專利名稱：REIC/Dkk-3基因的部分片段和包含所述部分片段的癌癥治療劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及使用腫瘤抑制基因(即REIC/Dkk-3基因片段)對癌細胞凋亡進行的誘導、包含REIC/Dkk-3基因片段的癌細胞凋亡誘導劑、和包含
所述凋亡誘導劑的癌癥治療劑。
背景技術：
癌細胞的選擇性去除在癌癥治療中起著關鍵的作用。不同類型的基因突變在腫瘤發(fā)生和癌癥發(fā)展期間在細胞內出現(xiàn)(Vogelstein, B.等，TrendsGenet 9， 138-41, 1993)，且這些突變可以作為癌癥基因療法的靶標。當給定類型的基因過表達時，這些基因表現(xiàn)出選擇性殺死癌細胞的效果。所述基因的代表性實例包括p53 (Chen， R L.等，Science 250， 1576-80， 1990;Fujiwara, T.等，J. Natl. Cancer Inst， 86, 1458-62， 1994; Nielsen, L. L.等，Cancer Gene Ther., 4， 129-38， 1997)和mda畫7 (Fisher, R B.等，Cancer Biol.Ther.， 2， S23-37, 2003)，且所述基因被稱作癌癥抑制基因。
同時，已知REIC/Dkk-3基因與細胞永生化有關，并且據(jù)報道，在癌細胞中該基因的表達受到抑制(WO 01/038523， Tsuji， T.等，Biochem.Biophys. Res. Commun., 268, 20-4， 2000; Tsuji, T.等，Biochem. Biophys. Res.Commun., 289， 257-63， 2001; Nozaki， I.等，Int. J. Oncol" 19， 117-21, 2001;和Kurose, K.等，J. Urol" 171， 1314-8， 2004)。
REIC/Dkk-3基因是Dkk家族的一員，并且表明該基因通過Wnt受體而抑制Wnt信號傳輸(Bafico, A.等，Nat. Cell Biol" 3， 683-6, 2001;和Hoang, B. H.等，Cancer Res., 64, 2734-9, 2004)。據(jù)報道，所述Wnt基因在諸如細胞生長、分化和癌化等重要生物學條件中起著多重作用(Moon，R. T.等，Science 296， 1644-6,2002)。因此也認為所述Dkk家族(目前已知在人類中存在4種基因)在細胞生長、分化和癌化中起著關鍵的作用，盡管其大多數(shù)功能仍然未知。
目前，關于內質網(wǎng)應激的研究已經(jīng)得到了發(fā)展。體內合成的分泌蛋 白被轉移到內質網(wǎng)并由多種分子伴侶或折疊酶進行有效的折疊。然而， 折疊并非總能充分地進行，在這種情況下，具有較高級結構的異常蛋白
在內質網(wǎng)內凝集，從而誘導內質網(wǎng)應激(D. Thomas Rutkowski等，TRENDS in Cell Biology第14巻，第1瓶第20-28月，2004年1月)。據(jù)報道，細 胞可能由于由所述內質網(wǎng)應激誘導的凋亡而死亡(Mori K.， Traffic, 4, 519-528,2003)。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了包含REIC/Dkk-3基因片段的癌細胞凋亡誘導劑和包 含所述凋亡誘導劑的癌癥治療劑。
到現(xiàn)在為止，本發(fā)明人已證明，通過腺病毒強制表達REIC/Dkk-3 會誘導諸如前列腺癌細胞等癌細胞的凋亡，正常細胞在同一條件下不會 受到明顯影響，且在動物移植模型中會觀察到治療癌癥的顯著效果(日 本專利第3813872號和WO 2006/098074)。此外，本發(fā)明人已進行了關 于表現(xiàn)強烈的凋亡誘導效果的REIC/Dkk-3蛋白區(qū)域和表現(xiàn)凋亡誘導效果 的機理的集中研究。
因此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了以下幾點。
(1) 當將REIC/Dkk-3基因導入CHO細胞以強制表達REIC/Dkk-3且 對所述癌細胞施用在培養(yǎng)基中分泌的REIC/Dkk-3蛋白時，沒有觀察到凋 亡。
(2) 在通過REIC/Dkk-3基因的強制表達使癌細胞凋亡時，JNK被激 活且JNK抑制劑抑制了對凋亡的誘導。JNK通過各種因素激活，己知內 質網(wǎng)應激是一個重要因素。
(3) 由內質網(wǎng)內異常蛋白凝集引起的應激誘導的CHOP和BIP基因 伴隨REIC/Dkk-3基因的強制表達而被誘導。
(4) 當使促進蛋白正常構象的構建的Hsp蛋白誘導劑作用于癌細胞 時，所述癌細胞沒有發(fā)生凋亡。相反，當允許Hsp蛋白抑制劑作用于正常細胞時，在所述正常細胞內的凋亡受到誘導，所述正常細胞內通常不
會通過REIC/Dkk-3基因的強制表達而發(fā)生凋亡。
(5)通過部分肽的強制表達而誘導癌細胞凋亡，所述部分肽沒有 REIC/Dkk-3的固有功能。
基于所述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了將內質網(wǎng)應激參與作為REIC/Dkk-3 誘導癌細胞凋亡的機理的可能性。
此外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，在癌細胞內表達的REIC/Dkk-3基因片段會 誘導凋亡且會導致癌細胞死亡。這導致了本發(fā)明的完成。
具體而言，本發(fā)明涉及REIC/Dkk-3基因片段。另外，本發(fā)明涉及這 樣的REIC/Dkk-3基因片段，所述REIC/Dkk-3基因片段會引起導入該 REIC/Dkk-3基因片段的細胞的內質網(wǎng)應激。此外，本發(fā)明還涉及這樣的 REIC/Dkk-3基因片段，所述REIC/Dkk-3基因片段會誘導導入了該 REIC/Dkk-3基因片段的細胞的凋亡。
