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      Mn/ca9剪接變體的制作方法

      文檔序號:439301閱讀:486來源:國知局

      專利名稱::Mn/ca9剪接變體的制作方法MN/CA9剪接變體發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)、生物化學(xué)工程、免疫化學(xué)和腫瘤學(xué)領(lǐng)域。更具體地說,本發(fā)明涉及MN基因—被認(rèn)為是癌基因的細(xì)胞基因,也稱為MN/CA9、CA9或碳酸酐酶9,該基因編碼現(xiàn)在也稱為MN蛋白的癌蛋白、MN/CAIX同功酶,MN/CAIX、碳酸酐酶IX、CAIX或MN/G250蛋白。更具體地說,本發(fā)明涉及一種以其他方式剪接的[AS形式的MN/CA9mRNA和用于檢測該mRNA的探針/引物。該ASMN/CA9mRNA主要在正常的細(xì)胞中于正常的血氧下表達(dá),能夠干擾檢測全長[FL]MN/CA9mRNA表達(dá)的試驗(yàn),尤其是RT-PCR試驗(yàn)。本發(fā)明還涉及該AS形式的MN/CAIX以及利用對其(單獨(dú)或與FL形式的MNCAIX蛋白組合)進(jìn)行檢測或檢測并定量的試驗(yàn)來進(jìn)行診斷/預(yù)后的方法。此外,本發(fā)明涉及利用MN/CA9旁路剪接(alternativesplicing)作為手段來靶向FLMN/CAIX蛋白的治療方法。作為本發(fā)明焦點(diǎn)的AS形式的MN/CA9/CAIX可以來自脊推動物,但優(yōu)選來自哺乳動物,更優(yōu)選來自人。
      背景技術(shù)
      :如上所述,該MN基因和蛋白有很多可選名稱,這些名稱在本文中可互換使用。發(fā)現(xiàn)MN蛋白可結(jié)合鋅并具有碳酸酐酶(CA)活性,現(xiàn)在被認(rèn)為是第九種碳酸酐酶同工酶-MN/CAIX或CAIX[Opavsky等(1996)見下文。按照碳酸酐#名法,人CA同工酶用大寫羅馬字母和數(shù)字表示,而它們的基因用斜體字母和阿拉伯?dāng)?shù)字表示。或者本文中^^I的"MN"指碳酸酐酶同工酶IX(CAIX)蛋白/多肽或碳酸酐酶同工酶9(CA9)基因、核酸、cDNA、mRNA等,如上下文所示。MN蛋白還已-皮鑒定為G250抗原。Uemura等"腫瘤相關(guān)抗原MN/G250在尿道癌中的表達(dá):潛在治療性把標(biāo)(ExpressionofTumor-AssociatedAntigenMN/G250inUrologicCarcinoma:PotentialTherapeuticTarget)","J.Urol"154(4增刊):377(摘要1475;1997)描述"序列分析和數(shù)據(jù)庫搜索顯示,G250抗原與MN(在宮頸癌中鑒定到的人腫瘤相關(guān)性抗原)相同(Pastorek等,1994)。CAIX是由ZavadaJ,Pastorekova,S.和Pastorek,J.利用首先由Pastorekova等Virologv187:620-626(1992)]描述的M75單克隆抗體鑒定到的癌相關(guān)性碳酸酐酶["zavada等",參見,例如,美國專利5,387,676。該抗體用于克隆編碼CAIX的cDNA[Pastorek等,Oncogene,9:2788-2888(1994),用于評價CAIX在腫瘤內(nèi)和正常組織中的表達(dá)[Zavada等,IntJCancer,54:268-274,(1993),以及很多其他的參考文獻(xiàn)],用于研究細(xì)胞密度對CAIX的調(diào)控[Lieskovska等,Neoplasma,46:17-24,(1999),Kaluz等,CancerResearch,62:4469-4477,(2002),還用于證明低氧對CAIX的誘導(dǎo)[Wykoff等,CancerResearch,60:7075-70832000),以及很多其他的參考文獻(xiàn)]。所有此類研究均支持Zavada等最初的觀點(diǎn)和工作[例如,Zavada等,美國專利5,387,676,即MN/CAIX/CA9可作為腫瘤發(fā)生前/腫瘤標(biāo)記物用于診斷和/或預(yù)防性用途,以及可作為靶標(biāo)用于治療性用途,Zavada等還表明M75單克隆抗體是一種有價值的CAIX特異性試劑,可用于不同的免疫檢測方法和免疫靶向方法。Zavada等,國際公開No.WO93/18152(1993年9月16日公開)和美國專利No.5,387,676(1995年2月7日授權(quán))描述了MN基因和蛋白的發(fā)現(xiàn)及其生物學(xué)和分子特征。發(fā)現(xiàn)MN基因存在于所有測試的脊推動物染色體DNA中,它的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生強(qiáng)烈相關(guān)。最初在來源于人子宮頸癌的HeLa細(xì)胞中鑒定到MN蛋白。在多種人腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了這種蛋白(其中特別是子宮頸、卵巢、子宮內(nèi)膜、腎、膀胱、乳房、結(jié)腸直腸、肺、食管和前列腺的腫瘤)。在正常組織中幾乎沒有發(fā)現(xiàn)MN蛋白的任何顯著性表達(dá)。那些表達(dá)MN的正常組織包括人的胃粘膜和膽嚢上皮,以及消化道的一些其它正常組織。自相矛盾的是,在一些正常地表達(dá)MN基因的組織(例如胃粘膜)中,發(fā)生癌及其他腫瘤發(fā)生前(preneoplastic)/腫瘤性疾病(neoplasticdisease)時MN基因的表達(dá)缺失或減少。通常,MN蛋白的異常表達(dá)可能預(yù)示肺瘤生成。例如,以下現(xiàn)象可能預(yù)示腫瘤生成(1)在正常情況下不表達(dá)MN蛋白的組織中存在顯著水平的MN蛋白;(2)在正常情況下表達(dá)MN蛋白的組織中不存在MN蛋白;(3)組織中MN基因表達(dá)相對于正常表達(dá)水平顯著增加,或顯著減少;或(4)在細(xì)胞內(nèi)的異常位點(diǎn)中表達(dá)MN蛋白。Zavada等,WO93/18152以及Zavada等,WO95/34650(1995年12月21日公開)公開了如何利用MN基因和蛋白以及MN基因表達(dá)與腫瘤發(fā)生學(xué)的強(qiáng)烈相關(guān)性的發(fā)現(xiàn)發(fā)明了診斷/預(yù)后以及治療癌癥和癌癥前期病癥的方法。這些專利申請中提供了通過檢測或檢測并定量脊推動物中MN基因的異常表達(dá)從而鑒定肺瘤性疾病的發(fā)病和存在的方法和組合物??赏ㄟ^多種常規(guī)試驗(yàn)在脊推動物樣品中檢測或檢測并定量MN基因的異常表達(dá),例如通過使用MN特異性抗體檢測或檢測并定量MN抗原的免疫測定方法,通過使用MN核酸(例如MNcDNA)檢測或檢測并定量MN核酸(例如MNmRNA)的雜交試驗(yàn)或PCR試驗(yàn),例如RT-PCR。MN/CAIX首先在HeLa細(xì)胞中鑒定到,其既是一種質(zhì)膜蛋白又是一種核蛋白,通過蛋白質(zhì)印跡法評估的表觀分子量分別為58和54千道爾頓(kDa)。MN/CAIX單個3kDa碳水化合物鏈N-糖基化,在非還原狀態(tài)下形成S-S連接的寡聚物[Pastorekova等,Virology,187:620-626(1992);Pastorek等,Oncogene9:2788-2888(1994)卜MN/CAIX是一種位于細(xì)胞表面的跨膜蛋白,但有時候也在細(xì)胞核中檢測到該蛋白[Zavada等,Int.J,Cancer,54:268-274(1993);Pastorekova等,見上文l。MN以孿生蛋白p54/58N的形式存在于HeLa細(xì)胞中。使用與p54/58N反應(yīng)的單克隆抗體(MAbM75)的免疫印跡顯示,在54kd和58kd處有兩個條帶。這兩個條帶可能對應(yīng)于一種類型的蛋白,它們很可能由于翻譯后加工而不同。Zavada等,WO9318152和/或WO95/34650公開了MNcDNA序列(SEQIDNO:l)(示于本文的圖8A-8C中),MN氨基酸順序(SEQIDNO:2)(也示于圖8A-8C中),以及MN基因組序列(SEQIDNO:3)(示于本文的圖9A-9F中)。MN基因包括11個外顯子和IO個內(nèi)含子。SEQIDNO:1的人MNcDNA序列含有1522個堿基對(bp)。SEQIDNO:70的MNcDNA序列含有1552bp[EMBL登錄號X66839;Pastorek等(1994)J。示于圖8A-8C中的MN蛋白(SEQIDNO:2)的頭37個氨基酸構(gòu)成了推定的MN信號肽[SEQIDNO:4??缒N蛋白有胞外(EC)結(jié)構(gòu)域[圖8A-8C(SEQIDNO:5)的氨基酸(aa)38-414)、跨膜(TM)結(jié)構(gòu)域[aa415-434(SEQIDNO:6)j和胞內(nèi)(IC)結(jié)構(gòu)域taa435-459(SEQIDNO:7)。該胞外結(jié)構(gòu)域在約氨基酸(aa)53-lll(SEQIDNO.8)或優(yōu)選在約aa52-12510(SEQIDNO:81)處含有蛋白聚糖樣(PG)結(jié)構(gòu)域,在約aa135-391(SEQIDNO:9)或優(yōu)選在約aa121-397(SEQIDNO:82)處含有碳酸酐酶(CA)結(jié)構(gòu)域。Zavada等WO93/18152和WO95/34650描述了MN-特異性抗體的制備。一種代表性且優(yōu)選的MN特異性抗體,即單克隆抗體M75(MabM75),其對應(yīng)的雜交瘤(VU-M75)保藏在美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)(Manassas,VA,USA),ATCC編號HB11128。M75抗體用來例如在新鮮、冷凍或經(jīng)福爾馬林、酒精、丙酮或其他試劑固定的和/或經(jīng)石蠟包埋和脫蠟的組織樣品中通過蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)、放射免疫測定和免疫組化學(xué)來發(fā)現(xiàn)和鑒定MN蛋白,也可用于容易地鑒定MN抗原。另一種代表性并優(yōu)選的MN特異性抗體MabMN12由保藏在ATCC名為HB11647的雜交瘤MN12.2.2分泌。Zavada等的WO95/34650的實(shí)施例l提供了用MAbM75進(jìn)行組織的免疫組織化學(xué)染色獲得的代表性結(jié)果,這些結(jié)果證明了MN基因的致癌性。位,包括針對M75mab的重復(fù)性表位,特別是氨基酸序列PGEEDLP(SEQIDNO:ll),該序列是N末端PG區(qū)域的4X完全重復(fù)序列[Zavada等(2000),見下文l。針對MN12mab的表位也是免疫顯性的。Pastorekova等,Virology,187:620-626(1992)首先報(bào)道了M75mab,并在很多美國和外國專利(包括例如Zavada等美國專利No.5,981,711和EP0637336Bl)中具體要求保護(hù),以及與MN/CAIX特異性抗體(多克隆和單克隆抗體及其片段)等一起要求保護(hù)。[也參見,Zavada等,美國專利No.5,387,676;5,955,075;5,972,353;5,989,838;6,004,535;6,051,226;6,069,242;6,093,548;6,204,370;6,204,887;6,297,041;和6,297,051;Zavada等,AU669694;CA2,131,826;DE69325577.3;和KR282284。Zavada等的那些美國專利和外國專利通過參考納入本文。CAIX是鋅金屬酶的oc碳酸酐酶家族中的一種高度活性成員,該酶家族催化二氧化碳和碳酸氫鹽之間的可逆轉(zhuǎn)化[Pastorek等(1994);Opavsky等(1996);Chegwidden等,(2000),見下文;Wingo等,(2001),見下文;Pastorekova等(2004),見下文。CAIX是14種同工型之一,這些同工型存在于哺乳動物中,位于不同的亞細(xì)胞位置,包括細(xì)胞質(zhì)(CAI,II,III,VII)、線粒體(CAVA,VB)、分泌小泡(CAVI)和質(zhì)膜(CAIV,IX,XII,XIV)。一些同功酶分布在多種組織中(CAI,II,CAIV),其它的同工酶則更局限于特定的器官中(唾液腺中的CAVI),已發(fā)現(xiàn)兩種同工型與癌組織有關(guān)系(CAIX,XII)[綜述于Chegwidden2000;Pastorekova和Pastorekj第9章,CarbonicAnhydrase:ItsInhibitorsandActivators(Supuran等主編;CRCPress(London等)2004中卜酶活性和動力學(xué)性質(zhì)以及對氨磺酰抑制劑的靈敏度從高(CAII,CAIX,CAXII,CAIV)到低(CAHI)變化[Supuran和Scozzafava(2000),見下文]。由于不完全保守性活性位點(diǎn),幾種稱為CA-相關(guān)性蛋白的同工型(CA-RPVIII,X,XI)是非催化性的(acatalytic)。屬于相同蛋白家族的遺傳相關(guān)性成員的這種特別的變異性為它們在多種生理學(xué)和病理過程中的應(yīng)用創(chuàng)造了基礎(chǔ)。這種催化活性與維持代謝活性組織中的離子和水交換以及酸堿平衡有重要關(guān)系。通過該活性,CA酶類顯著影響呼吸、體液(玻璃體液(vitreoushumor)、胃液、腦脊髓液)的產(chǎn)生、骨吸收、腎酸化等(Chegwidden等2000)。CAIX同功酶綜合了幾種性質(zhì),使其成為基礎(chǔ)研究和臨床研究的重要課題。首先,CAIX的表達(dá)與各種人腫瘤十分密切相關(guān),而它通常不存在于相應(yīng)的正常組織[Zavada等,(1993);Liao等,(1994),infra;Turner等,1997,見下文;Liao等,1997,見下文;Saarnio等,1998,見下文;Vermylen等,1999,見下文;Ivanov等(2001),見下文;Bartosova等,(2002),等。這主要與腫瘤低氧有關(guān)系,腫瘤低氧通過低氧誘導(dǎo)因子(HIF)強(qiáng)烈激活CA9基因的轉(zhuǎn)錄,該低氧可誘導(dǎo)因子結(jié)合于定位在靠近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的最小CA9啟動子(位置在-10/-3)中的低氧效應(yīng)元件(HRE)[Wykoff等(2000),見下文I。HIF轉(zhuǎn)錄因子通過活化支持弱氧化腫瘤細(xì)胞的生存和對低氧應(yīng)激的適應(yīng)或?qū)е逻@些細(xì)胞死亡的基因而顯著改變?nèi)跹趸[瘤細(xì)胞的表達(dá)鐠。因此,低氧選擇了侵襲和轉(zhuǎn)移能力增加、從而固有地與預(yù)后不良及對抗癌治療響應(yīng)較差相關(guān)的、更具侵略性的腫瘤細(xì)胞[Harris(2002),見下文J。因?yàn)槟[瘤低氧是一種重要現(xiàn)象,其很大程度上暗示著癌癥的發(fā)展及治療(結(jié)果)[Hockel和Vaupel(2001),見下文1,MN非常有可能作為具有預(yù)后/前兆價值的一種內(nèi)在低氧標(biāo)記物和作為一種有前景的治療靶標(biāo)[Wykoff等(2000);Wykoff等,(2001),見下文Beasley等,(2001),見下文;Giatromanolaki等,(2001),見下文;Koukourakis等,(2001),見下文;Potter和Harris(2003),見下文l。CAIX是一種整體的質(zhì)膜蛋白,其大的胞外部分暴露在癌細(xì)胞的表面上,因而能夠被靶向工具(包括特異性單克隆抗體)接近,這對其臨床應(yīng)用是有利的。而且,CAIX與其他CA同功酶的不同在于CAIX中存在獨(dú)特的蛋白聚糖相關(guān)性區(qū)域(PG),該區(qū)域形成胞外CA結(jié)構(gòu)域的N末端延伸,從而消除了與其他同功酶的交叉識別Opavsky等(1996)1。通過調(diào)節(jié)細(xì)胞粘著和控制pH值,CAIX似乎在腫瘤生物學(xué)中發(fā)揮著活躍的作用(Svastova等,2003,見下文,Svastova等,2004,見下文,Swietach等,2007,見下文)。CAIX參與碳酸氫鹽運(yùn)輸蛻變中間物質(zhì)并響應(yīng)于低氧條件而影響胞外小環(huán)境的酸化(Morgan等,2007,見下文,Svastova等,2004,^下文).另外,CAIX的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(IC)具有潛在性第三致瘤作用,至少在腎細(xì)胞腫瘤中酪氨酸-磷酸化CAIX(通過EGFR介導(dǎo))與PI-3K(p85)的調(diào)節(jié)亞基相互作用,導(dǎo)致Akt活化[Dorai等,(2005),見下文l。由于它的很多潛在活性促使肺瘤生成,靶向CAIX蛋白從而消除其功能預(yù)期具有治療效果。然而,關(guān)于CAIX的很多基本的分子和功能方面是未知的;其中一個方面是CAIX可能的旁路剪接。旁路剪接是一種非常重要的分子機(jī)制,其有助于蛋白的結(jié)構(gòu)多樣化和功能多樣化。旁路剪接常常是差異性外顯子包涵體(differentialexoninclusion)導(dǎo)致的,其造成結(jié)構(gòu)域組成、亞細(xì)胞定位、相互作用可能性、信號容量的及其他蛋白水平的改變。通過最近的基因組技術(shù)獲得的數(shù)據(jù)顯示,超過60%的人基因是旁路剪接形成的。還有越來越明顯的一點(diǎn)是旁路剪接變體表達(dá)的不平衡可顯著影響細(xì)胞表型,并在多種病理學(xué)中起作用(Matlin等,2005,見下文)。本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)CA9基因的表達(dá)涉及旁路剪接。