專利名稱：抑制丙型肝炎病毒復(fù)制子復(fù)制的抗核酸酶rna適體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠抑制丙型肝炎病毒復(fù)制子復(fù)制的抗核酸酶RN A 適體，以及用于診斷丙型肝炎病毒感染的試劑盒和丙型肝炎病毒復(fù)制 的抑制劑。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒(HCV)是引起慢性肝炎、肝硬化以及，在某些情況 下，肝細(xì)胞癌的主要病原體(參考文獻(xiàn)14)。盡管HCV影響超過(guò)3 %的世界人口，然而目前還沒有開發(fā)出專門且有效的抗HCV療法。
HCV包含一條長(zhǎng)約9600個(gè)核苷酸的正單鏈RNA基因組，編碼 多聚蛋白約含3010個(gè)氨基酸(參考文獻(xiàn)6)。該多聚蛋白前體伴隨或 翻譯后被細(xì)胞和病毒蛋白酶加工成至少10個(gè)成熟結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu) 蛋白(C, m, E2, p7, NS2, NS3, NS4A， NS4B, NS5A,和NS5B )(參考文 獻(xiàn)6和23 )。
IICV NS5B具有RNA依賴的RNA聚合酶活性(參考文獻(xiàn)2 ), 其被認(rèn)為在HCV基因組復(fù)制期間對(duì)于負(fù)鏈和病毒基因組RNA的合 成是至關(guān)重要的。因此，1ICVNS5B被認(rèn)為是病毒增殖必不可少的， 因而，是開發(fā)抗病毒藥物的首要靶(參考文獻(xiàn)18)。
RNAs的特征在于它們能夠釆用復(fù)雜而穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，特異地并且 容易地結(jié)合目標(biāo)蛋白，并且可以輕松地化學(xué)合成，使RNAs潛在地成 為非常有用的診斷和/或治療先導(dǎo)化合物(參考文獻(xiàn)4和8)。
短RNA配體，稱為.RNA適體，采用被稱為指數(shù)富集的配體系 統(tǒng)進(jìn)化(SELEX)(參考文獻(xiàn)7和28)的體外反復(fù)篩選技術(shù)，利用高 親和性和特異性結(jié)合到多種蛋白，從一個(gè)隨機(jī)RNA文庫(kù)中鑒別出來(lái)。
一些適體已成功地用動(dòng)物疾病模型進(jìn)行評(píng)估(參考文獻(xiàn)9 ， 24和26)，其中一些目前正處于治療的臨床開發(fā)階段(參考文獻(xiàn)27)。
值得注意的是，美國(guó)FDA最近批準(zhǔn)了抑制抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (VEGF)的RNA適體，稱為哌加他尼鈉(Macugen)，用于治療各 種類型的新生血管性老年性黃斑變性(參考文獻(xiàn)19),表明RNA適 體巨大的治療潛力。
最近已經(jīng)實(shí)現(xiàn)專門用于HCV NS5B的高親和性RNA適體的分離 和特征分析(參考文獻(xiàn)3和29)。盡管分離出的適體已被證明在體外 抑制RNA依賴的RNA聚合酶的酶活性，但沒有研究表明用抗HCV NS5B的RNA適體抑制細(xì)胞內(nèi)HCV的復(fù)制。
由本發(fā)明者進(jìn)行的深入和透徹的抑制細(xì)胞內(nèi)丙型肝炎病毒復(fù)制 的研究，導(dǎo)致本發(fā)明，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用于HCV NS5B RNA依賴的RNA 聚合酶的抗核糖核酸酶RNA適體能夠抑制人體肝癌細(xì)胞系中HCV

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的 一個(gè)目標(biāo)是提供一種能夠特異性地結(jié)合丙型肝炎病毒 (HCV)NS5B的RNA適體。
本發(fā)明的另 一 目標(biāo)是提供一種用于治療和診斷HCV感染的RNA 適體,其能夠特異性地結(jié)合丙型肝炎病毒NS5B和抑制HCV的復(fù)制。
本發(fā)明進(jìn)一步的目標(biāo)是提供診斷HCV感染的試劑盒和HCV的 抑制劑，其使用 一種能夠特異性地結(jié)合HCVNS5B并抑制IICV復(fù)制 的RNA適體。
根據(jù)其中的一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種能夠抑制HCV復(fù)制子復(fù) 制的抗核酸酶的RN A適體。
本發(fā)明的RNA適體是由至少 一個(gè)序列組成，選自包含SEQ ID NOS. 3和4的組，其中氟基團(tuán)取代IJ(尿嘧嚏)和C (胞嘧p定)堿基上的 2'-羥基，并且SEQ ID NO. 4以膽固醇基在5'末端和idT在3'末端標(biāo)記。 在肝細(xì)胞內(nèi)，抗核酸酶RNA適體發(fā)揮作用特異性地結(jié)合丙型肝炎病毒(HCV)NS5B并抑制HCV復(fù)制子的增殖。
來(lái)源于RNA適體SEQ ID NOS. 1和2的RNA的適體SEQ ID NOS. 3和4具有以下序列。
5'-GGGAGAGCGGAAGCGUGCUGGGCCUUGAACGAUUGGU
CGAUGGAUCCU-3' (SEQ ID NO. 1)
5'-GGGAGAGCGGAAGCGUGCUGGGCCGACAGGGUAGCUU
CGAUGGAUCCCCCC陽(yáng)3' (SEQ ID NO. 2)
5'-GCUGGGCCUUGAACGAUUGGUAGUAGAAUAUCGUCAG UGAACGGC誦3' ( SEQ ID NO. 3 )
5'-GUUGAACGAUUGGUAGUAGAAUAUCGUCAG-3' (SEQ ID NO. 4)
根據(jù)其中另 一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于診斷丙型肝炎病毒的試劑 盒，包含至少-一種RNA適體，篩選自包含SEQIDNOS. 3和4的組，
2'-羥基，并且SEQ
ID NO. 4以膽固醇基在5'末端和idT在3'末端標(biāo)記，借l^被 適體與HCVNS5B的特異性結(jié)合 -方面，
RNA
其能特異
..爪
l復(fù)制子的增 l篩選自包含SEQ
性地結(jié)合丙型肝炎病毒(IIC V)N S 5 B 殖，包括至少一種RNA適體，由至少 ID NOS. 3和4的組，其中氟基團(tuán)取代U (尿嘧啶)和C (胞嘧啶)堿基 上的2'-羥基，并且SEQ ID NO. 4以膽固醇基在5'末端和idT在3'末