本發(fā)明涉及這樣的載體，該載體能夠在含有REIC/Dkk-3基因片段的 細胞內表達該REIC/Dkk-3基因片段。
此外，本發(fā)明還涉及包含上述片段或包含含有該片段的載體的凋亡 誘導劑。由該片段或載體誘導的凋亡通過內質網(wǎng)應激進行誘導。
此外，本發(fā)明還涉及包含上述片段或包含含有該片段的載體的癌癥 治療劑。
此外，本發(fā)明還涉及REIC/Dkk-3蛋白片段，所述蛋白片段為會引起 施用該片段的細胞發(fā)生內質網(wǎng)應激的部分肽。此外，本發(fā)明還涉及 REIC/Dkk-3蛋白片段，所述蛋白片段為會引起施用該片段的細胞的凋亡 的多肽片段。
此外，本發(fā)明還涉及包含所述多肽片段的凋亡誘導劑。由該多肽片
段誘導的凋亡通過內質網(wǎng)應激進行誘導。
此外，本發(fā)明還涉及包含含有上述多肽片段的載體的癌癥治療劑。 本說明書包括在日本專利申請第2006-289040號的說明書和/或附圖
中公開的部分或全部內容，該專利申請是本申請的優(yōu)先權文件。


圖1顯示了 REIC/Dkk-3片段。
圖2顯示了 REIC/Dkk-3基因片段誘導細胞死亡的活性。
圖3是顯示由REIC/Dkk-3基因片段(第I部分)誘導的PC3細胞死 亡的狀態(tài)的照片。
圖4是顯示由REIC/Dkk-3基因片段(第II部分)誘導的PC3細胞 死亡的狀態(tài)的照片。
圖5顯示了 PC3和OUMS-24對誘導由REIC/Dkk-3基因片段所誘導 的凋亡的效果;其中A顯示了關于PC3的結果，而B顯示了關于OUMS-24 的結果。
圖6是顯示REIC/Dkk-3片段對內質網(wǎng)應激標記蛋白的誘導的照片。 圖7顯示了所述REIC/Dkk-3基因片段對間皮腫瘤細胞系凋亡的誘導。
圖8是顯示當使用FuGENE將含有所述REIC/Dkk-3基因片段作為 誘導試劑的質粒導入間皮腫瘤細胞系時的細胞死亡狀態(tài)的照片。
圖9是顯示當使用CytoPure將含有所述REIC/Dkk-3基因片段作為 誘導試劑的質粒導入間皮腫瘤細胞系時的細胞死亡狀態(tài)的照片。
圖10是顯示所述REIC/Dkk-3基因片段在體內抑制腫瘤的效果的照片。
具體實施例方式
下文將對本發(fā)明進行詳細的說明。
本發(fā)明的凋亡誘導劑或癌癥治療劑包含誘導凋亡且具有作為癌癥治 療劑的效果的REIC/Dkk-3基因片段作為活性成分。
REIC/Dkk-3基因的全長核苷酸序列和由該基因編碼的蛋白的氨基 酸序列分別如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示。在如SEQ ID NO: 2 所示的氨基酸序列中，包含第1 19個氨基酸的序列被推斷為信號序列。 所述信號序列的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO: 7中，且其氨基酸序列顯 示于SEQ ID NO: 8中?；赟EQ ID NO: 1的序列信息，REIC/Dkk-3基因可以從人類細胞或組織等獲得。此外，該基因還可根據(jù)WO 01/038523 的說明書而獲得。
誘導凋亡且具有作為癌癥治療劑的效果的本發(fā)明的REIC/Dkk-3基 因片段包括多核苷酸(a) (p)中的任一條，所述基因片段編碼具有凋亡活 性的多肽；
(a) 編碼多肽的多核苷酸，所述多肽由如SEQ ID NO: 2所示的 REIC/Dkk-3蛋白的氨基酸序列的第1個氨基酸至第39 78個氨基酸中的 任一個氨基酸的氨基酸序列組成；
(b) 編碼多肽的多核苷酸，所述多肽由從如SEQ ID NO: 2所示的 REIC/Dkk-3蛋白的氨基酸序列的第1個氨基酸至第39 78個氨基酸中的 任一個氨基酸的氨基酸序列通過取代、缺失或添加1個或數(shù)個氨基酸而 衍生的氨基酸序列組成，并且具有凋亡活性；
(c) 由如SEQ ID NO: 1所示的REIC/Dkk-3基因的核苷酸序列的第1 個核苷酸至第117 234個核苷酸中的任一個核苷酸的核苷酸序列組成的 多核苷酸；
(d) 在嚴格條件下與由核苷酸序列組成的多核苷酸雜交并且編碼具 有凋亡活性的多肽的多核苷酸，所述核苷酸序列與由如SEQ ID NO: 1所 示的REIC/Dkk-3基因的核苷酸序列的第1個核苷酸至第117 234個核 苷酸中的任一個核苷酸組成的核苷酸序列互補；
(e) 由編碼如SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列的核苷酸序列組成的多 核苷酸；
(f) 編碼多肽的多核苷酸，所述多肽由從如SEQ ID NO: 4所示的氨 基酸序列通過取代、缺失或添加1個或數(shù)個氨基酸而衍生的氨基酸序列 組成，并且具有凋亡活性；
(g) 由如SEQ ID NO: 3所示核苷酸序列組成的多核苷酸；
(h) 在嚴格條件下與由核苷酸序列組成的多核苷酸雜交且編碼具有 凋亡活性的多肽的多核苷酸，所述核苷酸序列與如SEQ ID NO: 3所示的 核苷酸序列互補；
(i) 有編碼如SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列的核苷酸序列組成的多核苷酸；
(j)編碼多肽的多核苷酸，所述多肽從如SEQ ID NO: 6所示的氨基 酸序列通過取代、缺失或添加1個或數(shù)個氨基酸衍生，并且具有凋亡活 性；
(k)由如SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列組成的多核苷酸；
(1)在嚴格條件下與由核苷酸序列組成的多核苷酸雜交且編碼具有
凋亡活性的多肽的多核苷酸，所述核苷酸序列與如SEQ ID NO: 5所示的
核苷酸序列互補；
