專利名稱：：涉及基因gypc、agpat3、agl、pvrl2、hmgb3、hsdl2和/或ldb2的篩選和治療方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及藥物開發(fā)領域，并且特別涉及篩選對動脈粥樣硬化和動脈粥樣石更化相關的疾病以及對參與炎癥和白細胞從血流向病態(tài)組織遷移的其他疾病具有療效的化合物。
背景技術：
：盡管改善的生活方式和有效的降脂劑，例如他汀類藥物(statins)，冠心病(CAD)仍然是主要的健康威脅。CAD是變性疾病，該病是由循環(huán)血細胞和其他血漿成分的應激經(jīng)過數(shù)十年發(fā)展而來，所述應激逐漸改變動脈壁的成分(細胞的和細胞外的)，最終導致動脈粥樣硬化斑塊的形成。動脈粥樣硬化的發(fā)展速率依賴于環(huán)境壓力和個體的基因組成。與CAD有關的環(huán)境壓力主要通過空氣中的污染物(包括香煙的煙)、傳染和食物攝取(卡路里和膽固醇)并通過行為因素，特別是應激和鍛煉的程度來介導。通過個體基因組成過濾的環(huán)境壓力的凈效應通過血流量和成分的變化來反映。數(shù)年后，環(huán)境和生活方式的因素改變器官中的基因表達。與肝、脂肪或骨骼肌中的能量代謝和炎癥相關的基因的表達變化被認為與CAD十分相關。進而，基因表達的改變反映在循環(huán)中，在所述循環(huán)中可檢測到在這些器官中合成的代i射和炎癥標志物。因此，血漿成分(例如膽固醇和甘油三酯)、血糖和胰島素水平以及炎癥標志物(例如C-反應蛋白)的測量是檢測高三酸甘油脂血癥、高膽固醇血癥、胰島素耐受性、糖尿病、炎癥和免疫活化的狀態(tài)以及其他CAD表型的標準方法。血液和血漿的這些成分以及4艮可能還未鑒別的成分決定了動脈粥樣硬化的進展速率。CAD風險主要從脂質、葡萄糖和炎癥標志物的血漿濃度以及乂人血壓、身體質量指數(shù)(bodymassindex)和腰臀比例(waist-to-hipratio)來判斷。改善生活方式風險因子(例如吸煙、高脂肪和卡路里攝取以及缺少鍛煉)可以降低高血壓和體重并具有對血液中風險因子的有益影響。雖然CAD風險因子是密切相互關聯(lián)的并且在大多數(shù)人中被終身監(jiān)測，但嚴重的動脈粥樣硬化通常在晚期才被檢測到，經(jīng)常是作為心肌梗塞(MI)、中風或其他臨床表現(xiàn)的結果。動脈粥樣硬化是終身的進行性疾病，它在50%的群體中變得臨床顯著，導致心肌梗塞和中風以及最后的死亡。動脈粥樣硬化的第一個表現(xiàn)是在動脈壁的內膜中形成泡沫細胞，產(chǎn)生脂紋的組織學外觀。簡而言之，循環(huán)脂蛋白，主要是LDL，粘著于內皮下基質并經(jīng)受最終改變了內皮細胞的基因和蛋白質表達的氧化修飾。這些變化導致單核細胞的募集，所述單核細胞遷移到動脈壁的內膜，分化成巨噬細胞并吞噬修飾的LDL。這些早期步驟的后面是額外的炎癥和免疫響應，平滑肌細胞遷移和纖維化，最終形成動脈粥樣硬化斑塊并凋亡。這些生物過程以及還未鑒別的其他可能過程的相互作用構成了動脈粥樣硬化發(fā)展的基礎。最近，降低血漿膽固醇的他汀類藥物療法已經(jīng)表現(xiàn)出防止或在一些情況下甚至退化動脈粥樣硬化的發(fā)展(repertoire)卻知之甚少(2),并且?guī)缀醪涣私怅P于血漿膽固醇降低對動脈壁基因表達的有益影響的任何事情。發(fā)明概述人類基因組的作圖(mapping)已經(jīng)產(chǎn)生大量的新技術來從基因組角度研究復雜疾病，像CAD。通過揭示構成復雜生物系統(tǒng)基礎的分子活性的全部內容，這些技術可用于疾病的早期鑒別和靶向中心疾病途徑(centraldiseasepathway)的新療法(3-5)。實際上，這說明從現(xiàn)在開始的使用這些基因的狹窄角度去鑒別疾病的機制。由于可監(jiān)測所有分子的活性，表現(xiàn)最中心的分子將成為用于治療的最高等級的靶，這與迄今鑒別的根據(jù)候選驅動々lil(candidate-drivenhypothesis)予貞選的所有的輩巴的歷史相反。這一歷史偏見可能是我們觀察到當今如此多的靶在臨床試驗的后期(II和III期)失敗的原因，這并不少見。本文提供的新鑒別的耙基因代表新一代的靶，其是根據(jù)它們在涉及動脈粥樣硬化和動脈粥樣硬化相關疾病的所有可能的靶的高等級來選擇的。本文提供的靶基因主要通過在小鼠中的研究發(fā)現(xiàn)，所述基因使用獨特的小鼠模型鑒別，在所述小鼠模型中可使用肝中的遺傳矛^feCT7e/c,s'wto^降低血漿膽固醇，所述遺傳開關可在小鼠成年期的任何給定時間點被活化(9)。血漿膽固醇降低是當今阻止動脈粥樣硬化發(fā)展的最有效的方法。不幸地是，只有小部分群體(<10%)適合血漿膽固醇降低治療。使用這一小鼠模型，發(fā)明人已經(jīng)鑒別出在響應血漿膽固醇降低而預防動脈粥樣硬化中介導有益影響的基因靶。因此，這些靶可用于千預患有動脈粥樣硬化的大多數(shù)患者，他們也缺乏高水平的血漿膽固醇。開發(fā)直接靶向所鑒別的分子的化合物應該有助于防止或甚至退化這些個體的動脈粥樣硬化發(fā)展。通過對人的研究發(fā)現(xiàn)的靶基因表明白細胞的跨內皮遷移是內臟脂肪和動脈壁中導致動脈粥樣硬化發(fā)展的生物過程。這一過程對所有的炎癥反應是常見的，因此所鑒別的靶(即負責這一過程的基因)可用于預防除動脈粥樣硬化以外的其他炎癥疾病，例如類風濕關節(jié)炎、炎性腸病、阿爾茨海默病等幾個實例。在人類中進行的導致本發(fā)明的研究的另一個方面是，不僅在病態(tài)的動脈壁(即動脈粥樣硬化動脈壁)中，還在肝、骨骼肌和內臟脂肪中尋找靶。這種多器官篩選增加假定的靶的覆蓋范圍，其超過疾病自身的分子活性的全部內容，到達可影響動脈粥樣硬化發(fā)展的所有器官。本發(fā)明包括參與白細胞跨內皮遷移的129個基因(表8)。這一應用的重點是LDB2，已發(fā)現(xiàn)它是這129個基因中的122個的高級調節(jié)子，并且因此是干預的合適耙。本發(fā)明是基于對表4和表8中公開的基因，特別是G)T(:、JGM7'丄JOL,PWL2、//MGS丄/ff/)/J與動脈粥樣硬化和動脈粥樣硬化相關疾病之間的關系的發(fā)現(xiàn)。在第一個方面中，本發(fā)明涉及鑒別化合物作為候選藥物的方法，所述方法包括使所述化合物接觸表達選自由表4和表8中公開的基因(特別是LDS2、GFPC、/IGTMn/4G丄、尸f^/J、HMG/3、HSD/J)組成的組的基因的細胞，并且分析所述化合物是否調節(jié)所述基因中至少一種的表達。表達的調節(jié)可相對未治療對照的參考水平，通過技術人員可用的任何合適的直接或間接方法來測量，所述方法諸如測量轉錄的mRNA的量、產(chǎn)生的基因產(chǎn)物的量、基因產(chǎn)物的活性或測量引入的報道實體(reporterentity)。在根據(jù)這一方面的本發(fā)明的一個實施方案中，所述分析包括對所述基因中至少兩種的表達調節(jié)的分析。在進一步的實施方案中，所述分析進一步包括對選自由CD36和尸/MWa組成的組的基因的表達調節(jié)的分析。在第二個方面中，本發(fā)明涉及鑒別化合物作為候選藥物的方法，所述方法包括使所述化合物接觸選自由表4和表8中公開的基因(特別是丄/)S入GJTC、y4G/M73>」G/」>PKW/J,//MGfiL//S/)丄26)纟且成的纟且的基因的基因產(chǎn)物，并且分析所述化合物是否調節(jié)所述基因產(chǎn)物的生物活性。在這一方面，所述調節(jié)可以是活性的增加或降低。所述活性可以是一般與以下相關的活性所述基因產(chǎn)物、或參與動脈粥樣硬化或動脈粥樣硬化相關疾病的發(fā)展或進展的基因表達的調節(jié)(所述基因諸如選自由/力i2、G1TC>爿(7/^73>」G丄、PFW丄入//A/GS丄/ASAL入C7D36和尸尸ARcc組成的組的基因)或白細胞的跨內皮遷移。在進一步方面中，本發(fā)明涉及根據(jù)前述方面的任一方面的方法，所述方法包括-獲得DNA分子，所述DNA分子包括選自由〃)S2>Girr./IG/^D.爿G丄、///WGB3、Z/SU2組成的組的基因的編碼序列，以及任選地，調節(jié)所述基因表達的序列元件；-將所述DNA分子引入宿主細胞，諸如非人胚胎的細胞系或細胞，以獲得所述DNA分子的細胞表達；-使所述宿主細胞接觸所述化合物，并且移的分物活性。根據(jù)這一;^析。在根據(jù)以上(ebove)方面的方法的優(yōu)選實施方案中，該方法涉及鑒別化合物作為用于治療選自由動脈粥樣硬化和動脈粥樣硬化相關疾病組成的組的疾病的候選藥物。在以上提到的方面中，有待鑒別為候選藥物的化合物可以是有機小分子、肽、多肽或蛋白質、諸如DNA或RNA的核酸，包括siRNA和miRNA、諸如PNA的修飾的核酸或可摻入藥物組合物的任何其他化合物。在進一步的方面中，本發(fā)明涉及鑒別用于評估動脈粥樣硬化和動脈粥樣硬化相關的疾病(諸如冠心病、中風和心肌梗塞)或炎癥疾病的誘因、發(fā)展和/或結果的遺傳標志物的方法，所述方法包括檢測群體中的個體之間的選自由表4和表8中公開的基因(特別是/X)B入G)TC、/4G/MJX/1(,'丄>PFW/J.//MG7^./^7J丄力組成的組的基因的遺傳性變異，并將所述遺傳性變異與所述個體之間的動脈粥樣硬化和動脈粥樣硬化相關疾病的誘因、發(fā)展和/或結果的差異相互關聯(lián)。在本發(fā)明的這一方面中，所述遺傳性變異可以是調節(jié)(例如增加或降低)基因的表達或基因產(chǎn)物的活性的遺傳性變異。在進一步的方面中，本發(fā)明涉及包含異源DNA分子的遺傳修飾細胞和動物，所述異源DNA分子包含選自由表4和表8中公開的基因(特別是丄Z)/^.G]^C、.40R4:n、爿(7￡>PP7丄2、//A^G8J、HSD丄2)組成的組的基因的編碼序列，和/或使這些基因之一滅活。此類"敲除"動物是本領域公知的，并且根據(jù)需求進行商業(yè)基礎的生產(chǎn)。所述基因的滅活不需要了。可進一步引入異源DNA分子，所述異源DNA分子包含動物的敲除基因的編碼序列，優(yōu)選地具有允許所調節(jié)的基因產(chǎn)物表達的調節(jié)序列。在這一方面中，所述動物可以是任何非人動物，優(yōu)選哺乳動物，諸如靈長類或嚙齒類，如小鼠或大鼠。遺傳修飾細胞可以是任何來源的，并且本領域技術人員可決定合適的表達系統(tǒng)。根據(jù)這一方面的遺傳修飾細胞和動物可用于以上鑒別化合物作為候選藥物的方法。在這一方面的一個實施方案中，所述異源DNA分子進一步包含選自由表4和表8中公開的基因(特別是丄DB2、G1TC>v4G7M713、爿GL、i3F規(guī)2、//A/(763.//SD丄2)組成的組的基因的調節(jié)序列。在進一步的方面中，本發(fā)明涉及治療患有動脈粥樣硬化或動脈粥樣硬化相關疾病(諸如冠心病、中風和心肌梗塞)或炎癥疾病或有發(fā)展所述疾病的風險的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用選自由表4和表8中公開的基因(特別是丄DS入G1TC、爿G7M7:、爿G/"PK/^2、//MGfiJ、//SD/J)組成的組的基因的原型或修飾變體或用根據(jù)以上提到方面的方法鑒別的化合物。在進一步的方面中，本發(fā)明涉及治療患有動脈粥樣硬化或動脈粥樣硬化相關的疾病或有發(fā)展所述疾病的風險的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用選自由siRNA分子組成的組的化合物，所述siRNA分子靶向選自由/,/)B入GJT('、y4G尸/173、爿G7.、PFW丄入//M(WLZft7)/J組成的組的基因。這一方面還涵蓋了包含耙向選自由G1TC,y40P/T/3>爿G7,,尸WL2、//MGW、//5Y)L2組成的組的基因的siRNA分子以及任選地，藥學上可接受的載體、賦形劑、稀釋劑以及類似物質的藥物組合物。