專(zhuān)利名稱(chēng)：：重組中溫活性熱穩(wěn)定蛋白及其設(shè)計(jì)和生物合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供包括嗜熱性蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性特征和嗜中溫蛋白的活性特征的重組中溫活性熱穩(wěn)定蛋白(meso-activethermo-stableprotein)及其設(shè)計(jì)和生物合成方法，其中包括嗜熱性蛋白的底物-結(jié)合和催化活性表面的主要不連續(xù)氨基酸組被結(jié)構(gòu)-同源的嗜中溫蛋白中的結(jié)構(gòu)等價(jià)位置處存在的不同的不連續(xù)氨基酸組所替換。更具體地，本發(fā)明描述通過(guò)基于理性的殘基替換由一組殘基改變，或"理論上移植"，其表面的一個(gè)部分(或多個(gè)部分)而謹(jǐn)慎改變蛋白分子功能行為的一般適用方法，所述一組殘基包括不同的、獨(dú)立演化的、結(jié)構(gòu)同源的蛋白質(zhì)中的一個(gè)功能等價(jià)表面(或多個(gè)表面)，所述蛋白在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、和物理活性方面具有明顯不同的特征，但是具有相同的化學(xué)特征。變化的蛋白中的許多不同的不連續(xù)放置的殘基被同源蛋白等價(jià)位置處使用的殘基合理替換意欲引起將所述變化的蛋白折疊為三維結(jié)構(gòu)，其充滿相同蛋白的未改變形式的原始結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性特征，和另一種(同源)蛋白的活性特征(例如，最佳活性的溫度)。這促進(jìn)產(chǎn)生組合來(lái)源于不同生命形式和不同生命領(lǐng)域的酶的理想特征的酶。現(xiàn)有技術(shù)和
背景技術(shù)：
：^^^##祭溝關(guān)系賞熱蛋白質(zhì)是通過(guò)肽鍵連接在一起的氨基酸的天然聚合物，其在合成時(shí)折疊成具有某些生物活性的三維結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)受到其氨基酸序列的控制(Anfinsen,1973.科學(xué)(Sc/e"ce)181,223)。氨基酸序列包括指示由蛋白鏈形成三維結(jié)構(gòu)所需的全部相關(guān)信息。在進(jìn)化過(guò)程中通過(guò)天然引入突變產(chǎn)生的或通過(guò)遺傳工程技術(shù)引起的蛋白質(zhì)序列的改變導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。所述改變可以是細(xì)微的或深切的。如果所述改變是細(xì)微的，則它們通常僅涉及蛋白質(zhì)特定區(qū)域顯微結(jié)構(gòu)的微小變化，表現(xiàn)為變化的殘基附近的局部殘基群(所述蛋白中包埋的，或位于其表面上的)的形狀改變，但對(duì)該蛋白質(zhì)總體形狀或功能，或其肽主鏈穿過(guò)其三維結(jié)構(gòu)所采用的軌道不具有任何深切或明顯的影響。然而，當(dāng)所述改變是深切的時(shí)候，它們改變蛋白質(zhì)的整體形狀以及主鏈穿過(guò)蛋白結(jié)構(gòu)所采用的軌道。有時(shí)，由突變產(chǎn)生的深切變化甚至可以引起所述鏈?zhǔn)シ€(wěn)定折疊為特定三維結(jié)構(gòu)的能力(導(dǎo)致聚集和沉淀)。不能總使突變對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響與其序列中發(fā)生的變化相聯(lián)系或針對(duì)其進(jìn)行校準(zhǔn)。盡管現(xiàn)在所述非常有限改變的作用可以通過(guò)計(jì)算機(jī)建模，但是實(shí)驗(yàn)研究序列改變的作用在所有情形中(無(wú)論這些改變是細(xì)微的或是深切的)成為基本的，因?yàn)檫€不能對(duì)確定這些改變的作用所涉及的所有參數(shù)、以及物理力進(jìn)行建?！，F(xiàn)今充分已知的是深切和細(xì)微的序列改變均可以以挑戰(zhàn)可預(yù)期性的方式導(dǎo)致結(jié)構(gòu)深切或細(xì)微的改變。因此，有時(shí)可以看到來(lái)自兩種在進(jìn)化上不相關(guān)的生物體的兩種蛋白質(zhì)具有在它們的總形狀和折疊結(jié)構(gòu)上幾乎相同的多肽主鏈(盡管不是氨基酸殘基側(cè)鏈)，即使這兩種蛋白質(zhì)具有無(wú)相似性的完全不同的氨基酸序列。然而，這作為超越這樣的規(guī)則的例外，所述規(guī)則是，通常相似尺寸的蛋白質(zhì)僅傾向于采用基本相似的主鏈結(jié)構(gòu)，如果它們具有稍微相似的氨基酸序列(包括所有殘基的至少20%的一致性)。然而，所述蛋白質(zhì)的外部形狀特征非常不同，且這是由于所述蛋白質(zhì)特有的特異性相互作用殘基(側(cè)鏈)組以由其特異性氨基酸序列決定的方式對(duì)各種蛋白質(zhì)的主鏈進(jìn)行特異性"修飾"。因此，主鏈結(jié)構(gòu)的保守性與廣泛的功能保守性相關(guān)；功能性的精確熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)參數(shù)幾乎完全受到由蛋白質(zhì)表面上存在的側(cè)鏈所決定的蛋白質(zhì)外部形狀特征的影響。為了總結(jié)以上討論，氨基酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之間的精確關(guān)系是非常微妙的；尚不理解或領(lǐng)會(huì)這種關(guān)系的所有方面，且尚不可能在不進(jìn)行必要實(shí)驗(yàn)或不參考特定結(jié)構(gòu)情形的條件下預(yù)期在序列中進(jìn)行的特定變化對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響。在這點(diǎn)上，和在與通過(guò)序列改變?cè)俑脑烊魏蔚鞍踪|(zhì)表面的特定關(guān)系中，折疊和穩(wěn)定性的考慮因素起作用，因?yàn)楦脑焱暾虿糠值牡鞍踪|(zhì)表面影響其結(jié)構(gòu)-形成能力，及其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。通常，在改造蛋白質(zhì)的所有嘗試中，無(wú)論關(guān)于它們的表面還是它們的內(nèi)部，可以采用兩種不同的方法，這些是(i)基于結(jié)構(gòu)-功能分析的理性改造方法，和謹(jǐn)慎引入特定的突變，和(ii)更依賴(lài)于隨機(jī)過(guò)程諸如基因改組，或篩選表現(xiàn)出隨機(jī)產(chǎn)生的變體群的噬菌體的非理性的(基于組合學(xué)的和基于定向進(jìn)化的)方法，隨后基于結(jié)合特征進(jìn)行選擇。在蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域中，理性方法是最初采用的方法。然而，因?yàn)樽龀龅母淖兊淖饔玫牟豢深A(yù)期性，證明它不夠令人滿意。隨后，最近可用的重組DNA技術(shù)使得基于組合學(xué)的(組合的)方法也可行。所述理性方法的不夠令人滿意的結(jié)果最初導(dǎo)致轉(zhuǎn)換為組合方法。然而，逐漸地，研究可以通過(guò)完全隨機(jī)方法(對(duì)于n個(gè)殘基的鏈有2(f種變化)令人信服地產(chǎn)生的序列變化的甚至非常小的級(jí)分的不可行性導(dǎo)致采用試圖組合這兩種方法的最佳部分的雜交方法。這些雜交方法包括理性選擇待進(jìn)行改變的蛋白質(zhì)中的殘基或結(jié)構(gòu)位點(diǎn)，和非-理性(基于組合學(xué)研究)研究在所述位點(diǎn)處進(jìn)行突變的影響。以下，我們簡(jiǎn)要評(píng)述先前的工作者如何采用理性、非-理性或雜交方法，從而幫助隨后對(duì)這些和我們?cè)诒景l(fā)明中采用的方法進(jìn)行區(qū)分。辨潘絲歪A廣改遣游實(shí)銀Rutter和同事在胰蛋白酶的活性位點(diǎn)的兩個(gè)位置引入位點(diǎn)-特異性突變(在對(duì)其活性位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析后)，從而降低催化速度，但增強(qiáng)酶針對(duì)其天然底物的底物特異性(Craik等，1985.科學(xué)(&^"c"228,291-297)。許多其他小組隨后基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的理性分析引入有限的突變，從而產(chǎn)生具有改變的速度和/或親和性特征的變體。Estdl和同事在關(guān)于酶活性位點(diǎn)附近的靜電學(xué)方面，改造了另一種蛋白酶，即枯草桿菌蛋白酶，從而改變由于它們靜電學(xué)特征而不同的底物結(jié)合的優(yōu)選性(Wells等,1987.美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)(iVoc.Ato/.<SW.84,1219-1223)。Perham和同事在谷胱甘肽還原酶中進(jìn)行了理性的突變，以在將其輔酶特異性由NADP+改變?yōu)镹AD+的同時(shí)保持其底物特異性不變(Scrutton等，1990.自然(A^/wrd343,38-43)。在九十年代中進(jìn)行了所述工作的若干實(shí)例，在所有這些中在活性位點(diǎn)附近引入有限的理性-選擇的突變，以在活性位點(diǎn)附近改變關(guān)于蛋白質(zhì)-配體相互作用方面的酶特征。隨后，進(jìn)行了下述更大膽的改造嘗試。Benkovic和同事成功地利用細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)因子2的結(jié)構(gòu)同源蛋白支架設(shè)計(jì)了scytalonedehyratase-樣酶，從而證明所述理性改造方法在通過(guò)重新設(shè)計(jì)支架蛋白的主要部分開(kāi)發(fā)新實(shí)體中的功效(Nixon等，1999.國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))96,3568-3571)。類(lèi)似地，Hdlinga和同事分析了核糖-結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)，針對(duì)預(yù)期可能賦予該蛋白丙糖磷酸異構(gòu)酶(TIM)活性的18-22位點(diǎn)-定向的突變合理地選擇了位點(diǎn)，并證明這是實(shí)驗(yàn)的情形(Dwyer等，2004.科學(xué)(Sc^weJ304，1967-1971)。隨后，組合的方法也獲得了成功。^A處改造游實(shí)銀定向的進(jìn)化由將隨機(jī)分布的突變低頻率引入到目的基因中，隨后選擇具有理想性質(zhì)的突變的(變體)蛋白質(zhì)組成(Roberto等，2005.現(xiàn)代生物技術(shù)觀點(diǎn)(CwreWC^z力/ow&Z)/otec/7"o/ogy).16,378-384)。證明了定向進(jìn)化是修飾蛋白質(zhì)的有力工具，并且現(xiàn)在已經(jīng)成為廣泛使用的方法。然而，其主要用于利用錯(cuò)誤-傾向的PCR技術(shù)將突變隨機(jī)引入蛋白質(zhì)序列來(lái)尋找溫度-敏感的以及諸如此類(lèi)的突變體，和用于發(fā)展新型結(jié)合試劑(通過(guò)噬菌體-展示組合方法，其包括通過(guò)將簡(jiǎn)并寡核苷酸結(jié)合到編碼DNA中隨機(jī)化蛋白質(zhì)的部分)。存在非常少量的用于改變酶活性的純非-理性方法的實(shí)例，這大概是因?yàn)橛糜陔S機(jī)引入突變的機(jī)制在不進(jìn)行一些位點(diǎn)的理性選擇的條件下，通常不能被控制和限制在蛋白質(zhì)表面特定的區(qū)域內(nèi)，這是因?yàn)榻M合空間的完全研究是不可能的(存在太多可以產(chǎn)生的變體)。利用人雌激素受體a配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，Zhao和同事使用隨機(jī)誘變和體外定向進(jìn)化，從而發(fā)展新型皮質(zhì)酮活性(Chen等，2005.分子生物學(xué)雜志(JMo/.348,1273-1282)。純粹的隨機(jī)改造方法應(yīng)用的另一個(gè)著名實(shí)例(然而，基于隨機(jī)化位點(diǎn)的半-理性選擇)是Bryan和同事的實(shí)例，他們利用定向共同進(jìn)化，來(lái)改變無(wú)l丐的枯草桿菌蛋白酶的穩(wěn)定性和催化活性(Stmusberg等，2005.生物化學(xué)(歷oc/2e/w^0^44,3272-3279)。定向進(jìn)化深切改變熱穩(wěn)定性而非活性的應(yīng)用的一個(gè)實(shí)例是Rao和同事的實(shí)例，他們使用該方法開(kāi)發(fā)高度穩(wěn)定的脂肪酶(Acharya等，2004.分子生物學(xué)雜志UMo/,編.力41，1271-1281)?；旧?，現(xiàn)今的趨勢(shì)是混合所述理性和非-理性的方法，一些這樣的實(shí)例引用如下。雜交f^絲-資會(huì)游J歪/^資改造實(shí)銀如通過(guò)由Kim和同事在乙二醛酶II的ap/(3ct金屬水解酶支架上發(fā)展新的催化活性(P-內(nèi)酰胺酶活性)所例證地，一些小組使用了雜交方法，其組合理性和組合的要素以獲得成功的結(jié)果(Park等，2006.科學(xué)(5We"ce,311,535-538)。該方法成功的第二個(gè)實(shí)例是Peimbert和Segovia的實(shí)例，他們?cè)贒-AlaD-Ala轉(zhuǎn)肽酶折疊上發(fā)展了卩內(nèi)酰胺酶活性(Peimbert禾QSegovia,2003.蠆^OT程)16，27-35)。另外一個(gè)實(shí)例是該方法改變NHR人雌激素受體特異性，相對(duì)于天然配體，即np-雌二醇，所述受體更支持合成的配體，即4,4'-二羥基偶苯酰(Chockalingam等，2005.