(m)包含編碼多肽片段的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸，所 述多肽片段包含由SEQ ID NO: 2所示的REIC/Dkk-3蛋白的氨基酸序列 的第1 19個氨基酸的序列組成的信號肽，并且包含至少39個氨基酸但 不包含所述REIC/Dkk-3蛋白的全長序列；
(n)編碼包含由如SEQIDNO: 2所示的REIC/Dkk-3蛋白的氨基酸序 列的第1 19個氨基酸的序列組成的信號肽和具有凋亡活性的多肽的多 核苷酸，所述多肽包含從包含至少39個氨基酸殘基但不包含所述 REIC/Dkk-3蛋白的全長序列的多肽片段的氨基酸序列通過取代、缺失或 添加1個或數(shù)個氨基酸而衍生的氨基酸序列；
(o)包含核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列包括編碼信號序列 的核苷酸序列且包含至少117個核苷酸但不包含REIC/Dkk-3的全長核苷 酸序列，所述信號序列由如SEQ ID NO: 1所示的REIC/Dkk-3基因的核 苷酸序列的第1 57個核苷酸的序列組成；或
(p)在嚴格條件下與包含核苷酸序列的多核苷酸雜交且編碼具有凋 亡活性的多肽的多核苷酸，所述核苷酸序列與包括編碼信號序列的核苷 酸序列且包含至少117個核苷酸但不包含REIC/Dkk-3的全長核苷酸序列 的核苷酸序列互補，所述信號序列由如SEQ ID NO: 1所示的REIC/Dkk-3 基因的核苷酸序列的第1 57個核苷酸的序列組成。
在上述(a)和(b)中，術語"如SEQ ID NO: 2所示的REIC/Dkk-3蛋白 的氨基酸序列的第1個氨基酸至第39 78個氨基酸中的任一個氨基酸的 氨基酸序列"指N端為如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的第1個氨基酸而C端為如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的第39 78個氨基酸中 的任一個氨基酸的氨基酸序列，該氨基酸序列的氨基酸殘基數(shù)為39 78。 該氨基酸序列包括包含如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的第1個氨基 酸至第39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77或78個氨基酸的氨基酸序列。
在上述(c)和(d)中，術語"如SEQ ID NO: 1所示的REIC/Dkk-3基因 的核苷酸序列的第1個核苷酸至第117 234個核苷酸中的任一個核苷酸 的核苷酸序列"指5'端為如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的第1個核 苷酸而3'端為如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的第117 234個核苷 酸中的任一個核苷酸的核苷酸序列。核苷酸數(shù)為117 234，且該數(shù)目優(yōu) 選對應于包含如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的第1個氨基酸至第 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77或78個氨基酸的氨基酸序列。
在上述(b)、 (f)、 (j)和(n)中，在術語"通過取代、缺失或添加l個或 數(shù)個氨基酸的…氨基酸序列"中的術語"1個或數(shù)個"指1 10個，優(yōu)選 為1 5個，且更優(yōu)選為1或2個。
誘導凋亡且具有癌癥治療劑的效果的本發(fā)明的REIC/Dkk-3基因片 段包括編碼氨基酸序列的多核苷酸，所述氨基酸序列具有與氨基酸序列 (a)、 (e)、 (i)或(m)相比為至少85%，優(yōu)選為90%以上，更優(yōu)選為95%以上， 特別優(yōu)選為97%以上的同源性，所述同源性使用例如BLAST (基本區(qū)域 比對 叟尋工具，Basic Local Alignment Search Tool)在National Center for Biological Information計算(使用例如缺省參數(shù)，即初始參數(shù))。
在(d)、 (h)、 (l)和(p)中的在"嚴格條件"下，例如，用IXSSC、 0.1% SDS且在37°C進行雜交。在較為嚴格的條件下，用0.5X SSC、 0.1% SDS 且在42。C進行雜交。在更加嚴格的條件下，用0.2XSSC、 0.1% SDS且 在65。C進行雜交。于是，在更嚴格的雜交條件下，可以預期具有與探針 序列相比為更高同源性的DNA發(fā)生分離。應當注意的是，上述SSC、 SDS和溫度條件的組合是舉例說明，可通過將探針濃度、探針長度、雜交反 應時間和其它條件適當組合來實現(xiàn)必要的嚴格性。
誘導凋亡且具有癌癥治療劑的效果的本發(fā)明的REIC/Dkk-3基因片 段包括多核苷酸，所述多核苷酸是具有與多核苷酸(c)、 (g)、 (k)或(o)的核 苷酸序列相比為至少85%，優(yōu)選為90%以上，更優(yōu)選為95%以上，特別 優(yōu)選為97M以上的同源性且具有誘導凋亡的活性的DNA，所述同源性使 用例如BLAST (基本區(qū)域比對搜尋工具)在National Center for Biological Information計算(使用例如缺省參數(shù)，即初始參數(shù))。