本文描述了小鼠和人的MNmRNA旁路剪接(AS)變體。發(fā)明人證明,腫瘤中人AS變體的豐度小于全長(FL)CA9mRNA,但是可以在正常組織和正常含氧量情況下檢測到。人ASCA9mRNA不含有外顯子8和9,該mRNA編碼截短的CAIX蛋白。因此,ASCAIX不限于質(zhì)膜并顯示降低的催化活性。在HeLa細(xì)胞中過度表達(dá)時,ASCAIX降低了低氧誘導(dǎo)的胞外酸化,阻礙HeLa球狀體的生長。由于AS變體可存在于具有正常表型、含氧量正常的細(xì)胞中,在用來評定低氧-和腫瘤-相關(guān)的CA9基因表達(dá)的診斷和/或預(yù)后研究中有可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果。而且,CAIX蛋白的AS形式可能在功能上干擾FLCAIX形式,在中度低氧的情況下,當(dāng)FL水平相對較低時尤其如此。發(fā)明概述本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)除編碼低氧誘導(dǎo)的、膜-結(jié)合和腫瘤相關(guān)的MN蛋白的全長(FL)CA9mRNA轉(zhuǎn)錄物之外,還有編碼ASMN蛋白(ASMN/CAIX或ASCAIX)的組成型產(chǎn)生的旁路剪接(AS)CA9mRNA轉(zhuǎn)錄物,所述ASMN蛋白不限于質(zhì)膜。作為本發(fā)明治療方面的基礎(chǔ)的另一個發(fā)現(xiàn)是,ASCAIX干擾FLCAIX的功能。獨(dú)立于低氧-和腫瘤-的CAIXAS變體產(chǎn)生對CAIX的診斷、預(yù)后和治療方面有很多意義。一方面中,本發(fā)明涉及與脊推動物、優(yōu)選哺乳動物、更優(yōu)選人中MN/CAIX的異常表達(dá)相關(guān)的肺瘤發(fā)生前/腫瘤性疾病的診斷和/或預(yù)后方法,其包括區(qū)分全長[FLI和旁路剪接[ASjMN/CA9mRNA或AS和FLMN/CAIX的表達(dá)。所述方法可包括使用一個或多個探針和/或引物檢測或檢測并定量FL和/或ASMN/CA9mRNA的表達(dá);優(yōu)選地,所述方法包括使用(a)探針和/或引物,以檢測全長FLjMN/CA9mRNA,但不檢測旁路剪接[ASMN/CA9mRNA;(b)探針和/或引物,以檢測ASMN/CA9mRNA,但不檢測FLMN/CA9mRNA;和/或(c)探針和/或引物,以檢測FL和ASMN/CA9mRNA。一方面中,本發(fā)明的診斷預(yù)后方法利用旁路剪接MN/CA9核酸和全長MN/CA9核酸之間的差異,例如,通過將探針靶向存在于ASMN/CA9但不存在于FLMN/CA9mRNA中的剪接點(diǎn),或靶向不存在于ASMN/CA9mRNA中,但存在于FLMN/CA9mRNA中的核酸序列。類似地,可設(shè)計(jì)引物對用于例如擴(kuò)增僅在ASMN/CA9mRNA中發(fā)現(xiàn)但未在FLMN/CA9中發(fā)現(xiàn)(或反之亦然)的區(qū)域。鑒于本公開內(nèi)容,本領(lǐng)域技術(shù)人員將能設(shè)計(jì)任意數(shù)目的有用于本發(fā)明的診斷/預(yù)后方法的探針和/或引物/引物對。在人腫瘤發(fā)生前/腫瘤性疾病的優(yōu)選診斷/預(yù)后方法中,本發(fā)明的一個或多個特別優(yōu)選的探針和/或引物選自SEQIDNOS:97-101及與SEQIDNOS:97-101至少80%同源(更優(yōu)選與SEQIDNOS:97-101至少90%)的核酸序列。所述方法包括使用一個或多個探針和/或引物來檢測或檢測并定量FL和/或ASMN/CA9mRNA表達(dá),還可包括測定FL:ASMN/CA9mRNA的比率或FL:ASMN/CA9mRNA比率隨時間的變化。此外,所述ASMN/CA9mRNA表達(dá)可用于指示MN/CA9基因正常表達(dá),所述FLMN/CA9mRNA表達(dá)可用于指示MN/CA9基因異常表達(dá),特別是所述AS和/或FLMN/CA9mRNA表達(dá)的水平,或者或另外地,所述ASMN/CA9mRNA表達(dá)可用于指示含氧量正常情況下MN/CA9基因表達(dá),所述FLMN/CA9mRNA表達(dá)可用于指示低氧的情況下MN/CA9基因表達(dá)。此外,所述MNAS和/或FLmRNA表達(dá)的水平將具有特定的指示值。所述包括使用一個或多個探針和/或引物來檢測或檢測并定量FL和/或ASMN/CA9mRNA表達(dá)的方法還可包括使用核酸擴(kuò)增方法,優(yōu)選選自以下的擴(kuò)增方法PCR、RT-PCR、實(shí)時PCR或?qū)崟r定量RT-PCR以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的同等核酸擴(kuò)增方法?;蛘?,所述用于檢測或檢測并定量FL和/或ASMN/CA9mRNA表達(dá)的方法可包括使用微陣列芯片。例如,所述微陣列芯片可包含結(jié)合于全長[FLIMN/CA9mRNA但不結(jié)合旁路剪接[AS]MN/CA9mRNA的探針,和/或結(jié)合于ASMN/CA9mRNA但不結(jié)合FLMN/CA9mRNA的探針,其中策略地使所述探針定位在此類芯片上在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。另一個方面,本發(fā)明涉及與哺乳動物中MN/CAIX異常表達(dá)相關(guān)的肺瘤發(fā)生前/腫瘤性疾病的診斷和/或預(yù)后方法,包括區(qū)分FL和ASMN/CAIX的表達(dá)。優(yōu)選地,所述方法包括使用一種或多種抗體區(qū)分腫瘤發(fā)生前/贅生性組織(neoplastictissue)中FL和ASMN/CAIX的表達(dá)。所述方法可包括檢測或檢測并定量所述組織中的ASMN/CAIX;還可包括測定所述組織中FLMN/CAIX水平與ASMN/CAIX水平的比率。此外,所述FL:ASMN/CAIX比率可用來指示所述組織中低氧的存在或程度。本發(fā)明一種優(yōu)選實(shí)施方案中,該診斷和/或預(yù)后方法包括檢測或檢測并定量脊推動物組織中的FLMN/CAIX和ASMN/CAIX,其包括以下步驟(a)使所述樣品同時或按序地與至少兩種抗體、至少兩種抗原結(jié)合抗體片段、或抗體和抗原-結(jié)合抗體片段的混合物接觸,其中至少一種抗體/抗體片段特異性結(jié)合于FLMN/CAIX蛋白但不結(jié)合ASMN/CAIX蛋白,其中至少一種其他抗體/抗體片段特異性結(jié)合于FL和ASMN/CAIX兩者;(b)檢測并定量所述樣品中的抗體/抗體片段;和(c)比較所述差異結(jié)合性(differentiallybinding)抗體/抗體片段的結(jié)合,以測定FLMN/CAIX和ASMN/CAIX的相對水平。優(yōu)選地,所述特異性結(jié)合于FLMN/CAIX但不結(jié)合ASMN/CAIX的抗體/抗體片段對MN/CAIX的碳酸酐酶(CA)結(jié)構(gòu)域具有特異性;所述特異性結(jié)合FL的蛋白聚糖樣(PG)結(jié)構(gòu)域具有特異性。更優(yōu)選,所述對MN/CAIX的CA結(jié)構(gòu)域具有特異性的抗體是是保藏在比利時根特、登錄號為LMBP6009CB的BCCMTM/LMBP雜交瘤VU-V/10產(chǎn)生的V/10單克隆抗體;所述對MN/CAIX的PG結(jié)構(gòu)域具有特異性的抗體是保藏在美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)、ATCC名稱編號為HB11128的雜交瘤VU-M75產(chǎn)生的M75單克隆抗體。此外,本發(fā)明涉及與脊推動物中MN/CAIX異常表達(dá)相關(guān)的腫瘤發(fā)生前/肺瘤性疾病的診斷和/或預(yù)后方法,包括檢測或檢測并定量合適的脊推動物組織樣品中的全長[FLlMN/CAIX蛋白但非旁路剪接[ASMN/CAIX蛋白,所述方法包括以下步驟(a)使所述樣品與抗體或抗體片段接觸,其中所述抗體或抗體片段特異性結(jié)合于FLMN/CAIX但不結(jié)合ASMN/CAIX;和(b)檢測并定量所述樣品中所述抗體/抗體片段的結(jié)合。所述脊推動物優(yōu)選哺乳動物,所述哺乳動物更優(yōu)選人。特異性結(jié)合于FLMN/CAIX但不結(jié)合ASMN/CAIX的示例性且優(yōu)選的抗體或抗體片段是對MN/CAIX的碳酸酐酶(CA)結(jié)構(gòu)域具有特異性的抗體或抗體片段。更優(yōu)選,所述對MN/CAIX的CA結(jié)構(gòu)域具有特異性的抗體是是保藏在比利時根特、登錄號(accessionNo.)為LMBP6009CB的BCCMTM/LMBP雜交瘤VU-V/10產(chǎn)生的V/10單克隆抗體。本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案涉及與脊推動物(優(yōu)選哺乳動物)中MN/CAIX異常表達(dá)相關(guān)的肺瘤發(fā)生前/肺瘤性疾病的診斷和/或預(yù)后方法,其包括檢測或檢測并定量脊推動物(優(yōu)選哺乳動物)的腫瘤發(fā)生前/贅生性樣品(neoplasticsample)中的全長[FLMN/CA9mRNA但非旁路剪接[ASMN/CA9mRNA,包括使所述樣品中的mRNA與特異性結(jié)合FLMN/CA9mRNA但不結(jié)合ASMN/CA9mRNA的引物或探針接觸。本發(fā)明還涉及用來區(qū)分哺乳動物中旁路剪接[ASjMN/CA9mRNA和全長[FLjMN/CA9mRNA表達(dá)的核酸探針和/或引物。如上所述,此類基于本發(fā)明公開內(nèi)容的探針/引物的設(shè)計(jì)在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。優(yōu)選地,其中所述哺乳動物是人,所述探針和/或引物用來檢測ASMN/CA9mRNA但不檢測FLMN/CA9mRNA,所述探針或引物包含結(jié)合于MN/CA9基因的外顯子7和10的剪接點(diǎn)的核酸。更優(yōu)選,所述探針或引物具有SEQIDNO:16101的序列或與SEQIDNO:101至少80%同源(更優(yōu)選與SEQIDNO:101至少90%同源)的序列?;蛘?,其中所迷哺乳動物是人,所述探針或引物用來檢測FLMN/CA9mRNA但不檢測ASMN/CA9mRNA,所述探針或引物包含結(jié)合于人MN/CA9基因的外顯子8或外顯子9的核酸,或結(jié)合于人MN/CA9基因外顯子7和8的剪接點(diǎn)的核酸、或結(jié)合于人MN/CA9基因外顯子8和9的剪接點(diǎn)的核酸、或結(jié)合于人MN/CA9基因外顯子9和10的剪接點(diǎn)的核酸。更優(yōu)選,所述用于檢測人FLMN/CA9mRNA但不檢測ASMN/CA9mRNA的探針或引物具有SEQIDNO:100的序列或與SEQIDNO:100至少80%同源(更優(yōu)選與SEQIDNO:100至少卯%同源)的序列。本發(fā)明還涉及表達(dá)此類探針或引物的載體、和/或包含此類載體的宿主細(xì)胞、包含一個或多個此類探針的微陣列芯片。本發(fā)明還涉及用來區(qū)分哺乳動物中旁路剪接[ASMN/CA9mRNA和全長[FLMN/CA9mRNA表達(dá)的探針對和/或引物對。所述探針對和/或引物對可用于檢測旁路剪接[AS人MN/CA9mRNA但不檢測全長[FL人MN/CA9mRNA。用于檢測旁路剪接[AS人MN/CA9mRNA但不檢測全長FL]人MN/CA9mRNA的示例性且優(yōu)選的探針對或引物對由SEQIDNOS:99和101、或與SEQIDNOS:99和101至少80%同源(更優(yōu)選與SEQIDNOS:99和101至少90%同源)的核酸序列組成。或者所述探針對和/或引物用于檢測全長[FL人MN/CA9mRNA但不檢測旁路剪接[AS1人MN/CA9mRNA。用于檢測FLmRNA的示例性且優(yōu)選的探針對或引物對僅由SEQIDNOS:99和100、或與SEQIDNOS:99和100至少80%同源(更優(yōu)選與SEQIDNOS:99和100至少90%同源)的核酸序列組成。在本發(fā)明另一種實(shí)施方式中,探針對和/或引物對用來檢測AS人MN/CA9mRNA和FL人MN/CA9mRNA兩者,所述ASmRNA和所述FLmRNA的長度不同。優(yōu)選地,所述用于檢測AS和FL人MN/CA9mRNA兩者的探針對和/或引物對僅由SEQIDNOS:97和98、或與SEQIDNOS:97和98至少80%同源(更優(yōu)選與SEQIDNOS:97和98至少90%同源)的核酸序列組成。本發(fā)明還涉及編碼哺乳動物中的旁路剪接[AS]MN/CAIX的分離核酸。優(yōu)選地,所述ASMN/CAIX的分子量為約43-約48千道爾頓。本發(fā)明還涉及表達(dá)此類核酸或其片段的載體、包含此類載體的宿主細(xì)胞和/或涉及通過重組、合成或其他生物學(xué)方法產(chǎn)生ASMN/CAIX蛋白和多肽。所述分離核酸編碼的示例性且優(yōu)選的AS形式的MN/CAIX的特征還在于,它與對MN/CAIX的PG結(jié)構(gòu)域具有特異性的抗體特異性結(jié)合,但不與對MN/CAIX的CA結(jié)構(gòu)域具有特異性的抗體結(jié)合。本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述AS形式的MN/CAIX與M75單克隆抗體特異性結(jié)合,但不與V/10單克隆抗體結(jié)合,所述M75單克隆抗體由保藏在美國模式培養(yǎng)物保藏所、名為ATCCNo.HB11128的雜交瘤VU-M75分泌,所述V/10單克隆抗體由保藏在比利時根特、登錄號為LMBP6009CB的BCCMTM/LMBP雜交瘤VU-V/10產(chǎn)生。更優(yōu)選,所述哺乳動物是人,所述分離核酸特征在于刪除了對應(yīng)于外顯子8和外顯子9的核香酸。更優(yōu)選,所迷分離的人核酸具有SEQIDNO:108的核酸序列、或與SEQIDNO:108至少80%同源(更優(yōu)選與SEQIDNO:108至少90%同源)的分離核酸。優(yōu)選地,由SEQIDNO:108或非常相關(guān)的序列編碼的示例性AS形式的人MN/CAIX與M75單克隆抗體特異性結(jié)合,但不與V/10單克隆抗體結(jié)合,所述M75單克隆抗體由保藏在美國模式培養(yǎng)物保藏所、名為ATCCNo.HB11128的雜交瘤VU-M75分泌,所述V/10單克隆抗體由保藏在比利時根特、登錄號為LMBP6009CB的BCCMTM/LMBP雜交瘤VU-V/10產(chǎn)生。此外,本發(fā)明涉及特異性結(jié)合ASMN/CAIX但不結(jié)合其他形式的MN/CAIX的抗體或抗原結(jié)合抗體片段。例如,此類AS-特異性抗體可以是特異性結(jié)合AS形式的MN/CAIX但不特異性結(jié)合FL形式的MN/CAIX的抗體或抗原-結(jié)合抗體片段;或特異性結(jié)合ASMN/CAIX但不特異性結(jié)合可溶性MN/CAIX(s-CAIX)的抗體或抗原結(jié)合抗體片段。本文還公開了用于治療哺乳動物肺瘤發(fā)生前/腫瘤性疾病的治療方法,其中所述疾病與MN/CAIX的異常表達(dá)有關(guān),這些方法包括給予所述哺乳動物治療有效量的組合物,該組合物包含相對于全長[FLlMN/CAIX水平提高旁路剪接[ASMN/CAIX水平的物質(zhì)。所述ASMN/CAIX還包括干擾FLMN/CAIX活性的ASMN/CAIX的任何蛋白或多肽片段。優(yōu)選地,所所述物質(zhì)可以優(yōu)選處于生理學(xué)上可接受的載體中的ASMN/CAIX本身、表達(dá)ASMN/CA9mRNA的栽體、阻斷FLMN/CAIX但非ASMN/CAIX表達(dá)的反義寡核苷酸、表達(dá)所述反義寡核苷酸的載體、FLMN/CA9同工型特異性siRNA、或表達(dá)所述FLMN/CA9同工型特異性siRNA的載體。例如,所述物質(zhì)可以是耙向MN/CA9mRNA的外顯子7和8、外顯子8和9或外顯子9和10的剪接點(diǎn)的FLMN/CA9同工型特異性siRNA?;蛘?,所述物質(zhì)是調(diào)節(jié)AS和/或FLMN/CA9前mRNA(pre—mRNA)剪接的反義寡核苷酸。另一方面,本發(fā)明涉及相對于全長[FL1MN/CAIX水平提高旁路剪接[AS]MN/CAIX水平的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸用于治療與MN/CAIX異常表達(dá)相關(guān)的腫瘤發(fā)生前/腫瘤性疾病。例如,所述寡核苷酸可以是與FLMN/CA9前inRNA互補(bǔ)但不與ASMN/CA9前mRNA互補(bǔ)的寡核苷酸;優(yōu)選地,所述寡核苷酸與MN/CA9mRNA的外顯子7和8、外顯子8和9或外顯子9和10的剪接點(diǎn)互補(bǔ)?;蛘?,所述相對于FLMN/CAIX水平提高ASMN/CAIX水平的寡核苷酸可以是與FLMN/CA9mRNA互補(bǔ)但不與ASMN/CA9mRNA互補(bǔ)的siRNA。本發(fā)明還涉及一種體外方法,其用于鑒定能夠調(diào)節(jié)旁路剪接[AS]MN/CAIX水平的物質(zhì),所述方法包括使表達(dá)ASMN/CAIX的細(xì)胞與懷疑調(diào)節(jié)細(xì)胞中所述ASMN/CAIX水平的物質(zhì)接觸,檢測并定量所述ASMN/CAIX水平的變化。參考文獻(xiàn)以下參考文獻(xiàn)被本文引用,或者提供了涉及MN/CA9基因和MN/CAIX蛋白、或旁路剪接mRNAs的最新信息。所有列出的參考文獻(xiàn)以及本文引用的其他參考文獻(xiàn)均通過參考具體地納入本文。