美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)102,5691-5696)。通過(guò)i^橋或二疏眾激參像遂療歪A質(zhì)潛賴(lài)穩(wěn)定絲改造游實(shí)/媒另外，盡管尚未詳細(xì)研究這個(gè)方面，但是可以注意到也己經(jīng)嘗試了包括理性方法的蛋白質(zhì)改造，以通過(guò)引入如特異性靜電相互作用或其他另外的鍵諸如二硫鍵獲得特定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。所述嘗試基于這樣的知識(shí)，即表面鹽橋(Anderson等，1990.生物化學(xué)(Aoc/zem/W^)29，2403-2408)以及二硫鍵(Creighton,1986.酶學(xué)方法(MeAo血五"z;;wo/.J>131,83-106)為蛋白質(zhì)提供額外的穩(wěn)定性。然而，所述理性嘗試沒(méi)有獲得什么成功，正如通過(guò)Perham和同事的工作所例證地(Scrutton等，1998.FEBS通信(FEBSLetters)241，46-50)，他們通過(guò)設(shè)計(jì)將二硫鍵引入到谷胱甘肽還原酶中，以試圖提高其穩(wěn)定性，并且生成形成預(yù)期的二硫鍵但不顯示額外的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的活性酶。我們能夠發(fā)現(xiàn)的試圖以某種方式組合一種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和另一種(相關(guān)的)蛋白質(zhì)活性的溫度方案的蛋白質(zhì)構(gòu)建體的僅有的先前實(shí)例包括反復(fù)試驗(yàn)(trial-and-error)方法，其中重組了由源自兩種不同的同源蛋白質(zhì)的連續(xù)的殘基序列段組成的結(jié)構(gòu)域，以產(chǎn)生嵌合蛋白。我們已經(jīng)能夠發(fā)現(xiàn)四個(gè)制備所述嵌合蛋白的實(shí)例，兩個(gè)涉及卩葡萄糖苷酶，來(lái)自Hayashi和同事的工作(Singh和Hayashi,1995.生物化學(xué)雜志Q歷o/.J270，21928-21933;;Goyal等，2001,分子催化作用B:酶雜志UMo/.Cato—.5:五"矽ma"c^16,43-51)，一個(gè)涉及檸檬酸合酶，來(lái)自Danson和同事的工作(Arnott等，2000.分子生物學(xué)雜志QMo/.所o/J304，657-668)，和一個(gè)涉及抗生物素蛋白(Hytonen等，2007.美國(guó)專(zhuān)利7,268,216)。在第一個(gè)實(shí)例中，制備來(lái)自根癌農(nóng)桿菌(』gro^"en'wwmme/adera)和gz7vw纖維弧菌(CW/W^'ogz7my)的同源-|3葡萄糖苷酶(37%的序列同一性；40%的序列相似性)的嵌合體(Singh等，1995.同前引用)。在第二個(gè)實(shí)例中，制備來(lái)自根癌農(nóng)桿菌和海棲熱袍菌(T7ze，otoga的同源-P葡萄糖苷酶的嵌合體(Goyal等，2001.同前引用)。在第三個(gè)實(shí)例中，制備來(lái)自嗜酸熱原體(T7zermo//osmaaczWo//n7wm)禾卩激烈火球菌(i^racoccw/wn'os"s)的同源檸檬酸合酶(Amott等，2000.同前引用)。在所有三個(gè)實(shí)例中，目的是為了獲得具有提高的酶穩(wěn)定性和改變的最佳功能溫度和pH的酶性質(zhì)的嵌合體。在第四個(gè)實(shí)例中，它是在專(zhuān)利文獻(xiàn)中找到的(Hytonen等,2007.同前引用)，雞抗生物素蛋白的熱穩(wěn)定性是通過(guò)其稱(chēng)為的結(jié)構(gòu)域被不同抗生物素蛋白-相關(guān)(AVR)蛋白的完整P4結(jié)構(gòu)域替換得到提高的。本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容、本發(fā)明的新穎性、和<嵌合體'方法與本發(fā)明提議的方法之間的區(qū)別在本發(fā)明中，我們己經(jīng)研究了序列變化對(duì)蛋白質(zhì)表面的微觀-結(jié)構(gòu)和宏觀-結(jié)構(gòu)的影響(來(lái)自蛋白質(zhì)的進(jìn)化比較)，其具體涉及使用所述變化，通過(guò)設(shè)計(jì)(而非通過(guò)非-理性的組合方法)產(chǎn)生組合一種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征和源自不同生物體的另一種(同源)蛋白質(zhì)的功能特征的新型蛋白。因此，在本發(fā)明中，我們的重點(diǎn)是對(duì)蛋白質(zhì)表面的重新改造，其具體涉及改造限定蛋白質(zhì)酶活性和/或其他功能(例如，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用)的物理參數(shù)。
發(fā)明內(nèi)容我們疊合兩種基于(3-折疊的卩薄巻餅型(jdly-roll)折疊蛋白R(shí)MCell2A(SEQIDNO:l)和TRCell2A(SEQIDNO:2)的結(jié)構(gòu)，它們是纖維素-降解酶，稱(chēng)為纖維素酶。我們證實(shí)這兩種酶的多肽主鏈原子可與1.1埃的均方根偏差重疊。我們?nèi)缓笤谶@兩種酶中構(gòu)建約60個(gè)類(lèi)似殘基的對(duì)應(yīng)組，其包括它們的活性表面。在此，活性表面定義為這兩種酶中的扭曲的/彎曲的、結(jié)構(gòu)-同源的(3折疊的完整的溶劑-暴露表面，其包含底物(纖維素)-結(jié)合溝。認(rèn)為SEQIDNO:l是主體酶(hostenzyme)，且保留其大部分氨基酸序列，我們?nèi)缓笤谖挥谡郫B的酶結(jié)構(gòu)活性表面上的位置處將突變引入該序列中，從而使所有所述殘基被另一種(客體)酶結(jié)構(gòu)中的結(jié)構(gòu)-類(lèi)似位置處使用的殘基替換，所述另一種(客體)酶結(jié)構(gòu)具有由SEQIDN0:2表示的氨基酸序列。該替換的目的是為了將組成其活性表面的60個(gè)主要不連續(xù)殘基的完整組(完全來(lái)自主體酶的多肽鏈)替換為組成客體酶的活性表面的結(jié)構(gòu)-等價(jià)殘基。該替換導(dǎo)致形成由SEQIDNO:3表示的宿主酶突變形式。這實(shí)現(xiàn)在主體酶突變形式的折疊結(jié)構(gòu)上對(duì)客體酶的活性表面的模仿，以使SEQIDNO:3折疊，從而表現(xiàn)出RMCell2A的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性特征和TRCdl2A的活性特征。由于RMCell2A是嗜熱性纖維素酶，且TRCell2A是嗜中溫纖維素酶，我們將RMCell2A的該種突變形式(引入TRCell2A的活性表面)稱(chēng)為中溫活性熱穩(wěn)定纖維素酶(meso-activethermostablecellulase)，艮卩MTCell2A。利用X-射線晶體學(xué)、圓二色譜學(xué)、質(zhì)譜學(xué)、凝膠過(guò)濾色譜法和凝膠電泳、和纖維素酶活性測(cè)定法，在結(jié)構(gòu)上和功能上表征MTCell2A。證明了MTCell2A的確是一種中溫活性熱穩(wěn)定酶，其組合TRCell2A的活性表面和RMCell2A的大部分結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性特征。本發(fā)明中提出的方法的新穎性總之，在現(xiàn)有技術(shù)和背景中，上述改造方法的所有成功應(yīng)用涉及試圖使用蛋白質(zhì)改造(利用理性或組合的方法)來(lái)改變(a)蛋白/酶活性位點(diǎn)關(guān)于對(duì)結(jié)合底物或其他配體(例如，輔酶)的優(yōu)選性的化學(xué)特異性，或(b)結(jié)合底物或配體的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)參數(shù)。相反，在本發(fā)明中，我們提出針對(duì)酶/蛋白質(zhì)功能的物理特征(即，最佳結(jié)合的溫度，或活性)，而非與例如優(yōu)選結(jié)合特定化學(xué)結(jié)構(gòu)的底物或配體相關(guān)的功能的化學(xué)特征，而改變蛋白質(zhì)/酶表面。我們提出使用理性改造方法而非組合的或雜交的方法，但是其是足夠系統(tǒng)的，以至于具有適用于所有這樣的蛋白質(zhì)的高度可能性，所述蛋白質(zhì)的功能部分(即其活性表面、或活性結(jié)構(gòu)域、或亞-結(jié)構(gòu)域)主要為特定類(lèi)型的二級(jí)結(jié)構(gòu)，即(3-折疊結(jié)構(gòu)。在不干擾所述折疊的條件下將突變引入(3-折疊(在所述折疊完整的朝向溶劑的一側(cè))比將突變引入位于蛋白質(zhì)表面上的(3-螺旋中更容易進(jìn)行，因?yàn)樵?3-折疊中交替的殘基以相反的方向背離朝向，且"緊鄰的"的殘基彼此不相互作用或彼此相互干擾。在另一方面，在|3-螺旋中，"緊鄰的"殘基處于螺旋的同一側(cè)或同一面，彼此非常大地互相影響，由于該原因，在不在直接相鄰的殘基中生成伴隨(補(bǔ)償)突變條件下進(jìn)行的甚至單個(gè)突變可以極大地?cái)_亂結(jié)構(gòu)-形成和穩(wěn)定性。我們的情形是突變作用的不可預(yù)知性對(duì)螺旋結(jié)構(gòu)比對(duì)折疊結(jié)構(gòu)更適用得多。我們提出利用關(guān)于所有-P結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)/功能關(guān)系的詳細(xì)理解，在理性設(shè)計(jì)的(3折疊表面上產(chǎn)生突變，從而探究理性方法可以進(jìn)行到什么程度?？梢宰⒁獾剑淮嬖陉P(guān)于這種性質(zhì)的實(shí)例，并且因此沒(méi)有在此引用任何內(nèi)容。'嵌合體'方法和本發(fā)明之間的區(qū)別如己經(jīng)闡述地，我們的目的之一是構(gòu)建具有嗜熱性(熱穩(wěn)定的)類(lèi)似物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性特征和嗜中溫類(lèi)似物作用于相同底物的功能特征的新型蛋白質(zhì)/酶。而且，如己經(jīng)闡述地(在現(xiàn)有技術(shù)和背景中)，先前在該方向(即具有相似的總體目標(biāo))的唯一類(lèi)型的嘗試涉及交換包括連續(xù)殘基序列段的完整結(jié)構(gòu)域，從而產(chǎn)生嵌合的蛋白。在嵌合蛋白中，不存在在任何單獨(dú)的二級(jí)結(jié)構(gòu)或超二級(jí)結(jié)構(gòu)元件(諸如P折疊)水平上重建蛋白表面，而涉及來(lái)自兩種執(zhí)行相似功能的多-結(jié)構(gòu)域蛋白的完全自主-折疊的結(jié)構(gòu)域的混合。在蛋白質(zhì)中，通常，公知結(jié)構(gòu)域之間的相互作用水平總是遠(yuǎn)低于(就涉及的殘基-殘基接觸的數(shù)目而言)結(jié)構(gòu)域中結(jié)構(gòu)元件之間的相互作用水平、或單一二級(jí)或超二級(jí)結(jié)構(gòu)元件中的殘基之間的相互作用水平。實(shí)際上，從結(jié)構(gòu)觀點(diǎn)來(lái)看，兩種自主折疊的結(jié)構(gòu)域通常甚至不直接相互作用，而結(jié)構(gòu)域中二級(jí)和超二級(jí)結(jié)構(gòu)元件中的殘基參與廣泛且親密的相互作用。因此，將來(lái)自不同蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域組合到同一多肽鏈中并設(shè)法保持這兩種結(jié)構(gòu)域中的功能一般是簡(jiǎn)單且微不足道的工作，因?yàn)殛P(guān)于結(jié)構(gòu)域-結(jié)構(gòu)域相互作用的關(guān)注少得多。所述的連續(xù)序列段的簡(jiǎn)單(嵌合體-型)組合不能成功地進(jìn)行重建單-結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)，因?yàn)樵谒銮逗象w中，來(lái)自兩種蛋白質(zhì)的序列將位于表面上和內(nèi)部中。不能迫使來(lái)自在兩種不同蛋白質(zhì)中預(yù)進(jìn)化的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件的殘基在任何蛋白質(zhì)內(nèi)部的兩種結(jié)構(gòu)的交界面處彼此接觸和結(jié)合，因?yàn)榻唤缑娴男纬尚枰叨鹊男螤罨パa(bǔ)性和化學(xué)相容性。簡(jiǎn)單的嵌合體不能避免在它們內(nèi)部的結(jié)構(gòu)-結(jié)構(gòu)交界面處的形狀互補(bǔ)性和化學(xué)不相容性的這種沖突。大概作為這樣的結(jié)果，不存在構(gòu)建包括單結(jié)構(gòu)域蛋白的任何嵌合體的已知成功實(shí)例，在所述單結(jié)構(gòu)域蛋白中，連續(xù)的氨基酸序列段被來(lái)自另一種蛋白質(zhì)的等價(jià)序列段所替代。我們的發(fā)明通過(guò)僅改造表面殘基和僅在基于卩折疊的結(jié)構(gòu)內(nèi)進(jìn)行改造，避免了上述問(wèn)題，并成功地組合了兩種單結(jié)構(gòu)域蛋白的特征。我們的方法成功的原因如下(i)彼此鄰近的表面殘基僅需要在蛋白質(zhì)表面的一個(gè)限定的區(qū)域內(nèi)與溶劑且彼此間相互作用，其中所有殘基來(lái)自于同一蛋白質(zhì)，并且因此具有參與相互作用的預(yù)-進(jìn)化方案，從而構(gòu)建所述表面。與在嵌合體中不同，這些殘基不必須與另一組來(lái)自具有包埋的內(nèi)部位置的不同蛋白質(zhì)的殘基接合，由此消除形狀互補(bǔ)性和化學(xué)不相容性的問(wèn)題。(ii)我們使用結(jié)構(gòu)元件(二級(jí)或超二級(jí)結(jié)構(gòu)元件)的完整表面，諸如例如，(3折疊的完整的溶劑-暴露表面，而不是任何結(jié)構(gòu)元件的一部分表面。