上述(m)和(n)包括包含信號肽的REIC/Dkk-3蛋白片段。術語"包含 由如SEQIDNO: 2所示的REIC/Dkk-3蛋白的氨基酸序列的第1 19個 氨基酸的序列組成的信號肽的多肽片段的氨基酸序列，并且包含至少39 個氨基酸但不包含REIC/Dkk-3蛋白的全長序列"中的氨基酸殘基數(shù)為例 如39、 40、 45、 50、 55、 60、 65、 70、 75、 80、 85、 90、 95、 100、 105、 110、 115、 120、 125、 130、 135、 140、 145、 150、 155、 160、 165、 170、 175、 180、 185、 190、 195、 200、 205、 210、 215、 220、 225、 230、 235、 240、 245、 250、 255、 260、 265、 270、 275、 280、 285、 290、 300、 305、 310、 315、 320、 325、 330、 335或340。
上述(o)和(p)各自是包含編碼信號肽的核苷酸區(qū)域的REIC/Dkk-3基 因片段。
這些片段在細胞內表達多肽，這些多肽被轉移到內質網(wǎng)，但所述多 肽不能構成正常的更高級的結構。據(jù)認為這引起了內質網(wǎng)應激。本發(fā)明 的REIC/Dkk-3基因片段優(yōu)選包含編碼信號肽的核苷酸序列以使表達產物 被轉移至內質網(wǎng)。
此外，本發(fā)明包括包含所述REIC/Dkk-3基因片段的載體?？蓪⑺?載體導入受試對象中，以在所述受試對象體內表達由所述REIC/Dkk-3基 因片段編碼的多肽并表現(xiàn)出誘導凋亡的效果。在基因治療中，可根據(jù)傳 統(tǒng)技術將目標基因導入受試對象內。在受試對象內導入基因的技術的實 例包括涉及病毒載體的使用的方法和涉及非病毒載體的使用的方法。各 禾中技術是已矢B的(Bessatsu Jikken-Igaku, Idenshi-Chiryo畫No-Kisogijutsu(Basic Techniques for Gene Therapy (基因治療基石出技術)),Yodosha Co.， Ltd., 1996; Bessatsu Jikken Igaku (Separate volume, Experimental Medicine (實驗醫(yī)學分冊))，Idenshi donyu禾口 hatsugen kaiseki jikken-hou (Experimentation of gene introduction & expression analysis (基因導入禾口表 達分析實驗))，Yodosha, Co., Ltd.;和日本基因治療學會(Japan Society of Gene Therapy)(編),"Idenshi chiryo kaihatsu kenkyu handbook淳因治療石開 發(fā)手冊)，，，N.T.S., 1999)。
用于基因導入的病毒載體的代表性實例包括腺病毒載體、腺伴隨病 毒載體和逆轉錄病毒載體。可通過將目標基因導入諸如解毒逆轉錄病毒 (detoxicated retrovirus)、皰疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰質炎病毒、 辛德畢斯病毒(Sindbis virus)、仙臺病毒(Sendai virus)、 SV40或HIV等DNA 或RNA病毒內并用所述病毒感染細胞來將目標基因導入所述細胞內。
當本發(fā)明的基因用于使用病毒的基因治療時，優(yōu)選使用腺病毒載體。 腺病毒載體的特征是(l)它能將基因導入多種類型的細胞內；(2)它能在 生長停滯期將基因有效地導入細胞內；(3)它能通過離心濃縮來獲得高滴 度的病毒(10PFU/mL llPFU/mL以上)；和(4)它適用于將基因體內直 接導入組織或細胞中。作為用于基因治療的腺病毒載體，已經(jīng)開發(fā)了缺 乏El/E3區(qū)的第一代腺病毒載體(Miyake, S.等，Proc. Natl. Acad. Sci.， U.S.A., 93， 1320, 1996)、通過除E1/E3區(qū)外還缺失E2或E4區(qū)從而由第一 代腺病毒載體制備的第二代腺病毒載體(Lieber, A.等，J. Virol.， 70, 8944， 1996; Mizuguchi, H.和Kay, M. A.， Hum. Gene Ther.， 10， 2013， 1999)和缺乏 幾乎所有腺病毒基因組的第三代腺病毒載體(GUTLESS) (Steinwaerder， D. S.等，J.Viro1.，73，9303, 1999)?？梢詻]有特別限制地使用任何這類腺病毒 載體導入本發(fā)明的基因。此外，可以使用已賦予有將基因引入AAV染色 體中的腺-AAV雜交載體(adeno-AAV hybrid vector)(Recchia, A.等，Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 96， 2615， 1999)或能使用轉座子基因將基因引入 染色體中的腺病毒載體，從而所述載體可應用于基因的長期表達。此外， 可以插入表現(xiàn)出對腺病毒纖維的HI環(huán)的組織特異性轉移能力的多肽序 列使所述腺病毒載體具有組織特異性(Mizuguchi, H.和Hayakawa, T.,Nippon Rinsho, 7， 1544, 2000)。
作為另一種選擇，可以使用其中已經(jīng)引入諸如質粒載體等基因表達 載體的重組表達載體而不使用上述病毒來將目標基因導入細胞或組織 內。例如，可通過脂質體轉染法、磷酸鈣共沉淀法、DEAE-葡聚糖法或 使用微玻璃管直接注射DNA法來將基因導入細胞內。此外，可通過例如 使用內部脂質體的基因導入法、使用靜電型脂質體的基因導入法、使用 HVJ脂質體的方法、使用經(jīng)修飾HVJ脂質體的方法(g卩，HVJ-AVE脂 質體方法)、使用HVJ-E (包膜)載體的方法、受體介導的基因導入法、 使用基因槍利用載體(即金屬顆粒)將DNA分子導入細胞內的方法、裸 DNA的直接導入法或使用各類高分子的基因導入法來將重組表達載體引 入細胞內。在此情形中，可使用任何表達載體，只要該載體能在體內表 達目標基因。這類載體的實例包括pCAGGS (Gene 108， 193-200， 1991)、 pBK-CMV、pcDNA3、pcDNAl和pZeoSV (Invitrogen， Stratagene)及pVAXl 載體。
