專利名稱：編碼鉬輔助因子生物合成酶A的moaA基因的表達增加的谷氨酸棒桿菌及用該棒桿菌生產(chǎn)L ...的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種棒桿菌屬微生物，該微生物中編碼鉬輔助因子合成酶A 的基因的表達增加，還涉及用所述微生物生產(chǎn)L-賴氨酸的方法。更具體地， 本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)化的菌株，該菌株的棒桿菌鉬輔助因子生物合成酶 A(mo^4)活性比固有活性有所增強，還涉及用所述菌株生產(chǎn)L-賴氨酸的方法。
背景技術(shù)：
棒桿菌(尤其是谷氨酸棒桿菌)是革蘭氏陽性微生物，其被廣泛用于生 產(chǎn)L-賴氨酸。L-氨基酸(尤其是L-賴氨酸)主要通過棒桿菌菌株的發(fā)酵來 生產(chǎn)，L-賴氨酸可以用于動物飼料、及人類藥物和化妝品工業(yè)中。
另一方面，由于使用谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)L氨基酸的方法在工業(yè)中占有重 要地位，因此對此方法的改良進行了多種嘗試。
具體地，在已有的許多研究中，通過DNA重組技術(shù)擴增了各個與L-氨 基酸生物合成相關(guān)的基因，以檢測它們對L-氨基酸的形成的影響，并且由此 改良了棒桿菌菌株生產(chǎn)L-氨基酸的能力。[Kinoshita, "glutamic acid bacteria" in Biology of industrial Microorganisms, Demain and Solomon(Eds), Benjamin Chummings， London, UK, 1985, 115-142; Hilinger， BioTec 2, 40-44(1991); Eggeling， ^4m/wo ^cz'^is 6, 261-272(1994); Jetten and Sinskey, CW&ca/ i ev/evra ■S/o&c/zwo/ogy 15, 73-103(1995》and Sahm & a/" Annuals of the New York Academy of Acience 782, 25-39(1996)]。
另外，通過破壞特定基因或使特定基因低表達進行研究，從而改良產(chǎn) L-氨基酸的棒狀桿菌菌株。例如，韓國公開的申請?zhí)枮?001-51915和 2001-62279、申請人為Degusa-Huels Acktiengeselshaft的專利申請中，公開了通過使來源于谷氨酸棒桿菌的和 c￡>基因及zvra2基因低表達來增 強棒桿菌的產(chǎn)L-氨基酸能力的方法。
另外，公開了引入來源于外界其它細菌的基因的方法。例如，日本專利 H07-121228公開了引入來源于大腸桿菌0&^r汰/" co/Z)的編碼檸檬酸合成酶
的基因的方法。
另一方面，鉬是在生物界中發(fā)揮重要作用的一種基本的過渡元素，酶在 催化碳、硫和氮代謝中的多種基本反應的過程中都需要鉬。然而，由于鉬本 身沒有生物學活性，其必須與細胞中的蝶呤混合物形成復合物，從而具有合 適的活性，所述復合物被稱為鉬輔助因子。因為鉬輔助因子的生物合成途徑 是進化上非常保守的，所以在從細菌到包括人在內(nèi)的高等動物中，參與該途 徑的蛋白質(zhì)和基因具有高度的同源性。
在鉬輔助因子的生物合成過程中，鳥苷三磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)殂f蝶呤前體Z，然 后，鉬蝶呤前體Z轉(zhuǎn)變?yōu)殂f蝶呤，最后鉬結(jié)合在鉬蝶呤上。
所述鉬輔助因子的生物合成過程的第一個步驟中涉及的鉬輔助因子生 物合成酶A，與鉬輔助因子生物合成酶C 一起在鳥苷三磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)殂f蝶呤前 體Z的過程中發(fā)揮作用。