此類siRNA分子還可被修飾以增強性質，諸如增加的攝取、體內延長的半衰期等。在進一步的方面中，本發(fā)明涉及鑒別受治療者具有低于平均的發(fā)展動脈粥樣硬化或動脈粥樣硬化相關疾病的風險的方法，所述方法包括分析所述受治療者的LDS2基因，并且其中/X)B2基因中單核苷酸多態(tài)rs10939673的T次要等位基因(minorallele)的存在表明低于平均的風險。附圖簡述圖1.通過蘇丹IV染色固定<主(pinned-out)的主動樂:K來評估Ldl,Apob10,0Mttp化爐。x小鼠中動脈粥樣硬化的進展。第20(n=12)、30(n=25)、40(n=15)、50(n二15)和60(n二10)周的動脈粥樣硬化進展的箱形圖。PO.05,20周對比30周;PO.OOOl，30周對比40周;PO.02,40周對比50周。值為表面損傷面積占整個主動脈的百分比。箱形包括在百分之75和百分之25之間的值，柱形表示百分之90和百分之10之間的值，并且黑點表示這些邊界之外的個別觀察結果。圖2.動脈粥樣硬化細胞類型的細胞特異性標志物的相對表達水平。顯示了每個細胞類型的標志物數(shù)量。唯一的統(tǒng)計顯著增加是泡沫細胞的數(shù)量，它在第20周和30周之間增加20%(/'O.001)并在60周時仍然升高。圖3:血漿膽固醇降低對損傷進展的影響。損傷表面面積通過損傷面積占從分叉到主動脈根的固定住的主動脈總面積的百分比來確定。在28周齡時，小鼠接受腹膜內pI-pC注射以誘導肝中M印的重組，并且12周后或實現(xiàn)膽固醇降低1周后處死小鼠。高膽固醇對照小鼠注射PBS。(A)在40周齡時，具有低血漿膽固醇的小鼠(即pI-pC處理的，w=7)的損傷表面面積沒有進展并且與40周的高膽固醇對照(即PBS處理的，"=6)顯著不同(*尸<0.005)。(B，C)一周的膽固醇低水平(30周齡的小鼠)沒有影響(B)損傷大小(i^0.96)。顯示損傷面積的相對變化的百分比。(C)泡沫細胞(iM).52)、內皮細胞(/M).49)、平滑肌細胞(尸4.18)(SMC)和T細胞(1)=0.34)的數(shù)量。圖4.泡沫細胞形成的調節(jié)基因網(wǎng)絡。使用siRNA靶向THP-l巨噬細胞中的12個膽固醇響應動脈粥樣硬化基因。轉染后2天，siRNA靶向的巨噬細胞和用非特異性siRNA處理的對照用AcLDL(50pg/mL)孵育48小時；分離總RNA，并且確定CE和脂質的積累。(A)將來自12個siRNA實驗和四個混合對照的16個表達譜(HG-U133_Plus—2陣列，Affymetrix)用于產(chǎn)生參與泡沫細胞形成的8個膽固醇響應基因的調節(jié)基因網(wǎng)絡，包括PPARa和CD36。(B)CE積累被8個基因中的5個的siRNA抑制降低，并被2個其它基因的抑制增加；1個基因的抑制沒有影響(另參見表2)。圖5.與冠狀動脈和頸動脈狹窄有關以及與白細胞跨內皮遷移途徑有關的聚類(clusters)的Venn圖。A.表7中的聚類代表的基因的Venn圖。7個基因發(fā)現(xiàn)于動脈粥樣硬化的主動脈根/IMA聚類和縱隔脂肪聚類(Pc〈x1(T1Q)，17個在動脈粥樣硬化的主動脈根/IMA聚類和頸動脈聚類(Pc<lx10-3G)并且16個在縱隔聚類和頸動脈聚類(Pc<9x10-27)。發(fā)現(xiàn)6個基因存在于所有這三種聚類(Pc〈7.15x10-23)中。所有三個聚類的并集為I"個基因。發(fā)明詳述本發(fā)明是基于使用最新水平的聚類算法(clusteralgorithms)對來自小鼠和人的轉錄數(shù)據(jù)的系統(tǒng)生物處理，所述轉錄數(shù)據(jù)包含基因組中所有基因的基因活性信息以及在發(fā)展動脈粥樣硬化期間它們的活性語。與其中以研究的關注基因的初始選擇為標準的本領域的標準技術形成對比，這一方法允許本發(fā)明人對參與動脈粥樣硬化的所有基因進行無偏見的研究。另外，這一方法允許發(fā)明人將所有的人類基因以對動脈粥樣硬化的重要性的順序分級。這一方法在以下給出的兩個實施例中進一步解釋。在實施例1中，發(fā)明人已經(jīng)表明，在動脈粥樣硬化損傷的快速擴展前降低血漿膽固醇防止動脈粥樣硬化損傷的進一步擴大，并且已經(jīng)鑒別介導這一效應的基因(即耙)。發(fā)明人所用的生物信息方法學(即反向工程)構建了膽固醇響應的動脈粥樣硬化靶基因的基因網(wǎng)絡。治療性降低血漿膽固醇(諸如通過施用他汀類藥物)的有益影響至少部分是通過這一基因網(wǎng)絡的作用來介導的。因此，本發(fā)明涉及篩選影響這一血漿膽固醇調節(jié)的基因網(wǎng)絡的候選藥物的方法，并涉及它如何防止或甚至退化動脈粥樣硬化或動脈粥樣硬化相關疾病的發(fā)展和/或進展。作為該方法工作的確認，使用靶向所述網(wǎng)絡中的單個基因的siRNA分子調節(jié)所述基因的表達。已發(fā)現(xiàn)基因表達的調節(jié)影響巨噬細胞中膽固醇酯的積累，這是一個對動脈粥樣硬化進展重要的過程。在實施例2中，發(fā)明人使用多器官全基因組表達譜分析來鑒別與動脈粥樣硬化和其相關疾病有關的所有分子活性。使用鑒別在所有患者的四種不同器官中具有相似表達模式的基因的聚類算法，發(fā)明人鑒別了總共60個聚類。發(fā)現(xiàn)其中有3個與動脈粥樣硬化的程度相關。這三個聚類一起代表129種基因，其中大多數(shù)對白細胞向病態(tài)組織的跨內皮遷移起作用。當在動脈壁和縱隔脂肪而不是在肝或骨骼肌中有活性時，這一過程與動脈粥樣硬化的程度有關。這些發(fā)現(xiàn)在患有頸動脈(至頭部的動脈)動脈粥樣硬化的患者的確認組(validationcohort)中重復。發(fā)現(xiàn)129個基因中的122個具有共同的調節(jié)子；LIM-結構域結合2(LDB2)。因此這一高級調節(jié)子參與調節(jié)動脈粥樣硬化和動脈粥樣硬化相關疾病的嚴重性。LDB2中單核苷酸多態(tài)rs10939673的T次要等位基因被鑒別為在心肌梗塞的幸存者中未被充分代表，并且相反與LDB2mRNA和冠狀動脈粥樣硬化相關。因此，這一SNP可用作降低的冠狀動脈粥樣硬化風險的遺傳標志物。由于白細胞遷移是任何炎癥反應的主要途徑，因此作為這一過程的調病的標志物和/或治療靶的含義。本申請中公開的新型基因網(wǎng)絡和高級調節(jié)子LDB2還提供鑒別動脈粥樣硬化或動脈粥樣硬化相關疾病的誘因的或預測這些疾病的發(fā)展或結果的遺傳標志物的新的可能性。因此，本發(fā)明部分涉及通過對比具有動脈粥樣硬化或動脈粥樣硬化相關疾病的患者與沒有患所述疾病的受治療者的基因型來鑒別所述遺傳標志物的方法。并且就LDB2而言，還為了除動脈粥樣硬化以外的其它炎癥相關疾病。本發(fā)明通過對表達譜的兩個研究，一個在小鼠中并且一個在人中，來進一步描述，其顯示所鑒別的基因與動脈粥樣硬化和動脈粥樣硬化相關的疾病之間的聯(lián)系。這些研究用于闡釋和證實本發(fā)明，而不應該被認為是限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍是由所附的權利要求定義。當實踐本發(fā)明時，本領域技術人員可進一步使用以下領域的常規(guī)技術藥物化學、免疫學、分子生物學、孩走生物學、細胞生物學、轉基因動物和重組DNA技術，參見Sambrook等人."Molecularcloning:Alaboratorymanual"(分子克隆實驗室手冊)，第3版2001;Ausubel等人."Shortprotocolsinmolecularbiology"(精編分子生物學實驗指南)，第5版1995;"Methodsinenzymology"(酶學方法)，AcademicPress,Inc.;MacPherson、Hames禾口Taylor(編)"PCR2:Apracticalapproach"(PCR2:實踐方法)1995;Harlow和Lane(編)"Antibodies,alaboratorymanual"(抗體，實-瞼室手冊)1988;Freshney(編)"Cultureofanimalcells"(動物細胞培養(yǎng))第4版2000;Hogan等人."ManipulatingtheMouseEmbryo:ALaboratoryManual"(小鼠胚月臺才喿作實驗室手冊)，ColdSpringHarborLaboratory,1994;或這些書的后續(xù)版本所公開的內容。，辨/瀠^浙々遽傳舉效^《農^攀"蔞定農^舉喊應W動脈游存硬動脈粥樣硬化進展的轉錄表型在很大程度上是未知的。我們以10周的間隔在有動脈粥樣硬化傾向(atherosclerosis-prone)的小鼠中4丸行損傷發(fā)展的轉錄i普分析，所述小鼠具有人樣高膽固醇血癥和關閉肝脂蛋白產(chǎn)生的遺傳開關。我們顯示開始動脈粥樣硬化進展緩慢，在脂紋轉化為斑塊后迅速擴大，并在晚期損傷形成后達到平穩(wěn)狀態(tài)。形成四個不同表達聚類的1259個基因(其中329個先前與動脈粥樣硬化相關)的活性表達這一發(fā)展。遺傳性降低具有早期損傷的小鼠的血漿膽固醇導致不同的轉錄響應，防止迅速擴大和轉化為斑塊。鑒別了37個膽固醇響應基因(表4)，其中>90%先前沒有與動脈粥樣硬化相關。在6個沉默千擾RNA介導的全部10個膽固醇響應基因的抑制中，由THP-1巨噬細胞產(chǎn)生泡沫細胞也受到影響。因此，通過仔細研究損傷進展的轉錄表型和當血漿膽固醇降低時的其預防，可鑒別膽固醇響應的動脈粥樣硬化耙基因。動脈粥樣硬化是終身的進行性疾病，它在50。/。的群體中變得臨床顯著，導致心肌梗塞和中風以及最后的死亡。最近，降低血漿膽固醇的他汀類藥物療法已經(jīng)表現(xiàn)出防止或在一些情況下甚至退化動脈粥樣硬化的發(fā)展。然而，關于構成動脈粥樣硬化損傷發(fā)展的基礎的轉錄變化的全部內容卻知之甚少，并且?guī)缀醪涣私怅P于血漿膽固醇降低對動脈壁基因表達的有益影響的任何事情?，F(xiàn)在，在人(6，7)和小鼠(8)基因組計劃之后發(fā)展的全基因組測定技術為闡釋與復雜疾病(像動脈粥樣硬化)相關的表達變化的全部內容提供了可能性。我們研究了Z^/r-'-々o/^,"M"/。慮。XMxl-Oe小鼠模型(9)以調查損傷進展、基本的轉錄表型和血漿膽固醇降低的影響。這些小鼠具有與家族性高膽固醇血癥相似的血漿脂蛋白譜(Z^/,^wV,，)并且含有關閉脂蛋白的肝合成的遺傳開關(M//ox/floxMxl-Oe)。動脈粥樣硬化進展在第10、20、30、40、50和60周齡時檢查小鼠。血漿膽固醇隨時間略有增加，但是甘油三酯和葡萄糖水平?jīng)]有顯著變化(表I)。在87只丄*—'"Apob爆，M"/。幽x小鼠中評估損傷面積和形態(tài)學變化(圖1)。在第10周時，僅檢測到少數(shù)的蘇丹IV染色的斑點(n=10，未顯示)，但是在第20周時，所有的小鼠中均檢測到損傷。在第20周和30周之間，損傷大小增加了~1.6%(P=0.05)，并且在第30周和40周之間增加了~7.2%(PO.OOOl)。在第20周時，主要的形態(tài)學特征是脂紋(具有擴散邊界的紅色透明區(qū)域)；未檢測到斑塊。然而，在第30周時，所有的小鼠的主動脈弓具有小斑塊(具有明確邊界的紅色不透明區(qū)域)，其在第40周大幅擴大。在第50周和60周，斑塊生長受到限制。損傷隨時間的發(fā)展通過油紅0染色和CD68抗原的熒光的變化來反映(未顯示)。動脈粥樣硬化進展的轉錄表型隨后，我們鑒別了在動脈粥樣硬化進展期間構成組織學變化基礎的轉錄變化。在小鼠基因組信息數(shù)據(jù)庫(參見www.jax.org)的19,879個基因中，6.3。/。在至少一次時間對比中被差異表達(FDRO.05,未修正PO.00008,n=1259)，并且329個(27%)先前已經(jīng)與動脈粥樣硬化相關。在剩余的73%中，根據(jù)GO分析，95%具有已知的生物學功能。在動脈粥樣硬化中具有明確作用的基因中，78%在至少一次時間對比中被差異表達(尸<0.05,n=88/lll)。