包含所述REIC/Dkk-3基因片段的載體可適當包含用于轉錄所述基 因的啟動子或增強子、聚A信號、用于標記和/或選擇已經(jīng)導入有所述基 因的細胞的標記基因等。在此情形下，可使用已知的啟動子。
可通過例如直接將基因治療劑導入體內的體內方法或間接體內方法 來將包含本發(fā)明的REIC/Dkk-3基因片段的藥物組合物導入受試對象內， 在所述間接體內方法中，從人類提取給定的細胞、將基因治療劑導入所 述離體細胞然后將所述細胞返回到體內(Nikkei Science, 1994年4月，第 20-45頁；Gekkan Yakuji， 36(1)， 23-48, 1994; Jikken igaku zoukan, 12(15)， 1994;日本基因治療學會(編)，Idenshi chiryo kaihatsu kenkyu handbook, N. T. S., 1999)。
此外，本發(fā)明的凋亡誘導劑或癌癥治療劑包含作為活性成分的 REIC/Dkk-3蛋白的多肽片段，所述多肽片段誘導凋亡且具有作為癌癥治 療劑的效果。
所述多肽片段包括如(a)、 (b)、 (e)、 (f)、 (i)或(j)所述的具有凋亡活性 的REIC/Dkk-3蛋白的多肽片段(a) 由如SEQ ID NO: 2所示的REIC/Dkk-3蛋白的氨基酸序列的第1 個氨基酸至第39 78個氨基酸中的任一個氨基酸的氨基酸序列組成的多 肽；
(b) 由從如SEQIDNO: 2所示的REIC/Dkk-3蛋白的氨基酸序列的第 1個氨基酸至第39 78個氨基酸中的任一個氨基酸的氨基酸序列通過取 代、缺失或添加1個或數(shù)個氨基酸而衍生的氨基酸序列組成且具有凋亡 活性的多肽；
(e) 由如SEQIDNO:4所示的氨基酸序列組成的多肽；
(f) 由從如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列通過取代、缺失或添加1 個或數(shù)個氨基酸而衍生的氨基酸序列組成且具有凋亡活性的多肽；
(i)由如SEQIDNO:6所示的氨基酸序列組成的多肽；和 (D由從如SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列通過取代、缺失或添加1 個或數(shù)個氨基酸而衍生的氨基酸序列組成且具有凋亡活性的多肽。
REIC/Dkk-3蛋白的多肽片段(a)、 (b)、 (e)、 (f)、 (i)和(j)的細節(jié)如上所述。
由本發(fā)明的基因編碼的本發(fā)明的蛋白誘導受體細胞的衰老狀態(tài)或靜 息狀態(tài)并因此能介導癌細胞分化為非癌性細胞。例如，該蛋白可用于治 療以抑制癌細胞或原始癌細胞的急性生長。
一般而言，腫瘤分為良性腫瘤和惡性腫瘤，而后一類腫瘤統(tǒng)稱為"癌癥"。
可以使用本發(fā)明的蛋白治療的腫瘤不受特別限制，良性腫瘤和惡性 腫瘤都可治療，且本發(fā)明的蛋白對惡性腫瘤特別有效。
惡性腫瘤根據(jù)腫瘤形成的器官位置分為顱神經(jīng)腫瘤、皮膚癌、胃癌、 肺癌、肝癌、淋巴瘤/白血病、結腸癌、胰腺癌、肛門癌/直腸癌、食道癌、 子宮癌、乳腺癌、骨瘤/骨肉瘤、平滑肌瘤、橫紋肌瘤、間皮瘤 (mesoep池elioma)和其它癌癥。如上所述，可治療的腫瘤不受特別限制， 且可以治療上述腫瘤和癌癥。本發(fā)明的蛋白對前列腺癌、肺癌、肝癌、 胃癌、食道癌、頭頸癌、卵巢癌和骨瘤/骨肉瘤特別有效。所述蛋白對前 列腺癌和間皮癌更為有效，并且對高度惡性前列腺癌特別有效。本文所用術語"高度惡性前列腺癌"指例如Gleason評分為8以上的前列腺癌。 此外，在這些器官中形成的癌癥根據(jù)組織學性質大致分為源自于上 皮細胞的癌、非源自于上皮細胞的肉瘤及其混合腫瘤。使用本發(fā)明的蛋 白能夠治療的腫瘤不受特別限制，源自于上皮細胞的癌、非源自于上皮 細胞的肉瘤及其混合腫瘤都可受治療。本發(fā)明的蛋白對源自于上皮細胞 的癌特別有效。
本發(fā)明的藥物組合物包含REIC/Dkk-3基因片段或包含所述基因片 段的載體、和藥用載體、稀釋劑或賦形劑。
此外，本發(fā)明的藥物組合物包含REIC/Dkk-3多肽片段和藥用載體、 稀釋劑或賦形劑。
本發(fā)明的藥物組合物可以以多種劑型施用。劑型的實例包括口服 施用劑型，如片劑、膠囊劑、顆粒劑、粉劑和糖漿劑；和胃腸外施用劑 型，如注射劑、滴劑、栓劑、噴霧劑、滴眼劑、鼻劑和貼劑。
本發(fā)明的藥物組合物可以局部施用。例如，可將所述組合物通過注 射施用到癌癥部位以提供其效果。
本發(fā)明的藥物組合物包含通常用在制藥領域的載體、稀釋劑和賦形 劑。例如，可以使用乳糖或硬脂酸鎂作為片劑的載體或賦形劑。含生理 鹽水、葡萄糖和其他佐劑的等滲溶液可以用作注射水溶液。等滲溶液可 與適當?shù)脑鋈軇?如醇、諸如丙二醇等多元醇、或非離子表面活性劑) 組合使用。芝麻油或豆油等用作油性液體，并且苯甲酸芐酯或苯甲醇等 可以作為增溶劑組合使用。
劑量根據(jù)癥狀、年齡、體重和其它情況而變化。在REIC/Dkk-3基因 片段或包含所述片段的載體的情形中，劑量可以是以數(shù)日、數(shù)周或數(shù)月 為間隔的0.001 mg 100 mg所述REIC/Dkk-3多核苷酸片段，且該多核 苷酸片段可通過皮下注射、肌內注射或靜脈內注射來施用。在REIC/Dkk-3 多肽片段的情形中，口服施用情形中的劑量可為每日約0.001 mg 100mg， 且該片段可以以一次劑量或數(shù)次分開劑量施用。在胃腸外施用的情形下， 可以通過皮下注射、肌內注射或靜脈內注射來施用約0.001 mg 100mg 的劑量。下文將參考以下實施例對本發(fā)明進行詳細說明，但本發(fā)明的技術范 圍并不限于所述實施例。