述，IICV NS5B為RNA依賴的RNA聚合酶， 中主要的催化酶，從而被認(rèn)為可用作開發(fā)抗HCV
如—從包含40個(gè)隨機(jī)核苷酸序列的組合RNA文庫(kù)中，其中氟基團(tuán)取 代了羥基基團(tuán)在2'位置，以賦予RNAs核酸酶抗性，釆用SELEX技 術(shù)初步篩選出抗核酸酶的RNA適體。本發(fā)明的RNA適體被確定為 SEQ ID NO. 1 (RNA適體#9 )和SEQ ID NO.2 ( RNA適體#24 )。
然而文庫(kù)RNAs很難結(jié)合目標(biāo)蛋白，本發(fā)明的RNA適體(SEQ ID NO. l和SEQ ID NO.2)能夠以高親和力特異性地結(jié)合HCVNS5B， 其Kd值分別為18 nM和5 nM。
當(dāng)引入到肝癌細(xì)胞系Huh-7中時(shí)，觀察到本發(fā)明的RNA適體抑 制HCV亞基因組復(fù)制子的RNA合成，從而抑制HCV的復(fù)制。
在本發(fā)明中，RNA適體SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2的截短 結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兛梢岳喂痰亟Y(jié)合HCVNS5B。優(yōu)選的 RNA適體具有SEQ ID NO. 3 (RNA適體#9- tl)和SEQ ID NO. 4 (RNA適體#942)。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的RNA適體SEQ ID NO. 4 (RNA適體約-t2)只 有30nt大小，并以2.6 nM Kd值的高親和力結(jié)合NS5B,抑制1ICV 亞基因組復(fù)制子RNA的合成，比全長(zhǎng)的RNA適體(SEQ ID NO. l)更
在本發(fā)明中，進(jìn)一步地，優(yōu)選的RNA適體(Chol-RM9 t2)通過(guò)化
學(xué)合成。關(guān)于這一點(diǎn)，化學(xué)合成的RNA適體通過(guò)膽固醇基在5'末端 標(biāo)記以滲透到細(xì)胞中并以idT (反脫氧胸苷)在3 '末端標(biāo)記。當(dāng)和 IIuh-7細(xì)胞孵育，觀察到這些修飾的優(yōu)化RNA適體以劑量依賴的方 式抑制IICV亞基因組復(fù)制子的RNA合成，比無(wú)法結(jié)合NS5B的突變
因此，本發(fā)明的RNA適體在診斷和治療IICV，以及作為工具用 于研究RNA依賴的RNA聚合酶將是有益的。
如上所述，抗核酸酶的RNA適體抑制I-ICV NS5B RNA依賴的 RNA聚合酶是通過(guò)SELEX技術(shù)鑒定的。這些適體以納摩爾結(jié)合常數(shù)特異性地并非常容易結(jié)合靶蛋白。重要的是，當(dāng)引入人體肝細(xì)胞中時(shí)，
該RNA適體可部分抑制細(xì)胞內(nèi)HCV復(fù)制子的RNA合成。
近來(lái)，除了 NS5BRNA復(fù)制酶， 一些研究報(bào)告了分離RNA適體 抗其他HCV調(diào)節(jié)蛋白，如NS3解旋酶結(jié)構(gòu)域(參考文獻(xiàn)lO和ll) 或NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域(參考文獻(xiàn)13)。然而，這種適體含有普通的2 '-羥基，因此，該適體必須利用其cDNA對(duì)應(yīng)部分表達(dá)以抑制HCV 的復(fù)制(參考文獻(xiàn)20)，這將給抗病毒制劑開發(fā)的應(yīng)用帶來(lái)巨大的困 難。相比之下，在本發(fā)明中開發(fā)的抗核酸酶RNA適體的明顯優(yōu)勢(shì)在 于該適體可被直接轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞，類似于小的化合物。，
顯而易見地，通過(guò)優(yōu)化本發(fā)明的RNA適體中獲得的該適體(RNA 適體#9-t2) SEQIDNO. 4，只有30nt大小，因而可以容易地化學(xué)合 成，并且在實(shí)際應(yīng)用中將是非常有效的。
此外，這種由優(yōu)選適體(SEQ ID NO. 4 )經(jīng)膽固醇基在5 '末端和 idT在3 '末端化學(xué)修飾得到的適體結(jié)構(gòu)(Chol-RM9 t2 )，可以抵抗核 酸酶并且可以通過(guò)細(xì)胞膜。因此，當(dāng)施用于細(xì)胞時(shí)，本發(fā)明的該適體 能有效地抑制HCV的復(fù)制。
該適體的進(jìn)一步修飾，比如phosphothioate鍵或末端PEG (聚乙 二醇)標(biāo)簽，將增加其治療潛力(參考文獻(xiàn)5)。
除了治療劑，該RNA適體可用作HCV感染的診斷探針以及作 為遺傳學(xué)工具以探討在HCV增殖期間HCV NS5B在細(xì)胞內(nèi)的作用。


優(yōu)點(diǎn)。圖1顯示的是篩選出的2'-氟RNA適體預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)； 圖2表明篩選出的2'-氟RNA適體結(jié)合HCV NS5B; 圖3表明高親和性的2'-氟RNA適體結(jié)合HCV NS5B復(fù)制酶； 圖4表明2'-氟RNA適體抑制HCV復(fù)制子的復(fù)制；圖6表明優(yōu)選的(截短的)2'-氟RNA適體抑制HCV復(fù)制子的 復(fù)制；
圖7顯示的是化學(xué)合成的、優(yōu)選的2'-氟RNA適體，Chol-RM9t2
的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)；
圖8顯示的是化學(xué)合成的適體，Chol-RM9 t:2 RNA適體和 Chol-Mu-RM912 RNA適體的序列及結(jié)構(gòu)；
圖9表明化學(xué)合成的適體，Chol-RM9 t2 RNA適體和 Chol-Mu-RM9 t2RNA適體，抑制HCV復(fù)制子的復(fù)制。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合附圖進(jìn)一步說(shuō)明。首先，根據(jù)本發(fā)明測(cè)定該RNA適體的 序列并用于特征分析，接著是其實(shí)施例的說(shuō)明。 1、制備RNA適體
SELEX技術(shù)是用于制備RNA文庫(kù)所必須的，使用以下5 '引物 (SEQ ID NO. 5 )和3 '引物(SEQ ID NO. 6 )，以40個(gè)隨機(jī)堿基的 76-mcr單鏈寡核苷酸作為模板，通過(guò)PCR技術(shù)構(gòu)建DNA文庫(kù)。5 ' 引物含有T7啟動(dòng)子區(qū)域用于RNA合成。