為了反映動脈粥樣硬化進展期間的基因表達模式，我們對所述1259個被差異表達的基因執(zhí)行mRNA水平的聚類分析(clusteranalysis)。產(chǎn)生了4個不同的聚類(表3)。聚類1的基因(n=293)在損傷的快速擴大期間被活化(圖l)，在全部60周內保持活化，并且具有先前與動脈粥樣硬化和動脈粥樣硬化細胞類型相關的最高百分比的基因(表3)。在聚類1的基因中，89%與炎癥細胞相關，包括巨噬細胞標志物CD68，其增加了五倍；在免疫組織化學方面，也鑒別到增加的CD68表達(未顯示)。這些發(fā)現(xiàn)和8個巨噬細胞標志物的相對數(shù)量的增加一起(圖2)有力地表明聚類1的表達^^式反映損傷巨噬細胞的募集和活化。聚類2在第30周(n=331)，聚類4在第40周(n=300)，基因活性達到峰值，并且在動脈粥樣硬化進展的后期被抑制。在這些聚類的基因中，73%先前沒有與動脈粥樣硬化或動脈粥樣硬化細胞類型相關。在20個轉錄因子TF中，17個失活并且只有三個被活化。聚類2和4的功能注解表明其可能參與平滑肌細胞的增殖和向損傷的遷移。聚類3(n=339)是特別顯示的。這些基因的mRNA水平在第30周達到峰值，并且在第40周被抑制，這與動脈粥樣硬化損傷的快速擴大一致。此外，該聚類含有比聚類1少但比聚類2或4多的動脈粥樣硬化相關基因，并且主要由與羧基和脂質代謝相關的基因組成。該聚類的19個TF中的13個在脂質和能量代謝中是已經(jīng)確認的，例如過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisomeproliferatoractivatorreceptors,PPAR)、PPARa、PPARd和PPARY以及固醇調節(jié)元件結合因子2。凋亡和細胞死亡在聚類2至4中是活性過程，但在聚類l中不是。這一發(fā)現(xiàn)與以下觀點一致在動脈粥樣硬化發(fā)展的所有階段，細胞死亡和凋亡是連續(xù)的過程(10)。泡沫細胞的轉錄表型除了泡沫細胞(其在第20周和30周之間的數(shù)量是增加的(PO.001;圖2))之外，其他主要損傷細胞類型(即內皮細胞、平滑肌細胞和T細胞)的相對量是隨時間相對穩(wěn)定的，如細胞類型特異性基因標志物的mRNA水平所示。免疫組織化學上證實了在第30周的缺乏脂質的巨噬細胞的募集，其在第40周擴張并成為脂質富集的?？傊虮磉_數(shù)據(jù)表明缺乏脂質的巨噬細胞在損傷發(fā)展的早期逐漸積累，在第30周達到臨界質量(圖2)，誘導炎癥反應(表3，聚類i)，增加泡沫細胞中脂質的積累(表3，聚類3)并引起迅速的損傷擴大(圖1)。泡沫細胞中的脂質積累維持到第40周(表3，聚類3)。炎癥持續(xù)到后期(表3,聚類l)。聚類2和4是與動脈粥樣硬化的新相關(表3)。LDL膽固醇降低對動脈粥樣硬化#的影響隨后，我們通過用聚肌胞苷酸(polyinosinicpolycytodylicacid)(pI-pC)處理以誘導主要在肝中的(>e轉基因的Mxl-啟動子，導致7W"/7的重組(Mrt;/"1)來遺傳性降低30周齡的小鼠的血漿LDL膽固醇；對照小鼠用鹽水處理。我們選擇第30周的時間點是因為它在動脈粥樣硬化損傷迅速擴大之前，并且因為所鑒別的動脈粥樣硬化基因在損傷和泡沫細胞中隨時間的表達模式。M印重組后，血漿膽固醇水平被降低了超過80%(從427到54±31mg/L，n=4)，并且在這一水平保持10周直到處死。處死時，這些小鼠的損傷大小沒有增加并且顯著少于具有高膽固醇的40周齡的小鼠(圖3A,尸<0.005)。因此，在第30周降低血漿膽固醇防止在具有高血漿膽固醇水平的小鼠中所觀察到的動脈粥樣硬化損傷的迅速擴大(7.2%,尸O.0001;表1和圖1)。膽固醇降低對動脈粥樣硬化的轉錄表型的影響為了鑒別由血漿膽固醇降低誘導的轉錄變化，我們再次在28周齡的小鼠中重組了肝A/"p,但這次在實現(xiàn)膽固醇降低后僅1周(第30周)就處死動物。在檢查損傷中基因表達變化前，我們檢查了影響損傷表達的其他可能來源。首先，我們檢查了損傷大小和四種主要細胞類型的相對數(shù)量在pI-pC處理的具有降低的膽固醇的小鼠(M"尸重組的)和用鹽水處理的具有高膽固醇的對照(M/Z/完整的)中是否不同。如細胞類型特異性基因標志物的表達水平所示，損傷大小(圖3B)或細胞類型的數(shù)量(圖3C)沒有差異。這些觀察通過油紅0染色的損傷的組織學外觀和損傷的CD68表達的免疫組織化學分析來確認(未顯示)。在動脈粥樣硬化的動脈壁中變化最顯著的血漿膽固醇響應基因中的37個顯示于表4。為了排除任何基因表達變化是因為Mx-lOe轉基因的肝活化而不是膽固醇降低這一可能性，我們繁殖了缺少位于M印啟動子和外顯子1的側翼的loxP位點的小鼠(^//-傘0^,朋M印"^),并且對從pI-pC處理的和PBS處理的小鼠(每個n=5)分離的損傷RNA執(zhí)行轉錄譜分析。這一對比所鑒別的幾個顯著變化的動脈壁基因中沒有表4中的基因(數(shù)據(jù)未顯示)?；虺聊瑢呐囵B(yǎng)的THP-1巨噬細胞形成泡沫細胞的影響因為幾種原因，泡沫細胞形成顯示出在第30周和40周之間的損傷的快速擴大中起重要作用。首先，第30周的動脈壁中巨噬細胞的積累處在損傷的快速擴大之前(圖2)。第二，損傷聚類3含有對細胞內脂質代謝重要的基因，它在第30周被短暫地活化。第三，在第30周，炎癥和免疫響應在損傷聚類l中活化。第四并且可能是最重要的，在炎癥和泡沫細胞的脂質體內穩(wěn)態(tài)中具有已知作用的TF在第40周失活(PPAR和SREBP-2)。從第30周至40周的損傷的迅速擴大主要由第30周出現(xiàn)的泡沫細胞的脂質載入引起(表2中聚類1和3)。我們懷疑在第30周所鑒別的膽固醇響應基因(表4)中的一些基因是這一過程的關鍵。為處理這一點，我們選擇了37個基因中的12個，它們先前已經(jīng)與泡沫細胞形成相關或為已知的巨噬細胞基因(參見"方法")。在用AcLDL孵育的THP-1巨噬細胞中用siRNA耙向這12個基因。來自所耙向的細胞的mRNA經(jīng)受轉錄語分析(11=15)，并且如所描述的來推知泡沫細胞形成的調節(jié)基因網(wǎng)絡(11)(參見"方法")。所fc向的基因中的8個屬干共有調節(jié)基因網(wǎng)絡(圖4A)并且被siRNA有效抑制(表2)。這些基因包括促進泡沫細胞形成的CD36和防止它的PPARa。羥類固醇脫氫酶樣2(HDSL2)上調PPARa并下調CD36。此外，脊髓灰質炎病毒受體相關2(PVRL2)也調節(jié)CD36,增加其表達并且負調節(jié)HSDL2，并且因此間接抑制PPARa活性。我們從這一調節(jié)網(wǎng)絡中CD36和PPARa的調節(jié)(圖4A)預測抑制PVRL2將防止泡沫細胞形成，而抑制HDSL2將促進它。為了測試這些預測和評估在網(wǎng)絡中抑制單個基因的影響，我們測量膽固醇酯(CE)和脂質積累(圖4B和表2)?？偟膩碚f，CE的測量結果確認了我們的預測并且顯示幾種其他網(wǎng)絡基因也影響THP-1巨噬細胞中CE的積累(圖4B,表2)。在這一研究中，我們鑒別了臨界點，在它之前動脈粥樣硬化緩慢發(fā)展并且僅出現(xiàn)低水平的炎癥。此后，損傷迅速擴大并且炎癥顯著增加。炎癥持續(xù)到后期，導致晚期斑塊(advancedplaque)的形成，但是在10周的時間內損傷大小短暫增加。迅速的損傷擴大主要由巨噬細胞中同樣迅速的CE積累引起。具有低含量脂質的巨噬細胞在動脈粥樣硬化發(fā)展的早期積累，達到啟動脂質的迅速積累和炎癥的臨界密度。在這一臨界點上降低血漿膽固醇防止損傷的迅速擴大和晚期斑塊的形成。膽固醇降低效應至少部分地由37個膽固醇響應的動脈粥樣硬化基因介導。通過siRNA靶向的用AcLDL孵育的THPl巨嗜細胞的轉錄譜分析確認了這些基因中的一些，顯露了泡沫細胞形成的調節(jié)基因網(wǎng)絡。這一網(wǎng)絡構架突出PVRL2和HSDL2作為新的候選基因，它們可能是防止晚期斑塊形成的未來療法的良好的靶。理解動脈粥樣硬化損傷的轉錄語富有挑戰(zhàn)性(2)。此類損傷含有幾種細胞類型，并且給定細胞類型的平均mRNA貢獻隨疾病的發(fā)展變化。因此，mRNA水平的變化代表細胞mRNA濃度實際變化和細胞類型混合物變化的混合。此外，在給定的細胞類型內，處于增殖和分化(例如巨噬細胞分化為泡沫細胞)的不同階段的細胞也增加了這一問題。然而，損傷mRNA濃度提供損傷中活化的生物過程和途徑的概況。損傷mRNA聚類(表3)的分析表明，首先巨噬細胞相對緩慢地浸潤動脈壁，導致脂紋的形成。然后，在顯示為非常具體的時間點，這些細胞被活化，導致大量的炎癥活性，所述活性和巨噬細胞中CE迅速積累組合產(chǎn)生晚期斑塊。我們認為這種轉化可與動脈壁中巨噬細胞的密度有關。在給定的密度下，巨噬細胞不但刺激它們自身(自分泌)，還相互刺激(旁分泌)，導致大量的炎癥活性并增加脂質攝取(12)。如果該機制也存在于人中，那么防止或延緩動脈粥樣硬化發(fā)展的治療時機可能非常重要。事實上在小鼠中，晚期斑塊的形成被在迅速損傷擴大前的遺傳性降低阻止(圖3A)。與損傷發(fā)展形成對比，不同細胞類型在損傷中的程度(extent)和相對組成在亞急性降低血漿膽固醇前后是相似的(圖3B，C)。因此，通過基因芯片(GeneChip)監(jiān)測的mRNA濃度的變化可能反映細胞mRNA水平的實際變化。由于巨噬細胞中脂質的積累是迅速損傷擴大的中心過程，因此通過siRNA在用AcLDL孵育的THP-1巨噬細胞中證實了37個膽固醇響應基因中的12個。已發(fā)現(xiàn)八個基因屬于共有調節(jié)基因網(wǎng)絡，其中PVRL2和HSDL2具有核心作用。關于PVRL2和HSDL2知之甚少(在PubMed中分別產(chǎn)生6和3個匹配(hits))。PVRL2中的一個序列變體與多發(fā)性硬化的嚴重性有關(13)。HSDL編碼固醇載體蛋白2，一種體外增強膜之間的脂質轉移的小的細胞內堿性蛋白結構域(14)。如調節(jié)基因網(wǎng)絡所示(圖4A),所述調節(jié)網(wǎng)絡中沒有節(jié)點(即基因)單獨促進或抑制泡沫細胞的形成，這突出了推斷基因網(wǎng)絡以了解并評估候選基因在復雜疾病中真實復雜性的重要性(11，15)。我們的發(fā)現(xiàn)暗示用血漿膽固醇降低劑干預的時機是關鍵。具有發(fā)展動脈粥樣硬化的并發(fā)癥(例如，中風和心肌梗塞)的風險的患者可從在生命的極早期治療受益。檢測早期動脈粥樣硬化的無創(chuàng)技術(noninvasivetechnoogy)在這方面是重要的。對于具有其他動脈粥樣硬化風險因子的血膽固醇正常(normocholesterolemic)的個體，介導血漿膽固醇降低的有益效果的靶向動脈粥樣硬化基因的新方案可能是有效的。因此，本發(fā)明的一個方面是鑒別化合物作為用于防止后期動脈粥樣硬化損傷的發(fā)展的未來療法的候選藥物，所述化合物靶向這些膽固醇響應基因。這一方面在所附的權利要求中進一步定義。方法小鼠模型/J/,'—4^/)膽柳M"/。^。XMxl-Oe小鼠模型具有與家族性高膽固醇血癥相似的血漿脂蛋白鐠，所述家族性高膽固醇血癥？1起動脈粥樣硬化的迅速發(fā)展(9)。為了M印刪除，小鼠在6天的時間內每隔一天注射500|il的pI-pC(1pg/^il;Sigma,St.Loms,MO)以誘導Oe表達，由此在W/r—^;w/7柳細M///^wtMxl-CV6'小鼠中重組或不重組(M"/^")。同窩出生仔畜對照接受PBS(A^/。x/tl。x)。研究小鼠與C57BL/6回交5次(<5%129/SvJae和〉95%C57BL/6)，圏養(yǎng)于無病原體屏障設備(12-小時光/12-小時黑暗周期)，并用含有4。/Q脂肪的嚙齒動物飼料(rodentchow)喂養(yǎng)?；蛐屯ㄟ^用來自尾部活體標本(bi叩sy)的基因組DNA的聚合酶鏈式反應(PCR)來確定。血漿膽固醇和甘油三酯濃度用比色測定(無限(Infinity)膽固醇/甘油三酯試劑盒；ThermoTrace)確定，并且血漿葡萄糖水平用PrecisionXtra(MediScience，CherryHill,NJ)測定。