專利名稱：：用于產(chǎn)生酵母提取物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及使用外源蛋白酶產(chǎn)生酵母提取物的方法。
背景技術(shù)：
：酵母提取物用途廣泛，例如，用于食品工業(yè)中的調(diào)味，用于微生物發(fā)酵培養(yǎng)基中，和用作保健食品。酵母提取物的產(chǎn)生在文獻(xiàn)中有描述，參見(jiàn)例如Kelly,M.(1982)YeastExtract(于IndustrialEnzymology,Godfrey,T.編)或Chae，H.J.等(2001)，BioresourceTechnology76，253-258。酵母提取物通常通過(guò)如下方法制備，通過(guò)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行酸水解或機(jī)械或化學(xué)破壞來(lái)分解酵母，繼而用內(nèi)源酶自溶，從而將酵母的大分子結(jié)構(gòu)(特別是蛋白質(zhì))降解成極大量(maximumamount)的可溶性物質(zhì)?？梢蕴砑觾?nèi)源酶，包括蛋白酶如木瓜蛋白酶，以增進(jìn)酵母自身酶的效果。在酶水解之后，將酵母提取物與細(xì)胞碎片分離，并且可以進(jìn)行巴氏滅菌和濃縮。濁度是酵母提取物的一個(gè)質(zhì)量量度。低濁度使?jié)饪s和分離更容易。因此，對(duì)產(chǎn)生低濁度酵母提取物的方法存在期望。根據(jù)本發(fā)明可應(yīng)用的蛋白酶在先前已有描述。例如，源自擬諾卡氏菌屬菌種(Nocardiopsissp.)NRRL18262的蛋白酶在WO88/03947(其中將該菌抹稱作擬諾卡氏菌屬菌種菌抹IOR)和WO01/58276中公開(kāi)。其它可用于本發(fā)明的相關(guān)蛋白酶在WO88/03947、WO04/111220、WO04/111222、WO04/111223、WO05/123911和WO04/072279中公開(kāi)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了可用于以高產(chǎn)率制備濁度非常低的酵母提取物的蛋白酶。當(dāng)與等量酶蛋白進(jìn)行比較時(shí)，這些蛋白酶比本領(lǐng)域使用的其它蛋白酶更有效，這使酵母提取物的制造者獲得更經(jīng)濟(jì)的產(chǎn)品。此外，當(dāng)使用本發(fā)明的蛋白酶制備酵母提取物時(shí)，總干固體的蛋白質(zhì)含量高，這反映了高純度。因此，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生酵母提取物的方法，其包括a)向包含蛋白質(zhì)的酵母添加蛋白酶，所述蛋白酶與SEQIDNO:1具有至少50%同一性；和b)3溫育從而使蛋白質(zhì)水解。發(fā)明詳述蛋白酶術(shù)語(yǔ)蛋白酶(protease)用于本文是水解肽4建的酶(具有蛋白酶活性)。蛋白酶也稱為，例如，肽酶、蛋白水解酶(proteinase)、肽水解酶或蛋白水解酶(proteolyticenzyme)。用于本發(fā)明的蛋白酶是在多肽鏈內(nèi)部作用的內(nèi)切型(endo-type)蛋白酶(內(nèi)肽酶)。對(duì)用于本發(fā)明的蛋白酶的來(lái)源不進(jìn)行限制。因此，術(shù)語(yǔ)蛋白酶不僅包括天然或野生型蛋白酶，還包括任何顯示蛋白酶活性的蛋白酶的突變體(mutant)、變體(variant)、片段等，以及合成的蛋白酶，諸如改組的蛋白酶(shuffledprotease),和共有蛋白酶(consensusprotease)。這些遺傳工^呈〈'l"飾的蛋白酶可以如本領(lǐng)域通常所知的來(lái)制備，例如通過(guò)定點(diǎn)誘變(site-directedmutagenesis)，通過(guò)PCR(使用含有期望的突變的PCR片段作為PCR反應(yīng)中的引物之一)，或通過(guò)隨機(jī)誘變來(lái)制備。共有蛋白的制備在例如EP897985中描述。