專利名稱：：用于結(jié)合鞘氨醇-1-磷酸的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及結(jié)合鞘氨醇-l-磷酸(S1P)的制劑，尤其涉及在生理條件下對S1P具有特異反應(yīng)性的人源化單克隆抗體、抗體片段、以及抗體衍生物。通過遞送包含上述制劑的藥物組合物，可利用上述制劑來治療和/或預(yù)防各種疾病或病癥。以下描述包括可能有利于理解本發(fā)明的信息。但這并不是承認，本文中提供的任何信息、或本文中具體或間接提及的任何出版物是現(xiàn)有技術(shù)，或甚至明顯與目前要求保護的發(fā)明有關(guān)。
背景技術(shù)：
：生物活性信號脂質(zhì)脂質(zhì)和它們的衍生物現(xiàn)在被認為是用于醫(yī)學(xué)研究的重要的靶標，而不<義<又是細月包力莫中的簡單的結(jié)構(gòu)元件或作為用于(3-氧化作用、糖酵解作用或其它代謝過程的能量來源。尤其是，某些生物活性脂質(zhì)在動物和人疾病中作為重要的信號介質(zhì)。雖然質(zhì)"莫的大部分脂質(zhì)僅僅起到結(jié)構(gòu)的作用，但它們的小部分的與將胞外刺激傳遞到細胞內(nèi)有關(guān)。"脂質(zhì)信號"是指許多利用細胞膜脂作為第二信使的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的任何一種，以及是指脂質(zhì)信號分子與其本身的特異性受體的直接相互作用。脂質(zhì)信號通路由各種胞外刺激(從生長因子到炎性細胞因子)激活，并且調(diào)節(jié)細胞命運決定，如凋亡、分化以及增殖。對生物活性脂質(zhì)信號的研究是一個熱門科學(xué)研究領(lǐng)域，因為越來越多的生物活性脂質(zhì)被鑒定并且它們的作用被表征。生物活性脂質(zhì)的實例包括類花生酸類(包括大麻素類、白三烯類、前列腺素類、脂氧素類、環(huán)氧二十碳三烯酸、以及異二十烷酸類)、非類花生酸大麻素介質(zhì)、磷脂及其衍生物如磷脂酸(PA)和磷脂酰甘油(PG)、血小板活化因子(PAF)和心磷脂以及溶血磷脂如溶血卯磷脂(LPC)和各種溶血磷脂酸(LPA)。生物活性信號脂質(zhì)介質(zhì)還包括鞘脂，例如鞘磷脂、神經(jīng)酰胺、神經(jīng)酰胺-l-磷酸、鞘氨醇、神經(jīng)鞘氨醇磷酸膽石咸、神經(jīng)鞘氨醇(sphinganine)、神經(jīng)鞘氨醇-l-磷酸(二氫S1P)以及鞘氨醇-l-磷酸。鞘脂類和它們的衍生物代表對重要的細胞過程具有多效性的一類月包外和月包內(nèi)信號分子。生物活性信號脂質(zhì)的其它實例包括磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PEA)、甘油二酯(DG)、石克苦脂、神經(jīng)節(jié)苷脂、以及腦苷脂。鞘脂是一類獨特的脂質(zhì)，由于它們起初的神秘特性，其后被以Sphinx命名。鞘脂最初被表征為細胞膜的主要的結(jié)構(gòu)成分，但最近的研究表明，鞘脂還作為細月包4言號和調(diào)節(jié)分子(Hannun,etal,Adv.LipidRes.25:27-41,1993;Speigel,etal,FASEBJ.10:1388-1397,1996;Igarashi，J.Biochem122:1080-1087，1997;Hla，T.(2004).S畫"CW/Dev腸/,15，513-2;Gardell，S.E.，Dubin,A.E.&Chun,J.(2006).7>emfeMo/Me《12，65-75)。鞘脂是細胞膜的主要的結(jié)構(gòu)成分，其還作為細力包4言號和調(diào)節(jié)分子(Hannun和Bel，Adv.LipidRes.25:27-41,1993;Igarashi,J.Biochem122:1080-1087,1997)。已經(jīng)對鞘脂信號介質(zhì)、神經(jīng)酰胺(CER)、鞘氨醇(SPH)和鞘氨醇-l-磷酸(SIP)進行了最廣泛的研究并且最近已明了它們在心血管系統(tǒng)、血管發(fā)生和月中瘤生物學(xué)中的4卡用(Claus,etal.，CurrDrugTargets1:185-205，2000;Levade，etal.，Circ.Res.89:957-968，2001;Wang，etal"J.Biol.Chem.274:35343-50,1999;Wascholowski和Giannis,DrugNewsPerspect.14:581-90，2001;Spiegel,S.&Milstien,S.(2003).Sphingosine-l-phosphate:anenigmaticsignalinglipid.iV"/^evM/CW/S/o/，4，397-407)。關(guān)于鞘脂代謝的綜述，參見Liu等，CritRev.Clin.Lab.Sci.36:511-573,1999。關(guān)于鞘磷脂信號通路的綜述，參見Hannun,etal.,Adv.LipidRes.25:27-41,1993;Liu等，Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.36:511-573,1999;Igarashi,J.Biochem.122:1080-1087,1997;Oral,etal.，J.Biol.Chem.272:4836-4842,1997;以及Spiegeletal"Biochemistry(莫斯科)63:69-83,1998。(Maceyka,etal.(2002),BBA，vol.1585):192-201,以及Spiegel,etal.(2003),NatureReviewsMolecularCellBiology,vol.4:397-407)。已經(jīng)提出CER/SPH水平和SIP之間的平衡提供了一種可調(diào)機制(rheostatmechanism),該才幾制決定細月包4皮引向死亡通^各或免于凋亡。可調(diào)機制的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶是鞘氨醇激酶(SPHK),其作用是將促進死亡的生物活性信號脂質(zhì)(CER/SPH)轉(zhuǎn)化成促進生長的SIP。SIP具有兩種命運SIP可以被SIP裂解酶(一種酶，其將SIP裂解24成石壽酸乙醇胺和十六烷醛)降解，或4交不常見地，^皮S1P;岸酸酶水解成SPH。S1P的多效生物學(xué)活性是經(jīng)由最初稱作內(nèi)皮分化基因(EDG)的G蛋白耦聯(lián)受體(GPCR)的家族介導(dǎo)的。已經(jīng)確定5種GPCR為高親和力S1P受體(S1PR):S1P!/EDG-1、SlP2/EDG-5、SlP3/EDG-3、SlP4/EDG-6、以及SlP5/EDG-8,它們直到1998年才被鑒定(Lee,etal.，1998)。由SIP誘發(fā)的許多應(yīng)答耦聯(lián)于不同的異三聚體G蛋白(Gq_、G12_13)和Rho家族的小GTP酶(Gardell，etal"2006)。在成體中，S1P釋方文自血小板(Murataetal.，2000)和月巴大細胞以產(chǎn)生用于促進傷口愈合并參與炎性應(yīng)答的游離SIP的局部脈沖(足以超過S1PR的Kd)。在正常條件下，血漿中的總SIP相當高(300-500nM);然而，假設(shè)大多數(shù)SIP可以通過血清蛋白，尤其是通過脂蛋白(例如，HDL>LDL>VLDL)和白蛋白加以'緩沖，，以致生物有效的SIP(或SIP的游離部分)不足以明顯激活S1PR(Murataetal.,2000)。^口果不是這種情況，則會導(dǎo)致不適當?shù)难馨l(fā)生和炎癥。還已^是示了S1P的胞內(nèi)作用(參見例如，SpiegelS,KolesnickR(2002),Leukemia,vol.16:1596-602;Suomalainen,""/(2005)，AmJPathol，vol.166:773-81)。細胞表面S1P受體的廣泛表達使得S1P影響多種不同的細胞應(yīng)答，其包括增殖、黏著、收縮、運動性、形態(tài)發(fā)生、分化、以及存活。這種應(yīng)答范圍似、乎取決于細月包和組織系統(tǒng)內(nèi)的SIP受體的重疊或不同表達才莫式。此外，最近已證明S1P和生長因子信號通3各之間的交互作用(串擾，crosstalk),包括血小板衍生的生長因子(PDGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、以及石咸性成纖維細胞生長因子(bFGF)(參見伊J^口，Baudhuin，etal.(2004)，F(xiàn)ASEBJ，vol.18:341-3)。；步及S1P的各種細胞過程的調(diào)節(jié)尤其對于神經(jīng)信號、血管緊張度、傷25口愈合、免疫細胞運輸、生殖、以及心血管功能有特定的影響。這些系統(tǒng)內(nèi)S1P的內(nèi)源水平的改變會具有不利影響，從而誘發(fā)若干種病理生理4大態(tài)，其包纟舌癌癥、炎癥、血管發(fā)生、心臟病、嗜喘、以及自身免疫性疾病。最近治療各種疾病和病癥(包4舌心血管疾病、力*血管病、以及各種癌癥)的新方法涉及單獨地或連同其他治療來降低生物可利用的S1P的水平。雖然已提出了耙向鞘脂代謝途徑的關(guān)鍵酶(如SPHK)的基于鞘脂的治療策略，但直到最近才強調(diào)干擾脂質(zhì)介質(zhì)S1P本身，主要由于難以直接緩和(mitigate)這種脂質(zhì)靶標，尤其是由于難以首先提高抗體水平，然后針對S1P耙標來檢測抗體。最近，已描述了對于S1P具有特異性的抗體的產(chǎn)生。參見例如，共有的美國專利申請系列第20070148168號；WO2007/053447。這樣的抗體，其可以例如選擇性地吸附來自血清的S1P,作為分子海綿來中和胞夕卜S1P。還參見共有的美國專利第6,881,546號和第6,858,383號以及美國專利申i青系歹'J第10/029,372號。SPHINGOMAB,鼠單克隆抗體(mAb)(由Lpath,Inc.開發(fā)并在以上所列的某些專利或?qū)＠暾堉忻枋?已顯示出在人類疾病模型中是有效的。在某些情況下，人源化抗體可以優(yōu)選于鼠抗體，尤其用于人類的治療應(yīng)用，其中會發(fā)生人抗鼠抗體(HAMA)應(yīng)答。通過中和結(jié)合活性和/或通過從體內(nèi)循環(huán)中快速清除抗體，這才羊的應(yīng)答可以降低抗體的有效性。在隨后給予鼠抗體的情況下，HAMA應(yīng)答還會引起毒性?，F(xiàn)已開發(fā)了人源化抗S1P抗體并在本文中加以描述。就結(jié)合S1P、中和S1P和調(diào)節(jié)與S1P有關(guān)的疾病狀態(tài)的歲文力而言，當用于人類時這種抗體預(yù)期具有鼠mAb的所有優(yōu)點，而沒有鼠mAb的潛在缺點。如在下文的實施例中所描述的，這種人源化抗體(稱作LT1009或sonepcizumab)事實上在疾病的動物才莫型中已顯示出比親4戈(鼠)抗體具有更大的活性。3、定義在詳細描述本發(fā)明以前，將定義在本發(fā)明的范圍內(nèi)4吏用的若干術(shù)語。除這些術(shù)語之外，必要時，則在本說書的其它地方對其它術(shù)語加以定義。除非本文中另有明確失見定，在本"i兌明書中所用的術(shù)語將具有
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認可的含義。在沖突的情況下，以本說明書(包括定義)為準。"免疫衍生部分"包括任何抗體(Ab)或免疫球蛋白(Ig)，并且指衍生自免疫球蛋白基因的、按照免疫球蛋白基因制作的、或由免疫球蛋白基因編碼的任何形式的肽、多肽，或能夠結(jié)合抗原或表位的上述肽或多肽的片l殳(參見例如，Immunobiology,第5版,Janeway，Travers，Walport，Shlomchiked.(編者)，GarlandPublishing(2001))。在本發(fā)明中，抗原是生物活性脂質(zhì)分子。"抗SIP抗體"或"相對于SIP具有活性的免疫衍生部分"是指結(jié)合SIP的任何抗體或抗體源性分子。如根據(jù)這些定義將明了的，抗體或免疫書t生部分可以是多克隆的或單克隆的并且可以通過各種方式來產(chǎn)生，和/或可以分離自動物(包括人類對象)。"生物活性脂質(zhì)"是指脂質(zhì)信號分子。通常，當施加其信號效應(yīng)時，生物活性脂質(zhì)并不存在于生物膜中，也就是"^兌，雖然這樣的脂質(zhì)物質(zhì)可以在某個時候存在于生物膜(例如，細胞膜、細胞器膜等)中，但當伴隨生物膜時它不是"生物活性脂質(zhì)"而是"結(jié)構(gòu)脂質(zhì)"分子。生物活性脂質(zhì)與結(jié)構(gòu)脂質(zhì)(例如，膜結(jié)合磷脂)的區(qū)別在于，它們介導(dǎo)胞外和/或胞內(nèi)信號，因此通過調(diào)節(jié)分化、遷移、增殖、分泌、存活、以及其它過程而涉及許多類型的細胞的功能控制。在體內(nèi)，生物活性脂質(zhì)可以存在于細胞外液中，其中它們可以與其它分子復(fù)合，例如血清蛋白如白蛋白和脂蛋白，或具有"游離"形式，即，沒有與另一種分子物質(zhì)復(fù)合。作為細胞外介質(zhì)，通過激活膜結(jié)合離子通道或G蛋白耦聯(lián)受體，進而又激活復(fù)雜的信號系統(tǒng)，某些生物活性脂質(zhì)可改變細力包信號傳導(dǎo)，/人而改變細力包功能或存活。作為細月包內(nèi)介質(zhì)，生物活性脂質(zhì)可以通過直4妄與細月包內(nèi)成分(4口酶和離子通道)的相互作用來施加它們的作用。生物活性脂質(zhì)的典型實例包括LPA和S1P。術(shù)語"治療劑，，是指這樣的制劑，其緩和血管發(fā)生和/或新血管形成，例如，CNV和BV成熟、水腫、血管通透性和纖維化、纖維發(fā)生和癥痕，其伴隨眼病和眼部病癥，或者是眼病和眼部病癥的部分的基本病理特4正。術(shù)語"聯(lián)合療法"是指一種治療方案，其涉及提供至少兩種不同的療法以達到指定的治療歲丈果。例如，l關(guān)合療法可以涉及給予兩種或更多種化學(xué)上不同的活性組分，例如，抗LPA抗體和抗S1P抗體?？商鎿Q地，聯(lián)合療法可以涉及給予相對于生物活性脂質(zhì)具有活性的免疫4汙生部分以及*會予一種或多種其它化療藥物?？商娌艎J地，聯(lián)合療法可以涉及連同進行另一種治療一起給予抗脂質(zhì)抗體，如放射治療和/或外科手術(shù)。另夕卜，聯(lián)合療法可以涉及給予抗脂質(zhì)抗體連同一種或多種其它生物制劑(例吵口，抗VEGF、TGFP、PDGF、或bFGF制劑)、化療藥物以及另一種治療如i文射治療和/或外科手術(shù)。在利用兩種或多種化學(xué)上不同的活性組分進行的聯(lián)合治療的范圍內(nèi)，應(yīng)當明了，活性《且分可以作為一目同ia合物的一部分或4乍為不同的組合物來癥會予。當作為分開的《且合物給予時，可以在相同或不同的時間、通過相同或不同的途徑、利用相同或不同的鄉(xiāng)會藥方案來給予包含不同活性組分的組合物，其均才艮據(jù)具體情況需要并由主治醫(yī)生確定。類似;也，當一種或多種抗脂質(zhì)抗體物質(zhì)(例如，抗LPA28抗體)單獨或連同一種或多種化療藥物而與例如，》丈射治療和/或外科手術(shù)結(jié)合時，可以在外科手術(shù)或》文射治療之前或之后遞送藥物。"抗S1P劑"是指對S1P具有特異反應(yīng)性的任何制劑，并且包"半抗原"是指適合于共軛于半抗原的分子，從而使半抗原具有免疫原性。典型的、非限制性類型的半抗原分子是蛋白質(zhì)，其實例包4舌白蛋白、鑰孑L戚血藍素、血)疑素(hemaglutanin)、石皮傷風毒素(tetanus)、以及白候類毒素。適合于本發(fā)明使用的半抗原分子的其它類型和實例在本