實施例l: REIC/Dkk-3基因片段(l)的凋亡誘導 使用如下材料以下列方式進行該實施例。
(1) 細胞培養(yǎng)
使用添加了 10%胎牛血清的HAM'S F-12 K培養(yǎng)基培養(yǎng)來自人類前 列腺癌的細胞系(PC3)。
(2) 重組質粒的制備
使用合成引物通過PCR制備了 REIC/Dkk-3 (F: 1-350 aa(氨基酸))的 全長cDNA及其片段(l: 1-39 aa; 2: 1-78 aa)，用EcoRl和Xhol限制酶消 化所得物，然后將其引入質粒(pDNR-CMV) (pDNR-CMV-F 、 pDNR-CMV-l和pDNR-CMV-2)。圖1顯示了所述片段在REIC/Dkk-3蛋
白上的位置。
(3) 重組質粒在細胞內的導入
將如上制備的質粒通過磁轉染導入所述PC3細胞內(將質粒、轉染 試劑(DreamFect試齊!j; OZ BIOSC正NCES， Marseille France)和磁性納米顆 ?；旌?，將所得物加入細胞培養(yǎng)體系，然后讓所述細胞在磁板上靜置30分 鐘)。使用GFP表達質粒(pDNR-CMV-GFP)評價將質粒導入細胞內的效 率，發(fā)現(xiàn)該效率在導入后24小時高達約70%。
(4) 細胞死亡的評價
在所述質粒導入后72小時，對細胞死亡進行評價。通過涉及使用乙 錠同二聚體l (ethidium homodimer 1，對死亡細胞染色紅色熒光)與 Hoechst 33342 (對所有細胞染色藍色熒光)的組合的染色方法進行評 價。在該系統(tǒng)中，對100個細胞(即，Hoechst 33342陽性細胞)中的死 亡細胞數(shù)(即，乙錠同二聚體1陽性細胞)計數(shù)，總共進行四次，然后 確定死亡細胞的百分比。
圖2顯示了當所述REIC/Dkk-3片段在PC3細胞中表達時的死亡細 胞百分比。使用腺病毒-LacZ和pDNR-CMV-GFP作為陰性對照并使用腺 病毒-REIC (全長)作為陽性對照。對死亡細胞百分比進行確定，其中在使用腺病毒的情況中在感染后36小時時進行確定，而在使用質粒的情況
中則在感染后72小時時進行確定。如圖2所示，發(fā)現(xiàn)片段1和片段2具 有高的誘導細胞死亡的活性。圖3顯示了在此情形中在相差顯微鏡下對 細胞狀態(tài)的觀察結果。相似地，在片段1和片段2中觀察到了顯著降低 的細胞密度。
實施例2: REIC/Dkk-3基因片段(2)的凋亡誘導
將PC3細胞(1X1()S細胞)接種到6孔板上，24小時后，使用 TransIT⑧-Keratinocyte試齊U (轉染試劑，Minis Bio Corporation)將其中 已經(jīng)插入有所述REIC片段的cDNA的pTracer-EF-A-l (#1: 1-39 aa)、 pTracer-EF-A陽2 (#2: 1-78 aa)和pTracer-EF-A-6 (全長1-350 aa)質粒導入 PC3細胞內。使用FuGENE⑧-HD試齊U(轉染試齊!J， Roche Applied Science) 將質粒導入OUMS-24。 48小時后，用Hoechst 33342對仍然存活的細胞 進行核染色，然后在熒光顯微鏡下觀察。使用GFP陽性細胞(含質粒的 細胞)作為分母計算已發(fā)生凋亡的細胞(即，核凝集的細胞)百分比。 此處也采用實施例1中所用的細胞培養(yǎng)條件。
向PC3導入基因所用的質粒能利用不同的啟動子同時表達所插入的 基因(即，所述REIC/Dkk-3片段)禾BGFP。因此，GFP (綠色)檢測能 實現(xiàn)對其中表達了所述REIC片段的細胞的間接檢測。在導入后48小時， 評價細胞凋亡的誘導。圖4顯示了染色圖像。如圖4所示，在1和2的 情形中觀察到了核(用Hoechst染色藍色)己經(jīng)顯著凝集(即，凋亡) 的GFP陽性細胞。在圖4中，符號(-)代表空質粒，即沒有插入所述REIC 片段的pTracer-EF-A。
圖5A顯示了通過使用GFP陽性細胞(含質粒的相比)作分母計算 利用PC3的凋亡(g卩，核凝集的細胞)百分比的結果。在REIC片段1(#1: 1-39 aa)和2 (#2: 1-78 aa)中觀察到了凋亡誘導的顯著效果。圖5B顯示了 使用OUMS-24獲得的結果。在PC3中觀察到的凋亡誘導效果在正常成 纖維細胞OUMS-24中沒有觀察到。
實施例3: REIC/Dkk-3片段對內質網(wǎng)應激標記蛋白的誘導
將PC3細胞(1X1(^細胞)接種到10cm培養(yǎng)盤中，24小時后，使用TransIT-Keratinocyte試劑(轉染試劑)將其中已經(jīng)插入有所述REIC 片段的cDNA的pTmcer-EF-A-l (#1: 1-39 aa)、pTracer-EF-A-2 (#2: 1-78 aa) 和pTracer-EF-A-6 (全長l-350aa)質粒導入PC3細胞。使用FuGENE-HD 試劑(轉染試劑)將質粒導入OUMS-24。 48小時后，回收細胞并通過蛋 白提取制備樣品。對所得樣品進行SDS-PAGE，然后通過Western印跡進 行目標蛋白的表達分析。
結果如圖6所示。在圖6中，"Ad-REIC"顯示了與其中導入了誘導全 長REIC過表達的腺病毒載體的細胞有關的結果。"對照"代表與其中插 入了不含REIC片段的空質粒(即，pTracer-EF-A)的細胞有關的結果。 在PC3細胞中，質粒1 (#1: 1-39 aa)和2 (#2: 1-78 aa)都顯著誘導了內質網(wǎng) 應激標記CHOP、 BIP和JNK的磷酸化。然而，在OUMS-24中沒有觀察 到該現(xiàn)象。
實施例4: REIC/Dkk-3基因片段在間質上皮腫瘤細胞系中對凋亡的
誘導