這消除了在結(jié)構(gòu)元件表面內(nèi)的形狀互補(bǔ)性和化學(xué)相容性問(wèn)題，并將該問(wèn)題僅限制到所述表面的邊緣，在所述邊緣處其與不同結(jié)構(gòu)元件表面的另一部分接觸，在此處，在任何情形中，由于溶劑暴露，存在更高程度的靈活性和適應(yīng)性。因此，總之，現(xiàn)有技術(shù)中引用的嵌合體方法在以下方面與本發(fā)明提出的方法不同-他們對(duì)相似酶的選擇基于已知序列的酶之間的序列相似性。相反，我們的選擇基于已知結(jié)構(gòu)的酶之間的結(jié)構(gòu)(主鏈)的疊合性。-他們對(duì)提高穩(wěn)定性、最佳溫度和最佳pH的嘗試基于這樣的假設(shè)，即這些特征確定地處于由總序列中的連續(xù)序列段限定的各個(gè)結(jié)構(gòu)域中，沒(méi)有提供支持該假設(shè)的證明，即所述特征確實(shí)是由單獨(dú)的結(jié)構(gòu)域-樣結(jié)構(gòu)限定的。相反，我們的方法不將特性歸咎于連續(xù)的殘基序列段。而是，我們認(rèn)為最佳pH和溫度特征是單獨(dú)構(gòu)成活性表面的溶劑-暴露殘基(通過(guò)鏈折疊三維集合在一起的明確的不連續(xù)殘基組)的相互作用和靈活性的函數(shù)。我們認(rèn)為結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性在很大程度上是構(gòu)成蛋白質(zhì)的疏水性中心的隱蔽殘基的函數(shù)。因此，我們的新型蛋白質(zhì)的構(gòu)建涉及一起位于結(jié)構(gòu)(而非位于序列！)中的不連續(xù)殘基的突變。我們基于結(jié)構(gòu)原則和在文獻(xiàn)中首次說(shuō)明的理解，制造這樣的突變，即通過(guò)同源嗜中溫酶的活性表面僅移植熱穩(wěn)定酶的活性表面。-作為上述方法中基本區(qū)別的結(jié)果，Hayashi和同事(Singh和Hayashi,1995.生物化學(xué)雜志(/腸/.C/zewJ270，21928-21933;Goyal等，2001.分子催化作用B:酶雜志aMo/.Cato/jwi5:五"矽m加'c)16,43-51)以及Danson和同事(Arnott等，2000.分子生物學(xué)雜志aMo/.Ao/.J304，657-668)設(shè)法僅構(gòu)建具有這樣的穩(wěn)定性和功能特征的嵌合體，所述嵌合體是制備所述嵌合體所來(lái)源的兩種酶的序列的中間產(chǎn)物，或以完全不可預(yù)期的方式與兩種親本序列完全不同。相反，我們的方法提出理性和可預(yù)期地混合一種親本的功能特征(即精確的最佳pH和溫度)和另一種親本的穩(wěn)定性特征，從而衍生在很大程度上保持這些特征的蛋白。-在所述嵌合體中，不基于在蛋白質(zhì)的內(nèi)部或蛋白質(zhì)的表面上的殘基位置選擇來(lái)自祖先酶的殘基。這使得該方法僅對(duì)簡(jiǎn)單混合來(lái)自多-結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的編碼結(jié)構(gòu)域的序列有效。相反，我們的方法集中于基于結(jié)構(gòu)選擇溶劑-暴露的殘基。發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供包括嗜熱性蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性特征和嗜中溫蛋白的活性特征的重組中溫活性熱穩(wěn)定蛋白及其合成方法，其中主要不連續(xù)的氨基酸組被結(jié)構(gòu)-同源蛋白的結(jié)構(gòu)等價(jià)部分中存在的不同的不連續(xù)氨基酸組代替。-而且，本發(fā)明提供用于系統(tǒng)改變?nèi)魏沃饕蒔結(jié)構(gòu)構(gòu)成的蛋白質(zhì)的功能表現(xiàn)的方法學(xué)。-本發(fā)明的另一個(gè)目的是將一種蛋白質(zhì)的完整表面或所述表面的一部分取代/移植到具有高度疊合性的主鏈的同源蛋白上。-另一個(gè)目的是將來(lái)自嗜中溫蛋白的活性表面移植到嗜熱性蛋白上，從而生成重組的熱穩(wěn)定蛋白。-另一個(gè)目的是生成表現(xiàn)出嗜熱性蛋白的穩(wěn)定性特征和嗜中溫蛋白的活性特征的重組熱穩(wěn)定蛋白，由此提供用于組合經(jīng)天然進(jìn)化一般不組合的結(jié)構(gòu)和功能屬性的方法學(xué)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及基于(3折疊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并特別集中于檢驗(yàn)蛋白質(zhì)表面可變性的酶。這是通過(guò)將一種蛋白的完整表面取代/移植到重疊主鏈軌跡的同源蛋白表面上(即，完整表面移植)或僅改變參與催化和/或底物/配體結(jié)合的表面區(qū)域(即，活性表面移植)而進(jìn)行的。本發(fā)明還涉及選擇性混合和匹配不連續(xù)的和/或連續(xù)的殘基，從而完成移植包括卩鏈和/或來(lái)自卩折疊結(jié)構(gòu)的中間環(huán)的表面。本發(fā)明還涉及進(jìn)行表面改造，其涉及將嗜熱性功能特征的蛋白轉(zhuǎn)化為嗜中溫功能特征的蛋白，同時(shí)保持嗜熱性蛋白的結(jié)構(gòu)特征。因此，本發(fā)明提供包括嗜熱性蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性特征和嗜中溫蛋白活性特征的重組的中溫活性熱穩(wěn)定蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組中溫活性熱穩(wěn)定蛋白包括具有單結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域的蛋白，其中主要不連續(xù)的氨基酸組被在結(jié)構(gòu)-同源蛋白的結(jié)構(gòu)等價(jià)部分處存在的不同的不連續(xù)氨基酸組代替。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將"客體"或"供體"祖蛋白的一部分或整體理論上移植到"主體"或"受體"祖蛋白的結(jié)構(gòu)核心上。然而，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述客體和主體祖蛋白具有同源結(jié)構(gòu)和相同的功能。然而，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述客體祖蛋白是嗜中溫蛋白，和所述主體祖蛋白是嗜熱性蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述同源客體和主體祖蛋白的功能-活性表面區(qū)域由基于P折疊的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用的嗜熱性主體祖蛋白和嗜中溫客體先祖分別具有由SEQIDNO:l和SEQIDNO:2表示的氨基酸序列，并且重組的中溫活性熱穩(wěn)定蛋白包括由SEQIDNO:3表示的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組中溫活性熱穩(wěn)定蛋白具有下列特征1.分子質(zhì)量20-30千道爾頓；2.殘基數(shù)目約200-300個(gè)；3.等電點(diǎn)在4-8范圍內(nèi)；4.最佳活性pH:在4-8范圍內(nèi)；5.解鏈溫度(Tm):80-95°C，禾口6.最佳活性溫度(T0A):在30-6(TC范圍內(nèi)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白或其先祖是屬于水解酶組的單-結(jié)構(gòu)域卩折疊蛋白的結(jié)構(gòu)類(lèi)的酶，并選自由纖維素酶、木聚糖酶、淀粉酶和蛋白酶組成的組，優(yōu)選地，是纖維素酶。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組中溫活性熱穩(wěn)定蛋白還可以起生物催化劑的作用。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，用于設(shè)計(jì)重組中溫活性熱穩(wěn)定蛋白的方法包括主體祖蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性特征和不同的且結(jié)構(gòu)同源的客體祖蛋白的活性特征。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)構(gòu)-同源的主體和客體祖蛋白包括這樣的結(jié)構(gòu)，在所述結(jié)構(gòu)中由位于基于(3折疊的二級(jí)結(jié)構(gòu)上的殘基提供底物-結(jié)合和催化功能。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用于涉及重組中溫活性熱穩(wěn)定蛋白的方法包括下列步驟a.疊合所述客體和主體祖蛋白的結(jié)構(gòu)，并在多肽主鏈水平上，優(yōu)選地，在包括所述底物-結(jié)合和催化功能的結(jié)構(gòu)區(qū)域中，評(píng)估它們結(jié)構(gòu)的疊合性程度，b.通過(guò)使用步驟(a)的信息，生成所述主體和客體祖蛋白的蛋白序列以及編碼DNA序列的基于結(jié)構(gòu)類(lèi)似的序列對(duì)比，c.鑒定在主體祖蛋白序列中構(gòu)成基于(3折疊的'活性表面'的特定氨基酸殘基，并且使用獲自步驟(b)的對(duì)比序列以在所述客體祖蛋白中鑒定相應(yīng)類(lèi)似的不連續(xù)殘基和殘基組，d.確定在來(lái)自所述主體和客體祖蛋白構(gòu)成所述兩種蛋白的活性表面的兩個(gè)相應(yīng)氨基酸殘基組中相同的特定殘基，并且消除所述相同的殘基，從而獲得在所述兩種蛋白中的結(jié)構(gòu)-等價(jià)位置處存在的一組相應(yīng)的不同殘基，e.在基于(3折疊的'活性表面'中的位置處突變所述主體祖蛋白，所述位置與所述客體祖蛋白的相應(yīng)殘基不同，f.將在所述主體祖蛋白中存在的殘基替換為所述客體祖蛋白中存在的殘基，導(dǎo)致構(gòu)成新型中溫活性熱穩(wěn)定蛋白，g.通過(guò)已知的重組DNA方法生物合成該新型中溫活性熱穩(wěn)定蛋白，隨后通過(guò)已知方法分離和純化，和h.通過(guò)活性測(cè)量證實(shí)在該理想的中溫活性熱穩(wěn)定蛋白中的主體祖蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定特征和客體祖蛋白的物理和化學(xué)活性特征。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，構(gòu)成產(chǎn)物中溫活性熱穩(wěn)定蛋白的結(jié)構(gòu)核心的氨基酸殘基源自所述兩種祖蛋白中的一種，而構(gòu)成該產(chǎn)物蛋白的一部分或完整表面的殘基源自另一種祖蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述兩種祖蛋白是結(jié)構(gòu)同源的，它們的主鏈原子的坐標(biāo)以0.5-2.5埃的均方根偏差(RMSD)疊合。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用的主體和客體祖蛋白中的最佳功能和結(jié)構(gòu)解鏈溫度相差5"C以內(nèi)。然而，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述兩種祖蛋白的結(jié)構(gòu)-同源"活性表面'區(qū)域主要由基于卩折疊的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成。然而，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，使用的客體先祖是SEQIDNO:l的嗜熱性蛋白R(shí)MCell2A，且使用的主體先祖是SEQIDN0:2的嗜中溫蛋白TRCell2A。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，構(gòu)成產(chǎn)物蛋白的結(jié)構(gòu)核心的氨基酸殘基源自RMCdl2A，而構(gòu)成產(chǎn)物蛋白一部分表面的殘基源自TRCell2A。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，RMCell2A和TRCdl2A蛋白是結(jié)構(gòu)同源的，它們的主鏈原子的坐標(biāo)以0.5-2.5埃的均方根偏差(RMSD)疊合。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，RMCell2A禾BTRCell2A蛋白中的最佳功能和結(jié)構(gòu)解鏈溫度相差5°C以內(nèi)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，RMCell2A和TRCdl2A的結(jié)構(gòu)-同源性(活性表面'區(qū)域主要由基于P折疊的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，SEQIDNO:3的產(chǎn)物MTCell2A是通過(guò)將主體先祖活性表面包括的殘基替換為客體先祖活性表面包括的結(jié)構(gòu)-相似殘基，而衍生自主體先祖的。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，獲得的新型中溫活性熱穩(wěn)定(MTCd2A)產(chǎn)物具有嗜中溫客體先祖TRCell2A的最佳活性溫度和同源嗜熱性主體先祖RMCell2A的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述中溫活性熱穩(wěn)定蛋白(MTCel2A)具有下列特征1.分子質(zhì)量20-30千道爾頓；2.殘基數(shù)目約200-300個(gè)；3.等電點(diǎn)在4-8范圍內(nèi)；4.最佳活性pH:在4-8范圍內(nèi)；5.解鏈溫度(Tm):80-95。C，禾口6.最佳活性溫度(Toa):在30-6(TC范圍內(nèi)。