GG-3' (SEQ ID NO . 5)
5'-GGGGGGATCCATCGACCTCTGGGTTATG-3' (SEQ ID NO. 6) 關(guān)于這一 點(diǎn)，pcr溶液制備包含0.25 m m 5 '引物，0.25 ju m 3 '引物，
10XPCR緩沖液和100 jaMdNTP。在2.5單位Taq聚合酶(Promega)的
條件下，經(jīng)過(guò)最初95 。C變性5分鐘后，PCR在95。C 30秒，55°C 30秒，
72°C l分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，接著是72°C延伸8分30秒以生成DNA文庫(kù)。
RNA文庫(kù)的制備釆用T7 RNA聚合酶(Takara)通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄上 述制備的DNA文庫(kù)。關(guān)于這一點(diǎn)，生成隨機(jī)的抗核酸酶RNA寡核苷酸，每一個(gè)嘧嗖由氟基團(tuán)在其2'位置修飾，通過(guò)2'-脫氧-2'-氟CTP 和UTP (Epicentre Technologies)和普通的GTP, ATP和T7 RNA聚合
酶，體外轉(zhuǎn)錄合成的DNA模板(參考文獻(xiàn)25)。
更詳細(xì)地，50 jil由DNA文庫(kù)，5X轉(zhuǎn)錄緩沖液，50mMDTT， 0.5 mM ATP， GTP, 2'-氟CTP， 2'-氟UTP, T7 RNA聚合酶(Takara),以 及DEPC-水組成的混合物，于37 。C反應(yīng)3小時(shí)。通過(guò)5U RQ1 DNaseI(Promega)于37 'C對(duì)DNA模板進(jìn)行消化30分鐘后，使用 Sephadex (sigma)提取RNA文庫(kù)。從7M尿素-6 %聚丙烯酰胺凝膠中 回收SELEX獲得的RNA。
所 產(chǎn) 生 的 RNA 文 庫(kù) 序 列 為 5'-GGGAGAGCGGAAGCGUGCUGGGCC N40 CAUAACCCAGAGGUCGAUGGAUCCCCCC-3'，其中Hu)代表在每 個(gè)位置上A、 G、 C和U等摩爾摻入的40個(gè)核苷酸(nts)。
HCV NS5B RNA依賴的RNA聚合酶的重組片段被克隆到pET21 表達(dá)載體上(Novagcn),其表達(dá)出的重組蛋白在C -末端具有六個(gè)組 氨酸標(biāo)簽。蛋白在大腸桿菌BL21 (DI:;3)中過(guò)量表達(dá)，并通過(guò)鎳螯合 樹脂(Ni-NTA瓊脂糖)進(jìn)行純化(參考文獻(xiàn)22)。
釆用SELEX技術(shù)分離對(duì)HCV NS5B特異性的帶有 一 些修飾的抗 核糖核酸酶RNA適體(參考文獻(xiàn)1， 10和25)。首先，lOug的RNA 文庫(kù)和20 jul Ni-NTA瓊脂糖珠在100 )i 1的結(jié)合緩沖液(30 mM Tris -鹽酸,pH值7.5 ， 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl 2， 2 mM 二硫蘇 糖和1 y。BSA)中于室溫?fù)u動(dòng)30分鐘，進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。然后沉淀該RNA-珠復(fù)合物并去除任何非特異性地結(jié)合于瓊脂糖珠的RNA。
將預(yù)先處理的上清轉(zhuǎn)移至新管中，接著與組氨酸標(biāo)記的HCV NS5B于室溫孵育30分鐘。該NS5B - RNA復(fù)合物通過(guò)凝珠沉淀，并 以0.5 ml的結(jié)合緩沖液洗滌顆粒5次。
回收該RNA，用RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增及體外轉(zhuǎn)錄，并用于多于7輪的篩選。經(jīng)過(guò)8輪的篩選后，克隆擴(kuò)增的DNA，并對(duì)14個(gè)克隆子
進(jìn)行了測(cè)序。
2、 RNA適體的結(jié)合特異性
前面篩選的RNA適體中心以[a-32P] ATP標(biāo)記。關(guān)于這一點(diǎn)， 在[a - 32P]ATP的條件下利用T7 RNA聚合酶由cDNA克隆產(chǎn)生RNA適體。
在95°C變性2分鐘后，通過(guò)7M尿素-6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分 離RNA片段，然后暴露于X光片下3分鐘。參照沖洗的X光片切下 感興趣的RNA條帶，用400jj1的洗脫緩沖液于37'c洗脫3小時(shí)。洗 脫的RNA通過(guò)苯酚提取和乙醇沉淀進(jìn)行分離和濃縮，接著用液體閃
爍計(jì)數(shù)器進(jìn)行定量分析。
然后，檢測(cè)該RNA適體對(duì)丙型肝炎病毒NS5B的結(jié)合特異性。 最后，1 nM該RNA和100nM NS5B在100 ju 1結(jié)合緩沖液中(30 mM Tris-鹽酸(pH7.5)， 150mMNaCl， 1.5mMMgCl2， 2mMDTT)，于
室溫孵育30分鐘。
在以Ni-NTA瓊脂糖珠沉淀后，NS5B - RNA復(fù)合物用0.5 ml結(jié) 合緩沖液洗滌五次。該結(jié)合RNA用15pl0.1MEDTA和苯酚從顆粒 中提取出來(lái)。通過(guò)乙醇沉淀獲得的該RNA濃縮物，用含尿素的6 %
結(jié)果，制備出根據(jù)本發(fā)明的RNA適體SEQ ID NO. 1 ( RNA適體 #9 )和SEQ ID NO. 2 (RNA適體#24)。
3、 截短RNA適體的構(gòu)建
截短形式的RNA適體SEQ ID NO. l( RNA適體#9 )和SEQ ID NO. 2 (RNA適體#24)使用T7聚合酶通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄構(gòu)建，具體如下。
應(yīng)用PCR，分別使用SEQ ID NOS. 7和8的5'和3 '引物擴(kuò)增RNA 適體將-tl (SEQ ID NO. 3)，分別使用SEQ ID NOS. 9和10的3 '引物 擴(kuò)增RNA適體# 9-t2 (SEQ ID NO. 4)，以及分別使用SEQ ID NOS. 11和12的3 '引物擴(kuò)增脂A適體#943 (SEQ ID NO. 3)。
