專利名稱：：源自假單胞菌6-19的pha合酶的突變體和使用該突變體制備乳酸酯均聚物或共聚物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及源自假單胞菌6-19(i^Wo,"wsp.6-19)的聚羥基鏈烷酸酯合酶突變體，其中，該突變體可以使用乳酰輔酶A(lactyl-CoA)作為底物來生產(chǎn)乳酸酯聚合物和/或乳酸酯共聚物。本發(fā)明還涉及一種制備乳酸酯聚合物和/或乳酸酯共聚物的方法，其中，該方法使用所述聚羥基鏈垸酸酯合酶突變體。
背景技術(shù)：
：聚乳酸酯(PLA)是一種源自乳酸酯的常見生物可降解聚合物，其作為一種普通或者醫(yī)用聚合物具有多種應(yīng)用。目前，PLA通過聚合由微生物發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸酯而制備，但是通過乳酸酯的直接聚合只能產(chǎn)生低分子量PLA(1000-5000道爾頓)。為了合成高分子量(>100,000道爾頓)的PLA，可以使用通過鏈偶聯(lián)劑聚合由乳酸酯的直接聚合得到的低分子量PLA的方法。然而，其具有如下缺點(diǎn)如由于加入溶劑或者鏈偶聯(lián)劑而使高分子量PLA的制備方法復(fù)雜，且還不容易除去該溶劑或者鏈偶聯(lián)劑。目前，在制備高分子量的商業(yè)上可用的PLA的方法中，正使用一種其中將乳酸酯轉(zhuǎn)化成交酯以通過交酯環(huán)的環(huán)化脫水作用合成PLA的方法。PLA均聚物可以由使用乳酸酯的化學(xué)合成方法容易地獲得，但是難于制備具有多種單體單元的乳酸酯共聚物，并且其商業(yè)可用性非常低。同時(shí)，聚羥基鏈垸酸酯(PHA)是一種在例如磷、氮、鎂、氧的其它營養(yǎng)元素缺乏而碳源過量時(shí)在微生物中積累作為碳和能量儲(chǔ)存化合物的聚酯。由于PHA與源于石油的合成聚合物具有相似的性質(zhì)，并且同時(shí)呈現(xiàn)出優(yōu)異的生物降解性質(zhì)，所以其被認(rèn)為是合成塑料的替代性材料。為了在微生物中產(chǎn)生PHA，需要將微生物代謝物轉(zhuǎn)化成PHA單體的酶和使用PHA單體合成PHA聚合物的PHA合酶。當(dāng)使用微生物生產(chǎn)PLA和乳酸酯共聚物時(shí)，需要相同的體系，并且除了提供羥酰輔酶A(PHA合酶的原始底物)以外，還需要能夠提供乳酰輔酶A的酶。因此，本發(fā)明發(fā)明人開發(fā)了一種使用源自丙酸梭菌(C/o^W畫prap/om'cww)的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶來提供乳酰輔酶A的體系，并且成功地制備了PLA和乳酸酯共聚物(韓國專利申請公開第10-2006-0121555號)。但是，其對于在2-位羥基化的羥基鏈垸酸酯具有較小的PHA合酶活性。在體外檢測的對乳酰輔酶A的PHA合酶活性已經(jīng)有報(bào)道，但是對乳酰輔酶A的PHA合酶活性據(jù)報(bào)道如上述一樣非常低(Zhang等人，M/cra^o/.，56:131，2001;Valentin禾口Steinbuchel，jp//.M/cra6/o/.5/Wec/2"o/.，40:699，1994;gYuan等人，^rc/z所oc/zem&.op/z;^.，394:87，2001)。因此，如果PHA合酶不能夠有效地利用乳酰輔酶A且使用PHA合酶來生產(chǎn)PLA和乳酸酯共聚物，則合成的效率必定低。也即是說，因?yàn)槿樗狨?在2-碳位羥基化的羥基鏈烷酸酯)不是PHA合酶的適合底物，所以能夠有效使用乳酰輔酶A的PHA合酶對于有效地合成PLA和乳酸共聚物是非常重要的
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供能夠有效使用乳酰輔酶A作為底物的PHA合酶。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備PLA和乳酸酯共聚物的方法，其中，所述方法使用含有能夠使用乳酰輔酶A作為底物的PHA合酶基因和丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因的細(xì)胞或者植物。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)所述目的，本發(fā)明提供一種聚羥基鏈垸酸酯合酶突變體，該突變體使用乳酰輔酶A作為底物生產(chǎn)乳酸酯聚合物或者乳酸酯共聚物并且具有SEQ.IDNo:10的氨基酸序列，其中，在SEQ.IDNo:10的氨基酸序列的第481位的谷氨酰胺發(fā)生突變。優(yōu)選地，本發(fā)明提供聚羥基鏈烷酸酯合酶突變體，其中，選自在第130位的谷氨酸、在第325位的絲氨酸和在第477位的絲氨酸中的至少一個(gè)氨基酸進(jìn)一步發(fā)生突變。更優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種聚羥基鏈垸酸酯合酶突變體，該突變體使用乳酰輔酶A作為底物生產(chǎn)乳酸酯聚合物或者乳酸酯共聚物并且具有SEQ.IDNo:IO的氨基酸序列，其中，所述氨基酸序列具有如下任何一種突變a)S325T和Q481M;b)E130D和Q481K;c)S325T和Q481K;d)E130D和Q481M;e)E130D和Q481R;f)E130D、S325T和Q481M;g)E130D、S325T和Q481K;h)E130D、S477R和Q481K;i)E130D、S477R和Q481M;j)E130D、S477R和Q481R;k)E130D、S477H和Q481K;1)E130D、S477H和Q481M;m)E130D、S477H和Q481R;n)E130D、S477F禾卩Q481K;o)E130D、S477F和Q481M;p)E130D、S477F和Q481R;q)E130D、S477Y和Q481K;r)E130D、S477Y和Q481M;s)E130D、S477Y和Q481R;t)E130D、S325T、S477R和Q481M;u)E130D、S325T、S477R和Q481K;v)E130D、S325T、S477F和Q481M;w)E130D、S325T、S477G和Q481M;或x)E130D、S325T、S477F和Q481K。