰苯二甲酰亞胺的特征C＝O峰(虛線，圖24)，顯示可用于偶聯(lián)的活性胺。
CA001的光譜顯示于圖25中，其中實線表示吸光度，虛線表示發(fā)射光譜。
實施例4. 陽離子偶聯(lián)聚合物-FAM偶聯(lián)物CA001-FAM的合成 脫保護的聚合物CA001(具有自由胺)與琥珀酰亞胺酯FAM，5(6)FAM-SE(Invitrogen，#C1311)反應(yīng)，該反應(yīng)采用www.invitrogen.com(最后一次瀏覽日期10/04/07)的方案的修改方案。作為陰性對照，相同聚合物與熒光素(無反應(yīng)基團)在相同反應(yīng)條件下孵育。這個步驟的方案如下。
NHS-FAM與CA001的偶聯(lián) 目的 用NHS-FAM將CA001生物素化，并證明向共價偶聯(lián)的染料的FRET。
材料 熒光計，具有UV可穿透的比色杯 UV-可見光儀器 純化的CA001 NHS-FAM(Invitrogen#C-1311) 0.5M NEt3(母液(7.2M)NEt3的1∶14稀釋液) MC30過濾器 步驟 1.用10倍XS的NH-FAM至胺-聚合物中建立反應(yīng)。每10uL反應(yīng)液使用50ug聚合物和8.0ug NHS-FAM 2.當除染料外的所有試劑都混合后，在DMSO中以130uL無水DMSO/mg染料溶解1-2毫克染料。溶解后立即使用NHS-試劑。
3.在熱模塊上25℃孵育30min。
4.在90M1T中稀釋(10uL于400ul中) 5.用MC30脫鹽兩次 6.用UV/可見光分析濃度 產(chǎn)生的每個反應(yīng)產(chǎn)物的熒光光譜顯示于圖26中。陽性對照產(chǎn)生的熒光顯示為實線。當聚合物被激發(fā)時，發(fā)生向受體染料(現(xiàn)在已共價結(jié)合至聚合物)的FRET，導(dǎo)致強烈的熒光發(fā)射。陰性對照產(chǎn)生的熒光顯示為虛線。因為陰性對照的熒光素?zé)o法結(jié)合聚合物，當聚合物被激發(fā)時，不發(fā)生FRET，只觀測到聚合物發(fā)射。這些數(shù)據(jù)表明CA001上的胺可用于偶聯(lián)。
實施例5. 生物素化偶聯(lián)聚合物生物素基-CA001的合成
使用來自于Pierce的NHS-生物素連接體(#20217)，將CA001上的胺官能團轉(zhuǎn)換為生物素官能團。這個步驟的方案根據(jù)可見于Pierce網(wǎng)站www.piercenet.com(最后一次訪問日期09/23/2007)的Pierce方案改良。這個步驟的方案類似地沿用實施例12中所述的方案。
實施例6. 通過生物素基-CA001、親和素DN和生物素基-熒光素放大信號的步驟 目的 使用生物素基-CA001、親和素DN和生物素基-熒光素，證明經(jīng)由FRET的熒光素信號放大。
材料 NanoDrop熒光計 Perkin-Elmer熒光計，型號PE-LS55 UV-可穿透的1-ml塑料比色杯 移液器+吸頭 生物素基-CA001(BCA) CA001(CA) 生物素基-熒光素(BFL) 親和素DN(ADN) TBS 步驟 1.在一個Eppendorf試管中，混合下表中列出的試劑。確保最后添加AND并且在添加DNA之前混勻其他試劑。在熒光計測量之前將混合物稀釋100倍，對于Nanodrop是將1uL加至100uL，對于臺式熒光計是將10uL加至1mL。
2.在488nm直接激發(fā)熒光以及通過在380nm激發(fā)聚合物經(jīng)由FRET間接激發(fā)。
3.在相關(guān)波長下采集關(guān)于峰高度的數(shù)據(jù)。從峰高度中減除背景，包括這些來源。
3a)僅有緩沖液的對照。
3b)從FRET至熒光素峰的聚合物峰尾(～5％)。
實施例7. 對生物素基-CA001、親和素DN和生物素基-熒光素放大信號的分析 圖27A顯示了CA001的生物素化。胺聚合物CA001(生物素基聚合物的前體)不結(jié)合親和素，并且作為陰性對照聚合物。圖27B示意性地描述了該試驗。生物素化染料和聚合物通過生物素-親和素結(jié)合被特異性地結(jié)合在一起。陰性對照聚合物(胺聚合物CA001，標注為CA)不結(jié)合親和素。圖27C顯示了沿用上述方案(實施例6)進行的試驗產(chǎn)生的熒光光譜。虛線顯示了在含有親和素DN(AvDN)和生物素化熒光素(B-F1)的溶液中非特異性聚合物(CA)在380nm激發(fā)時的熒光光譜。僅觀測到聚合物的發(fā)射，以420nm為中心。實線顯示的是在含有親和素DN(AvDN)和生物素化熒光素(B-F1)的溶液中生物素化聚合物(BCA)在380nm激發(fā)時的熒光光譜。觀測到強烈的能量傳遞，引起來自于熒光素的額外發(fā)射，以530nm為中心。僅生物素基-CA001發(fā)生FRET，意味著供體生物素基-CA 001和受體熒光素通過生物素-親和素結(jié)合被拉近至較近的距離。這就證實了沿用Pierce步驟(實施例5)的CA001的生物素化。染料在488nm的直接激發(fā)顯示為虛線。比較虛線和實線揭示出間接激發(fā)(經(jīng)由FRET)比直接激發(fā)，染料信號放大了19倍。
實施例8. 具有羧酸酯官能團的陽離子偶聯(lián)聚合物前體CC001的合成