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是已知的。這些以及以后發(fā)現(xiàn)或術(shù)語"化療藥物"是指抗癌劑和其它抗超增生劑。簡而言之，"化療藥物"是指用來破壞細胞和組織的化學(xué)物質(zhì)。這樣的制劑包括^旦不限于(1)DNA損傷劑和抑制DNA合成的制劑蒽環(huán)類抗生素(多柔比星、柔紅霉素(donorubicin)、表柔比星)、烷化劑(苯達莫司汀、白消安、卡鉑、卡莫司汀、順鉑、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、達卡巴。秦、六曱三聚氰胺、異環(huán)磷酰胺、洛莫司汀、氮芥、美法侖、米托坦、絲裂霉素、哌泊溴烷、丙卡巴肼、鏈佐星、塞替派、以及三亞胺。秦)、鉑衍生物(順鉑、卡鉑、順式二氯二氨合鉑)、端粒酶和拓樸異構(gòu)酶抑制劑(Camptosar)，(2)孩i管蛋白解聚劑紫杉烷類(紫杉醇、多西他賽、BAY59-8862),(3)抗代謝物，如卡培他濱、氯脫氧&泉普、阿糖胞苷(以及其激活形式，ara-CMP)、阿糖胞苷、氮烯咪胺、氟尿苷、氟達拉濱、5-氟尿嘧啶、5-DFUR、吉西他濱、羥基脲、6-巰基嘌呤、氨甲喋呤、戊制菌素、三曱曲沙、以及。票p令，(4)抗血管形成藥(Avastin、沙利度胺、舒尼替尼、來那度胺)，血管破壞劑(黃酮類化合物/黃酮、DMXAA、考布他汀書f生物如CA4DP、ZD6126、AVE8062A等)，(5)生物制劑，如抗體或抗體片,殳(赫賽汀(Herceptin)、阿瓦#斤汀(Avastin)、Panorex、利必妥(Rituxan)、'澤娃靈(Zevalin)、Mylotarg、Campath、Bexar、愛必妥(Erbitux)、Lucentis)，(6)內(nèi)分泌治療芳香酶抑制藥(4-氫雄烯二酮、依西美坦、氨魯米特、阿那曲哇、來曲唑)、抗雌激素藥(他莫昔芬、托瑞米芬、Raoxifene、氟維斯群(Faslode))、類固醇(如地塞米+〉)，(7)免疫調(diào)節(jié)劑細胞因子如IFN-(3和IL2、整合素的抑制劑，其它黏附蛋白質(zhì)和間質(zhì)金屬蛋白酶，(8)組蛋白去乙?；敢种苿?9)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑如酪氨酸激酶的抑制劑如伊馬替尼(格列衛(wèi)(Gleevec)),(10)熱激蛋白的抑制劑，(11)類一見黃醇，如全反式視黃酸，(12)生長因子受體抑制劑或生長因子本身的抑制劑，(13)抗有絲分裂化合物，如諾維本、紫杉醇、泰索帝、長春花堿、長春新石成、長春i也辛、以及長春瑞濱，(14)消炎藥，如COX4中制劑，以及(15)細胞周期調(diào)節(jié)劑，例如，4企-驗點調(diào)節(jié)劑和端粒酶抑制劑。如在本文中所1吏用的，術(shù)語"鞘脂"是指在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中稱作鞘脂的一類化合物，其包括但不限于以下化合物(參見http:〃www.lipidmaps.org，其為包含以下由方4舌號內(nèi)的字母凄t字字符串指示的鏈接的網(wǎng)站，上述鏈接包含相應(yīng)化合物的化學(xué)式、結(jié)構(gòu)信息等)鞘氨基醇堿[SPOl]鞘氨醇(Sphing醒4-enines，Sphingosines)[SP0101]神經(jīng)鞘氨醇[SP0102]4-羥雙氫鞘氨醇(植物鞘氨醇)[SP0103]鞘氨基醇石咸同系物和變體[SP0104]鞘氨基醇石咸l-磷酸[SP0105]溶鞘^粦脂和溶血津唐鞘脂[SPO106]N-曱基化鞘氨基醇堿[SPO107]鞘氨基醇^威類似物[SP0108]神經(jīng)酰胺[SP02]N-?；拾贝?神經(jīng)酰胺)[SP0201]N-酰基神經(jīng)鞘氨醇(二氫神經(jīng)酰胺)[SP0202]N-?；?4-羥基神經(jīng)鞘氨醇(植物神經(jīng)酰胺)[SP0203]?；窠?jīng)酰胺[SP0204]神經(jīng)酰胺1^粦酸[SP0205]鞘石粦脂[SP03]神經(jīng)酰胺磷酸膽堿(鞘磷脂)[SP0301]神經(jīng)酰胺磷酸乙醇胺[SPO302]神經(jīng)酰胺石岸酸肌醇[SP0303]磷酸鞘脂[SP04]中性鞘糖脂[SP05]筒單Glc系列(GlcCer、LacCer等)[SP0501]GalNAcbl-3Galal畫4Galbl-4Glc畫(Globo系列)[SP0502]GalNAcbl畫4Galbl-4GIc畫(Ganglio系列)[SP0503]Galbl陽3GlcNAcbl陽3Galbl-4Glc陽(Lacto系列)[SP0504]GaIbl-4GlcNAcbl-3Galbl-4Glc-(Neolacto系列)[SP0505]GalNAcbl-3Galal-3Galbl畫4Glc-(Isoglobo系列)[SP0506]GlcNAcbl-2Manal-3Manbl-4Glc-(Mollu系列)[SP0507]GalNAcbl-4GlcNAcbl-3Manbl-4Glc-(Arthro系歹'J)[SP0508]Gal-(Gala系列)[SP0509]其它[SP0510]酸性鞘糖脂[SP06]神經(jīng)節(jié)苷脂[SP0601]硫酸鞘糖脂(硫苷脂)[SP0602]葡糖醛酸鞘脂[SP0603]鞘糖^舞脂[SP0604]其它[SP0600]堿性鞘糖脂[SP07]兩性鞘糖脂[SP08]偶砷鞘月旨(arsenosphingolipid)[SP09]如下文詳細描述的，本發(fā)明提供了抗鞘脂S1P劑，其可用于治療或預(yù)防高增生病癥(如癌癥和心血管或腦血管疾病和病癥)以及各種眼部疾病。尤其是本發(fā)明涉及S1P以及其變體，包括但不限于鞘氨醇-l-磷酸[sphingene-l-磷酸；D-赤型-鞘氨醇-l-磷酸；鞘氨醇-l-磷酸；(E，2S，3R)-2-氨基-3-羥基-十八-4-烯氧基]膦酸(AS26993-30-6)，DHS1P一皮定義為二氫鞘氨醇-l-石粦酸[神經(jīng)鞘氨醇-l-磷酸；[(2S，3R)-2-氨基-3-羥基-十八氧基]膦酸；D-赤型-二氫-D-鞘氨醇一1一磷酸(CAS19794-97-9];SPC是神經(jīng)鞘氨醇磷酸膽石咸、溶鞘磷脂、革肖氛醇石粦臥臾月旦石威(sphingosylphosphocholine)、革肖氛醇石粦酸膽石威(sphingosinephosphorylcholine)、氣化三甲基按乙醜辨(ethanaminium);2-((((2-氨基-3-羥基-4-十八烯基)氧)羥基氧膦基)氧)-N,N,N-三甲基-,氯化物，(R-(R*，S*-(E)))，2-[[(E，2R,3S)-2-氨基_3-羥基-十八_4-烯氧基]-羥基-磷?；鵠乙氧基-三甲基-氯化銨(CAS10216-23-6)。32當在本文中使用時，除非另有^L定，術(shù)語"表位"或"抗原決定簇"是指抗SIP劑對其具有反應(yīng)性的SIP區(qū)。術(shù)語"高增生性病癥"是指與不受控制的增殖細胞有關(guān)的疾病和病癥，包括但不限于器官和組織細胞的不受控制的生長，從而導(dǎo)致癌癥或瘤形成以及良性腫瘤。與內(nèi)皮細胞有關(guān)的高增生性病癥可以導(dǎo)致血管發(fā)生的疾病如血管瘤、子宮內(nèi)膜異位癥、肥胖癥、年齡相關(guān)性黃斑變性和各種一見網(wǎng)力莫病、以及由于在治療動力永粥辨_石更4匕時成纖維細胞有關(guān)的高增生性病癥(例如，纖維發(fā)生)包括但不限于過度的疤痕形成(例如，纖維化)的病癥，如與年齡相關(guān)的黃斑變性、心臟重塑和與心肌梗死有關(guān)的衰竭，過度的傷口愈合如由于外訐+手術(shù)或損傷、瘢痕疙疼、以及纖維瘤和內(nèi)支架置入術(shù)而通常發(fā)生的。本發(fā)明的組合物用于基于鞘脂的治療方法。"治療"是指預(yù)防和/或治療疾病、病癥、或身體創(chuàng)傷。"心血管治療，，包括心臟治療以及預(yù)防和/或治療與心血管系統(tǒng)有關(guān)的其它疾病，如心臟病。術(shù)語"心臟病"包括涉及心臟或心月幾組織的任何類型的疾病、病癥、創(chuàng)傷或手術(shù)治療。人們對與心肌組織的缺氧和/或缺血和/或心力衰竭有關(guān)的心臟病特別感興趣。由缺血引起的一種類型的心臟病是再灌注損傷，如當在治療中使用抗凝劑、溶血一全劑、或抗心絞痛藥時、或當通過血管成形術(shù)或通過冠狀動脈拼接術(shù)打開心臟血管時可能發(fā)生的。本發(fā)明涉及的另一種類型的心臟病是冠狀動脈疾病(CAD)，其會由動脈硬化，尤其是動脈粥樣硬化引起，是缺血的常見原因。CAD的癥狀例如是穩(wěn)定型或不穩(wěn)定型心紋痛，并且能夠?qū)е滦募」Ｋ?MI)和心臟性猝死。特別感興趣的病癥包括4旦不限于心肌缺血；急性心肌梗死(AMI);33冠狀動脈疾病(CAD);急性冠脈綜合征(ACS);心肌細胞和組織損傷，其可以在具有或不具有支架的情況下在經(jīng)皮血運重建(冠狀動力永血管成形術(shù))期間或作為經(jīng)皮血運重建(冠狀動^永血管成形術(shù))的結(jié)果而發(fā)生；冠狀動脈旁路拼接術(shù)(CABG)或其它手術(shù)或醫(yī)學(xué)操作或療法，其可以引起人類的缺血或缺血/再灌注損傷；以及心血管創(chuàng)傷。術(shù)語"心力衰竭"包括急性心肌梗死、心肌炎、心肌病、充血性心力衰竭、感染性^木克、心臟創(chuàng)傷以及先天性心力衰竭。導(dǎo)致心力衰竭的各種缺血性病癥稱作急性冠脈綜合征(ACS)。術(shù)語"心臟病治療劑"是指用于治療由心臟和心月幾疾病和病癥引起的或^半有心臟和心"幾疾病和病癥的疾病和病癥的制劑。"腦血管病的治療"是指涉及預(yù)防和/或治療伴隨腦缺血和/或缺氧的疾病和病癥的治療。特別感興趣的是由完全性缺血(由心臟病引起的)所造成的腦缺血和/或缺氧，包括〗旦不限于心力衰竭。術(shù)語"鞘脂代謝物，，是指由其獲得鞘脂的化合物、以及降解特定鞘脂所獲得的化合物。換言之，"鞘脂代謝物"是指與鞘脂代謝途徑有關(guān)的化合物。代謝物包括代謝前體和代謝產(chǎn)物。術(shù)語"代謝前體"是指從其獲得鞘脂的化合物。特別感興趣的代謝前體包括但不限于SPC、鞘磷脂、二氫鞘氨醇、二氫神經(jīng)酰胺、以及3-酮基神經(jīng)鞘氨醇。術(shù)語"代謝產(chǎn)物"是指由降解鞘脂而獲得的化合物，如磷酰月旦堿(例如，磷酸膽堿(phosphocholine)、磷酸膽堿(cholinephosphate))、脂肪酸(包括游離脂肪酸)、以及十六烷醛(例如，十六醛)。如本文中所^吏用的，術(shù)語"治療的"包括對疾病或病癥的所有治療。本發(fā)明的"治療"劑可以防衛(wèi)或預(yù)防的方式起作用，包括與i殳計用來把向可以;故確定為處于危險中(遺傳藥理學(xué))的個體的程序相結(jié)合的方式；或以改善或治愈的方式起作用；或可以用來減緩-降治療疾病或病癥的至少一種癥狀的進展速率或禾呈度；或可以用來最大程度減少所需要的時間、任何不適或疼痛的發(fā)生或程度、或伴隨A人疾病、病癥或身體創(chuàng)傷恢復(fù)后的體力限度；或可以對其它療法和治療起到壽乾助作用。"治療"是指治療性治療和預(yù)防性措施。需要治療者包括已經(jīng)患有病癥者以及要予頁防病癥者。術(shù)語"聯(lián)合療法"是指一種治療方案，其涉及提供至少兩種不同療法以達到指定的治療歲丈果。例如，聯(lián)合療法可以涉及給予兩種或更多種化學(xué)上不同的活性組分，例如，快速作用化療藥物和抗脂質(zhì)抗體?？商鎿Q地，聯(lián)合療法可以涉及單獨給予或連同另一種治療(如方丈射治療和/或外科手術(shù))一起給予抗脂質(zhì)抗體和/或一種或多種化療藥物。另外，聯(lián)合療法可以涉及連同一種或多種其它生物制劑(例3口，4元VEGF、TGF|3、PDGF、或bFGF劑)、4b療藥物以及另一種治療(如放射治療和/或外科手術(shù))一起給予抗脂質(zhì)抗體。在給予兩種或更多種化學(xué)上不同的活性組分的情況下，應(yīng)當明了，作為分開的組合物給予時，包含不同活性組分的組合物可以在相同或不同的時間、通過相同或不同的途徑、利用相同或不同的給藥方案來給予，其均才艮據(jù)具體情況的需要并由主治醫(yī)生確定。類似地，當一種或多種抗脂質(zhì)抗體物質(zhì)(例如，抗LPA抗體)單獨或連同一種或多種化療藥物而與例如，》文射治療和/或外-牛手術(shù)結(jié)合時，可以在外科手術(shù)或放射治療之前或之后遞送藥物。"單藥治療"是指基于遞送一種治療有效化合物的治療方案，不管是作為單劑量或作為隨著時間推移的若干劑量來給予。"瘤形成"或"癌癥"是指異常的和不受控制的細胞生長。"新生物"、或肺瘤或癌癥，是細^^生長的異常的、不受調(diào)節(jié)的、以及紊亂的增殖，并且通常稱作癌癥。新生物可以是良性的或惡性的。如果新生物具有破壞性生長、侵襲性、以及轉(zhuǎn)移的性能，則是惡性的、或癌性的。^f憂襲性是指新生物通過浸潤或石皮壞周圍組織而局部擴散，通常沖破限定組織邊界的基底層，從而經(jīng)常進入體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)。轉(zhuǎn)移通常是指腫瘤細胞通過淋巴管或血管的散布。轉(zhuǎn)移還指腫瘤細胞通過直4妄延伸通過漿膜腔、或蛛網(wǎng)力莫下隙或其它腔隙的遷移。通過轉(zhuǎn)移過程，腫瘤細胞遷移到身體的其它區(qū)域，從而在遠離最初出現(xiàn)部位的區(qū)域建立新生物。就治療來說，"哺乳動物"是指分類為哺乳動物的任何動物，其包括人類、家養(yǎng)和農(nóng)場動物、以及動物園動物、體育動物、或?qū)櫸飫游?，如狗、馬、貓、牛等。優(yōu)選地，哺乳動物是人。"天然抗體"和"天然免疫球蛋白"通常是約150,000道爾頓的異四聚體并唐蛋白，由兩個相同的輕(L)《連和兩個相同的重(H)鏈構(gòu)成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵連接于重鏈，而在不同免疫球蛋白同種型的重鏈之間二硫鍵的數(shù)目是不同的。每條重鏈和輕鏈還具有>見則間隔的鏈內(nèi)二碌^橋。每條重鏈在一端具有可變結(jié)構(gòu)域^(Vh),接著是若干恒定結(jié)構(gòu)域。每條輕鏈在一端具有可變結(jié)構(gòu)域(VL)而在另一端具有恒定結(jié)構(gòu)域；輕《連的恒定結(jié)構(gòu)域?qū)?alignedwith)重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域，而輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域則對準重4連的可變結(jié)構(gòu)i或。i人為特定的氨基酸殘基在輕鏈可變結(jié)構(gòu)i或和重鏈可變結(jié)構(gòu)i戈之間形成界面。術(shù)語"可變"區(qū)包含骨架和CDR(在其它情況下稱作高變區(qū))并且是指以下事實在抗體之間，可變結(jié)構(gòu)域的某些部分在序列方面是廣泛不同的，并且用于每個特定抗體對其特定抗原的結(jié)合和特異性。然而，變異性并不是均勻地分布于整個抗體的可變結(jié)構(gòu)域。在輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域，它均集中在三個稱作高可變區(qū)的區(qū)段。可變結(jié)構(gòu)域的更高保守部分被稱作骨架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域各自包含四個FR(分別為FR1、FR2、FR3以及FR4),大部分采取P-折疊構(gòu)型，通過三個高可變區(qū)加以連接，該環(huán)連接卩-折疊結(jié)構(gòu)形成環(huán)并在某些情況下形成(3-折疊結(jié)構(gòu)的一部分。在每個鏈中的高可變區(qū)通過FR被緊密地保持在一起，并且與來自其它鏈的高可變區(qū)緊密地保持在一起，有助于形成抗體的抗原結(jié)合位點(參見Kabat，etal，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，Md.(1991)，第647-669頁)。恒定結(jié)構(gòu)域并不直接涉及將抗體結(jié)合于抗原，但呈現(xiàn)各種效應(yīng)子功能，如抗體依賴性細胞毒性中抗體的參與。當在本文中使用時，術(shù)語"高可變區(qū)"是指負責抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基。高可變區(qū)包含來自"互補決定區(qū)"或"CDR"的氨基酸殘基(例如，在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基24-34(Ll)、50-56(L2)、和89-97(L3)，以及在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的31-35(Hl)、50-65(H2)、和95-102(H3);Kabat,etal.(1991)，上文)和/或那些來自"高可變環(huán)"的殘基(例如在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基26-32(Ll)、50-52(L2)、和91-96(L3)以及在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的26-32(Hl)、53-55(H2)、和96-101CH3);ChothiaandLeskJ.Mol,Biol.196:901-917(1987))。如本文中所定義的，"骨架"或"FR"殘基是那些不同于高可變區(qū)殘基的可變結(jié)構(gòu)域殘基?？贵w的木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生兩個相同的抗原結(jié)合片段，稱作"Fab"片段，每個具有單抗原結(jié)合位點，以及殘余"Fc"片段，其名稱反映了其容易結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生F(ab')2片段，其具有兩個抗原結(jié)合位點并且仍然能夠交聯(lián)抗原。"Fv"是最小抗體片段，其包含完全抗原識別和結(jié)合位點。此區(qū)由緊密、非共4介締合的一個重鏈和一個輕鏈可變結(jié)構(gòu)J或的二聚體37構(gòu)成。正是以這種構(gòu)型，每個可變結(jié)構(gòu)域的三個高可變區(qū)相互作用以在Vh-Vl二聚體的表面上限定抗原結(jié)合位點。共同地，上述6個高可變區(qū)將抗原結(jié)合特異性賦予抗體。然而，甚至單可變結(jié)構(gòu)域(或一半Fv,其〗又包含對于抗原具有特異性的三個高可變區(qū))也具有識別和結(jié)合抗原的能力，雖然親和力低于整個結(jié)合位點。Fab片段還包含輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈的第一'度定結(jié)構(gòu)域(CH1)。Fab'片段與Fab片段的差別在于在重鏈CH1結(jié)構(gòu)域(包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸)的羧基末端加入幾個殘基。