乎湯("/i""Fflce,分析和組織學如所述地將主動脈平面固定于黑蠟表面(16),用蘇丹IV染色，用NikonSMZIOOO顯微鏡拍照，并用EasyImageAnalysis2000軟件(TeknoOptik,Skarholmen，Sweden)分析。損傷面積計算為主動脈根到髂動脈分立即于在OCT化合物(Histolab，VastraFr6lunda，Sweden)中的液氮中冷凍。如所述地切割凍干切片(20)并用蘇木精和油紅O染色(17);其他切片(6-8nm)首先用大鼠抗小鼠CD68抗體或對照抗體(Serotec)在4°C下醉育過夜，然后用熒光抗大鼠IgG(VectorLaboratories,Burlingame,CA)孵育，并且用含有DAPT的封固劑(VectorLaboratories)復染。轉錄譜分析主動脈用RNAlater(Qiagen，Valencia,CA)灌注，并且移除從第三個肋狀突起(rib)向上到主動脈根的主動脈弓，并且用FastPrep(Qbiogene,Irvine,CA)勻漿?？俁NA用使用DNAseI處理步驟的RNeasy小型試劑盒(RNeasyMiniKit，Qiagen)來分離。RNA質量用生物分析儀2100(Bioanalyzer2100,AgilentTechnologies,SantaClara,CA)"i平估。將高質量的RNA樣品(32個來自M"/°x/fl°x，5個來自A/"/^M,并且9個來自M印由小鼠)在第〗0(n=7)、20(n=5)、30(n=6+5)(pI-pC)和9M,//wt/wt(n=5(PBS)+4(pI-pC))、40(n=5)、50(n=5)和60(n=4)周用于總基因表達測定，所述測定用cDNA陣列(小鼠基因組4302.0基因芯片，Affymetrix，SantaClara，CA)進行。所有樣品用生產(chǎn)商推薦的雙循環(huán)規(guī)程制備。陣列用GeneChipScanner3000掃描并用基因芯片操作軟件(GeneChipOperatingSoftware，Affymetrix)分析。文本挖掘(textmining)和現(xiàn)有動脈粥樣石更化知識使用PubMed的自動文本挖掘建立與動脈粥樣硬化、泡沫細胞、平滑肌細胞、內皮細胞和T細胞相關的基因的列表。簡單地說，一個基因^皮認為是相關的，如果它與PubMed中的文章的摘要中的任何以下術語同時出現(xiàn)動#》/多^^硬化、動^:硬化("動脈粥樣硬化相關的")>^求勿^、^逸勿y敏，("泡沫細胞相關的")>^;薩/A^7y敏、力.皮^^和7'i皮應。這些匹配構成相當廣泛但不具體的基因列表，并具有相當?shù)闹貜停龌蛟趧用}粥樣硬化或參與動脈粥樣硬化的細胞類型(即可能含有假陽性，但假陰性數(shù)量低)中可能起作用。我們還通過從已知對動脈粥樣硬化重要的最近的綜述的基因中人工提取，制作了"確定的"動脈粥樣硬化基因的列表。用乙?；疞DL孵育的THP-1巨噬細胞的siRNA將人類單核細胞細胞系THP-1的單核細胞以6xl()S個細胞/孔(于含有L谷氨酰胺(2mM)和HEPES緩沖液(25mM)(Gibco-Invitrogen，Carlsbad,CA)且補充了青霉素(]00U/mL)和鏈霉素(100嗎/mL)(PEST)的10Q/。胎牛血清(FCS)-RPMI-1640培養(yǎng)基中)置于6孔培養(yǎng)盤(Falcon,BectonDickinsonLabware)中，并用佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯(phorbol12-mynstate13-acetate,PMA)(50ng/mL)(Sigma)誘導72小時以分化為巨噬細胞。對于每種基因，細胞用至多三種siRNA(Ambion，Austin,TX),根據(jù)生產(chǎn)商的說明書(I冊trogen)使用Lipofectamine2000在不含F(xiàn)CS、PEST和PMA的培養(yǎng)基中轉染。轉染2天后，siRNA靶向的巨噬細胞和模擬物處理的對照(非特異性siRNA)用乙?；疞DL(AcLDL，50fig/mL)在含有PEST的1%FCS培養(yǎng)基中孵育48小時。如所述地制備AcLDL(18)。在4。C下，針對PBS透析樣品。AcLDL蛋白濃度通過Bradford方法確定。LDL通過順序超速離心從健康的捐贈者的血漿分離(19)。脂質、蛋白質和基因表達測定為了脂質成像，源自THP-1的泡沫細胞用在PBS中的10%甲醛固定10分鐘，并用PBS洗滌2次。所述細胞用油紅O(0.3%于60%異丙醇中)染色20分鐘，用60%異丙醇洗滌2次并用PBS洗滌2次，并用NikonEclipseE800顯微鏡在40x放大倍率下檢測。脂質通過在室溫下己烷/異丙醇(3:2)提取i小時，隨后0.5ml氯仿提取15分鐘來分離(20)。將脂質提取物千燥并重新懸浮于含有l(wèi)%Triton-X-100(Sigma)的異丙醇。泡沫細胞的脂質含量通過酶促分析，使用針對總膽固醇的無限試劑盒(ThermoTrace)和針對游離膽固醇的試劑盒(WakoChemicals,Richmond,VA)來確定。脂質提取后，蛋白質通過用0.5M的氫氧化鈉在37。C下孵育5小時來從相同的孔中提取。蛋白質濃度通過Bradford方法確定。為了HG-U133—Plus—2陣列分析(Affymetrix)并且為了確定siRNA的擊倒(knockdown)程度，總RNA用RNeasy小型試劑盒(Qiagen)從AcLDL孵育的THP-1細胞中分離。RNA濃度用分光光度計(ND-IOO，NanoDropTechnologies,Wilmington,DE)確定。為了cDNA合成，0.5貼的總RNA根據(jù)生產(chǎn)商的規(guī)程用SuperscriptIT(Invitrogen)逆轉錄。5倍稀釋后，根據(jù)生產(chǎn)商的^1程，通過實時PCR用lx丁aqMan通用PCR核心試劑盒(universalPCRmastermix)(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)在ABIPrism7000(PEBiosystems)和軟件上擴增cDNA(3)。使用含有相應引物和4笨4十的來自AppliedBiosystems的Assay-On-Demand試劑盒，并且將表達值針對酸性核糖體磷蛋白P0進行歸一化。每個樣品以兩個重復進行分析。統(tǒng)計和計算使用未配對/檢驗分析所選基因的mRNA水平的差異、小鼠血漿測量值的差異和時間點之間的損傷表面面積的差異?；虮磉_的信號水平數(shù)據(jù)用MAS5.0(Affymetrix)使用默認設置來計算，進行對數(shù)轉換(log-transformed)并歸一化為總強度(全局縮放(globalscaling))。歸一化后，通過平均相應Affymetrix探針組合的信號，計算小鼠基因組信息數(shù)據(jù)庫(MGD基因，JacksonLaboratory,www.jax.org)中的每個基因的信號強度。在數(shù)據(jù)庫中沒有配對的11,979個基因芯片探針組合(小鼠基因組4302.0基因芯片，Affymetrix)中，1.5%被差異表達(錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05，n=177)，表示基因/探針組合的部分不會被考慮用于進一步的分析。剩余的33,122個探針組合在19,879個MGD基因(總共32,095個)中有至少一個配對。差異表達測試前，以逐對(pair-wise)方式應用Lowess歸一化(21)。為了在計算差異表達的概率和FDR時進行多重檢驗的校正，我們4吏用經(jīng)-驗Bayes統(tǒng)計(22)。使用Mathematica5.1(WolframResearch,Champaign,IL)中的FindCluster算法進行聚類。GO和途徑分析用EASE軟件執(zhí)行(23)。如所述地推斷用AcLDL孵育的THP-1巨噬細胞的調節(jié)基因網(wǎng)絡(U)(見下文)。膽固醇響應的動脈粥樣硬化基因鑒別膽固醇響應的動脈粥樣硬化基因被認為是在小鼠的動脈粥樣硬化主動脈弓中被差異表達(FDR<0.05)的那些基因，與注射PBS的對照相比，所述小鼠肝中的M"p重組(參見上文)已經(jīng)通過腹膜內注射500]LilpIpC(i貼/pi)誘導(參見表4，n=37)。注射在具有兩天間隔的四個順序時間點執(zhí)行，它開始于第29周(week29weeks)的第一天，持續(xù)到第29周的最后。如第30周處死時在血漿中所測，pIpC治療在所有小鼠中實現(xiàn)80%或更多的血漿膽固醇降低。用鹽水處理的對照小鼠的血漿膽固醇水平?jīng)]有影響。在第30周期間，單獨留下小鼠以洗除注射的任何殘留效應。在缺少floxedA^,p(^///;4/7oV,柳M印mMMx10)的pIpC處理的對照小鼠中，這37個基因中沒有一個被鑒別出，因此，Mttp的重組的確沒有發(fā)生，血漿膽固醇也沒有降低。用基因芯片陣列研究這些對照小鼠以排除所述血漿膽固醇響應基因代替地是動脈粥樣硬化損傷中pIpC誘導的基因的可能性。選擇用于siRNA把向的膽固醇響應基因在37個鑒別的膽固醇響應基因中，27個具有預先確定的taqman和siRNA測定(Invitrogen)。在表4中，這37個基因中的12個被標記為粗體，表示先前已經(jīng)報道它們是由THP-I巨噬細胞表達。這些基因由沉默千擾RNA耙向。CD36作為陽性對照1并且PPAR-a作為陰性對照2包含在這些基因之中。調節(jié)網(wǎng)絡鑒別表達數(shù)據(jù)(AffymetrixHu130,2.0+)從12個siRNA實驗(對所有實驗>58%抑制，另參見表4，標記粗體的基因)和用非特異性siRNA(模擬物)處理的4組對照中產(chǎn)生。在已經(jīng)由PMA活化，用siRNA或模擬物處理然后用乙?；疞DL孵育48小時的細胞培養(yǎng)物中，從所靶向的和對照的THP-1巨噬細胞中分離總RNA(也參見上文)。三個轉錄物GPR120、GPR81和S0X6低于基因芯片的檢測極限，表明這些基因在這一泡沫細胞形成的實驗模型中沒有充分活化以被檢測或是失活的。將剩余的基因組織成9x9的數(shù)據(jù)矩陣。每個基因的表達數(shù)據(jù)通過除以對照的平均表達水平，隨后進行對數(shù)轉換來歸一化。如前所述，將線性基因調節(jié)模型與數(shù)據(jù)擬合(ll)。其中；c指表達數(shù)據(jù)向量，『是網(wǎng)絡鄰接矩陣，并且尸是干擾向量。在每個擊倒實驗中，對于干擾基因p的元素(element)是-1,對于所有其他基因是0。應注意，由于進行了對數(shù)轉換，這相當于實際表達水平的乘法模型(multiplicativemodel)。該算法通過單一參數(shù)d控制精確度和召回率(recall)之間的權衡。在我們的實驗中，我們選擇(1=0.2。在模擬中，我們發(fā)現(xiàn)這一值對應約60%的精確度和80%的召回率。應注意，基因之間的相互作用(即指向刺激或抑制效應的邊緣)不暗示直接的生物相互作用，而在大多數(shù)情況下暗示間接的生物相互作用(例如由蛋白質、代謝物或甚至中間體基因(intermediategene)(具有低表達水平，諸如轉錄因子)介導)。多器#j^^S漭》浙f^冠心病#齊W娛這^^在這一實施例中，我們在Stockholm動脈粥樣硬化基因表達(STAGE)研究中的具有冠心病(CAD)的患者中執(zhí)行多器官基因表達諳分析。方法在STAGE研究中，在冠狀動脈旁路移植術期間，使用AffymetrixHG-U133基因芯片從動脈粥樣硬化的和未被影響的動脈壁(n=40x2)中以及從肝、骨骼肌和縱隔脂肪(n=66x3)中獲得278個轉錄譜。還分析了確認組(25例頸動脈狹窄患者)。mRNA水平的聚類通過偶聯(lián)雙向聚類來鑒別?