[(2，7-{9，9-二(6’-溴己基)}芴-交替共聚-1，4-{2，5-二氟}亞苯基)-共聚-(2，7-{9，9-二(6’-溴己基)}芴-共聚-alt-3，5-1-{7’-乙酯庚氧基)亞苯基)]共聚物在一個裝備有水套回流冷凝器的50mL圓底燒瓶中，2，7-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧雜硼雜環(huán)戊烷-2-基)-9，9-二(6′-溴己基)芴(500mg，0.670mmol)、1，4-二溴-2，5-二氟苯(173.2mg，0.637mmol)、1-(7’-乙酯庚氧基)-3，5-二溴苯(13.6mg，0.033mmol)、碳酸鉀(1.12g，8.12mmol)和四(三苯基膦)鈀(0)(21mg，0.018mmol)在THF(15mL)和水(5mL)中的溶液經(jīng)由四個冷凍-抽氣-融解循環(huán)脫氣，在第三和第四輪脫氣后引入氬。然后將溶液在氬氣氛下加熱回流48小時。冷卻后，將溶液滴加到40mL攪拌的甲醇中以沉淀聚合物，離心收集。然后用甲醇潷析和洗滌(兩次)來去除低分子量組分，產(chǎn)生淺黃色、蓬松粉末。1H NMR(CD2Cl2)7.887-7.406(m，8H)；3.322(t，J＝6.6Hz，4H)；2.080(br s，4H)；1.710(t，J＝7.0Hz，4H)；1.269(br s，4H)；1.158(br s，4H)；0.799(br s，4H).Mn 39.5K，PDI 2.1。
IR光譜用于評估功能化單體向最終聚合物結(jié)構(gòu)中的整合。在聚合反應(yīng)過程中羧酸官能團作為酯被保護以防止催化劑污染。該保護基在紅外(IR)光譜中具有獨特的特征，如圖28所示。顯示的峰對應(yīng)于僅有羧酸酯保護基才呈現(xiàn)的獨特的C＝O峰。圖28中的虛線對應(yīng)于單體的IR光譜，而實線對應(yīng)于聚合物的IR光譜。在兩種情況中，都觀測到羧酸酯的峰，表明功能性單體的整合。
實施例9. 具有胺官能團的陰離子偶聯(lián)聚合物AA003的合成
[(2，7-{9，9-二(4’-(磺酸鈉)丁基)}芴-共聚-alt-1，4-{2，5-二氟}亞苯基)-共聚-(2，7-{9，9-二(4’-(磺酸鈉)丁基)}芴-共聚-alt-3，5-1-{4’-鄰苯二甲酰亞胺基丁氧基)亞苯基)]共聚物在一個100mL的裝備有水套回流冷凝器的圓底燒瓶中，2，7-二溴-9，9-二(4′-(磺酸鈉)丁基)芴(129.5mg，0.202mmol)、1，4-二硼酸(37.4mg，0.225mmol)、1-(4’-鄰苯二甲酰亞胺基丁氧基)-3，5-二溴苯(10.4mg，0.023mmol)、碳酸鉀(366mg，2.65mmol)和四(三苯基膦)鈀(0)(8.8mg，0.008mmol)在DMF(20mL)和水(20mL)中的溶液經(jīng)由四個冷凍-抽氣-融解循環(huán)脫氣，在第三或第四輪脫氣后引入氬。然后將溶液在氬氣氛下加熱回流48小時。在反應(yīng)進程中，形成黑色沉淀。冷卻后，去除溶液并用丙酮洗滌沉淀，產(chǎn)生棕色粉末。1H NMR(DMSO)7.910-7.597(m，10H)；2.206(br s，8H)；1.400(br s，4H)；0.668(brs，4H).IR1696cm-1，表明為被保護的胺(鄰苯二甲酰亞胺)。
AA003，[(2，7-{9，9-二(4’-(磺酸鈉)丁基)}芴-共聚-alt-1，4-{2，5-二氟}亞苯基)-共聚-(2，7-{9，9-二(4’-(磺酸鈉)丁基)}芴-共聚-alt-3，5-1-{4’-氨基丁氧基)亞苯基)]共聚物將肼一水合物(29.9mg，0.598mmol)和[(2，7-{9，9-二(4’-(磺酸鈉)丁基)}芴-交替共聚-1，4-{2，5-二氟}亞苯基)-共聚-(2，7-{9，9-二(4’-(磺酸鈉)丁基)}芴-交替共聚-3，5-1-{4’-氨基丁氧基)亞苯基)]共聚物(45mg，0.081mmol)在50％甲醇/水(5mL)中的溶液回流5小時。冷卻至室溫后，用1M HCl調(diào)節(jié)溶液的pH至3，然后回流另外2小時。冷卻并轉(zhuǎn)移至15mL Falcon管中后，用下述方案純化AA003。
純化脫保護的AA003 目的 富集胺活化的陰離子聚合物 材料 UV-可穿透的1-mL塑料比色杯 離心機 UV-可見光分光光度計 移液器+吸頭 NaOH，1.0M，0.1mL NaOH，10M 10uL H2O90uL 粗AA003 90％MeOH，1％T20(90M1T，50mL) MC30過濾器 步驟 1.分選組分 1a)如果有一層膜襯在試管內(nèi)部(沉淀的聚合物)，把上清液倒入一個新試管中。用移液器吸頭徹底去除所有上清液，置于一邊。
1b)處理襯在試管內(nèi)的膜(ppt) i.加入0.5mL水并用石蕊檢測pH。如果需要，通過添加NaOH(開始用1-5uL 0.1M NaOH，然后更實際地，用1.0M NaOH)、混合、沉淀(pellet)、石蕊檢測，中和至pH～7-8。重復(fù)幾個添加-混合-沉淀-檢測pH試驗循環(huán)，直至pH保持于8。
ii.去除水萃取物，并放置在一個1.5mL離心管中。
iii.在14krcf下離心2’。保留上清和沉淀物。
iv.將沉淀物凍干。
1c)處理來自于步驟1a)的上清液 i.取0.5mL上清液(通常是懸浮液)并放在一個1.5mL離心管中。
ii.用石蕊測pH并記錄pH。
iii.如上述步驟1b1一樣中和至pH～7-8。
iv.在14krcf下離心2’。
v.從沉淀物中分離上清液，保留兩者。
vi.將沉淀物凍干。
vii.在最小量的無水DMSO中重新懸浮沉淀物。
viii.在水中進行UV/可見光光譜測量，并記錄吸光度，使用有效的消光系數(shù)計算所有組分的濃度。
2.用MC30脫鹽。
AA003的光學(xué)光譜顯示于圖29中，其中實線表示吸光度，虛線表示發(fā)射光譜。脫保護的聚合物AA003(有一個自由胺)與一個琥珀酰亞胺酯FAM，5(6)FAM-SE(Invitrogen，#C1311)反應(yīng)，反應(yīng)方案由來自www.invitrogen.com(最后一次瀏覽日期10/04/07)的方案修改。作為陰性對照，相同聚合物與熒光素(無反應(yīng)基團)在相同反應(yīng)條件下孵育。這個步驟的方案類似地沿用實施例4的方案。
實施例10. 具有馬來酰亞胺官能團的陰離子偶聯(lián)聚合物AA003-M01的合成