5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGCTGGGCCTTGAACGAAT GGTAG-3' (SEQ ID NO . 7 )
5陽(yáng)GCCGTTCACTGACGATATTCTACTACCAATCGTTCAAGG陽(yáng)3' (SEQ ID NO . 8 )
5 '-GGTAATACGACTCACTATAGGGTTGAACGATTGGTA-3 ' (SEQ ID NO . 9)
5 ' -CTGACGATATTCTACTACCAATCGTTCAACCCTATA-3 ' (SEQ ID NO 10)
5'隱GGTAATACGACTCACTATAGGGAACGATTGGTA-3'(SEQ ID
NO. 11)
5'-ACGATATTCTACTACCAATCGTTCCCTATAGTG-3'(SEQ ID NO. 12)
使用T7 RNA聚合酶通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增的雙鏈DNA，生成每一 個(gè)嗜p定在2'位置由氟基團(tuán)修飾的RNA。通過(guò)10%變性尿素凝膠電泳 分離所述RNA。
結(jié)果，SEQ ID NO. 3 (RNA適體#941)和SEQ ID NO. 4 (RNA適
體#9 -t2 )被認(rèn)為是理想的應(yīng)用于本發(fā)明中。 4、 RNA適體的合成
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的RNA適體#942 (含2'-氟嘧啶)的合成釆用標(biāo) 準(zhǔn)固相亞礫胺化學(xué)法，并釆用HPLC (高效液相色譜法)純化。
這時(shí)，不能結(jié)合到NS5B的突變適體也被合成。優(yōu)選的適體和突 變的適體用idt (反向胸苷)在3 '端標(biāo)記以保護(hù)它們免受核酸酶的降 解，以及用膽固醇基在5'端標(biāo)記以通過(guò)細(xì)胞膜。
修飾適體的合成以1 mmol的量采用idTCPG (固相支持)進(jìn)行。 為使膽固醇基結(jié)合到5 '端，使用了膽固醇三甘醇amidite (1-dimethoxytrityloxy基-3-氧-(N -膽固醇基-3-氨丙基)-三甘醇基-甘油基-2-氧-(2-氰乙基)隱(N，N-二異丙基)-亞磷酰胺)。
結(jié)合膽固醇基的適體通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳，高效液相色譜和
飛行時(shí)間質(zhì)譜確定，釆用CentriSep ( Princeton Separations Inc.)通過(guò)
沉淀和脫鹽的方法分離，并在實(shí)驗(yàn)使用前溶解于水中。最后化學(xué)合成 的優(yōu)選適體和突變適體，分別命名為Chol-RM9t2和Chol-Mu-RM9 t2。
5、 RNA適體結(jié)合親和性檢測(cè)
(1) 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)
內(nèi)部放射性標(biāo)記的RNA適體(50 pM )與不斷增量(0 - 320 nM) 的NS5B發(fā)生反應(yīng)。為此，將適體，蛋白，結(jié)合緩沖液(30mMTris-鹽酸(pH 7.5), 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2， 2 mM DTT )，以及3 HgtRNA混合，以達(dá)到總體積40ial，然后于室溫培養(yǎng)30分鐘。加 入6XBPB，電泳使用6 %基礎(chǔ)凝膠(6。/。聚丙烯酰胺，1XTBE, 10mM MgC12,2。/。甘油)，于40° C120V電壓下進(jìn)行。凝膠經(jīng)過(guò)X光片曝 光后，進(jìn)行沖洗。NS5B結(jié)合的RNA適體占總RNA適體的比例通過(guò) 計(jì)算解離常數(shù)(Kd)而測(cè)定。
(2) SPR分析
Biacore 2000的CM5傳感芯片的激活是通過(guò)注射50 Ml等體積 的NIIS和DKC的混合物，流速為5 s/min持續(xù)40秒。當(dāng)出現(xiàn)150 - 200 RU時(shí)，將要進(jìn)行固定的蛋白用醋酸鈉(pII4.0)稀釋至濃度50ng/Mg， 然后注射。隨后，注射50mMNaOH5秒鐘以檢測(cè)是否可以準(zhǔn)確地實(shí) 現(xiàn)配體固定。該RNA適體于8(TC變性5分鐘并于室溫復(fù)性15分鐘 以制備用作分析目標(biāo)的RNA標(biāo)本。流速改為30 s/min，以獲得的動(dòng) 力學(xué)分析目標(biāo)。注射分析目標(biāo)在1XIIBS中的稀釋液，濃度介于6.25 nM和500 nM之間。在每一步中，使用50mM NaOH進(jìn)行復(fù)性。在 配體和分析目標(biāo)之間的平衡解離常數(shù)(Kd)設(shè)置在1:1之間后，使用 動(dòng)力學(xué)Ka / Kd模型程序從sensogram的Req值的情況獲得KD值。6、 RNA適體對(duì)HCV增殖的抑制
釆用最近開發(fā)的丙型肝炎病毒亞基因組復(fù)制系統(tǒng)(參考文獻(xiàn)12 和17)測(cè)定RNA適體在人體肝細(xì)胞中抑制HCV復(fù)制的能力。
從德國(guó)海德堡大學(xué)Ralf Bartenschlager博士處獲得亞基因組復(fù)制 子結(jié)構(gòu)，pFK-l 389 neo/NS3-3'/5.1 (參考文獻(xiàn)12)，其攜帶兩個(gè)細(xì)胞 培養(yǎng)自適應(yīng)突變，分別在NS3和NS5A上。通過(guò)AseI和Scal消化 的復(fù)制子質(zhì)粒的體外轉(zhuǎn)錄構(gòu)建HCV復(fù)制子RNA,如(參考文獻(xiàn)IO) 所述。
為確定篩選的RNA是否抑制細(xì)胞內(nèi)HCV的復(fù)制，在與HCV復(fù) 制子RNA和各種竟?fàn)嶳NA共轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，通過(guò)RT - PCR定量測(cè) 定肝癌Huh-7細(xì)胞中合成HCV負(fù)(-)鏈RNA的水平。
釆用基因脈沖系統(tǒng)(BioRad)，在950 nF， 250V的條件下，進(jìn)行 電擊實(shí)驗(yàn)使RNA轉(zhuǎn)染至含有500 ng丙型肝炎病毒復(fù)制子RNA及5 jjg tRNA的4 x io6 Huh-7細(xì)胞懸浮液中。編碼海腎熒光素酶的質(zhì) 粒pcDNAluc，也被加入每個(gè)樣本，以評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。