蛋白酶變體的實(shí)例(如本文中使用的)是已缺失、插入或用其它氨基酸取代了一個(gè)或多個(gè)氨基酸的蛋白酶。用于本發(fā)明的蛋白酶的實(shí)例是(i)WO01/58276中公開(kāi)的源自擬諾卡氏菌屬菌種NRRL18262的蛋白酶，所述蛋白酶的序列示于本文件的SEQIDNO:1;(ii)與(i)的蛋白酶具有至少50、55、60、65、70、75、80、85、90或至少95%氨基酸同一性的蛋白酶；(iii)(i)或(ii)的蛋白酶顯示蛋白酶活性的突變體、變體或片段。就本發(fā)明而言，兩個(gè)氨基酸序列的比對(duì)可以通過(guò)使用EMBOSS程序包(http:〃emboss.org)版本2.8.0的Needle程序來(lái)測(cè)定。Needle程序執(zhí)行Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.MoLBiol.48,443-453中描述的全局比對(duì)算法(globalalignmentalgorithm)。使用的取代矩陣是BLOSUM62,缺口產(chǎn)生罰分(gapopeningpenalty)是10，并且擊夾口延伸罰分(gapextensionpenalty)是0.5。兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性程度這樣計(jì)算，用兩個(gè)序列的比對(duì)中的精確匹配數(shù)除以兩個(gè)序列中最短序列的長(zhǎng)度。結(jié)杲表示為百分比同一性。當(dāng)兩個(gè)序列在重疊的相同位置具有相同的氨基酸殘基時(shí)，出現(xiàn)精確匹配。序列的長(zhǎng)度為序列中的氨基酸殘基數(shù)(例如SEQIDNO:1的長(zhǎng)度是188)。作為可用于本發(fā)明的細(xì)菌蛋白酶的實(shí)例，可提及的是WO88/03947中公開(kāi)的來(lái)自白擬諾卡氏菌(Nocardiopsisalba)(先前為達(dá)*〉維爾擬諾卡氏菌(Nocardiopsisdassonvillei))NRRL18133的蛋白酶；來(lái)自ii^維爾擬諾卡氏菌達(dá)+〉維爾亞種(Nocardiopsisdassonvilleisubsp.dassonvillei)DSM43235、白#以諾卡氏菌DSM15647、擬諾卡氏菌屬菌種DSM16424的蛋白酶和合成的蛋白酶22，全部四種公開(kāi)在WO04/111220中；WO04/111222中公開(kāi)的來(lái)自蔥綠擬諾卡氏菌(Nocardiopsisprasina)DSM15648的蛋白酶；WO04/111223中^>開(kāi)的來(lái)自蔥綠擬諾卡氏菌DSM15649的蛋白酶；來(lái)自蔥綠擬諾卡氏菌(先前為白擬諾卡氏菌)DSM14010、嗜i威擬諾卡氏菌(Nocardiopsisalkaliphila)DSM44657和盧森坦擬諾卡氏菌(Nocardiopsislucentensis)DSM44048的蛋白酶，全部三種公開(kāi)于WO05/123911中；來(lái)自BrachysporiellagayanaCGMCC0865、綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)、粘帚酶屬菌種(Gliocladiumsp.)CBS114001、黑團(tuán)孢屬菌種(Periconiasp.)CBS114002、黑團(tuán)孢屬菌種CBS114000和新月彎孢(Curvularialunata)CBS114003的蛋白酶，全部六種公開(kāi)在WO04/072279中；以及這些蛋白酶顯示蛋白酶活性的突變體、變體或片段。用于本發(fā)明的蛋白酶是細(xì)菌蛋白酶，術(shù)語(yǔ)"細(xì)菌的(bacterial)"表明所述蛋白質(zhì)是衍生自或起源于細(xì)菌，或是源自細(xì)菌的類似物、片段、變體、突變體或合成蛋白酶。