；颊吆突铙w標本收集為了探究新的CAD和動脈粥樣硬化的表達表型，STAGE研究包含了124例因為CABG(=2次移植)而入住Karolinska大學醫(yī)院，Solna的患者。征募42例在StockholmS6der醫(yī)院進行頸動脈手術的患者作為確認組。淘汰標準是其他嚴重的疾病(例如癌癥、腎病和慢性全身性炎癥疾病)。該研究由Karolmska大學醫(yī)院的道德委員會，Solna批準。所有的患者提供了知情同意。遺傳確認在具有<60歲的匹配對照的387例MI幸存者中執(zhí)行(39)以及在具有Stockholm心臟流行病學計劃(SHEEP)的匹配對照的1091例MI幸存者中執(zhí)行(24)。四名外科醫(yī)生執(zhí)行CABG，兩名執(zhí)行頸動脈手術。麻醉為標準化的；收縮壓保持在<150mmHg。在CABG患者中，活體標本從乳房內動脈(IMA)、主動脈根、肝、骨骼肌和縱隔脂肪獲得，保存于RNAlater(Qmgen)中并在-80。C下冷凍。主動脈根樣品中存在動脈粥樣硬化損傷(25，26)和IMA中不存在損傷(27)通過肉0艮檢查和顯微鏡檢查確認(未顯示)。頸動脈斑塊從動脈壁分離，粉碎，用不含核糖核酸酶的水洗滌，嵌入OCT培養(yǎng)基(Tissue-Tek，HistolabProducts)，在液態(tài)異戊烷和千冰下冷凍，并在-8(TC下儲存。隨訪和實驗室測量完成了對124例CABG患者中的114例以及42例頸動脈狹窄患者中的39例的3個月的隨訪。使用標準問巻，研究護士獲得了病史和生活方式因素的信息(例如吸煙、飲酒和體力活動)。進行身體檢查，并將靜脈血樣品抽入預先冷卻的含有NaEDTA的無菌管(Vacutainer,BectonDickinson)中并置于水上。如所述的，在30分鐘內通過離心回收血漿(2.750g，20分鐘，4°C)以分析膽固醇、甘油三酯和脂蛋白(28)。血糖通過葡萄糖氧化酶方法(KodakEktachem)測量，并且胰島素和胰島素原通過酶聯(lián)免疫吸附測定(DakoDiagnostics)測量。RNA分離和表達鐠分析總RNA用Trizol(BRL-LifeTechnologies)和FastPrep(MPBiomedicals)分離，用RNeasy小型試劑盒(Qiagen)純化，并且用RNase-FreeDNaseSet(Qiagen)處理。樣品質量用安捷倫生物分析儀2100(AgilentBioanalyzer2100)評估。與HG-U133Plus—2陣列(Affymetrix)雜交前，用分光光度計(ND-1000，NanoDropTechnologies)評估cRNA收率。陣列用FlmdicsStation450處理，用GeneArrayScanner3000掃描，并用基因芯片操作軟件2.0分析。對40例患者的所有五種活體標本、來自STAGE研究的另外26例患者的三種代謝活體標本以及來自25例隨機選擇的頸動脈狹窄患者的頸動脈損傷執(zhí)行表達語分析。冠狀和頸動脈粥樣硬化測量所有CABG患者經(jīng)受手術前雙平面冠狀血管造影術(Judkms技術)。血管造影片用定量冠狀血管造影術(QCA)技術(Medis)評估。將左右冠狀動脈和它們的分支分為幾個部分(29)。每個部分在舒張末期期間測量，并且將斑塊面積確定為占該部分的總面積的百分比。一些患者具有右冠狀動脈阻塞，這阻止了QCA評估。冠狀動脈狹窄分數(shù)從冠狀動脈中所有動脈粥樣硬化損傷來計算(腔的20%-50%和>50%的阻塞分別為1分和2分)。外科手術前，頸動脈用B型超聲檢測。使用頸總動脈的遠壁(farwall)從動脈內膜切除術(endoarterectomy)側測量內膜中層厚度(IMT)(30)?；蚍中陀肣iagen血液和細胞培養(yǎng)DNA試劑盒從血液中提取DNA?；蚍中陀肨aqManSNP基因分型測定(AppliedBiosystems)執(zhí)行。在LIM結構域結合2(LDB2)基因(dbSNP:rs872478、rsl501127、rs廳9673、rs2658509和rs7671482)中選擇了五種單核苷酸多態(tài)(SNP)，根據(jù)SNPbrowserSoftware3.5(AppliedBiosystems)，所述單核苷酸多態(tài)平均分布于不同的連鎖不平衡(LD)區(qū)。0.5昭的總RNA根據(jù)生產(chǎn)商的規(guī)程用SuperscriptII(Invitrogen)逆轉錄。5倍稀釋后，根據(jù)生產(chǎn)商的規(guī)程，通過實時PCR用lxTaqMan通用PCR核心試劑盒(AppliedBiosystems)在ABIPrism7000(PEBiosystems)和軟件上擴增cDNA(3)。使用含有相應引物和探針的來自AppliedBiosystem的AssayOn-Demand試劑盒。將mRNA水平乂十36B4進4亍歸一化。每個樣品以兩個重復進行分析。計算和統(tǒng)計分析臨床和代謝特征提供為平均值土SD的連續(xù)變量以及受治療者數(shù)量和百分比的分類變量。P值用非配對Z檢驗計算；將偏態(tài)值(skewedvalue)進行對數(shù)轉換。對于SNP分析，使用ANOVA、卡方和邏輯回歸(StatView5.0.1)?；虮磉_值用分位數(shù)歸一化和穩(wěn)健多芯片平均(RobustMultichipAverage)預處理(3)(另參見"補充方法")。604,258個完全配對的Affymetrix探針信號中，423,636個可繪制成參考序列(refseq)轉錄物(32),產(chǎn)生15,042個參考序列轉錄物?；虮磉_數(shù)據(jù)通過偶聯(lián)雙向方法聚類(33，34)。首先，基因聚類用超級順磁聚類算法來鑒別(33)。第二，對于每個基因聚類，患者通過分級聚類來分組(35)(參見"補充方法")。聚類用樹形圖(TreeView)來顯示(35)。如所述地計算差異表達的概率和錯誤發(fā)現(xiàn)率(22)?；虮倔w論(GeneOntology,GO)和途徑分析用DAVID軟件(56)執(zhí)行，并且所有的計算用Mathematica5.1執(zhí)行。使用文本挖掘定義先前與CAD和動脈粥樣硬化相關的轉錄物(參見"補充方法")。對于啟動子分析，使用TRANSFAC(36)。4卜充方法STAGE研究所包含的114例患者經(jīng)受分離的選擇性冠狀動脈旁路移植術(CABG)。手術期間獲得5個組織樣品。0.5g骨骼肌取自接近切口的頂腹直月幾(apicalrectusabdominismuscle)的內側緣，并且約lg的縱隔脂肪自位于心包和大血管前的組織。乳房內動樂j^人左胸壁的內部分離，并且切下1cm的遠端部分。全厚度主動脈壁樣品從穿孔獲得，所述穿孔用于在手術期間在主動脈根處產(chǎn)生近側靜脈移植物吻合。約0.05g肝組織(直徑3mm)在手術末期取自左肝葉的極下緣。當在劍突下僅幾厘米處打開腹膜后，肝的這一部分是容易接近的。在移走活體標本后縫合該極小切口，并且將腹膜再次閉合。所有組織樣品獲取沒有使用燒灼術且沒有并發(fā)癥。將它們在10秒鐘內立即放入RNAlater(Qiagen)溶液，并且在-80。C冷凍直到進一步處理。來自每個組織的基因表達數(shù)據(jù)以Getz等人啟發(fā)的偶聯(lián)雙向方式聚類(34)。該程序的第一步包括使用由Tetko等人實施的超級順磁聚類(SPC)算法聚類基因(33)。該算法允許基因表現(xiàn)為多個聚類。基因表達譜之間的相似性用Spearman等級相關來測量。我們鑒別在0.015溫度間隔內穩(wěn)定的聚類，并移除重疊的聚類，如果它們超過60%同一性，并且排除具有超過1000個成員的聚類?；趩蝹€基因聚類，我們使用分級(聚合)聚類用Mathematica中的平均連鎖將患者分為2個聚類。使用Manhattan距離測量2例患者表達語之間的相似性。小的患者聚類(3例患者或更少)被認為是異常值并因此移除，將剩余的患者重新聚類。為了具體化，患者用Eisen等人的聚類中的分級聚類來重新聚類(35)。這產(chǎn)生了與我們的聚合算法聚類完全相同的用樹形圖具體化(35)的聚類樹。定乂^#與C4D初^使用PubMed的自動化文本挖掘建立先前與CAD和動脈粥樣硬化相關的基因的廣泛列表。筒單地說，一個基因被認為是相關的，如果它與PubMed上的發(fā)表文章的摘要中的任何以下術語同時出現(xiàn)冠心^|、動#游脊硬化和動#硬化。其他2個列表使用膽塔寧或凝尿^作為搜索術語人工生成。由于一些明確的動脈粥樣硬化基因未被捕捉，所以從最近CAD和動脈粥樣硬化的綜述中人工提取了一些基因。CAD相關的基因的列表包含2832個基因。啟動子序歹'J來自Ensemblv.43，乂人Biomart(http:〃www.biomart.org/)下載。鑒別了具有LIM結構域(37)或已知與LDB2相互作用(38)的轉錄因子(TF)。我們在TRANSFACv10.4(36)上從這組Tf中搜索已知的轉錄因子結合位點(TFBS)。這些Tf中的7個具有總計171個已知的TFBS。我們使用程序PATCH(36)并在啟動子序列中搜索這171個基序以至少6bp配對且沒有錯配的位置。遽傳確"逸SCARFStockliolm冠狀動脈粥樣硬化風險因子(SCARF)研究是病例-對照研究，其被設計以形成遺傳和生物化學因子早發(fā)MI研究的基礎。包括總計387例年齡小于60歲的首次MI的幸存者，他們已經(jīng)入住Stockholm北部三家醫(yī)院(Danderyd醫(yī)院、Karolmska大學醫(yī)院Solna和Norrtalje醫(yī)院)的冠心病監(jiān)護病房。筒單地說，登記了滿足選擇標準的隨意4兆選的患者，并且淘汰標準為1型糖尿病、腎功能不全(定義為血漿肌酐》00pmol/L)、任何慢性炎癥疾病、藥物成癮、精神病或無力遵從規(guī)程。對于每位心肌梗塞后的患者，從一般人群中征募性別和年齡匹配的對照者(響應率79%)。在所述索引心血管事件(indexcardiacevent)后三個月，患者和對照經(jīng)受體檢，并且過夜禁食后取得血液樣品。背景資料(例如社會環(huán)境、生活方式、病史和藥物治療)通過結構性訪談的形式收集。種族劃分根據(jù)自我報道的回溯遠至3代的起源來記錄，并且超過99%的本研究參加者被認為是白種人。另參見表9。Stockholm心臟流行病學計劃(SHEEP)研究是大型的基于人群的病例-對照研究，其目標為研究誘發(fā)MI的遺傳、生物化學和環(huán)境因子。潛在的研究參與者(年齡范圍45-70歲)是生活在Stockholm郡的先前沒有臨31床診斷為MI的所有瑞典居民。男性病例征募于1992-1994年之間，并且女性病例于]992-1994年之間。Mi診斷的標準是根據(jù)由瑞典心臟病學會于1991年提出的指導原則，并且包括:(1)典型癥狀;(2)血清肌酸激酶(S-CK)和乳酸脫氬酶(LDH)的顯著升高以及(3)特有的心電圖變化。如果滿足2個或3個標準，則患者^皮診斷為MI。每名病例的5名對照候選者在病例事件的2天內取樣，以便能夠代替潛在的無響應者。對于每位心肌梗塞后患者，在符合年齡、性別和集水區(qū)域(catchmentarea)后，在病例事件2天內征募隨機選4奪的健康個體。由于來自一些初始對照的延遲響應，偶爾地會同時包括初始和可選對照。在患者的所述索引心血管事件后近三個月，收集血液樣品，并且所有的參與者經(jīng)受體檢。另參見表IO。結果患者特征所述114例STAGE患者為典型CAD組(表5)。重要地，他們的特征沒有顯著不同于從中獲取代謝基因表達譜的66例STAGE患者的特征，所述114例STAGE患者轉而也沒有不同于從中獲取全部5個表達譜的40例STAGE患者。從中獲取基因表達譜的頸動脈狹窄患者(n=25)的基本特征也顯示于表5中。與冠狀動脈粥樣硬化的程度相關的基因表達為了定義與動脈粥樣硬化相關的基因聚類，我們使用偶聯(lián)雙向聚類分析(補充方法)，分析來自動脈粥樣硬化主動脈根與未受影響的IMA的15,042參考序列轉錄物(方法)的mRNA比例。