本文中Fab'-SH是用于Fab'的名稱，其中恒定結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基攜帶游離硫醇基。F(ab')2抗體片段最初產(chǎn)生為成對的Fab'片段，其在它們之間具有鉸鏈半胱氨酸。抗體片段的其它化學(xué)耦聯(lián)也是已知的?；诤愣ńY(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，來自任何脊推動物物種的抗體(免疫球蛋白)的"輕鏈"可以被指定為兩種明顯不同類型之一，稱作K和x。取決于它們重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，免疫球蛋白可以被指定為不同的類型。目前有5種主要類型的免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG、以及IgM,并且這些主要類型的若干種可以進一步分為亞類(同種型)，例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、以及IgA2。對應(yīng)于不同類的免疫球蛋白的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別稱為oc、S、s、y、以及p。不同類免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是眾所周知的。術(shù)語"抗體，，在本文中是在廣義上加以使用并且具體包括單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)。多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)，抗體片l殳，以及結(jié)合劑，其采用親代抗體的CDR(或其保留抗原結(jié)合活性的變體)。本文中抗體被定義為保留親代抗體的至少一種所期望的活性。所期望的活性可以包括特異性地結(jié)合抗原的能力、體外抑制增殖(proleration)的能力、體內(nèi)抑制血管發(fā)生的能力、以及體外改變細胞因子輪廓的能力。"抗體片段"包括全長抗體的一部分，通常是其抗原結(jié)合或可變結(jié)構(gòu)i或?？贵w片段的實例包括Fab、Fab'、F(ab')2、以及Fv片段；雙體分子；線狀抗體；單鏈抗體分子；以及形成自抗體片段的多特異性抗體。如在本文中所使用的，術(shù)語"單克隆抗體"是指獲自基本上同型抗體的群體的抗體，例如，包含群體的個體抗體是相同的，除了可能的天然發(fā)生的突變，其可以少量存在。單克隆抗體是高度特異的，針對單抗原位點。此外，不同于常規(guī)(多克隆)抗體制劑，其通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體，每個單克隆抗體針對抗原上的單決定簇。修飾詞"單克隆"表示抗體的特性是獲自抗體的基本上同型群體，而不應(yīng)看作是需要通過特定的方法來生產(chǎn)抗體。例如，根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過首先由Kohler等，Nature256:495(1975)描述的雜交瘤方法加以制備，或可以通過重纟且DNA方法力口以制備(參見例3口，美國專利第4,816,567號)。利用例如在Clackson，etal.，Nature352:624-628(1991)和Marksetal.，J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中描述的4支術(shù)，"單克隆抗體"還可以分離自噬菌體抗體文庫。本文中的單克隆抗體特別包括"嵌合"抗體(免疫^^蛋白)，其中重《連和/或輕《連的一部分相同于或同源于在書f生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類或亞類的抗體中的對應(yīng)序列，而鏈的剩余部分相同于或同源于在衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類或亞類的抗體中的對應(yīng)序列，以及上述抗體的片段，只要它們呈現(xiàn)所期望的生物學(xué)活性(美國專利第4,816,567號；以及Morrison,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984))。39非人(例如，小鼠)抗體的"人源化"形式是嵌合抗體，其包含衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多數(shù)情況下，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體的高可變區(qū)殘基被來自非人物種(供體抗體)的高可變區(qū)殘基取代，其中非人物種如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類，其具有所期望的特異性、親和力、以及能力。在某些情況下，人免疫球蛋白的骨架區(qū)(FR)殘基^皮對應(yīng)的非人殘基取代。此外，人源化抗體可以包含在受體抗體或供體抗體中未發(fā)現(xiàn)的殘基。進行這些修飾以進一步完善抗體性能。通常，人源化抗體將基本上均包含至少一個、以及通常兩個可變結(jié)構(gòu):威，其中所有或基本上所有的高可變區(qū)對應(yīng)于非人免疫^求蛋白的那些高可變區(qū)，以及所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的那些FR。人源化抗體可選地還將包含至少一部分的免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc),通常為人免疫主求蛋白的恒定區(qū)。關(guān)于進一步的詳情，參見Jones,etal.:Nature321:522-525(1986);Reichmann,etal，Nature332:323-329(1988);以及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)和Hansen,WO2006105062。"單鏈Fv"或"sFv"抗體片段包含抗體的Vh和VL結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單多肽鏈中。通常，F(xiàn)v多肽進一步包含在Vh和VL結(jié)構(gòu)域之間的多肽接頭，其使sFv能夠形成所期望的用于抗原結(jié)合的結(jié)構(gòu)。關(guān)于sFv的綜述，參見Pluckthun的ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,vol.113,RosenburgandMooreeds.Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315(1994)。術(shù)語"雙體分子"是指具有兩個抗原結(jié)合位點的小抗體片段，該片段包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)，其連接于在相同多肽鏈(Vh-Vl)中的輕《連可變結(jié)構(gòu)域(VL)。通過使用太短以致在相同鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間不允許配對的接頭，結(jié)構(gòu)域:帔迫配對于另一《連的互補結(jié)構(gòu)域并產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合^f立點。例如，在EP404,097、WO93/11161、40以及Hollinger,etal.,Proc,Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)中更充分描述了雙體分子。當在整個本申請中使用時，術(shù)語"線狀抗體"是指在Zapata,etal.ProteinEng.8(10):1057-1062(1995)中所描述的抗體。簡單地i兌，這些抗體包含一對串聯(lián)Fd區(qū)段(Vh-Ch1-Vh-Ch1)，其形成一對抗原結(jié)合區(qū)。線狀抗體可以是雙特異性的或單雙特異性的。在本文中，"變異"抗鞘脂抗體是指一種分子，其在氨基酸序列方面不同于"親代"抗鞘脂抗體氨基酸序列(借助于在親代抗體序列中添加、缺失、和/或取—個或多個氨基酸殘基)，^旦保留親代抗結(jié)合抗體的至少一種所期望的活性。所期望的活性可以包括特異性地結(jié)合抗原的能力、體外抑制增殖的能力、體內(nèi)抑制血管發(fā)生的能力、以及體外改變細胞因子輪廓的能力。在一種實施方式中，變體包含在親代抗體的一個或多個高可變區(qū)中的一個或多個氨基酸耳又代。例如，變體可以包含在親代抗體的一個或多個高可變區(qū)中的至少一個，例如，約一個至約10個，以及優(yōu)選約兩個至約5個取代。通常，變體將具有一種氨基酸序列，其與親代抗體重鏈或輕4連可變結(jié)構(gòu)i或序列具有至少50%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少65%,更4尤選至少75%，更4尤選至少80%,更^尤選至少85%,更優(yōu)選至少90%,以及最優(yōu)選至少95%的序列同一性。相對于此序列的同一性或同源性在本文中^皮定義為，在對比序列和引入間隙(如果必要的話)以后(以達到最大百分比序列同一性)，在4'美選序列中相同于親代抗體殘基的氨基酸殘基的百分比。N端、C端、或內(nèi)部延伸、缺失、或插入抗體序列均不應(yīng)i人為會影響序列同一性或同源性。變體保留結(jié)合鞘脂的能力并且優(yōu)選具有所期望的活性，其優(yōu)越于親K抗體的活性。例如，變體可以具有更強的結(jié)合親和力、增強的減少血管發(fā)生和/或停止腫瘤進展的能力。為了分析這樣的所期望的性能(例如較少免疫原性的、更長的半壽期、增強的穩(wěn)定性、增強全長形式和親代抗體的全長形式，例如，因為已發(fā)現(xiàn)，抗鞘脂抗體的格式會影響其在本文披露的生物學(xué)活性測定中的活性。本文中特別感興趣的變異抗體可以是這樣一種變異抗體，其呈現(xiàn)至少一種所期望活性的至少約5%，優(yōu)選至少約10%、25%、59%、或更大。4尤選的變體是這樣一種變體，當和親代抗體比較時，其具有優(yōu)越的生物物理性能(如體外測得的)或優(yōu)越的生物學(xué)活性(如體外或體內(nèi)測得的)。本文中的"親代"抗體是由用于制備變體的氨基酸序列編碼的抗體。優(yōu)選地，親代抗體具有人骨架區(qū)，并且，如果存在的話，具有人抗體恒定區(qū)。例如，親代抗體可以是人源化或人抗體。"分離的"抗體是這樣一種抗體，其已被鑒定和分離和/或回收自其天然環(huán)境的成分。其天然環(huán)境的污染物成分是將干纟尤抗體的it斷或治療應(yīng)用的物質(zhì)，并且可以包4舌酶、激素、以及其它蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)溶質(zhì)。在優(yōu)選實施方式中，抗體將^皮純化(1)4妄抗體的重量計達到大于95。/。，如通過勞里方法確定的，并且4姿重量計最4尤選大于99%，(2)達到這樣的程度，其足以獲得N端或內(nèi)部氨基酸序列的至少15個殘基，其中通過4吏用S走杯、序列分才/H義(spinningcupsequenator)，或(3)在還原或非還原條件下通過SDS-PAGE達到同質(zhì)性，其中使用考馬斯藍或優(yōu)選銀染。分離的抗體包括在重組細胞內(nèi)的原位抗體，因為抗體的天然環(huán)境的至少一種成分將不存在。然而，通常將通過至少一個純化步驟來制備分離的4元體。當在本文中使用時，術(shù)語"標記"是指直接或間接共軛于抗體的可才企測化合物或組分。標記本身可以是獨自可4企測的(例如，力丈射性同位素標記或熒光標記)或，在酶標記的情況下，可以催化可才企測的底物化合物或組分的化學(xué)變化。"固相"是指非水基質(zhì)，本發(fā)明的抗體可以與其勦附或抗體或其它抗-S1P結(jié)合劑可以固定在其上。本文包括的固相的實例包括部分或完全由3皮璃(例如，受控孔玻璃)、多糖(例如，瓊脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇以及聚硅氧烷形成的那些固相。在某些實施方式中，4艮據(jù)具體情況，固相可以包4舌測定4反的孔，而在其它情況下則是純化柱(例如，親和層析柱)。此術(shù)語還包括離散顆粒的不連續(xù)固相，如在美國專利第4,275,149號中所描述的那些不連續(xù)固相。"脂質(zhì)體"是由各種類型的脂質(zhì)、磷脂和/或表面活性劑組成的小嚢，其可用于向哺乳動物遞送藥物(如本文描述的抗鞘脂抗體以及，可選地，化療藥物)。脂質(zhì)體的成分通常以雙層形式排列，類似于生物膜的脂質(zhì)排列。"分離的"核酸分子是這樣的核酸分子，其尋皮鑒定和分離自至少一種污染物核酸分子，在抗體核酸的天然源中分離的核酸分子通常伴隨污染物核酸分子。分離的核酸分子在形式或環(huán)境方面不同于在自然界發(fā)現(xiàn)的核酸分子。因此分離的核酸分子不同于在天然細月包中存在的核酸分子。然而，分離的核酸分子包括包含在通常表達抗體的細胞中的核酸分子，其中，例如，核酸分子所處的染色體位置不同于在天然細胞中的位置。術(shù)語"調(diào)控序列"是指在特定宿主生物體中表達可操作連接的編碼序列所必要的DNA序列。適用于例如原核細力包的調(diào)控序列包括啟動子、可選的纟喿作子序列、以及核^唐體結(jié)合位點。已知真核細胞可利用啟動子、多&良苷酸化信號、以及增強子。當核酸凈皮置于與另一核酸序列的功能關(guān)系中時，則核酸是"可才乘作連4妄的"。例4。，如果用于前序列或分泌前導(dǎo)序列的DNA凈皮表達為參與多肽分泌的前體蛋白，則用于前序列或分泌前導(dǎo)序列的DNA可才乘作地連4妻于用于多肽的DNA;如果啟動子或增強子影響43序列的轉(zhuǎn)錄，則啟動子或增強子可操作地連接于編碼序列；或如果核糖體結(jié)合位點一皮定位以致促進翻i,，則核糖體結(jié)合位點可操作;也連接于編碼序列。通常，"可操作連接的"是指^皮連接的核酸分子是鄰4妄的，并且，在分泌前導(dǎo)序列的情況下，是鄰接的和處于讀碼;階,殳。然而，增強子并不必須是鄰接的。通過在方便的限制位點的連接作用來完成連接。如果這樣的位點并不存在，則按照常規(guī)做法使用合成寡核苷酸銜接子或接頭。如在本文中所-使用的，術(shù)語"細胞，，、"細胞系"、以及"細胞培養(yǎng)"可互換使用并且所有這樣的名稱包括子代。因此，術(shù)語"轉(zhuǎn)化體"和"轉(zhuǎn)化細胞"包括原代主體細胞和從其衍生的培養(yǎng)物，而與傳遞次數(shù)無關(guān)。還應(yīng)當明了，由于蓄意突變(deliberatemutation)或無意突變(inadvertentmutation),戶斤有子4氣可能并不具有4青確才目同的DNA含量。包括具有相同功能或生物學(xué)活性的突變子代，如在最初轉(zhuǎn)化細胞中篩查的。其中使用了不同名稱，根據(jù)上下文它將是清楚的。根據(jù)本發(fā)明的"具備專利性的"組合物、方法、機器、或制品是指在進行分析時其主題名稱滿足專利性的所有法定要求。例如，關(guān)于新穎性、創(chuàng)造性等，如果以后的研究指出一項或多項權(quán)利要求包含否定新穎性、創(chuàng)造性等的一種或多種實施方式，則由"具備專利性的"實施方式限定的纟又利要求具體地排除不具備專利性的實施方式。而且，所附權(quán)利要求將被解釋為提供最廣的合理范圍，以及保護它們的有效性。此外，以這樣的方式解釋權(quán)利要求，即(l)保護它們的有效性以及(2)從本申請作為專利被提交或公開時到一項或多項所附權(quán)利要求的有效性受到質(zhì)疑時，在具備專利性的一項或多項法定要求被修訂或如果用于評估專利性的特定法定要求是否滿足的標準發(fā)生變化的情況下提供最寬的合理解釋。術(shù)語"藥用鹽"是指這樣的鹽，其保留本發(fā)明的制劑和化合物的生物有效性和性能并且其在生物上或其它方面也是需要的。在i午多情況下，借助于存在帶電荷基團，例如，帶電荷氨基和/或羧基基團或與其類似的基團，本發(fā)明的制劑和化合物能夠形成酸式鹽和/或石威式鹽。藥用酸加成鹽可以制備自無才幾酸和有才幾酸，而藥用石咸力口成鹽可以制備自無枳〃減和有初^咸。對于藥用鹽的綜述(參見Berge，etal.(1977)J.Pharm.ScL，vol.66,1-19)。"多個"或"多種"是指一個(種)以上。術(shù)語"分開的"、"純化的"、"分離的"等是指包含在容納樣品的容器中的樣品的一種或多種成分被或已#:從存在于容器中的一種或多種其它樣品成分物理地除去，或被稀釋在存在于容器中的一種或多種其它樣品成分中。在分離或純化步驟中可以被除去或稀釋的樣品成分包括化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物、未反應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)、蛋白質(zhì)、石灰水化合物、脂質(zhì)、以及未結(jié)合的分子。本文中所使用的術(shù)語"物種(或物質(zhì))"用于各種情況，例如，化療藥物的特定物質(zhì)。在每一種情況下，該術(shù)語是指在特定范圍內(nèi)提及的化學(xué)上難以區(qū)分的分子的群體。"