多發(fā)色團上的胺官能團可使用雙功能連接體如GMBS轉(zhuǎn)化成其他官能團。采用此策略來將AA003轉(zhuǎn)化成AA003-M01。這個步驟的方案是對可見于Pierce網(wǎng)站www.piercenet.com(最后一次訪問日期09/23/2007)的Pierce方案的改良。使用的方案如下。
將GMBS偶聯(lián)至AA003 目的 用GMBS將AA003功能化來產(chǎn)生馬來酰亞胺部分 材料 離心機 UV-可見光分光光度計 UV-可穿透的1-mL比色杯 移液器+吸頭 AA003 GMBS(Pierce#22309) 90％MeOH，1％T20(90M1T，50mL) DMSO NEt3 MC30過濾器 步驟 1.用馬來酰亞胺使AA003功能化，下面是使用的量 1a)對于40X XS，使用0.3mM聚合物和12mM GMBS。這意味著3.0nmol聚合物/10uL反應(yīng)液如下 2.當除連接體以外所有試劑都混合后 2a)在DMSO中溶解GMBS(在溶解后不要立刻使用GMBS) i.120mM GMBS＝3.4mg/0.1mL DMSO，或30uL/mg 2b)在熱模塊上25℃孵育30min。檢查澄清度。
3.用MC30去除XS GMBS 3a)在加至MC杯之前，稀釋DMSO到＜5％ 3b)分別合并每個反應(yīng)w/400uL 90M1T 3c)加至杯中 3d)以14k rcf離心10min 3e)通過估計滯留物體積來確定是否需要離心更長的時間 3f)棄掉濾液 3g)再加入400uL 90M1T并且重復(fù)離心 3h)如果滯留物看上去近乎干燥，加入20uL 90M1T并在杯中稍許振蕩 3i)顛倒并離心收集滯留物 3j)測量最終滯留物體積＝______uL 3k)通過UV-可見光來確定濃度，然后在0.5X 90M1T中調(diào)整最終濃度至25uM。
實施例11. 陰離子偶聯(lián)聚合物-熒光素偶聯(lián)物AA003-M01-F1的合成 采用來自www.invitrogen.com(最后一次訪問日期10/04/07)的修改方案，通過與SAMSA-熒光素(Invitrogen)反應(yīng)，來檢測AA003-M01上的馬來酰亞胺官能團的硫醇反應(yīng)性。AA003用作陰性對照。修改的方案如下。
對馬來酰亞胺的SAMSA試驗 目的應(yīng)用10X XS SAMSA-熒光素至AA003-M01，來確定AA003-M01具有活性馬來酰亞胺部分 材料 離心機 UV-可穿透的1-mL比色杯 熒光計，型號PE-LS55 移液器+吸頭 磷酸鉀，0.5M，pH 7.0，0.2mL K2HPO4，1M62uL KH2PO4，1M39uL H2O 100uL HCl，6M，0.2mL H2O 0.1mL HCl，12M 0.1mL NaOH，0.1M，1mL NaOH，10M 10uL H2O990uL AA003 AA003-M01 SAMSA-熒光素(Invitrogen，產(chǎn)品A685) MC30過濾器 步驟 1.制備1.0mM脫保護的SAMSA 1a)溶解1.0mg SAMSA于95uL 0.1M NaOH中(20mM SAMSA) 1b)室溫孵育15min來去除乙?；Ｗo基 1c)用6M HCl1.4uL/mg SAMSA中和(20mM SAMSA) 1d)用20uL 0.5M磷酸鈉，pH 7/mg SAMSA緩沖(16mMSAMSA) 1e)用水稀釋16倍至1.0mM SAMSA 2.加入以下物質(zhì)建立反應(yīng) 2a)對于AA003-M01添加10uL 1.0mM脫保護的SAMSA至10uL 25uM AA003+GMBS(3.k+G來自于實施例10中的方案)中 2b)對于AA003添加10uL 1.0mM脫保護的SAMSA至10uL25uM AA003-GMBS(3.k-G來自于實施例10中的方案)中 3.在熱模塊上25℃孵育30min 4.用MC30去除XS SAMSA 4a)在加至MC杯之前，稀釋DMSO到＜5％ 4b)分別合并每個反應(yīng)w/400uL 90M1T 4c)加至杯中 4d)以14k rcf離心10min 4e)通過估計滯留物體積來確定是否需要離心更長的時間 4f)棄掉濾液 4g)再加入400uL 90M1T并且重復(fù)離心 4h)如果滯留物看上去近乎干燥，加入20uL 90M1 T并在杯中稍許振蕩 4i)顛倒并離心收集滯留物 5.在488和380下激發(fā)來自步驟4.i的AA003-M01和AA003，分析熒光。
圖30C顯示了該試驗的結(jié)果。AA003-M01(圖30B，標注為馬來酰亞胺功能化聚合物)和陰性對照聚合物(無馬來酰亞胺，AA003，圖30A，標注為陰性對照聚合物)與硫醇化的熒光素(SAMSA-熒光素)按照上述步驟反應(yīng)。馬來酰亞胺功能化的聚合物AA003-M01與硫醇化熒光素反應(yīng)，并且變成與該熒光素共價結(jié)合，確保了在供體聚合物和受體染料之間固定的距離。由此，聚合物的激發(fā)導(dǎo)致了向受體染料的FRET，并且觀測到強烈的染料發(fā)射(圖30C，實線)。陰性對照不與熒光素共價結(jié)合，并且當聚合物被激發(fā)時，僅觀測到聚合物的發(fā)射(圖30C，虛線)。
實施例12. 生物素化陰離子偶聯(lián)聚合物生物素基-AA003的合成
使用可獲自Pierce(#20217)的NHS-生物素連接體，將AA003上的胺官能團轉(zhuǎn)換成生物素。該步驟的方案是對可見于Pierce網(wǎng)站www.piercenet.com(最后訪問日期09/23/2007)的Pierce方案的改良。使用的方案如下。