每個(gè)樣本中近似的轉(zhuǎn)染效率通過(guò)對(duì)熒光素酶基因進(jìn)行RT-PCR分
轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，分離出總RNA并使用HCV cDNA負(fù)鏈特異3' 引物(5'- GGGGAATTCCGTAACACCAACGGGCGC : SEQ ID NO. 13 )或用于(3 -actin cDNA的隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。
使用 HCV(-)鏈 cDNA 特異 5'弓|物 (5'-GGGAAGCTTCTCGTCCTGCAGTTCAT : SEQ ID NO. 14 )和3 '引 物擴(kuò)增獲得的cDNA30個(gè)循環(huán)。數(shù)值被歸一化為P-actin的數(shù)值，其 擴(kuò) 增 使 用 5' 引物 (5' -
ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG : SEQ ID NO. 15) 和3 '引物(5' - CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC : SEQ ID NO. 16)。在Huh-7細(xì)胞中觀察到pFK-I 389 neo/NS3-3'/5.1 RNA亞基因組 復(fù)制子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定復(fù)制，而化學(xué)合成的RNA適體(Chol-RM9t2)抑 制HCV亞復(fù)制子RNA的復(fù)制。
含有HCV亞基因組復(fù)制子的H uh-7細(xì)胞，和不同濃度的 Chol-RM9 t2和Chol-Mu-RM9 t2適體于37° C孵育。經(jīng)過(guò)48小時(shí)的 孵育，分離總RNA并進(jìn)行實(shí)時(shí)RTPCR，以觀測(cè)HCV亞基因組復(fù)制 子RNA復(fù)制受到抑制的程度。使用綠色熒光核心試劑盒 (SYBR-Green core reagent kit)連同Taq聚合酶(Takara)進(jìn)行實(shí)時(shí) RT-PCR。
當(dāng)使用上述的HCV cDNA負(fù)鏈的特異性引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增負(fù)鏈， 其在以適體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的數(shù)量和在模擬轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的數(shù)量進(jìn)行比 較。
負(fù)鏈HCV cDNA的擴(kuò)增根據(jù)PCR-kit手冊(cè)12.5 ml SYBR Green Mix (2x), 0.2 ml cDNA, 1 ml引物混合物(5 pmol / ml每種引物)， 和11.3 ml II20使用2 mg總RNA進(jìn)行。
PCR反應(yīng)為95° C 30秒，55° C 40秒和72° C 1分鐘，進(jìn)行 40個(gè)循環(huán)。
GAPDH基因作為PCR產(chǎn)物的看家對(duì)照基因，以便使通過(guò)HCV cDNA獲得的限制片段調(diào)整到通過(guò)GAPDH獲得的片段，以修正在 cDNA上樣中的最小波動(dòng)。擴(kuò)增時(shí)，使用Roter-Gene和實(shí)時(shí)PCR儀 (Corbctt)。
例l :對(duì)HCVNS5B特異的抗核糖核酸酶RNA適體的篩選 生成大約含10"不同分子的RNA寡核苷酸隨機(jī)池，每一個(gè)嘧嚏 在2'位置由氟基團(tuán)修飾，用于對(duì)HCV NS5B特異的RNA適體的篩選。 RNA2'位置的修飾，增加了其在人體血清中的穩(wěn)定性，是未修飾的 2'-羥基RNA穩(wěn)定性的10,000倍之多(參考文獻(xiàn)15,16和25 )。此外，內(nèi)螺旋，形成熱力學(xué)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)和堅(jiān)固的三級(jí)結(jié)構(gòu)(參考文獻(xiàn)21)。
SELEX的結(jié)果是，篩選的2'-氟RNA適體主要分為兩組，分別 命名為#9 (SEQ ID NO. 1)和#24 (SEQ ID NO. 2)。兩組適體包含完全 不同的篩選序列。預(yù)測(cè)它們具有穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如圖1所示，使用 MULFOLD程序(參考文獻(xiàn)30 )。
預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)還表明，兩組適體具有不同的構(gòu)造。篩選的RNA弁9 由一個(gè)頂點(diǎn)莖環(huán)組成。相比之下，篩選的RNA #24含有兩個(gè)頂點(diǎn)莖 環(huán)結(jié)構(gòu)。
篩選自RNA文庫(kù)隨機(jī)區(qū)域的兩種適體序列，存在于這些頂點(diǎn)莖 環(huán)部分，表明頂點(diǎn)莖環(huán)構(gòu)造可能直接參與結(jié)合NS5B 。
圖1表明經(jīng)過(guò)8輪的體外篩選后從14個(gè)篩選的RNA適體確定的 序列。在這些克隆中發(fā)現(xiàn)兩種不同的RNA序列，#9和#24分別存 在于例8和例6中。在本圖中，C和U分別對(duì)應(yīng)于2'-氟C和2'-氟U。 使用MULFOLD程序確定穩(wěn)定的RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)。SEQ IDNOS. 1和 2的RNAs中核苷酸25至64表示選自RNA文庫(kù)隨機(jī)區(qū)域的序列。
例2 : RNA適體的結(jié)合特異性
為評(píng)價(jià)篩選的RNA適體2'-氟結(jié)合特異性，對(duì)例1中篩選的分子 內(nèi)放射標(biāo)記的RNA適體(圖2)進(jìn)行沉淀實(shí)驗(yàn)。如上所述將標(biāo)記和 純化的RNA與蛋白孵育，接著提取結(jié)合的RNA。