其可在原野生型細(xì)菌菌抹中、在另一微生物菌抹中或在植物中產(chǎn)生或表達(dá)；即所述術(shù)語(yǔ)涵蓋野生型、天然存在的蛋白酶的表達(dá)，以及重組蛋白酶、遺傳工程蛋白酶或合成蛋白酶在任何宿主中的表達(dá)。在本發(fā)明的方法中，蛋白酶可以是純化的。術(shù)語(yǔ)"純化的"用于本文包括這樣的酶蛋白，其基本上不含來(lái)自該酶蛋白所來(lái)源的生物的組分。術(shù)語(yǔ)"純化的"還包括這樣的酶蛋白，其不含來(lái)自從中獲得該酶蛋白的天然生物的組分，這也稱為"基本上純的(essentiallypure)"酶，并且可以具體涉及天然存在并且未經(jīng)遺傳修飾的酶，所述遺傳修飾諸如通過(guò)缺失、取代或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。因此，蛋白酶可以是純化的，即僅存在少量的其它蛋白質(zhì)。表述"其它蛋白質(zhì)"具體而言指其它的酶。術(shù)語(yǔ)"純化的"用于本文還指去除其它組分，特別是作為所述蛋白酶來(lái)源的細(xì)胞中存在的其它蛋白質(zhì)，并且最具體而言是其它的酶。蛋白酶可以是"基本上純的(substantiallypure)",即基本上不含來(lái)自在其中產(chǎn)生所述蛋白酶的生物的其它組分，所述生物例如用于重組產(chǎn)生酶的宿主生物。優(yōu)選地，所述蛋白酶是75。/。(w/w)純的，更優(yōu)選至少80%、85%、90%或甚至至少95%純的。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述蛋白酶是至少98%純的酶蛋白制備物。然而，對(duì)于本發(fā)明的使用，蛋白酶不需要那么純。其可以例如包括其它酶，甚至其它蛋白酶，在這樣的情況下可將其稱為蛋白酶制備物。本發(fā)明的蛋白酶可以與其它酶(例如其它蛋白酶)一起使用。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將內(nèi)切型的蛋白酶，例如源自擬諾卡氏菌屬菌種NRRL18262的蛋白酶，與外肽酶組合，或與具有外肽酶活性的蛋白酶制備物組合，例如源自米曲霉(Aspergillusoryzae)的蛋白酶制備物，如W094/25580中所述，諸如Flavourzyme(NovozymesA/S,Denmark)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，當(dāng)通過(guò)對(duì)酪蛋白的水解和后續(xù)的TCA可溶性肽與鄰苯二曱醛及2-巰基乙醇的反應(yīng)，然后測(cè)量所得復(fù)合物在340nm的吸光度時(shí)，用于本發(fā)明的蛋白酶具有接近中性的pH-活性最優(yōu)值。術(shù)語(yǔ)接近中性的pH活性最優(yōu)值意指以下的一種或多種情況pH-最優(yōu)值在pH5.5-11.0，或pH7,0-11.0，或pH6.0-10.0,或pH7.0-10.0，或pH8.0-11.0,或pH8.0-10.0的區(qū)間中。在另一具體實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的蛋白酶是熱穩(wěn)定的。術(shù)語(yǔ)熱穩(wěn)定意指以下的一種或多種情況當(dāng)如上所述通過(guò)對(duì)酪蛋白的水解來(lái)測(cè)定時(shí)，最佳溫度是至少50。C、52。C、54。C、56。C、58。C、60。C、62。C、64°C、66°C、68。C或至少70°C。酵母(familySaccharomycetaceae)。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，酵母是酵母屬(Saccharomyces)的酵母，例如酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或葡萄汁酵母(Saccharomycesuvamm)。在另一實(shí)施方案中，酵母是克魯維酵母屬(Kluyveromyces)的酵母，例如脆壁克魯維酵母(Kluyveromycesfragilis)。