然而，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法在不改變所述酶活性的化學(xué)特征或所述底物的化學(xué)限定的條件下，有效調(diào)整酶的物理功能特征。然而，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法有效用于重組來(lái)自兩種非常不同的生命領(lǐng)域的酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和活性特征。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述中溫活性熱穩(wěn)定蛋白有效用于紡織工業(yè)的應(yīng)用中，諸如牛仔布(denimfabrics)的石洗(stone-washing)。附圖和表格簡(jiǎn)述圖1:RMCell2A(紅色)，和TRCell2A(藍(lán)色)之間的結(jié)構(gòu)相似性和相異性。'圖A顯示以1.1A的RMSD疊合的多肽主鏈。注意夾心的上和下折疊，以及由頂部折疊形成的凹溝構(gòu)成纖維素-結(jié)合？舌性表面'。圖B和C，分別地，顯示TRCell2A和RMCell2A表面的頂視圖，強(qiáng)調(diào)19-21A長(zhǎng)的纖維素-結(jié)合溝。注意這兩個(gè)溝的顯微結(jié)構(gòu)特征的相異性。圖2:RM(紅色)、TR(藍(lán)色)、和建模的MT(紅-藍(lán))Cdl2的基于-結(jié)構(gòu)的序列對(duì)比和表面描繪。圖A.綠色框突出由SEQIDNO:l表示的RMCell2A(1H0B)和由SEQIDN0:2表示的TRCell2A(10A2)中的'活性表面'殘基，其為保守的(三行)或不保守的(兩行)。在最上一行的單個(gè)殘基表示在預(yù)測(cè)的和獲得的序列之間的差異，在文獻(xiàn)中報(bào)告的關(guān)于1HOB的所述殘基顯示在我們通過(guò)對(duì)我們的克隆(SEQIDNO:l)測(cè)序獲得所述殘基的上方。在中間一行中提到的序列是MTCdl2A(SEQIDNO:3)的序列。注意來(lái)自卩鏈的交替'活性表面，殘基簇?；说㏑M(紅)、TR(藍(lán))、和建模的MT(紅-藍(lán))Cell2A的表面的側(cè)視圖。對(duì)MTCell2A模型進(jìn)行彩色-編碼，從而指示來(lái)自RM和TR先祖的殘基的不同來(lái)源。圖3:RMCell2A和MTCell2A在pH8.0和pH5.0時(shí)的四級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)。在缺乏(黑線)和存在(紅線)100mMNaCl條件下的洗脫液Superdex-75層析圖，將關(guān)于MTCell2A的顯示在圖A(pH8.0)和凰衛(wèi)(pH5.0)中，并且將關(guān)于RMCell2A的顯示在凰￡(pH8.0)和圖D(pH5.0)中。注意在缺乏鹽的條件下在1.23ml處(單體)的MT和RMCell2A的洗脫，和后來(lái)在存在鹽和低pH的條件下的體積。在存在100mMNaCl條件下在pH8.0(黑線)和pH5.0(紅線)下的酶的遠(yuǎn)-UVCD光譜顯示在圖E(MTCdl2A)和圖F(RMCell2A)中。在缺乏鹽的條件下獲得相同的光譜(未顯示)。圖4:RMCell2A和MTCell2A在pH8.0和pH5.0時(shí)的熱穩(wěn)定性。218nm處的平均殘基橢圓率的溫度-依賴(lài)性變化顯示在圖A(RMCell2A,pH5.0)、圖B(MTCell2A,pH5.0)、圖C(RMCell2A，pH8.0)和圖D(MTCdl2A,pH8.0)中。注意在所有情況下，結(jié)構(gòu)改變僅發(fā)生在85。C以上，且MTCell2A在pH8.0和pH5.0時(shí)的RMCell2A-樣熱穩(wěn)定性。圖5:MTCell2A禾卩RMCell2A的溫度-禾卩pH-依賴(lài)性活性。圖A:作為溫度的函數(shù)，在pH5.0測(cè)量的MTCell2A(空心三角形)和RMCell2A(實(shí)心方塊)的活性變化。作為pH的函數(shù)，在50。C測(cè)量的MTCell2A(空心三角形)禾QRMCell2A(實(shí)心方塊)的活性變化。平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差條各基于5次實(shí)驗(yàn)。注意MTCell2A具有與TRCell2A接近的最佳溫度和pH(本圖)，即使它具有與RMCell2A相當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定性(圖4)。圖6:在不同溫度和pH值處比較RMCell2A和MTCell2A活性。縱坐標(biāo)表示關(guān)于DNSA反應(yīng)的還原糖在550nm處的光學(xué)密度。為了允許更好的視覺(jué)比較，關(guān)于RMCell2A數(shù)據(jù)的刻度(0-8)與關(guān)于MTCell2A的那些(0-1.5)不同地顯示。圖7:比較MTCell2A(3B7M)測(cè)定的結(jié)構(gòu)和RMCell2A(lH0B)與TRCell2A(10A2)的己知結(jié)構(gòu)。圖A:疊合MTCell2A(藍(lán))、RMCell2A(紅)和TRCell2A(綠)的主鏈。由氨基酸極性彩色-編碼的RMCell2A(左上)、TRCell2A(右上)和MTCell2A(中下)的活性表面溝的視圖。1_Q:針對(duì)它們的主鏈(如細(xì)帶表示地)疊合的MTCell2A(綠)和TRCell2A(藍(lán))的活性表面?zhèn)孺?。圖D:與圖C中顯示的相同的活性表面?zhèn)孺湥淮嬖谥麈?為了清楚)。圖E:MTCell2A(綠)、RMCell2A(紅)和TRCell2A(藍(lán))側(cè)視圖的所有-原子表面表示法，顯示MTCdl2A與兩種親本酶的的相似性。圖8:參與(3折疊形成的鏈中的殘基的交替幾何排列，和由來(lái)自折疊中相鄰鏈的側(cè)鏈形成表面。利用軟件PYMOL生成來(lái)自RMCdl2A的三條鏈的圖示。M^:作為卩折疊一部分的鏈中的交替殘基以相反方向背離朝向該折疊的平面。自來(lái)自(3折疊中的相鄰鏈的、以相同方向背離朝向該折疊的側(cè)鏈彼此相鄰。圖C:圖B中顯示的側(cè)鏈的這些原子彼此相互作用。圖D:圖C中顯示的側(cè)鏈的原子充分相互作用，以至于足以形成表面。圖9:RMCell2A和TRCell2A之間結(jié)構(gòu)同源性和構(gòu)成這兩種酶的活性表面的P折疊的視覺(jué)描述。凰^:主鏈的重疊。盡管在RMCell2A和TRCell2A之間僅存在28%的序列同一性，但是其結(jié)構(gòu)高度同源，并可以以l.lA的RMSD疊合。由兩種彎曲的卩折疊組成的蛋白質(zhì)夾入到P薄巻餅型折疊中，纖維素-結(jié)合溝位于上方折疊的凹陷表面中。RMCdl2A主鏈顯示為黃色。其活性表面顯示為青色。TRCell2A主鏈顯示為紅色?；诵l(wèi)RMCdl2A的活性表面。顯示在所述兩種蛋白的疊合主鏈上的是RMCdl2A的活性表面，其由來(lái)自構(gòu)成纖維素-結(jié)合溝的上方P折疊的殘基組成。RMCdl2主鏈顯示為紅色，且TRCell2A為藍(lán)色。凰_￡:TRCell2A的活性表面。顯示在所述兩種蛋白的疊合主鏈上的是TRCdl2A，其由來(lái)自構(gòu)成纖維素-結(jié)合溝的上方P折疊的殘基組成。RMCell2主鏈顯示為紅色，且TRCell2A為藍(lán)色。該嗜中溫活性表面和嗜熱性同系物的活性表面的視覺(jué)比較顯示本工作中試圖進(jìn)行的表面-改造的深度的理論"切除"視圖。圖10:TRCdl2A的"溫度對(duì)比活性"、"pH對(duì)比活性"和"溫度對(duì)比結(jié)構(gòu)含量"特征。圖A禾DB:如Karlsson,J.,Siika-aho，M.,Tenkanen,M.&Tjerneld,F.(2002).生物技術(shù)雜志(/淑ec/z朋/.)99，63-78報(bào)告地，TRCell2A活性隨溫度和pH的變化。M^:如Sandgren,M.,Gualfetti,P丄，Shaw,A.，Gross,L.S.,Saldajeno,M.,Day,A.G.,Jones,T.A.&Mitchinson,C.(2003).歪A質(zhì)棄學(xué)0^o^'"5We"cd12,848-860報(bào)告地，TRCell2ACD信號(hào)(結(jié)構(gòu)含量)隨溫度的變化。本附圖中顯示的圖來(lái)自于以上引用的論文。圖11:RMCell2A和MTCell2A的DNA和蛋白質(zhì)序列。最上一行——MCell2A蛋白序列。第二行——RMCel12ADNA序列。第三行——MTCell2ADNA序列。第四行——MTCell2A蛋白序列。注意僅顯示殘基編號(hào)。未顯示堿基編號(hào)。顯示的殘基編號(hào)是來(lái)自原始參考文獻(xiàn)中真實(shí)序列的那些，忽視缺口。在標(biāo)記物后，RM序列以Met(殘基O起始，其未顯示。圖12:合成編碼RMCelll2A(通過(guò)來(lái)自基因組DNA的PCR)和MTCdl2A(通過(guò)利用誘變引物的SOE-PCR)的基因的示意圖。編號(hào)是分配的引物編號(hào)(見(jiàn)表4)。星號(hào)標(biāo)記表示引物是誘變的。誘變的引物結(jié)合DNA堿基變化，所述變化設(shè)計(jì)為(i)改變RM殘基為結(jié)構(gòu)類(lèi)似的TR殘基，(ii)包括與RM中無(wú)類(lèi)似性的來(lái)自TR的環(huán)，(iii)通過(guò)破壞備選(不理想的)引物-模板締合的可能性進(jìn)行沉默突變，從而最優(yōu)化PCR的可行性，和(iv)進(jìn)行沉默突變，從而破壞二級(jí)結(jié)構(gòu)，認(rèn)為所述二級(jí)結(jié)構(gòu)可能在基因表達(dá)過(guò)程中在mRNA水平影響翻譯效率。注意利用引物1N和12，從海洋紅嗜熱鹽菌(兄man'm^)基因組DNA中擴(kuò)增關(guān)于RMCel12A的基因。利用誘變引物1-11和不包括突變的引物12，通過(guò)剪接編碼RMCdl2A的基因的合適的突變部分構(gòu)建關(guān)于MTCell2A的基因。圖13:顯示來(lái)自PCR和SOE-PCR反應(yīng)的擴(kuò)增的凝膠。凝膠顯示a)通過(guò)PCR從來(lái)自海洋紅嗜熱鹽菌的基因組DNA(反應(yīng)號(hào)l)生成編碼RMCell2A的基因，和b)編碼MTCdl2A的基因的合成中涉及的步驟，其涉及來(lái)自編碼RMCdl2A的基因的區(qū)域的誘變PCR擴(kuò)增和通過(guò)剪接重疊延伸(splicing-by-overlap-extension,SOE)PCR(反應(yīng)號(hào)2-11)裝配所述區(qū)域。圖14:DNA測(cè)序電泳圖驗(yàn)證編碼MTCell2A的基因的正確構(gòu)建。圖15:顯示MTCell2A(圖A&B)和RMCell2A(圖C&D)的非-變性純化的凝膠。圖A:泳道1—沉淀。泳道2—溶胞產(chǎn)物(在10mM咪唑中)。泳道3—流出液。泳道4一洗滌液(在20mM咪唑中)。泳道5—分子量標(biāo)記(從上到下分別為116,66,45,35,25,18.4，14.4kDa)。泳道6-9—洗脫在1M咪唑中的MTCell2A級(jí)分。泳道10-15—洗脫在1M咪唑中的MTCell2A級(jí)分。泳道16—分子量標(biāo)記(從上到下分別為116,66,45,35,25,18.4kDa)?；恕?泳道1—沉淀。泳道2—溶胞產(chǎn)物(在10mM咪唑中)。泳道3—流出液。泳道4一洗滌液(在20mM咪唑中)。泳道5—分子量標(biāo)記(從上到下:分別為116,66,45,35,25,18.4,14.4kDa)。泳道6-9—洗脫在1M咪唑中的MTCell2A級(jí)分?；诵l(wèi)泳道10-15—洗脫在1M咪唑中的MTCell2A餾分。泳道16—分子量標(biāo)記(從上到下分別為116,66,45,35，25,18.4kDa)。圖16:RMCell2A和MTCdl2A的MS特征。利用IgG校準(zhǔn)、以具有>100ppm的精確性的線性模式在ABIVoyagerDE-STRMALDI-TOF質(zhì)譜儀上收集數(shù)據(jù)。RMCell2A的預(yù)測(cè)質(zhì)量是26215.93Da。MTCCell2A的預(yù)測(cè)質(zhì)量是25037.01Da。注意l:觀察到的質(zhì)量在對(duì)這些質(zhì)量預(yù)測(cè)的誤差范圍內(nèi)。注意2:對(duì)于m值m=l,z=2&m=l,z=l&m=2,z=l&m=3觀察至ljm/z峰。圖17:凝膠過(guò)濾校準(zhǔn)和以不同濃度運(yùn)行MTCCdl2A。該附圖顯示MTCdl2A樣品的堆疊的凝膠過(guò)濾洗脫層析圖，每份樣品為5(^1體積，所述樣品是在將蛋白質(zhì)濃度稀釋為插入數(shù)據(jù)中顯示的數(shù)值后上樣的。四種樣品的吸光度值范圍明顯不同，并且因此在標(biāo)準(zhǔn)化后顯示它們堆疊，從而促進(jìn)觀察洗脫體積的變化，如果存在變化的話。利用50mMTrispH8.0平衡樣品和SMARTSuperdex-75柱。觀察到的結(jié)果是MTCell2A的稀釋不引起凝膠過(guò)濾洗脫體積(己知與分子流體力學(xué)體積有關(guān))的任何變化。在稀釋時(shí)，任何締合、或解離的缺乏，以及在以上校準(zhǔn)圖中插入其洗脫體積(1.23ml)，表明MTCell2A是25kDa的穩(wěn)定單體。表1:通過(guò)LSQMAN疊合程序生成的相似殘基對(duì)(具有RMSD數(shù)據(jù))。該表僅顯示存在結(jié)構(gòu)疊合的殘基對(duì)。以上未顯示未疊合的環(huán)。表2:活性表面移植的詳細(xì)信息。該表顯示為RMCell2A和TRCell2A各自的活性表面溝貢獻(xiàn)側(cè)鏈的所有結(jié)構(gòu)-類(lèi)似的殘基對(duì)。構(gòu)成(3鏈的殘基顯示為綠色突出標(biāo)記的格中。在經(jīng)過(guò)移植保守的殘基顯示為黃色。其他殘基來(lái)自于連接鏈的環(huán)，其側(cè)鏈朝向溶劑。重要的注意上表僅列出上方折疊和指向溶劑的表面環(huán)上存在的殘基，而沒(méi)有列出在上方折疊上向下指向下方折疊的殘基。