圖2表明篩選的2'-氟RNA適體結(jié)合HCV NS5B。 lnM分子內(nèi)放 射標(biāo)記起始RNA文庫(kù)，RNA適體#9，或RNA適體#24和含有(+E) 或不含NS5B(-E)的NS5B(100nM)孵育，RNA-蛋白復(fù)合物用Ni-NTA 凝珠沉淀。結(jié)合的RNA用含尿素的6 %聚丙烯酰胺凝膠提取和分析。 帶I含有10 %的每一個(gè)插入標(biāo)記的RNA。
從圖2數(shù)據(jù)中可以看出，起始的含2'-氟嘧嚏的RNA文庫(kù)既不和 Ni-NTA凝珠結(jié)合又不和目標(biāo)HCVNS5B蛋白結(jié)合(帶1-3)，而篩選 的RNA適體#9和#24顯示出結(jié)合丙型肝炎病毒NS5B (帶4-9)。顯而易見地，篩選的RNA適體#24比篩選的RNA適體#9更加牢固地 結(jié)合目標(biāo)蛋白。這可能是因?yàn)楹Y選的RNA適體#24以更高的親和性 結(jié)合HCV NS5B。
此外，篩選的RNA適體無(wú)法結(jié)合其他His-標(biāo)記的HCV蛋白， 比如NS3解旋酶，從而排除可能的非特異性結(jié)合NS5B蛋白的組氨 酸部分，而且，表明了適體和目標(biāo)丙型肝炎病毒NS5B的專一性反應(yīng)。
例3 : RNA適體的結(jié)合親和性
使用痕量標(biāo)記的RNA適體和不斷增量的RNA依賴的RNA聚合 酶(圖3 )進(jìn)行凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定篩選的RNA適體-丙型肝炎病毒 NS5B相互作用的親和性。關(guān)于這一點(diǎn)，將放射標(biāo)記的RNA適體和 目標(biāo)蛋白孵育用于凝膠轉(zhuǎn)換分析。
圖3表明篩選的RNA適體結(jié)合HCVNS5B復(fù)制酶的高親和性。 將分子內(nèi)放射標(biāo)記的RNA適體#9(50 pM,圖3A)或RNA適體#24 (50 pM,圖3B)和不斷增量的HCV NS5B復(fù)制酶(0-320 nM)進(jìn)行孵育。產(chǎn) 生的NS5B-RNA復(fù)合物，C，通過(guò)4%非變性聚丙烯酰胺凝膠從未結(jié) 合的游離RNA、 F中被分離出來(lái)。
圖3C中RNA結(jié)合丙型肝炎病毒NS5B的百分比通過(guò)確定存在 于RN A -丙型肝炎病毒N S 5 B復(fù)合物中的放射部分計(jì)算出來(lái)。顯示的 數(shù)值代表了三種不同的測(cè)量方法。
從圖3中數(shù)據(jù)可以看出，起始的RNA文庫(kù)，含有40-nt長(zhǎng)度的 隨機(jī)序列，顯示出與丙型肝炎病毒NS5B低親和性，即使在最高的蛋 白濃度下。相比之下，篩選的2'-氟RNA適體弁9和弁24分別有效地與 丙型肝炎病毒NS5B以劑量依賴的方式形成轉(zhuǎn)換的核蛋白復(fù)合物，并 表現(xiàn)出高親和性，表觀解離常數(shù)(Kd)分別為約18nM和5nM。顯而 易見地，篩選的RNA弁24結(jié)合目標(biāo)蛋白是RNA糾的4倍，表明篩選 的RNA#24更有效的結(jié)合活性。本發(fā)明篩選的RNA適體，觀察到其以高親和力特異性結(jié)合
HCVNS5B,釆用最近開發(fā)的丙型肝炎病毒亞基因組復(fù)制系統(tǒng)(參考 文獻(xiàn)文獻(xiàn)12和17)(圖4)評(píng)價(jià)它們?cè)谌梭w肝細(xì)胞中抑制HCV復(fù)制 的活性。
為確定篩選的RNA適體是否抑制細(xì)胞內(nèi)HCV的復(fù)制，在與HCV 復(fù)制子RNA和各種竟?fàn)嶳NA共轉(zhuǎn)染后，通過(guò)RT-PCR 72小時(shí)進(jìn)行 定量測(cè)定肝癌Huh-7細(xì)胞中合成HCV負(fù)(-)鏈RNA的水平。將細(xì)胞 中單獨(dú)以HCV復(fù)制子轉(zhuǎn)染的丙型肝炎病毒RNA的量和細(xì)胞中以丙 型肝炎病毒復(fù)制子以及各種竟?fàn)嶳NA轉(zhuǎn)染的丙型肝炎病毒RNA的 量進(jìn)行比較。電擊實(shí)驗(yàn)用于測(cè)定RNA轉(zhuǎn)染至Huh-7細(xì)胞，使用HCV 復(fù)制子RNA以及tRNA,或者以抗不相關(guān)目標(biāo)蛋白的RNA適體，比 如引起重癥肌無(wú)力的自身抗體(MGRNA適體)(參考文獻(xiàn)25)，或以 篩選的RNA適體存9或#24。經(jīng)過(guò)72小時(shí)的轉(zhuǎn)染，分離總RNA并進(jìn) 行反轉(zhuǎn)錄用于擴(kuò)增(-)鏈HCV cDNA或卩-actin cDNA。數(shù)值被歸 一化 為|3-actin的數(shù)值。
圖4中的圖表說(shuō)明篩選的2'-氟RNA適體對(duì)丙型肝炎病毒復(fù)制子 復(fù)制的抑制。Huh-7細(xì)胞被空白轉(zhuǎn)染，或轉(zhuǎn)染無(wú)任何競(jìng)爭(zhēng)RNAs(w/o RNA)的I-ICV亞基因組復(fù)制子RNA，或以MG適體RNA，篩選的 RNA適體#9，或RNA適體#24轉(zhuǎn)染。IICV(-)亞基因組RNA鏈通過(guò) RT-PCR擴(kuò)增。通過(guò)PCR而不進(jìn)行RT(w/o RT),沒有cDNA從轉(zhuǎn)染 RNA適體弁24的細(xì)胞中被擴(kuò)增出來(lái)。加載擴(kuò)增的p-actin cDNA作為 內(nèi)對(duì)照。IICV RNA值首先被歸 一 化為(3-actin的量，然后HCV RNA 的水平表現(xiàn)出和細(xì)胞中單獨(dú)以丙型肝炎病毒復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染的水平 相關(guān)。分三次測(cè)量的平均值被顯示出來(lái)。
如圖4表明，非特異性RNA比如tRNA幾乎沒有影響到HCV亞 基因組RNA合成。相比之下，RNA適體糾和RNA適體#24對(duì)于 I-ICVNS5B，抑制IICV復(fù)制子RNA的合成分別達(dá)到27%和47% 。不相關(guān)的2'-氟MG RNA適體不能保護(hù)肝細(xì)胞免受HCV復(fù)制子 RNA復(fù)制的影響，其強(qiáng)烈表明本發(fā)明篩選的RNA對(duì)丙型肝炎病毒復(fù) 制的抑制主要是由于篩選的RNA適體和細(xì)胞中丙型肝炎病毒復(fù)制子 表達(dá)的丙型肝炎病毒NS5B的特異性反應(yīng)(圖2和3 )。
根據(jù)對(duì)篩選RNA結(jié)合能力和親和力的分析，篩選的RNA適體 #24抑制丙型肝炎病毒復(fù)制子RNA的復(fù)制比RNA適體#9更有效(圖 4)。這表明RNA適體抑制丙型肝炎病毒復(fù)制的生物活性可以通過(guò)增 強(qiáng)適體對(duì)目標(biāo)丙型肝炎病毒蛋白的結(jié)合親和力而提高。