在細菌中，包括鉬輔助因子的超過50種的酶參與了氮代謝過程的中心 反應。例如，硝酸鹽還原酶是通過使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽的反應來催化無 機氮源代謝的主要的酶。而且，在生產(chǎn)每個分子具有兩個氮源子的L-賴氨酸 的過程中，氮代謝是非常重要的。
基于上述情況，發(fā)明者不斷努力通過加強鉬輔助因子的生物合成，來提 高氮代謝中所涉及的酶的活性，從而平穩(wěn)地提供氮原子以提高L-賴氨酸的生 產(chǎn)效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是加強鉬輔助因子的生物合成，從而提供具有增強的L-賴氨酸生產(chǎn)能力的產(chǎn)L-賴氨酸的棒桿菌菌株。
本發(fā)明的另一個目的是提供用上述菌株生產(chǎn)L-賴氨酸的方法。
本發(fā)明通過下述方法實現(xiàn)將來源于棒桿菌的編碼鉬輔助因子生物合成
酶A的附o"』基因克隆到棒桿菌-大腸桿菌穿梭載體pECCG122中，然后將 其轉(zhuǎn)化到產(chǎn)L-賴氨酸的菌株中，從而制備得到鉬輔助因子生物合成酶A表 達增加的重組細菌菌株，然后培養(yǎng)該重組菌株以生產(chǎn)L-賴氨酸。
本發(fā)明涉及一種棒桿菌屬微生物，該微生物中編碼鉬輔助因子生物合成 酶A的基因的表達增加，還涉及用所述微生物生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，該方 法提供了用具有增強的L-賴氨酸生產(chǎn)能力的棒桿菌菌株來生產(chǎn)L-賴氨酸的 方法，所述L-賴氨酸生產(chǎn)能力的增強是通過加強編碼鉬輔助因子生物合成酶 A的mod基因的表達來實現(xiàn)的。


圖1顯示了本發(fā)明的mo"基因表達載體pECCG122-附oa丄
具體實施例方式
本發(fā)明包括制備附o"基因表達增加的轉(zhuǎn)化的棒桿菌菌株的步驟和以直 接培養(yǎng)方法來培養(yǎng)所述菌株和在發(fā)酵液中累積L-賴氨酸以及隨后回收L-賴 氨酸的步驟。
本發(fā)明提供了一種能產(chǎn)生L-賴氨酸的微生物，優(yōu)選能夠通過增強鉬輔助 因子生物合成酶A的活性而具有增加的L-賴氨酸生產(chǎn)能力的棒桿菌微生物。
在本發(fā)明中，酶的激活可以通過本領域內(nèi)眾所周知的方法來實現(xiàn)。本發(fā) 明中的術(shù)語"激活"指與野生菌株相比，編碼鉬輔助因子生物合成酶A的基因以更高的水平表達。
在本發(fā)明中，酶的激活通過表達完整的表達單位來實現(xiàn)，所述表達單位
包括編碼鉬輔助因子生物合成酶A的基因的啟動子部分。
在本發(fā)明的具體實施方式
中，所述激活可以通過如下方法實現(xiàn)將包括
SEQIDNo.l的載體轉(zhuǎn)化到棒桿菌微生物中，培養(yǎng)該微生物，然后進行篩選 以表達包括編碼鉬輔助因子生物合成酶A的基因的啟動子部分的完整表達 單位。
在本發(fā)明中，使用了向棒桿菌中插入重組表達載體以表達具有增強功能 的mod的方法，然而，mod基因可以通過眾所周知的方法來表達，例如 利用病毒感染來表達重組表達載體以外的外源基因，但并不限定于這些方 法。
本發(fā)明的特征在于，所述產(chǎn)L-賴氨酸的棒桿菌屬微生物是谷氨酸棒桿菌 CA01-015(KCCM-10802P)，所述谷氨酸棒桿菌具有比固有活性更強的鉬輔助 因子生物合成酶A的活性。
本發(fā)明還提供了通過發(fā)酵培養(yǎng)棒桿菌屬微生物或它的培養(yǎng)液來生產(chǎn)L-賴氨酸的方法。