Anderson等.,25:61-69(2006)Alvarez-P6rez等.,3^4GMJ18:293-301(2005)Bartosova等.,/尸fl,Ao/.197:314-321(2002)Beasley等.,Cfl/i"r及"61(13):5262-5267(2001)Cecchi等.,/3/^/CAew48:4834-41(2005)Chegwidden等.,£%590:343-363(2000)Chrastina等.,/105:873-881(2003)Dorai等.,/Owicc41:2935-2947(2005).Garcia-Blanco,C"/rAfo/77^r.,7(5):476-82(2005)Giatromanolaki等.,Or"c^及杠61(21):7992-7998(2001)Gothie等.,C/^柳275:6922-6927(2000)Gut等.,GW/w"&油5J123:1889-1903(2002)HarrisAL.,及evCer2:38-47(2002)He等.,0腳g麼25:192-2202(2006)Hockd和Vaupel,S簡汰O歸,.28(2Suppl8):36-41(2001)Ivanov等.,/戶W/^/.158(3):905-919(2001)Kaluz等.,Owice,及^y62:4469-4477(2002)Kivela等.,『of/rf/Gfl對roe"&ro/11:155-163(2005)Koukourakis等.,C7,w.7(11):3399-3403(2001)Liao等.,j附./戶fl&o/.145(3):598-609(1994)Liao等.,57:2827-2831(1997)Lieskovska等.,A^o//"s廳46:17-24(1999)Matlin等.,iV加及evO/Z6:386-398(2005)Morgan等.,X柳/iV^wo/-CW/尸奵w》/293(2):C738-C748(2007)Olive等.,Cflcw61:8924-8929(2001)Opavsky等.,G^wo柳/"33(3):480-487(1996)Ortova-Gut,G""幽e政油^v123:1889-1903(2002)Pajares等.,丄fl/icWOwo/.,8(4):349-57(2007)Pastorek等.,9:2877-2888(1994)Pastorekova和Pastorek,第9章,CarbonicAnhvdrase:ItsInhibitorsandActivators[Supuran等主編.;CRCPress(London等)2004Pastorekova等.,腸一187:620-626(1992)Pastorekova等.,G^麼Wm/柳112:398-408(1997)Pastorekova等.,/fl似6Af^ZC7^柳19:199-229(2004)PotterandHarris,丑r/89:2-7(2003)Robertson等.,Cfl歸/"紐64:6160-6165(2004)Robinson和Stringer,/CW/SW114:853-865(2001)Romero-Ramirez等.,Cflc"Wey64:5943-5947(2004)Roy等.,iy"c/爿"V/iM33:5026-5033(2005)Saarnio等.,^附153:279-285(1998)Skotheim和Nees,/"f/別oc臉柳CW/5/o/"39(7-8):1432-49(2007)Srebrow和Kornblihtt,/Ce//5W.,119(Pt13):2635-41(2006)Supuran和Scozzafava,/E"矽附e/"A仏15(6):597-610(2000)Svastova等.,Ex/CW/及^2卯332-345(2003)Svastova等.,/^5S丄"fe,s577:439-445(2004)Swietach等.,CflwcerAf^w^s^及ev,DOI10.1007/s10555-007-9064-0(2007)Taconelli等.,CW/6:347-60(2004)Turner等.,〃《附朋戶"Z/w/.28(6):740-744(1997)VenablesJP,偷五咖w28:378-386(2006)Vermylen等.,及^p/r./14:806-811(1999)Wilton和Fletcher,<7e/^77^r.,5(5):467-83(2005)Wingo等.,J5/oc/rew/cfl/W^seflrcACo/w柳Mw/cflAVw51288:666-669(2001)Wong等,Afo/尸WAo/75:124-130(2003)Wykoff等.,C療w60:7075-7083(2000)Wykoff等.,爿附./Az幼o(hù)/.158(3):1011-1019(2001)XingY.F簡Z別固"12:4034-41(2007)Zatovicova等.,//畫歸/M"tofe282:117-134(2003)Zavada等.,/54:268-274(1993)Zavada等.,5/*./Cfl/icc82(11):1808-1813(2000)縮寫本文使用了以下縮寫Aa—氨基酸AS一旁路剪接ATCC-美國典型培養(yǎng)物保藏中心bp一堿基對BSA-牛血清白蛋白CA-碳酸酐酶CAM-細(xì)胞粘著分子CARP—碳酸酐酶相關(guān)蛋白21cm—厘米C-末端一羧基末端CTL—細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞匸-攝氏度DEAE-二乙氨基乙基DMEM-Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基ds-雙鏈EDTA—乙二胺四乙酸鹽EGFR-表皮生長因子受體EIA-酶免疫測定ELISA-酶聯(lián)免疫吸附測定ER-雌激素受體蛋白FCS-胎牛血清FITC-異硫氰酸熒光素FITC-CAI—焚光CA抑制劑(與FITC綴合(conjugated)的高磺FL-全長FTP-脫氧核糖核酸酶l足跡法分析GST-谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶GST-MN—融合蛋白MN谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶h-小時H-低氧HBS-HIF結(jié)合位點(diǎn)HIF-低氧誘導(dǎo)因子HRE-j氐氧響應(yīng)元件IC-胞質(zhì)內(nèi)的或胞內(nèi)IF-免疫熒光IHC-免疫組織化學(xué)-白介素誦2IP-使用A蛋白瓊脂糖凝膠的免疫沉淀反應(yīng)kb—千堿基對kd或kDa-千道爾頓KS-角質(zhì)素硫酸鹽M-摩爾Mab或mab-單克隆抗體min.-分鐘mg-毫克ml-毫升mM-毫摩爾M-MuLV-鼠白血病病毒N-標(biāo)準(zhǔn)濃度;正常含氧量(normoxia)ND-未做ng一納克nt-核苷酸N-末端-氨基末端ODN-寡脫氧核糖核苷酸ORF-開放讀框PAGE-聚丙烯酰胺凝膠電泳PBS-磷酸鹽緩沖鹽水PCR-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PG-蛋白聚糖樣區(qū)域pi-等電點(diǎn)RACE-cDNA末端快速擴(kuò)增RCC—腎細(xì)胞癌RIA放射免疫測定RIPA-放射免疫沉淀測定法RNP-核糖核酸酶保護(hù)試驗(yàn)RT—PCR-逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)SDS-十二烷基硫酸鈉SDS—PAGE-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳SP-信號肽TC-組織培養(yǎng)tk-胸苷激酶TM-跨膜Tris-三(羥基曱基)氨基甲烷Hg—微克pl-微升^M-微摩爾VEGF-血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子細(xì)胞系A(chǔ)CHN-人腎癌C33a-人宮頸癌細(xì)胞[ATCCHTB國31;J.Natl.CancerInst.(Bethesda)32:135(1964)1CAKI-1-人腎癌Caski-人宮頸癌CGL1—H/F-N雜交細(xì)胞HeLaD98/AH.2衍生物)CGL2—H/F-N雜交細(xì)胞(HeLaD98/AH.2衍生物)CGL3—H/F-T雜交細(xì)胞(HeLaD98/AH.2衍生物)CGL4-H/F-T雜交細(xì)胞(HeLaD98/AH.2衍生物)HeLa-人宮頸癌;來自美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)MDCK-犬上皮細(xì)胞系,來源于表觀(apparently)正常的成年雌性英國小獵犬(cockerspaniel)(ATCCCCL誦34)(S.H.Madin和N.B.Barby,1958)NIH3T3-Aaronson,Science,237:178(1987)中報(bào)道的鼠成纖維細(xì)胞系SiHa-人子宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系[ATCCHTB-35;Friedl等,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,135:543(19,核苷酸和氨基酸符號本文用以下符號來代表核苷酸堿基肚絲A腺噤呤C胞嘧啶G鳥噤呤T胸腺嘧啶U尿嘧咬I肌苷MA或CRA或GWA或T/UsC或GYC或T/UKG或T/UVA或C或GHA或C或T/UDA或G或T/UBC或G或T/U■A或C或G或有二十種主要氨基酸,各自用三個相鄰的核苷酸的不同排列(三聯(lián)體密碼或密碼子)表示,這些氨基酸以特定的順序連在一起形成特征性蛋白。本文用如下3字母或1字母表示所述氨基酸,例如見下圖1:3字母l字母氨基酸名稱縮寫縮寫丙氨酸AlaA精氨酸ArgR天門冬酰胺AsnN天冬氨酸AspD半胱氨酸CysC谷氨酸GluE谷氨酰胺GinQ甘氨酸GlyG組氨酸HisH異亮氨酸lieI亮氨酸Leu賴氨酸K甲硫氨酸MetM笨丙氛酸PheF脯氨酸ProP絲氨酸SerS蘇氨酸ThrT色氨酸TrpW酪氨酸TyrY纈氨酸ValV未知的或其他的X附圖簡述圖1提供小鼠CAIX剪接變體的鑒定和預(yù)測的結(jié)構(gòu)。(A)小鼠Car9基因(GenBank井AY049077)的基因結(jié)構(gòu)。(B)小鼠胃腸組織中Car9剪接變體的RT-PCR。[參見表2,見下文,實(shí)施例中所用的引物序列。(C)分離FL和AS轉(zhuǎn)錄物的擴(kuò)增產(chǎn)物。(D)FL和AS氨基酸序列的比較。(E)小鼠ASCAIX蛋白的預(yù)測結(jié)構(gòu)。圖2示出了小鼠ASCAIX的免疫印跡分析和定位。將含有小鼠AScDNA的pSG5C-AS質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到NIH3T3和MDCK細(xì)胞中。(A)使用抗小鼠CAIX的多克隆血清進(jìn)行的AS-轉(zhuǎn)染細(xì)胞的免疫印跡分析顯示單一的AS相關(guān)性條帶。(B)轉(zhuǎn)染子的免疫焚光分析證明了小鼠AS蛋白的胞內(nèi)定位。圖3提供人CAIX剪接變體的鑒定和預(yù)測的結(jié)構(gòu)。(A)示意性說明人CA9基因(GenBank弁Z54349)的基因結(jié)構(gòu)。箭頭顯示引物的位置。[參見表2,實(shí)施例所用的引物序列。l旁路剪接排除的外顯子為黑灰色。(B)人胃和小腸的CA9的RT-PCR分析,使用不區(qū)分各剪接變體的hlS-h6A引物[SEQIDNOS:95和96。(C)人組織中FL和AS轉(zhuǎn)錄物兩者的擴(kuò)增,使用h6S-hllA引物[SEQIDNOS:97和98。(D)從人FL和ASCA9cDNAs推斷的^J^酸序列的比較。信號肽(SP)用斜體字表示,蛋白聚糖樣結(jié)構(gòu)域(PG)用粗體表示,碳酸酐酶結(jié)構(gòu)域(CA)加實(shí)線框表示,起始于氨基酸(aa)415的跨膜區(qū)域(TM)加虛線框表示。虛線代表在AS中刪除的氨基酸殘基。結(jié)合催化性鋅的組氨酸和涉及S-S鍵形成的半胱氨酸單獨(dú)地加虛線框表示。人FL和ASCAIX蛋白的預(yù)測結(jié)構(gòu)。圖4示出了人腫瘤細(xì)胞系和人組織中ASCAIX變體的表達(dá),人ASCA9的RT-PCR分析使用設(shè)計(jì)用于剪接變體的獨(dú)立擴(kuò)增的引物,用于FL的引物稱為h7S-h8A[SEQIDNOS:99和100,A用于S的引物稱為h7S-hlO/7A[SEQIDNOS:99和101(參見圖3)。P-肌動蛋白用作標(biāo)樣。從以下來源分離cDNAs:(A)暴露于正常含氧量(N)和低氧(H)48小時的細(xì)胞,(B)以低和高密度培養(yǎng)72小時的細(xì)胞,和(C)人的正常組織和贅生性組織。結(jié)果顯示,AS的表達(dá)是穩(wěn)定的,不依賴于低氧、密度和腫瘤表型。圖5示出了人ASCAIX的定位和寡聚。用pSG5C質(zhì)粒中的ASCA9cDNA永久性轉(zhuǎn)染CAIX陰性MDCK細(xì)胞和天然4氐氧-誘導(dǎo)表達(dá)FLCAIX的HeLa細(xì)胞。(A)使用既識別AS蛋白又識別FL蛋白的M75MAb進(jìn)行AS轉(zhuǎn)染細(xì)胞(AS)、FL轉(zhuǎn)染細(xì)胞(FL)和對照細(xì)胞(模擬的)的免疫熒光分析。(B)HeLa-AS和對照HeLa細(xì)胞的蛋白提取物和培養(yǎng)基的免疫印跡分析。用M75MAb檢測AS國轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的提取物以及培養(yǎng)基中的ASCAIX變體。圖6示出了FL和AS剪接變體形成寡聚物的能力。(A)非還原SDS-PAGE和用M75進(jìn)行的免疫印跡分析表明,AS不能形成寡聚物。(B)通過用MAbV/10(識別FL但不識別AS)或M75(識別這兩種變體)進(jìn)行HeLa-AS提取物的免疫沉淀反應(yīng),檢測寡聚物形式的剪接變體。使用過氧化物酶-標(biāo)記的M75使沉淀的寡聚物的組分顯現(xiàn)。圖7示出了過度表達(dá)的AS變體對酸化、抑制劑結(jié)合和球狀體形成的影響。(A)分別在正常含氧量和低氧下培養(yǎng)AS轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞和相關(guān)模擬轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞48h,試驗(yàn)結(jié)束時立即檢測培養(yǎng)基的胞外pH值。數(shù)據(jù)表示為含氧量正常細(xì)胞vs低氧細(xì)胞中檢測到的pH值之間的差異(ApH),包括標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明AS的表達(dá)降低低氧下FLCAIX蛋白介導(dǎo)的酸化。(B)在MDCK-AS轉(zhuǎn)染子的條件培養(yǎng)基中不存在(對照)或存在分泌的AS變體的情況下,用熒光CA抑制劑(FITC-CAI)處理組成型表iiAFLCAIX蛋白的經(jīng)MDCK-CAIX轉(zhuǎn)染的細(xì)胞48小時。條件培養(yǎng)基與新鮮的培養(yǎng)基混合。FITC-CAI僅結(jié)合低氧細(xì)胞,并在AS蛋白的存在下顯著被降低。(C)用一半(1/2AS)或者三分之一(1/3AS)的來自MDCK-AS細(xì)胞的條件培養(yǎng)基重復(fù)進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)。用Scion影像軟件利用獲得的影像評價FITC-CAI的結(jié)合和相應(yīng)的熒光。數(shù)據(jù)表示為無AS的情況下陽性對照的百分比,其中與FITC-CAI—起培養(yǎng)的低氧MDCK誦CAIX細(xì)胞代表陽性對照。結(jié)果證實(shí),AS降低FITC-CAI對CAIX的結(jié)合。(D)分別顯示生長自對照模擬轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞和AS轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞的球狀體的顯微影像。對照HeLa細(xì)胞表達(dá)低氧誘導(dǎo)的、功能性FLCAIX蛋白并產(chǎn)27生形成緊湊核心的球狀體。含有低氧誘導(dǎo)的FLCAIX和組成型表達(dá)AS兩者的HeLa-AS細(xì)胞含有木沐的核心,這可能是由于AS相對于FL的功能減弱,從而導(dǎo)致低氧核心細(xì)胞的存活量減少。圖8A-C提供如本文所述分離的MNcDNA克隆的核苷酸序列SEQIDNO:11。Figure8A-C還顯示該cDNA編碼的預(yù)測的氨基酸序列[SEQIDNO:2。圖9A國F提供MN的完全10,898bp基因組序列[SEQIDNO:3。堿基計(jì)算如下2654A;2739C;2645G;和2859T。11個外顯子一般以大寫字母表示,但通過核糖核酸酶保護(hù)試驗(yàn)測定認(rèn)為外顯子l從位置3507開始。圖10是人MN基因的推定啟動子的核苷酸序列[SEQIDNO:24。核苷酸從根據(jù)核糖核酸酶保護(hù)試驗(yàn)測得的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)開始編號。列出了可能的調(diào)控元件。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)用相應(yīng)核苷酸上面的星號(核糖核酸酶保護(hù))和點(diǎn)(RACE)表示。第一個外顯子序列在星號下開始。MN4啟動子片段的FTP分析顯示,5個區(qū)域(1-V)在編碼和非編碼鏈上均受保護(hù),兩個區(qū)域(VI和VII)在編碼鏈?zhǔn)鼙Wo(hù)但在非編碼鏈不受保護(hù)。發(fā)明詳述MN/CAIX蛋白作為控制pH值和細(xì)胞粘著的調(diào)節(jié)機(jī)制的一部分而在功能上與腫瘤發(fā)生有關(guān)。MN/CAIX主要在低氧下通過HIF-1途徑被誘導(dǎo);HIF-1也可能通過不同的胞外信號和致癌變化而在正常含氧量情況下表達(dá),所述胞外信號和致癌變化例如高細(xì)胞密度、通過PI3K途徑傳導(dǎo),這些能夠?qū)е翸N/CAIX表達(dá)增加。HIF1和PI3K途徑均增加HIF-1蛋白水平,而這種增加能夠被轉(zhuǎn)換為增加的MN/CAIX水平。