在14個基因聚類(表7)中，一個基因聚類(n=49個基因)將患者聚類成冠狀動脈狹窄程度不同(P=0.008)的2組。從肝和骨骼肌鑒別的基因聚類(分別為15和11聚類；表7)與冠狀動脈狹窄不相關。相反，縱隔脂肪基因表達i普的雙向聚類產(chǎn)生了20個基因聚類(表7);—個基因聚類(n=59)將患者聚類成冠狀動脈狹窄程度不同(P=0.00015)的2組。7個基因出現(xiàn)在兩個動脈粥樣硬化相關的聚類中(偶然出現(xiàn)的可能性(PcX7xl0—,)，表明了在縱隔脂肪和動脈粥樣硬化主動脈根中的共同的動脈粥樣硬化相關基因活性。與頸動脈粥樣硬化的程度相關的基因表達為了確認在STAGE組中鑒別的動脈粥樣硬化相關的基因，我們分析一組經(jīng)受頸動脈外科手術的頸動脈狹窄患者(表5)。偶聯(lián)雙向聚類來自25個頸動脈斑塊的表達譜產(chǎn)生11個基因聚類(表7)，其中一個(n=55)將患者聚類成IMT分數(shù)不同(P=0.038)的2組。明顯地，所述55個基因中的16個與縱隔脂肪聚類基因重疊(Pc<9x10—27)，并且17個與主動脈根/IMA聚類基因重疊(Pc<lxl(T3Q)。6個轉錄物(C型凝集素結構域家族14、《丐黏著蛋白5、染色體20開放閱讀框160、內皮分化鞘脂G蛋白偶聯(lián)受體-l、G蛋白偶聯(lián)受體-116和LDB2)在所有三個聚類中(Pc〈7.15x10_23),并且總計有129個基因(表8)?；虮倔w論和KEGG途徑分析3種鑒別的聚類(與來自兩個患者組的3個單獨的組織中動脈粥樣硬化的程度相關，圖5)之間的高度顯著的重疊表明這3個聚類包含了對動脈粥樣硬化發(fā)展重要的生物活性。為了了解更多關于這些聚類中的基因(n=129，表8),我們執(zhí)行了GO和KEGG途徑分析。89個在GO分類^參過程中具有匹配，100個在》、子j^中具有匹配，并且93個在勿y艘^_^中具有匹配。最高分在蘭*3,中是細胞通訊(n=40，P<.41CT5)、信號轉導(n-37，P=3.7x10-5)和細胞黏著(n=13，P<6.5"(r4);在》、子中是鳥苷酸交換因子活性(n-7，PL7x10-s)、GTP酶調節(jié)活性(n二9，P<2.5xl(T4)和信號轉導活性(n=34,P=3.1xl(T4);并且在/耽腔^皇中是膜(n=64,P<1.310-7)和質膜(n=31,P〈4.8x](r7)。在129個基因中(表8);3個基因先前已經(jīng)與動脈粥樣硬化相關，40個沒有i^》i^疾注釋并且7個參與調節(jié)活性(轉錄因子(TF)和它們的輔因子)。在38個有KEGG途徑的注釋的基因中，16個與跨內皮遷移途徑有關，其中8個具有精確的匹配(n=8,P<7.7xl(T7)。啟動子分析和遺傳確認在重復代表的具有與冠狀和頸動脈粥樣硬化程度相關的較高mRNA水平的6個基因中(所有三個聚類的交叉；圖5),LDB2作為唯一的轉錄調節(jié)子脫穎而出。為了探究LDB2可能參與調節(jié)其他128個基因(除LDB2以外的所有三個聚類的聯(lián)合，圖5)中的一些基因的可能性，我們在TRANSFAC中對在這些基因中的122個基因中發(fā)現(xiàn)的161個啟動子執(zhí)行計算機芯片(/"w/zco)序列匹配。首先，我們鑒別了7個TF,這些TF具有在TRANSFAC(vl0.4)中已知的結合位點基序和LIM結合結構域或已知與LDB2相互作用的其他結構域(ISL-la、Lmo2、Lhx3a、Lhx3b、LHX2、LHX4和BRCA1)。我們發(fā)現(xiàn)在這129個基因中的122個(94%)中發(fā)現(xiàn)的161個啟動子(靶啟動子)的81%具有至少一個這種結合位點。涉及相對于轉錄起始位點的10255個人啟動子覆蓋[-600，-l]區(qū)的背景，結合靶啟動子顯著增加1.2至5倍。聚類和計算機芯片上的啟動子分析表明LDB2可能與涉及動脈粥樣硬化嚴重性的129個基因中的一些基因的體內調節(jié)有關。如果是這樣，影響LDB2表達的功能多態(tài)應該也影響動脈粥樣硬化的發(fā)展。為了檢驗這一假設，我們在遺傳學上確認了387名MI幸存者和匹配對照中(39)，以及1091名MT幸存者和來自SHEEP的對照中的LDB2基因(24)。首先，我們鑒別了根據(jù)LD區(qū)在LDB2中均勻分布的5個SNP,然后尋找與STAGE組中的基因表達的關聯(lián)。SNPrs10939673的次要T等位基因的載體傾向于在主動脈根/丄MA(P00.004)和縱隔脂肪(P二0.001)中具有較低的LDB2mRNA水平(通過實時PCR評估)。此外，如通過冠狀動脈狹窄分數(shù)(P=0.012，n=375)和斑塊面積百分比(P-0.029)判斷的，T等位基因載體在MI幸存者中明顯未被充分代表(P=0.014(n=375)，0.03(n=917)和0.005(n=1304，組合)，表6A-C)，并且具有較少的動脈粥樣硬化(表6D)。結果總結在所有組織類型中鑒別的60個聚類中，2個與冠狀動脈狹窄的程度有關一個在主動脈損傷(11=49個基因)中并且一個在縱隔脂肪中(n=59)。明顯地，在頸動脈狹窄的患者的確認組中，也在與動脈粥樣硬化程度相關的聚類(n=55)中鑒別了這些基因中的27個。功能分析將^/恥嫁^/#力^if移鑒別為動脈粥樣硬化嚴重性和LIM-結構域結合2(LDB2)的共同特征，因為7個基因中的一個涉及轉錄調節(jié)。計算機芯片上的啟動子分析表明LDB2可間接調節(jié)大部分鑒別的基因。在387位具有匹配對照的心肌梗塞幸存者中，LDB2中的SNPrsl0939673的稀少T等位基因在幸存者中未^皮充分代表，并且相反地與冠狀動脈粥樣硬化相關。討論不同于候選基因或途徑方法，全基因組方法，諸如全基因表達分析相對于所研究的生物或病理學系統(tǒng)的現(xiàn)有知識更加7>正。因此，全基因組分析可迅速增加我們對復雜生物問題的分子機制和共有調節(jié)子的理解。在STAGE研究中，在每位患者中分析了5個CAD相關的器官中的15,042個參考序列信號值，以反映對冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)展重要的基因活性。動脈粥樣硬化主動脈壁和縱隔內臟脂肪中的101個轉錄物與冠狀動脈粥樣硬化的程度有關，而在肝和骨骼肌中的基因活性聚類是無關的。明顯地，在25例頸動脈狹窄患者的確認組中，還發(fā)現(xiàn)101個轉錄物中的27個屬于與動脈粥樣硬化程度相關的唯一的基因活性聚類。生物信息評估表明所鑒別的基因中的僅31個先前與動脈粥樣硬化相關，40個沒有生物過程注釋并且16個與跨內皮白細胞遷移途徑相關。根據(jù)計算機芯片序列啟動子分析，與轉錄調節(jié)相關的7個轉錄物中，一個(LDB2)可潛在調節(jié)多達81。/。的所鑒別的轉錄物。在兩組具有基于人群的對照的MI幸存者中的/,D/^遺傳確認表明SNPrs10939673的次要T等位基因較少地與冠狀動脈狹窄相關，并且在MI幸存者中具有明顯較少的普遍性。這些結果表明(1)縱隔中的內臟脂肪充當影響冠狀動脈粥樣硬化的炎癥的局部來源；(2)增加的白細胞跨內皮遷移與增加的動脈粥樣硬化嚴重性相關；(3)LDB2是參與CAD發(fā)展的高級調節(jié)子；(4)LDB2的拮抗物值得作為動脈粥樣硬化的療法來測試；并且(5)/,/)/^中的SNPrs10939673可用于鑒別CAD/MI風險。白細胞的跨內皮遷移是動脈粥樣硬化發(fā)展的明確途徑。單核細胞的跨內皮遷移對泡沫細胞形成和啟動動脈粥樣硬化斑塊發(fā)展是重要的(40,41)并且T細胞的跨內皮遷移被認為是動脈粥樣硬化后期的中心過程(42)。事實上，跨內皮白細胞遷移已經(jīng)被認為是動脈粥樣硬化治療的可能靶。我們的KEGG途徑分析表明增加的白細胞的跨內皮遷移可能是具有更加嚴重的動脈粥樣硬化患者的共同特征。此外，所鑒別的基因中的一些沒有注釋的基因可能在這一途徑或其調節(jié)中起作用。另外，我們的數(shù)據(jù)表明這一途徑直接參與斑塊的形成并且也通過增加縱隔脂肪的炎癥狀態(tài)間接地參與斑塊的形成。在肝或骨骼肌中沒有鑒別到與冠狀動脈狹窄的程度相關的基因聚類。當考慮這些器官對明確的CAD風險因子，諸如血漿膽固醇和葡萄糖水平(即糖尿病)的重要性，這是令人驚訝的。這些發(fā)現(xiàn)可反映基因表達通過對這些風險因子的治療而正?；??？v隔脂肪(或任何內臟脂肪)與血液中明確的CAD風險因子的關系并不清楚。然而，增加的腰臀比例一腹部內臟脂肪質量增加的指示一是CAD最有力的預告者之一。縱隔脂肪令人關注的方面是其解剖位置并且最近的數(shù)據(jù)表明內臟脂肪作為炎癥介質的來源的作用(43)。盡管我們的研究沒有表明縱隔脂肪可如何引起動脈粥樣硬化，但炎癥介質的局部來源可增加動脈粥樣硬化進展的速率(44)。編碼LIM結構域結合因子(諸如LDB2)的基因最初是在篩選與核蛋白的L.IM結構域物理上相互作用的蛋白質中分離的。這些蛋白質結合多種TF并且可能起增強子的作用，將不同的轉錄因子結合到一起以形成高階活化復合體(higher-orderactivationcomplex)(45,46)。在我們篩選LDB2相關的TF中,鑒別了ISL-la、Lmo2、Lhx3a、Lhx3b、Lhx2、Lhx4和BRCA1。ISL-la增強HNF4活性，因此增強胰島素信令(signalling)(47，48)。Lmo2參與血管發(fā)生(49,50)。Lhx3和Lhx4調節(jié)垂體特異性細胞語系的增殖和分化(51)并且在^fr巴細胞的亞型(52)和胸腺細胞腫瘤細胞系(53)中表達。BRCA1與自發(fā)和LPS誘導的TNF-a的產(chǎn)生的選擇性缺陷有關，并與自發(fā)和LPS誘導的TNF-a誘導的外周血單核細胞上(54)細胞間黏著分子1的表達的產(chǎn)生的選擇性缺陷及控制T淋巴細胞生命周期(55)中的選擇性缺陷相關。直到本研究為止，LDB2都未與CAD或動脈粥樣硬化相關。其高等級的調節(jié)作用和參與不同生物過程使之成為復雜疾病的進一步評估所關注的靶?？傊?，幾種CAD相關器官的分子譜分析反映由縱隔脂肪分享并在頸動脈損傷中復制的獨特分子動脈粥樣硬化表型。該表型包括白細胞的跨內皮遷移和作為包含動脈粥樣硬化保護性(atheroprotective)稀少SNP等位基因的高級調節(jié)子的TF輔因子LDB2。參考文獻1.Grines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BRCAlmutationscarriers(BRCAl突變載體中腫瘤壞死因子a(TNF-a)的產(chǎn)生和TNF-a誘導的ICAM-1的表達的缺陷).BreastCancerResTreat2003;81(2):99-105.55.MakTW,HakemA,McPhersonJP,ShehabeldinA,ZablockiE,MigonE等人.BrcalrequiredforTcelllineagedevelopmentbutnotTCRlocirearrangement(T細胞譜系發(fā)展而不是TCR基因座重排需要Brcal).NatImmunol2000;l(l):77-82.56.DennisGJr，ShermanBT,HosackDA,YangJ,GaoW,LaneHC,LempickiRA,DAVID:DatabaseforAnnotation,Visualization,andIntegratedDiscovery(DAVTD:注釋、顯示和整合發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)庫).GenomeBiol.2003;4(5):P3表1.代表性丄必-/-^^層卿她《/。,。