本發(fā)明中的術(shù)語"轉(zhuǎn)化"指將基因引入宿主細胞從而在宿主細胞中表達 的方法。轉(zhuǎn)化的基因只要在宿主細胞中處于被表達的狀態(tài)，其可以包括插入 到宿主細胞染色體中的或位于染色體其它部位的任何基因。另外，轉(zhuǎn)化的基 因可以包括作為編碼多肽的多核苷酸的DNA和RNA。只要所述基因可以被 引入到宿主細胞并在其中表達，那么該基因可以以任意的形式引入。例如， 所述基因可以以表達盒的形式引入到宿主細胞中，所述表達盒是本身包含基 因表達所需的所有元件的多核苷酸表達體。所述表達盒包含可操作地連接于 基因的啟動子、轉(zhuǎn)錄終止信號、核糖體部分和翻譯終止信號。所述表達盒可 以是能夠自我克隆的表達載體的形式。所述基因也可以獨自地引入到宿主細胞中，或以多核苷酸表達盒的形式引入到宿主細胞中，其中，所述基因可操 作地連接于在宿主中表達所必需的序列。
根據(jù)本發(fā)明使用的棒桿菌菌株可以通過連續(xù)的或分批的方法進行培養(yǎng)， 所述分批的方法可以是分批、或補料分批或重復補料分批的方法。在
Chmiel(Bioprozesstechnik 1. Einfbhrung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)); 禾卩 Storhas(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag， Braunschweig/Weisbaden, 1994))中公開了此類
公知的培養(yǎng)方法。
本發(fā)明中所使用的培養(yǎng)基必須能夠滿足以合適方法培養(yǎng)的特定菌株的 需要。棒桿菌菌株的培養(yǎng)基可以在Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology (Washington D.C.， USA, 1981)(美
國細菌學會常用細菌學方法指南)在中找到。
可以用于微生物的培養(yǎng)基的糖源包括糖和碳水化合物，例如葡萄糖、
蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖或淀粉纖維素；油和脂肪，例如大豆油、葵花油、 蓖麻油、椰子油；脂肪酸，例如棕櫚酸、硬脂酸或亞油酸；醇，例如乙醇； 有機酸，例如乙酸。這些材料可以單獨使用或混合使用。
所述培養(yǎng)基的氮源包括蛋白胨、酵母提取物、牛肉汁、麥芽膏、玉米 消化液、大豆粉末和尿素、或無機化合物(例如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、 碳酸銨和硝酸銨)。所述氮源也可以單獨使用或混合使用。
所述培養(yǎng)基的磷源包括磷酸二氫銨或磷酸二氫鉀、或相應的鈉鹽。 所述培養(yǎng)基還必須含有金屬鹽，例如硫酸鎂或硫酸鐵。 最后，除上述材料以外，還使用基本的生長物質(zhì)，例如氨基酸和維生素。 同時，也可以使用適合于培養(yǎng)基的前體。上述物質(zhì)可以在培養(yǎng)期間通過適當 的方法分批的或連續(xù)的添加。培養(yǎng)基的pH值可以通過適當?shù)姆椒ㄓ脡A性化 合物來控制，所述堿性化合物例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水，或用酸性化
7合物來控制，所述酸性化合物例如磷酸或硫酸。
另外，可以通過使用包括脂肪酸聚乙二醇酯在內(nèi)的消泡劑來抑制泡沫的 形成。為了維持需氧狀態(tài)，可以注入氧氣或含氧氣體。
培養(yǎng)溫度通常在20-45°C、優(yōu)選25-4(TC。持續(xù)培養(yǎng)，直到獲得的L-氨 基酸產(chǎn)物達到預期水平。這一目標可在10-160小時內(nèi)實現(xiàn)。L-賴氨酸可以被 釋放到培養(yǎng)基中或存在于細胞中。
可以通過陰離子交換層析和隨后的茚三酮衍生化作用來分析L-氨基酸 [Spackman et al. Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190]。
實施例
下面參考實施例來說明本發(fā)明。然而，這些實施例僅為了說明本發(fā)明， 而非限制本發(fā)明。
實施例1:來源于棒桿菌的mo"^的表達載體的產(chǎn)生