本發(fā)明發(fā)明人證實(shí)假單胞菌6-19的聚羥基鏈烷酸酯合酶的一些突變體可以使用乳酰輔酶A作為底物并且非常有效地生產(chǎn)乳酸酯聚合物和/或共聚物，由此完成了本發(fā)明。本發(fā)明還提供編碼所述聚羥基鏈垸酸酯合酶突變體的基因。本發(fā)明又提供包含用于合成乳酸酯聚合物或共聚物的基因的重組載體。更優(yōu)選地，本發(fā)明提供重組載體，其進(jìn)一步包含編碼丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(p")的基因。本發(fā)明還提供用上述重組載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或者植物。本發(fā)明又提供由使用上述重組載體轉(zhuǎn)化而獲得的細(xì)胞或者植物，其中，原始細(xì)胞或者植物沒有編碼丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的基因。本發(fā)明還提供一種制備乳酸酯聚合物或共聚物的方法，其中，該方法包括培養(yǎng)所述細(xì)胞或者植物。更優(yōu)選地，本發(fā)明提供所述方法，其中，所述培養(yǎng)是在含有3-羥基丁酸酯(3-HB)的培養(yǎng)基中進(jìn)行的并且所制備的共聚物為含有3-羥基丁酸酯單體單元和乳酸酯單體單元的共聚物。在這里使用的術(shù)語"共聚物"意圖包括由兩種不同單體構(gòu)成的二元共聚物、由三種不同單體構(gòu)成的三元共聚物或者由四種不同單體構(gòu)成的四元共聚物。在本發(fā)明中，所述羥基鏈垸酸酯為選自下列化合物中的至少一種3-羥基丁酸酯、3-羥基戊酸酯、4-羥基丁酸酯、中鏈長(C6~14)的(D)-3-羥基羧酸、3-羥基丙酸、3-羥基己酸、3-羥基庚酸、3-羥基辛酸、3-羥基壬酸、3-羥基癸酸、3-羥基十一烷酸、3-羥基十二烷酸、3-羥基十四烷酸、3-羥基十六垸酸、4-羥基戊酸、4-羥基己酸、4-羥基庚酸、4-羥基辛酸、4-羥基癸酸、5-羥基戊酸、5-羥基己酸、6-羥基十二烷酸、3-羥基-4-戊烯酸、3-羥基-4-反-己烯酸、3-羥基-4-順-己烯酸、3-羥基-5-己烯酸、3-羥基-6-反-辛烯酸、3-羥基-6-順-辛烯酸、3-羥基-7-辛烯酸、3-羥基-8-壬烯酸、3-羥基-9-癸烯酸、3-羥基-5-順-十二碳烯酸、3-羥基-6-順-十二碳烯酸、3-羥基-5-順-十四碳烯酸、3-羥基-7-順-十四碳烯酸、3-羥基-5，8-順-順-十四碳烯酸、3-羥基-4-甲基戊酸、3-羥基-4-甲基己酸、3-羥基-5-甲基己酸、3-羥基-6-甲基庚酸、3-羥基-4-甲基辛酸、3-羥基-5-甲基辛酸、3-羥基-6-甲基辛酸、3-羥基-7-甲基辛酸、3-羥基-6-甲基壬酸、3-羥基-7-甲基壬酸、3-羥基-8-甲基壬酸、3-羥基-7-甲基癸酸、3-羥基-9-甲基癸酸、3-羥基-7-甲基-6-辛烯酸、蘋果酸、3-羥基琥珀酸甲酯、3-羥基己二酸甲酯、3-羥基辛二酸甲酯、3-羥基壬二酸甲酯、3-羥基癸二酸甲酯、3-羥基辛二酸乙酯、3-羥基癸二酸乙酯、3-羥基庚二酸丙酯、3-羥基癸二酸芐酯、3-羥基-8-乙酰氧基辛酸、3-羥基-9-乙酰氧基壬酸、苯氧基-3-羥基丁酸、苯氧基-3-羥基戊酸、苯氧基-3-羥基庚酸、苯氧基-3-羥基辛酸、對氰基苯氧基-3-羥基丁酸、對氰基苯氧基-3-羥基戊酸、對氰基苯氧基-3-羥基己酸、對硝基苯氧基-3-羥基己酸、3-羥基-5-苯基戊酸、3-羥基-5-環(huán)己基丁酸、3，12-二羥基十二烷酸、3，8-二羥基-5-順-十四碳烯酸、3-羥基-4,5-環(huán)氧癸酸、3-羥基-6,7-環(huán)氧十二烷酸、3-羥基-8，9-環(huán)氧-5，6-順-十四烷酸、7-氰基-3-羥基庚酸、9-氰基-3-羥基壬酸、3-羥基-7-氟庚酸、3-羥基-9-氟壬酸、3-羥基-6-氯己酸、3-羥基-8-氯辛酸、3-羥基-6-溴己酸、3-羥基-8-溴辛酸、3-羥基-ll-溴十一烷酸、3-羥基-2-丁烯酸、6-羥基-3-十二碳烯酸、3-羥基-2-甲基丁酸、3-羥基-2-甲基戊酸和3-羥基-2,6-二甲基-5-庚烯酸。本發(fā)明還提供一種制備乳酸酯聚合物或乳酸酯共聚物的方法，其中，該方法包括培養(yǎng)所述細(xì)胞或者植物。在這里使用的術(shù)語"載體"指的是一種DNA構(gòu)造，其包含DNA序列，該DNA序列可操作地連接至在適合的宿主內(nèi)能夠表達(dá)該DNA的適合控制序列。在本發(fā)明中，載體可以為質(zhì)粒、噬菌體或者簡單的基因組插入。當(dāng)用其轉(zhuǎn)化適合的宿主時(shí)，載體可以不顧宿主基因組自我復(fù)制并運(yùn)行，或者在某些情況下，載體并入宿主基因組。因?yàn)槟壳白畛Ｊ褂觅|(zhì)粒作為載體，所以在這里可替換地使用質(zhì)粒代替載體。但是，根據(jù)本發(fā)明的載體包括具有相同功能的不同類型載體，其已經(jīng)或者將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。術(shù)語"表達(dá)控制序列"指的是用于在特定宿主中表達(dá)可操作連接的編碼序列所必需的DNA序列。這種控制序列包含用于進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子；用于控制轉(zhuǎn)錄的任意操縱基因序列；編碼適合mRNA核糖體的結(jié)合位點(diǎn)的序列；和用于控制轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯的終止的序列。例如，適合于原核生物的控制序列包含啟動(dòng)子、任意操縱基因序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。對于真核生物，包含啟動(dòng)子、多聚腺苷酸信號和增強(qiáng)子。