^^1_(>6小鼠的血漿膽固醇、甘油三酯和葡萄糖的濃度年齡(周)1t).6士0.42L3士〗」.29.6±0.040.3±0,050.5±0.86i.0±0.0血漿水平(mg/dl)(n=7)(n=5)(n=6)(:n=5)(『5)(n=4)膽固醇36L2±64.2345.7±65.3427.0±72,4461.9±14.1427.2士74.2527.3±7L5-皆油三酯83.0±25.8S4.1士l(〗.587.8士17.084.7±20,0K)8.6土26.289.6土38.3葡萄糖359.6土50,6425.4±76:2369,8±37.83U.4±28.5350.6±〗<).6376.0±38J值為平均值士SD。時間點之間沒有統(tǒng)計顯著的差異(尸>0.05)。表2siRNA靶向的膽固醇響應基因基因符號基園名稱擊倒程度賴對對'體P—值a的顯^淀粉-1,6-葡糖魯酶，4i-葡聚糖轉移酶63%37%p<0001減少2..AGPA丁3卜酰基-.siv-甘油卜磚酸乙酰轉移攀鵬-14%ns減少3.CD36CD加抗原能％-1'7%p《0001減少《GP『化1G蛋白偶聯(lián)受體gl鵬-14%減少5,(;菱白偶葛失受體im"■%增加gypc^:型糖蚤白〔52%od-iHMG83高遷移率族盒365%-18%減少8.P脇訓蛋白激鐮，d,儂賴性調節(jié)，類型np49%-鄉(xiāng)減少脊髓灰廣炎病毒受體相關2燃-30%減少mSOX672%-27%p鄰細減少aP值表示與lipofectamine轉染的平行對照(n=6)相比，所靶向基因(n=6)的泡沫細胞中的CE含量。CE表示膽固醇酯；ORO,油紅O;nd,無差異；ns，不顯著表3<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>表430周齡的小鼠的動脈粥樣硬化壁中的膽固醇響應基因<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>Fndc3b舍纖連蛋白類型ni結構域的3B葡聚糖(i.，4-or)，分支酶lGpr81G蛋白偶聯(lián)受體81Gprl20G蚤白偶聯(lián)受體120Gprc5bG蚤白偶聯(lián)受體，家族C,組5,成員BGypcgypc,血型糖蛋白CHragM高遷移率族盒3Hsdl2羥類固醇脫氫酶樣2294±41330±501.130,035717±353108土620.150,0061278士16736士18《U30.018530±23196±640.180.023548U9390-153tU6().(KK)74520±137882.±304微±55鵬±8(10.360.210,036().柳77，412±627253士1300.180.012Io加t內膜蛋白，線粒體的663土l約176±98().270.046Lrppi'c含富舍亮氨酸PPR-基序5("+2iOli7-f480.230.012Mccc2甲基巴豆酰輔醃A羧化酶2(p)My!ifL球蛋白，輕鏈多舦tIMhx丙Sfl酸脫氬晦復合體，組成XPpara過氧化物酶體增殖激活受體aPrk紅2b蛋白激酶，cAMP依賴性調節(jié)，類型IIp205±3460±400.290.038248二1()835±24(U40.00251147±4082.23±1570.19(l(Ml428±177SS±3()0.130,0301819±731.343±2.22O,M()Pvr!2脊髓灰質炎病毒受體相關2220±55SJcJ6al溶質載體蛋白家族16286*129(—元羧酸轉運蛋白),成員l62±230,280,003355±300.190.017Sox-6含SRY盒基因6Stall信號轉導蛋白和轉錄激活蚤白l22翻2D01.RIKENeDNA.2210412D():lRik基因23畫2(K)6:腿ENcDNA.2310042G06Rik基因231叛)79M0RIKENcD"NA2310()79P10她基因261OCI02J23RJKENc:DNA2610002J23Rik基因4933429D07RIKENcDNA4933429D07基因AA408954表達序列AA4,954BC(B40f)8cDNA序列BC034()68D0:H4S1DNA區(qū)H人D4S114D83(腦H16RMNe)NAD83訓H16Rik基因174±42374±15465±1800.31譜3S0.049247±8481±280.330,0421.284±316387±1420.300.037370±7855±30(U40.002788±5!292±66i.560.048598±24768.±51(U20.0(H72576士834530±3560.2i(),(M()1518±595172±137O.!l0.012269:t68546±1992.03C).()37663±189176±訴0.27().()46表5STAGE研究中患者的基礎特征頸動脈賴it代謝.完全傷.泉達潛特征襲達請-表這#連續(xù)變量平均儻土sf;(:N=114)(N=66)P(N=40)P(N=25)年餘w66±866±8664:869±11身體質量指數(shù)26.6±3.726.4±3.926.3±3.925,3土3'20.94±0.060.93±0.060鄰:i-0加0.91±0,07血壓-mmHg收縮141±19140"9135i18150±19舒張80±980±1078±877±962±47SS±4961士5344±16胰島素原-ptriol/L5,6±5.75,1i5,75.5±6.94.6±2.4總4,08i:1.013,97±1.083.83.±1.024.74±1.21VLDL0,32±0.250.29±0.2.50.26±0,250.22±0.17亂2.09i0.792.01±0.841.87±0,762.60±0鄰HD〖—1.49±0.291.51±0-331.54±0.391.74±0,48甘'油三l旨-mmoyL總3.41±0.731,36±0.701.41±0.761,23±0.49VLDL1.(34±0.670,97±0.640.98:t0.680.79±0.420.26±0.090,27±0..090.2i3±0.090.29±0.09HDL0.16±0.050.17±0,050.19±0.08"0.20±0,08飲酒g/周120±恥124±32117±106動脈粥祥硬化分數(shù)斑塊面積￥37.8:i14,138J±13.8NA狹窄分數(shù)NA5-06±2.415,37±2.43證NANANA1.24±!3,24康復天數(shù)NA13土813±7喊分類變量受治療者的數(shù)量")性別男102(89)59(89)37《93)1S《抑)女12(11)7(")3《8)10(夠吸煙者當前8(7)4,2<5)1(4)過去'70{61》42(64)25(63)不吸煙36(32)20(30)13(33)5《21)當前癡病糖尿病24(21)11(17)5(13)*2(8)高血壓72(63)43(防)25(:&3)16(64)高脂血癥84《74)棉(74>27,13(52)治療他汀類藥物101《糊61(92)37(93)15(60)p阻斷劑103《90)62(94)38(95)11(44)賧島素(口服或皮下)23(20)9(14)5(13)1(4.)手術后并發(fā)癥主要心血管事件NA9<14》8(15〉NA次要心血管事件NA13(20)8(20)NAP值使用非配對t檢驗比較STAGE中的亞組和整個STAGE組(N=114)來計算.*尸值<0.05;**尸值<0.01￥斑塊面積是對左冠狀動脈的7個部分的總結，圓括號中的數(shù)字表示整個亞組的％.表6MI病例和匹配對照兩個組中rsl0939673的關4關分析樹35個Ml和對照中rs!0939673的基因型和等位基H頻率基S型分布等位基閨頻率t優(yōu)勢模型ccgtrrp—植c'tmafHtCT+TTor〖95%C,i.)iK皇^患者M！對照糊170船0.04柳534902600.3470,0344郞加${).3雜糊1滯215'雄(0,51-0.93》0,014rsl093963的基S型和等位基閨頻率等化基.S頻率優(yōu)勢模型CTrMFp-值CCGT+TTOR〖郎。"丄)p-植婦對體'14215067160.3850.G311060d413351578O.挑440脇謹6(G》酌個MI組中rS復093963的基B型和等位基因頻率基閨型分布等位基踢頻率T優(yōu)勢模型CCCTTT。..值CtMAFp-值CC"直,患者礎對照6101830.0151632S60.3740,005，鄉(xiāng)1368O."O5115707930,81{G朋-0.S4)'i鵬問在35個MI病例中fs]力93暢73和動脈粥樣硬化測量之間的聯(lián)系基因型-患者基〖萄型-患者變量CC(、'T.TT值CCCWTP'值.狹窄分敎斑塊面積3,/±2.9Jt3.0Z.5i-3力68±3032±20!33±2713,02468±3060i22MAF表示次要等位基因頻率；MI,心肌梗塞斑塊面積是對所有部分的總結表7與所有組織中狹窄分數(shù)或IMT相關的偶聯(lián)雙向基因聚類狹窄分數(shù)主動*#-!MA平均#1平均#2P-值FDRNlN2聚類l5,81258，2—-325聚類25，0714296,720,0400,2811425聚類36,3636364,833333--336聚類46,75,0625o耀)0，2卯2016聚類54,8757o，,0,1001623聚類()6,5833335,3846〗5()，〗72()，5352413聚類76，0606()66,5--336聚類85，55882410—-M聚類96，26923〗6,25264聚類IO5，31259,857.143—327聚類n46,266667—530<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>聚類85,5090915,60，9430，鄰35510聚類95,5(,15,714286--7聚類IO5,53571450，6850鄰956聚類ll5,5094345,625(),鵬O,船8不考慮<8的患者組狹窄分數(shù)縱隔脂脒平均#1平均#2P-值冊RN1N'2聚類l5,5333335,5_—604聚類25，6792454,833333()，3940,8225312聚類35,9583334,294n80,0440,281站17聚類45,0454556，523810，0470,281442:i聚類53,,05()，■0,007〗.946聚類65,4146345，7727270,6440,9394122聚類75，5178575,5555560,%01,000569聚類85,984.0扉0,0575015聚類95,〗77778O0,125()，4384520聚類io5,7241383,857143一587聚類ll5，7843M4,57〗429(),1990,5355114聚類12557(則44，5714290J990,5355114聚類135，(順575，0714290,2010,5353528聚類145,9583334,294"80,0440,28148n聚類155,418〗826,〗0,4440,88855聚類1.65,4615385,3333330,8620，9635212聚類175,42592660,487()，91154u聚類185,4833336-'6《〕5聚類195,3333336,2142860,3290,7〗851!4聚類205,4523815,3809520,9160,9634221不考慮〈8的患者組IMT值頸動脈狹窄平均#1平均#2PHtNl—聚類l~"^^^^^^聚類21,219〗，3214—186聚類31,1927651,4106—186聚類41，2377651，339333—184聚類51，〗932941,4088—19聚類61，29320，柳8411013聚類？