將NHS-生物素偶聯(lián)至AA003的步驟 目的 用NHS-生物素將AA003生物素化 材料 熒光計，具有UV可穿透的比色杯 UV-可見光分光光度計 純化的AA003(AA3) NHS-生物素(Pierce#20217) 0.5M NEt3(母液(7.2M)NEt3的1∶14稀釋液) DMSO MC30過濾器 步驟 1.建立反應(yīng)，0.5mM聚合物和20mM NHS-生物素 2.當除生物素以外的所有組分都混合后，在DMSO中以15uL無水DMSO/mg NHS-生物素的量(或1.7mg/0.025mL；200mM)溶解1-2mg NHS-生物素。溶解后立即使用NHS-試劑。
3.在熱模塊上25℃孵育30min。
4.于90M1T中1∶100稀釋(1uL加至100uL，或4uL加至400uL) 5.用MC30脫鹽，兩次 6.用UV/可見光分析濃度 實施例13. 由生物素基-AA003和親和素D-熒光素放大信號的步驟 目的 證明使用生物素基-AA003和親和素D-熒光素經(jīng)由FRET產(chǎn)生的特異性熒光信號。
材料 熒光計(NanoDrop或Perkin-Elmer PE-LS55) UV-可穿透的塑料1-mL比色杯 移液器+吸頭 生物素基-AA003(BAA) AA003(AA) 親和素D-熒光素(A-F1) TBS 步驟 1.在一個eppendorf管中，混合列于下表中的試劑。孵育五分鐘，然后在熒光計測量之前將該混合物稀釋100倍，對于NanoDrop是將1uL加至100uL，對于臺式熒光計是將10uL加至1mL。
2.在488nm處直接激發(fā)A-F1以及通過在380nm處激發(fā)聚合物經(jīng)由FRET間接激發(fā)。
3.在相關(guān)波長下采集關(guān)于峰高度的數(shù)據(jù)。從峰高度中減除背景，包括這些來源。
3a)僅緩沖液的對照 3b)從FRET到熒光素峰的聚合物峰尾(～5％)。
實施例14. 由生物素基-AA003和熒光素標記的親和素D引起的信號放大的分析 該試驗的步驟在實施例13中描述。該試驗的示意圖顯示于圖31B中。生物素基-AA003(參見圖31A，標注為生物素基聚合物)與熒光素標記的親和素D孵育。作為陰性對照，胺聚合物AA003(參見圖31A，標注為陰性對照聚合物)以同樣方式與熒光素標記的親和素D孵育。在每種情況下，聚合物被激發(fā)，并且觀測到熒光素發(fā)射。對于陰性對照AA003，僅觀測到聚合物的發(fā)射(以420nm為中心)，而對于生物素基-AA003，觀測到強烈的染料發(fā)射。
該試驗的結(jié)果顯示于圖32A-B中。用每個親和素含4個染料的親和素D檢測生物素基-AA003。也記錄來自于對照聚合物和單獨的染料的信號，并且顯示于圖32A-B中。圖32A顯示了產(chǎn)生的熒光光譜。來自于該數(shù)據(jù)集的在523nm處的染料信號總結(jié)于圖32B中。
這些數(shù)據(jù)表明，該熒光素信號(在523nm處)在聚合物存在的情況下被放大了(圖32A，左側(cè)，實線對比虛線光譜，和右側(cè)，生物素基-AA003對比單獨的染料)，并且觀測到的信號是由于特異性的聚合物-親和素D復(fù)合物(圖32A，左側(cè)，實線對比虛線光譜，和右側(cè)，生物素基-聚合物對比對照)。胺聚合物對照(無生物素)不能結(jié)合親和素，并且由此觀測到最小的能量傳遞(88％特異性)。特異性定義為1-(對照信號/特異性染料信號)。右圖顯示了在有或無聚合物條件下以及陽性和陰性對照樣本之間染料信號的不同。圖32B顯示的數(shù)據(jù)是對緩沖液和聚合物尾產(chǎn)生的信號校正后的。聚合物尾在523nm處的貢獻是聚合物在419nm處峰高的5％。
實施例15. 不同染料親和素D比的放大效果 測試了聚合物與染料的不同比例。這是用來自于VectorLaboratories的、每個親和素平均含有0.8、1.5和4個熒光素染料的親和素D偶聯(lián)物來評估的。當染料數(shù)目增加時，聚合物和染料之間的消光系數(shù)(吸光度)比就減少。因此對于這套熒光素標記的親和素D，預(yù)測在含有最少數(shù)目染料的親和素偶聯(lián)物上觀測到最佳放大值。在每個親和素D兩當量聚合物時聚合物濃度保持恒定。
圖33A-B顯示的數(shù)據(jù)表明預(yù)計依賴于聚合物與染料的比例。在恒定的聚合物和親和素濃度下，通過增加每親和素D上染料的數(shù)目，該比例會發(fā)生變化。數(shù)據(jù)表明當染料親和素比從0.8增加至4時，染料信號強度增加(圖33A)，而觀測到的放大作用下降(圖33B)。當染料數(shù)目增加時，由于較高吸光度以及較高的熒光引起的直接染料信號也增加(灰色條，圖33A)。
實施例16. 能在405nm激發(fā)的具有胺官能團的陰離子偶聯(lián)聚合物AA002的合成
[2，7-{9，9-二(1-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)))}-交替共聚-(2，7-{9，9-二(4’-(磺酸鈉)丁基)}芴-共聚-2，7-{9，9-二(1-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)))}-交替共聚-3，5-1-{4’-鄰苯二甲酰亞胺基丁氧基)亞苯基)]共聚物在48mL Schlenck試管中，2，7-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧雜硼雜環(huán)戊烷-2-基)-9，9-二(1-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)))氟(120.1mg，0.150mmol)、2，7-二溴{9，9-二(4’-(磺酸鈉)丁基)}芴(91.3mg，0.143mmol)、1-(4’-鄰苯二甲酰亞氨基丁氧基)-3，5-二溴苯(3.7mg，0.0082mmol)、碳酸鉀(234mg，1.7mmol)和四(三苯基膦)鈀(0)(6.2mg，0.0054mmol)在DMF(3.8mL)、THF(2.5mL)和水(2.5mL)中的溶液通過用氬噴射20分鐘脫氣。該溶液然后在氬氣氛下加熱至85℃，3天。將溶液滴加至攪拌的丙酮中，產(chǎn)生深褐色固體。該固體然后與甲醇一起攪拌，過濾收集，并且去除溶劑，產(chǎn)生亮黃色固體。1H NMR(DMSO)8.055-7.828(m，12H)；3.558-3.293(m，24H)；3.188(m，12H)；2.217-2.161(m，8H)；1.417(br s，4H)；0.664(br s，4H)。Bimodal，Mn 7.3K，PDI 1.02，和Mn 49K，PDI 1.2。