例5: RNA適體的優(yōu)化
篩選的適體約和#24分別為89-nt和92-nt，它們太長(zhǎng)不易于 化學(xué)合成。已知當(dāng)RNA適體為40-nt或更小時(shí)(參考文獻(xiàn)26)易于 化學(xué)合成。此外，由于它們可形成各種結(jié)構(gòu)的構(gòu)型，長(zhǎng)RNA適體通 常不被認(rèn)為是優(yōu)選的。
進(jìn)行實(shí)驗(yàn)用于優(yōu)化篩選的RNA適體，通過(guò)將它們變短。最后， 條選的RNA適體(#9和#24)的截短形式是通過(guò)使用T7聚合酶進(jìn)行體
觀察到短的RNA適體#24具有較低的親和性，表明全長(zhǎng)(92nt)形 式的RNA適體粒4是理想的?？紤]到化學(xué)合成，因而RNA適體弁24 盡管對(duì)目標(biāo)蛋白具有高親性，不是優(yōu)選的。
構(gòu)建三種不同截短形式的RNA適體弁9 (圖5A)。
RNA適體#941大小為45 nt，相當(dāng)于RNA適體#9序列的核苷酸 17-61，由頂點(diǎn)莖環(huán)和中間凸起環(huán)組成。
RNA適體#942大小為30 nt，相當(dāng)于RNA適體#9序列的核苷酸 25-53，由頂點(diǎn)莖環(huán)組成。
RNA適體#943大小為23 nt，相當(dāng)于RNA適體#9序列的核苷酸 28-50，由部分頂點(diǎn)莖環(huán)組成。
使用SPR技術(shù)(圖5B )分析這些RNA適體對(duì)HCV NS5B結(jié)合親和性。如所見，RNA文庫(kù)顯示出KD值高達(dá)933 nM,而#9-13的 KD值僅為40.4 nM，表明部分序列的頂點(diǎn)莖環(huán)不能單獨(dú)表現(xiàn)出高親 和性。相比之下，觀察到糾-tl和#942分別以8.4 nM和2.6 nM KD 值較好地結(jié)合NS5B。
顯而易見地，RNA適體#9-t2,其僅由頂點(diǎn)莖環(huán)組成，被認(rèn)為是 優(yōu)選的，因?yàn)樗员热L(zhǎng)RNA適體弁9具有更高的親和性結(jié)合丙型肝 炎病毒NS5B，除此之外，它含30nt。
圖5A顯示的是釆用MULFOLD程序測(cè)定(參考文獻(xiàn)30)的穩(wěn) 定的二級(jí)RNA結(jié)構(gòu)。在本圖中，C和U分別對(duì)應(yīng)于2'-氟胞嘧啶和 2'-氟尿嘧啶。RNA中核苷酸25至64表示來(lái)自的RNA文庫(kù)隨機(jī)區(qū)域 的序列。在圖5B中，總結(jié)了通過(guò)SPR分析而確定的RNA適體對(duì)丙 型肝炎病毒NS5B的KD值。
例6:優(yōu)化的RNA適體對(duì)HCV復(fù)制的抑制
進(jìn)行類似于圖4插圖的實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)例5中優(yōu)化的RNA適體約-t2 是否有效地抑制IICV的復(fù)制。釆用IICV亞基因組復(fù)制系統(tǒng)，評(píng)價(jià) 本發(fā)明優(yōu)化的RNA適體在人體肝細(xì)胞中抑制丙型肝炎病毒復(fù)制的活 性(參考文獻(xiàn)12和17 )(圖6 )。 HCV復(fù)制子RNA和各種RNA適體 轉(zhuǎn)染至肝癌I-Iuh-7細(xì)胞中。經(jīng)過(guò)72小時(shí)的轉(zhuǎn)染，分離總RNA并進(jìn)行 反轉(zhuǎn)錄用于擴(kuò)增(-)鏈的丙型肝炎病毒cDNA或用于擴(kuò)增卩-actin cDNA。數(shù)值被歸 一化為卩-actin的數(shù)值。
圖6表明截短形式的RNA適體對(duì)丙型肝炎病毒復(fù)制子復(fù)制的抑 制。1Iuh-7細(xì)胞被模擬轉(zhuǎn)染，或用丙型肝炎病毒亞基因組復(fù)制子RNA 轉(zhuǎn)染而無(wú)任何競(jìng)爭(zhēng)RNAs (w/o RNA)，或用RNA適體#9 ，或截短形 式，RNA適體#9-tl，#9-t2或#943#24轉(zhuǎn)染。丙型肝炎病毒(-)亞基因 組RNA鏈通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增。丙型肝炎病毒(-)RNA值首先被歸一化 為(3-actin RNA的量，然后丙型肝炎病毒RNA的水平表現(xiàn)出和細(xì)胞 中單獨(dú)以丙型肝炎病毒復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染的水平相關(guān)。分三次測(cè)量的平均值被顯示出來(lái)。
如圖6所示，RNA適體#9對(duì)于丙型肝炎病毒NS5B顯示出抑 制丙型肝炎病毒復(fù)制子RNA的合成高達(dá)30。/。，如圖4所示。至于約-t3， 其缺少對(duì)NS5B的親和性，被認(rèn)為抑制丙型肝炎病毒復(fù)制子RNA的 合成高達(dá)15%。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明結(jié)合親和性的減少導(dǎo)致抑制丙型肝炎病 毒復(fù)制能力的減弱。
相比之下，#9-tl顯示出抑制丙型肝炎病毒復(fù)制子RNA合成高達(dá) 38%。進(jìn)一步地，RNA適體#942，其僅為30 nt,顯示出抑制高達(dá) 53%。這些數(shù)據(jù)表明截短形式的RNA適體#9比全長(zhǎng)的適體抑制丙 型肝炎病毒復(fù)制更有效，并且截短的RNA適體比全長(zhǎng)的RNA適體 具有更高的結(jié)合目標(biāo)蛋白的親和性，抑制丙型肝炎病毒復(fù)制的活性也 增強(qiáng)。
顯而易見地，優(yōu)化的RNA適體#942在抑制丙型肝炎病毒復(fù)制 中是非常有益的，因?yàn)樗銐蛐∫子诨瘜W(xué)合成，對(duì)丙型肝炎病毒NS5B
例7:化學(xué)合成的RNA適體對(duì)丙型肝炎病毒復(fù)制的抑制 上述優(yōu)選的RNA適體#942被化學(xué)合成并測(cè)定其對(duì)丙型肝炎病 毒復(fù)制的抑制。該適體用idT在3'末端標(biāo)記以防止其被核酸外切酶降 解。同時(shí)用膽固醇基在5'末端標(biāo)記以通過(guò)細(xì)胞膜而無(wú)需任何轉(zhuǎn)染子的
圖7顯示是期望的Chol-RM9 t2結(jié)構(gòu)， 一種根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的 RNA適體#942的化學(xué)合成形式。