在質(zhì)粒中，啟動(dòng)子是對基因的表達(dá)量影響最嚴(yán)重的一個(gè)因素。優(yōu)選，使用SRa啟動(dòng)子、源于巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子等作為高度表達(dá)的啟動(dòng)子。在各種表達(dá)控制序列中的任何一種都可以用在載體中表達(dá)本發(fā)明的DNA序列。例如，有用的表達(dá)控制序列的實(shí)例包括SV40或者腺病毒的早期或者后期啟動(dòng)子、lac體系、trp體系、TAC或TRC體系、T3和T7啟動(dòng)子、噬菌體X的主要操縱基因和啟動(dòng)子區(qū)域、fd編碼蛋白的控制區(qū)域、用于3-磷酸甘油酸酯激酶或者其它糖酵解酶的啟動(dòng)子、例如Pho5的磷酸酶的啟動(dòng)子、酵母a交配系統(tǒng)的啟動(dòng)子和巳知控制真核生物、原核生物或其病毒的基因表達(dá)的結(jié)構(gòu)序列，和它們的各種組合。當(dāng)將核酸置入與其它核酸序列的功能關(guān)系中時(shí)，其被"可操作地連接"。這可能意味著基因和控制序列連接的方式，因?yàn)楫?dāng)適合的分子(例如轉(zhuǎn)錄激活蛋白)與控制序列結(jié)合時(shí)，基因的表達(dá)是可能的。例如，當(dāng)前肽序列或分泌前導(dǎo)的DNA表達(dá)為參與多肽的分泌的前蛋白時(shí)，其可操作地連接至該多肽的DNA;當(dāng)啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄時(shí)，其可操作地連接至該編碼序列；或者當(dāng)設(shè)置核糖體結(jié)合位點(diǎn)以便有利于翻譯時(shí)，其可操作地連接至編碼序列?？傮w而言，"可操作地連接"指的是被連接的DNA序列為毗鄰的，而且在分泌前導(dǎo)的情況下，是毗鄰的且在閱讀相(readingphase)內(nèi)。但是，增強(qiáng)子不必為毗鄰的。連接是通過在方便的限制位點(diǎn)的連接實(shí)現(xiàn)的。如果不存在這些位點(diǎn)，則根據(jù)常規(guī)實(shí)踐使用合成的寡核苷酸接頭或者連接體。這里使用的術(shù)語"表達(dá)載體"一般指的是作為重組載體的雙鏈DNA片段，其中插入了典型的異源DNA片段。所述異源DNA指的是不是在宿主細(xì)胞中天然產(chǎn)生的異型DNA。一旦將該表達(dá)載體引入到宿主細(xì)胞中，其可以不顧宿主染色體DNA進(jìn)行復(fù)制產(chǎn)生幾個(gè)拷貝和插入它們中的異源DNA。如相關(guān)領(lǐng)域中的技術(shù)人員所已知的，為了增加轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中的基因的表達(dá)水平，相應(yīng)的基因應(yīng)當(dāng)可操作地連接至用于控制轉(zhuǎn)錄和解碼表達(dá)的序列，其在選擇的表達(dá)宿主中起作用。優(yōu)選地，將表達(dá)控制序列和相應(yīng)的基因包含在一個(gè)表達(dá)載體中，所述載體同時(shí)包含病毒選擇標(biāo)記和復(fù)制起點(diǎn)。如果表達(dá)宿主是真核生物，則表達(dá)載體應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步包含在真核生物表達(dá)宿主中有用的表達(dá)標(biāo)記。在本發(fā)明中，例如質(zhì)粒載體、噬菌體載體、粘粒載體或者YAC(酵母人工染色體)載體的各種載體都可以用作上述載體。對于本發(fā)明來說，優(yōu)選使用質(zhì)粒載體。可用于這些目的的典型質(zhì)粒載體具有(a)復(fù)制起點(diǎn)，以便其導(dǎo)致有效的復(fù)制使得各個(gè)宿主細(xì)胞包含幾百個(gè)拷貝的質(zhì)粒載體；(b)抗生素抗性基因，以使得可以選擇用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；和(c)序列，含有將要插入外源DNA片段的限制酶位點(diǎn)。即使在沒有適合的限制酶位點(diǎn)的情況下，根據(jù)常規(guī)方法通過使用合成的寡核苷酸接頭或者連接體也可以容易地連接載體或者外源DNA。本發(fā)明的重組載體可以根據(jù)本領(lǐng)域中的已知方法轉(zhuǎn)化到適合的宿主細(xì)胞中。在本發(fā)明中優(yōu)選的宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞，更優(yōu)選的是大腸桿菌。優(yōu)選的大腸桿菌菌株包括大腸桿菌DH5a、大腸桿菌JM101、大腸桿菌K12、大腸桿菌W3110、大腸桿菌X1776、大腸桿菌XL1-Blue(Stratagene)和大腸桿菌B。但是，也可以使用例如FMBIOI、NM522、NM538和NM539的其它大腸桿菌菌株和其它原核細(xì)胞種屬。除了上述大腸桿菌以外，在這里還可以使用例如農(nóng)桿菌A4的農(nóng)桿菌屬、例如枯草桿菌的桿菌屬、例如鼠傷寒沙門氏菌或粘質(zhì)沙雷菌的各種腸細(xì)菌和各種假單胞菌屬作為宿主細(xì)胞，但是本發(fā)明的范圍并不限于上述實(shí)例。另夕卜，原核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可以根據(jù)描述在Sambrook等人(supra)的章節(jié)1.82中的氯化鈣法容易地進(jìn)行?；蛘?，也可以使用電穿孔法(Neumann等人，EMBOJ.，1:841(1982))來轉(zhuǎn)化這些類型的細(xì)胞。制備含有轉(zhuǎn)移酶基因和合酶基因的植物的植物的轉(zhuǎn)化可以通過使用農(nóng)桿菌或者病毒載體的常規(guī)方法實(shí)現(xiàn)。