然后使用與實施例9所述類似的步驟，將該聚合物去保護并且純化產(chǎn)生AA002。AA002的光學(xué)光譜顯示于圖34，其中實線表示吸收，虛線表示發(fā)射光譜。
實施例17. 生物素化偶聯(lián)聚合物-生物素基-AA002的合成
生物素基-AA002 使用來自于Pierce(#20217)的NHS-生物素連接體，將AA002上的胺官能團轉(zhuǎn)換成生物素官能團。這個步驟的方案由Pierce方案改進而成，可見于Pierce網(wǎng)站www.piercenet.com(最后一次訪問日期09/23/2007)。這個步驟的方案類似地遵循實施例12所述。
實施例18. 不同聚合物親和素D比的放大效果 熒光素標記的親和素D，或親和素D-F1(每個親和素0.8個染料)，維持在一個恒定濃度，與一系列濃度增加的從0至8當量的生物素基-AA002孵育。圖35A中示意性地顯示了生物素基-AA002的頭兩個當量。對于每個比例，記錄直接和間接激發(fā)(經(jīng)由FRET)的染料熒光。當聚合物與染料的比例增加時，由直接激發(fā)產(chǎn)生的信號維持相當恒定，而由間接激發(fā)產(chǎn)生的信號增加，如圖35B所示，該圖是作為AA002與親和素D-F1之比的函數(shù)的熒光素發(fā)射圖。此種信號增加大致在生物素基-AA002的四個當量時達到平臺期，這與親和素D上所有生物素結(jié)合位點被占據(jù)相一致。
這些數(shù)據(jù)與生物素基-AA002與熒光素標記的親和素D之間的特異性結(jié)合相一致。觀測到了較高的信號放大，其平臺期在聚合物的四個當量時，表示所有可用的生物素結(jié)合位點都被占據(jù)。
實施例19. 染料信號的靜電放大 如圖36B示意性顯示，染料標記的蛋白質(zhì)(Cy3-標記的IgG和熒光素標記的BSA)各自獨立地與陽離子聚合物PFP-2F孵育(參見圖36A)。在聚合物和每個染料標記的蛋白質(zhì)之間發(fā)生了非特異性靜電結(jié)合。每個溶液都在380nm處激發(fā)，并且收集發(fā)射光譜。將這些光譜與直接激發(fā)染料收集的發(fā)射光譜進行比較，如圖36C所示，顯示出Cy3標記的IgG有30倍的放大，熒光素標記的BSA有25倍的放大。使用的Cy3標記的IgG是一種抗洋地黃毒苷抗體，其用來靶向洋地黃毒苷標記的抗體。
本發(fā)明優(yōu)選的實施方式已經(jīng)在此顯示并描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當明白這些實施方式僅以實施例的方式提供。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會想到在不偏離本發(fā)明的情況下進行多種變化、改變和替換。應(yīng)當理解在實踐本發(fā)明中可以采用此處描述的本發(fā)明實施方式的多種替代形式。可以預(yù)期下述的權(quán)利要求書限定了本發(fā)明的范圍，并且因此涵蓋這些權(quán)利要求范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)和它們的等同物。
權(quán)利要求
1.一種測定方法，包括
提供懷疑含有靶標生物分子的樣本；
提供與信號發(fā)色團偶聯(lián)并且能夠與靶標生物分子相互作用的傳感器；
提供偶聯(lián)的聚合物，該聚合物選自
其中該聚合物與該傳感器靜電相互作用并且在激發(fā)后能夠傳遞能量至該傳感器信號發(fā)色團；
在傳感器能夠與可能存在的靶標生物分子結(jié)合的條件下，在溶液中將樣本與所述傳感器和所述多發(fā)色團接觸；
向樣本施加能夠激所述發(fā)多發(fā)色團的光源；和
檢測是否從信號發(fā)色團發(fā)出光。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述R基團是磺酸基團。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述傳感器是一種生物分子。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述生物分子是抗體。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述傳感器包含與多個信號發(fā)色團偶聯(lián)的多個傳感器，其中在從多發(fā)色團能量傳遞后，所述多個發(fā)色團中的至少兩個發(fā)射不同波長的光。
6.一種多發(fā)色團復(fù)合物，包含
偶聯(lián)至至少一個生物分子上的多發(fā)色團，該生物分子選自傳感器生物分子、生物偶聯(lián)物和靶標生物分子，其中該多發(fā)色團進一步偶聯(lián)至信號發(fā)色團上，并且其中該多發(fā)色團包含結(jié)構(gòu)
其中CP1、CP2、CP3和CP4是任選取代的偶聯(lián)的聚合物區(qū)段或寡聚結(jié)構(gòu)，它們彼此相同或不同。
7.權(quán)利要求6的多發(fā)色團，其中偶聯(lián)的聚合物是一種陽離子偶聯(lián)聚合物。
8.權(quán)利要求6的多發(fā)色團，其中偶聯(lián)的聚合物是一種陰離子偶聯(lián)聚合物。