將211H人類惡性間皮腫瘤細胞(1X1()S細胞)接種到6孔板上， 24小時后，使用FuGENE -HD (Roche Applied Science)和CytoPure 試 劑(Nitto Denko Technical Corporation),并導入其中插入有所述REIC片段 的cDNA的pTracer畫EF-A-l (#1: 1-39 aa)、 pTracer-EF-A-2 (#2: 1-78 aa)和 pTracer-EF-A-6 (全長l-350aa)質粒。48小時后，用Hoechst 33342對仍 然存活的細胞進行核染色，然后在熒光顯微鏡下觀察。使用GFP陽性細 胞(含質粒的細胞)作為分母計算發(fā)生凋亡的細胞(即，核凝集的細胞) 百分比。
用于導入的質粒能利用不同啟動子同時表達所插入的基因(即，所 述REIC/Dkk-3片段)和GFP。因此，GFP (綠色)檢測能實現(xiàn)對表達所 述REIC片段的細胞的間接檢測。導入后48小時，在熒光顯微鏡下觀察 并評價細胞凋亡的誘導。使用GFP陽性細胞(含質粒的細胞)作為分母 計算發(fā)生凋亡的細胞(即，核凝集的細胞)百分比(圖7)。結果，在質 粒1 (1-39 aa)和2 (1-78 aa)的情形中，作為FuGENE-HD試劑(圖8)和 CytoPure試劑(圖9)的應用結果，觀察到了其中核(用Hoechst染色藍色)己顯著凝集(即，凋亡)的GFP陽性細胞。通過CytoPure試劑的 應用實現(xiàn)的凋亡誘導效果稍好于FuGENE-HD試劑的結果(圖7)。 實施例5:體內腫瘤抑制
向人類惡性間皮腫瘤細胞系211H中引入熒光素酶表達基因，以獲得 211H克隆4細胞(2X1()S細胞)，將所得物與Matrigd混合，然后將所得 物皮下異種移植到裸鼠內。3天后，通過IVIS (即，高靈敏度體內發(fā)光 成像系統(tǒng))檢査了皮下腫瘤形成情況，并在腫瘤形成部位注射 pTracer-EF-A-2 (#2: 1-78 aa)質粒/CytoPure的混合溶液(每日施用25昭 質粒一次，持續(xù)一周)。此后，終止施用，并在此后14天，通過IVIS (即， 高靈敏度體內發(fā)光成像系統(tǒng))再次評價腫瘤形成情況。作為對照樣品， 提供了單獨施用Cytopure (CYTOPURE)的組以及施用Cytopure和對照載 體(表達紅色熒光蛋白，CYTOPURE十pDsRed)的組。
圖IO顯示了所述結果。如圖IO所示，在施用了所述REIC片段的5 只小鼠中有2只的腫瘤基本完全得到消除。
工業(yè)實用性
本發(fā)明的REIC/Dkk-3基因片段可用作能誘導諸如前列腺癌或間皮 癌等癌細胞的凋亡且能抑制所述癌癥的癌細胞凋亡誘導劑或癌癥治療 劑。此外，本發(fā)明的REIC/Dkk-3基因片段及其表達產物具有小的分子量， 因此不易引起副作用。
本文通過參考引入本文所引用的所有出版物、專利和專利申請的全 部內容。
權利要求
1.編碼REIC/Dkk-3蛋白并編碼具有凋亡活性的多肽的多核苷酸片段(a)或(b)(a)編碼多肽的多核苷酸，所述多肽包含如SEQ ID NO2所示的REIC/Dkk-3蛋白的氨基酸序列的第1個氨基酸至第39～78個氨基酸中的任一個氨基酸的氨基酸序列；或(b)編碼多肽的多核苷酸，所述多肽包含從如SEQ ID NO2所示的REIC/Dkk-3蛋白的氨基酸序列的第1個氨基酸至第39～78個氨基酸中的任一個氨基酸的氨基酸序列通過取代、缺失或添加1個或數(shù)個氨基酸而衍生的氨基酸序列，并且具有凋亡活性。
2. 編碼REIC/Dkk-3蛋白并編碼具有凋亡活性的多肽的多核苷酸片段(c)或(d):(c) 包含如SEQIDNO: l所示的REIC/Dkk-3基因的核苷酸序列的第1個核苷酸至第117 234個核苷酸中的任一個核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸；或(d) 在嚴格條件下與包含核苷酸序列的多核苷酸雜交且編碼具有凋亡活性的多肽的多核苷酸，所述核苷酸序列與如SEQ ID NO: 1所示的REIC/Dkk-3基因的核苷酸序列的第1個核苷酸至第117 234個核苷酸中的任一個核苷酸的序列互補。
3. 編碼REIC/Dkk-3蛋白并編碼具有凋亡活性的多肽的多核苷酸片段(e)或(f):(e) 包含編碼如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸；或(f) 編碼多肽的多核苷酸，所述多肽包含從如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列通過取代、缺失或添加1個或數(shù)個氨基酸而衍生的氨基酸序列，并且具有凋亡活性。
4. 編碼REIC/Dkk-3蛋白并編碼具有凋亡活性的多肽的多核苷酸片段(g)或(h):(g) 包含如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列的多核苷酸；或(h) 在嚴格條件下與包含核苷酸序列的多核苷酸雜交且編碼具有凋亡活性的多肽的多核苷酸，所述核苷酸序列與如SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列互補。
5. 編碼REIC/Dkk-3蛋白并編碼具有凋亡活性的多肽的多核苷酸片段(i)或(j》(i) 包含編碼如SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸；或(j)編碼多肽的多核苷酸，所述多肽從如SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列通過取代、缺失或添加1個或數(shù)個氨基酸衍生，并且具有凋亡活性。
6. 編碼REIC/Dkk-3蛋白并編碼具有凋亡活性的多肽的多核苷酸片段(k)或(l):(k)包含如SEQIDNO:5所示的核苷酸序列的多核苷酸；或(1)在嚴格條件下與包含核苷酸序列的多核苷酸雜交且編碼具有凋亡活性的多肽的多核苷酸，所述核苷酸序列與如SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列互補。