例如，通過用含有本發(fā)明的基因的重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌并且用轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌感染目標(biāo)植物的組織等而獲得轉(zhuǎn)化的植物。更具體而言，可以通過如下步驟制備轉(zhuǎn)化的植物(a)預(yù)培養(yǎng)目的植物的外植體，然后通過共培養(yǎng)該外植體和轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌來轉(zhuǎn)化該外植體；(b)培養(yǎng)所述感染的外植體以誘導(dǎo)愈傷組織；以及(c)切下所得到的愈傷組織，并且將其在生芽培養(yǎng)基(shoot-inducingmedium)中培養(yǎng)。這里使用的術(shù)語"外植體"指的是從植物上切下的組織片段，并且包括子葉或者下胚軸。子葉或者下胚軸可以用作本發(fā)明的外植體。更優(yōu)選使用通過消毒并清洗植物的種子而在MS培養(yǎng)基中使其發(fā)芽而得到的子葉?？梢杂糜诒景l(fā)明的轉(zhuǎn)化的植物包括，但不限于，煙草、番茄、辣椒、豆、米和玉米。此外，即使轉(zhuǎn)化的植物為有性繁殖的，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，也可以通過使用植物組織培養(yǎng)等無性繁殖這種植物。圖1是顯示包含源自假單胞菌6-19的聚羥基鏈烷酸酯合酶基因的重組表達(dá)載體的制備方法的圖。圖2是在能夠合成PHB的條件下，在培養(yǎng)用含有phaClp".w合酶和SCL突變體(phaClPs6-1920(^[]phaClPs6-19300)的重組載體(pPs619Cl-ReAB、pPs619C1200-ReAB和pPs619C1300-ReAB)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌之后的FACS(熒光激活細(xì)胞分選)結(jié)果。圖3是同時(shí)表達(dá)PHA合酶和CP-PCT的組成型表達(dá)載體的簡圖。圖4是顯示包含源自假單胞菌6-19的PHA合酶基因、SCL突變體基因和CP-PCT基因的重組表達(dá)載體的制備方法的圖。具體實(shí)施例方式以下將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。下面提供的實(shí)施例以說明的方式來幫助本領(lǐng)域中的技術(shù)人員理解本發(fā)明，但是并非意圖限制本發(fā)明的范圍。特別地，雖然在下面的實(shí)施例中公開了當(dāng)用PHA合酶突變體制備乳酸酯共聚物時(shí)通過加入3-羥基丁酸酯(3-HB)獲得的聚G-羥基丁酸酯-共-乳酸酯)(P(3HB-共-LA))的合成，但是對于本發(fā)明
技術(shù)領(lǐng)域：
中的技術(shù)人員來說，顯而易見的是，通過加入非3-HB的其它羥基鏈烷酸酯可以制備含有不同羥基鏈烷酸酯和乳酸酯的多種共聚物?！磳?shí)施例1〉源自假單胞菌6-19的PHA合酶基因的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建為了分離源自假單胞菌6-19(KCTC11027BP)的PHA合酶(phaClp^,9)基因，提取假單胞菌6-19的全部DNA，并根據(jù)phaClp^9基因的序列制備SEQIDNO:1禾卩2的弓l物(Ae-jinSong，Master'sThesis,DepartmentofChemicalandBiomolecularEngineering,KAIST，2004)以及進(jìn)行PCR來得到phaClps6—,9的基因。SEQIDNO:1:5-GAGAGACAATCAAATCATGAGTAACAAGAGTAACG-3SEQIDNO:2:5-CACTCATGCAAGCGTCACCGTTCGTGCACGTAC-3作為用瓊脂凝膠電泳檢測PCR反應(yīng)產(chǎn)物的結(jié)果，觀察到對應(yīng)于phaClp^9基因的1.7Kbp的基因片段。為了表達(dá)phaClp^,9合酶，構(gòu)建了表達(dá)供應(yīng)單體的酶和合酶的組成型表達(dá)系統(tǒng)的操縱子(圖1)。含有源自富養(yǎng)羅爾斯通氏菌(/a/Wom'ae^ra//w)H16的PHB-合成操縱子的DNA片段用BamHI/EcoRI從pSYL105載體中切除出來(Lee等人，Biotech.Bioeng.，1994,44:1337-1347)，并被插入至lJpBluescriptIKStratagene)的BamHI/EcoRI-識別位點(diǎn)來構(gòu)建pReCAB重組載體。已知pReCAB載體通過PHB操縱子啟動(dòng)子組成型表達(dá)PHA合酶(phaCRE)和供應(yīng)單體的酶(phaA旺和phaBRE)，并且也己知在大腸桿菌中很好地工作(Lee等人，所o&c/7.S/oe"g.，1994，44:1337-1347)。pReCAB載體用BstBI/Sbfl切開以刪除富養(yǎng)羅爾斯通氏菌H16PHA合酶(phaCRE)，然后將上述phaClps6-,9基因插入到BstBI/Sbfl位點(diǎn)以制備pPs619C1-ReAB重組載體(圖1)。在沒有氨基酸突變的情況下用SDM(定點(diǎn)誘變)方法去除包含在內(nèi)部的BstBI位點(diǎn)來制備在兩端具有兩個(gè)BstBI/Sbfl位點(diǎn)的phaClPs6.19合酶基因片段，并用SEQIDNO:3和4、SEQIDNO:5和6以及SEQIDNO:7和8的引物進(jìn)行重疊PCR來加入BstBI/Sbfl-識別位點(diǎn)SEQIDNO:3:5-atgcccggagccggttegaa-3SEQIDNO:4:5-CGTTACTCTTGTTACTCATGATTTGATTGTCTCTC-3SEQIDNO:5:5-GAGAGACAATCAAATCATGAGTAACAAGAGTAACG-3SEQIDNO:6:5-CACTCATGCAAGCGTCACCGTTCGTGCACGTAC-3SEQIDNO:7:5-GTACGTGCACGAACGGTGACGCTTGCATGAGTG-3SEQIDNO:8:5-aacgggagggaacctgcagg-3通過測序驗(yàn)證pPs619Cl-ReAB重組載體的phaClp^9基因序列，并將結(jié)果顯示在SEQIDNO:9中，使用其編碼的氨基酸序列顯示在SEQIDNO:10中。