9.權(quán)利要求6的多發(fā)色團，其中偶聯(lián)的聚合物是一種電荷中性的偶聯(lián)聚合物。
10.權(quán)利要求6的多發(fā)色團，其中CP1、CP2、CP3和CP4是芳香族重復(fù)單元，選自苯、萘、蒽、芴、噻吩、呋喃、吡啶和噁二唑，每個任選地被取代，并且其中CP3和CP4可含有一個或多個通過連接體連接的獨特生物偶聯(lián)位點。
11.權(quán)利要求6的多發(fā)色團，進一步包含選自馬來酰亞胺、硫醇、琥珀酰亞胺酯(NHS酯)、胺、疊氮化物化學(xué)、羧基/EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亞胺鹽酸鹽、磺基-SMCC(磺基琥珀酰亞胺基4-[N-馬來酰亞胺甲基]環(huán)己烷-1-羧酸酯)、胺/BMPH(N-[β-馬來酰亞胺丙酸]酰肼·TFA)、以及磺基-SBED磺基琥珀酰亞胺基[2-6-(生物素酰氨基)-2-(對-疊氮基苯甲酰氨基)-己酰氨基]-乙基-1，3′-二硫代丙酸酯的生物偶聯(lián)物位點。
12.權(quán)利要求6的多發(fā)色團，其中該多發(fā)色團包含結(jié)構(gòu)
其中R1是加溶基，選自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。
13.權(quán)利要求6的多發(fā)色團，其中該多發(fā)色團包含結(jié)構(gòu)
其中R1是加溶基，選自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。
14.權(quán)利要求12或13的多發(fā)色團，其中1和2選自具有下述結(jié)構(gòu)的a-g連接基團
*＝用于共價連接至不飽和骨架的位點
3為具有如下結(jié)構(gòu)的基團h
L＝連接體
A＝生物偶聯(lián)位點
*＝用于共價連接至不飽和骨架的位點。
15.權(quán)利要求12或13的多發(fā)色團，進一步包含如下結(jié)構(gòu)
其中R1是加溶基，選自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。
16.權(quán)利要求12或13的多發(fā)色團，進一步包含如下結(jié)構(gòu)
其中R1是加溶基，選自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。
17.權(quán)利要求12或13的多發(fā)色團，進一步包含如下結(jié)構(gòu)
其中R1是加溶基，選自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。
18.一種用于鑒定靶標生物分子的多發(fā)色團復(fù)合物，包含
多發(fā)色團，
共價連接至該多發(fā)色團的傳感器生物分子，
共價連接至該多發(fā)色團的信號發(fā)色團，其中該信號發(fā)色團能夠接收在多發(fā)色團激發(fā)時來自多發(fā)色團的能量，并且該傳感器生物分子能夠與靶標生物分子相互作用。
19.權(quán)利要求18的多發(fā)色團復(fù)合物，其中所述信號發(fā)色團和所述傳感器生物分子均通過多個連接體共價連接至該多發(fā)色團。
20.權(quán)利要求18的多發(fā)色團復(fù)合物，其中所述信號發(fā)色團和所述傳感器生物分子均通過一個三官能化連接體共價連接至該多發(fā)色團，該三官能化連接體共價結(jié)合該多發(fā)色團、該信號發(fā)色團和該傳感器生物分子。
21.權(quán)利要求18的多發(fā)色團復(fù)合物，其中所述連接體包含選自馬來酰亞胺/硫醇、琥珀酰亞胺酯(NHS酯)/胺、疊氮化物化學(xué)、羧基/EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亞胺鹽酸鹽)/胺、胺/磺基-SMCC(磺基琥珀酰亞胺基4-[N-馬來酰亞胺甲基]環(huán)己烷-1-羧酸酯)/硫醇、和胺/BMPH(N-[β-馬來酰亞胺基丙酸]酰肼·TFA)/硫醇的連接化學(xué)。
22.權(quán)利要求18的多發(fā)色團復(fù)合物，其中該多發(fā)色團是偶聯(lián)的聚合物。
23.權(quán)利要求18的多發(fā)色團復(fù)合物，其中所述偶聯(lián)的聚合物是聚陽離子偶聯(lián)的聚合物。
24.一種測定方法，包括
提供懷疑含有靶標生物分子的樣本；
提供包含多發(fā)色團、共價連接的信號發(fā)色團和共價連接的傳感器生物分子的多發(fā)色團復(fù)合物，其中信號發(fā)色團能夠接收在多發(fā)色團激發(fā)時來自于多發(fā)色團的能量，并且傳感器生物分子能夠與靶標生物分子相互作用；
在傳感器生物分子能夠結(jié)合至可能存在的靶標生物分子的條件下，在溶液中將樣本與多發(fā)色團復(fù)合物接觸；
向樣本施加能夠激發(fā)多發(fā)色團的光源；和
檢測是否從信號發(fā)色團發(fā)出光。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述多發(fā)色團是偶聯(lián)的聚合物。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述偶聯(lián)的聚合物是聚陽離子偶聯(lián)聚合物。
27.一種測定方法，包括
提供懷疑含有靶標生物分子的樣本；
提供偶聯(lián)至信號發(fā)色團并能夠與靶標生物分子相互作用的第一生物偶聯(lián)物；
提供偶聯(lián)至多發(fā)色團的第二生物偶聯(lián)物，其中該發(fā)色團包含結(jié)構(gòu)