特異性地結(jié)合"和"特異性結(jié)合"等是指兩種分子之間的特異的、非隨機相互作用，該相互作用取決于存在使得分子之間可以發(fā)生適當?shù)幕瘜W(xué)或分子相互作用結(jié)構(gòu)、疏水/親水、和/或靜電特征。"受治療者"或"患者，，是指需要治療的動物，其中治療可以通過本發(fā)明的分子來進行。按照本發(fā)明可以治療的動物包括脊推動物，其中哺乳動物如牛、犬、馬、貓、綿羊、豬、以及靈長類(包括人類和非人靈長類)動物是特別優(yōu)選的實例。45"治療有效量"(或"有效量")是指當給予受治療者或患者時足以實施治療的活性組分(例如，根據(jù)本發(fā)明的制劑)的量。因此，可以由本領(lǐng)域才支術(shù)人員容易地確定才艮據(jù)本發(fā)明的組合物的治療有效量。在眼治療的范圍內(nèi)，"治療有效量"是這樣的量，其在與眼部疾病或病癥的治療有關(guān)的一個或多個參凄t方面產(chǎn)生客觀上測得的變化，其包括與眼部疾病或病癥有關(guān)的一種或多種基因的表達的增加或減少、凋亡或其它細胞死亡通^各的誘導(dǎo)、癥狀的臨床改善、異常的新血管形成或炎癥的降低等。當然，治療有效量將取決于特r治療的特定受治療者和病癥、受治療者的體重和年齡、疾病狀態(tài)的嚴重性、選用的特定化合物、采用的給藥方案、給予的時間、給予方式等，所有這些可以容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。應(yīng)當明了，在聯(lián)合療法的情況下，特定活性組分的治療有歲文量可以與作為單藥治療(即，采用^f又一種化學(xué)實體作為活性組分的治療方案)給予時的活性組分的治療有效量不同。術(shù)i吾疾病或病癥的"治療"包括:予貞防或防止疾病或病癥(即，使臨床癥狀不發(fā)展)；抑制疾病或病癥(即，阻止或抑制臨床癥狀的發(fā)展)；和/或緩解疾病或病癥(即，使臨床癥狀消退)。如將明了的，并不總是可以區(qū)分"預(yù)防"和"抑制"疾病或病癥，因為最終-秀導(dǎo)事件可以是未知的或潛在的。因此，術(shù)i吾"預(yù)防"將^皮理解為構(gòu)成一種類型的"治療，，，其包括"預(yù)防"和"抑制，，。因此術(shù)語"治療"包括"預(yù)防"。術(shù)語"治療方案"是指利用化療藥物、放射治療、外科手術(shù)、基因治療、DNA疫苗和治療、基于反義的療法(包括siRNA療法)、抗血管形成療法、免疫療法、骨髓纟并*接、適體和其它生物制劑如4元體和抗體變體、誘騙受體、以及其它基于蛋白質(zhì)的療法對疾病或病癥進行的任何治療。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及具備專利性的人源化抗鞘脂劑，該人源化抗鞘脂劑包括抗體和抗鞘脂抗體變體，從治療和/或診斷角度考慮，其具有所期望的性能，包括對鞘脂的強結(jié)合親和力，結(jié)合并中和鞘氨醇-l-磷酸(S1P)的能力，尤其是在生理范圍內(nèi)(例如，在活組織、血液等中)和在生理條件下，以及包4舌亞型(isoform)、變體、同分異構(gòu)體、和相關(guān)化合物。尤其是，本發(fā)明涉及針對S1P的抗體，尤其是單克隆抗體，更具體地是人源化單克隆抗體以及其變體。這樣的抗體和變體優(yōu)選包括在藥物組合物中，該藥物組合物適合于給予已知或疑似需要用上述化合物進行治療的受治療者。除組合物之外，本發(fā)明還纟是供了包括上述組合物的試劑盒、制備上述抗S1P抗體和變體的方法，以及利用上述制劑進行治療的方法。在一種實施方式中，提供了分離的抗S1P抗體重鏈和輕鏈，其包含新鑒定的優(yōu)選序列的可變結(jié)構(gòu)域，尤其是對重鏈而言的SEQIDNO:27和SEQIDNO:35以及》十輕鏈而言的SEQIDNO:30和SEQIDNO:37。在另一種實施方式中，才是供了抗S1P劑，其在生理條件下相對于鞘氨醇-l-磷酸(SlP)具有活性并且其包含至少一種CDR肽，該肽與在本文其它地方i兌明的CDR序列具有至少50%的氨基酸序列同一性，以及高達并包4舌100%的同一性。在一種實施方式中，4艮據(jù)本發(fā)明的抗鞘脂抗體具有輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包含具有以下氨基酸序列的高變互補決定區(qū)(CDR):ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10;CDRLl)、EGNILRP(SEQIDNO:ll;CDRL2)以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12;CDRL3)。優(yōu)選地，重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含具有以下氨基酸序列的CDR:DHTIH(SEQIDNO:13;CDRH1)、GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15;CDRH3)以及CISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:14;CDRH2)或AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31;CDRH2)。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實施方式中，一個或多個CDR以使CDR保留它們的結(jié)合并中和SIP的能力的方式而拼接到骨架。不限于以下實例，骨架可以表示緊密旁側(cè)CDR的纟元體輕鏈和重鏈的人序列，〗旦也可以表示任何結(jié)構(gòu)，其以一定的方式呈現(xiàn)CDR以便優(yōu)化人源化抗體在其結(jié)合于S1P方面的性能特征或其它特性，其可以增強抗體的效能、穩(wěn)定性、表達、生物半衰期、溶解性、免疫原性、藥理分布(pharmacodistribution)、以及貝i存期卩艮。優(yōu)選地，在人骨架區(qū)中具有三個重鏈高可變CDR區(qū)，例如，作為由下式表示的鄰接序列FR1-CDRH1畫FR2誦CDRH2-FR3-CDRH3-FR4。本發(fā)明進一步提供了一種抗鞘脂抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包含本文中由SEQIDNO:27表示的氨基酸序列。一種特別有用的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列是在以下實施例12中描述的人源化抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列，并且包含SEQIDNO:32的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列。上述優(yōu)選的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列可以結(jié)合于例如多肽(其包含本文中由SEQIDNO:33表示的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列)，結(jié)合于其它輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列，只要獲得的分子結(jié)合于鞘脂即可。在另一種實施方式中，本發(fā)明提供了一種人源化抗鞘脂抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包含在本文中由SEQIDNO:17表示的氨基酸序列。在一種實施方式中，一種有用的輕《連可變結(jié)構(gòu)i或序列是以下實施例12的人源化抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列，并且包含SEQIDNO:30或SEQIDNO:37的輕鏈可變結(jié)構(gòu)i或序列。在一種優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明^是供了一種人源化抗鞘脂抗體，其具有包含SEQIDNO:37的氨基酸序列的輕鏈和包含SEQIDNO:35的氨基酸序列的重鏈。輕鏈可變結(jié)構(gòu)域可以包含具有以下氨基酸序列的高可變區(qū)CDRL1(SEQIDNO:10)、CDRL2(SEQIDNO:11)、以及CDRL3(SEQIDNO:12)。優(yōu)選地，在人骨架區(qū)中可具有上述三個輕鏈高可變區(qū)，例如，作為由下式表示的鄰4妄序列FR1-CDRL1-FR2-CDRL2-FR3-CD-RL3-FR4。本發(fā)明還提供了親代抗鞘脂抗體的變體，優(yōu)選其中親代抗體是人源化或人抗鞘脂抗體。上述變體結(jié)合鞘脂，尤其是S1P,并且包含在親代抗鞘脂抗體的重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的高可變區(qū)中的氨基酸取代。上述變體優(yōu)選具有在抗鞘脂抗體的一個或多個高可變區(qū)中的一個或多個取代。才艮據(jù)一種實施方式，取代是在親代抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域中，例如，氨基酸取代可以是在重鏈可變結(jié)構(gòu)域CDRH1和/或CDRH3中。在上述兩個高可變區(qū)中均可存在取代。本文中證明了這樣的"親和力成熟的"變體比親代抗鞘脂抗體(由其產(chǎn)生"親和力成熟的"變體)更強地結(jié)合鞘脂。例如，通過親和力成熟產(chǎn)生的抗體可以具有顯著低于親代抗鞘脂抗體的Kd值的Kd值。親和力成熟的一個典型實例涉及改變?nèi)薎gGKl輕鏈和重鏈骨架，其中^H妄鼠抗SIPCDR。這導(dǎo)致人源化抗體相對于其草巴配體(即SIP)的增加的親和力。在其它實施方式中，不同于人IgG骨架的氨基酸序列可以支持一個或多個CDR?？梢酝ㄟ^改變高變CDR區(qū)中的氨基酸序列來實施親和力成熟，以改善上述抗體性能和/或特性。這種形式的親和力成熟的一個實例在以下的實施例12中示出，其中重鏈CDR中的半胱氨酸殘基通過定位誘變^皮改變成丙氨酸殘基，從而導(dǎo)致S1P結(jié)合親和力和穩(wěn)定性的顯著增加。在一個這樣的重鏈變體中，可變區(qū)包括SEQIDNO:27的氨基酸序列。在CDRH2中的這才羊的重鏈可變結(jié)構(gòu)i或序列可以可選i也結(jié)合于輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，例如，包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域、或優(yōu)選地SEQIDNO:30的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列。本文預(yù)期包括各種抗S1P分子。例如，抗SIP劑可以是抗體、抗體衍生物、或非抗體源性部分。例如，抗S1P劑可以是抗體，包括全長抗體(例如，具有完整人Fc區(qū)的抗體)或抗體片#爻(例如，F(xiàn)ab、Fab'、或F(ab')2分子)、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、或親和力成熟的抗體。不是受限于本發(fā)明，可以產(chǎn)生上述抗S1P劑以改善或在其它情況下改變抗體穩(wěn)、定性、半衰期、歲丈能、藥理分布、和/或免疫原性。例如，可以改變?nèi)嗽础絫Fc結(jié)構(gòu)i或的氨基酸組成以改善其免疫原性或其它性能特性。在其它實施方式中，抗S1P劑可以共軛于某個組成部分，如多聚體、；改射性核素、化療藥物、以及4企測劑。在某些優(yōu)選實施方式中，用諸如藥用載體的載體來配制抗S1P劑。在一種實施方式中，抗S1P劑結(jié)合于第二制劑，如抗體、抗體片段、抗體衍生物、抗體變體、不同于抗S1P劑的治療劑，或可以結(jié)合不同于S1P的分子的制劑。本發(fā)明還4是供了分離的核酸分子，其編碼抗體的各種成分、抗體變體、以及根據(jù)本發(fā)明的片段，包括各種重鏈和輕鏈序列和CDR。還提供了包含這些核酸分子的載體和宿主細胞。進一步提供了分離的多肽，其包含一種或多種優(yōu)選的氨基酸序列，如CDR序列或抗體輕鏈和/或重鏈序列。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，提供了分離的抗體分子，其在每個重鏈和每個輕鏈中包含精確限定的CDR序列。在一種這樣的實施方式中，分離的抗體分子是人源化抗體分子。50還提供了多價結(jié)合分子，其具有對SIP具有反應(yīng)性的并且包含一個或多個優(yōu)選CDR序列的配體結(jié)合元件。這些多價分子可以包含至少一個、并且多達IO，OOO個或更多的對S1P具有反應(yīng)性的配體結(jié)合元件。如果需要的話，還可以包4舌對不同配體具有反應(yīng)性的配應(yīng)性的，但在一個或多個特性(例如，分子結(jié)構(gòu)、結(jié)合親和力等)方面不同于其它S1P結(jié)合it/f牛。還提供了用于治療或預(yù)防與異常水平、尤其是高水平S1P有關(guān)的疾病或病癥的方法。通常，上述方法包4舌將本發(fā)明的抗S1P組合物之一給予需要這種治療的受治療者，例如人?？梢酝ㄟ^上述方法治療的疾病或病癥包4舌癌癥、炎斗生疾病、月鹵血管病、心血管疾病、眼部疾病、與過度纖維發(fā)生有關(guān)的疾病和病癥、以及與病理性血管發(fā)生有關(guān)的疾病或病癥。還可以連同另一種治療劑或治療方案來紿^予抗S1P組合物。一個有關(guān)方面涉及降^氐用于治療或f^防高增生病癥的治療方案的毒性的方法。上述方法包括在纟會予用來治療或預(yù)防高增生病癥的治療方案之前、期間、或之后，給予高增生病癥患者有效量的根據(jù)本發(fā)明的一種制劑(或多種不同制劑)。在一種優(yōu)選實施方式中，抗體和治療方案具有相加作用，并且治療方案中加入抗體可以有助于降低治療方案的劑量，從而降低治療相關(guān)毒性。本發(fā)明的又一個方面涉及本發(fā)明的抗S1P劑的診斷應(yīng)用。在一種診斷應(yīng)用中，本發(fā)明提供了用于在樣品中確定靶鞘脂存在的方法。通常，通過下述步驟來實施上述方法將懷^是包含特定鞘脂(即，"靶"鞘脂)的樣品(如體液或組織活檢樣品)暴露于本發(fā)明的抗S1P劑如抗鞘脂抗體，然后確定在樣品中是否存在異常水平(即，與疾病或病癥有關(guān)的水平)的輩巴鞘脂(例如，SIP)。對于這些應(yīng)用中的某些應(yīng)用，提供了包括抗體及其使用說明的試劑盒。本發(fā)明的又一個方面涉及用于制備抗SIP劑的方法。這種制劑的優(yōu)選實例包括抗體、抗體變體、以及抗體衍生物(例如，抗體片段)。在優(yōu)選實施方式中，尤其是那些涉及包含一種或多種多肽的抗S1P劑的實施方式中，生物生產(chǎn)系統(tǒng)如細胞系是優(yōu)選的。當然，也可以采用合成^b學(xué)方法。下文將更詳細描述本發(fā)明的這些和其它方面以及實施方式。才艮據(jù)以下詳細描述、附圖、以及權(quán)利要求，本發(fā)明的前述和其它方面將變得更明顯。雖然類似或等效于本文所描述方法和材料的方法和材料可以用于實施或試-驗本發(fā)明，4旦下文描述了適宜的方法和材料。此外，以下的材料、方法、以及實施例僅是說明性的而不是限制性的。本申請包括至少一個彩色附圖。要求并支付必要的費用時，即可提供帶有彩色附圖的本申請的副本。下面提供每個附圖的簡要介紹。圖1.圖1具有兩個圖片，A和B。圖片A圖示S1P、SPH、LPA、SPC、以及其它結(jié)構(gòu)類似生物脂竟爭生物素共軛抗S1P單克隆抗體的竟爭性ELISA的結(jié)果。這些結(jié)果說明，抗體對于S1P是特異的和選擇性的，并且并不識別結(jié)構(gòu)類似的生物活性脂質(zhì)。如在以下實施例1中所描述的，通過對小鼠或人IgG特異的、共軛于HRP的二抗來檢測結(jié)合抗體。測量顯色反應(yīng)并報道為光密度(OD)。用于竟爭的脂質(zhì)濃度表示在X軸上。未能檢測出二抗與僅S1P涂布基質(zhì)的相互作用(凄t據(jù)未示出)。圖片B示出與圖片A中列出的SIP類似的生物活性脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)。圖2.此圖示出若干嵌合和重組人源化抗SIP抗體變體的結(jié)合性能。在ELISA結(jié)合測定中，比較了嵌合抗體(pATH10+pATH50)和人源化抗SIP單克隆抗體的兩個變體(pATH201+pATH308)以及(pATH201+pATH309)與SIP的結(jié)合。pATH308是在骨架區(qū)具有5個鼠回復(fù)突變的人源〗匕輕鏈而pATH309則是具有3個回復(fù)突變的人源化輕鏈。人源化重鏈(pATH201)在骨架區(qū)僅包含一個鼠回復(fù)突變。圖3是示出SPHINGOMAB對于S1P是高度特異的曲線圖。該曲線圖(其數(shù)據(jù)是利用竟爭性ELISA而產(chǎn)生)說明，與其它生物活性脂質(zhì)相比，SPHINGOMAB對于SIP的特異性。SPHINGOMAB表明對于鞘氨醇(SPH)、SIP或溶血磷脂酸(LPA)的直接的代謝前體沒有交叉反應(yīng)性，其中溶血》粦脂酸(LPA)是一種重要的結(jié)構(gòu)上和功能上類似于SIP的胞外信號分子。SPHINGOMAB并不識別其它結(jié)構(gòu)類似的脂質(zhì)和^R^射物，包括神經(jīng)酰胺-1J粦酸(C1P)、二氫鞘氨醇(DH-SPH)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)、或鞘磷脂(SM)。