這些序列的相似性測試表明該基因與源自假單胞菌屬菌株61-3的phaCl(Matsusaki等人，^cfen'o/.，180:6459，1998)具有84.3%的核苷酸序列同一性和88.9%的氨基酸序列同一性，由此證實(shí)這兩種合酶是非常相似的。由這些結(jié)果證實(shí)，在本發(fā)明中得到的phaClp^,9合酶是II型PHA合酶。為了證實(shí)phaClp^9合酶是否合成了PHB，用pPs619Cl-ReAB重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-lBlue(Stratagene)，并將其在PHB檢測培養(yǎng)基(LB瓊脂，葡萄糖20g/L，尼羅紅0.5ug/ml)中進(jìn)行培養(yǎng)。該檢測的結(jié)果是，沒有觀察到PHB的合成。<實(shí)施例2>源自假單胞菌6-19的PHA合酶的底物-特異性突變體的制備在各種類型的PHA合酶中，已知II型PHA合酶為MCL-PHA(中鏈長PHA)合酶，能夠聚合具有相對較長碳鏈的底物。預(yù)期這種MCL合酶可以用于制備乳酸酯聚合物。即使源自假單胞菌61-3的phaCl合酶(其與本發(fā)明的phaClp^9合酶具有高度同一性)是II型合酶，但是據(jù)報(bào)道phaCl合酶具有相對較寬范圍的底物特異性(Matsusaki等人，《/^^enW.，180:6459，1998)，并且己經(jīng)報(bào)道了對其適于制備SCL-PHA(短鏈長PHA)的突變體的研究(Takase等人，所owGcromo/ecw/w，5:480，2004)?；谶@些結(jié)果，通過序列對比分析發(fā)現(xiàn)了影響SCL活性的氨基酸的三個(gè)位置，并通過SDM方法使用SEQIDNO:1114的引物制備了在下面表1中所示的phaClps6.,9合酶突變體。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>:5-CTGACCTTGCTGGTGACCGTGCTTGATACCACC-3SEQIDNO:12:5-GGTGGTATCAAGCACGGTCACCAGCAAGGTCAG-3SEQIDNO:13:5-CGAGCAGCGGGCATATCATGAGCATCCTGAACCCGC-3SEQIDNO:14:5-GCGGGTTCAGGATGCTCATGATATGCCCGCTGCTCG-3SEQIDNO:15:5-ateaacetcatgaccgatgcgatggcgccgacc-3SEQIDNO:16:5-ggteggcgccatcgcateggtcatgaggttgat-3用這些重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-lBlue，并將其在PHB檢測培養(yǎng)基(LB瓊脂，葡萄糖20g/L，尼羅紅0.5ug/ml)中進(jìn)行培養(yǎng)。在用pPs619C1200-ReAB轉(zhuǎn)化的大腸桿菌XL-lBlue和用pPs619C1300-ReAB轉(zhuǎn)化的大腸桿菌XL-lBlue中都觀察到了PHB的合成。也即是說，用phaARE和phaBRE的供應(yīng)單體的酶從葡萄糖制備了3HB-輔酶A，并通過phaClPs6.19合酶SCL突變體(phaClPs6-1920(^nphaClPs6.19300)使用3HB-輔酶A作為底物來制備PHB。為了進(jìn)行定量分析，在含有葡萄糖(20g/L)的LB培養(yǎng)基中在37。C培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的重組大腸桿菌XL1-Blue4天。將培養(yǎng)后的重組大腸桿菌進(jìn)行蔗糖休克(sucroseshock)并用尼羅紅染色，將其用FACS(熒光激活細(xì)胞分選)法進(jìn)行分析(圖2)。用包含野生型合酶的pPs619Cl-ReAB載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌XL1-Blue沒有被尼羅紅染色，而用pPs619C1200-ReAB或pPs619C1300-ReAB轉(zhuǎn)化的大腸桿菌XL1-Blue因?yàn)樵诩?xì)胞中被尼羅紅染色的PHB而顯示出高熒光性。此外，通過收集培養(yǎng)的微生物經(jīng)由離心，將其在80。C的干燥器中干燥48小時(shí)，然后進(jìn)行氣相色譜分析來評價(jià)在細(xì)胞中制備的PHB的含量。在用pPs619C1200-ReAB和pPs619C1300-ReAB轉(zhuǎn)化的大腸桿菌XL1-Blue中的PHB的含量分別為29.7%(w/w)禾n43.1%(w/w)，而在pPs619Cl-ReAB的情況下沒有檢測到PHB。<實(shí)施例3>能夠表達(dá)源自假單胞菌6-19的PHA合酶和丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的重組大腸桿菌的構(gòu)建，以及使用其制備PLA或乳酸酯共聚物在這個(gè)實(shí)施例中，使用源自丙酸梭菌(CP-PCT)的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶用來供應(yīng)乳酰輔酶A，一種合成PLA和乳酸酯共聚物所需的單體。如圖3所示構(gòu)建同時(shí)表達(dá)PHA合酶和CP-PCT的組成型表達(dá)體系的操縱子。CP-PCT對微生物具有毒性是眾所周知的。也就是說，在由IPTG誘導(dǎo)的tac啟動(dòng)子或者T7啟動(dòng)子表達(dá)體系(該體系廣泛用于重組蛋白的表達(dá))中，在加入誘導(dǎo)物之后，所有微生物都很快死亡。