棒桿菌中的鉬輔助因子生物合成酶A的序列信息獲自NIH GenBank(mod; SEQ ID No.l)。為了提高棒桿菌基因組上的mod基因的活 性，向細胞中引入用于增加mo"基因表達的表達載體。為了擴增包含mo" 基因啟動子的整個表達單位，基于已報道的序列合成一對引物(SEQ ID Nos. 2禾口 3)，且通過PCR方法[Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual (分子克隆實驗室手冊)(1989), Cold Spring Harbor Laboratories], 以野生型谷氨酸棒桿菌(ATCC13032)染色體DNA為模板擴增wo^4基因 片段(條件變性=96匸、30秒/退火=52°〇、30秒/延伸=72匸、2分鐘，30 個循環(huán))。由申請者制備和加工得到的棒桿菌-大腸桿菌穿梭載體 pEGCCG122用限制性內(nèi)切酶&o/ r處理，然后用連接酶將處理后的產(chǎn)物與 擴增的moo4基因片段產(chǎn)物連接，產(chǎn)生pECCG122-mod (見圖l)。實施例2:具有增強的mo^4基因表達的產(chǎn)L-賴氨酸微生物的產(chǎn)生 用電脈沖方法[Appl. Microbiol. Biotechnol (微生物生物技術(shù)應用)(1999) 52:541-545的轉(zhuǎn)化方法]，將實施例1中產(chǎn)生的pECCG122-mo"轉(zhuǎn)化到谷氨 酸棒桿菌KFCC10881中，然后涂布到含25嗎/mL卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng) 基上，隨后篩選和獲得轉(zhuǎn)化菌株(CA01-015)，然后從各轉(zhuǎn)化菌株中分離 pECCG122-wod并對它們進行確認。
實施例3:從具有增強的moa4基因表達的產(chǎn)L-賴氨酸微生物中生產(chǎn)賴
氨酸
為了生產(chǎn)L-賴氨酸，將實施例2中獲得的谷氨酸棒桿菌CA01-015進行 如下培養(yǎng)
留種培養(yǎng)基(pH7.0):(基于1L處理的水)
原糖20g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、尿素1.5g、 KH2P044g、 K2HP04 8g、 MgS04'7H20 0.5g、生物素100嗎、鹽酸硫胺素1000jxg、泛酸鉀 (potassium-pantotenic acid) 2000嗎禾卩煙酰胺2000嗎。
生產(chǎn)培養(yǎng)基(pH7.0):(基于1L處理的水)
原糖100g、 (NH4)2S04 40g、大豆蛋白2.5g、玉米浸漬固體5g、尿素3g、 KH2P04lg、 MgS04'7H20 0.5g、生物素IOO嗎，鹽酸硫胺素IOOO嗎、泛酸鉀 2000嗎、煙酰胺3000嗎和CaC03 30g。
在含有25 mL留種培養(yǎng)基的250 mL角擋板(corner-baffle)瓶中接種谷氨 酸棒桿菌KFCC10881和CA01-015，在3(TC振蕩(200 rpm)培養(yǎng)20小時。向 含24 mL生產(chǎn)培養(yǎng)基的250 mL角擋板瓶中接種1 mL留種培養(yǎng)液體，在30°C 振蕩(200 rpm)培養(yǎng)120小時。
培養(yǎng)后，通過氨基酸分析儀來檢測L-賴氨酸的產(chǎn)量，結(jié)果在表1中顯示。表1
菌株L-賴氨酸產(chǎn)量(g/L)與母菌株相比L-賴氨酸的增加率
批次1批次2批次3批次1批次2批次3
KFCC-108814545.244.74.2%4%4.1%
CA01-01546.94746.5表1中的顯示證實谷氨酸棒桿菌CA01-015中L-賴氨酸的濃度比谷氨酸 棒桿菌KFCC10881中增加4.1%。