如以下實(shí)施例所示,發(fā)明人發(fā)現(xiàn),除編碼低氧誘導(dǎo)的、具有高度酶活性和調(diào)節(jié)pH能力的CAIX蛋白的全長(FL)CA9轉(zhuǎn)錄物之外,還有豐度較小的、組成型-產(chǎn)生的、旁路剪接(AS)CA9轉(zhuǎn)錄物。如以下實(shí)施例2證明的,人CA9mRNA的旁路剪接變體不含有外顯子8和9,不依賴于低氧而在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。在沒有全長轉(zhuǎn)錄本時也可在正常組織中檢測到所述剪接變體,因此,基于對低氧-和癌癥-相關(guān)性CA9表達(dá)而進(jìn)行的預(yù)后研究中會產(chǎn)生假陽性數(shù)據(jù)。該剪接變體編碼截短的、缺少催化結(jié)構(gòu)域的C-末端部分的CAIX蛋白,其顯示減少的催化活性,定位在胞內(nèi)或被分泌。過度表達(dá)時,其降低全長CAIX蛋白酸化低氧細(xì)胞的胞外pH和結(jié)合碳酸酐酶抑制劑的能28力。實(shí)施例4和5描述的實(shí)驗(yàn)表明,人ASCAIX變體不限于質(zhì)膜上,當(dāng)過度表達(dá)時干擾FL蛋白的功能。實(shí)施例5中,用剪接變體cDNA轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞產(chǎn)生不形成緊湊核心的球狀體,這暗示它們不能適應(yīng)低氧應(yīng)激。這種AS能力可能在輕微低氧的條件下尤其相關(guān),此時細(xì)胞不遭受嚴(yán)重的酸中毒,也不需要過多的pH控制。不依賴于低氧-和腫瘤-的CAIXAS變體產(chǎn)生對CAIX的診斷、預(yù)后和治療方面有很多意義。未來對全長CA9mRNA(編碼功能性的CAIX蛋白)物,癌癥治療可基于CA9旁路剪接,例如通過設(shè)計(jì)用于反義和RNA干涉治療以及其他治療的寡核苷酸。腫瘤發(fā)生前/腫瘤性疾病作為本發(fā)明的診斷/預(yù)后和治療方法的對象的腫瘤發(fā)生前/腫瘤性疾病(以及受影響的組織)是與MN/CAIX異常表達(dá)相關(guān)的那些疾病。本文所用的"腫瘤發(fā)生前/贅生性組織"也可包括體液內(nèi)的腫瘤發(fā)生前/腫瘤細(xì)胞。優(yōu)選地,所述腫瘤發(fā)生前/腫瘤性疾病選自乳腺、尿路、膀胱、腎、卵巢、子宮、子宮頸、子宮內(nèi)膜、鱗狀上皮細(xì)胞、腺鱗細(xì)胞、陰道(vaginal)、陰門、前列腺、肝臟、肺、皮膚、甲狀腺、胰腺、睪丸、腦、頭頸、中胚層、肉瘤性(sarcomal)、胃、脾、胃腸、食管、以及結(jié)腸的腫瘤發(fā)生前/腫瘤性疾病。正常含氧量和低氧本文所用的"正常含氧量,,定義為具體哺乳動物組織中的氧張力(oxygentension)水平,其位于該組織的正常生理氧張力水平范圍內(nèi)。本文所用的"低氧"定義為穩(wěn)定具體組織或細(xì)胞中的HIF-la所需的氧張力水平。實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的低氧通常為2。/。p02或更低,但高于缺氧((T/op02,因?yàn)槿毖鯐?dǎo)致死亡)。涉及低氧的本文所述實(shí)施例是在2%pO;j下進(jìn)行的,這是一種示例性的低氧條件。然而,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以預(yù)期可理解為"低氧"并產(chǎn)生類似的試驗(yàn)結(jié)果的其他的氧張力水平。例如,Wykoff等[CancerResearch,60:7075-7083(2000)使用了0.1。/。p02作為代表性低氧條件來誘導(dǎo)CA9的HIF-1oc-依賴性表達(dá)。Tomes等描述了在示例性體外低氧條件,即0.3%、0.5%、和2.5%pO;j條件下HeLa細(xì)胞或初級人乳腺成纖維細(xì)胞中不同程度的HIF-1a穩(wěn)定和CA9表達(dá)[Tomes等,Br.CancerRes.Treat.81(1):61-69(2003)]?;蛘?,Kaluz等使用了示例性低氧條件0.5%p02用于試驗(yàn)誘導(dǎo)CA9[Kaluz等.,CancerRes.,63:917-922(2003),指出低氧的"實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)范圍"是0.1-l%pO2[CancerRes.,62:4469-4477(2002)。高于2。/。p02的氧張力水平也可能是低氧,如Tomes等所示,見上文?;趯IF-la穩(wěn)定性的測定,本領(lǐng)域技術(shù)人員將能確定某一條件是否為本文所定義的低氧。具體組織或細(xì)胞中的示例性低氧范圍可以是例如,約3%-約0.05%pO2,約2%-約0.1%pO2,約1%-約0.1%pO2,約0.5%-約0.1%p02。MN基因和蛋白術(shù)語"CAIX"和"MN/CA9"在本文認(rèn)為與MN同義。另外,認(rèn)為G250抗原指MN蛋白/多肽。Zavada等,WO93/18152和/或WO95/34650乂>開了MNcDNA序列[SEQIDNO:1(示于本文圖8中),MN氨基酸順序[SEQIDNO:2(也示于圖8中),以及MN基因組序列[SEQIDNO:3(示于本文圖9中)。MN基因包括11個外顯子和10個內(nèi)含子。示于圖8中的MNcDNA的ORF能編碼459個氨基酸的蛋白,計(jì)算分子量為49.7kd。MN蛋白的總體氨基酸組成偏酸性(ratheracidic),預(yù)測pi為4.3。通過雙向電泳和而后的免疫印跡對CGL3細(xì)胞自身產(chǎn)生的MN蛋白進(jìn)行分析顯示,與計(jì)算機(jī)預(yù)測一致,MN是一種酸性蛋白質(zhì),存在幾種等電位形式,pi范圍是4.7-6.3。示于圖8中的MN蛋白的頭37個氨基酸是推定的MN信號肽[SEQIDNO:4。MN蛋白具有胞外結(jié)構(gòu)域[圖8的氨基酸(aa)38-414[SEQIDNO:5、跨膜結(jié)構(gòu)域[aa415434;SEQIDNO:6j和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域[aa435-459;SEQIDNO:7。胞外結(jié)構(gòu)域含有蛋白聚糖樣結(jié)構(gòu)域[aa53-111:SEQIDNO:8和碳酸酐酶(CA)結(jié)構(gòu)域[aa135-391;SEQIDNO:9。CA結(jié)構(gòu)域?qū)﹀^定獨(dú)立性(anchorageindependence)非常重要,而TM錨和IC尾對該生物效應(yīng)不是必要的。MN蛋白在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中還能夠造成質(zhì)膜皺褶,似乎參與細(xì)胞對固相支持體的附著。數(shù)據(jù)證明MN參與調(diào)控細(xì)胞增殖、粘著和細(xì)胞間通訊。MN基因一克隆和測序圖8A-C提供全長MNcDNA克隆的核苷酸序列[SEQIDNO:1。圖9A-F提供MN完全基因組序列[SEQIDNO:3。建議的MN啟動子的核苷酸序列[SEQIDNO:24]示于圖9A-F(nt3001-3540)和圖10中。應(yīng)理解,由于遺傳密碼簡并,即,多于一種密碼子編碼一個氨基酸[例如,密碼子TTA、TTG、CTT、CTC、CTA和CTG各編碼氨基酸亮氨酸(leu)J,核苷酸序列例如SEQIDNOS:1和3的變化(其中一種密碼子被另一種密碼子代替)可以產(chǎn)生與本發(fā)明蛋白或多肽基本上等同的蛋白或多肽。所有這些MNcDNA核苷酸序列和互補(bǔ)核酸序列的變化均包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。還應(yīng)理解,本文描述并示于圖8、9和10中的核苷酸序列僅代表本文分離和描述的cDNA、基因組和啟動子核苷酸序列的精確結(jié)構(gòu)。預(yù)期將發(fā)現(xiàn)經(jīng)稍微修飾的核苷酸序列或可通過本領(lǐng)域已知技術(shù)來對其修飾,以編碼基本上相似或同源的MN蛋白和多肽(例如具有相似的表位的那些MN蛋白和多肽),就本發(fā)明目的而言,認(rèn)為此類核苷酸序列和蛋白/多肽是等同的。i人為具有等同密碼子的DNA或RNA在本發(fā)明范圍內(nèi),這些DNA或RNA是編碼與MN蛋白/多肽同源或基本同源的蛋白/多肽的合成核酸序列,以及能夠在嚴(yán)格條件下與所述示例性序列SEQ.ID.NOS.1、3和24j雜交的那些核酸序列,或如果不是由于遺傳密碼的簡并性將能夠在嚴(yán)格雜交條件下與所述cDNA核酸序列雜交的那些核酸序列。認(rèn)為本文指出的核酸序列的修飾和變化產(chǎn)生了與示例性MN序列及其片段基本上相同的序列。只有具有至少80-90%(優(yōu)選至少90%)的同源性的非常密切相關(guān)的核普酸序列才能夠在嚴(yán)格條件下彼此雜交,示于圖8中的MNcDNA序列和對應(yīng)的人碳酸酐酶II(CAII)cDNA的序列比較表明,這兩種序列間的同一性不足以使具有25個或更多核苷酸的CAIIcDNA序列片段在嚴(yán)格雜交條件下與MNcDNA雜交,反之亦然。本文考慮的嚴(yán)格雜交條件與本領(lǐng)域理解的標(biāo)準(zhǔn)雜交條件一致。例如,通常理解嚴(yán)格條件包括相對低鹽和/或高溫條件,例如0.02M-0.15MNaCl,溫度50x:-70x:??赏ㄟ^加入遞增量的甲酰胺(其作用是像提高溫度一樣使雜交雙鏈不穩(wěn)定)使較不嚴(yán)格的雜交條件(例如0.15-0.9M鹽、溫度20X:-55匸)變得更加嚴(yán)格。示例性嚴(yán)格雜交條件描述在Sambrook等,MolecularCloning:4LaboratoryMa畫l.第1.91和9.47-9.51頁(第二版,ColdSpringHarbor31LaboratoryPress;ColdSpringHarbor,N.Y.;1989);Maniatis等,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第387-389頁(ColdSpringHarborLaboratory;ColdSpringHarbor,N.Y.;1982);Tsuchiya等,OralSurgery,OralMedicine,OralPathology,71(6、:721-725(1991年6約);美國專利No.5,989,838、美國專利No.5,972,353、美國專利No.5,981,711和美國專利No.6,051,226。含有MN基因組序列(SEQIDNO:3)的質(zhì)粒一A4a克隆及XE1和XE3亞克隆于1995年6月6日保藏在美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC),ATCC保藏號分別為97199、97200和97198。完整的MN基因組區(qū)域的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)重疊克隆的全序列含有10,898bp(SEQIDNO:3)。人MN基因含有11個外顯子以及2個上游的、6個內(nèi)含子中的(intronic)Alu重復(fù)元件。除了第一個外顯子為445bp外,所有的外顯子都較小,為27-191bp。內(nèi)含子大小為89-1400bp。CA結(jié)構(gòu)域由外顯子2-8編碼,而外顯子1、lO和ll分別對應(yīng)MN/CAIX蛋白的蛋白聚糖樣結(jié)構(gòu)域、跨膜錨和胞質(zhì)尾。下表1列出了與包括AG-GT基序的共有剪接序列[MountNucleicAcidsRes.10:459-472(1982)1—致的剪接供體和受體序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>Zavada等,WO95/34650描述了定位MN基因轉(zhuǎn)錄起始和終止位點(diǎn)的方法步驟。核糖核酸酶保護(hù)試驗(yàn)用于MN基因5'末端的精細(xì)定位。探針是均勻標(biāo)記的470個核苷酸的RNA(核苷酸-205至+265)[SEQIDNO:66j,將其雜交于表達(dá)MN的HeLa和CGL3細(xì)胞中的總RNA,在測序凝膠上分析。分析顯示,MN基因轉(zhuǎn)錄在多位點(diǎn)起始,最長的MN轉(zhuǎn)錄物的5'末端比之前用種族鑒定的長30核苷酸。小鼠Cfl,9cDNA先前已經(jīng)描述了編碼小鼠CAIX的cDNA和基因的克隆和表征[Ortova-Gut等,Gastroenterology,123:1889-1卯3(2002)。用衍生自人cDNA的引物和從C57BL/6J小鼠胃中分離到的模板RNA進(jìn)行RT-PCR從而分離小鼠C"尸9cDNA片段。在5,/3,兩個方向進(jìn)行cDNA末端的快速擴(kuò)增以獲得全長cDNA。它包括1982bp,由以下區(qū)域組成49bp的5,非翻譯區(qū),1311bp的開放讀框和622bp的3'非翻譯序列(保存在EMBL數(shù)據(jù)庫中,登錄號為AJ245857;SEQIDNO:71)。Cflr9cDNA能編碼437個氨基酸的蛋白(保存在EMBL數(shù)據(jù)庫中,登錄號為CAC80975(Q8VDE4);SEQIDNO:73),理論分子量為47.3kDa。該小鼠蛋白與它的人同源物顯示69.5%的序列同一性,并且具有相似的預(yù)測結(jié)構(gòu)域排列[Opavsky等(1996)]。氨基酸(aa)1-31(SEQIDNO:74)對應(yīng)于信號肽。成熟蛋白質(zhì)的N-末端胞外區(qū)(aa32-389)(SEQIDNO:75)由以下區(qū)域組成蛋白聚糖樣區(qū)域(aa48-107)(SEQIDNO:76)、碳酸酐酶結(jié)構(gòu)域(aa112-369)(SEQIDNO:77)。C-末端區(qū)域(aa390-437)(SEQIDNO:78)由以下區(qū)域組成跨膜錨(aa390-411)(SEQIDNO:79)和短的胞質(zhì)尾區(qū)(aa412-437)(SEQIDNO:80)。小鼠和人CAIX之間的大多數(shù)序列差異發(fā)現(xiàn)于蛋白聚糖樣(PG)區(qū)域內(nèi),而CA結(jié)構(gòu)域顯示保守性最高。然而,涉及酶活性位點(diǎn)的5個關(guān)鍵氨基酸(His94,His96,Glu106,His119,Thr199)[Christianson和Cox,Annu.Rev.Biochem.,68:33畫57(1999)中,在人CAIX中都是保守的,但在小鼠同工酶中有一個發(fā)生了變化(Thr'"卄Ser)。盡管存在該取代,但小鼠CAIX仍然結(jié)合于氨磺酰瓊脂糖,暗示它可能具有酶活性。CflWcDNA的可用性允許分析小鼠組織中CflWmRNA的表達(dá)才莫式。利用設(shè)計(jì)用來檢測編碼CA結(jié)構(gòu)域的區(qū)域的3'部分的170bp核糖探針(riboprobe)進(jìn)行核糖核酸酶保護(hù)試驗(yàn)(RNP)。正如基于在人和大鼠組織中的分布所預(yù)期的,在小鼠胃中檢測到最高水平的Ozr9mRNA。在小腸和結(jié)腸中發(fā)現(xiàn)了中等水平的Qir9mRNA,而腎和腦顯示非常弱的表達(dá)。肝臟和脾顯示陰性結(jié)果。值得注意的是,RNP信號也存在于E18.5胚胎日齡的小鼠胚胎中,^"旦不存在于胚胎干細(xì)胞和E10.5胚胎中。這可顯示CAIX在小鼠胃腸道發(fā)育過程中的作用。小鼠Ow9基因的結(jié)構(gòu)為了分離C"r9基因并測定其結(jié)構(gòu),使用全長G^9cDNA篩選小鼠胚胎干細(xì)胞129/01a基因組文庫(載體為pBAC108L)。通過對小鼠野生型基因組DNA的限制性內(nèi)切酶圖析和DNA印跡分析,證實(shí)獲得一個BACM-355(G13)克隆,它含有完整的CVi,9基因組序列。將來源于該克隆的三個重疊基因組片段亞克隆入pBluescriptIIKS?;蚪M序列(GenBank登錄號AY049077;SEQIDNO:72)分析顯示,OirP基因覆蓋了6.7kb的小鼠基因組,由11個外顯子和IO個內(nèi)含子組成。內(nèi)含子的分布和外顯子與蛋白結(jié)構(gòu)域的關(guān)系與人中對應(yīng)的基因類似[Opavsky等(1996)]。Southern雜交模式指出Ow9是單拷貝基因。覆蓋5.9kb并跨越啟動子區(qū)域和外顯子1-6的EcoRI-HindIII片段用于構(gòu)建目標(biāo)載體。MN蛋白和/或多肽短語"MN蛋白和/或多肽"(MN蛋白/多肽)在本文定義為指MN基因或其片段編碼的蛋白和/或多肽。根據(jù)本發(fā)明的示例性且優(yōu)選的MN蛋白的推定的氨基酸序列示于圖8中。優(yōu)選的MN蛋白/多肽是與圖8中所示的MN蛋白具有顯著同源性的那些蛋白和/或多肽。例如,此類顯著同源的MN蛋白/多肽是與本發(fā)明的MN-特異性抗體(優(yōu)選MabsM75、V/10、MN12、MN9和MN7或它們的等同物)反應(yīng)的那些。分泌M75Mab的VU-M75雜交瘤于1992年9月17日保藏在ATCC,保藏號為HB11128。"多肽"或"肽"是通過肽鍵共價連接的一串氨基酸,本文認(rèn)為由50個或更少的氨基酸組成。"蛋白"在本文定義為由超過50個氨基酸組成的多肽。術(shù)語多肽涵蓋術(shù)語肽和寡肽。本文所用的"ASMN/CAIX"、"ASCAIX"或"ASMN"指由MN/C49mRNA的AS形式編碼的蛋白和/或多肽。MN蛋白顯示幾種有趣的特點(diǎn)細(xì)胞膜定位、HeLa細(xì)胞中的細(xì)胞密度依賴性表達(dá)、與HeLax成纖維體細(xì)胞雜種的致瘤表型相關(guān)、以及在很多人贅生性組織以及其他組織中表達(dá)。MN蛋白可直接在贅生性組織切片中找到,但通常在相應(yīng)的正常組織中找不到(如上所述在正常胃粘膜和膽嚢組織中例外)。MN有時也在顯示發(fā)育不良和/或惡性的組織樣本的形態(tài)上看上去正常的區(qū)域中表達(dá)。