因此，認(rèn)為使用其中較弱表達(dá)但是根據(jù)微生物的生長連續(xù)表達(dá)的表達(dá)體系是適當(dāng)?shù)?。將通過用丙酸梭菌的染色體DNA和SEQIDNO:17和18的引物進(jìn)行的PCR得到的片段用作cp-pct，并且為了容易克隆而通過SDM方法去除野生型CP-CPT的7V血I位點(diǎn)(圖4)。SEQIDNO:17:5-ggaattcATGAGAAAGGTTCCCATTATTACCGCAGATGASEQIDNO:18:5-gctctagattaggacttcatttccttcagacccattaagccttctg另外，使用SEQIDNO:19和20的引物進(jìn)行重疊PCR來添加識別位點(diǎn)。SEQIDNO:19:5-aggcctgcaggcggataacaatttcacacagg-3SEQIDNO:20:5-gcccatatgtctagattaggacttcatttcc-3用幼/I/MM切開含有phaClps6—,9合酶SCL突變體(phaClps6.,9300)的pPs619C1300-ReAB載體來去除源自富養(yǎng)羅爾斯通氏菌H16的供應(yīng)單體的酶(phaARE和phaBRE)，然后將該P(yáng)CT-克隆的cp-pct基因插入到幼yi/A^el位點(diǎn)來制備pPs619C1300-CPPCT重組載體(圖4)。另外，使用上述相同方法制備含有其它phaClPs6.l9合酶SCL突變體(phaClpsW9200)的pPs619C1200-CPPCT重組載體和含有野生型phaClPs6.19合酶的pPs619Cl-CPPCT重組載體。為了證實(shí)是否cp-pct通過供應(yīng)單體制備了聚合物，用pPs619C1200-CPPCT和pPs619C1300-CPPCT重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-lBlue，并將其在PHB檢測培養(yǎng)基(LB瓊脂，葡萄糖20g/L，3HB2g/L，尼羅紅0.5txg/ml)中進(jìn)行培養(yǎng)。該檢測的結(jié)果是，在兩者中都沒有觀察到PHB的合成。使用pPs619C1300-CPPCT重組載體，在多種條件下進(jìn)行玻瓶培養(yǎng)來制備PLA和乳酸酯共聚物。結(jié)果示于下面的表2中。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>通過用MR培養(yǎng)基代替培養(yǎng)基然后進(jìn)行厭氧培養(yǎng)進(jìn)行所述2步驟培養(yǎng)來在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生乳酸酯。作為在多種條件下培養(yǎng)重組大腸桿菌的結(jié)果，基于干燥細(xì)胞的重量，所制備的PLA均聚物約為1%，且通過添加3HB作為底物制備的乳酸酯共聚物約為6%。在根據(jù)本發(fā)明的補(bǔ)料分批培養(yǎng)中使用的MR培養(yǎng)基的組成示于下面的表3中。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>微量組分(/L):FeS04H20，10g;ZnS04H20，2.25g;CuS04'H20，lg;MnS04H20，0.5g;CaCl2.H20，2g;Na2B407.H20，0.23g;(NH4)6Mo7024，O.lg;35%HC1，10mL。<實(shí)施例4>通過重組大腸桿菌的補(bǔ)料分批培養(yǎng)制備P(3HB-共-LA)共聚物將重組大腸桿菌(用pPs619C1300-CPPCT載體轉(zhuǎn)化了的)在3mL含有20g/L的葡萄糖、100mg/L的氨芐西林等的LB培養(yǎng)基中，以200rpm的攪拌速度在37t:培養(yǎng)12小時(shí)。將該培養(yǎng)物接種至100mL的相同培養(yǎng)基中并在相同條件下培養(yǎng)6小時(shí)。使用最終培養(yǎng)基作為補(bǔ)料分批培養(yǎng)的種子培養(yǎng)物。使用MR培養(yǎng)基作為補(bǔ)料分批培養(yǎng)的起始培養(yǎng)基。通過將100mL的種子培養(yǎng)物接種到2.4L的MR培養(yǎng)基中開始進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)。培養(yǎng)基的溫度為37°C，且用14。/。的氨水溶液將pH調(diào)節(jié)至6，8-6.9，以及通過控制空氣供應(yīng)和攪拌速度將溶解氧保持為大于飽和空氣的20%。此時(shí)，供應(yīng)空氣的速度是lwm。當(dāng)在起始培養(yǎng)基中含有的葡萄糖耗盡時(shí)，加入20g的葡萄糖和5g的3-羥基丁酸酯(3-HB)，并同時(shí)將攪拌速度調(diào)節(jié)至200rpm并且將空氣供應(yīng)速度降低至0.1wm以將需氧條件改變?yōu)閰捬鯒l件。對于整個(gè)培養(yǎng)，供應(yīng)葡萄糖5次。在這5次中，在第一次和第三次同時(shí)供應(yīng)5g的3HB。在終止培養(yǎng)后，通過離心收集細(xì)胞并冷凍干燥。為了精制所制備的聚合物，使用氯仿通過索氏提取器(Soxhletextractor)從冷凍干燥的細(xì)胞中提取聚合物。然后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀從溶解聚合物的氯仿溶液中去除大部分的氯仿，并向剩余溶液中加入甲醇來沉淀聚合物。過濾出沉淀的聚合物并在真空干燥器中干燥12小時(shí)。另外，將一部分用離心得到的細(xì)胞在80"C的干燥器中干燥48小時(shí)，并用氣相色譜分析在細(xì)胞中的P(3HB-共-LA)共聚物的含量。使用PLA均聚物和其中3HV的含量為12wt。/。的P(3HB-共-3HV)共聚物作為標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果，基于干燥細(xì)胞的重量，在大腸桿菌中合成的P(3HB-共-LA)的含量為約10%,而在共聚物中PLA的含量為88mol%。