1,1361,354636C)、03鄉(xiāng)410:13聚類g1，2260671,2715—165聚類9U971,23210,733146811聚類IO1,2350771,286286(,093148聚類ll，,261U021437不考慮〈8的患者組表8主動脈-IMA、縱隔脂肪和頸動脈損傷中三個所鑒別的聚類的聯(lián)合中的129個基因麥考序列基因符號基因名稱AWR2精氨酸加壓素受體2(腎原性尿崩癥)函—000148FUT1巖藻糖基轉移酶l(半乳糖苷2-a-L-巖藻糖基轉移酶，H血型)SCN4A鈉通i,4壓i'，控，:—in',a「函J)00355…一—TCN2鈷胺傳遞蛋白:11:巨紅細胞性貧血爾—000442，紀XSlT一血小板/內疋細胞lif分.f(C加l抗.l)Sm1)W4^)—tekrag氣S嚴錄，內發(fā)〖靜脈畸形，多發(fā).的^鍋變的5"NMJX)(〕552———'VWFvon沐i11ebi:and因子NM000609趁化因子('-X-(::基序)配體12(基質'細胞衍生因子l)NM__0()()681ADRA2A腎上腺素能，a-2A-,受體NM」)00717CA4碳酸8f酶IV畫一()():[()!(腿S〖J3含Src同源性2結構域E固—.001046SIX〖2A2溶質載體蛋白家族12(鈉/鉀/氯轉運蛋白)，成員2NM——001084原狡原-賴氨酸，2-飼戊二酸5-雙加氣酶3函—(X)12明ci;ic2氯細胞內通道2i:db2LIM結構域結合2NM—001312C:R1P2半胱氨酸富集蛋白2NM—001400內皮分化，涵旨5*^偶*受雨，1麗:.001552………'胰島素祥生長因子結合蛋白4N化l骨形態(tài)發(fā)生蛋白6NM....(脂95鈣黏著蛋白5,類型2,VE-4丐黏:著蛋白(血管上皮)NM——(')()酒2!3麗bp一…促腎上腺皮質素釋放激素結合蛋白55<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>NM—152400NMj52536SlSCn^7:2^一'N!vl……〖74函…NM—174938NMJ75060MM二175744NM'.181844NM—182487NM152400雨J52406G玩—"一'—CUPJ^Jl^t2SH2D3C假設蛋白Hj39370假設蛋白f復j36748copineII含sM結構域3cANKRD29;鍋蛋白重復結構域29^麗一鈉通道，電壓.門控，類型TV，(3.^函經(jīng).竭頁「—..........................................................ciHHSji^豕族14,成—頁AF.RMD3CLEC14ACtlSSP—8:GTP酶，腿AP家族.成員8RHOC;ras同'系H,H「成員C1:0(3383弱——"'S￥S1￥^:^￥￥S—';BCL.6BB!ffl威CLL/淋巴瘤6,IIB(鋅指蛋白)()LFML2A嗅介蛋白樣2AANKRD47|錨蛋白iH,及47tp激酶相互作用絲氨酸/蘇氨酸激酶2表9387個MI患者和對照受治療者的基本特征患者("=387)對照(《=387)P值年齡54(49—57)54(49-57:)男性(％)8282吸煙者(％)5025<().00("Cffl)的家族史(％)4221糖尿病(％)110<().()001高血壓(％)346<:(),()001高脂血癥(％:)70!6〈O,()細5Si(kgm—2)—26.8(24,7—29.7)25.6(23.8-27.8)<0.(扁SBP(mm'Hg)卜1—3(5(:m—i4(:y)T2S(1.18-〗40)tis:DRP(i腦Hg)80(75—88)80(78-88)ns葡萄li(m:m()li:尸)5.3(5.0-5.9)4.8(4,6-5.2)<(),000159<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>所表達的值是中數(shù)(四分位數(shù)間距)或百分比CHI),冠心??；服I，身體質量指數(shù)；SBP，收縮壓；S)BP,舒張壓；LDL，低密度脂蛋白；HDL，高密度脂蛋白CRP,C反應蛋白;IL-6,白介素6;PA卜l,纖維蛋白溶酶活化素抑制素〗表10根據(jù)性別和病例-對照狀態(tài)的一般特征和基因型頻率分配男性女性病例對照P值案倒對照難年齡(歲)i58,3(7.1〗85250(7.1)W5436162,0(6,7)507—身體不活動(4)14U)334313331<腿154.818941.2205<0細吸煙(％)從不(％)J20.516935.5369<().()()〗35.212251.3257<0細以前和現(xiàn)在(％)179,565664,566964.8225銀7244腰贅比例JO.鄰(0,06)8470,94(0,06)1044<0.00〗j0.86(0,09)36復0.84(0.09)503<0扁高血壓(％y44.838250.95370.008i49,6:17955.22幼0.10高膽閨醇血癥(％)b83.0705/8-2;S二o0細i89.132084.6427J0.05#*三§旨{:mmolL—]j1.8(1.7-l局8501尊3-1.4)1053<糊11-8(1.7-3591.2(1.2-13)505|<0.001胰島-f'(/力ttS—，)6028.8《8.5—9.2)754<0.0011.1(10.3-12.0)297414||<0.001纖維蛋白原(gL—sy3.6(3.54.6)7893,4(3.3—3.4)992<0篇3413.5(3.5-3.6)467||<:0.00iIL-6(ngL—",.6(1.4-1.8)556.f〗(().9-1,2)5卯<0.()011.5(1.3-1,8)2751.5(1.2—285IJ0.70,"1JM1…"200780042778.7勢溢1被56/56:a;權利要求1.一種鑒別化合物作為候選藥物的方法，其包括如下步驟a.使所述化合物與表達基因GYPC、AGPAT3、AGL、PVRL2、HMGB3、HSDL2的細胞接觸；并且b.分析所述化合物是否調節(jié)所述基因中至少一種的表達。2.如權利要求1所述的方法，其中步驟b包括對所述基因中至少兩種的表達調節(jié)的分析。3.如權利要求1或2所述的方法，其中步驟b進一步包括對選自由CD36和尸州/ot組成的組的基因的表達調節(jié)的分析。4.一種鑒別化合物作為候選藥物的方法，其包括a.使所述化合物與選自由GIT(:>y4GiM3、爿G丄、PJ/W/J>//MG沼、//S/)丄2組成的組的基因的基因產(chǎn)物接觸；并且b.分析所述化合物是否調節(jié)所述基因產(chǎn)物的生物活性。5.如權利要求4所述的方法，其中所述分析針對所述基因產(chǎn)物的生物活寸生的增力D。6.如權利要求4所述的方法，其中所述分析針對所述基因產(chǎn)物的生物活性的降低。7.如權利要求4-6中任一項所述的方法，其中所述生物活性是調節(jié)參與動脈粥樣硬化或動脈粥樣硬化相關疾病的發(fā)展或進展的基因的表達。8.如權利要求4-7中任一項所述的方法，其中所述生物活性是調節(jié)選自由GY尸C、JG/M73、爿G丄，PF7L入//A/GS丄//SD丄入CD禾口組成的組的基因。9.一種鑒別化合物作為候選藥物的方法，其包括如下步驟a.使所述化合物與表達基因丄Z)B2的細胞接觸；并且b.分析所述化合物是否調節(jié)/jDB2的表達。10.—種鑒別化合物作為候選藥物的方法，其包括如下步驟a.使所述化合物與基因丄D52的基因產(chǎn)物接觸；并且b.分析所述化合物是否調節(jié)/力62的生物活性。11.如權利要求IO所述的方法，其中所述生物活性是調節(jié)參與動脈粥樣硬化或動脈粥樣硬化相關疾病的發(fā)展或進展的基因的表達。12.如權利要求IO所述的方法，其中所述生物活性是白細胞的跨內皮遷移。13.如前述權利要求的任一項所述的方法，其包括a.獲得DNA分子，所述DNA分子包括選自由LDB2、GYPC、AGPAT3、AGL、PVRL2、HMGB3、HSDL2組成的組的基因的編碼序列，以及任選地，調節(jié)所述基因的表達的序列元件；b.將所述DNA分子引入宿主細胞，諸如非人胚胎的細胞系或細胞，以獲得所述DNA分子的細胞表達；c.使所述宿主細胞接觸所述化合物，并且d.分析所述化合物是否調節(jié)所述DNA分子的表達或所述基因產(chǎn)物的生物活性。14.如權利要求13所述的方法，其中所述分析步驟包括分析白細胞的跨內皮遷移。15.如前述權利要求的任一項所述的方法，其用于鑒別化合物作為用于治療選自由動脈粥樣硬化、動脈粥樣硬化相關疾病和炎癥疾病組成的組的疾病的候選藥物。16.如前述權利要求的任一項所述的方法，其中所述化合物選自由有機小分子、肽、多肽、蛋白質、抗體和其片段、諸如DNA或RNA的核酸，包括sJRNA和miRNA、諸如PNA的修飾的核酸，或為加強治療目的修飾的這類化合物組成的組。17.—種鑒別用于評估動脈粥樣硬化、動脈粥樣硬化相關疾病或炎癥疾病的誘因、發(fā)展和/或結果的遺傳標志物的方法，其包括a.檢測群體中的個體之間的選自由基因LDB2、GYPC、AGPAT3、AGL、PVRL2、HMGB3、HSDL2組成的組的基因的遺傳性變異，并且b.將所述遺傳性變異與所迷個體之間的動脈粥樣硬化和動脈粥樣硬化相關疾病的誘因、發(fā)展和/或結果的差異相互關聯(lián)。18.如權利要求16所述的方法，其中所述遺傳性變異是調節(jié)基因產(chǎn)物的表達的變異。19.如權利要求16所述的方法，其中所述遺傳性變異是調節(jié)基因產(chǎn)物的生物活性的變異。20.—種動物物種的遺傳修飾細胞，a.包含異源DNA分子，所述異源DNA分子包含選自由基因LDB2、G1TC、」OR473、y4G丄、Pn入//A1G5丄//S/兒2組成的組的基因的編碼序列，和/或b.具有選自由滅活的基因/,/hgi7y7>y4GMr3、爿G丄、/)ra7」入T7A/r^3>//S/X2組成的組的基因。21.如權利要求20所述的遺傳修飾細胞，其中所述DNA分子編碼LIM結構域結合蛋白2和/或選自所述組的基因是丄/:)y^。22.如權利要求20或2]所述的遺傳修飾細胞，其中所述動物物種是哺I'L動物。23.如權利要求20-22中任一項所述的遺傳修飾細胞，其中所述動物物種選自由人、非人靈長類和嚙齒類組成的組。24.—種遺傳修飾的非人動物，其包含根據(jù)權利要求20-23中任一項所述的細胞。25.述疾病的風險的患者的方法，其包括向所述患者施用選自由基因/x)s2.g廳c、爿or4;n、爿gl、pkwzj、^wgs3、//見2組成的組的基因的原型或修飾變體或用根據(jù)權利要求1-12中任一項所述的方法鑒別的化合物。26.如權利要求25所述的方法，其中所施用的基因是編碼LIM結構域結合2的基因。27.如權利要求25所迷的方法，其中所述化合物是siRNA。28.—種治療患有動脈粥樣硬化或動脈粥樣硬化相關疾病或有發(fā)展所述疾病的風險的患者的方法，其包括向所述患者施用選自由siRNA分子組成的組的化合物，所述siRNA分子靶向選自由、G1TC、爿GiM73、v4G丄，尸KM入//A^Gi^、//SDU組成的組的基因。29.硬化相關疾病的風險的方法，其包括分析所述受治療者的/"fi2基因，并且其中所述/力W基因中單核苷酸多態(tài)rs10939673的T次要等位基因的存在表明低于平均的風險。全文摘要本發(fā)明涉及鑒別化合物作為候選藥物的方法，所述方法包括步驟a.使所述化合物與表達基因CYPC、AGPAT3、AGL、PVRL2、HMGB3、HSDL2的細胞接觸；并且b.分析所述化合物是否調節(jié)所述基因中至少一種的表達。本發(fā)明還涉及鑒別化合物作為候選藥物的方法，所述方法包括步驟a.使所述化合物與表達基因LDB2的細胞接觸；并且b.分析所述化合物是否調節(jié)LDB2的表達。本發(fā)明進一步涉及用于此類方法的遺傳修飾細胞和動物，并且涉及用于治療動脈粥樣硬化、動脈粥樣硬化相關疾病或炎癥疾病的方法，所述方法包括使用此類鑒別的化合物。文檔編號C12N5/10GK101589309SQ200780042778公開日2009年11月25日申請日期2007年11月19日優(yōu)先權日2006年11月17日發(fā)明者喬漢·布喬克格倫,杰斯佩·泰格奈爾申請人:臨床基因網(wǎng)絡公司