表3:基因片段合成和裝配的序列(PCR和SOE-PCR條件)。表4:用于基因合成的引物序列。表5:序列信息差異表。表6:蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)-生物化學(xué)和物理-化學(xué)性質(zhì)。對(duì)中溫活性熱穩(wěn)定酶(MTCell2A)測(cè)量的性質(zhì)與由文獻(xiàn)已知的嗜中溫(TRCell2A)和嗜熱性(RMCell2A)先祖的性質(zhì)一起顯示在比較表格中。發(fā)明詳述本發(fā)明提供包括嗜熱性蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性特征和嗜中溫蛋白活性特征的重組中溫活性熱穩(wěn)定蛋白及其合成方法，其中包括嗜熱性蛋白表面的底物-結(jié)合和催化-活性區(qū)域的主要不連續(xù)的氨基酸組被結(jié)構(gòu)-同源的嗜中溫蛋白中的結(jié)構(gòu)等價(jià)位置處存在的不同的不連續(xù)氨基酸組代替。我們的發(fā)明提出重建酶"活性表面"。認(rèn)為酶"活性表面"在酶反應(yīng)的任何階段，可以包括所有包括與催化作用直接有關(guān)的活性位點(diǎn)的殘基以及與結(jié)合底物或接觸底物原子有關(guān)的殘基。值得注意的是，即使在與底物-類(lèi)似物結(jié)合的酶的結(jié)構(gòu)在原子水平詳細(xì)已知的情形中，例如通過(guò)X-射線晶體學(xué)技術(shù)已知，人們卻從來(lái)不能確信哪些其他殘基(除在晶體結(jié)構(gòu)中實(shí)際看到與底物接觸的那些外)也在酶處理過(guò)程中與底物接觸，因?yàn)樵S多酶被認(rèn)為在它們結(jié)合和催化循環(huán)過(guò)程中改變構(gòu)象。因此，假定仍然不存在確定知曉任何酶完整活性表面的全部范圍的方法，實(shí)際上，我們應(yīng)該將"活性表面"定義為酶中參與底物-結(jié)合或催化作用的特定的二級(jí)結(jié)構(gòu)(或超二級(jí)結(jié)構(gòu))元件的與溶劑接觸的全部殘基組。因此，例如，如果底物-結(jié)合和催化殘基處于基于卩折疊的結(jié)構(gòu)的溶劑-暴露面，則我們應(yīng)該將指定所述特定(3折疊的完整的溶劑-暴露面為"活性表面"。本發(fā)明提出并且示范用于酶活性表面的"表面重建"或"表面重新改造"的理性方法。所述重建涉及對(duì)兩種具有廣泛疊合的主鏈("廣泛疊合的"定義為具有0.5-2.5埃均方根偏差的主鏈原子疊合性)的結(jié)構(gòu)-同源酶的殘基使用的比較。所述比較一旦完成，隨后用另一種酶的完整活性表面對(duì)一種酶中包括一個(gè)完整活性表面的所有殘基進(jìn)行基于殘基-對(duì)-殘基(residue-by-residue)突變的替換，一一我們稱(chēng)為"表面移植"的方法，因?yàn)槠鋵?dǎo)致活性表面從一種酶有效移植到另一種酶。如果以這樣的方式選擇在它們的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和功能性最佳條件方面不同的兩種酶，則所述"移植"作用導(dǎo)致基于折疊構(gòu)建新型酶生物催化劑，所述酶生物催化劑結(jié)合"主體"酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性特征和"客體"酶的活性特征，所述主體和客體是進(jìn)行結(jié)構(gòu)同源性比較的兩種酶。因此，所述主體和客體酶有效地成為新型酶生物催化劑的祖先酶，因?yàn)榭腕w酶促成新型酶結(jié)構(gòu)的活性表面，且主體酶促成所有其他殘基和主要部分。公知所述活性表面的形成是形成酶的總體三維結(jié)構(gòu)的結(jié)果，即其依賴(lài)于酶的折疊。由于活性位點(diǎn)構(gòu)成活性表面的子集，所以斷定所述活性表面也是由于折疊形成的。然而，重要的是理解通過(guò)折疊僅形成幾乎-正確的三維結(jié)構(gòu)不暗示任意酶的活性位點(diǎn)或"活性表面"的正確形成和功能執(zhí)行。這是因?yàn)榭梢栽诮Y(jié)構(gòu)上充分干擾所述活性位點(diǎn)引起終止執(zhí)行功能，而不以任何可辨別的方式干擾酶的總體結(jié)構(gòu)，正如Tsou和同事關(guān)于通常在整體解折疊前可以觀察到失活作用的許多酶的解折疊和折疊行為所示范地，這提示所述活性位點(diǎn)在構(gòu)象上比其余的分子更靈活(Tsou，1993.科學(xué)(Sc/e"ce)262,380-381;Tsou，1995.祝o//z;^.^cto1253,151-162;Yang和Tsou,1995.生物化學(xué)雜志(所oc/zem</J305，379-384)。因而斷定這對(duì)活性表面也是正確的，即活性表面的形成和功能執(zhí)行也可以表現(xiàn)出脫離展示所述表面的酶的折疊的一些自主性。本發(fā)明提出并示范用于驗(yàn)證和利用所述活性表面脫離酶的總體三維結(jié)構(gòu)的支持支架的自主性的理性方法，這是通過(guò)顯示可以怎樣在酶中通過(guò)由多(主要)不連續(xù)殘基替換實(shí)現(xiàn)的"移植"容易地模擬活性表面而進(jìn)行的。本發(fā)明示范利用具有卩薄巻餅型折疊結(jié)構(gòu)的酶進(jìn)行活性表面移植的可行性；然而，本發(fā)明提出本發(fā)明中開(kāi)發(fā)和公開(kāi)的特殊的理性方法可以用于利用任何兩種結(jié)構(gòu)-同源酶進(jìn)行所述活性表面移植，所述酶使用基于P折疊的活性表面，所述基于(3折疊的活性表面使用以0.5-2.5埃的RMSD疊合的主鏈原子。重建P折疊結(jié)構(gòu)的溶劑-暴露面在基于(3折疊的蛋白，諸如(3薄巻餅型折疊酶中，所述活性表面由卩-折疊形成。我們的發(fā)明的一個(gè)延伸是如果考慮到這樣的事實(shí)，即(3-鏈上交替的殘基以相反方向背離朝向，則可能突變酶的完整的基于(3折疊的表面。那些從折疊內(nèi)指向溶劑的殘基通常形成所述活性表面，而指向內(nèi)部的那些與另一個(gè)折疊的殘基疏水性相互作用，這兩組殘基之間不存在相互作用。因此，我們的情況是從(3折疊中去除朝向溶劑的殘基組并用來(lái)自結(jié)構(gòu)-相似(同源)酶的等價(jià)的朝向溶劑的殘基組替換它們是可行的，即換言之，將一種酶的完整活性表面"理論上移植"到另一種酶上，如我們?cè)诖颂岢龅脑谮啾嗭炐驼郫B酶中，或?qū)嶋H上在任何基于卩折疊的表面中，所述表面提供分別處理隱蔽殘基的機(jī)會(huì)，所述隱蔽殘基主要參與由在蛋白表面上暴露和參與其功能的那些確定酶的總折疊和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。移植可行性的結(jié)構(gòu)分析我們的移植方法僅適用于基于卩折疊的蛋白結(jié)構(gòu)。由于卩折疊中處在延伸構(gòu)象中的肽鍵的反式構(gòu)型，鏈中任意殘基的側(cè)鏈以與其在每一側(cè)的兩個(gè)緊鄰殘基完全相反的方向朝向背離折疊的方向。折疊中的交替殘基組因此以相反方向背離朝向，并對(duì)其側(cè)鏈發(fā)展完全獨(dú)立的包裝流程，這兩面彼此之間具有非常小的任意相互影響范圍。在優(yōu)選的平面折疊中，同一面上的殘基有時(shí)可以太過(guò)遠(yuǎn)離，以至于不能有效相互作用形成表面；因此，在多-折疊結(jié)構(gòu)中，殘基通過(guò)堆疊在一起的折疊獲得剛性構(gòu)象，這容許朝向的側(cè)鏈組之間的相互作用。然而，由長(zhǎng)鏈構(gòu)成的卩折疊很少是完全平面的，大多數(shù)天然是彎曲的。盡管所述彎曲的折疊也可以堆疊(如，例如發(fā)生在Cell2A酶的頂部和底部折疊之間)，但是一組堆疊的折疊中的頂部折疊的凹入、溶劑-暴露面上的殘基潛在地可以相互作用，從而形成自主包裝流程(圖1A-1C)和與所述堆疊中其他折疊有效隔離的表面。這造成選擇性重建頂部折疊的凹面的可能性(圖1A，2B)。我們繼續(xù)對(duì)形成RMCell2A活性表面的頂部折疊進(jìn)行重建，如下文詳述。RMCdl2A和TRCell2A共享約28%的氨基酸序列同一性。兩種結(jié)構(gòu)的詳細(xì)檢驗(yàn)容許鑒定在兩種蛋白質(zhì)中的類(lèi)似殘基位置。關(guān)于每種蛋白質(zhì)中的每對(duì)類(lèi)似殘基，我們鑒定具有參與構(gòu)成或毗鄰纖維素-結(jié)合溝的鏈的主鏈原子的那些，并然后分別將這些指定為具有這樣的側(cè)鏈，所述側(cè)鏈?zhǔn)?a)向上朝向所述溝，(b)向下(離開(kāi)所述溝的方向)朝向下方的P折疊，或(c)落入分隔鏈的環(huán)區(qū)域內(nèi)。然后，從所述列表中除去朝下的殘基，它們是不具有參與溝形成的側(cè)鏈的環(huán)結(jié)構(gòu)中存在的殘基。剩下的殘基，以及在每種蛋白中在其他蛋白質(zhì)中沒(méi)有負(fù)體的某些溝-組成殘基顯示在表2中，其還總結(jié)了關(guān)于哪些殘基位置是保守的，和哪些位置構(gòu)成結(jié)構(gòu)-類(lèi)似的非-相同殘基對(duì)的詳細(xì)信息。在表2中，可以觀察到來(lái)自交替殘基位置的數(shù)組側(cè)鏈存在于單獨(dú)的"框"中，其中這些源自相同的P鏈，盡管構(gòu)成所述表面的殘基是由整個(gè)蛋白質(zhì)序列獲得的(圖2A)?？傊?，可以觀察到由RMCell2A中的總共66個(gè)殘基，和由TRCell2A中的57個(gè)位于結(jié)構(gòu)-類(lèi)似位置處的殘基形成所述溝本身和毗鄰所述溝的上升區(qū)域。僅29個(gè)參與形成TRCell2A活性表面的殘基由RMCell2A中的結(jié)構(gòu)-類(lèi)似負(fù)體的不-相同的組表示。此外，RMCell2A中的兩個(gè)環(huán)，即分別地，12個(gè)殘基(Cys66-Leu77)和4個(gè)殘基(Serl15-Glyl18)，在TRCell2A中被各自3個(gè)殘基的非-結(jié)構(gòu)-同源環(huán)[(Ile67-Gln69)和(Hisl07-ThrlIO)]替換。而且，TRCell2A中與RMCell2A中的Aspl60和Trpl61對(duì)應(yīng)的類(lèi)似位置之間存在殘基插入(Ala153)。因此(見(jiàn)表2)，RMCell2A和TRCell2A活性表面之間的區(qū)別由來(lái)自TRCell2A的總共36個(gè)殘基[29(類(lèi)似的)+3(來(lái)自一個(gè)環(huán))+3(來(lái)自另一個(gè)環(huán))+1(來(lái)自插入)]限定。因此，我們改造的目的是在這36個(gè)位置處用TRCdl2A殘基替換RMCell2A殘基。這兩種酶的序列，以及結(jié)合這36個(gè)殘基變化的重新設(shè)計(jì)的海洋紅嗜熱鹽菌酶的序列顯示在圖2A中，所述重新設(shè)計(jì)的海洋紅嗜熱鹽菌酶命名為"中溫活性熱穩(wěn)定"Cdl2A,或MTCell2A。編碼MTCdl2A的基因的合成是通過(guò)多突變-引入的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)步驟，以及隨后通過(guò)重疊延伸PCR(SOE-PCR)程序由逐步剪接連接所獲得的擴(kuò)增子而完成的?？寺∫?xHisN-末端親和標(biāo)記物的基因構(gòu)建體，過(guò)表達(dá)并且純化，以及類(lèi)似地克隆、過(guò)表達(dá)和純化未修飾的RMCell2A作為對(duì)照，其蛋白質(zhì)量是通過(guò)MALDI-TOF質(zhì)譜法證實(shí)的。合成MTCell2A合成編碼MTCell2A的基因是通過(guò)多突變-引入的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)程序，以及隨后通過(guò)重疊延伸PCR(SOE-PCR)程序由逐步剪接裝配所獲得的擴(kuò)增子而實(shí)現(xiàn)的[見(jiàn)圖12(S0EPCR流程)、表3(SOE裝配詳細(xì)信息)、表4(使用的引物的詳細(xì)信息)、圖13(PCR結(jié)果)、圖14(DNA序列電泳圖)、和表5中的序列的一組差異]?？寺?、過(guò)表達(dá)和純化引入6xHis親和標(biāo)記物的基因構(gòu)建體，以及類(lèi)似地克隆、過(guò)表達(dá)和純化未修飾的海洋紅嗜熱鹽菌Cell2A(RMCell2A)作為對(duì)照分子(圖15)。這兩種蛋白的質(zhì)量是通過(guò)MALDI-TOF質(zhì)譜法證實(shí)的(圖16)。MTCell2A如RMCell2A—樣地折疊通過(guò)在非-變性條件下的相同程序純化的MTCell2A(圖3A)和RMCdl2A(圖3C)在pH8.0的凝膠過(guò)濾色譜法過(guò)程中表現(xiàn)出相同的洗脫體積，這提示單體狀態(tài)。在存在鹽(100mMNaCl)，和pH5.0下，MTCell2A在洗脫中顯示出相同的延遲(圖3A，3B)，這說(shuō)明與柱基質(zhì)相互作用的疏水性殘基簇可能的暴露；在存在鹽，禾BpH5.0下，對(duì)于RMCell2A也觀察到所述延遲的洗脫(圖3C，3D)。以四種不同樣品濃度、三個(gè)十進(jìn)制量級(jí)范圍內(nèi)層析的MTCdl2A，以完全相同的洗脫體積洗脫，這進(jìn)一步證實(shí)其為單體，并在濃度升高時(shí)不經(jīng)歷締合。MTCell2A(圖3E)和RMCell2A(圖3F)的遠(yuǎn)-UV圓二色譜彼此類(lèi)似，并是典型的(^型(P折疊)二級(jí)結(jié)構(gòu)，其在216nm處具有相似信號(hào)強(qiáng)度的特有負(fù)波段最大值。在從酸性轉(zhuǎn)移到堿性pH時(shí)，酶均不經(jīng)歷任何結(jié)構(gòu)改變(圖3E、3F)。RMCell2A光譜在225-235nm區(qū)域內(nèi)顯示出另外的負(fù)波段，該負(fù)波段在MTCell2A光譜中較不明顯，這提示可能存在一些微小的結(jié)構(gòu)差別。MTCell2A從RMCell2A繼承其Tm通過(guò)監(jiān)測(cè)作為25-98'C溫度升高函數(shù)的平均殘基橢圓率(MRE)的減小，評(píng)估MTCell2A和RMCell2A的熱穩(wěn)定性。