綜合起來,這些特點(diǎn)表明,MN參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和/或轉(zhuǎn)化??梢岳斫猓w內(nèi)贅生性細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白或多肽可能與細(xì)胞培養(yǎng)中的腫瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞所產(chǎn)生的蛋白或多肽序列不同。因此,具有改變的氨基酸序列(包括但不限于氨基酸取代、延伸、缺失、截短及它們的組合)的MN蛋白和/或多肽均落在本發(fā)明范圍內(nèi)。也可以理解,存在于體液內(nèi)的蛋白可經(jīng)歷降解過程,例如蛋白水解過程;因此,可在體液(例如血清)中發(fā)現(xiàn)顯著截短的MN蛋白和MN多肽。短語"MN抗原"在本文用于涵蓋MN蛋白和/或多肽。還可以理解,可通過遺傳技術(shù)來修飾MN蛋白和多肽的氨基酸序列??蓜h除或取代一個或多個氨基酸。此類氨基酸改變可不引起該蛋白或多肽的生物活性的任何可測量的變化,并產(chǎn)生本發(fā)明范圍內(nèi)的蛋白或多肽以及MN突變蛋白。根據(jù)本發(fā)明,可通過多種方式制備本發(fā)明的MN蛋白和多肽,例如,可通過重組、合成或生物學(xué)方法(即酶法和/或化學(xué)方法裂解較長的蛋白和多肽)來制備。優(yōu)選的MN蛋白制備方法是重組方法。MN蛋白和多肽重組體的產(chǎn)生制備MN蛋白(例如示于圖8中的MN蛋白或其片段)的一種代表性方法是將全長MNcDNA或其合適的片段插入合適的表達(dá)載體。Zavada等WO93/18152(見上文)中描述了使用部分cDNA在載體pGEX-3X(Pharmacia)中生產(chǎn)融合蛋白GEX-3X-MN(現(xiàn)在稱為GST-MN)。非糖基化GST-MN(MN融合蛋白MN谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)來自XL1-Blue細(xì)胞。Zavada等WO95/34650描述了使用表達(dá)質(zhì)粒pEt-22b[NovagenInc.;Madison,WI(USA)1從昆蟲細(xì)胞表達(dá)糖基化的MN蛋白和從大腸桿菌表達(dá)非糖基化MN蛋白而進(jìn)行的重組體生產(chǎn)。用重組桿狀病毒表達(dá)載體感染昆蟲細(xì)胞。在桿狀病毒-感染的sf9細(xì)胞中重組產(chǎn)生糖基化的MN20-19蛋白[Clontech;PaloAlto,CA(USA)。MN-特異性抗體的制備本文定義的術(shù)語"抗體"不僅包括完整抗體,而且包括抗體的生物學(xué)活性片段,優(yōu)選含有抗原結(jié)合區(qū)域的片段。對MN蛋白和另一種組織特異性抗原均具有特異性的雙特異性抗體也包括在抗體的定義中??捎糜杏糜诒景l(fā)明方法中的抗體可通過常規(guī)方法制備和/或通過遺傳工程制備??贵w片段可以是經(jīng)過遺傳工程化的,優(yōu)選來自輕鏈和/或重鏈(Vu和VL)的可變區(qū),包括高變區(qū),更優(yōu)選來自Vh和VL兩種區(qū)域。例如,本文所用術(shù)語"抗體"包括多克隆和單克隆抗體及其生物學(xué)活性片段,包括"一價"抗體及其它可能性;Fab蛋白,包括Fab'和共價或非共價聚集的F(ab)2片段;單獨(dú)的輕鏈或重鏈,優(yōu)選重鏈和輕鏈的可變區(qū)(Vh和Vl區(qū)域),更優(yōu)選包括高變區(qū)或者稱為Vh和VL區(qū)的互補(bǔ)決定域(CDRs)l;F。蛋白;能結(jié)合多于一種抗原的"雜合"抗體;恒變區(qū)嵌合體(constant-variableregionchimeras);帶有不同來源的重鏈和輕鏈的"復(fù)合"免疫球蛋白;用標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)和寡核苷酸定向誘變技術(shù)[Dalbadie-MacFarland等,"Oligonucleotide-directedmutagenesisasageneralandpowerfulmethodforstudiesofproteinfunction,"PNASUSA79:6409(1982)]制備的特異性及其他特征改進(jìn)的"改變型"抗體。對于很多用途,特別是藥物用途或體內(nèi)示蹤而言,部分或更優(yōu)選地,特用本領(lǐng)域公知方法制備此類人源化抗體/抗體片段??捎萌魏纬R?guī)方式將本發(fā)明的用于鑒定MN蛋白/多肽的抗體標(biāo)記,例如用酶,例如辣根過氧化酶(HRP)、熒光化合物或用放射性同位素,例如125I以及很多其他標(biāo)記。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選的標(biāo)記是125I,優(yōu)選的抗體標(biāo)記方法是用氯胺-T。[Hunter,W.M""Radioimmunoassay,":HandbookofExperimentalImmunology14.1-14.40頁(D.W.Weir編;Blackwell,Oxford/London/Edinburgh/Melbourne;1978)。其他的示例性標(biāo)記可包括例如別藻藍(lán)蛋白及藻紅蛋白等。Zavada等WO93/18152和WO95/34650詳細(xì)描述了產(chǎn)生MN-特異性抗體的方法以及制備代表性MN-特異性抗體,如M75、MN7、MN9和MN12單克隆抗體的詳細(xì)步驟。表位MAb對含有表位的肽的親合力取決于具體情況,例如,所述肽是否是短序列(4-6aa),或是否這種短肽的一側(cè)或兩側(cè)側(cè)接了較長的aa序列,或在測試表位時,肽是否在溶液中或固定在表面上。因此,本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠預(yù)期,本文描述的MN特異性MAbs的代表性表位將根據(jù)所用的MAb的具體情況而不同。術(shù)語"對應(yīng)于MN蛋白多肽的表位"應(yīng)理解為包括這種實(shí)際的可能性,即,在有些情況下,天然存在的蛋白或多肽的氨基酸序列變化可能是抗原性的,并帶來抗肺瘤性疾病的保護(hù)性免疫和/或抗致瘤性作用??赡艿男蛄凶兓ǖ幌抻诎被崛〈?、延伸、缺失、截短、插入及它們的組合。假設(shè)含有這些氨基酸序列變化的蛋白或多肽是免疫性的,并且這些多肽或蛋白引發(fā)的抗體在作為疫苗給藥時,與天然存在的MN蛋白和多肽交叉反應(yīng)的程度足夠提供保護(hù)性免疫和/或抗致瘤性活性,則此類氨基酸序列變化均落在本發(fā)明范圍內(nèi)。PG結(jié)構(gòu)域和鄰近區(qū)域的免疫顯性表位如上所述,全長CAIX的胞外結(jié)構(gòu)域含有PG和CA結(jié)構(gòu)域以及一些間隔區(qū)或也許有一些絞鏈區(qū)。CAIX免疫顯性表位主要在PG區(qū)域中,在大約aa53-111(SEQIDNO:8)或在大約aa52國125(SEQIDNO:81),現(xiàn)在認(rèn)為優(yōu)選在大約aa52-125(SEQIDNO:81)。CAIX的免疫顯性表位可位于鄰近PG區(qū)域的區(qū)域內(nèi)。例如,aa36-51(SEQIDNO:21)的表位認(rèn)為是免疫顯性表位。主要的CAIX免疫顯性表位是針對M75mab的表位。M75單克隆抗體被認(rèn)為是針對CAIX的蛋白聚糖樣(PG)區(qū)域的N-末端中的免疫顯性表位。氨基酸序列的比對說明MN/CAIX蛋白的PG區(qū)域(aa53-lll)[SEQIDNO:8J和人聚集蛋白聚糖(aa781-839)[SEQIDNO:lOj之間有顯著同源性。M75的表位已鑒定為氨基酸序列PGEEDLP(SEQIDNO:11),其是CAIX的氨基末端PG區(qū)域中的4x相同的重復(fù)[Zavada等(2000)]。也可與M75mab結(jié)合的非常相關(guān)的表位(這些也是示例性的免疫顯性表位)包括例如,可在圖8A-8C(顯示預(yù)測的CAIX氨基酸序列)的氨基酸(aa)61-96(SEQIDNO.12)中發(fā)現(xiàn)的免疫顯性6X串聯(lián)重復(fù)。PG結(jié)構(gòu)域中的免疫顯性串聯(lián)重復(fù)表位的變化包括GEEDLP(SEQIDNO:13)(aa61-66、aa79-84、aa85-90和aa91-96)、EEDL(SEQIDNO:14)(aa62-65、aa80-83、aa86-89、aa92-95)、EEDLP(SEQIDNO:15)(aa62-66、aa80-84、aa86-卯、aa92-96)、EDLPSE(SEQIDNO:16)(aa63-68)、EEDLPSE(SEQIDNO:17)(aa62-68)、DLPGEE(SEQIDNO:18)(aa82-87、aa88-98)、EEDLPS(SEQIDNO:19)(aa62-67)和GEDDPL(SEQIDNO:20)(aa55-60)。其他的免疫顯性表位可包括例如,aa68-91(SEQIDNO:22)。單克隆抗體MN9和MN12被認(rèn)為是分別針對氨基末端PG區(qū)域SEQIDNOS:19-20內(nèi)的免疫顯性表位。MN7單克隆抗體可針對鄰近PG區(qū)域位于圖8A-8C的aa127-147(SEQIDNO:23)的免疫顯性表位。CA結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:9)內(nèi)優(yōu)選的表位來自約aa279-291(SEQIDNO:67)。胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(IC結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:7)內(nèi)優(yōu)選的表位來自于約aa435國450(SEQIDNO:68)。SEQIDNO:69(圖8A-8C的aa166-397)被認(rèn)為是CA結(jié)構(gòu)域的一種重要的抗原成分。CA結(jié)構(gòu)域內(nèi)有幾個抗原位點(diǎn)。在CAIX-缺失小鼠中已制備了四組CAIX特異性單克隆抗體,以使它們針對CA結(jié)構(gòu)域;其中三組在SEQIDNO:69內(nèi)??乖稽c(diǎn)還可部分地位于氨基酸135-166(SEQIDNO:84)上。特利時根特、登錄號為LMBP6009CB的BCCMTM/LMBP雜交瘤VU-V/10產(chǎn)生的V/10單克隆抗體。試驗(yàn)篩選組織中的AS和FLMN/CAIX表達(dá)的試驗(yàn)這些方法可包括在取自診斷患有腫瘤發(fā)生前/腫瘤性疾病的病人的樣品中篩選AS和/或FLMN/CA9基因表達(dá)產(chǎn)物(如果有的話);MN/CA9基因表達(dá)產(chǎn)物可以是AS或FL形式的MN蛋白、MN多肽、編碼MN蛋白或多肽的mRNA、對應(yīng)于編碼MN蛋白或多肽的mRNA的cDNA等??墒苟喾N形式適合用于本發(fā)明的方法。例如可通過核酸擴(kuò)增方法例如使用PCR、RT-PCR、實(shí)時PCR、或?qū)崟r定量RT-PCR或通過利用微陣列芯片進(jìn)行AS和/或FLMNmRNA的檢測和定量。AS和/或FLMN蛋白或MN多肽的檢測和定量可通過以下試驗(yàn)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、放射免疫測定、竟?fàn)幟庖邷y定、雙抗體夾心試驗(yàn)、免疫組織化學(xué)染色試驗(yàn)、凝集試驗(yàn)、熒光免疫測定、使用免疫金的免疫電子和掃描顯微鏡法以及本領(lǐng)域通常所知的其他試驗(yàn)。這些試驗(yàn)中MNAS和/或FL基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測可通過本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法來進(jìn)行。核酸探針和/或引物本發(fā)明的核酸探針和/或是含有與圖8所示MNcDNA序列[SEQIDNO:l]或其他的MN基因序列(例如圖9A-F所示的完整基因組序列[SEQIDNO:31)互補(bǔ)或基本上互補(bǔ)的序列的那些。短語"基本上互補(bǔ)"在本文定義為本領(lǐng)域充分理解的含義,因此用在標(biāo)準(zhǔn)雜交條件的背景(context)中??烧{(diào)節(jié)雜交條件的嚴(yán)格性以控制互補(bǔ)的精確性。如果兩個核酸在嚴(yán)格雜交條件下彼此雜交,則這兩個核酸是例如基本上彼此互補(bǔ)的。如上所述,只有具有至少為80-90%(優(yōu)選至少90%)的同源性的非常相關(guān)的核苷酸序列才會在嚴(yán)格條件下彼此雜交??捎糜诒景l(fā)明的尤其優(yōu)選的探針和/或引物是區(qū)分全長[FL]和旁路剪接[AS]MN/CA9mRNA表達(dá)的探針和/或引物。很多最近的文章提供了有關(guān)癌癥中的旁路剪接的一般信息和有關(guān)用于檢測癌癥相關(guān)基因表達(dá)的mRNA變體的特異性探針和/或引物設(shè)計(jì)的具體信息,根據(jù)這些信息,可設(shè)計(jì)用于檢測AS和/或FLCA9mRNA變體的探針和/或引物[參見,例如Matlin等,NatRevMolCellBiol,6:386-398(2005);VenablesJP,BioEssavs,28:378-386(2006);Skotheim和Nees,IntJBiochemCellBiol.,39(7-8):1432-1449(2007);Srebrow和Kornblihtt,JCellSci.,119fPt13):2635-2641(2006);Gothie等.,JBiolChem,275:6922-6927(2000);Robinson等"JCellSci.,114:853-865(2001);He等.,Oncogene,25:2192-2202(2006);Roy等.,NucleicAcidsRes.,33(16):5026-5033(2005);Taconelli等.,CancerCell,6:347-360(2004)。一種方法中,僅用于檢測FLCA9mRNA的至少一用于檢測ASCA9mRNA的至少一種探針或引物來源于旁路剪接產(chǎn)生的結(jié)點(diǎn)。例如,人FLMN/C45Mt異性探針/引物可包含以充分的特異性結(jié)合(優(yōu)選特異性結(jié)合)于人MN/C49基因的外顯子8或外顯子9的核酸,或以充分的特異性結(jié)合(優(yōu)選特異性結(jié)合)于人MN/C49基因的外顯子7和8的剪接點(diǎn)、外顯子8和9的的剪接點(diǎn)或外顯子9和10的剪接點(diǎn)的核酸;或可合)的任何核酸。類似地,人ASMN/CA9特異性探針/引物可包含以足夠的40特異性與人MN/CA9基因的外顯子7和外顯子10的剪接點(diǎn)的結(jié)合(優(yōu)選特異性結(jié)合)的核酸;或可包含充分同源從而以足夠的特異性與該剪接點(diǎn)的結(jié)合(或優(yōu)選特異性結(jié)合)的任何核酸。或者,探針和/或引物可用于檢測FL和ASCA9mRNA兩者,且FL和ASmRNA產(chǎn)物的長度有別,例如可在凝膠上區(qū)分?;贛N旁路剪接變體的癌癥治療方法很多文章討論了基于癌癥相關(guān)基因的旁路剪接變體的癌癥治療方法,并提供了用于反義和RNA干擾治療以及其他治療方法的寡核苷酸的設(shè)計(jì)策略[例如,Garcia-Blanco,CurrOpinMolTher.,7f5、:476-482(2005);Wilton和Fletcher,CurrGeneTher.,467-483(2005);Pajares等,LancetOncol.,8"、:349-357,7、:XingY.,F(xiàn)rontBiosci.,12:4034-4041(2007)"例如,本領(lǐng)域一般才支術(shù)人員可分別從SEQIDNOS:1和108的核酸序列確定對人FLCA9mRNA有特異性但對人ASCA9mRNA沒有特異性的合適的反義核酸序列,優(yōu)選反義寡核苷酸。除了由AS形式的CA9mRNA表達(dá)的完整ASMN/CAIX之外,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以預(yù)期,分離的ASMN/CAIX蛋白或多肽片段將能夠干擾FLMN/CAIX活性。因此,干擾FLMN/CAIX活性的衍生自ASMN/CAIX的任何蛋白或多肽都考慮在本發(fā)明的治療方法的范圍內(nèi)。MNRNA干擾(MNRNAi)可例如利用對MN基因表達(dá)的RNA干擾作用來抑制MN基因的表達(dá)。RNA干擾是一種使用RNA來抑制基因表達(dá)的方法,如近年已報(bào)道[Elbashir等.,Nature,411:494-498f2001、1。更具體地說,可使用對MN基因的具體mRNA剪接變體(例如FL剪接變體)的表達(dá)顯示RNA干擾作用的一種或多種寡核苷酸來抑制MN基因的表達(dá)??赏ㄟ^用含有cDNA片段的載體或其互補(bǔ)RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞來抑制MN基因的mRNA剪接變體的表達(dá)。因此,含有所述寡核苷酸的用于抑制MN剪接變體的物質(zhì)也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。用于抑制MNmRNA剪接變體的物質(zhì)可含有一種寡核苷酸,或可含有兩種或更多種寡核苷酸??赏ㄟ^使用MN基因表達(dá)體系來選擇特異性沉默F(xiàn)LmRNA變體表達(dá)的寡核苷酸,從而從基于MN基因的AS和/或FLmRNA變體核苷酸序列而設(shè)計(jì)的寡核苷酸中獲得顯示RNA干擾作用的所述寡核苷酸。MN基因治療載體就使用寡核苷酸抑制FLMN/CAIX表達(dá)而言,有可能通過使用基因療法將寡核苷酸引入靶細(xì)胞中。可使用已知的方法進(jìn)行基因治療。例如,可使用非病毒性轉(zhuǎn)染(包括通過注射直接給予寡核苷酸)或使用病毒載體轉(zhuǎn)染。