SPHINGOMAB確實與二氫鞘氨醇-l-磷酸(DH-SlP)進4亍交叉反應(yīng)，并且在更低的程度上與鞘氨醇磷酰膽堿(SPC)進行交叉反應(yīng)。SPHINGOMAB對于S1P的親和力(Kd)小于100pM，遠高于大多數(shù)治療性抗體，尤其是其它分子海綿。圖4.圖4具有兩個部分，圖4A和圖4B。產(chǎn)生圖中所示凄丈據(jù)的實一驗在以下實施例4中加以詳細描述。簡單地說，這些凄欠據(jù)表明，SPHINGOMAB會減少CNV和眼部病變中的瘢痕形成。用SPHINGOMAB或同種型配對非特異性單克隆抗體治療小鼠。通過布魯赫膜(Bruchsmembrane)的激光破裂來誘導(dǎo)CNV病變。示出的是來自每個治療組的病變的圖解和典型圖^f象，其中用羅丹明共扼蓖麻凝集素I染色用于血管形成(A)或用馬松三色(Masson，sTrichrome)染色用于膠原瘢痕形成(B)。圖4A示出，在鼠CNV病變形成模型中，在布魯赫膜的激光誘導(dǎo)破裂后的第14天和第28天，SPHINGOMAB顯著減弱脈絡(luò)膜新血管形成。圖4B示出，在布魯赫月莫的激光i秀導(dǎo)石皮裂后的第28天，SPHINGOMAB顯著降<氐4半隨CNV病變形成的纖維4匕。圖5.圖5具有兩幅圖片，圖5A和圖5B。在圖5A中，示出了通過誘導(dǎo)HUVEC管形成和遷移，S1P促進新血管形成，其被SPHINGOMAB降低。圖5A示出了接種在基質(zhì)膜上并溫育6小時的HUVEC的四張顯孩t照片，以評估管形成。圖5B示出了在基質(zhì)膜侵入室中經(jīng)1SIP±SPHINGOMAB(1昭/ml)處理6小時的HUVEC的數(shù)據(jù)。在5個獨立區(qū)域中計數(shù)遷移到基質(zhì)膜的細胞數(shù)目。圖6.圖6包括在以下實施例6中描述的實驗的若干照片(A)以及圖解(B和C),其中利用SPHINGOMAB進4亍實馬全。SPHINGOMAB中和SIP誘導(dǎo)的、VEGFi秀導(dǎo)的以及bFGF誘導(dǎo)的新血管形成。圖6A示出若干典型的FITC染色血管的照片，其來自基質(zhì)膜栓士指定生長因子的切片。圖6B示出，S1P刺激內(nèi)皮細胞(EC)浸潤。圖6C示出來自基質(zhì)膜一全(用VEGF或bFGF加以刺激的)的相對熒光的量化結(jié)果作為新血管形成的指標。當用l或25mg/kg的SPHINGOMAB系鄉(xiāng)充治療小鼠時，S1P、VEGF、以及bFGF的效應(yīng)受到抑制。圖7.圖7示出了標記為圖7A-圖7E的5幅圖，以及兩幅々支彩色照片。該凄t據(jù)是利用抗S1P單克隆抗體SPHINGOMAB所產(chǎn)生。關(guān)于實-瞼細節(jié)，參見以下實施例7。簡單;也"i兌，這些凝j居表明，SPHINGOMAB可中和(或4氐消)S1P刺激的瘢痕形成。在這些實驗中，成纖維細胞是無血清的，然后用0、0.1、0.5、或1|^MS1P+/-1嗎/mLSPHINGOMAB處理12-24小時。翁:據(jù)表明，S1P刺激瑞士3T3成纖維細胞增殖，如通過3H-胸苷加入所測得的(A)，在劃痕測定中小鼠心臟成纖維細胞遷移(B)，在來自表達膠原GFP的轉(zhuǎn)基因小鼠的分離的心臟成纖維細胞中膠原基因表達(相對熒光)(C)，以及WI-38細月包分化成月幾成纖維細月包，如通過降4氐的細月包增殖和增加的a-SMA表達所測得的(D)。SPHINGOMAB中和這些SIP歲丈應(yīng)的每一種。在4c久性心月幾梗死的小鼠才莫型中SPHINGOMAB體內(nèi)降低血管周纖維化(E)。圖8.圖8具有三幅圖片，圖8A、圖8B、以及圖8C。這些數(shù)據(jù)表明，S1P可促進眼上皮細月包和成纖維細月包專t化成產(chǎn)生收縮性、瘢痕組織的肌成纖維細胞。如在以下實施例8中所描述的，斥全查了S1P對若干人眼細胞系的肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化的影響。研究發(fā)現(xiàn)，S1P可以刺激在人視網(wǎng)膜色素上皮細胞(圖8A)和人結(jié)膜成纖維細胞(圖8B)中a-平滑肌肌動蛋白(a-SMA;—種肌成纖維細胞標記)的產(chǎn)生。這些凄t據(jù)首次表明，S1P屬于促進眼上皮細"包和成纖維細胞轉(zhuǎn)化成產(chǎn)生收縮性、瘢痕組織的肌成纖維細胞的因子。還檢查了S1P對纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)在人結(jié)膜成纖維細胞中的表達的影響。增加的PAI-1表達與結(jié)締組織的蛋白降解降4氐有關(guān)并連同與疤痕增加有關(guān)的若干纖維變性性疾病^L正調(diào)節(jié)。如圖8C所示，S1P以劑量依賴方式刺激PAI-1表達。圖9.圖9示出兩個條形圖，圖9A和圖9B，其示出了^f吏用稱作SPHINGOMAB的抗S1P單克隆抗體所產(chǎn)生的實-瞼數(shù)據(jù)。SPHINGOMAB體內(nèi)降低了免疫細胞創(chuàng)傷浸潤。在外科手術(shù)后48小時，使小鼠經(jīng)受MI，用鹽水或25mg/kgSPHINGOMAB進行治療，然后在第4天將小鼠處死。SPHINGOMAB降低了巨喧細胞(A)和肥大細胞(B)浸潤進入傷口。凄t據(jù)表示為鹽水治療值成倍下降。圖10.圖IO具有兩幅圖片，圖IOA和圖IOB。每幅圖片示出了用于表達鼠抗SIP單克隆抗體Vl和vh結(jié)構(gòu)域的克隆載體的圖語。圖10A是用于克隆Vl結(jié)枸域的pKN100載體的圖譜。圖10B是用于克隆Vh結(jié)枸域的pGlD200載體的圖譜。圖11.圖11^是供了一些示出若千小鼠、嵌合、以及重組人源化抗S1P抗體的結(jié)合性能的數(shù)據(jù)。在ELISA結(jié)合測定中比較了小鼠(muMAbSlP;由方形數(shù)據(jù)點形成的曲線)和嵌合(chMAbS1P;由豎三角形教:據(jù)點形成的曲線)與人源化抗體的第一變體(pATH200+pATH300;由倒三角形H悟點形成的曲線)與S1P的結(jié)合。圖12.圖12具有兩幅圖片，圖12A和圖12B,其示出了利用若干人源化單克隆抗體變體進4亍體外細胞測定所獲得的數(shù)據(jù)。圖12A示出了人源化mAb能夠防止SlP保護SKOV3細胞免于紫杉醇誘導(dǎo)的凋亡。如在以下實施例16中所描述的，在存在或沒有500nMS1P的情況下用500nM紫杉醇(Tax)，用濃度為l|ag/mL的56huMAbHCLC3(309)、huMAbHCLC5(308)、muMAbS1P(muMAb)、或非特異性IgGl(NS)來處理SKOV3細胞48小時。數(shù)值表示平均值士SEM(n=3)，其中對于每個數(shù)據(jù)點進行三次。"NT"是指未處理，而"Veh"表示1X用載體進4亍處理。圖12B示出了在用SIP和若干不同的抗SIP單克隆抗體之一或?qū)φ諉慰寺】贵w處理的卵巢癌(OVCAR3)細胞中的IL-8分泌。在以下實施例16中詳細描述的實馬全中，IOO，OOO個OVCAR3細胞/孔饑餓過夜，然后將luMSIP單獨加入培養(yǎng)基或用1ug/ml的非特異性抗體(NS)、pATH201+pATH309(LC3)、pATH201+pATH308(LC5)、pATH207+pATH309(cysLC3)、pATH207+pATH308(cysLC5)、以及0.1ug/ml(MO.l)、1ug/ml(Ml)或10ug/ml(M10)的抗S1P鼠抗體進行預(yù)溫育。在溫育22小時以后，收集細胞上清液，然后通過ELISA并利用R&D系統(tǒng)Quantikine人CXCL8/IL-8試劑盒來測量IL-8分泌。在圖中"NT"是指未處理的細胞。圖13.圖13示出了在CNV動物模型中，與鼠抗S1P單克隆抗體和對照相比，若干人單克隆抗體變體的體內(nèi)效力。如在以下實施例17中描述的，在這些實-驗中，兩次(第O天和第6天)*會予小鼠0.5ug的鼠(Mu)抗S1P單克隆抗體、若干人源化4元S1P單克隆抗體變體(即，變體LC3、LC5、HCcysLC3、以及HCcysLC5)、或非特異性單克隆抗體(NS)(通過玻璃體內(nèi)給予)，然后經(jīng)受布魯赫膜的激光破裂。在激光外科手術(shù)后的第14天處死小鼠。切開鞏膜-RPE-"永絡(luò)力莫復(fù)合體并用羅丹明共輒蓖麻凝集素I抗體染色。CNV病變?nèi)莘e表示為平均值士SEM。具體實施例方式1.化合物本發(fā)明描述了某些抗SIP劑，尤其是那些為免疫衍生部分的抗S1P劑，包括抗體，其對于生物活性脂質(zhì)S1P具有特異反應(yīng)性；換言之，抗SIP劑與其進行反應(yīng)的生物活性脂質(zhì)是S1P?？贵w分子或免疫球蛋白是分子量大約為150kDa的大糖蛋白分子，通常由兩種不同種類的多肽鏈組成。一種多肽《連，稱作"重"鏈(H)，大約為50kDa。另一種多肽鏈，稱作"輕"鏈(L),大約為25kDa。每個免疫球蛋白分子通常由兩個重鏈和兩個輕鏈構(gòu)成。兩個重鏈通過二石克4建;波此連4妄，其中二石克4建的凄t目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈之間是不同的。每個輕鏈通過一個共價二硫4走連接于重鏈。在任何給定的天然存在的抗體分子中，兩個重鏈和兩個輕鏈是相同的，包含兩個相同的抗原結(jié)合位點，因而被說成是二<介的，即，具有同時結(jié)合兩個相同分子的能力?；诤愣ńY(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，來自任何脊推動物物種的抗體分子的"輕"鏈可以被指定為兩種明顯不同類型之一，卡巴(K)和入(l)。兩種類型的輕鏈的比率隨物種而不同。例如，在小鼠中K與1的平均比率為20:1,而在人類中為2:1以及在牛中為1:20?；诤愣ńY(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，來自4壬何脊推動物物種的抗體分子的"重"鏈可以被指定為5種明顯不同類型(稱作同種型)之一。某些同種型具有若干亞型。免疫球蛋白的5種主要類型是免疫球蛋白M(IgM)、免疫J求蛋白D(IgD)、免疫3求蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、以及免疫球蛋白E(IgE)。IgG是最豐富的同種型并且具有若干子類(在人類中為IgGl、2、3、以及4)。Fc片段和鉸鏈區(qū)的差別在于不同同種型的抗體，從而確定它們的功能特性。然而，結(jié)構(gòu)域的全部機體組成在所有同種型中是類似的。術(shù)語"可變區(qū)"是指抗體分子或其片段的N端部分。通常，四個鏈中的每一個具有在其氨基末端部分的可變(V)區(qū)，其有助于抗原結(jié)合位點，以及恒定(C)區(qū)，其確定同種型。通過許多非共價相互作用和通過二硫4建，輕鏈結(jié)合于重鏈，并且在抗體分子的每個^^中重鏈和輕《連的V區(qū)配X十以產(chǎn)生兩個相同的抗原結(jié)合^f立點。i人為某些氨基酸殘基在輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域之間形成界面[參見Kabat,etal.(1991),SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,NationalInstituteofHealth,Bethesda,Md.andClothiaetal.(1985)，J.Mol.Biol,vol186:651]。值得注意的是，變異性并不是均勻分布于抗體的整個可變結(jié)構(gòu)域，而是集中在輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的三個區(qū)段，稱作"互補決定區(qū)"(CDR)或"高可變區(qū)"?？勺兘Y(jié)構(gòu)域的更高保守部分4皮稱作"骨架區(qū)"(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域各自包括通過三個CDR相連的四個FR區(qū)。在每個鏈中的CDR通過FR區(qū)與來自其它鏈的CDR緊密地保持在一起，從而形成抗體的抗原結(jié)合位點[參見Kabat，etal.(1991),SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,NationalInstituteofHealth,Bethesda,Md.]。共同地，6個CDR均有助于抗體分子對抗原的結(jié)合性能。然而，甚至單個可變結(jié)構(gòu)域(或Fv的一半，Y又包含對抗原特異的三個CDR)也具有識別和結(jié)合抗原的能力[參見Pluckthun(1994)，ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,vol.113，RosenburgandMooreeds.，Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315]。術(shù)語"恒定結(jié)構(gòu)域"是指抗體重鏈或輕鏈的C端區(qū)。通常，恒定結(jié)構(gòu)域并不直接涉及抗體分子與抗原的結(jié)合性能，但呈現(xiàn)各種效應(yīng)子功能，如在抗體依賴性細胞毒性中參與抗體。在這里，"效應(yīng)子功能"是指抗體的不同生理^:應(yīng)(例如，調(diào)理作用、細力包溶解、肥大細胞、嗜石咸性粒細胞和嗜伊紅粒細胞脫粒作用、以及其它過程)，其是通過募集免疫細胞并通過免疫系統(tǒng)的Fc結(jié)構(gòu)域和蛋白質(zhì)之間的分子相互作用所介導(dǎo)的。重鏈的同種型決定抗體的功能特性。它們的特定的功能特性由不伴隨有輕鏈的重鏈的羧基末端部分所賦予。如在本文中所使用的，"抗體片段"是指完整抗體的一部分，其包括完整抗體的抗原結(jié)合位點或可變區(qū)，其中上述部分可以沒有完整抗體的Fc區(qū)的恒定重鏈結(jié)構(gòu)域(例如，CH2、CH3、以及CH4)。可替換地，恒定重鏈結(jié)構(gòu)域(例如，CH2、CH3、以及CH4)的部分可以包括在"抗體片段，，中?？贵w片段的實例是那些保留抗原結(jié)合的4元體片l殳并且包4舌Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、以及Fv片萃殳；只又體分子；三鏈抗體；單鏈抗體分子(sc-Fv);小體、納米抗體、以及形成自抗體片段的多特異性抗體。例如，F(xiàn)ab片段還包含輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(CH1)。術(shù)語"變體"是指一種氨基酸序列，其與抗體的天然氨基酸序列的差別在于至少一個氨基酸殘基或<*飾。天然或親代或野生型氨基酸序列是指在自然界發(fā)現(xiàn)的抗體的氨基酸序列?？贵w分子的"變體"包括但不限于在輕鏈和/或重鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)內(nèi)的變化，包括高變或CDR區(qū)、Fc區(qū)、Fab區(qū)、CH1結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域、CH3結(jié)構(gòu)域、以及4交鏈區(qū)。術(shù)語"特異的"是指抗體選擇性地結(jié)合于其耙表位。可以通過在#會定的一組條件下比專交抗體與所期望抗原的結(jié)合和抗體與不相關(guān)抗原或類似抗原或抗原混合物的結(jié)合來試-瞼抗體分子的結(jié)合特異性。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體會缺乏與不相關(guān)抗原、或甚至靶抗原的類似物的顯著結(jié)合。在本文中，術(shù)語"抗原"是指由抗體分子或結(jié)合于抗原的免疫書于生部分識別和結(jié)合的分子。由抗體結(jié)合的抗原的特異性部分^皮稱作"表位"。"半抗原"是指小分子，其在大多數(shù)情況下并僅當附著于載體分子時，例如，蛋白質(zhì)、聚乙二醇(PEG)、60膠體金、聚硅氧烷珠等，才能誘發(fā)免疫應(yīng)答(即，作為抗原)。載體還可以是并不獨自誘發(fā)免疫應(yīng)答的載體。術(shù)語"抗體"是在廣義上使用，并且包括單克隆、多克隆、多特異性的(例如，雙特異性的，其中，抗體的每個臂對不同表位或相同或不同抗原具有反應(yīng)性)微型抗體、異源共軛物、雙體分子、三鏈抗體、嵌合抗體、和合成抗體，以及特異性地結(jié)合抗原并具有所期望的結(jié)合性能和/或生物學(xué)活性的抗體片段。術(shù)語"單克隆抗體"(mAb)是指抗體、或類似抗體的群，其獲自基本上同型抗體的群，并且并不認為需要通過任何特定的方法來生產(chǎn)抗體。例如，單克隆抗體可以通過由Koher和Milstein(1975)，Nature,vol256:495-497首次描述的雜交瘤方法、或通過重組DNA方法，加以制備。術(shù)語"嵌合"抗體(或免疫球蛋白)是指包含重鏈和/或輕鏈的分子，其相同于或同源于衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類或亞類的抗體中的對應(yīng)序列，而鏈的余余部分相同于或同源于衍生自另一物種或?qū)儆诹硪?元體類或亞類的抗體中的乂十應(yīng)序列，以及上述抗體的片段，只要它們呈現(xiàn)所期望的生物學(xué)活性[Cabillyetal.(1984),下文；Morrisonetal,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6851]。