MTCell2A表現(xiàn)出93'C的Tm，其顯示結(jié)構(gòu)在pH5.0完全解鏈(圖4B)，和在pH8.0不完全解鏈(圖4D)，由此證明其具有與RMCdl2A相似的結(jié)構(gòu)(熱)穩(wěn)定性水平，所述RMCell2A表現(xiàn)出96。C的Tm，其顯示結(jié)構(gòu)在pH8.0近似-完全解鏈(圖4C)，和在pH5.0不完全解鏈(圖4A)。MTCell2A的極端熱穩(wěn)定性明顯歸功于其使其大多數(shù)殘基，即其完整的疏水性核心和其大部分表面，來(lái)源于熱穩(wěn)定的RMCell2A。兩種酶在兩種不同pH值下加熱時(shí)完全解折疊的事實(shí)可能可以闡釋如下。對(duì)于RMCell2A在pH5.0可獲得的高度穩(wěn)定性，MTCell2A在該pH下不能獲得，因?yàn)镸TCell2A具有在pH5.0時(shí)發(fā)展為其最高活性(且大概，因此，最高構(gòu)象靈活的)狀態(tài)的活性表面；該活性表面在pH5.0時(shí)的熱不穩(wěn)定性可能起始繼續(xù)完成的解鏈過(guò)程。相同的論據(jù)可能適用于RMCell2A，其具有在pH7.0時(shí)發(fā)展為最佳活性的活性表面，在pH8.0或pH6.0具有相似的活性，但在pH5.0具有低得多的活性。因此，每種酶似乎更易于在其擁有的活性表面的最佳活性pH(或接近該pH)下熱解鏈。MTCell2A從TRCell2A繼承其T。a如作為恒定pH5.0下溫度的函數(shù)(圖5A);作為恒定溫度5(TC下pH的函數(shù)(圖5B);并且針對(duì)不同pH和溫度的組合(圖6)測(cè)量的由RMCell2A和MTCdl2A對(duì)底物羧基-甲基纖維素(CMC)所顯示的活性，共同表示許多令人感興趣的領(lǐng)悟。第一，(a)與由RMCell2A顯示的90。C的T。a相比，MTCell2A具有顯著降低的55。C的T。a，其接近于已知的由TRCell2A顯示的5CTC的T。a(圖5A)。這證明TRCell2A的活性表面即使在移植到RMCell2A的結(jié)構(gòu)支架上后，仍以其原始性質(zhì)起作用(在MTCell2A中)，其沒(méi)有由具有高出42。C的Tm(即96。C代替54°C;見(jiàn)表6)的支架的適用性引起T。a上移。第二，(b)盡管由MTCell2A顯示的55。C的T。a，其活性對(duì)照溫度曲線圖(圖5A)比關(guān)于TRCell2A已知的相應(yīng)曲線圖(圖IO)顯著更寬。即使在已知由于其結(jié)構(gòu)在54'C解鏈TRCdl2A不顯示活性的高溫下，仍存在顯著的活性保留(例如，在7CTC保留最大活性的70%,和在9(TC保留7-8%的活性)。因此，明顯地，對(duì)在MTCell2A中起作用的輸入的TRCdl2A活性表面賦予另外的穩(wěn)定性，即使該活性表面的T。a在很大程度上保持不變。第三，(c)MTCell2A具有比RMCell2A的低l.O單位的最佳活性pH，即pH6.0代替7.0(圖5B)，這進(jìn)一步確定在MTCell2A中起作用的TRCell2A的自主性并為解釋它們移植能力的原理提供支持。最后，(d)在pH5.0和50°C，MTCell2A顯示出RMCell2A活性的1/5，(圖6)。該值在其它溫度和pH值時(shí)更低，這可能是由于移植的活性表面在其新結(jié)構(gòu)背景中的'脆性'，這可以進(jìn)一步通過(guò)誘變改進(jìn)。盡管如此，在pH5.0和50。C時(shí)，MTCell2A幾乎是RMCell2A活性的1/5的事實(shí)提示從定性和定量的觀點(diǎn)來(lái)看，結(jié)構(gòu)成分的折疊和裝配在新酶中幾乎完全地發(fā)生。這些結(jié)果還證明，與引入的改變的深度相比，改變的支架的任何顯微結(jié)構(gòu)(對(duì)活性的)影響是非常小的。MTCell2A繼承TRCell2A活性表面和RMCell2A支架以及(剩余的)表面我們通過(guò)X-射線晶體學(xué)確定了MTCell2A的結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)保存在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)中，其具有標(biāo)識(shí)碼(PDBID)3B7M。該蛋白質(zhì)結(jié)晶為四聚體。該四聚體的幾何排列是這樣的，即各個(gè)亞基與另外兩個(gè)亞基相互作用。然而，在溶劑中使用的pH和離子強(qiáng)度條件下，作為已經(jīng)提到地，所述分子是單體，在儲(chǔ)存時(shí)也觀察到二聚體群(數(shù)據(jù)未顯示)，這表明結(jié)晶條件可以有利于這種二聚體形式的二聚體的沉積。單體結(jié)構(gòu)的詳細(xì)視圖顯示在圖7的圖A中，其顯示與RMCell2A(紅)禾卩TRCell2A(綠)的已知多肽主鏈結(jié)構(gòu)疊合的確定的MTCdl2A(藍(lán))主鏈結(jié)構(gòu)的帶狀結(jié)構(gòu)草圖。該圖揭示MTCell2A的大多數(shù)主鏈結(jié)構(gòu)與RMCell2A和TRCell2A的相似。在圖7的圖B中，以殘基極性編碼顯示所有三種蛋白質(zhì)的溝的表面視圖，從而證明MTCdl2A的溝與TRCell2A的溝共享特征。在圖7的圖C中，觀察到構(gòu)成與MTCell2A(綠)和TRCel12A(藍(lán))疊合的活性表面的大多數(shù)側(cè)鏈，圖D以稍微放大的形式顯示相同的側(cè)鏈，且沒(méi)有帶狀結(jié)構(gòu)(為了清楚)。直接證明MTCell2A的活性表面與TRCell2A的類(lèi)似，其移植的殘基在這兩種情形中采用相同的幾何排列。在圖7的圖E中，MTCell2A(綠)、RMCell2A(紅)和TRCell2A(藍(lán))的表面的側(cè)視圖均從相同的角度顯示。可以看出，在很大程度上，MTCell2A的表面與RMCell2A共享特征，因?yàn)槠浯蟛糠謿埢推淙勘砻?不包括活性表面溝)源自RMCdl2A。總之，結(jié)構(gòu)的詳細(xì)信息證明盡管引入36個(gè)不連續(xù)突變，MTCell2A采用與RMCell2A非常類(lèi)似的折疊結(jié)構(gòu)，其具有與TRCell2A非常類(lèi)似的表面(除了環(huán)區(qū)域中的一些微小偏差外)。這為本發(fā)明中已經(jīng)提出的實(shí)驗(yàn)觀察提供進(jìn)一步的支持，所述實(shí)驗(yàn)觀察顯示MTCdl2A具有RMCell2A的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和TRCell2A的物理活性特征。推論討論MTCell2A是混合嗜中溫親本的功能性特征和嗜熱性親本的結(jié)構(gòu)特征的新型酶，所述混合通過(guò)從所述嗜中溫獲得不連續(xù)殘基組(構(gòu)成負(fù)責(zé)底物結(jié)合的彎曲(3折疊的溶劑-暴露面)并使用其代替所述嗜熱性中的結(jié)構(gòu)-類(lèi)似殘基組實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)然，提供穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)支架的確在高溫下將移植的活性表面的功能性明顯地增強(qiáng)到顯著的程度，盡管TRCdl2A的原始T。a延續(xù)到MTCell2A中。嘗試的"活性表面移植"的成功證明酶中T。a和Tm的關(guān)聯(lián)不是必須的，并且顯示如何利用蛋白質(zhì)工程來(lái)分開(kāi)并獨(dú)立分類(lèi)酶中的熱穩(wěn)定性和功能性。采用易于結(jié)晶和結(jié)構(gòu)確定的所述徹底重新-改造的酶的顯著折疊和功能不僅證明酶活性表面在其較寬的總體三維結(jié)構(gòu)背景中操作的自主性，還為新型理性方法提供"概念-的-證據(jù)"示范，所述新型理性方法能夠在較寬的酶范圍內(nèi)用于縮短生物體中酶功能性和穩(wěn)定性的天然共同進(jìn)化，其目的是產(chǎn)生具有自然界通常不產(chǎn)生的特征的分子。本發(fā)朋涉及所有卩蛋白的功能行為的改變，其通過(guò)下列步驟進(jìn)行1)鑒定具有不同物理功能特征(例如，酶功能的最佳溫度)和相同化學(xué)功能特征(即，作用在相同底物上)的兩種蛋白質(zhì)，稱(chēng)為A和B。2)確定所需改造轉(zhuǎn)化的性質(zhì)，并且還確定A和B中哪種蛋白質(zhì)被認(rèn)為是"客體"或供體結(jié)構(gòu)，和哪種是"主體"或接納體結(jié)構(gòu)[例如，所述主體蛋白應(yīng)該是需要保持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的蛋白，例如，嗜熱性蛋白，且所述客體蛋白應(yīng)該是需要將其功能行為經(jīng)過(guò)涉及特定殘基改變(如以下步驟3-6中給出地確定)的表面移植引入到所述主體中的蛋白，例如，嗜中溫蛋白]。3)疊合A和B的多肽主鏈。4)鑒定位于A和B中類(lèi)似表面位置處的殘基對(duì)。5)鑒定位于A和B中與底物結(jié)合有關(guān)的類(lèi)似位置處的殘基對(duì)子集。6)確定將要產(chǎn)生的殘基變化的表(包括從鏈和環(huán)區(qū)域中的連續(xù)或不連續(xù)的取代、插入和缺失)。7)構(gòu)建靶多肽氨基酸序列，其是利用合適的誘變引物和來(lái)自主體基因的野生型模板區(qū)域，通過(guò)重疊序列延伸(SOE)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引起的剪接合成的(引入未改變和改變的殘基)，從而生成突變的蛋白。8)DNA測(cè)序以驗(yàn)證正確的基因合成。9)利用親和標(biāo)記物(例如，用于固定金屬親合層析的6xHis標(biāo)記物)克隆、過(guò)表達(dá)和純化突變的和其他形式的酶。10)針對(duì)生物化學(xué)和生物物理特征純化酶。11)利用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法繪制活性對(duì)比溫度曲線圖。12)利用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法繪制活性對(duì)比pH曲線圖。13)遠(yuǎn)-UVCD光譜法確定二級(jí)結(jié)構(gòu)。14)通過(guò)在遠(yuǎn)-UV范圍內(nèi)監(jiān)測(cè)圓二色(CD)信號(hào)獲得熱解鏈曲線圖。15)質(zhì)譜法確定完整酶的分子量。16)凝膠過(guò)濾色譜法確定所述蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)狀態(tài)(即是單體還是多聚體)。17)X-射線結(jié)晶學(xué)確定所述酶的三維結(jié)構(gòu)，并驗(yàn)證是否發(fā)生了預(yù)期的結(jié)構(gòu)變化。下列實(shí)施例通過(guò)例證本發(fā)明的方式給出，并且因此不應(yīng)該將其解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例實(shí)施例l:設(shè)計(jì)中溫活性熱穩(wěn)定(MT)Cell2A我們利用軟件LSQMAN檢查了RMCel12A和TRCel12A之間的結(jié)構(gòu)同源性，從而計(jì)算主鏈的疊合。我們使用相同的軟件量化主鏈疊合性水平(圖l，圖A)，并確定所述主鏈能夠以1.1A的RMSD疊合，盡管這兩種蛋白的表面特征是顯著不同的(圖1，圖B)。疊合的主鏈可以用于確定處于這兩種酶中的類(lèi)似位置處的殘基號(hào)(表l)。使用該信息產(chǎn)生這兩種酶基于結(jié)構(gòu)-類(lèi)似的蛋白質(zhì)(圖2)和DNA(圖11)序列對(duì)比。然后進(jìn)行視覺(jué)檢驗(yàn)RMCdl2A酶的結(jié)構(gòu)，從而鑒定構(gòu)成纖維素-結(jié)合溝和所述溝周?chē)嚓P(guān)區(qū)域的殘基。確定這些位于構(gòu)成所述蛋白的彎曲頂部(3折疊的P鏈和中間環(huán)中。形成彎曲的(3折疊的鏈區(qū)域由分別屬于RMCell2A鏈的位置8-29,53-77，100-140,159-167,200-210的殘基序列段限定。對(duì)于上述RMCdl2A序列段中的每個(gè)殘基，我們確定側(cè)鏈?zhǔn)窍蛏现赶蛏锼?結(jié)合溝中，還是沿著溝的側(cè)面(即，具有與纖維素底物相互作用的可能性)，還是位于沿著溝排列的壁外側(cè)(不具有與底物相互作用的可能性)。這組成構(gòu)成RMCell2A活性表面的殘基子集，其顯示在表2的第一欄中。我們?nèi)缓髾z査了TRCdl2A序列/結(jié)構(gòu)中相應(yīng)的類(lèi)似殘基，從而確定是否對(duì)于RMCell2A中每個(gè)殘基，TRCell2A中的類(lèi)似殘基也參與形成纖維素-結(jié)合表面。我們發(fā)現(xiàn)對(duì)于位于鏈中的所有殘基和對(duì)于位于環(huán)中的大部分殘基，每對(duì)結(jié)構(gòu)-類(lèi)似殘基的兩個(gè)組成部分均具有完全相同的結(jié)構(gòu)排列，即二者均向上指向纖維素-結(jié)合表面(活性表面)或向下指向下方的卩折疊，或指向側(cè)面。因此，鑒定為構(gòu)成RMCell2A活性表面的殘基子集在TRCell2A中具有類(lèi)似物，這顯示在表2的第二欄中。然而，可以注意到，類(lèi)似殘基對(duì)不在所有殘基位置存在。在某些區(qū)域中，環(huán)可能不疊合。因此，殘基取代和插入的最終定義還包括非-類(lèi)似的殘基環(huán)，如表2所示?？梢宰⒁獾剑趦煞N酶中，一些殘基是保守的。在表面移植過(guò)程中不需要對(duì)這些進(jìn)行突變。關(guān)于RMCell2A、MTCell2A、和TRCell2A蛋白質(zhì)序列的基于結(jié)構(gòu)的多序列對(duì)比顯示在圖2，圖A中。<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>實(shí)施例2:MTCell2A結(jié)構(gòu)的建模通過(guò)用TRCdl2A中結(jié)構(gòu)-類(lèi)似殘基的坐標(biāo)在計(jì)算機(jī)芯片上代替RMCell2A殘基的坐標(biāo)首先生成MTCdl2A的坐標(biāo)文件來(lái)生成移植的蛋白(MTCdl2A)的模型。