非病毒性轉(zhuǎn)染的優(yōu)選方法包括給予含有寡核苷酸的磷脂載體(例如脂質(zhì)體),以及包括通過注射直接給予寡核苷酸的方法。用于轉(zhuǎn)染的優(yōu)選栽體是病毒載體,更優(yōu)選DNA病毒載體,例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體和牛痘病毒載體或RNA病毒載體。材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)、組織和抗體于濕潤氣氛、5%C02、37匸下,在補(bǔ)充有10%FCS(BioWhittaker,Verviers,比利時)和40jig/ml慶大霉素(LekSlovenia)的DMEM中培養(yǎng)小鼠NIH3T3成纖維細(xì)胞、犬MDCK上皮細(xì)胞、衍生自腎癌的人腫瘤細(xì)胞系CAKI-1和ACHN以及來自宮頸癌的Caski、SiHa、HeLa和C33a細(xì)胞系。低氧處理在厭氧性工作站(RuskinTechnologies,Bridgend,英國)、2%02、5%C02、10%112和83%]\2、37X:進(jìn)行。37t;下從懸掛在組織培養(yǎng)皿蓋上的每2(Hd滴狀培養(yǎng)基中的400個細(xì)胞預(yù)先形成(pre-form)HeLa球狀體,持續(xù)3天。將所得的細(xì)胞聚集體轉(zhuǎn)移到具有非粘性(non-adherent)表面的皮式培養(yǎng)皿中,懸浮培養(yǎng)另外11天,每三天更換培養(yǎng)基。用NikonE400顯微鏡檢查球狀體,用NikonCoolpix990照相機(jī)拍照。人組織選自先前描述的集合(collection)(Kivela等,2005)。小鼠組織取自頸脫位致死的BALB/c小鼠。這些組織存儲在-80X:直到用于RNA分離和/或蛋白抽提。早先已表征了特異性針對人MN/CAIX蛋白的M75和V/10小鼠MAb(Pastorekova等,1993,Zatovicova等,2003)。二級抗小鼠過氧化物酶綴合抗體和與辣才艮過氧化物酶綴合的抗兔抗體來自于Sevapharma(Prague,CzechRepublic),抗小鼠FITC綴合抗體來自于VectorLaboratories,(BurlingameCA)。Alexa488綴合的抗兔二級抗體獲自AdvancedTargetingSystems(SanDiego,CA)。免疫熒光如先前所述進(jìn)行免疫熒光(Svastova等,2004)。生長在玻璃蓋玻片上的細(xì)胞用冰冷的PBS清洗兩次,在20X:用冷曱醇固定5分鐘。蓋玻片與含有1%BSA的PBS于37X:孵育30分鐘,然后與含有M75MAb的未稀釋的雜交瘤培養(yǎng)基或1:1000稀釋的兔抗mCAIX多克隆血清一起孵育。其他文獻(xiàn)描述了抗小鼠CAIX蛋白的抗體(Gut等,2002)。在濕潤的小室中于37匸用初級抗體進(jìn)行孵育1小時。蓋玻片用含有0.02%吐溫-20的PBS洗滌三次(10分鐘),然后在PBS中用1:300稀釋在0.5%BSA中的熒光素綴合的抗小鼠二級抗體于371C處理1小時,或在PBS中用1:1000稀釋在0.5%BSA中的抗兔Alexa488綴合的二級抗體處理。用PBS清洗三次(10分鐘)之后,將蓋玻片用固定劑(mountingmedium)(Calbiochem,Cambridge,MA)固定在顯微鏡載玻片上,然后用NikonE400顯微鏡檢查并用NikonCoolpix990照相機(jī)拍照。表達(dá)質(zhì)粒用反向PCR從含有小鼠CA9cDNA的pSG5C-Car9質(zhì)粒產(chǎn)生編碼小鼠剪接變體的真核生物表達(dá)質(zhì)粒pSG5C-mAS。正向引物自外顯子9的起始位點(diǎn)設(shè)計(jì)(m9S,5,-TCCATGTGAATTCCTGCTTCACTG-3,)SEQIDNO:102反向引物特異性針對外顯子6的末端(m6A,5,-CTTCCTCCGAGATTTCTTCCAAAT畫3,)[SEQIDNO:103]。類似地,用針對外顯子10和7的引物進(jìn)行反向PCR從含有全長人CA9cDNA(GenBank#X66839)的pSG5C畫MN/CA9表達(dá)質(zhì)粒(Pastorek等,1994)產(chǎn)生編碼人剪接變體的真核生物表達(dá)質(zhì)粒pSG5C-AS。正向引物(hl0S,5,-GTGACATCCTAGCCCTGGTTTTT國3,)[SEQIDNO:104特異性針對外顯子10的起始位點(diǎn),反向引物(h7A,5,國CTGCTTAGCACTCAGCATCACTG-3,)[SEQIDNO:105]特異性針對外顯子7的末端。同樣的h7A和hlOS引物用于由編碼無信號肽的全長CAIX蛋白的初級質(zhì)粒構(gòu)建物pGEX-3XCA9來制備編碼人CAIX蛋白的GST-融合剪接變體的細(xì)菌表達(dá)載體pGEX-3X-AS。使用Phusion聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增(Finnzymes,Espoo,F(xiàn)inland).PCR反應(yīng)由以下反應(yīng)組成開始在98"變性30秒,98X:變性10秒(32個循環(huán)),64X:退火30秒,72X:延伸l分40秒,最后721C延伸5分鐘。將PCR產(chǎn)物凝膠純化,用T4多核苷酸激酶處理,用T4DNA連接酶(InvitrogenCarlsbad,美國)連接。通過測序驗(yàn)證所有的構(gòu)建物。編碼含有人CAIX胞外部分的GST-PGCA融合蛋白的構(gòu)建物先前已有描述(Zatovicova等,2003)。下表2提供實(shí)施例中所用的引物序列。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>轉(zhuǎn)染將細(xì)胞接種在60mm的皮式培IM^中,第二天達(dá)到大約70%的密度。分另,J用2mg編碼人和小鼠CAix剪接變體的pSG5C-hAS和pSG5CmAS質(zhì)粒連同200ngpSV2neo質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。使用GenePorterII轉(zhuǎn)染試劑(Genlantis,SanDiego,CA),分別將2^g編碼人和小鼠CAIX剪接變體的pSG5C-hAS和pSG5C-mAS質(zhì)粒連同200ngpSV2neo質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用G418(Invitrogen)對轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行選擇,對HeLa細(xì)胞的濃度為900Mg/ml,對MDCK細(xì)胞的濃度為500pg/ml??寺】剐约?,通過免疫印跡測試剪接變體的表達(dá)并擴(kuò)增。熒光CA抑制劑的結(jié)合通過高磺胺和異硫氰酸熒光素反應(yīng)獲得熒光CA抑制劑(FITC-CAI),對CAIX的Kj值為24nM(Svastova等,2004,Cecchi等,2005)。將該抑制劑以100mM濃度和20。/o的DMSO溶于PBS中,臨加入細(xì)胞中前在培養(yǎng)基中稀釋至終濃度為1mM。將MDCK-CAIX細(xì)胞(Svastova等,2004)以4x1()5細(xì)胞/3.5cm培養(yǎng)皿的密度接種在含有分泌人AS變體的MDCK-AS轉(zhuǎn)染子產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中。對照細(xì)胞在沒有分泌的AS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培育24小時之后,補(bǔ)充同等的新鮮培養(yǎng)基,添加FITC-CAI至細(xì)胞,將細(xì)胞轉(zhuǎn)入低氧工作站,允許進(jìn)行結(jié)合另外48小時。平行樣品在正常含氧量中培養(yǎng)。最后,這些細(xì)胞用PBS洗滌5次,用NikonE400落射焚光顯微鏡觀察。使用ScionImageBeta4.02軟件(ScionCorporation,Frederick,MD)評價所獲得的影像的焚光強(qiáng)度,相關(guān)的FITC-CAI結(jié)合以百分比表示。蛋白抽提如先前所述(Svastova等,2004)用RIPA緩沖液從細(xì)胞單層或組織勻漿中抽提蛋白。在冰上用含有蛋白酶類Completemini抑制劑(RocheAppliedScience,Mannhein,德國)的RIPA緩沖液(PBS中的1%TritonX-100、0.1%脫氧膽酸鈉,lmM苯甲基磺酰氟)從細(xì)胞單層或組織勻漿中抽提蛋白30分鐘。抽提物以13000rpm離心15分鐘,按照制造商的說明書用BCA試驗(yàn)(Pierce,Rockford,IL)測定總蛋白濃度。在10%和8%SDSPAGE(在有2-巰基乙醇(還原條件)或沒有2-巰基乙醇(非還原條件)的Laemmli樣品緩沖液中)中分離總蛋白抽提物(含有30-50|1g的等分試樣)。免疫沉淀和免疫印跡從無FCS條件下在低氧和正常含氧量下培養(yǎng)24小時的AS轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基中制備樣品用于檢測人胞外AS。將四分之一的培養(yǎng)基(500inl)10倍濃縮,在SDS-PAGE中分離。對于免疫沉淀,室溫下使lml雜交瘤培養(yǎng)基中的CAIX特異性MAb與25)il50%的蛋白A瓊脂糖凝膠懸浮液(Pharmacia,Uppsala,瑞典)結(jié)合1小時。細(xì)胞抽提物(200pl)用20^1的50%蛋白A瓊脂糖凝膠懸浮液預(yù)清潔,然后添加到結(jié)合的MAb中。如先前所述(Zatovicova等,2003),洗滌蛋白A瓊脂糖凝膠上收集的免疫復(fù)合物,煮沸并進(jìn)行SDS-PAGE和免疫印跡。在SDS-PAGE中分離蛋白并印跡到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(ImmobilonTM~P,Millipore,Billerica,MA)上。用含有PBS配制的5%無脂奶、0.2%NonidetP-40的封閉緩沖液處理所述膜1小時,然后和稀釋在封閉緩沖液中的初級抗體(在雜交瘤培養(yǎng)基中l(wèi):2稀釋的M75單克隆抗體,或者1:1000稀釋的兔抗小鼠CAIX多克隆抗體)一起孵育1小時。處理后,膜用含有0.2%NonidetP-40的PBS徹底清洗45分鐘,和在封閉緩沖液中1:7500和1:5000稀釋的辣根過氧化酶綴合的豬抗小鼠或抗兔二級抗體(Sevapharma)—起孵育1小時。膜在含有0.2%NonidetP-40(Sigma,StLouis,MO)的PBS中清洗,用ECL檢測系統(tǒng)顯影。為了分離膜和亞膜蛋白并分析寡聚物,用PBS洗滌細(xì)胞,在冰上與RIPA抽提緩沖液孵育30秒。抽出含有蛋白的RIPA緩沖液并在細(xì)胞中添加新鮮的RIPA緩沖液。剩余的蛋白在冰上抽提15分鐘。首先使用CAIX特異性MAbsV/10(識別FL但不識別AS)或M75(識別這兩種變體)從HeLa-AS提取物中免疫沉淀寡聚物。在還原性SDS-PAGE解析沉淀寡聚物的組分,印跡(blotted)并用過氧化物酶標(biāo)記的M75抗體顯象。反轉(zhuǎn)錄PCR使用InstaPure試劑(Eurogentec,Seraing,比利時)從細(xì)胞或者組織中分離總RNA。使用隨機(jī)七聚體引物(400ng/|Lil),用M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(Finnzymes,Oy,芬蘭)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。5嗎總RNA和隨機(jī)引物(400ng/nl)的混合物于70E加熱10分鐘,在冰上迅速冷卻,補(bǔ)充有0.5mMdNTPs(Fimizymes),含有6mMMgCl2、40mMKCl、lmMDTT、0.1mg/mlBSA和50mMTris畫HCl,pH8.3的反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液。終容積24^1的混合物進(jìn)一步補(bǔ)充200U的反轉(zhuǎn)錄酶M-MuLV,于42E培養(yǎng)1小時,701C加熱15分鐘,-80€下存儲直至使用。用DynazymeEXT聚合酶(Finnzymes)和表2(見上文)中列出的引物進(jìn)行PCR。所得的PCR片段在1.5。/o瓊脂糖凝膠上電泳。PCR程序由以下組成94。C3分鐘,然后30個循環(huán)94。C變性30秒,退火40秒(溫度取決于引物組),72X:延伸40秒,然后于72°C最后延伸5分鐘。純化PCR產(chǎn)物,并使用AppliedBiosystemsABI3100(FosterCity,USA)的自動測序儀進(jìn)行測序。以下實(shí)施例僅用于闡釋本發(fā)明,不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例1小鼠CAIX剪接變體的鑒定、結(jié)構(gòu)和表達(dá)早先與小鼠組織中Car9mRNA表達(dá)相關(guān)的反轉(zhuǎn)錄(RT)PCR數(shù)據(jù)基于外顯子l-6的擴(kuò)增。然而,使用引物m6S和mllA擴(kuò)增跨越外顯子6-11的區(qū)域進(jìn)行的Car9mRNA的RTPCR分析顯示,存在兩種擴(kuò)增產(chǎn)物--種預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物和一種較小產(chǎn)物(圖1A、B)。該較小PCR產(chǎn)物的測序證明其對Car9有特異性,表明它代表缺少外顯子7和8的小鼠Car9mRNA的旁路剪接(AS)變體。在所有三種被分析的組織,即,胃、小腸和結(jié)腸中均發(fā)現(xiàn)小鼠AS變體(圖1B)。使用相應(yīng)的引物對(wt的引物是m8S-mlOA,AS的引物是m6/9S-mlOA)對Car9的野生型和AS變體進(jìn)行的獨(dú)立的RTPCR擴(kuò)增證實(shí),在所分析的組織中同時存在兩種產(chǎn)物(圖1C)。AS變體序列的計(jì)算機(jī)分析表明,推定的蛋白小于全長小鼠CAIX約6kDa,其預(yù)測的分子量是48kDa。該剪接變體能編碼缺少氨基酸335-379的蛋白,該蛋白缺少催化(CA)結(jié)構(gòu)域的羧基末端部分和跨膜錨上游的區(qū)域,而跨膜和胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域是完整的(圖1D、E)。為了研究小鼠ASCAIX變體的亞細(xì)胞定位,發(fā)明人將ASOw5>cDNA克隆入pSG5C表達(dá)質(zhì)粒中,并用它產(chǎn)生永久轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。AS變體已在不含有內(nèi)源性CAIX蛋白的小鼠NIH3T3成纖維細(xì)胞和犬MDCK上皮細(xì)胞中過度表達(dá)。使用多克隆抗小鼠CAIX抗體(Gut等,2002)進(jìn)行免疫印跡和免疫熒光來檢測兩種轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。在轉(zhuǎn)染子的細(xì)胞抽提物中檢測到約48kDa的單個條帶,與計(jì)算機(jī)預(yù)測的小鼠ASCAIX蛋白分子量很好地吻合(圖2A)。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞顯示出清晰的細(xì)胞質(zhì)著色,表示小鼠AS變體定位在細(xì)胞溶質(zhì)中(圖2B)。實(shí)施例2人CAIX剪接變體的鑒定和結(jié)構(gòu)為了搜索人組織和細(xì)胞系中的ASCA9mRNA,發(fā)明人設(shè)計(jì)了一組引物,其覆蓋了完整的人CA9mRNA(圖3A)。這些引物用于對分離自人胃和小腸的mRNAs反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA模板進(jìn)行RT-PCR。使用針對外顯子1和6設(shè)計(jì)的引物,發(fā)明人僅檢測到預(yù)計(jì)的PCR產(chǎn)物(圖3B)。然而,針對外顯子6和11的引物產(chǎn)生了兩種PCR擴(kuò)增子一一種豐度較大的較長產(chǎn)物和一種豐度較小的較短產(chǎn)物(圖3C)。較短產(chǎn)物的序列分析證實(shí),它對應(yīng)于人CA9mRNAAS變體。剪接導(dǎo)致缺失外顯子8和9。計(jì)算機(jī)預(yù)測的人ASCAIX蛋白缺少氨基酸356-412,其推定的分子量約為43kDa,而全長(FL)CAIX的預(yù)測大小為49kDa。所述氨基酸缺失包括催化CA結(jié)構(gòu)域的C-末端部分缺失的35個氨基酸和CA結(jié)構(gòu)域與跨膜區(qū)域之間缺失的21個氨基酸,其中包括Cys柳,該氨基酸似乎參與形成分子間S-S鍵(圖3D)。由于移碼在ASmRNA1119bp處產(chǎn)生的終止密碼子(FLCA9mRNA中,終止密碼子在1142bp位置),AS蛋白被截短,既不含有跨膜結(jié)構(gòu)域也不含有胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域(圖3E)。實(shí)施例3人ASCAIX在腫瘤細(xì)胞系和組織中的表達(dá)為了有利于CA9mRNA的FL和AS變體的.單獨(dú)檢測,發(fā)明人使用了允許獨(dú)立擴(kuò)增這兩種mRNA的引物。引物的設(shè)計(jì)U于使一條FL特異性引物位于所述刪除的區(qū)域內(nèi),一條AS特異性引物位于旁路剪接產(chǎn)生的結(jié)點(diǎn)上(圖3A)。首先,發(fā)明人分析了暴露于低氧(2°/。)和正常含氧量(21°/。)的人癌細(xì)胞系中AS變體的存在。在所有檢查的細(xì)胞系中均檢測到AS變體,并在正常含氧量和低氧兩種情況下水平相似(圖4A)。