而且，優(yōu)選的RNA適體糾-t2被化學(xué)合成，并以膽固醇基和idT 分別在5'末端和3'末端標(biāo)記。2'-F表示2'-氟取代2'-羥基的嘧P定核苷
不能結(jié)合NS5B的化學(xué)合成RNA適體(Chol-RM9 t2)和突變RNA 適體(Choi-Mu-RM9 t2;僅是環(huán)序列與Chol-RM9 t2不同)的序列和結(jié)
20構(gòu)，顯示于圖8。
為檢測(cè)Chol-RM9t2是否有效地抑制丙型肝炎病毒的復(fù)制，進(jìn)行 圖9所示實(shí)驗(yàn)。關(guān)于這一點(diǎn)，當(dāng)化學(xué)合成的RNA適體Chol-RM9 t2
在缺少轉(zhuǎn)染子的條件下和丙型肝炎病毒亞基因組復(fù)制子穩(wěn)定復(fù)制的 Huh-7細(xì)胞系統(tǒng)發(fā)生反應(yīng)時(shí)，測(cè)定它們抑制丙型肝炎病毒復(fù)制的活性。
當(dāng)丙型肝炎病毒亞基因組復(fù)制子穩(wěn)定復(fù)制的Huh-7細(xì)胞被施以 各種濃度的Chol-RM9t2或Chol-Mu-RM9t2 48小時(shí)后，分離總RNA 并進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR以擴(kuò)增(-)鏈丙型肝炎病毒cDNA或擴(kuò)增GAPDH cDNA。數(shù)值被歸 一化為GAPDH的數(shù)值。
圖9表明化學(xué)合成的RNA適體對(duì)丙型肝炎病毒復(fù)制子復(fù)制的抑 制。Huh-7細(xì)胞被空白轉(zhuǎn)染，或被施以化學(xué)合成的RNA適體。接著， 丙型肝炎病毒(-)亞基因組RNA鏈通過(guò)實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增。丙型肝炎病毒 (-)RNA數(shù)值首先被歸一化為GAPDHRNA的量，然后表達(dá)的丙型肝 炎病毒RNA的水平與細(xì)胞中空白轉(zhuǎn)染的水平相比較。分別進(jìn)行五次 實(shí)驗(yàn)，數(shù)值顯示為平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
如圖9所示，當(dāng)對(duì)細(xì)胞施以高濃度的突變RNA適體時(shí)，沒有探 測(cè)到對(duì)丙型肝炎病毒復(fù)制的影響。相比之下，發(fā)現(xiàn)Chol-RM9 t2以劑 量依賴方式抑制丙型肝炎病毒亞復(fù)制子RNA的復(fù)制，高達(dá)80%。觀 測(cè)到Chol-RM9 t2對(duì)抑制丙型肝炎病毒復(fù)制的IC50值約為2 mM。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明化學(xué)合成的RNA適體顯示出細(xì)胞通透性， 能有效抑制丙型肝炎病毒的復(fù)制，并且這種抑制是基于含有對(duì)NS5B 特異性序列的RNA適體的特異性相互作用，而不是基于粘附在RNA 適體上的膽固醇基的非特異性反應(yīng)。因此，化學(xué)合成的Chol-RM9t2 可被用作丙型肝炎治療應(yīng)用中有效的候選藥物，因?yàn)樗軌蛉菀椎耐?br> 工業(yè)應(yīng)用
如前所述，提供抗核酸酶RN A適體用于抑制丙型肝炎病毒復(fù)制子的復(fù)制。并且，本發(fā)明提供用于診斷丙型肝炎病毒感染的試劑盒，
使用RNA適體和制劑用于抑制丙型肝炎病毒。根據(jù)本發(fā)明的該RNA 適體，可抵抗核酸酶并抑制RNA-依賴的RNA聚合酶NS5B的活性， 其是丙型肝炎病毒復(fù)制主要的催化酶。該RNA適體以納摩爾水平結(jié) 合目標(biāo)蛋白(即，它們以高親和性特異地結(jié)合目標(biāo)蛋白)顯示出低的 結(jié)合常數(shù)。而且，當(dāng)導(dǎo)入人體肝細(xì)胞中時(shí)，本發(fā)明的RNA適體有效 地抑制丙型肝炎病毒RNA復(fù)制子RNA的合成。參考文獻(xiàn)
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權(quán)利要求
1、一種能特異性結(jié)合丙型肝炎病毒(HCV)NS5B并抑制HCV復(fù)制子增殖的抗核酸酶的RNA適體，由至少一個(gè)選自包含SEQ ID NOS.3和4的組的序列組成，其中用氟基團(tuán)取代U(尿嘧啶)和C(胞嘧啶)堿基上的2′-羥基，且以膽固醇基標(biāo)記SEQ ID NO.4的5′末端以及用idT標(biāo)記其3′末端。
2、 一種含有至少一種選自包含SEQ IDNOS. 3和4的組的RNA 適體的診斷HCV的試劑盒，其中用氟基團(tuán)取代U(尿嘧啶)和C (胞嘧 ^^)堿基上的2'-羥基，且以膽固醇基標(biāo)記SEQIDNO.4的5'末端以及 用idT標(biāo)記其3'末端，由此來(lái)檢測(cè)RNA適體與HCVNS5B的特異性 結(jié)合。
3、 一種能特異性地結(jié)合HCV NS5B并抑制HCV復(fù)制子增殖的 HCV的抑制劑，其包含至少 一種由至少 一個(gè)選自包含SEQ ID NOS. 3和4的組的序列組成的RNA適體，其中用氟基團(tuán)取代U (尿嘧啶)和 C (胞嘧啶)堿基上的2'-羥基，且以膽固醇基標(biāo)記SEQ ID NO. 4的5' 末端以及用idT標(biāo)記其3'末端。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于抑制HCV復(fù)制子復(fù)制的抗核酸酶的RNA適體。這種適體能特異性地結(jié)合HCV NS5B并抑制HCV復(fù)制子的增殖，其由至少一個(gè)選自包含SEQ ID NOS.3和4的組的序列組成，其中氟基團(tuán)取代U(尿嘧啶)和C(胞嘧啶)堿基上的2′-羥基，并且SEQ IDNO.4以膽固醇基在5′末端和idT在3′末端標(biāo)記。該RNA適體可用于HCV感染中的診斷和治療。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101605908SQ200780044401
公開日2009年12月16日 申請(qǐng)日期2007年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月28日
發(fā)明者李城煜, 李昌熩, 李詠柱, 林鍾勳, 申京淑 申請(qǐng)人:株式會(huì)社Bexcore;大元制藥株式會(huì)社