術(shù)語"人源化抗體"是指抗體形式，其包含來自非人(例如，鼠)抗體以及人抗體的序列。人源化抗體可以包括來自相同或不同物種的保守性氨基酸取代或非天然殘基，其并不顯著改變它的結(jié)合和/或生物學(xué)活性。這樣的抗體是嵌合抗體，其包含衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多數(shù)情況下，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體的互補決定區(qū)(CDR)的殘基被來自非人物種(供體抗體)如小鼠、大鼠、^^駝、牛、山羊、或兔的CDR并具有所期望性能的殘基替換。此外，人源化抗體可以包含在受體抗體或在輸入的CDR或骨架序列中均末發(fā)現(xiàn)的殘基。進行這些》務(wù)飾以進一步完善和最大化抗體性能。因此，通常，人源4b抗體將包含至少一個，并且在一個方面包含兩個可變結(jié)構(gòu)域，其中所有或所有的高可變環(huán)對應(yīng)于非人免疫^求蛋白的高可變環(huán)，并且所有或基本上所有的FR區(qū)是人免疫球蛋白序列的那些FR區(qū)。人源化抗體可選地還將包含至少一部分的免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)、或至少一部分的人免疫球蛋白。參見例如，Cabilly等，美國專利第4，816，567號；Cabilly等，歐洲專利第0,125,023Bl號；Boss等,美國專利第4,816,397號；Boss等，歐洲專利第0,120,694Bl號；Neuberger，M.S.等，WO86/01533;Neuberger,M.S.等，歐洲專利第0，194，276Bl號；Winter,美國專利第5,225,539號；Winter,歐洲專利第0,239,400Bl號;Padlan,E.A.等，歐洲專利申請第0,519,596Al號；Queen等(1989)Proc.Nat'lAcad.Sci.USA,vol86:10029-10033)。術(shù)語"雙特異性抗體"可以指對于至少兩個不同表位具有結(jié)合性能的抗體、或單克隆抗體。在一種實施方式中，表位來自相同抗原。在另一種實施方式中，表位來自兩個不同的抗原。用于制備雙特異性抗體的方法在本一支術(shù)領(lǐng)域是已知的。例如，可以利用兩個免疫球蛋白重鏈/輕鏈對的同時表達來重組產(chǎn)生雙特異性抗體?？商鎿Q地，可以利用化學(xué)鍵合來制備雙特異性抗體。雙特異性抗體包括雙特異性抗體片段。術(shù)語"異源共軛抗體"可以指兩個共〗介連4妄的抗體?？梢岳煤铣傻鞍踪|(zhì)化學(xué)中已知的方法來制備上述抗體，包括使用交聯(lián)劑。如在本文中所l吏用的，術(shù)語"共輒物"是指通過一個或多個抗體片^殳或結(jié)合部分共^介附著于一個或多個多聚體分子所形成的分子。術(shù)語"生物活性的"是指抗體或抗體片段，其能夠結(jié)合所期望的表位并且以某種方式施加生物歲文應(yīng)。生物效應(yīng)包括^f旦不限于生長信號的調(diào)節(jié)、抗凋亡信號的調(diào)節(jié)、凋亡信號的調(diào)節(jié)、效應(yīng)子功能級耳關(guān)反應(yīng)的調(diào)節(jié)、以及其它配體相互作用的調(diào)節(jié)。術(shù)語"重組DNA"是指核酸和乂人其表達的基因產(chǎn)物，其已由人加以-沒計、產(chǎn)生、或<奮飾。"重組，，多肽或蛋白質(zhì)是通過重組DNA4支術(shù)產(chǎn)生的多肽或蛋白質(zhì)，例如，乂人通過編石馬所期望多肽或蛋白質(zhì)的外源性DNA構(gòu)成物加以轉(zhuǎn)化的細胞。"合成"多肽或蛋白質(zhì)是那些通過化學(xué)合成制備的多肽或蛋白質(zhì)。術(shù)語"表達框"是指核苦酸分子，其能夠在與序列相容的宿主中影響結(jié)構(gòu)基因(即，蛋白質(zhì)編碼序列，如本發(fā)明的抗體)的表達。表達框包括至少一個啟動子，其可操作連接于多肽編碼序列，以及可選地可才喿作連接于其它序列，例如，轉(zhuǎn)錄終止信號。還可以使用進4亍表達所必要的或有助于表達的其他調(diào)節(jié)元件，例如，增強子。因此，表達框包括質(zhì)粒、表達性載體、重組病毒、任何形式的重組"棵DNA"載體等。抗體的來源并不限于本文說明的那些來源(例如，鼠和人源化鼠抗體)?？梢栽谠S多物種中產(chǎn)生抗體，上述物種包括哺乳動物物種(例如，小鼠、大鼠、駱駝、牛、山羊、馬、豚鼠、倉鼠、綿羊以及兔)和鳥類(鴨、雞)。產(chǎn)生的抗體可以衍生自來自動物(其中它們產(chǎn)生)的不同物種。例如，XenoMouseTM(Abgenix,Inc.,FremontCA)產(chǎn)生全人單克隆抗體。對于某些目的來說，可以使用天然人抗體，如S1P的自身抗體，其分離自可以顯示出一定凌丈價的上述S1P自身抗體的個體。可^^4奐地，人抗體序列文庫可以用來產(chǎn)生包含人序列的抗體。2.應(yīng)用本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防某些疾病和病癥的組合物和方法，其中利用一種或多種治療劑，其改變一種或多種不希望的生物活性脂質(zhì)、或其前體或代i射物的活性或濃度。本發(fā)明的治療方法和組合物是通過改變有效濃度，即，某些不希望的生物活性脂質(zhì)的絕對、相對、有效和/或可用濃度和/或活性，來起作用。降低生物活性脂質(zhì)的有效濃度可以說成是"中和，，耙脂質(zhì)或其不希望的效應(yīng)，包括下游效應(yīng)。在這里，"不希望的，，是指生物活性脂質(zhì)，其由于涉及疾病過程(例如，作為信號分子)而是有害的，或由于有害量的生物活性脂質(zhì)，當過量存在時其有助于疾病。不希望受限于任何特定理論，認為不適當濃度的S1P和/或其^R:射物或下游歲丈應(yīng)子可以引起或有助于各種疾病或病癥的發(fā)展。因jt匕，上述纟且合物和方法可以用來治療這些疾病或病癥，尤其是通過降低特定靶脂質(zhì)，例如，S1P或其變體，的有效體內(nèi)濃度。尤其是，認為，本發(fā)明的組合物和方法可用于治療至少部分地具有以下特征的疾病異常的新血管形成、血管發(fā)生、纖維發(fā)生、纖維化、疤痕、炎癥、以及免疫應(yīng)答。下面描述4姿照本發(fā)明可以治療的若干類疾病的實例。應(yīng)當明了，許多疾病和病癥至少部分地具有多種病理性過程的特4正(例如，病理性新血管形成和癥痕)并且本文^是供了分類是為了描述方便而不是限制本發(fā)明。S1P和高增生'性病癥本發(fā)明的一個方面涉及用于治療高增生性病癥的方法。這些方法包括給予已知或懷疑患有S1P相關(guān)高增生病癥的哺乳動物(例如，牛、犬、馬、綿羊、或豬動物，尤其是人)治療有效量的優(yōu)選在藥用或獸醫(yī)用載體(當所期望的用途可能需要時)中的組合物，該組合物包含干護匸S1P活性的制劑。S1P相關(guān)高增生病癥包括瘤形成、與64內(nèi)皮細月包增殖有關(guān)的病癥、以及與纖維發(fā)生有關(guān)的病癥。最常見;也，瘤形成將是癌癥。與內(nèi)皮細胞增殖有關(guān)的典型病癥是血管發(fā)生相關(guān)病癥，例如，由實體腫瘤、血液腫瘤、以及年齡相關(guān)性黃J迕變性引起的癌癥。與纖維發(fā)生有關(guān)的病癥包括那些涉及異常心臟重塑的病癥，如心力衰竭。存在許多已知的高增生病癥，其中各種組織和器官的細胞呈現(xiàn)生長、增殖、遷移、信號、衰老、以及死亡的異常才莫式。雖然已開創(chuàng)了許多治療方法來治療這些疾病中的一些，但許多疾病仍然在很大程度上是不能用現(xiàn)有技術(shù)治療的，而在其它情況下，雖然在治療中有效的，但它們經(jīng)常不是最佳的并且很少能治愈。癌癥也許是最廣泛i人識的一類高增生病癥。癌癥是-皮壞性類型的疾病，并且它們一起具有^又次于心血管疾病的死亡率。^午多種癌癥并沒有在分子水平上充分理解。因此，癌癥是美國政府和制藥公司的研究和開發(fā)計劃的主要工作重點。結(jié)果是空前的R&D努力以及許多有〗介值治療劑的生產(chǎn)以幫助4氐抗癌癥。不幸的是，許多癌癥研究還沒有足以克服由癌癥引起的顯著損傷?！恫嬖诿绹?，每年"^斷有一百萬以上的癌癥新病例并且有五十萬以上的死亡。這顯著地說明，即使已進行了巨大努力來發(fā)現(xiàn)癌癥的新療法，但抵抗疾病的有效治療劑仍然是難以捉摸的。目前主要用三種療法(外科手術(shù)、》丈射治療、以及化療)之一或組合來治療癌癥。外科手術(shù)涉及大量除去病變組織。雖然外科手術(shù)有時可有效除去位于某些部位(例如，胸部、結(jié)腸、以及皮膚)的腫瘤，但它不能用于治療位于其它區(qū)域(如脊柱)的腫瘤，也不能用于治療彌散性胂瘤性病癥如白血病。放射治療涉及將活組織暴露于電離輻射，其引起所暴露細胞的死亡或損傷。i文射治療的副作用可以是急性的和臨時的，雖然其它副作用可以是不可逆的?；熒婕凹毎麖?fù)制或細胞代謝的破壞。其他的危害是目前的治療劑通過涉及對患者而言明顯的缺點(毒性以及嚴重的副作用)。因此，許多專家小組最近已開始尋找新方式來4氏抗癌癥。這些新的所謂的"創(chuàng)新療法"包括基因治療和治療性蛋白如單克隆抗體。在臨床上首次用于治療癌癥的單克隆抗體是于1997年提出的Rituxan(利妥昔單抗)，并且已i正明生物特異性單克隆抗體可用作治療劑。因j):匕，并不意外i也，其后已i人可16種其它單克隆*元體用于臨床，其中包4舌6種用于治療癌癥。這些產(chǎn)品的成功，以及和小分子相比，開發(fā)單克隆抗體的減少的成本和時間，已使得單克隆抗體治療成為小分子以后的第二最大類型的藥物候選物。另外，與小分子療法相比，就效力和毒性而言，抗體的靈敏的特異性已證明是一個主要優(yōu)點?！接謱τ诎┌Y來"i兌，目前有270項以上的工業(yè)抗體R&D計劃，其中50家以上的乂>司參與開發(fā)新的癌癥抗體治療。因此，單克隆抗體隨時準備著成為治療癌癥的主要角色并且估計它們將獲得越來越大的癌癥治療市場的份額。促進腫瘤生長和存活的細胞外介質(zhì)的鑒定是發(fā)現(xiàn)治療性干預(yù)的關(guān)4建步驟，其中治療性干預(yù)將降低癌癥的發(fā)病率和死亡率。如下所述，鞘氨醇-l-磷酸(SlP)，鞘脂信號級聯(lián)放大的一種關(guān)4建成分，被認為是多效的、致癌的生長因子。通過刺激細胞增殖、細胞存活以及轉(zhuǎn)移，S1P可促進腫瘤生長。通過支持內(nèi)皮細胞的遷移和存活(當它們在腫瘤內(nèi)形成新血管時)，S1P還促進腫瘤血管發(fā)生?？偟膩碚f，S1P引發(fā)增生、促血管再生、以及抗凋亡事件，其有助于癌癥進展。因此，調(diào)節(jié)，尤其是降低體內(nèi)S1P水平的療法將有效治療癌癥。研究表明，鞘氨醇激酶(SPHK)是一種最近證實的癌基因，該癌基因產(chǎn)生一種細胞外鞘脂信號分子，促進腫瘤生長的鞘氨醇-l-石粦酸(S1P)。與腫瘤細月包增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)SIP的生長因子作用、以及SIP的促血管再生效應(yīng)會直4妻和間接地促進腫瘤生長。本發(fā)明申請人已產(chǎn)生了一種生物特異性單克隆抗S1P抗體(抗SlPmAb),其可以用作治療性分子海綿來選4奪性地吸收S1P，乂人而降〗氐腫瘤生長因子的胞外濃度，并預(yù)計減小腫瘤容積和轉(zhuǎn)移潛能并同時阻斷新血管形成，否則會給養(yǎng)生長中的腫瘤。上述分子吸收概念的預(yù)計的成功將是治療癌癥的創(chuàng)新方式。如以下,殳落將i兌明的，本發(fā)明的申"i青人已開發(fā)了一種mAb,其抵抗一種重要的腫瘤生長因子，鞘氨醇-l-磷酸(S1P)。本發(fā)明的申請人相信，這種抗體可以有效降低與許多癌癥類型有關(guān)的增殖、轉(zhuǎn)移潛能以及血管發(fā)生，從而降低一般的癌癥以及伴隨上述疾病的腫瘤血管發(fā)生。鞘磷脂酶(nSMase)的中性形式是鞘脂信號通路的關(guān)鍵早期成分(Chatterjee,Adv.LipidRes.26:25-46,1993;Liu,Obein,andHan薩，Semin.CellDev.Biol.8:311-322,1997)。nSMase僅是已鑒定的至少5類SMase之一，其包括石威性的、酸性的、酸性鋅依賴性的、中性4美依賴性的、以及與中性4美無關(guān)的(Liu，Obein,andHannun，Semin.CellDev.Biol.8:311-322,1997)。nSMase類通常與表面膜有關(guān)(Das,Cook,andSpence，BiochimBiophysActa777:339-342,1984;Dobrowsky,CellSignal12:81-90，2000)并且可以由各種刺激來激活以引起凋亡，如促炎細胞因子、腫瘤壞死因子ot(TNFa)(Segui,etal,J.Clin.Invest.108:143-151，2001)、T細胞受體(Tonnetti,etal.，J.Exp.Med189:1581-1589,1999)、電離輻射(Haimovitz-Friedman，etal.，J.Exp.Med180:525-535，1994)以及蒽3不霉素4元月中瘤藥(Andrieu國Abadie，etal"FASEBJ.13:1501-1510,1999)。在許多細月包類型中，包4舌癌細月包系(Andrieu-Abadie,etal.,FASEBJ.13:1501-1510,1999;HamumandObein,TrendsinBiol.Sci.20:72-76，1995;Kolesnick，trendsBiochemSci24:224-5,1999;Obeid，etal"Science259:1769-1771，1993)、肺瘤壞死因子ot(TNFa)是眾所周知的nSMase(Adam，etal"J.BioChem271:14617-14622,1996;Dressier,Mathias，andKolesnick,Science255:1715-1718,1992;Kim,etal"J.Biol.Chem.266:1:484-489,1991;Kronke，ChemPhysLipids102:157-66.,1999;YanagaandWatson，F(xiàn)EBSLetters314:297-300,1992)、CER生產(chǎn)(Kronke,ChemPhysLipids102:157-66.,1999)以及凋亡(RathandAggarwal,J.Clin.Immimo.19:350-364,1999;Robaye，etal"AmJPathol138:447-453，1991;Takedaetal"Int.Immunol.5:691-694，1993)的激活劑，并且已表明nSMase的激活對于TNFa誘導(dǎo)凋亡是關(guān)鍵的(Luberto,etal"J.Biol.Chem.277:41128-41139，2002;Segui，etal"J.Clin.Invest.108:143-151，2001)。因jt匕，nSMase也已成為藥4勿研發(fā)的目才示(WascholowskiandGiannis，DrugNewsPerspect.14:581-90,2001)。通過鞘氨醇激酶(SPHK)的作用，由SPH產(chǎn)生鞘脂信號分子，S1P。已鑒定了上述酶的兩種亞型，SPHK1和SPHK2(Liu,JBiolChem275:19513-20,2000;Nava，etal,ExpCellRes281:115-127，2002)。雖然CER和SPH通常與凋亡有關(guān)，但相反地SIP是細胞增殖和生存途徑激活的介質(zhì)(An,AnnNYAcadSci905:25-33,2000;Maceyka,etal"BBA1585:193-201，2002;Zhang，etal"J.CellBiol.114:155-167,1991)。最近已明了它作為一種細胞外介質(zhì)，可以激活屬于S1P/LPA受體家族的一組G蛋白耦聯(lián)受體(GPCR),以前稱作Edg受體(An,AnnNYAcadSci905:25-33,2000;An,Goetzl,andLee，J.cellbiochem30/31:147-157，1998;Lee,etal.，Science279:1552-1555,1998;Okamoto,etal"Biochem.Biophys.Res.Commun.260:203-208，1999);然而，也已指出了SIP的月包內(nèi)作用(VanBrocklyn，etal.,J.CellBiol.142:229-240,1998)。jt匕夕卜，已4是示，CER/SPH水平與SIP之間的平纟軒可4是供一種可調(diào)才幾制，其決定細胞被送入死亡通路或免于凋亡(Kwon，etal"JBiolChem276:6810627-10633，2001;Maceyka,etal.,BBA1585:193-201，2002;Pyne，BiochemJ.349:385-402,2000)。可調(diào)機制的關(guān)4建調(diào)節(jié)酶是SPHK,其作用是將促進死亡的鞘脂(CER/SPH)轉(zhuǎn)化成促進生長的S1P。首次提出SPHK作為癌基因的劃時代的研究由來自阿德萊德(Adelaide)的小組發(fā)表，其證明了用激酶穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NIH-3T3成纖維細力包呈現(xiàn)增強的細力包增殖并〗半隨增加的S1P產(chǎn)生(VadasandGamble,Circ.Res.79:1216-1217,1996;Xiaetal"CurrBiol10:1527-1530，2000)。