這與FLCA9mRNA相反,后者明顯地可被低氧誘導(dǎo)而水平顯著增加(即在衍生自腎癌的ACHN細(xì)胞中和衍生自宮頸癌的Caski和SiHa細(xì)胞中),而CAKI-1細(xì)胞錄達(dá)極低水平的FLCA9(圖4A)。缺乏CA9基因的C33a宮頸癌細(xì)胞中沒有觀察到FLCA9特異性信號(Lieskovska等,1999)。早先的研究顯示了與細(xì)胞外周低氧相關(guān)的FLCAIX的密度誘導(dǎo)性表達(dá)(Kaluz等,2002)。為了確定AS變體的表達(dá)是否依賴于密度,發(fā)明人使用了分別在稀薄培養(yǎng)物(以1x104細(xì)胞/cm2接種)和稠密培養(yǎng)物(8x104細(xì)胞/cm"中培養(yǎng)24小時的HeLa和SiHa細(xì)胞。稠密的細(xì)胞清楚顯示FLCA9mRNA正常含氧量的表達(dá),但其水平比低氧細(xì)胞中低。在稀薄和稠密的細(xì)胞單層之間沒有觀48察到AS變體水平的顯著差異圖4B)。最后,發(fā)明人分析了正常與惡性的人組織(包括胃、結(jié)腸、直腸和肝臟)中AS的表達(dá)。RT-PCR顯示所有檢查的組織中都存在AS變體(圖4C)。根據(jù)先前的研究,F(xiàn)L轉(zhuǎn)錄物僅存在于正常的胃和源自結(jié)腸和直腸的腫瘤內(nèi)(Saarnio等,1998,Kivela等,2005)。實(shí)施例4人CAIXAS變體的定位和基本特點(diǎn)為了對CAIX的AS變體進(jìn)行基本表征,發(fā)明人用人AS蛋白的異位表達(dá)產(chǎn)生了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子。將人AScDNA轉(zhuǎn)染入CAIX陰性的MDCK細(xì)胞以及響應(yīng)于密度和低氧自然地表達(dá)FLCAIX的人HeLa宮頸癌細(xì)胞中。與計(jì)算機(jī)分析(即預(yù)測的剪接-和移碼-介導(dǎo)刪除了TM和IC區(qū))一致,ASCAIX蛋白不限于質(zhì)膜上,而是在MDCK細(xì)胞和含氧量正常的HeLa細(xì)胞兩者中顯示胞內(nèi)定位(圖5A)。這與暴露于低氧(2%02)的轉(zhuǎn)染的MDCK細(xì)胞和模擬轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞中FLCAIX的細(xì)胞表面定位明顯地不同。在免疫印跡中,轉(zhuǎn)染的HeLaAS細(xì)胞顯示約43/47kDa的兩條帶,這對應(yīng)于ASCAIX,另外的54/58K兩條帶對應(yīng)于低氧誘導(dǎo)的FLCAIX(圖5B)。由于AS蛋白完全缺少跨膜和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域,發(fā)明人還假定ASCAIX分子的至少一部分應(yīng)釋放入培養(yǎng)基中。為了研究這種可能性,在無血清培養(yǎng)基中于正常含氧量和低氧情況下培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)24小時后,濃縮四分之一的培養(yǎng)基,并通過SDS-PAGE分析。免疫印跡顯示在正常含氧量和低氧兩種情況下培養(yǎng)基中都存在ASCAIX(圖5B)綜合在一起,這些數(shù)據(jù)表明,AS存在于胞內(nèi)以及細(xì)胞間隙中,這與大都限于質(zhì)膜上的FLCAIX相反。然而,還可能的是,一些AS分子可與FLCAIX摻入異源寡聚體(heterooligomers)中。使用正常結(jié)合于完整的CAIX結(jié)構(gòu)域但不能識別AS變體的單克隆抗體V/10測試這種假i更(數(shù)據(jù)未顯示)。該V/10Mab經(jīng)由其與FL分子的相互作用用于CAIX寡聚物的免疫沉淀。然后用還原性PAGE解析寡聚物組分(包括可能摻入的AS分子),使用與FL和AS形式均反應(yīng)的過氧化物酶標(biāo)記的M75抗體進(jìn)行免疫印跡顯象。在非還原條件下,F(xiàn)L蛋白形成約153K的寡聚物,而ASCAIX變體不能這樣做,并且不能進(jìn)入FLCAIX蛋白形成的寡聚物(圖6;細(xì)節(jié)參見材料和方法部分)。實(shí)施例5人ASCAIX的功能性質(zhì)低氧誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞中FLCAIX的表達(dá)。低氧還激活CAIX的催化性能,導(dǎo)致胞外pH的加強(qiáng)酸化(Svastova等,2004)。缺少CAIX的催化CA結(jié)構(gòu)域的顯性-陰性突變體的過度表達(dá)可消除這種酸化能力(Svastova等,2004)。由于AS蛋白僅含有不完整的CA結(jié)構(gòu)域,它對分析其是否具有催化活性和是否能夠干擾FLCAIX蛋白介導(dǎo)的酸化來說尤其重要。使用含有截短的CA結(jié)構(gòu)域的重組細(xì)菌GSTAS融合蛋白的停流光鐠法(stoppedflowspectrometry)檢測酶活性,與融合有GST的含有完整的CA結(jié)構(gòu)域的胞外部分[例如SEQIDNO:91(從而形成含有PG和CA結(jié)構(gòu)域兩者[aa52-397(SEQIDNO:83)的GST-PGCA)進(jìn)行比較。結(jié)果顯示,野生型CAIX的催化活性Kcat(WT)=3.8x105s"在剪接變體中減少了一半,Kcat(AS)=1.9xl。5s1。另外,GSTAS蛋白對乙酰唑胺(一種碳酸酐酶的磺胺抑制劑)的親合力顯著降低KiWT=14nM對KiAS=110nM。這些數(shù)據(jù)說明,剪接削弱了CAIX的酶活性和其對抑制劑的親合力。發(fā)明人還想要研究ASCAIX是否可調(diào)節(jié)FLCAIX在低氧條件下酸化胞外pH的能力。出于該目的,發(fā)明人分析了轉(zhuǎn)染的HeLa-AS細(xì)胞和模擬轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞,這些細(xì)胞在2%02(低氧)和21%02(正常含氧量)中培養(yǎng)48小時。與含氧量正常的相應(yīng)細(xì)胞比較,低氧培養(yǎng)導(dǎo)致對照和AS轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞中預(yù)期的胞外酸化(圖7A)。然而,培養(yǎng)基比在AS-過度表達(dá)的細(xì)胞中少酸化約0.2pH單位,說明AS干擾野生型CAIX蛋白的活性。由于CAIX的催化部位暴露于細(xì)胞間隙,發(fā)明人測試了AS胞外級分(fraction)的可能的作用。如先前所述,可使用僅結(jié)合低氧激活的CAIX(其催化部位可被抑制劑接近)的熒光素-標(biāo)記的CA抑制劑(FITC-CAI)來間接地證明CAIX的活性(Svastova等20(M)。因此,發(fā)明人使用已建立的CAIX轉(zhuǎn)染的MDCK細(xì)胞模型,該模型顯示用低氧處理時CAIX介導(dǎo)的胞外酸化以及低氧(但并非正常含氧量)中FITC-CAI的聚集。發(fā)明人分析了存在或不存在來自分泌AS的MDCK隱AS轉(zhuǎn)染子的培養(yǎng)基時MDCK-CAIX細(xì)胞中FITC-CAI的積聚。如圖7B所示,在混合有含AS的條件培養(yǎng)基的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)MDCKCAIX細(xì)胞,結(jié)果可觀察到FITC-CAIX積聚下降,這支持了胞外AS減少抑制劑的結(jié)合的觀點(diǎn)。用一半和三分之一的含有AS的條件培養(yǎng)基重復(fù)該試驗(yàn)。分析獲得的影像以確定熒光強(qiáng)度的差異。結(jié)果清楚地證明,AS的胞外級分將FITC-CAI的積聚減少約一半(圖7C)。為確定AS變體對FLCAIX功能的這種作用是否具有生物學(xué)影響,發(fā)明人分析了HeLa-AS轉(zhuǎn)染子的生長參數(shù)并與模擬轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞進(jìn)行比較。在不依賴于正常含氧量或低氧條件的貼壁培養(yǎng)的短期生長(72小時)中未觀察到兩種類型細(xì)胞之間的顯著差別(數(shù)據(jù)未顯示)。因此,發(fā)明人還使HeLa細(xì)胞球狀體生長了14天,并將HeLaAS細(xì)胞產(chǎn)生的球狀體的質(zhì)量和形狀分別與對照HeLa細(xì)胞進(jìn)行比較。HeLa-AS球狀體緊湊程度較小,缺少中心區(qū)域,在該區(qū)域中通常含有承受低氧和酸性pH的細(xì)胞(圖7D)。這些HeLa-AS球狀體的表觀顯示了AS的作用(導(dǎo)致FLCAIX調(diào)節(jié)pH的能力降低)可影響細(xì)胞在這些微環(huán)鏡應(yīng)激下的生存能力??偠灾覀兊慕Y(jié)果表明,與FLCAIX相比,ASCAIX受到不同的調(diào)控、定位異常、功能減弱(functionallydisabled)。討論旁路剪接的失調(diào)尤其在癌癥中是一種普遍認(rèn)可的現(xiàn)象(Venables等,2006)。有很多旁路剪接基因的實(shí)例,所述基因的產(chǎn)物通常涉及腫瘤的發(fā)展,例如CD44、HIF-a、VEGF、骨橋蛋白和很多其它產(chǎn)物(Wong等,2003,Gothie等,2000,Robinson等,2001,He等,2006)。某些情況下,在正常組織中罕見的剪接形式會在腫瘤中變得常見,而存在于正常組織中的旁路剪接形式可保持不變(Roy等,2005)。本研究中鑒定的人CAIX旁路剪接變體可歸為此類,盡管由于全長CAIX的表達(dá)模式非常特別,難以給出明確的結(jié)論。FLCAIX在極少的正常組織(包括胃和小腸)中有豐度,同時表達(dá)低水平的旁路剪接變體。在胃癌中,F(xiàn)LCAIX的表達(dá)降低,但AS的水平和正常胃中相似。另一方面,全長CA1X在正常的結(jié)腸和直腸(以及本研究中另外的未分析的正常組織)中不存在表達(dá)或表達(dá)極低,但在相應(yīng)的在腫瘤中的表達(dá)顯著提高(Saarnio等,1998)。然而,AS變體在正常組織和結(jié)腸癌兩者中均顯示穩(wěn)定的表達(dá)水平。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明其表達(dá)與腫瘤表型無關(guān)。而且,與擁擠的培養(yǎng)物中生長和暴露于低氧的細(xì)胞中FLCAIX的水平纟皮誘導(dǎo)相反,AS變體不主要依賴于低氧和細(xì)胞密度。相對低但組成型的AS表達(dá)對利用CA9轉(zhuǎn)錄作為低氧肺瘤標(biāo)記物用于潛在的預(yù)后或預(yù)測目的的臨床研究相當(dāng)重要。由于在缺少FLCA9轉(zhuǎn)錄物的正常和/或非低氧組織中存在AS,設(shè)計(jì)用于檢測未受剪接影響的區(qū)域的引物或探針不能區(qū)分CA9mRNA的兩種形式,因此可能會給出假陽性結(jié)果,從而可能影響低氧誘導(dǎo)的FLCA9的真實(shí)臨床價值。值得注意的是,與FL轉(zhuǎn)錄物對比進(jìn)行的ASmRNA和5,RACE分析產(chǎn)生了相同長度的產(chǎn)物,這支持了兩種變體均產(chǎn)生同樣的啟動子的結(jié)論(數(shù)據(jù)未顯示)。該事實(shí)可能顯示了,依賴于生理學(xué)環(huán)境,在CA9轉(zhuǎn)錄物加工過程中轉(zhuǎn)錄設(shè)備和剪接機(jī)器構(gòu)件之間進(jìn)行了差異性合作。實(shí)際上,有幾個被低氧調(diào)控的剪接事件的實(shí)例,例如與hTERT、TrkA和XBP1有關(guān)的那些(Anderson等,2006,Tacondli等,2004,Romero-Ramirez等,2004)。對于hTERT,已證明,低氧下含有RNA聚合酶II、TFIIB、HIF和共活化劑的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物募集在啟動子處,并在轉(zhuǎn)錄過程中始終保持與基因相連。這種方式誘導(dǎo)了剪接模式的轉(zhuǎn)換,有利于酶的活性形式(Anderson等2006)。非常容易想到,在CA9基因轉(zhuǎn)錄期間可能存在一種類似的機(jī)制。由于外顯子8和9的缺失產(chǎn)生了人CA9mRNA的AS變體,該變體凈皮翻譯成不含跨膜區(qū)、胞內(nèi)尾和催化性結(jié)構(gòu)域的羧基末端部分的截短的蛋白。顯然,TM和IC區(qū)域的缺失導(dǎo)致該AS變體的定位改變,其主要占據(jù)細(xì)胞間隙并釋放到胞外培養(yǎng)基中。這與FLCAIX蛋白形成對比,F(xiàn)LCAIX蛋白是一種整合的質(zhì)膜蛋白??梢灶A(yù)期,這種與催化性結(jié)構(gòu)域的部分缺失相關(guān)的不當(dāng)定位將削弱蛋白的功能。實(shí)際上,GST-AS的酶活性只有含完整的催化性結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)GST-PG+CA蛋白的一半。然而,m難將這種發(fā)現(xiàn)直接應(yīng)用到具體的細(xì)胞環(huán)境中,因?yàn)樵诘脱鯒l件下的細(xì)胞環(huán)境中CAIX與碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(transporter)相互作用并影響質(zhì)膜內(nèi)外的pH調(diào)節(jié)(Morgan等,2007,Svastova等,2004,Swietach等,2007)。首先,在沒有任何亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、離子流動和微環(huán)鏡影響(這些因素當(dāng)然在調(diào)控CAIX的催化性能起作用)的裝置中用細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白檢測活性。其次,不同碳酸酐酶同工酶的催化活性大致在兩個數(shù)量級中變化,活性高的同工型比活性中等的同工酶的活性高20-3倍不等(Pastorekova等,2004)。因此,不可能預(yù)測(preclude)所述減少一半的活性是否足以(維持)CAIX的生理功能。不過,這個問題可能不是關(guān)鍵,因?yàn)锳S變體不能恰當(dāng)定位在質(zhì)膜上,不能形成寡聚物,這些是對CAIX蛋白功能的重要限制。然而,組成型過度表達(dá)AS形式的CAIX的低氧HeLa-AS細(xì)胞培養(yǎng)物中觀察到的胞外酸化減少清楚地表明,ASCAIX干擾內(nèi)源性、低氧誘導(dǎo)的FL蛋白的功能。雖然目前還不清楚其機(jī)制,但基于用AS變體處理的低氧MDCK-CAIX細(xì)胞中CA抑制劑的積聚減少,可認(rèn)為AS在與碳酸氫鹽運(yùn)輸代謝區(qū)室(metabolon)的細(xì)胞表面組分的相互作用方面與FLCAIX竟?fàn)?。此外,AS的過度表達(dá)顯著影響HeLa細(xì)胞形成緊湊球狀體的能力,HeLa細(xì)胞球狀體通常用作模仿具有相應(yīng)的瘤內(nèi)微環(huán)境的腫瘤塊的三維模型。很多研究很好地記栽了穿越球狀體的氧分壓、pH值、營養(yǎng)物和代謝物梯度,球狀體的核心區(qū)與以較酸性的微環(huán)鏡為特征的實(shí)體瘤低氧區(qū)非常相似(Alvarez-Perez等,2005)。其他文獻(xiàn)已證明,在SiHa和HeLa宮頸癌細(xì)胞產(chǎn)生的多細(xì)胞球狀體最內(nèi)部的細(xì)胞中,F(xiàn)LCAIX的質(zhì)膜染色顯著增加(Olive等,2001,Chrastina等,2003)。這些數(shù)據(jù)表明,F(xiàn)LCAIX剛好存在于那些細(xì)胞為了生存需要增加保護(hù)和適應(yīng)對低氧壓力及酸性微環(huán)境的有害影響的區(qū)域。FLCAIX通過碳酸氬鹽-介導(dǎo)的胞內(nèi)pH的緩沖來發(fā)揮作用(Swietach等,2007)。明顯地,部分?jǐn)_亂pH調(diào)節(jié)的AS變體不允許對酸性球狀體內(nèi)pH的適應(yīng),導(dǎo)致球狀體核心中最受脅迫的中心細(xì)胞的消失。這種想法與CAIX的催化活性受低氧調(diào)控是一致的,其建議CAIX調(diào)節(jié)pH的能力對低氧腫瘤細(xì)胞的存活非常重要。這種建議已經(jīng)得到Robertson等(2004)中RNAi實(shí)驗(yàn)的間接支持。雖然天然產(chǎn)生的AS變體以低水平表達(dá),但存在僅微弱地誘導(dǎo)FLCAIX的生理學(xué)情況和細(xì)胞類型。例如,位置離功能性供血脈管較近的腫瘤細(xì)胞暴露于輕微低氧中,F(xiàn)L和AS的表達(dá)水平可能相當(dāng),從而導(dǎo)致CAIX活性的顯性-陰性下調(diào)。這些弱低氧的細(xì)胞假設(shè)沒有暴露于嚴(yán)重的酸中毒,因此可能不受益于這種pH控制機(jī)理的完全實(shí)施(fullperformance)。類似的解釋可適用于遭受輕微缺血的正常組織。這種想法得到了最近及先前一些數(shù)據(jù)的支持,這些數(shù)據(jù)表明,一些腫瘤細(xì)胞系、含氧量正常的稠密細(xì)胞(受微弱的細(xì)胞外周低氧的影響)和一些早期低氧程度較輕的肺瘤僅表達(dá)較低水平的CAIX??傊l(fā)明人認(rèn)為,在這兩種蛋白共同表達(dá)的情況中,AS變體起調(diào)節(jié)FLCAIX的作用。旁路剪接變體較低但組成型的表達(dá)對基于利用CA9轉(zhuǎn)錄作為低氧腫瘤標(biāo)記物用于潛在的預(yù)后或預(yù)測目的的臨床研究相當(dāng)重要。由于在不存在FLCA9轉(zhuǎn)錄物的正常和/或非低氧組織中存在AS,設(shè)計(jì)用于檢測不受剪接影響的區(qū)域的引物或探針不能區(qū)分CA9mRNA的兩種形式,因此可能會給出假陽性結(jié)果,這會影響低氧誘導(dǎo)的FLCA9的真實(shí)臨床價53值。