因此，將鉬輔助因子生物合成酶A活性比固有活性增加的谷氨酸棒桿菌 CA01-015保藏在韓國聯(lián)邦菌物保藏中心(KFCC)附屬的韓國微生物保藏中 心(Korean Culture Center of Microorganism attached to the Korean Federation of Culture Collection),保藏日為2006年11月27日，保藏號為KCCM-10802P。國際承認用于專利程序的微生物保藏布達佩斯條約 致CJ第一制糖株式會社 一
韓國首爾中區(qū)南大門路5街500番地國際保藏單位根據(jù)條約7.1的規(guī) CJ大廈 定對原始提出的事由在此頁下 郵編100-749 部做出的認定的收據(jù)
I、微生物的鑒定保藏人給出的鑒定參考國際保藏單位給出的登錄號
谷氨酸棒桿菌CA01-015KCCM10802P
II、科學的描述和/或建議的分類學描述在上述I欄中鑒定的微生物具有
□科學的描述
□建議的分類學描述
(在適用處用叉標記)
III、受理和接收本國際保藏單位收到上述I欄中鑒定的微生物，該微生物于2006年11月27日收到。(原始保藏日)
IV、國際保藏單位名稱韓國微生物保藏中心
地址361-221， YurimB/D Hongje-l-dong， Seodaemun-gu 首爾120-091
國際保藏單位的代表人或該單位授權(quán)
者的簽章
日期2006年11月27日
條約6.4 (d)規(guī)定，該日期為國際保藏單位獲得保藏的日期，當在國際 保藏單位保藏以后又在布達佩斯條約規(guī)定的保藏單位以外的保藏單位進行 的保藏在轉(zhuǎn)入到布達佩斯條約規(guī)定的保藏單位時，該日期為國際保藏單位收 到該微生物的日期。
BP/4 單頁
權(quán)利要求
1、一種棒桿菌屬(Corynebacterium ssp.)微生物，其特征在于，該微生物的產(chǎn)L-賴氨酸的能力增強，所述產(chǎn)L-賴氨酸的能力增強是通過增強鉬輔助因子生物合成酶A的活性來實現(xiàn)的，該微生物具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的棒桿菌屬微生物，其中，所述鉬輔助因子生 物合成酶A的活性的增強是通過使用包括SEQ IDNo.l所示的核苷酸序列的載體轉(zhuǎn)化所述棒桿菌屬微生物以表達包括啟動子部分的編碼所述鉬輔助因 子生物合成酶A的基因的完整表達單位來實現(xiàn)的。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的棒桿菌屬微生物，其中，該微生物為谷氨酸 棒桿菌(Coo^ek^ten.Mwg/Mto柳.cMm) CA01-015 KCCM-10802P。
4、 一種生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，其特征在于，該方法通過發(fā)酵培養(yǎng)權(quán)利 要求1所述的微生物或它的培養(yǎng)液來生產(chǎn)L-賴氨酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種棒桿菌屬微生物，該微生物中編碼鉬輔助因子生物合成酶A的基因的表達增加，還涉及使用所述微生物生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，該方法提供了用具有增強的產(chǎn)L-賴氨酸能力的棒桿菌菌株來生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，所述產(chǎn)L-賴氨酸能力增強是通過增加編碼鉬輔助因子生物合成酶A的moaA基因的表達來實現(xiàn)的。
文檔編號C12N1/21GK101611136SQ200780047318
公開日2009年12月23日 申請日期2007年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月21日
發(fā)明者崔宗秀, 張在佑, 文準玉, 樸英薰, 林相曹, 羅昭妍, 金亨俊 申請人:Cj第一制糖株式會社