在另一實(shí)施方案中，酵母是念珠菌屬(Candida)酵母，例如產(chǎn)朊念珠菌(Candidautilis),也稱為串酵母菌(Torulayeast)。應(yīng)用的酵母可以是任何形式，諸如特別培養(yǎng)在例如糖蜜上的酵母，或廢啤酒酵母(spentBrewer'syeast)，或自醇發(fā)酵收集的酵母。應(yīng)用的酵母可以是完整的酵母細(xì)胞，或完全或部分^C壞或降解的酵母細(xì)胞。酵母提取物酵母提取物在本發(fā)明的上下文中與酵母水解產(chǎn)物或酵母自溶產(chǎn)物同義，是來(lái)自包含經(jīng)水解蛋白的酵母的可溶性提取物，其用途廣泛，例如用作增味劑(flavourenhancer)。根據(jù)本發(fā)明，所述酵母提取物是使用用于蛋白質(zhì)水解的外源蛋白酶產(chǎn)生的。除了添加的蛋白酶之外，酵母本身含有多種降解酶(degradativeenzymes)，包括脂肪酶、核酸酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶和蛋白酶。這些內(nèi)源酶的最優(yōu)溫度和pH值各不相同，并且它們?cè)诒景l(fā)明的工藝條件下可能或多或少是有活性的。在添力口蛋白酶之前，酵母可以是含7K懸'液(aqueoussuspension)的開(kāi)^式。酵母懸液的干物質(zhì)含量可以是5-50%，諸如10-30%。所述酵母懸液的pH和溫度可以適當(dāng)參考所述蛋白酶的特性來(lái)調(diào)節(jié)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將酵母懸液的pH調(diào)節(jié)得堿性更強(qiáng)，例如調(diào)節(jié)至pH5.5-9，優(yōu)選pH6-8，或更優(yōu)選pH6-7。pH和溫度的調(diào)節(jié)可以在添加蛋白質(zhì)之前、同時(shí)或之后進(jìn)行。蛋白酶應(yīng)該以有效量應(yīng)用，即足以進(jìn)行充分蛋白質(zhì)水解的量。目前預(yù)期按一種或多種以下量(劑量范圍)施用所述酶0.001-1;0.005-1;0.01-0.5;0.01-0.2;或0.01-0.1——全部這些范圍的單位是mg酶蛋白/g酵母干物質(zhì)。在添加蛋白酶之前或之后，可以破壞酵母細(xì)胞，如通過(guò)提高溫度來(lái)進(jìn)行。任選地，可以添加化學(xué)物質(zhì)，諸如鹽或有機(jī)溶劑。此過(guò)程通常稱為質(zhì)壁分離。質(zhì)壁分離和由外源蛋白酶引起的蛋白質(zhì)水解可以同時(shí)發(fā)生。酵母細(xì)胞內(nèi)容物的自體消化通常稱為自溶。這種自體消化可能以不同程度在外源蛋白酶引起的蛋白質(zhì)水解之前發(fā)生或與之同時(shí)發(fā)生。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，質(zhì)壁分離、外源蛋白酶引起的蛋白質(zhì)水解和特定程度的自體消化同時(shí)發(fā)生。在另一實(shí)施方案中，質(zhì)壁分離和以酵母自身酶進(jìn)行的自體消化首先進(jìn)行，而以添加的蛋白酶進(jìn)行的水解在單獨(dú)的澄清步驟(aseparateclarificationstep)中進(jìn)行。添加蛋白酶之后的溫育可以在獲得期望程度的蛋白質(zhì)水解所必需的任何方便的溫度和溫育時(shí)間進(jìn)行。本發(fā)明上下文中的蛋白質(zhì)水解可以基本上通過(guò)添加的蛋白酶進(jìn)行，或者可以是添加的蛋白酶和酵母的自體消化性內(nèi)源蛋白酶的作用的組合。即，術(shù)語(yǔ)蛋白質(zhì)水解包括由添加的蛋白酶進(jìn)行的蛋白質(zhì)水解，和通常稱作自溶的由酵母自身的蛋白酶進(jìn)行的蛋白質(zhì)水解。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，溫育溫度是約20°C至約70°C，優(yōu)選約40。