由這個(gè)對最終得到的聚合物進(jìn)行氣相色譜分析的實(shí)施例，證明所獲得的聚合物為P(3HB-共-LA)共聚物且在共聚物中PLA的含量為88mol%。<實(shí)施例5>通過重組大腸桿菌的補(bǔ)料分批培養(yǎng)制備PLA均聚物按照實(shí)施例4的方法，進(jìn)行用pPs619C1300-CPPCT載體轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌的種子培養(yǎng)，并通過將100mL的種子培養(yǎng)物接種至2.4L的MR培養(yǎng)基中開始補(bǔ)料分批培養(yǎng)。培養(yǎng)基的溫度為37"C，且用14%的氨水溶液將pH調(diào)節(jié)至6.8-6.9，以及通過控制空氣供應(yīng)和攪拌速度將溶解氧保持為大于飽和空氣的20%。此時(shí)，供應(yīng)空氣的速度是1vvm。當(dāng)在起始培養(yǎng)基中含有的葡萄糖耗盡時(shí)，加入20g的葡萄糖，同時(shí)將攪拌速度調(diào)節(jié)至200rpm并且將空氣供應(yīng)速度降低至0.1wm以將需氧條件改變?yōu)閰捬鯒l件。對于整個(gè)培養(yǎng)，供應(yīng)葡萄糖5次。在終止培養(yǎng)后，通過離心收集細(xì)胞并冷凍干燥。根據(jù)實(shí)施例4的方法收集聚合物。另外，將一部分用離心得到的細(xì)胞在80。C的干燥器中干燥48小時(shí)，并用氣相色譜分析在細(xì)胞中的PLA的含量。使用4-羥基丁酸甲酯、PLA均聚物和其中3HV的含量為12wt。/。的P(3HB-共-3HV)共聚物作為標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果，沒有檢測到3HB和4HB，并且只檢測到PLA?；诟稍锛?xì)胞的重量，在大腸桿菌中合成的PLA的含量為約10。/。。由最終得到的聚合物的氣相色譜結(jié)果，檢測到所獲得的聚合物為聚乳酸酯聚合物，其中PLA的含量為99.1mol%。<實(shí)施例6>多種突變體的制備使用下面的引物根據(jù)在上述實(shí)施例2中公開的相同方法制備多種PHA合酶突變體。所得到的突變體示于表4、5、6和7中。E130DSEQIDNO:15:5'-atcaacetcatgaccgatgcgatggcgccgacc-3'SEQIDNO:16:5'-ggteggcgccatcgcateggtcatgaggttgat-3'S325TSEQIDNO:11:5'-CTGACCTTGCTGGTGACCGTGCTTGATACCACC-3'SEQIDNO:12:5'-GGTGGTATCAAGCACGGTCACCAGCAAGGTCAG-3'S477RSEQIDNO:21:5'-gaattcgtgctgtegagecgcgggcatate-3'SEQIDNO:22:5'-gatatgcccgcggetcgacagcacgaattc-3'S477HSEQIDNO:23:5'-gaattcgtgctgtegagecatgggcatatc匿3'SEQIDNO:S477FSEQIDNO:SEQIDNO:S477YSEQIDNO:SEQIDNO:S477GSEQIDNO:SEQIDNO:Q481KSEQIDNO:SEQIDNO:Q481MSEQIDNO:SEQIDNO:Q481RSEQIDNO:SEQIDNO:表424:5'-gatatgcccatggetcgacagcacgaattc-25:26:27:28:29:30:31:32:33:34:35:36:-gaattcgtgctgtegagetttgggcatate-3'-gatatgcccaaagetcgacagcacgaattc-3-gaattcgtgctgtegagetatgggcatate-3'-gatatgcccatagetcgacagcacgaattc-3'.gaattcgtgctgtegageggcgggcatate-3'.gatatgcccgccgetcgacagcacgaattc-3'-gggcatateaaaageatectgaacccgc-3'■gcgggtteaggatgcttttgatatgccc-3'■gggcatateatgageatectgaacccgc-3'■gcgggtteaggatgcteatgatatgccc-3'.gggcatatecgcageatectgaacccgc-3'gcgggtteaggatgctgcggatatgccc-3'<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><實(shí)施例7>使用多種突變體合成P(3HB-共-LA)根據(jù)在上述實(shí)施例3中描述的相同方法，構(gòu)建了能夠表達(dá)源自假單胞菌6-19的PHA合酶突變體和丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的重組大腸桿菌，并使用該重組大腸桿菌通過與在上述實(shí)施例4中描述的相同方法制備P(3HB-共-LA)。結(jié)果示于表8、9和10中。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>如表8、9和10中所示，本發(fā)明的PHA合酶突變體能夠有效地使用乳酰輔酶A作為底物制備乳酸酯共聚物。[工業(yè)適用性l如上所示，源自假單胞菌6-19的本發(fā)明聚羥基鏈烷酸酯合酶突變體能夠通過使用用常規(guī)聚羥基鏈烷酸酯合酶難以用作底物的乳酰輔酶A作為底物有效地制備乳酸酯聚合物和/或共聚物。權(quán)利要求1、一種聚羥基鏈烷酸酯合酶突變體，其使用乳酰輔酶A作為底物生產(chǎn)乳酸酯聚合物或者乳酸酯共聚物并且具有SEQ.IDNo10的氨基酸序列，其中，在SEQ.IDNo10的氨基酸序列的第481位的谷氨酰胺發(fā)生突變。2、如權(quán)利要求1所述的聚羥基鏈烷酸酯合酶突變體，其中，選自在第130位的谷氨酸、在第325位的絲氨酸和在第477位的絲氨酸中的至少一個(gè)氨基酸進(jìn)一步發(fā)生突變。