事實(shí)上,在迄今為止發(fā)表的幾個研究中已經(jīng)發(fā)生了這種現(xiàn)象[例如McKiernan等.,Cancer,86(3、:492-497(1999);Span等"BrJCancer,8簡:271-276(2003);Simi等"LungCancer,52m:59-66(2006);Greiner等"Blood,匿13、4109-4117f2006),。為此原因,用于微陣列芯片和RT-PCR的正確的引物及探針的設(shè)計(jì)應(yīng)避免上述現(xiàn)象的出現(xiàn),應(yīng)考慮MN/CAIX的AS形式。根據(jù)布達(dá)佩斯條約進(jìn)行的保藏下列材料保藏在現(xiàn)位于10810UniversityBlvd.,Manassas,Virginia20110-2209(USA)的美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)。保藏是根據(jù)國際承認(rèn)用于專利程序和控制的微生物保藏布達(dá)佩斯條約進(jìn)行的。從保藏日開始計(jì)算,保證維持活培養(yǎng)物30年。根據(jù)布達(dá)佩斯條約可從ATCC獲得本發(fā)明的雜交瘤和質(zhì)粒,根據(jù)申請人與ATCC之間的協(xié)議,保證一旦本申請授予專利權(quán)則公眾可無限制地獲得這些保藏的雜交瘤和質(zhì)粒。這些保藏菌林的可獲得性并不意味著違背任何政府當(dāng)局根據(jù)其專利法授予的專利權(quán)而許可實(shí)施本發(fā)明。雜交瘤保藏日ATCC#VU-M751992年9月17日HB11128MN12.2.21994年6月9日HB11647質(zhì)粒保藏日ATCC#A4a1995年6月6日97199XE11995年6月6日97200XE31995年6月6日97198類似地,產(chǎn)生V/10單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系V/10-VU根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2003年2月19日保藏在比利時根特,B-卯OO,根特大學(xué),K丄.Ledeganckstraat35的LaboratoriumvoorMoleculaireBiologie-Plasmidencollectie(LMBP)(BelgianCoordinatedCollectionsofMicroorganisms(BCCM)的國際保藏機(jī)構(gòu)(IDA))[BCCM/LMBP],登錄號為6009CB。本發(fā)明上述實(shí)施方式的描述僅出于闡釋和說明的目的。這些實(shí)施方式不是窮盡性的,也并非將本發(fā)明限于所公開的具體形式,很明顯,根據(jù)上文教導(dǎo)可進(jìn)行很多修飾和變化。選擇和描述這些實(shí)施方式是為了說明本發(fā)明的原則和其具體應(yīng)用,以使本領(lǐng)域技術(shù)人員以多種實(shí)施方式和根據(jù)特定目的進(jìn)行各種變化來利用本發(fā)明。本文引用的所有參考文獻(xiàn)均通過引用納入本文。權(quán)利要求1.與哺乳動物中MN/CAIX異常表達(dá)相關(guān)的腫瘤發(fā)生前/腫瘤性疾病的診斷和/或預(yù)后方法,包括區(qū)分全長[FL]和旁路剪接的[AS]MN/CA9mRNA或MN/CAIX表達(dá)。2.如權(quán)利要求1所述的方法,包括使用一種或多種探針和/或引物來檢測或檢測并定量FL和/或ASMN/C49mRNA表達(dá)。3.如權(quán)利要求2所述的方法,包括使用(a)探針和/或引物,以檢測全長FL]MN/C49mRNA但不檢測旁路剪接的[ASMN/C49mRNA;(b)探針和/或引物,以檢測ASMN/C45>mRNA但不檢測FLmRNA;和/或(c)探針和/或引物,以檢測FL和ASMN/C49mRNA。4.如權(quán)利要求2所述的方法,其中所述哺乳動物是人,且其中所述一種或多種探針和/或引物選自SEQIDNOS:97-101和與SEQIDNOS:97-101至少80%同源的核酸序列。5.如權(quán)利要求2所述的方法,包括使用核酸擴(kuò)增方法。6.如權(quán)利要求5所述的方法,其中所述核酸擴(kuò)增方法包括使用PCR、RT-PCR、實(shí)時PCR或定量實(shí)時RT-PCR。7.如權(quán)利要求2所述的方法,包括使用微陣列芯片,所述芯片含有結(jié)合全長[FLmRNA但不結(jié)合旁路剪接的[AS]mRNA的探針,和/或結(jié)合ASMN/C49mRNA但不結(jié)合FLMN/C49mRNA的探針。8.如權(quán)利要求2所述的方法,還包括測定FL:ASMN/C49mRNA的比率。9.如權(quán)利要求2所述的方法,其中所述ASMN/C49mRNA表達(dá)指示正?;虮磉_(dá),所述FLmRNA表達(dá)指示異常MN/C49基因表達(dá)。10.如權(quán)利要求2所述的方法,其中所述ASMN/C49mRNA表達(dá)指示正常含氧量情況下MN/C49基因的表達(dá),所述FLmRNA表達(dá)指示低氧情況下MN/C49基因的表達(dá)。11.如權(quán)利要求1所述的方法,包括使用一種或多種抗體來區(qū)分腫瘤發(fā)生前/贅生性組織中的FL和ASMN/CAIX表達(dá)。12.如權(quán)利要求11所述的方法,包括檢測或檢測并定量所述組織中的ASMN/CAIX。13.如權(quán)利要求12所述的方法,還包括測定所述組織中FLMN/CAIX水平與ASMN/CAIX水平的比率。14.如權(quán)利要求13所迷的方法,其中所述比率指示所述組織中低氧的存在或程度。15.如權(quán)利要求11所述的方法,包括檢測或檢測并定量脊推動物組織中的FLMN/CAIX和ASMN/CAIX,其包括以下步驟(a)使所述脊推動物組織的樣品同時或按序與至少兩種抗體、至少兩種抗原結(jié)合抗體片段、或抗體和抗原-結(jié)合抗體片段的混合物接觸,其中至少一種抗體/抗體片段特異性結(jié)合于FLMN/CAIX蛋白但不結(jié)合ASMN/CAIX蛋白,其中至少一種其他抗體/抗體片段特異性結(jié)合于FL和ASMN/CAIX兩者;(b)檢測并定量所述樣品中的所述抗體/抗體片段;和(c)比較所述差異結(jié)合性抗體/抗體片段的結(jié)合以測定FLMN/CAIX和ASMN/CAIX的相對水平。16.如權(quán)利要求15所述的方法,其中所述特異性結(jié)合于FLMN/CAIX但不結(jié)合ASMN/CAIX的抗體/抗體片段對MN/CAIX的碳酸酐酶(CA)結(jié)構(gòu)域有特異性;其中所述特異性結(jié)合于FLMN/CAIX和ASMN/CAIX兩者的抗體/抗體片段對MN/CAIX的蛋白聚糖樣(PG)結(jié)構(gòu)域有特異性。17.如權(quán)利要求16所述的方法,其中所述對MN/CAIX的CA結(jié)構(gòu)域有特異性的抗體是保藏在比利時根特、登錄號為LMBP6009CB的BCCMTM/LMBP雜交瘤VU-V/10產(chǎn)生的V/10單克隆抗體;其中所述對MN/CAIX的PG結(jié)構(gòu)域有特異性的抗體是保藏在美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)、ATCC名稱編號為HB11128的雜交瘤VU-M75產(chǎn)生的M75單克隆抗體。18.與脊推動物中異常MN/CAIX表達(dá)相關(guān)的腫瘤發(fā)生前/腫瘤性疾病的診斷和/或預(yù)后方法,包括檢測或檢測并定量脊推動物組織中的全長[FLMN/CAIX蛋白但非旁路剪接AS]MN/CAIX蛋白,其包括以下步驟(a)使所述脊推動物組織的樣品與抗體或抗體片段接觸,其中所述抗體或抗體片段特異性結(jié)合于FLMN/CAIX但不結(jié)合ASMN/CAIX;和(b)檢測并定量所述樣品中所迷抗體/抗體片段的結(jié)合。19.如權(quán)利要求18所述的方法,其中所述抗體或抗體片段對MN/CAIX的碳酸酐酶(CA)結(jié)構(gòu)域有特異性。20.如權(quán)利要求19所述的方法,其中所述對MN/CAIX的CA結(jié)構(gòu)域有特異性的抗體是保藏在比利時根特、登錄號為LMBP6009CB的BCCMTM/LMBP雜交瘤VU-V/10產(chǎn)生的V/10單克隆抗體。21.診斷和/或預(yù)后方法,包括檢測或檢測并定量哺乳動物腫瘤發(fā)生前/贅生性樣品中的全長[FL1MN/CA9mRNA但非旁路剪接[ASlMN/CA9mRNA,所述方法包括使所述樣品中的mRNA與特異性結(jié)合FLMN/CA9mRNA但不結(jié)合ASMN/CA9mRNA的引物或探針接觸。22.用于區(qū)分哺乳動物中旁路剪接[AS]MN/CA9mRNA和全長[FLJMN/CA9mRNA表達(dá)的探針或引物。23.如權(quán)利要求22所述的探針或引物,其中所述哺乳動物是人,所述探針或引物用來檢測ASMN/CA9mRNA但不檢測FLMN/CA9mRNA,所述探針或引物包含結(jié)合于MN/CA9基因的外顯子7和10的剪接點(diǎn)的核酸。24.如權(quán)利要求23所述的探針或引物,其中所述探針或引物具有SEQIDNO:101的序列或與SEQIDNO:101至少80%同源的序列。25,表達(dá)權(quán)利要求22所述的探針或引物的栽體。26.包含權(quán)利要求25所迷載體的宿主細(xì)胞。27.如權(quán)利要求22所述的探針或引物,其中所述哺乳動物是人,所述探針或引物用來檢測FLMN/CA9mRNA但不檢測ASMN/CA9mRNA,所述探針或引物包含結(jié)合于人MN/CA9基因的外顯子8或外顯子9的核酸,或結(jié)合于人MN/CA9基因外顯子7和8的剪接點(diǎn)的核酸、或結(jié)合于人MN/CA9基因外顯子8和9的剪接點(diǎn)的核酸、或結(jié)合于人MN/CA9基因外顯子9和10的剪接點(diǎn)的核酸。28.如權(quán)利要求27所述的探針或引物,其中所述探針或引物具有SEQIDNO:100的序列或與SEQIDNO:100至少80%同源的序列。29.包含一種或多種權(quán)利要求22所述的探針的微陣列芯片。30.用于區(qū)分哺乳動物中旁路剪接[ASMN/CA9mRNA和全長[FLJMN/CA9mRNA表達(dá)的探針對和/或引物對。31.如權(quán)利要求30所述的探針對和/或引物對,其用于檢測旁路剪接[ASj人MN/CA9mRNA但不檢測全長FL]人MN/CA9mRNA。32.如權(quán)利要求31所述的探針對或引物對,其由SEQIDNOS:99和101或與SEQIDNOS:99和101至少80%同源的核酸序列組成。33.如權(quán)利要求30所述的探針對和/或引物對,用于檢測全長FLj人MN/CA9mRNA但不檢測旁路剪接[AS人MN/CA9mRNA。34.如權(quán)利要求33所述的探針對或引物對,其由SEQIDNOS:99和100或與SEQIDNOS:99和100至少80%同源的核酸序列組成。35.如權(quán)利要求30所述的探針對和/或引物對,其用于檢測AS人mRNA和FL人MN/CA9mRNA兩者,所述探針對和/或引物對由SEQIDNOS:97和98、或與SEQIDNOS:97和98至少80%同源的核酸序列組成;其中所述ASmRNA和所迷FLmRNA的長度不同。36.編碼哺乳動物的旁路剪接[AS]MN/CAIX的分離核酸,其中所述ASMN/CAIX的分子量為約43-約48千道爾頓。37.表達(dá)權(quán)利要求36所述的分離核酸序列的載體。38.包含權(quán)利要求37所述載體的宿主細(xì)胞。39,如權(quán)利要求36所述的分離核酸,其特征在于,對應(yīng)于MN/C49的外顯子8和外顯子9的核苷酸缺失,其中所述哺乳動物是人。40.如權(quán)利要求36所述的分離核酸,其具有SEQIDNO:108的序列或與SEQIDNO:108至少80%同源的分離核酸序列,其中所迷哺乳動物是人。41.由SEQIDNO:108或權(quán)利要求40所述的分離核酸編碼的AS形式的MN/CAIX,其特征在于,所述AS形式的MN/CAIX與M75單克隆抗體特異性結(jié)合,但不與V/10單克隆抗體結(jié)合,所述M75單克隆抗體由保藏在美國模式培養(yǎng)物保藏所、名為ATCCNo.HB11128的雜交瘤VU-M75分泌,所述V/10單克隆抗體由保藏在比利時根特、登錄號為LMBP6009CB的BCCMTM/LMBP雜交瘤VU-V/10產(chǎn)生。42.由權(quán)利要求36所述的分離核酸編碼的AS形式的MN/CAIX,其特征還在于,所述AS形式的MN/CAIX與對MN/CAIX的PG結(jié)構(gòu)域有特異性的抗體特異性結(jié)合,但不與對MN/CAIX的CA結(jié)構(gòu)域有特異性的抗體結(jié)合。43.如權(quán)利要求42所述的AS形式的MN/CAIX,其特征還在于,所述AS形式的MN/CAIX與M75單克隆抗體特異性結(jié)合,但不與V/10單克隆抗體結(jié)合,所述M75單克隆抗體由保藏在美國模式培養(yǎng)物保藏所、名為ATCCNo.HB11128的雜交瘤VU-M75分泌,所述V/10單克隆抗體由保藏在比利時根特、登錄號為LMBP6009CB的BCCMTMrM/LMBP雜交瘤VU-V/10產(chǎn)生。44.MN/CAIX的抗體或抗原結(jié)合抗體片段。45.特異性結(jié)合于權(quán)利要求36所述的ASMN/CAIX^a不特異性結(jié)合可溶性MN/CAIX(s-CAIX)的抗體或抗原結(jié)合抗體片段。46.治療哺乳動物中腫瘤發(fā)生前/腫瘤性疾病的方法,其中所述疾病與MN/CAIX異常表達(dá)有關(guān),所述方法包括給予所述哺乳動物治療有效量的組合物,該組合物包含相對于全長[FL]MN/CAIX水平提高旁路剪接[ASjMN/CAIX水平的物質(zhì)。47.如權(quán)利要求46所述的方法,其中所述增加的ASMN/CAIX的相對水平干擾所述FLMN/CAIX的碳酸酐酶活性。48.如權(quán)利要求46所述的方法,其中所述物質(zhì)是處于生理學(xué)上可接受的栽體中的ASMN/CAIX本身,表達(dá)ASMN/CA9mRNA的載體,阻斷FLMN/CAIX但不阻斷ASMN/CAIX表達(dá)的反義寡核苷酸,表達(dá)所述反義寡核苷酸的載體,F(xiàn)LMN/CA9同工型特異性siRNA,或表達(dá)所述FLMN/CA9同工型特異性siRNA的載體。49.如權(quán)利要求48所述的方法,其中所述FLMN/CA9同工型特異性siRNA靶向MN/CA9mRNA的外顯子7和8、外顯子8和9或外顯子9和10的剪接點(diǎn)。50.如權(quán)利要求46所述的方法,其中所述物質(zhì)是調(diào)節(jié)AS和/或FLMN/CA9前mRNA剪接的反義寡核苷酸。51.相對于全長FLMN/CAIX水平提高旁路剪接[ASjMN/CAIX水平的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸用于治療與MN/CAIX異常表達(dá)相關(guān)的肺瘤發(fā)生前/肺瘤性疾病。52.如權(quán)利要求51所述的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸是與FLMN/CA9前mRNA互補(bǔ)但不與ASMN/CA9前體mRNA互補(bǔ)的反義寡核苷酸。53.如權(quán)利要求51所述的寡核苷酸,其是與FLMN/CA9mRNA互補(bǔ)但不與ASMN/CA9mRNA互補(bǔ)的SiRNA。54.如權(quán)利要求53所述的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸與FLMN/CA9mRNA的外顯子7和8、外顯子8和9或外顯子9和10的剪接點(diǎn)互蜂卜。55.用于鑒定能夠調(diào)節(jié)旁路剪接[AS]MN/CAIX水平的物質(zhì)的體外方法,其包括使表達(dá)ASMN/CAIX的細(xì)胞與懷疑調(diào)節(jié)細(xì)胞中所述ASMN/CAIX水平的物質(zhì)接觸,檢測并定量所述ASMN/CAIX水平的變化。全文摘要本文公開了MN/CA9mRNA的旁路剪接[AS]變體及相關(guān)蛋白-ASMN/CAIX。不同于在大多數(shù)組織中意味著腫瘤形成和/或低氧的與癌癥相關(guān)的全長[FL]MN/CA9mRNA和FLMN/CAIX,ASMN/CA9mRNA在正常含氧量下組成型表達(dá),不受低氧刺激,ASMN/CAIX不限于細(xì)胞膜上。本文提供了區(qū)分AS和FLMN/CA9的表達(dá)從而用于腫瘤發(fā)生前/腫瘤性疾病的診斷/預(yù)后的方法,以及用于這些方法的探針、引物和抗體。還公開了涉及MN基因和蛋白的腫瘤發(fā)生前/腫瘤性疾病的治療方法,這些方法基于ASMN蛋白(ASMN/CAIX)干擾FLMN蛋白(FLMN/CAIX)催化活性的能力;此類方法還可使用具有所述干擾能力的ASMN蛋白片段。所述方法可包括相對于FLMN/CAIX水平增加ASMN/CAIX水平。示例性治療方法可包括給予物質(zhì),例如,ASMN/CAIX本身、表達(dá)ASMN/CA9mRNA的載體、阻斷FLMN/CAIX表達(dá)但不阻斷ASMN/CAIX表達(dá)的反義寡核苷酸、表達(dá)此類反義寡核苷酸的載體、FLMN/CA9-同工型特異性siRNA、或表達(dá)此類FLMN/CA9-同工型特異性siRNA的載體。還公開了鑒定能夠調(diào)節(jié)ASMN/CAIX水平的物質(zhì)的方法。文檔編號C12Q1/68GK101641450SQ200780045271公開日2010年2月3日申請日期2007年10月12日優(yōu)先權(quán)日2006年10月12日發(fā)明者J·帕斯托雷克,M·巴拉索瓦申請人:病毒學(xué)研究所
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