利用AMBER8.0通過(guò)能量最小化去除原子撞擊和鍵角異常(DRMS0.01;使用急劇下降和共軛梯度方法)。該模型以全-原子表面表示，以及RMCell2A和TRCell2A的類(lèi)似表示顯示在圖2B中。實(shí)施例3:基因合成、克隆和DNA測(cè)序我們構(gòu)建兩種編碼天然-存在RMCell2A酶重組形式和重組非-天然-存在中溫活性熱穩(wěn)定酶MTCell2A的基因。用于基因合成的方案，用于PCR和剪接-重疊序列延伸(SOE)PCR的引物和條件，以及合成的基因的全序列和編碼的氨基酸序列的詳細(xì)信息分別在圖11、表3和4和圖12、和圖13中給出。可以注意到基因合成引入(i)BamHI限制位點(diǎn)(其5，末端側(cè)連12個(gè)堿基對(duì)的突出端，以促進(jìn)消化)，該位點(diǎn)在編碼RMCell2A和MTCdl2A的基因中均緊接在編碼起始N-端殘基(蘇氨酸)的密碼子之前，(ii)終止密碼子，其在編碼最后的C-端殘基(谷氨酰胺)之后，和(iii)HindIII限制位點(diǎn)(其3，末端側(cè)連12個(gè)堿基對(duì)的突出端，以促進(jìn)消化)，其緊接在終止密碼子之后。消化BamHI和HindIII限制位點(diǎn)，從而容許將基因插入和連接進(jìn)入pQE-30(Qiagen)載體。除選擇標(biāo)記(氨芐青霉素抗性)夕卜，所述載體提供可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、翻譯起始位點(diǎn)、禾BN-端親合標(biāo)記物(N-MRGSHHHHHGS-C)。載體中用于編碼所述標(biāo)記物最后兩個(gè)殘基，即G和S的堿基一起構(gòu)成BamHI位點(diǎn)，這容許插入合成的基因。所述載體還在HindIII位點(diǎn)后提供終止密碼子，但是我們優(yōu)選使用在HindIII位點(diǎn)前、緊隨C-端谷氨酰胺之后的終止密碼子，如已經(jīng)提及地。將連接的載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入攜帶基因型fe汲17^cAl/acF，braAB+/acIq/acZA15TnlO(tef)]的感受態(tài)大腸桿菌(￡.co")XL-1blue細(xì)胞中。在含有四環(huán)素和氨芐青霉素的LB平板上進(jìn)行克隆的選擇。使用應(yīng)用生物系統(tǒng)DNA測(cè)序儀(3130XL測(cè)序儀)進(jìn)行克隆的自動(dòng)化DNA測(cè)序。利用ABIMiniPrep試劑盒，從XL-1blue細(xì)胞中純化質(zhì)粒。使用具有序列5'-CGGATAACAATTTCACACAG-3，的載體-特異性正向引物，或具有序列5'-GTTCTGAGGTCATTACTGG-3'的載體-特異性反向弓I物進(jìn)行熱-(循環(huán))-測(cè)序反應(yīng)，所述正向引物用于通讀編碼所述蛋白N-末端的基因區(qū)域，所述反向引物用于通讀編碼所述蛋白C-末端的區(qū)域。反應(yīng)使用ABI現(xiàn)成反應(yīng)混合物(大染料終止子v3.1循環(huán)測(cè)序RR-IOO(BigDyeTerminatorv3.1cyclesequencingRR-100))，所述混合物在96。C變性(5分鐘)，隨后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的96。C變性(l分鐘)，5(TC退火(l分鐘)，和60。C延伸(2分鐘)。在上樣到分析器上之前，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)程序結(jié)合使用EDTA和乙醇的洗滌進(jìn)行反應(yīng)-后的清理，。顯示編碼MTCell2A的基因的序列的電泳圖提供在圖14中。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>硫酸銨。在65"C加熱重新溶解在檸檬酸鹽緩沖液中的蛋白質(zhì)15-30分鐘，從而加熱-變性和加熱-沉淀裂解物中除存在的酶，即RMCell2A或MTCdl2A(依賴(lài)于純化這些蛋白的哪一種)之外的所有細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)蛋白。隨后進(jìn)行離心，去除熱-沉淀的蛋白，將純RMCell2A或MTCell2A保留在上清液中，其可作為考馬斯-染色的SDS-PAGE中單一條帶辨別。實(shí)施例5:質(zhì)譜法在VoyagerDE-STRMALDI-TO質(zhì)譜儀上對(duì)純化的RMCdl2A和MTCell2A進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。獲得的質(zhì)量值充分落入確定這些質(zhì)量范圍的質(zhì)量精確性中預(yù)期的誤差范圍內(nèi)。圖16的圖例中提供了進(jìn)一步的詳細(xì)信息。實(shí)施例6:遠(yuǎn)-UVCD光譜法為了波長(zhǎng)掃描和溫度(結(jié)構(gòu)解鏈)掃描，使用0.1-0.3mg/ml范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)濃度，使用徑長(zhǎng)為0.1或0.2cm的杯子，和250-195nm范圍內(nèi)的掃描原始橢圓率(e)值，以6-9升/分鐘的N2氣流速，在JascoJ-810分光偏振計(jì)上，進(jìn)行CD光譜測(cè)量。對(duì)于在固定波長(zhǎng)(218nm)處的pH-依賴(lài)性溫度掃描，考慮到218nm處25"C的e值對(duì)應(yīng)于完全折疊的狀態(tài)，且為零的e值對(duì)應(yīng)于完全未折疊狀態(tài)，將原始觀察到的橢圓率值轉(zhuǎn)換為部分解折疊值。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)波長(zhǎng)掃描，利用公式={0。bsx100x平均殘基重量)/{濃度(mg/ml)x徑長(zhǎng)(cm"，將原始9轉(zhuǎn)換為平均殘基橢圓率值。CD結(jié)果提供在圖3和4中。實(shí)施例7:凝膠過(guò)濾色譜法使用與SMART色譜工作站(法瑪西亞(Pharmacia))連接的、預(yù)校準(zhǔn)和適當(dāng)預(yù)平衡的微-分析Superdex-75凝膠過(guò)濾柱(床體積2.4ml)，在存在不同濃度的鹽，和使用不同蛋白濃度條件下，檢查處于pH5.0或pH8.0緩沖液中正常條件下的RMCdl2A和MTCell2A的流體力學(xué)體積和洗脫行為。校準(zhǔn)數(shù)據(jù)顯示在圖17圖A中，且顯示MTCell2A缺乏任何解離的對(duì)照(進(jìn)一步支持單體狀態(tài))顯示在圖17圖B中。實(shí)施例8:內(nèi)切葡聚糖酶活性測(cè)定通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的基于DNS-終止的方法(Miller等，1960.分析生物化學(xué)U"a/.腸c/z艮)2,127陽(yáng)132)測(cè)定MTCdl2A和RMCell2A的酶活性。對(duì)于在多種溫度(具有固定的pH)，或在多種pH值(具有固定的溫度)下進(jìn)行總酶活性測(cè)量，使用以下詳述的條件。蘊(yùn)度占箱(圖5A)—為了在各種溫度下溫育，我們使用處在pH5.0的檸檬酸鹽緩沖液中的最終MTCell2A濃度0.1mg/ml和NaCl濃度100mM(終濃度35mM)。對(duì)每次實(shí)驗(yàn)，用水使反應(yīng)體積達(dá)到lml，并向其中加入lml1.8%的CMC(羧甲基纖維素)，并溫育該溶液1小時(shí)。對(duì)每種溫度進(jìn)行總共5次這樣的實(shí)驗(yàn)。關(guān)于RMCell2A，我們使用處在pH5.0的檸檬酸鹽緩沖液中的最終酶濃度0.04mg/ml和NaCl濃度100mM(終濃度35mM)。類(lèi)似地使反應(yīng)體積達(dá)到lml，并向其中加入lmll.8MCMC，并溫育該溶液20分鐘。對(duì)每種溫度進(jìn)行總共5次這樣的實(shí)驗(yàn)。在下列溫度下溫育各容納2ml的不同管10,20,30,40,50,60,70,80,禾卩90。C。還在100。C對(duì)RMCell2A進(jìn)行測(cè)量。溫育后，將3mlDNS(二硝基水楊酸)試劑加入到每個(gè)管中，并將所述管煮沸15分鐘，從而通過(guò)DNS與由纖維素酶對(duì)CMC底物的作用釋放的還原糖反應(yīng)而產(chǎn)生顏色。也在沒(méi)有酶的條件下溫育對(duì)照反應(yīng)。通過(guò)550nm的吸光度測(cè)量評(píng)估顏色的形成，并減去關(guān)于對(duì)照的值(~0.03)。還使用葡萄糖進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)圖，以評(píng)估還原糖一一但沒(méi)有報(bào)告這些，因?yàn)槭鼙O(jiān)測(cè)的相關(guān)參數(shù)具有相對(duì)活性。認(rèn)為獲得的最高活性是100%，且將剩余的活性轉(zhuǎn)換為觀察到的最大活性的百分比數(shù)值。p/7/i/箱(圖5B)—為了在各種pH下溫育，我們使用處在適當(dāng)緩沖液中的最終MTCell2A濃度0.1mg/ml和NaCl濃度100mM(最終濃度35mM)。使反應(yīng)體積達(dá)到lml，并向其中加入lml1.8%CMC，并在50。C溫育該溶液1小時(shí)。對(duì)每種pH進(jìn)行總共5次這樣的實(shí)驗(yàn)。關(guān)于RMCdl2A，我們使用處在適當(dāng)緩沖液中的最終酶濃度0.01mg/ml和NaCl濃度100mM(終濃度35mM)，使其達(dá)到lml，并向其中加入lml1.8%CMC，并在5(TC培養(yǎng)該溶液20分鐘。對(duì)每種pH進(jìn)行總共5次這樣的實(shí)驗(yàn)。不同的管容納2ml處于下列pH值范圍內(nèi)的各種以上混合物3,4,5,6，7,8,9,和10。對(duì)于3.0-6.0范圍內(nèi)的pH，使用檸檬酸鹽緩沖液。對(duì)于pH7.0-9.0，使用tris緩沖液。對(duì)于pH10.0，使用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液。嚴(yán)格按照關(guān)于以上的溫度掃描，進(jìn)行利用DNS的顏色形成反應(yīng)。認(rèn)為獲得的最高活性是100%，且將剩余的活性轉(zhuǎn)換為觀察到的最大活性的百分比數(shù)值。在賴(lài)/^條斧7^r夢(mèng)iMCW7"CW7Z4游薪絲(圖6)—為了比較，在以下絕對(duì)相同的條件下對(duì)RMCell2A和MTCell2A進(jìn)行活性測(cè)定在45mM檸檬酸鹽緩沖液(用于在pH5.0比較)或45mMtris緩沖液(用于在pH8.0比較)中，在存在100mMNaCl的條件下，使用相同最終濃度(O.lmg/ml)的兩種酶，使其達(dá)到lml，并加入到1.0ml1.8%CMC中，以形成總體積2ml。在兩種不同溫度，即5(TC和9(TC，在這兩種pH下，使用這兩種酶一式三份地進(jìn)行溫育1小時(shí)。嚴(yán)格按照關(guān)于以上的溫度和pH掃描，進(jìn)行利用DNS的顏色形成反應(yīng)。實(shí)施例9:蛋白質(zhì)參數(shù)腹Cell2A。長(zhǎng)度:236個(gè)殘基(包括具有序列N-MRGSHHHHHHGS-C的12個(gè)殘基長(zhǎng)的N-端親合標(biāo)記物)。分7量26215.93Da。游H教G卵"mA280nm處的92940.1O.D等價(jià)于0.28mg/ml。5.53。MTCell2A。長(zhǎng)度:227個(gè)殘基(包括具有序列N-MRGSHHHHHHGS-C的12個(gè)殘基長(zhǎng)的N-端親合標(biāo)記物)。分f量25037.01Da。a50"mA280nm處的56,000.1O.D等價(jià)于0.45mg/ml。箏培點(diǎn)(>/;>:5.39。表6TRCell2A脂Cell2AMTCell2A殘基數(shù)*218225+215分子質(zhì)量#23512Da26216Da+25037Da等電點(diǎn)5.565.535.59最佳活性pH5.07.06.0Tm54。C96°C93DCT50。C90°C55°CT。g28。C65°C不適用排除在RMCell2A和MTCell2A上存在的N-MRGSHHHHHHGS-C標(biāo)記物的長(zhǎng)度。#包括在RMCell2A和MTCell2A上存在的N-MRGSHHHHHHGS-C標(biāo)記物的質(zhì)量。+我們的RMCell2A克隆在所述標(biāo)記物后僅具有224個(gè)殘基，因?yàn)槲覀內(nèi)コ薔-端的甲硫氨酸。@關(guān)于TRCell2A和RMCell2A的詳細(xì)信息來(lái)自公開(kāi)的文獻(xiàn)，或我們的數(shù)據(jù)。TRCdl2A的詳細(xì)信息來(lái)自Sandgren等，2003.歪A質(zhì)棄學(xué)OVoto'"5We"ce912,848-860;Simmons,1977，第二屆國(guó)際真菌大會(huì)(&co"dMyco/.Owg"^入坦帕，美國(guó)佛羅里達(dá)，第618頁(yè)；Karlsson等，2002.生物技術(shù)雜志Q5/o&c/7"o/."9,63-78。RMCell2A的詳細(xì)信息來(lái)自Crennel等.2002.分子生物學(xué)雜志(JMo/.Ao/.力20,883-897;Bjornsdottir等，2006.嗜極端生物(Extremophiles)10,1-16;Hallorsdottir等，199&應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)U///.Mz'cra&o/.所Wec/wo/J49,277-284。實(shí)施例10:結(jié)構(gòu)鑒定利用懸滴蒸汽擴(kuò)散法，在下列條件下，使用約10mg/ml的起始蛋白濃度使蛋白結(jié)晶0.2MNaH2PO4.H2O，20%PEG3350，pH4.5。