其中CP1、CP2、CP3和CP4是任選地取代的偶聯(lián)的聚合物區(qū)段或寡聚結(jié)構(gòu)，它們彼此相同或不同，其中該第二生物偶聯(lián)物能結(jié)合該第一生物偶聯(lián)物，并且在這種結(jié)合后，多發(fā)色團的激發(fā)能夠傳遞能量至該信號發(fā)色團；
在第一生物偶聯(lián)物能結(jié)合可能存在的靶標生物分子的條件下，在溶液中將樣本與第一生物偶聯(lián)物接觸；
將溶液與第二生物偶聯(lián)物接觸；
向樣本施加能夠激發(fā)多發(fā)色團的光源；和
檢測是否從信號發(fā)色團發(fā)出光。
28.權(quán)利要求27的多發(fā)色團，其中所述偶聯(lián)的聚合物是陽離子偶聯(lián)聚合物。
29.權(quán)利要求27的多發(fā)色團，其中所述偶聯(lián)的聚合物是陰離子偶聯(lián)聚合物。
30.權(quán)利要求27的多發(fā)色團，其中所述偶聯(lián)的聚合物是電荷中性偶聯(lián)聚合物。
31.權(quán)利要求27的多發(fā)色團，其中CP1、CP2、CP3和CP4是芳香族重復(fù)單元，選自苯、萘、蒽、芴、噻吩、呋喃、吡啶和噁二唑，每個任選地被取代，并且其中CP3和CP4可含有一個或多個獨特生物偶聯(lián)位點，由一個連接體連接。
32.權(quán)利要求27的多發(fā)色團，進一步包含選自馬來酰亞胺、硫醇、琥珀酰亞胺酯(NHS酯)、胺、疊氮化物化學(xué)、羧基/EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亞胺鹽酸鹽、磺基-SMCC(磺基琥珀酰亞胺基4-[N-馬來酰亞胺基甲基]環(huán)己烷-1-羧酸酯)、胺/BMPH(N-[β-馬來酰亞胺基丙酸]酰肼·TFA)、以及磺基-SBED磺基琥珀酰亞胺基[2-6-(生物素酰氨基)-2-(對-疊氮苯甲酰氨基)-己酰氨基]-乙基-1，3′-二硫代丙酸酯的生物偶聯(lián)位點。
33.權(quán)利要求27的多發(fā)色團，其中該多發(fā)色團包含結(jié)構(gòu)
其中R1是加溶基，選自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。
34.權(quán)利要求27的多發(fā)色團，其中該發(fā)色團包含結(jié)構(gòu)
其中R1是加溶基，選自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。
35.權(quán)利要求33或34的多發(fā)色團，其中1和2選自具有下述結(jié)構(gòu)的a-g連接基團
*＝用于共價連接至不飽和骨架的位點
3為具有如下結(jié)構(gòu)的基團h
L＝連接體
A＝生物偶聯(lián)位點
*＝用于共價連接至不飽和骨架的位點。
36.權(quán)利要求33或34的多發(fā)色團，進一步包含結(jié)構(gòu)
其中R1是加溶基，選自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。
37.權(quán)利要求33或34的多發(fā)色團，進一步包含結(jié)構(gòu)
其中R1是加溶基，選自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。
38.權(quán)利要求33或34的多發(fā)色團，進一步包含結(jié)構(gòu)
其中R1是加溶基，選自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。
39.權(quán)利要求27的方法，其中所述偶聯(lián)的聚合物是聚陽離子偶聯(lián)聚合物。
40.權(quán)利要求27的方法，其中所述偶聯(lián)的聚合物是陰離子偶聯(lián)聚合物。
41.權(quán)利要求27的方法，其中所述偶聯(lián)的聚合物是電荷中性結(jié)合偶聯(lián)聚合物。
42.權(quán)利要求27的方法，其中第一和第二生物偶聯(lián)物中的至少一個是抗體。
43.權(quán)利要求27的方法，其中第一和第二生物偶聯(lián)物均為抗體。
44.一種測定方法，包括
提供懷疑含有靶標生物分子的樣本；
提供包含共價連接的第一生物偶聯(lián)物的多發(fā)色團；
提供包含能夠與靶標生物分子相互作用的傳感器生物分子、信號發(fā)色團和能夠與第一生物偶聯(lián)物結(jié)合的共價連接的第二生物偶聯(lián)物的傳感器生物分子復(fù)合物，其中在這種結(jié)合后，多發(fā)色團的激發(fā)能夠?qū)⒛芰總鬟f至該信號發(fā)色團；
在傳感器生物分子能結(jié)合可能存在的靶標生物分子的條件下，在溶液中將樣本與傳感器生物分子復(fù)合物接觸；
將溶液與多發(fā)色團接觸；
向樣本施加能夠激發(fā)多發(fā)色團的光源；和
檢測是否從信號發(fā)色團發(fā)出光。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述多發(fā)色團是偶聯(lián)的聚合物。
46.權(quán)利要求44的方法，其中所述偶聯(lián)的聚合物是聚陽離子偶聯(lián)聚合物。
47.權(quán)利要求44的方法，其中第一和第二生物偶聯(lián)物選自蛋白質(zhì)、抗體和核酸。
48.權(quán)利要求44的方法，其中所述第一生物偶聯(lián)物是鏈親和素或生物素，其中所述傳感器生物分子是抗體，以及其中當?shù)谝簧锱悸?lián)物是鏈親和素時，所述第二生物偶聯(lián)物是生物素，或當?shù)谝簧锱悸?lián)物是鏈親和素時，該第二生物偶聯(lián)物為生物素。