C至約60°C，并且溫育時(shí)間是約1小時(shí)至48小時(shí)，優(yōu)選12至30小時(shí)。在溫育進(jìn)程中的任何時(shí)刻，可將pH和溫度二者任選地調(diào)節(jié)得更高或更低。將用蛋白酶進(jìn)行的溫育持續(xù)到達(dá)到期望的結(jié)果，其后可以或可以不通過(guò)使酶失活來(lái)終止，例如通過(guò)熱處理步驟進(jìn)行。這種熱處理也可以用于對(duì)酵母提取物進(jìn)行巴氏滅菌。蛋白水解處理之后，可以將酵母提取物與細(xì)胞碎片分離，例如通過(guò)離心并且傾析上清。由此獲得的酵母提取物可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法濃縮?？梢詫?duì)酵母提耳又物的質(zhì)量進(jìn)行表征，例如通過(guò)以下參數(shù)進(jìn)行表征蛋白質(zhì)產(chǎn)率是在酵母提取物中回收的蛋白質(zhì)占水解之前酵母千物質(zhì)中的百分比。以下是使用本發(fā)明的蛋白酶可以獲得的蛋白質(zhì)產(chǎn)率的實(shí)例至少40%,至少50%，或至少60%。水解程度(DH)表示通過(guò)所述方法獲得的蛋白質(zhì)水解的程度。在本發(fā)明的上下文中，水解程度(DH)由下式定義DH=(切割的肽鍵數(shù)/肽鍵總數(shù))x100%蛋白質(zhì)分?jǐn)?shù)(proteinfraction)是蛋白質(zhì)來(lái)源的酵母提取物中干固體所占的分?jǐn)?shù)。以下是使用本發(fā)明的蛋白酶可以獲得的蛋白質(zhì)分?jǐn)?shù)的實(shí)例至少45%,至少50%，或至少55°/。。酵母提取物的濁度可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法測(cè)定。其可以作為NTU(比濁法濁度單位(NephelometricTurbidityUnits))測(cè)量。以下是使用本發(fā)明的蛋白酶可以獲得的酵母提取物濁度的實(shí)例低于2000NTU，低于1500NTU,低于1000NTU，或低于500NTU。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是通過(guò)上述方法產(chǎn)生的酵母提取物。實(shí)施例1將具有SEQIDNO:1中所示序列的來(lái)自擬諾卡氏菌屬菌種NRRL18262的蛋白酶與Alcalase和無(wú)外源蛋白酶的酵母對(duì)照相比較來(lái)進(jìn)行評(píng)估。在來(lái)自釀酒酵母的成塊酵母(blockyeast)上測(cè)試擬諾卡氏菌屬蛋白酶和Alcalase2.4L(NovozymesA/S,Denmark)。將酵母與去離子水混合以達(dá)到13.7%的干物質(zhì)含量，并且在室溫(磁力)攪拌60分鐘。將酵母混合物加熱至55°C，并且將一部分調(diào)節(jié)至pH6.5。另一部分不調(diào)節(jié)pH并且用作對(duì)照("酵母對(duì)照，，的水解產(chǎn)物pH是大約pH5)。向來(lái)自調(diào)節(jié)過(guò)pH的部分的樣品添加酶。酶的量按照mg酶蛋白/g酵母干物質(zhì)(YDM)的配制(dose)。取出20ml樣品并且稱量精確量。不向稱為"空白，，的樣品加酶。水解在55。C進(jìn)行22小時(shí)。將樣品在85。C失活10分鐘。失活之后，使用Heraeus的Multifuge3S-R將樣品在3500rpm離心10分鐘。傾析之后稱量提取物的量。通過(guò)稱量(在105。C干燥之后)測(cè)量提取物中的干固體。通過(guò)燃燒法在LecoFP-528上測(cè)定了提取物中氮的量。蛋白質(zhì)的量按照氮的量的6.25倍計(jì)算。游離氨基氮使用OPA(鄰苯二醛)法測(cè)定?；谏鲜鰷y(cè)量進(jìn)行以下計(jì)算%提取物產(chǎn)率=(離心之后的提取物g數(shù))/(離心之前的酵母混合物g數(shù))*100%蛋白質(zhì)產(chǎn)率=(離心之后的提取物g數(shù)*提取物中的蛋白質(zhì)含量(content))/(離心之前的酵母混合物g數(shù)*酵母混合物的蛋白質(zhì)含量)*100。