晶體在20°C，2-3天后，生長(zhǎng)為尺寸0.5x0.4x0.8mm。利用旋轉(zhuǎn)式陽(yáng)極X-射線發(fā)生器(RigakuUltraX,日本)和圖像板檢測(cè)器(MAR研究(MARresearch),德國(guó))收集數(shù)據(jù)。晶體衍射到2.3A分辨率。利用程序的HKL組簡(jiǎn)化和測(cè)量數(shù)據(jù)(Denzo和Scalepack)。利用RMCell2A作為模型，和如在CCP4中執(zhí)行的MOLREP程序，通過(guò)分子替換法確定結(jié)構(gòu)。利用CNS和CCP4進(jìn)行細(xì)化。通過(guò)利用Coot程序計(jì)算傅里葉和差別傅里葉圖譜，在繪圖工作站上檢查所述模型。利用PROCHECK和WHATCHECK程序驗(yàn)證所述模型，從而檢查任何誤差。將模型和結(jié)構(gòu)因子存放在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中(PDBIDNo.3B7M)。優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明闡明的設(shè)計(jì)原理促進(jìn)將基于(3折疊結(jié)構(gòu)的任何活性表面從任何蛋白質(zhì)/酶"移植"結(jié)構(gòu)-同源的蛋白質(zhì)/酶中，所述移植不管序列同一性水平，但以嚴(yán)格依賴(lài)于供體(客體)和接納體(主體)酶主鏈、特別是在移植涉及的兩種酶類(lèi)似區(qū)域內(nèi)的疊合能力水平的方式進(jìn)行。酶活性表面的成功移植，如通過(guò)本發(fā)明所述示范地，揭示酶活性表面是能夠主要不依賴(lài)其主體酶的支持結(jié)構(gòu)支架的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性起作用的酶顯微結(jié)構(gòu)和功能的自主單位，這是因?yàn)樵谒兄С只钚员砻婀δ艿臈l件下保持所述主體結(jié)構(gòu)；同樣地，該發(fā)現(xiàn)(和相關(guān)方法)容許研究者重組來(lái)自兩種非常不同的生命領(lǐng)域的酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)活性特征，如本發(fā)明中所示。本發(fā)明示范調(diào)整酶物理功能特征，諸如例如其最佳活性溫度的嚴(yán)格理性方法的第一個(gè)用途。本發(fā)明證明酶活性位點(diǎn)功能特征的差別顯著歸功于與底物分子結(jié)合的表面的特征(結(jié)構(gòu)/穩(wěn)定性/靈活性/化學(xué))的不同，而非僅歸功于直接參與催化作用的殘基。盡管，本發(fā)明示范了使用P折疊結(jié)構(gòu)的原理，但是通過(guò)仔細(xì)的結(jié)構(gòu)分析可以將該概念和方法外推至移植還包括螺旋和其他結(jié)構(gòu)的表面。盡管，本發(fā)明示范包括對(duì)小分子底物結(jié)合和催化作用的活性表面的移植，但是可將該概念和方法外推至不包括任何催化化學(xué)活性的蛋白-蛋白和蛋白-小分子相互作用。盡管，本發(fā)明示范僅移植酶表面的一部分，但是，可以將該概念和方法外推至酶之間、或非-酶蛋白質(zhì)之間的完整-表面移植，從而以自然界中一般不采用的方式，組合一種酶的核心的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性特征和另一種同源酶的表面特征和功能性。權(quán)利要求1.重組中溫活性熱穩(wěn)定蛋白，其包括嗜熱性蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性特征和嗜中溫蛋白的活性特征。2.按照權(quán)利要求1的重組中溫活性熱穩(wěn)定蛋白，包括具有單結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，其中主要不連續(xù)的氨基酸組被結(jié)構(gòu)-同源蛋白中結(jié)構(gòu)等價(jià)位置處存在的不同的不連續(xù)氨基酸組替換。3.按照權(quán)利要求1和2的重組中溫活性熱穩(wěn)定蛋白，其中"客體"或"供體"祖蛋白的一部分或完整表面有效地移植到"主體"或"接納體"祖蛋白的結(jié)構(gòu)核心上。4.按照權(quán)利要求l-3的重組中溫活性熱穩(wěn)定蛋白，其中所述客體和主體祖蛋白具有同源的結(jié)構(gòu)和相同的功能。5.按照權(quán)利要求l-4的重組中溫活性熱穩(wěn)定蛋白，其中所述客體祖蛋白是嗜中溫蛋白，且所述主體祖蛋白是嗜熱性蛋白。6.按照權(quán)利要求l-5的重組中溫活性熱穩(wěn)定蛋白，其中所述同源的客體和主體祖蛋白的功能-活性表面區(qū)域由基于(3折疊的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成。7.按照權(quán)利要求l-6的重組中溫活性熱穩(wěn)定蛋白，其中使用的嗜熱性主體祖蛋白和嗜中溫客體先祖具有分別由SEQIDNO:l和SEQIDNO:2表示的氨基酸序列。8.按照權(quán)利要求1-7的重組中溫活性熱穩(wěn)定蛋白，其包括由SEQIDNO:3表示的氨基酸序列，其具有由SEQIDNO:l表示的主體蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性特征(熱-穩(wěn)定性)和由SEQIDNO:2表示的客體蛋白的活性特征(中溫-活性)。9.按照權(quán)利要求l-8的重組中溫活性熱穩(wěn)定蛋白，其具有下列特征i.分子質(zhì)量20-30千道爾頓；ii.殘基數(shù)目約200-300個(gè)；iii.等電點(diǎn)在4-8范圍內(nèi)；iv.最佳活性pH:在4-8范圍內(nèi)；v.由解鏈溫度(Tm)定義的熱穩(wěn)定性80-95°C，和Vi.由最佳活性溫度(ToA)定義的中溫-活性在30-6(TC范圍內(nèi)。10.按照權(quán)利要求1-9的重組中溫活性熱穩(wěn)定蛋白，其中所述蛋白及其先祖是屬于水解酶組的單-結(jié)構(gòu)域卩折疊蛋白結(jié)構(gòu)類(lèi)的酶，并且選自由纖維素酶、木聚糖酶、淀粉酶和蛋白酶組成的組，優(yōu)選地為纖維素酶。11.按照權(quán)利要求1的重組中溫活性熱穩(wěn)定蛋白，其還可以起生物催化劑的作用。12.用于設(shè)計(jì)包括主體祖蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性特征和不同的且結(jié)構(gòu)同源的客體祖蛋白的活性特征的重組中溫活性熱穩(wěn)定蛋白的方法。13.按照權(quán)利要求12的用于設(shè)計(jì)重組中溫活性熱穩(wěn)定蛋白的方法，其中所述結(jié)構(gòu)-同源的主體和客體祖蛋白包括這樣的結(jié)構(gòu)，在所述結(jié)構(gòu)中，由位于基于P折疊的二級(jí)結(jié)構(gòu)中的殘基提供底物-結(jié)合和催化功能。14.用于設(shè)計(jì)重組中溫活性熱穩(wěn)定蛋白的方法，所述方法包括下列步驟a.疊合所述客體和主體祖蛋白的結(jié)構(gòu)，并在多肽主鏈水平上，優(yōu)選地，在包括底物-結(jié)合和催化功能的結(jié)構(gòu)區(qū)域中，評(píng)估它們結(jié)構(gòu)的疊合性程度，b.通過(guò)使用步驟(a)的信息，生成所述主體和客體祖蛋白的蛋白序列以及編碼DNA序列的基于結(jié)構(gòu)類(lèi)似的序列對(duì)比，c.鑒定在主體祖蛋白序列中構(gòu)成基于卩折疊的'活性表面'的特定氨基酸殘基，并且使用獲自步驟(b)的對(duì)比序列以在所述客體祖蛋白中鑒定相應(yīng)類(lèi)似的不連續(xù)殘基和殘基組，d.確定在來(lái)自所述主體和客體祖蛋白構(gòu)成所述兩種蛋白的活性表面的兩個(gè)相應(yīng)氨基酸殘基組中相同的特定殘基，并且消除所述相同的殘基，從而獲得在所述兩種蛋白中的結(jié)構(gòu)-等價(jià)位置處存在的一組相應(yīng)的不同殘基，'e.將所述主體祖蛋白的^活性表面'中與所述客體祖蛋白中相應(yīng)的殘基不相同的殘基替換為后者蛋白中的殘基，由此構(gòu)成新型中溫活性熱穩(wěn)定蛋白，f.通過(guò)已知的重組DNA方法，生物合成所述新型中溫活性熱穩(wěn)定蛋白，隨后通過(guò)已知方法分離和純化蛋白，和g.通過(guò)活性測(cè)量，證實(shí)在理想的中溫活性熱穩(wěn)定蛋白中的所述主體祖蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性特征和所述客體祖蛋白的物理和化學(xué)活性特征。15.按照權(quán)利要求12-14的方法，其中構(gòu)成所述產(chǎn)物中溫活性熱穩(wěn)定蛋白的結(jié)構(gòu)核心的氨基酸殘基源自所述兩種祖蛋白中的一種，而構(gòu)成所述產(chǎn)物蛋白的一部分或完整表面的殘基源自另一種祖蛋白。16.按照權(quán)利要求12-15的方法，其中所述兩種祖蛋白是結(jié)構(gòu)同源的，它們的主鏈原子的坐標(biāo)以0.5-2.5埃的均方根偏差(RMSD)疊合。17.按照權(quán)利要求12-16的方法，其中所述主體和客體祖蛋白二者中的最佳功能溫度和結(jié)構(gòu)解鏈溫度相差5r以內(nèi)。18.按照權(quán)利要求12-17的方法，其中所述兩種祖蛋白的結(jié)構(gòu)-同源'活性表面'區(qū)域主要由基于(3折疊的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成。19.按照權(quán)利要求12-18的方法，其中使用的客體先祖是SEQIDNO:l的嗜熱性蛋白R(shí)MCell2A。20.按照權(quán)利要求12-19的方法，其中使用的主體先祖是SEQIDNO:2的嗜中溫蛋白TRCell2A。21.按照權(quán)利要求12-20的方法，其中構(gòu)成所述產(chǎn)物蛋白的結(jié)構(gòu)核心的氨基酸序列源自RMCell2A，而構(gòu)成所述產(chǎn)物蛋白一部分表面的殘基源自TRCell2A。22.按照權(quán)利要求12-21的方法，其中所述RMCell2A和TRCell2A蛋白是結(jié)構(gòu)同源的，它們的主鏈原子的坐標(biāo)以0.5-2.5埃的均方根偏差(RMSD)疊合。23.按照權(quán)利要求12-22的方法，其中RMCell2A和TRCell2A二者中的最佳功能溫度和結(jié)構(gòu)解鏈溫度相差5。C以內(nèi)。24.按照權(quán)利要求12-23的方法，其中RMCell2A和TRCell2A的結(jié)構(gòu)-同源"活性表面'區(qū)域主要由基于P折疊的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成。25.按照權(quán)利要求12-24的方法，其中所述SEQIDNO:3的產(chǎn)物MTCell2A是通過(guò)將所述主體先袓活性表面包括的殘基替換為所述客體先祖活性表面包括的結(jié)構(gòu)-相似的殘基，而來(lái)源于所述主體先祖。26.按照權(quán)利要求12-25的方法，其中獲得的新型中溫活性熱穩(wěn)定(MTCel2A)產(chǎn)物具有所述嗜中溫客體先祖TRCell2A的最佳活性溫度和所述同源嗜熱性主體先祖RMCell2A的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。27.按照權(quán)利要求12-26的方法，其中所述中溫活性熱穩(wěn)定蛋白(MTCel2A)具有下列特征i.分子質(zhì)量20-30千道爾頓；ii.殘基數(shù)目約200-300個(gè)；iii.等電點(diǎn)在4-8范圍內(nèi)；iv.最佳活性pH:在4-8范圍內(nèi)；v.由解鏈溫度(Tm)定義的熱穩(wěn)定性80-95°C，禾口vi.由最佳活性溫度(T0A)定義的中溫-活性在30-6(TC范圍內(nèi)。28.按照權(quán)利要求12-18的方法，其有效用于在不改變所述酶活性的化學(xué)特征或底物的化學(xué)限定的條件下調(diào)整酶的物理功能特征。29.按照權(quán)利要求12-19的方法，其有效用于重組來(lái)自兩種非常不同的生命領(lǐng)域的酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與蛋白穩(wěn)定性和活性特征。30.按照權(quán)利要求12-19的方法，其中所述中溫活性熱穩(wěn)定蛋白有效用于紡織工業(yè)的應(yīng)用中，諸如牛仔布的石洗。全文摘要本發(fā)明涉及檢驗(yàn)基于β折疊的蛋白結(jié)構(gòu)的一部分或完整表面的可變性，特別集中于酶。所述改變是通過(guò)將一種蛋白的一部分或完整表面取代/移植到可疊合多肽主鏈的同源蛋白表面上，通過(guò)使用β折疊的結(jié)構(gòu)特征僅改變參與底物/配體結(jié)合和催化作用的表面區(qū)域進(jìn)行的。所述移植涉及將選擇的構(gòu)成一種酶/蛋白中待改變的表面區(qū)域的不連續(xù)殘基組替換為位于另一種酶/蛋白中類(lèi)似位置處的不連續(xù)殘基組，這是以促進(jìn)通過(guò)組合來(lái)自這兩種酶/蛋白的殘基形成的新蛋白的折疊和功能的方式進(jìn)行的。本發(fā)明還涉及利用該表面改造方法來(lái)選擇性組合來(lái)自不同生命領(lǐng)域的酶/蛋白特征，所述特征一般不通過(guò)天然進(jìn)化組合，諸如構(gòu)建這樣的新蛋白，所述新蛋白保留在其上移植了嗜中溫同系物的活性表面的嗜熱性酶的大部分熱穩(wěn)定支架，以構(gòu)建具有最佳功能pH和溫度的中溫活性功能特征的熱穩(wěn)定蛋白。文檔編號(hào)C12N9/42GK101568551SQ200780048162公開(kāi)日2009年10月28日申請(qǐng)日期2007年11月6日優(yōu)先權(quán)日2006年11月6日發(fā)明者卡蒂肯揚(yáng)·蘇布拉馬尼亞恩,巴爾溫德?tīng)枴ば粮?斯瓦蒂·夏爾馬,普馬南達(dá)·古普塔薩瑪,桑吉夫·庫(kù)馬·錢(qián)德拉揚(yáng),舒伯爾·阿赫邁德,迪維亞·卡普爾,馬尼施·達(dá)塔申請(qǐng)人:科學(xué)與工業(yè)研究委員會(huì)