49.權(quán)利要求44的方法，其中所述第一生物偶聯(lián)物是鏈親和素或生物素，其中所述傳感器生物分子是核酸，以及其中當?shù)谝簧锱悸?lián)物是鏈親和素時，所述第二生物偶聯(lián)物是生物素，或當?shù)谝簧锱悸?lián)物是鏈親和素時，該第二生物偶聯(lián)物為生物素。
50.一種用于鑒定生物分子的生物識別復(fù)合物，包含
生物偶聯(lián)物；
共價連接至該生物偶聯(lián)物的信號發(fā)色團；
共價連接至該生物結(jié)合物的多發(fā)色團，其中該多發(fā)色團的激發(fā)能夠?qū)⒛芰總鬟f至該信號發(fā)色團。
51.權(quán)利要求50的生物識別復(fù)合物，其中所述生物偶聯(lián)物是抗體。
52.權(quán)利要求50的生物識別復(fù)合物，其中所述生物偶聯(lián)物是鏈親和素。
53.權(quán)利要求50的方法，其中所述多發(fā)色團是偶聯(lián)的聚合物。
54.權(quán)利要求53的方法，其中所述偶聯(lián)的聚合物是聚陽離子偶聯(lián)聚合物。
55.一種測定方法，包括
提供懷疑含有靶標生物分子的樣本；
提供包含生物偶聯(lián)物、共價連接至該生物偶聯(lián)物的信號發(fā)色團和共價連接至該生物偶聯(lián)物的多發(fā)色團的生物識別復(fù)合物，其中多發(fā)色團的激發(fā)能夠?qū)⒛芰總鬟f至該信號發(fā)色團；
在生物偶聯(lián)物能結(jié)合可能存在的靶標生物分子或靶標相關(guān)生物分子的條件下，在溶液中將樣本與生物識別復(fù)合物接觸；
向該溶液施加能夠激發(fā)多發(fā)色團的光源；和
檢測是否從信號發(fā)色團發(fā)出光。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所述多發(fā)色團是偶聯(lián)的聚合物。
57.權(quán)利要求56的方法，其中所述偶聯(lián)的聚合物是聚陽離子偶聯(lián)的聚合物。
58.一種用于鑒定靶標生物分子的生物識別復(fù)合物，包含
生物偶聯(lián)物；
共價連接至該生物偶聯(lián)物的多發(fā)色團；和
共價連接至該多發(fā)色團的信號發(fā)色團，其中多發(fā)色團的激發(fā)能夠?qū)⒛芰總鬟f至該信號發(fā)色團。
59.權(quán)利要求58的生物識別復(fù)合物，其中所述生物偶聯(lián)物是抗體。
60.權(quán)利要求58的生物識別復(fù)合物，其中所述生物偶聯(lián)物是鏈親和素。
61.權(quán)利要求58的方法，其中所述多發(fā)色團是偶聯(lián)的聚合物。
62.權(quán)利要求61的方法，其中所述偶聯(lián)的聚合物是聚陽離子偶聯(lián)的聚合物。
63.一種測定方法，包括
提供懷疑含有靶標生物分子的樣本；
提供包含生物偶聯(lián)物復(fù)合物的生物識別復(fù)合物，該生物偶聯(lián)物復(fù)合物包含生物偶聯(lián)物、共價連接至該生物偶聯(lián)物的多發(fā)色團、和共價連接至該多發(fā)色團的信號發(fā)色團，其中該多發(fā)色團的激發(fā)能夠?qū)⒛芰總鬟f至該信號發(fā)色團；
在生物偶聯(lián)物能結(jié)合可能存在的靶標生物分子或靶標相關(guān)生物分子的條件下，在溶液中將樣本與該生物識別復(fù)合物接觸；
向該溶液施加能夠激發(fā)多發(fā)色團的光源；和
檢測是否從信號發(fā)色團發(fā)出光。
64.權(quán)利要求63的方法，其中所述多發(fā)色團是偶聯(lián)的聚合物。
65.權(quán)利要求64的方法，其中所述偶聯(lián)的聚合物是聚陽離子偶聯(lián)的聚合物。
66.權(quán)利要求1、24、27、44、54和62中任一項的方法，其中基因的表達通過檢測靶標生物分子來檢測。
67.權(quán)利要求1、24、27、44、54和62中任一項的方法，其中靶標生物分子的檢測提供可以用于診斷患者疾病狀態(tài)的結(jié)果。
68.權(quán)利要求67的方法，其中診斷疾病的方法包括
檢查或分析關(guān)于樣本中是否存在靶標生物分子的數(shù)據(jù)；和
對患者、醫(yī)務(wù)人員或醫(yī)療衛(wèi)生管理者提供結(jié)論，該結(jié)論是基于檢查或分析關(guān)于疾病診斷的數(shù)據(jù)而作出的。
69.權(quán)利要求68的方法，其中提供結(jié)論包括在網(wǎng)絡(luò)上傳輸數(shù)據(jù)。
70.一種用于鑒定靶標生物分子的試劑盒，包括
多發(fā)色團，
共價連接至該多發(fā)色團的傳感器生物分子，
共價連接至該多發(fā)色團的信號發(fā)色團，其中該信號發(fā)色團能夠接收在多發(fā)色團激發(fā)時來自于該多發(fā)色團的能量，并且該傳感器生物分子能夠與靶標生物分子相互作用。
71.權(quán)利要求70的試劑盒，其中該試劑盒進一步包含一種基質(zhì)。
全文摘要
提供了包括用于鑒定靶標生物分子的多發(fā)色團和/或多發(fā)色團復(fù)合物的方法和組合物。傳感器生物分子，例如抗體，可與該多發(fā)色團共價連接。此外，信號發(fā)色團可與該多發(fā)色團共價連接。這種排列使得該信號發(fā)色團能夠接收在多發(fā)色團激發(fā)時來自于該多發(fā)色團的能量。因為該傳感器生物分子能夠與靶標生物分子相互作用，該多發(fā)色團和/或多發(fā)色團復(fù)合物能夠提供針對靶標生物分子的增強的檢測信號。
文檔編號C12Q1/68GK101553579SQ200780041763
公開日2009年10月7日 申請日期2007年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月6日
發(fā)明者B·S·蓋洛德, J·W·霍格, T-j·付, 孫成軍 申請人:賽里根有限公司