/。蛋白質(zhì)/DS=(離心之后的提取物g數(shù)4是取物中的蛋白質(zhì)含量)/(提取物中的干固體g數(shù)"100水解程度=(切割的肽鍵數(shù)/肽鍵總數(shù))*100=(h/htot)*100其中h表示為meqv絲氨酸NH2的函數(shù)h=(絲氨酸NH2-0.4)/1;并且htot=7.8。絲氨酸NH2相對(duì)于含100mg/L的絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)品通過(guò)測(cè)量340nm的吸光度測(cè)量。提取物的濁度作為NTU(比濁法濁度單位)通過(guò)HACH2100AN濁度計(jì)使用USEPA濾光片測(cè)量。針對(duì)FormazinTurbidityStandard4000NTU(可從HACHCompany,USA獲得)進(jìn)行校準(zhǔn)。較高的NTU是較高濁度的量度。結(jié)果在下表中給出(EP二酶蛋白，YDM=酵母干物質(zhì))9<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>來(lái)自擬諾卡氏菌屬菌種NRRL18262的蛋白酶在低劑量水平(0.022-0.044mgEP/gYDM)產(chǎn)生了非常高的蛋白質(zhì)產(chǎn)率。在相同的劑量范圍，經(jīng)擬諾卡氏菌屬菌種NRRL18262蛋白酶處理的提取物的濁度非常澄清，并且更大部分的干固體來(lái)源于蛋白質(zhì)。權(quán)利要求1.一種用于產(chǎn)生酵母提取物的方法，包括a)向包含蛋白質(zhì)的酵母添加蛋白酶，所述蛋白酶與SEQIDNO1具有至少50％同一性；和b)溫育從而使蛋白質(zhì)水解。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白酶與SEQIDNO:1具有至少60%同一性。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白酶與SEQIDNO:1具有至少80%同一性。4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述酵母是酵母屬、克魯維酵母屬或念珠菌屬酵母。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述酵母是釀酒酵母或葡萄汁酵母。6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白酶以每克酵母干物質(zhì)0.005-1mg酶的濃度存在。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述蛋白酶以每克酵母干物質(zhì)0.01-0.5mg酶的濃度存在。8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括將所述酵母懸浮在水溶液中。9.權(quán)利要求8的方法，其進(jìn)一步包括將酵母懸液的pH調(diào)節(jié)成堿性更強(qiáng)。10.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其在步驟b)之后進(jìn)一步包括進(jìn)行離心以獲得沉淀和上清。11.權(quán)利要求10的方法，其中在所述上清中回收水解的蛋白質(zhì)。12.通過(guò)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生的酵母提取物。全文摘要本發(fā)明涉及使用外源蛋白酶產(chǎn)生酵母提取物的方法。文檔編號(hào)C12N1/06GK101558148SQ200780046547公開(kāi)日2009年10月14日申請(qǐng)日期2007年12月20日優(yōu)先權(quán)日2006年12月22日發(fā)明者利斯貝思·卡盧姆申請(qǐng)人:諾維信公司