此夕卜，SPHK過表達逃逸的接觸抑制，一種由轉(zhuǎn)化細胞通常呈現(xiàn)的性能。此觀測結(jié)果與最近的報道一致，該報道表明S1P可增強所選人癌細胞系的轉(zhuǎn)移潛能(Igarashi,Ann.N.Y.Acad.Sci.845:19-31，1998;Takuwa，BiochimBiophysActa.1582:112-120,2002)。此外，當皮下注入NOD/SCID小鼠中時，轉(zhuǎn)染子產(chǎn)生肺瘤。在一項研究中最近i正實了這些結(jié)果，該研究表明腹腔內(nèi)給予SPHK的小分子抑制劑可以使接受皮下注射JC乳腺腺癌細胞的SCID小鼠體內(nèi)的月中瘤容積減小(French,etal,CancerRes63:5962-5969,2003)。顯著地，SPHK可以是新的致癌基因的觀點由以下發(fā)現(xiàn)得以鞏固SPHK在許多實體腫瘤中被過表達，如胸部、結(jié)腸、肺臟、卵巢、胃、子宮、腎、以及直腸的那些實體腫瘤(Frenchetal.(2003),上文)。此外，已證明，當用SPHK小分子抑制劑治療時若干人肺瘤源性細力包系可以#1驅(qū)動到凋亡，并且可以通過它們降低S1P水平的能力來說明它們的有效性。總的來說，這些發(fā)現(xiàn)證明了一種重要的觀點SIP是可能由腫瘤細胞本身產(chǎn)生的生長因子，以及降低SIP的濃度可以引起在生長因子撤除后所觀測到的凋亡。SIP和腫瘤血管發(fā)生血管發(fā)生是一種過程，借助于該過程新血管形成自存在的脈管系統(tǒng)。血管發(fā)生在若干生理過程中具有關(guān)4建作用并且與各種病癥(包括腫瘤生長、侵襲以及轉(zhuǎn)移)的發(fā)病機制有關(guān)。與實體和循環(huán)肺瘤有關(guān)的血管發(fā)生過程(肺瘤血管發(fā)生)被認為是腫瘤發(fā)生和疾病發(fā)展的關(guān)鍵組成部分，其中與非癌性細胞相比，新血管為腫瘤細月包才是供生長優(yōu)勢。因此，對于治療癌癥和其它血管發(fā)生相關(guān)性疾病來說，血管發(fā)生的臨床控制是關(guān)鍵組成部分?？寡苄纬芍委熓侨藗兲貏e關(guān)注的，因為血管內(nèi)皮細胞(EC)并不和癌細胞一樣容易突變；因此與癌細胞相比，EC獲得對長期治療的抗性的可能更小，/人而4吏它們成為治療的良好的;昝在目標。若干生長因子與癌性血管發(fā)生有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，生物脂鞘氨醇-l-磷酸(SIP)是對于癌癥來說重要的許多細胞過程的介質(zhì)。作為G蛋白耦聯(lián)受體家族的特異性配體(稱作SlPw)而施加其大部分效應(yīng)。這些受體調(diào)節(jié)血管發(fā)生和血管成熟、細力包運動、以及'淋巴細月包運輸。與S1P相反，S1P的前體，鞘氨醇和神經(jīng)酰胺，與生長停滯和凋亡有關(guān)。最后，在S1P和其它促血管再生生長因子(如VEGF、EGF、PDGF、bFGF以及IL-8)之間存在復(fù)雜的通訊。通過結(jié)合于受體SlPpS1P反式激活生長因子受體酪氨酸激酶，如在VEGFR、EGFR、以及PDGFR上發(fā)現(xiàn)的生長因子受體酪氨酸激酶。S1P在血管發(fā)生相關(guān)性腫瘤中的重要性使得S1P成為癌癥治療的特定目標?；谶@些觀測結(jié)果，用來中和胞外S1P的抗體方式可以導(dǎo)致在人類中癌癥發(fā)展的顯著降低，這是由于血管形成的抑制以及支持腫瘤生長所需要的營養(yǎng)物和氧的伴隨損失。此外，最近的研究指出，許多血管發(fā)生抑制劑還可以作為還能夠有助于緩解癌癥擴散到遠離最初腫瘤的部位的抗4曼襲和反轉(zhuǎn)移化合物。涉及S1P作為最有效的促血管再生劑之一的最近的證據(jù)來自直接比較S1P與制劑如VEGF和bFGF的研究。S1P刺激人靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)的DNA合成和趨化能動性，同時誘導(dǎo)多細胞結(jié)構(gòu)的分化，所有這些都暗示了S1P在早期血管形成中的作用(Argraves,etal.，2004;Leeetal.,1999;Liu，etal"2000)。jt匕夕卜，S1P促進骨髓源性EC前體遷移到新血管形成部位(Annabi,etal.,2003))。過表達SIP!的細胞對抗血管形成劑沙利度胺和新伐司他具有4元斗生(Annabietal.,2003)。ot匕夕卜，已i正曰月，在S1P和其它促血管再生生長因子(3口VEGF、EGF、PDGF、bFGF以及IL-8)之間存在顯著的通ifl。侈'W口，S1P反式5致5舌EGF(Shida，eta1.，2004)和VEGF2受體(Spiegel&Milstien,2003)，以及VEGF正調(diào)節(jié)SlPi受體表達(Igarashi，etal.，2003)。l匕夕卜，4昔Ji力于S1P!和"VEGF軸"起作用的S1P是下月支血管發(fā)生和新血管形成所需要的(Chae,etal.,2004)。最近FDA批準的抗血管形成藥，貝伐單抗(Avastin⑧，Genentech)，作為細胞毒性化療的添加劑來治療結(jié)腸癌，治療癌癥的抗血管形成方式已獲得很大進展。最近開發(fā)了抗SlP小鼠MAb，LT1002,其對于S1P具有高結(jié)合親和力和特異性。研究表明，在人癌癥的若干動物模型中LT1002可顯著放慢胂瘤發(fā)展和伴隨的血管發(fā)生。此外，在年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)的血管發(fā)生的既定模型中，LT1002減弱脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)病變形成。CNV發(fā)生在其中存在布魯赫膜和視網(wǎng)月莫色素上皮的異常的疾病中。這種類型的最常見疾病是AMD，在老年患者中嚴重視力喪失的最常見的原因。這些結(jié)果表明，LT1002具有若干作用機制，包括(1)對腫瘤細胞生長的直接影響，(2)對血管內(nèi)皮細月包的間^妻抗血管生成效應(yīng)，以及(3)防止其它促血管再生生長因子釋方文和作用的間*接抗血管形成效應(yīng)。S1P有助于胂瘤血管發(fā)生的最直接的體內(nèi)證據(jù)來自我們最近的集中于小鼠單克隆抗體(mAb)的出片反物，其中，通過分子p及收，小鼠單克隆抗體(mAb)用來中和胞外S1P(Visentin,etal.，2006)。在利用HUVEC進行的各種體外測定中，抗S1PmAb中和管形成、血管內(nèi)皮細胞的遷移以及4吏細胞免于死亡的保護，其中的每一種都是SIP誘導(dǎo)的。SIP增加新的毛細血管生長進入植入小鼠體內(nèi)的基質(zhì)才全(Matrigel^全)，一種通過系統(tǒng)纟會予4元S1PmAb力口以中和的#丈應(yīng)。在鼠Matrigel栓子試驗中，上述mAb基本上中和bFGF誘導(dǎo)以及VEGF誘導(dǎo)的血管發(fā)生，并且抗體緩和的S1P刺激體外和體內(nèi)從腫瘤細胞釋》文促血管再生細胞因子(VEGF、IL-8、IL-6)。重要的是，在用抗SlPmAb進行治療的情況下，用位于同位的人癌細胞異種拼接的小鼠呈現(xiàn)腫瘤進展的顯著遲緩。這在人乳腺癌、卵巢癌以及肺癌的小鼠模型中以及在小鼠黑素瘤一種同種異體拼接模型中得到證明(Visentin，etal.，2006)。用單克隆抗體(mAb)來治療性治療各種疾病和病癥正快速增加，這是因為它們已顯示出是安全且有效的治療劑。認可的治療性mAb包4舌Avastin⑧、Erbitux⑧、以及Rituxan⑧。另夕卜的mAb處于針對各種疾病的臨床開發(fā)的不同階段，其中大多數(shù)靶向各種形式的癌癥。通常，在非人哺乳動物中產(chǎn)生單克隆抗體。然而，鼠單克隆抗體的治療效用是有限的，主要由于以下事實病人利用(mount)他們自身對鼠抗體的抗體反應(yīng)。這種反應(yīng)，所謂的HAMA(人抗鼠抗體)反應(yīng)，導(dǎo)致鼠mAb的最終中和和迅速消除。通過開發(fā)稱作鼠抗體的"人源化"方法已克服了這種限制。人源化大大地減輕了相對于給予的治療性mAb的免疫應(yīng)答的發(fā)展，乂人而避免因HAMA而引起的半衰期的縮短和治療效力的降低。在大多數(shù)情況下，人源化方法包4舌將鼠互補決定區(qū)(CDR)4并*接到人免疫3求蛋白的骨架區(qū)(FR)。這種策略稱作"CDR拼接"。在人FR中的所選殘基"回復(fù)突變"到小鼠氨基酸殘基是經(jīng)常需要的以恢復(fù)在最初拼接構(gòu)造物中喪失的親和力。mAb的制造是一個復(fù)雜過程，其起因于蛋白質(zhì)本身的變異性。mAb的變異性可以凈皮局限于蛋白質(zhì)主鏈和/或石灰水化合物部分。異質(zhì)性可以歸因于可替換的二疏4建配對的形成、脫酰胺和異天冬氨酰殘基的形成、蛋氨酸和半胱氨酸氧化作用、N端谷氨酰胺殘基環(huán)化成焦谷氨酸以及通過哺乳動物羧肽酶的C端賴氨酸的部分酶裂解。通常對抗體分子進行設(shè)計以改善它們的性能，如增強的穩(wěn)定性、對蛋白酶的抗性、聚集行為，以及增強在異源系統(tǒng)中的表達水平。在本文中，描述了小鼠MAb相對于S1P的人源化。總策略包括將來自LT1002的6個CDR拼接到人骨架。進一步的修飾用來進一步完善和優(yōu)化抗體性能。人源化MAb呈現(xiàn)和LT1002相同的特性，因此適用于在臨床試驗中進行試驗。S1P和纖維4匕在響應(yīng)細胞損傷和炎癥的瘢痕形成中，成纖維細胞，尤其是肌成纖維細胞，是關(guān)4建細胞元件[Tomasek，etal.(2002),NatRevMolCellBiol,vol3:349-63，以及ViragandMurry(2003)，AmJPathol，vol163:2433-40]。通過肌成纖維細胞的膠原基因表達是重建標志并且是瘢痕形成所還需要的[SunandWeber(2000),CardiovascRes,vol46:250-6，以及SunandWeber(1996),JMolCellCardiol,vol28:851-8]。通過激活成纖維細"包遷移和增殖同時增加"交原生產(chǎn)，SIP可以促進傷口愈合[Sun,etal.(1994)，JBiolChem,vol269:16512-7]。由受損細力包局部產(chǎn)生的SIP可能是與重建和瘢痕形成有關(guān)的不適當傷口愈合的原因。因此i人為，SIP抑制劑可用于治療至少部分地特4正為異常的纖維發(fā)生或纖維化的疾病或病癥。在本文中，"纖維發(fā)生，，#1定義為成纖維細^>的過度活性或過多凄1目，以及"纖維化"被定義為過度活性或過多數(shù)目的成纖維細胞，其導(dǎo)致過度或不適當?shù)?交原生產(chǎn)和疤痕、生理組織結(jié)構(gòu)的》皮壞和/或基質(zhì)的不適當收縮，其引起這樣的病理特征如視網(wǎng)膜脫落或?qū)е聯(lián)p害器官功能的其它過程。SIP和成纖維細胞膠原表達SIP促進休眠成纖維細胞分化成活性肌成纖維細胞，其在瘢痕形成期間呈現(xiàn)增強的膠原表達[Umta,etal.(2005)，KobeJMedSci，vol51:17-27]。成纖維細胞增殖和遷移到疤痕區(qū)的同時，肌成纖維細胞沉積主要由骨橋蛋白和纖連蛋白構(gòu)成的臨日寸茅貞斗立網(wǎng)纟各[SunandWeber(2000)，CardiovascRes,vol46:250-6]。當重建進行時，臨時基質(zhì)被吸收并建立起膠原網(wǎng)絡(luò)[SunandWeber(2000),CardiovascRes，vol46:250-6]。我們已i正明了，SIP促進通過肌成纖維細胞的膠原生產(chǎn)。已表明，TGFp,—種眾所周知的纖維變性介質(zhì)，正調(diào)節(jié)若干促纖維化蛋白、將成纖維細胞轉(zhuǎn)化成肌成纖維細胞以及刺激炎性蛋白表達(可能通過SIP的作用)[Squires,etal.(2005)，JMolCellCardiol，vol39:699-707以及Butt，LaurentandBishop(1995),EurJCellBiol,vol68:330-5]。TIMP1(與將成纖維細力包TGFp刺激分化成力幾成纖維細力包有關(guān)的一種信號分子)的正調(diào)節(jié)^皮4十對SPHK1的siRNA阻斷[Yamanaka,etal"JBiolChem.2004Dec24;279(52):53994-4001],這^是示抗SIP抗體的人源化變體可以i爰解TGFP的促纖維化效應(yīng)以及纟爰和SIP本身的纖維發(fā)生歲文應(yīng)。將不適當^痕降低到最小程度被認為可用于治療纖維變性性疾病和病癥，包括]旦不限于眼和心血管疾病、傷口愈合、以及石更皮病。用于治療》更皮病的抗SIP抗體本發(fā)明的組合物和方法將可以用于治療這樣的病癥和疾病，其至少部分地特征為異常的新血管形成、血管發(fā)生、纖維發(fā)生、纖維化、疤痕、炎癥、以及免疫應(yīng)答。一種這樣的疾病是硬皮病，其還稱作系統(tǒng)性硬/化病。74石更皮病是一種自身免疫病，其引起疤痕或皮月夫增厚，并且有時涉及身體的其它區(qū)域，包括肺臟、心臟、和/或腎。石更皮病的特4正在于在身體的皮膚和器官中形成瘢痕組織(纖維化)，其可以導(dǎo)致所涉及區(qū)域的增厚和堅實，以及隨之發(fā)生的功能降低。4艮據(jù)美國硬皮病基金會(SclerodermaFoundation)的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，目前有約300,000美國人患有-更皮病。三分之一或更少的受感染的患者患有普遍疾病，而其余的三分之二主要具有皮膚癥狀。當該疾病侵襲肺臟并引起疤痕時，呼吸可能會受到限制，這是因為肺臟不再能如它們應(yīng)該的那樣進行擴張。為了測量肺活量，醫(yī)生使用了一種用來估計用力肺活量(FVC)的裝置。在FVC小于50%的預(yù)期的人群中，起因于石更皮病相關(guān)的肺部疾病的10年死亡率為約42%。死亡率如此高的一個原因是目前沒有有效的治療方法。如在本申請的實施例中所描述的，現(xiàn)有證據(jù)表明，S1P是一種促纖維化生長因子，其可以有助于成纖維細胞激活、增殖、以及增加的與不適當癥痕和重建有關(guān)的成纖維細胞活性。此外，已證明了S1P在皮月夫和其它類型成纖維細月包的活性中的潛在作用。例如，已表明，生物活性脂質(zhì)可刺激鼠皮膚成纖維細胞的遷移(Hama,etal,JBiolChem.2004Apr23;279(17):17634-9),以及人皮月夫成纖維細月包表達若干SIP受體亞型(Zhang,etal.，Blood.1999Mayl;93(9):2984-90)。除SIP對成纖維細胞活性的許多直接影響之外，SIP還可以具有對成纖維細l包活性的許多潛在的間4妄影響。例如，SIP可以促進其它眾所周知的促纖維化因子的作用，如TGF-P和血小板衍生生長因子(PDGF)。TGF-J3是纖維化的最廣泛研究和識別的促成因素之一(Desmouliere,etal.,/Ce〃122:103-111，1993)。TGF-卩正調(diào)節(jié)SphKl表達和活'性，導(dǎo)致金屬蛋白酶1(TIMP-1)的組織抑制劑的表達增加，金屬蛋白酶1(TIMP-1)是一種抑制ECM降解的蛋白質(zhì)(Yamanaka，etal.，/5/o/CTzew279:53994-54001,2004)。TIMP-1的表達增加與心力衰竭患者的間質(zhì)纖維化和舒張功能不全有關(guān)(Heymans,etal,AmJ/^Ao/166:15-25,2005)。相反地，S1P刺激TGF畫(3的表達和釋》文(Norata，etal.,CV"w/"/,'ow111:2805-2811,2005)。還存在S1P和PDGF之間交互作用的不同證據(jù)。S1P直接刺激PDGF的表達(Usui，etal,/C/zem279:12300-12311,2004)。此外，SlPi受體和PDGF受體彼此結(jié)合并且它們的締合是下游信號的PDGF激活所必須的，其中下游4言號有助于各種細力包類型的增殖和遷移(Long,etal.，/Vostag/amZ/m1(9AerZ^/iMWaZ80:74-80,2006;Baudhuinetal"FasebJ18:341-343,2004)。因ot匕，TGF-p和PDGF只t纟千纟lM匕的f》響可以部分地起因于與S1P信號通3各的交互作用。因此，本發(fā)明的組合物和方法可以用來治療石更皮病，尤其通過降^f氐特定草巴脂質(zhì)(例如S1P)的有歲丈體內(nèi)濃度用來治療石更皮病。人們認為相對于PDGF受體的刺激性自身抗體會加劇系統(tǒng)性硬皮病(Baroni，etal"NEnglJMed.2006v354(25):2667-76)，并且在硬皮病成纖維細胞響應(yīng)TGF-j3中，PDGF受體被正調(diào)節(jié)(Yamakage，etal.，JExpMed.1992Mayl;175(5):1227-34)。由于SIP、PDGF以及TGF-P信號系統(tǒng)之間顯著的交互作用，用抗S1P劑(例如，抗SIPmAb)阻斷SIP生物活性可以間接緩和PDGF和TGF-j3的促石更化效應(yīng)。此夕卜，用這4羊的抗SIP劑進行治療可以有益于硬皮病患者，其中通過S爰和S1P》十皮膚和其它形成的成纖維細月包(其有助于疾病進展)的直接影響。