7. 編碼REIC/Dkk-3蛋白并編碼具有凋亡活性的多肽的多核苷酸片段(m)或(n):(m)包含編碼多肽片段的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸，所述多肽片段包含由如SEQ ID NO: 2所示的REIC/Dkk-3蛋白的氨基酸序列的第1 19個氨基酸的序列組成的信號肽，并且包含至少39個氨基酸但不包含所述REIC/Dkk-3蛋白的全長序列；或(n)編碼包含由如SEQ ID NO: 2所示的REIC/Dkk-3蛋白的氨基酸序列的第1 19個氨基酸的序列組成的信號肽并具有凋亡活性的多肽的多核苷酸，所述多肽包含從包含至少39個氨基酸殘基但缺乏所述REIC/Dkk-3蛋白的全長序列的多肽片段的氨基酸序列通過取代、缺失或添加1個或數(shù)個氨基酸而衍生的氨基酸序列。
8. 編碼REIC/Dkk-3蛋白并編碼具有凋亡活性的多肽的多核苷酸片段(O)或(p):(0)包含核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列包括編碼信號序列的核苷酸序列，并且包含至少117個核苷酸但不包含REIC/Dkk-3的全長核苷酸序列，所述信號序列由如SEQ ID NO: 1所示的REIC/Dkk-3基因的核苷酸序列的第1 57個核苷酸的序列組成；或(P)在嚴格條件下與包含核苷酸序列的多核苷酸雜交且編碼具有凋亡活性的多肽的多核苷酸，所述核苷酸序列與包括編碼信號序列的核苷酸序列且包含至少117個核苷酸但不包含REIC/Dkk-3的全長核苷酸序列的核苷酸序列互補，所述信號序列由如SEQIDNO: 1所示的REIC/Dkk-3基因的核苷酸序列的第1 57個核苷酸的序列組成。
9. 一種載體，所述載體包含如權利要求1 8任一項所述的多核苷酸。
10. —種凋亡誘導劑，所述凋亡誘導劑包含如權利要求1 8任一項所述的多核苷酸作為活性成分。
11. 如權利要求10所述的凋亡誘導劑，所述凋亡誘導劑引起細胞內的內質網(wǎng)應激而誘導凋亡。
12. —種凋亡誘導劑，所述凋亡誘導劑包含如權利要求9所述的載體。
13. 如權利要求12所述的凋亡誘導劑，所述凋亡誘導劑引起細胞內的內質網(wǎng)應激而誘導凋亡。
14. 一種癌癥治療劑，所述癌癥治療劑包含如權利要求1 8任一項所述的多核苷酸作為活性成分。
15. 如權利要求14所述的癌癥治療劑，所述癌癥治療劑引起細胞內的內質網(wǎng)應激而誘導凋亡。
16. —種癌癥治療劑，所述癌癥治療劑包含如權利要求9所述的載體。
17. 如權利要求16所述的癌癥治療劑，所述癌癥治療劑引起細胞內的內質網(wǎng)應激而誘導凋亡。
18. 如權利要求14 17任一項所述的癌癥治療劑，其中，所述癌癥為前列腺癌。
19. 如權利要求14 17任一項所述的癌癥治療劑，其中，所述癌癥為間皮癌。
20. REIC/Dkk-3蛋白的具有凋亡活性的多肽片段(a)或(b):(a) 包含如SEQ ID NO: 2所示的REIC/Dkk-3蛋白的氨基酸序列的第l個氨基酸至第39 78個氨基酸中的任一個氨基酸的氨基酸序列的多肽;或(b) 包含從如SEQ ID NO: 2所示的REIC/Dkk-3蛋白的氨基酸序列的第1個氨基酸至第39 78個氨基酸中的任一個氨基酸的氨基酸序列通過取代、缺失或添加1個或數(shù)個氨基酸而衍生的氨基酸序列且具有凋亡活性的多肽。
21. REIC/Dkk-3蛋白的具有凋亡活性的多肽片段(e)或(f):(e) 包含如SEQIDNO:4所示的氨基酸序列的多肽；或(f) 包含從如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列通過取代、缺失或添加1個或數(shù)個氨基酸而衍生的氨基酸序列且具有凋亡活性的多肽。
22. REIC/Dkk-3蛋白的具有凋亡活性的多肽片段(i)或(D:(i)包含如SEQIDNO:6所示的氨基酸序列的多肽；或(D包含從如SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列通過取代、缺失或添加1個或數(shù)個氨基酸而衍生的氨基酸序列且具有凋亡活性的多肽。
23. —種凋亡誘導劑，所述凋亡誘導劑包含如權利要求20 22任一項所述的多肽作為活性成分。
24. —種癌癥治療劑，所述癌癥治療劑包含如權利要求20 22任一項所述的多肽作為活性成分。
25. 如權利要求24所述的癌癥治療劑，其中，所述癌癥為前列腺癌。
26. 如權利要求25所述的癌癥治療劑，其中，所述癌癥為間皮癌。
全文摘要
本發(fā)明提供了包含REIC/Dkk-3基因片段的癌細胞凋亡誘導劑和包含所述凋亡誘導劑的癌癥治療劑。本發(fā)明還提供了編碼REIC/Dkk-3蛋白的多核苷酸片段(a)或(b)，所述片段編碼具有凋亡活性的多肽(a)編碼多肽的多核苷酸，所述多肽包含如SEQ ID NO2所示的REIC/Dkk-3蛋白的氨基酸序列的第1個氨基酸至第39～78個氨基酸中的任一個氨基酸的氨基酸序列；或(b)編碼多肽的多核苷酸，所述多肽包含從如SEQ ID NO2所示的REIC/Dkk-3蛋白的氨基酸序列的第1個氨基酸至第39～78個氨基酸中的任一個氨基酸的氨基酸序列通過取代、缺失或添加1個或數(shù)個氨基酸而衍生的氨基酸序列且具有凋亡活性。
文檔編號C12N15/09GK101541960SQ20078004346
公開日2009年9月23日 申請日期2007年10月24日 優(yōu)先權日2006年10月24日
發(fā)明者公文裕巳, 許南浩, 費爾南多·吉耶爾莫·阿瓦蘇亞·卡韋薩斯, 那須保友, 阪口政清 申請人:公文裕巳;許南浩;阪口政清;那須保友;費爾南多·吉耶爾莫·阿瓦蘇亞·卡韋薩斯