3、如權(quán)利要求2所述的聚羥基鏈烷酸酯合酶突變體，其中，所述氨基酸序列具有如下任何一種突變a)S325T和Q481M;b)E130D和Q481K;c)S325T和Q481K;d)E130D和Q481M;e)E130D和Q481R;f)E130D、S325T禾口Q481M;g)E130D、S325T和Q481K;h)E130D、S477R和Q481K;i)E130D、S477R和Q481M;pE130D、S477R和Q481R;k)E130D、S477H和Q481K;1)E130D、S477H禾口Q481M;m)E130D、S477H和Q481R;n)E130D、S477F和Q481K;0)E130D、S477F和Q481M;P)E130D、S477F和Q481R;q)E130D、S477Y和Q481K;r)E130D、S477Y和Q481M;s)E130D、S477Y和Q481R;t)E130D、S325T、S477R和Q481M;u)E130D、S325T、S477R和Q481K;V)E130D、S325T、S477F和Q481M;w)E130D、S325T、S477G和Q481M;或x)E130D、S325T、S477F和Q481K。4、一種編碼權(quán)利要求1所述的聚羥基鏈垸酸酯合酶突變體的基因。5、一種重組載體，其含有用于合成乳酸酯聚合物或共聚物的權(quán)利要求4所述的基因。6、如權(quán)利要求5所述的重組載體，其進(jìn)一步包含編碼丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的基因。7、一種用權(quán)利要求5所述的重組載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或者植物。8、一種使用權(quán)利要求6所述的重組載體轉(zhuǎn)化而獲得的細(xì)胞或者植物，其中，原始細(xì)胞或者植物沒有編碼丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的基因。9、一種制備乳酸酯聚合物或乳酸酯共聚物的方法，其中，該方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求7或8所述的細(xì)胞或者植物。10、如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述培養(yǎng)是在含有羥基鏈垸酸酯的培養(yǎng)基中進(jìn)行的，并且所述共聚物為含有羥基鏈垸酸酯單體單元和乳酸酯單體單元的共聚物。11、如權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述羥基鏈烷酸酯是選自下列化合物中的至少一種3-羥基丁酸酯、3-羥基戊酸酯、4-羥基丁酸酯、中鏈長(C6~14)的(D)-3-羥基羧酸、3-羥基丙酸、3-羥基己酸、3-羥基庚酸、3-羥基辛酸、3-羥基壬酸、3-羥基癸酸、3-羥基十一烷酸、3-羥基十二烷酸、3-羥基十四烷酸、3-羥基十六烷酸、4-羥基戊酸、4-羥基己酸、4-羥基庚酸、4-羥基辛酸、4-羥基癸酸、5-羥基戊酸、5-羥基己酸、6-羥基十二烷酸、3-羥基-4-戊烯酸、3-羥基-4-反-己烯酸、3-羥基-4-順-己烯酸、3-羥基-5-己烯酸、3-羥基-6-反-辛烯酸、3-羥基-6-順-辛烯酸、3-羥基-7-辛烯酸、3-羥基-8-壬烯酸、3-羥基-9-癸烯酸、3-羥基-5-順沖二碳烯酸、3-羥基-6-順沖二碳烯酸、3-羥基-5-順-十四碳烯酸、3-羥基-7-順沖四碳烯酸、3-羥基-5，8-順-順-十四碳烯酸、3-羥基-4-甲基戊酸、3-羥基-4-甲基己酸、3-羥基-5-甲基己酸、3-羥基-6-甲基庚酸、3-羥基-4-甲基辛酸、3-羥基-5-甲基辛酸、3-羥基-6-甲基辛酸、3-羥基-7-甲基辛酸、3-羥基-6-甲基壬酸、3-羥基-7-甲基壬酸、3-羥基-8-甲基壬酸、3-羥基-7-甲基癸酸、3-羥基-9-甲基癸酸、3-羥基-7-甲基-6-辛烯酸、蘋果酸、3-羥基琥珀酸甲酯、3-羥基己二酸甲酯、3-羥基辛二酸甲酯、3-羥基壬二酸甲酯、3-羥基癸二酸甲酯、3-輕基辛二酸乙酯、3-羥基癸二酸乙酯、3-羥基庚二酸丙酯、3-羥基癸二酸芐酯、3-羥基-8-乙酰氧基辛酸、3-羥基-9-乙酰氧基壬酸、苯氧基-3-羥基丁酸、苯氧基-3-羥基戊酸、苯氧基-3-羥基庚酸、苯氧基-3-羥基辛酸、對氰基苯氧基-3-羥基丁酸、對氰基苯氧基-3-羥基戊酸、對氰基苯氧基-3-羥基己酸、對硝基苯氧基-3-羥基己酸、3-羥基-5-苯基戊酸、3-羥基-5-環(huán)己基丁酸、3,12-二羥基十二垸酸、3,8-二羥基_5一順沖四碳烯酸、3-羥基-4,5-環(huán)氧癸酸、3-羥基-6，7-環(huán)氧十二烷酸、3-羥基-8,9-環(huán)氧-5,6-順-十四垸酸、7-氰基-3-羥基庚酸、9-氰基-3-羥基壬酸、3-羥基-7-氟庚酸、3-羥基-9-氟壬酸、3-羥基-6-氯己酸、3-羥基-8-氯辛酸、3-羥基-6-溴己酸、3-羥基-8-溴辛酸、3-羥基-11-溴十一垸酸、3-羥基-2-丁烯酸、6-羥基-3-十二碳烯酸、3-羥基-2-甲基丁酸、3-羥基-2-甲基戊酸和3-羥基-2,6-二甲基-5-庚烯酸。全文摘要本發(fā)明涉及源自假單胞菌6-19(KCTC11027BP)的聚羥基鏈烷酸酯合酶(PHA合酶)突變體，其可以通過使用乳酰輔酶A作為底物來制備乳酸酯聚合物和/或共聚物。本發(fā)明涉及一種使用所述合酶突變體制備乳酸酯聚合物和/或共聚物的方法。源自假單胞菌6-19的本發(fā)明聚羥基鏈烷酸酯合酶突變體能夠通過使用用常規(guī)聚羥基鏈烷酸酯合酶難以用作底物的乳酰輔酶A作為底物有效地制備乳酸酯聚合物和/或共聚物。文檔編號C12N15/52GK101541967SQ200780043377公開日2009年9月23日申請日期2007年11月21日優(yōu)先權(quán)日2006年11月23日發(fā)明者姜惠玉,樸時(shí)載,李恩政,李相燁,李相賢,梁宅鎬,金泰完申請人:Lg化學(xué)株式會(huì)社;韓國科學(xué)技術(shù)院