SIP和目艮部疾病以及病癥病理性或異常的血管發(fā)生/新血管形成、異常的重建、纖維化和皰痕以及炎癥的發(fā)生伴有視網(wǎng)膜和眼部疾病，如年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、糖尿病性^L網(wǎng)膜病(DR)、以及早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病(ROP)和其它發(fā)育障石尋[Eichler，etal.(2006),CurrPharmDes,vol12:2645-60]，并且是眼部感染和機械損傷的結(jié)果[Ciulla,etal.(2001),CurrOpinOphthalmol,vol12:442-9以及Dartetal(2003),Eye,vol17:886-92]。人們認為，針對SIP的抗體將可用于治療這樣的眼部疾病，其中病理性或異常的血管發(fā)生/新血管形成、異常的重建、纖維化、以及皰痕或炎癥是組成部分。眼部的血管發(fā)生/新血管形成在各種臨床病癥中，病理性眼血管發(fā)生是失明的主要原因。脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)發(fā)生在許多眼部疾病中，其中最常見的是、滲出性或"濕，，形式的AMD。由于老年人口增加，在西方國家的60歲以上的患者中，AMD是一種現(xiàn)代流行病并且是失明的主要原因。盡管由AMD引起的流行的視力減退，但僅有幾種療法，大部分是基于抗VEGF,可以放緩AMD的發(fā)展并且僅有甚至更少的療法可以逆壽爭^L力減退[BylsmaandGuymer(2005),ClinExpOptom,.vol88:322-34,Gryziewicz(2005)，AdvDrugDelivRev，vol57:2092-8,以及LiuandRegillo(2004)，CurrOpinOphthalmol,vol15:221-6]。因此，研發(fā)用于病理性新血管形成的新治療方法是非常重要的。在描述與異常的血管發(fā)生/新血管形成、異常的重建、纖維化和宛痕、以及炎癥有關(guān)的眼病癥中，本文中的AMD僅用于說明的目的，上述病癥存在于其它眼部疾病和病癥中(如本文中4皮露的并要求夂f呆護的)。AMD涉及年齡相關(guān)病理性變4匕[Tezel，Bora，andKaplan(2004),TrendsMolMed,vol10:417-20以及Zarbin(2004)，ArchOphthalmol,122:598-614]。盡管存在多種理論，《旦AMD的確切病因和發(fā)病^L制仍然不十分明了。老化與累積性氧化損傷、布魯赫膜增厚以及玻璃疣形成有關(guān)。氧化應(yīng)激導(dǎo)致對視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細胞并且在某些情況下導(dǎo)致對脈絡(luò)膜毛細血管層的損傷[Zarbin(2004)，ArchOphthalmol,vol122:598-614，以及Gorin,etal.(1999),MolVis,,vol5:29]。對RPE的損傷可能在布魯赫膜和脈絡(luò)膜內(nèi)誘發(fā)寸曼性炎性應(yīng)答[Johnsonetal.(2000)，ExpEyeRes，，vol70:441-9]。通過刺激CNV和萎縮，這種損傷和炎癥會助長并增強(potentate)一見網(wǎng)月莫損傷[Zarbin(2004),ArchOphthalmol,vol122:598-614，以及Witmer,etal.(2003),ProgRetinEyeRes,vol22:1-29〗。CNV導(dǎo)致缺損和、滲漏的血管(BV)，其可能一皮識別為傷口[KentandSheridan(2003),MolVis，vol9:747-55]。傷口愈合源于脈絡(luò)膜并通過布魯赫膜和RPE侵入視網(wǎng)膜下腔。傷口愈合反應(yīng)的特征在于典型的早期炎性應(yīng)答，顯著的血管源性應(yīng)答以及組織形成，接著是所有參與要素的終末期成熟。傷口重建會不可逆地損害光感受器和RPE，/人而i正明需要用比抗血管形成療法更多的療法來治療CNV[LaCour，Kiilgaard，andNissen(2002),DrugsAging,vol19:101-33.12]。由CNV相關(guān)纖維化、水胂以及炎癥(單獨地或累加地)所引起的正常視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜下結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致AMD相關(guān)^L覺喪失[TezelandKaplan(2004),TrendsMolMed，vol10:417-20，以及Ambati,etal.(2003),SurvOphthalmol,vol48:257-93]。與滲出性AMD有關(guān)的多種細胞和細胞因子相互作用使有效治療方法的尋找更加復(fù)雜化。雖然通過抗VEGF療法可以部分地控制CNV和7jc腫，^旦還沒有適當?shù)?是出可能的治療方法來1￡和瘢痕形成和炎癥[BylsmaandGuymer(2005)，ClinExpOptom，vol88:322-34，以及Pauleikhoff(2005),Retina,vol25:1065-84]。只要新生血管復(fù)合體仍然是完整的，如在用抗VEGF劑治療的患者中似乎就是這種情況，視網(wǎng)膜下纖維化和未來的視力減退的潛力就會持續(xù)?？筕EGF-A療法是治療滲出性AMD的最近的顯著的進展。然而，用哌加他尼(PEGAPTANIB)(—種高親合力適體，其選擇性地抑制VEGF-A的165亞型)進行的第三階段視覺試驗證明，一般患者會繼續(xù)喪失視力而僅少部分患者獲得了視覺[Gragoudas，etal.(2004)，NEnglJMed,vol351:2805-16]。用抗體片段78RANIBIZUMAB抑制VEGF-A的所有亞型(全VEGF抑制)產(chǎn)生了令人印象更為深刻的結(jié)果[Brown，etal.,NEngMed(2006),vol.355:1432-44，Rosenfeld，etal.NEngJMed(2006)，vol.355:1419-31]。2年MARINA試-驗和1年ANCHOR試-驗i正明，大約40%的患者獲得一些一見力增加。雖然這些結(jié)果表示在我們治療^l^出性AMD的能力方面的較大進展，但這也證明了60%的患者并沒有視力改善。此外，這些患者必須滿足嚴格規(guī)定的選擇標準和淘汰標準。在更大患者群體中的結(jié)果不那么有效。仍然存在意義明確的需要來開發(fā)靶向CNV發(fā)展中的其它步驟以及最終導(dǎo)致光感受器破壞過程的其他治療劑。首先，脈絡(luò)膜BV的生長涉及許多介質(zhì)(并不只是VEGF)之間的協(xié)調(diào)的相互作用，這提供了一種調(diào)節(jié)或抑制整個過程的機會[Gragoudas，etal.(2004),NEnglJMed，vol351:2805-16]。其次，滲出性AMD由血管成分和血管外成分組成。血管成分涉及血管內(nèi)皮細胞(EC)、EC前體以及周細胞。容積上似乎是最大成分的血管外成分由炎性細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、以及4見網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細胞和成纖維細胞組成。組織損傷可以起因于4壬4可一種成分。目前的抗VEGF治療并沒有著眼于病理過禾呈的這些其它方面。輩巴向與AMD有關(guān)的生血管級聯(lián)反應(yīng)的另外的要素可以提供一種更有效和協(xié)同的治療方式[Spaide，RF(2006)，AmJOphthalmol,vol141:149-156]。目艮部疾病中的炎癥越來越多的證據(jù)表明，炎癥，具體地說巨噬細胞和補體系統(tǒng)[Klein，etal.(2005),Science,vol308:385-9;以及Hageman，etal.(2005),ProcNatlAcadSciUSA,vol102:7227-32]在滲出性AMD的發(fā)病機制中具有重要作用。手術(shù)切除的脈絡(luò)膜新生血管膜的組織病理學(xué)i正明了巨p藍細月包幾乎普遍存在[Grossniklaus，etal.(1994)，Ophthalmology,vol101:1099-111，以及Grossniklaus,etal.(2002),MolVis,vol8:119-26]。越來越多的i正據(jù)表明，巨噬細月包可以通過多種步文應(yīng)在介導(dǎo)CNV形成和增殖中發(fā)4軍積才及作用[Grossniklaus,etal.(2003)，MolVis,vol8:119-26;Espinosa-Heidmann,etal.(2003),InvestOphthalmolVisSci，vol44:3586-92;Oh，etal.(1999)，InvestOphthalmolVisSci,vol40:1891-8;Cousins,etal.(2004)，ArchOphthalmol,vol122:1013-8;Forrester(2003),NatMed,vol9:1350-1，以及Tsutsumi,etal.(2003),JLeukocBiol，vol74:25-32]0，這些效應(yīng)包括分泌酶，該酶可以損傷細胞并降解布魯赫膜以及釋放促血管再生細月包因子[Otani,etal.(1999)，OphthalmolVisSci，vol40:1912-20,以及Amin，Puklin,andFrank(1994),InvestOphthalmolVisSci，vol35:3178-88]。在損傷部位，巨噬細胞呈現(xiàn)激活的樣i形態(tài)跡象，如脫粒作用[Oh,"(1999)，InvestOphthalmolVisSci,vol40:1891-8,以及Trautmannaa/.(2000)，JPathol，vol190:100-6]。因此，認為限制巨噬細胞浸潤進入脈絡(luò)膜新生血管復(fù)合體的分子可以有助于限制CNV形成。在眼部疾病中的脈絡(luò)膜新血管形成和血管成熟血管發(fā)生是正常傷口愈合的必不可少的組成部分，因為它將氧和營養(yǎng)物質(zhì)遞送到炎性細胞并幫助碎片清除[Lingen(2001),ArchPatholLabMed，vol125:67-71]。進行性血管發(fā)生由兩種不同的過程組成階_歐1:響應(yīng)附近刺^t,血管EC遷移到毛細血管的尖端，在這里它們增殖并形成腔結(jié)構(gòu)；以及階段II:修剪血管網(wǎng)絡(luò)和優(yōu)化脈管系統(tǒng)[Guo,etal.(2003),AmJPathol,vol162:1083-93]。階段I:新血管形成。血管發(fā)生通常有助于傷口愈合。然而，當新血管不受4空制時，則通常是缺損的并會加劇、滲漏、出血、以及炎癥。已證明通過靶向促血管再生GF來減少失調(diào)的和滲漏的BV具有一定的放緩AMD發(fā)展的能力[Pauleikhoff(2005),Retina,vol25:1065-84.14,以及糧Wijngaarden，Coster,andWilliams(2005)，JAMA，vol293:1509-13]。階革殳II:血管成熟和藥物脫4文作用。全-VEGF抑制似乎大部分借助于抗?jié)B作用(其導(dǎo)致一見網(wǎng)膜內(nèi)和一見網(wǎng)膜下水胂的消退)來發(fā)揮其有益^丈應(yīng)，因為實際CNV病變并沒有顯著退4b。擊夬少顯著的CNV退化可以部分地是由于新形成血管的成熟(起因于周細胞覆蓋)。周細胞在血管組織的發(fā)展和維持中具有關(guān)鍵作用。周細胞的存在似乎貝武予對抗VEGF劑的抗性并減損它們抑制血管發(fā)生的能力[BergersandSong(2005)，Neuro-oncol，vol7:452-64;YamagishiandImaizumi(2005)，IntJTissueReact,vol27:125-35;Armulik，AbmmssonandBetsholtz(2005)，CircRes,vol97:512-23;Ishibashietal.(1995)，ArchOphthalmol,vol113:227-31]。只十周細月包募集具有抑制效應(yīng)的制劑可能會石皮壞血管通道裝配和脈絡(luò)膜新血管通道的成熟，乂人而保全它們對抗血管形成劑的壽文感性。血管網(wǎng)絡(luò)的重建涉及調(diào)節(jié)血管(BV)密度以滿足營養(yǎng)需要[GarianoandGardner(2005)，Nature,438:960陽6]。BV不成熟期對應(yīng)于其中新血管發(fā)4軍作用并還沒有獲得周細月包涂層的時期[Benjamin，Hemo，andKeshet(1998)，Development,125:1591-8，以及GerhardtandBetsholtz(2003),CellTissueRes，2003.314:15-23]。這種延遲對于提供可塑性窗口是必要的，其中該可塑性窗口用于根據(jù)視網(wǎng)膜或脈絡(luò)膜的營養(yǎng)需要來微調(diào)正在發(fā)展的脈管系統(tǒng)。生物活性脂質(zhì)鞘氨醇-l-磷酸(SlP)、VEGF、PDGF、血管生成素(Ang)以及其它生長因子(GF)可增加血管生長并將平滑月幾細胞(SMC)和周細胞募集到初生血管，其促進正在形成的血管的重建[AllendeandPraia(2002)，BiochimBiophysActa,vol582:222-7;GarianoandGardner(2005),Nature,vol438:960-6;Grosskreutz,etal.(1999),MicrovascRes,vol58:128-36;Nishishita,andLin(2004),J81CellBiochem，vol91:584-93,以及Erber,etal.(2004),FASEBJ，vol18:338-40.32]。最可能在EC發(fā)芽時通過間充質(zhì)前體的原位分化產(chǎn)生的或產(chǎn)生自動力永平滑力幾細胞的遷移和去分化的周細胞緊密地結(jié)合并鞘化(ensheath)EC，從而導(dǎo)致總血管成熟和存活[Benjamin,Hemo,andKeshet(1998)，Development,vol125:1591國8]。最近的研究已i正明，S1P、以及S1P1受體，參與細J包表面運輸和細月包-細月包教著分子N-鈣黏著蛋白的激活[Paik，etal.(2004),GenesDev,vol18:2392-403]。N-4丐凝著蛋白是EC、周細胞和壁細胞之間的相互作用所必要的，該相互作用促進穩(wěn)定血管床的發(fā)展[GerhardtandBetsholtz(2003),CellTissueRes，vol314:15-23]。S1P1基因的整體缺失導(dǎo)致異常的壁細l包鞘化(或包蓋，ensheathment)新生BV，其是在胚胎發(fā)育期間BV穩(wěn)定化所需要的[AllendeandPraia(2002)，BiochimBiophysActa,vol1582:222-7]。在胂瘤異種拼接才莫型中，將siRNA局部注射到S1P1可抑制血管穩(wěn)定化[Chae，etal.(2004),JClinInvest,vol114:1082-9]。轉(zhuǎn)基因鼠研究已i正明，VEGF和PDGF-B可促進#斤BV的成fl;和牙急定[Guo,etal.(2003)，AmJPathol,162:1083-93,以及GarianoandGardner(2005)，Nature,vol438:960-6.50〗。VEGF正調(diào)節(jié)Ang-l(mRNA和蛋白質(zhì))[Asahara,etal.(1998)，CircRes，vol83:233-40]。Ang-1在由周細月包募集和維持周圍的血管內(nèi)皮載體中發(fā)4軍主要作用[Asaham,etal.(1998),CircRes,vol83:233-40]。目艮內(nèi)注射VEGF加速了EC叢的周細月包覆蓋[Benjamin,Hemo,andKeshet(1998)，Development,vol125:1591-8]。PDGF隱B缺陷小鼠胚胎缺少微血管周細胞，這會導(dǎo)致水腫、孩史動脈瘤以及致命性出血[Lindahl，etal.(1997),Science,vol277:242-5]。鼠產(chǎn)前研究已證明，為了血管床成熟的完全的VEGF刺激和PDGF刺激，需要另外的信號。基于上述SIP的反式激活，此因子可以是SlP[Erberetal.(2004)，F(xiàn)ASEBJ，vol18:338-40]。血管的穩(wěn)定和成熟伴隨可塑性的損失和缺少消退到VEGF和其它GF撤除以及對抗血管生成療法的抗性[Erber，etal.(2004),FASEBJ,vol18:338-40，以及HughesandChan-Ling(2004),InvestOphthalmolVisSci，vol45:2795-806]。BV對生血管抑制劑的抗性是由最初穩(wěn)定成熟血管和在治療后^皮募集到未成熟血管的周細胞所賦予的[Erber,etal.(2004),FASEBJ，vol18:338-40]。在鞘化未成熟EC以后，周細胞表達補償性生存因子(Ang-1和PDGF-B),其保護EC免受促凋亡劑的影響。在眼部疾病中的水腫和血管通透性CNV月莫由有孔血管EC組成，其傾向于使它們的血管內(nèi)內(nèi)含物滲漏進入周圍的腔隙，從而導(dǎo)致視網(wǎng)膜下出血、滲出物和液體積聚[GerhardtandBetsholtz(2003),CellTissueRes，vol14:15-23]。多年來CNV組織本身，以及最近^L網(wǎng)膜內(nèi)新血管形成，^皮認為是與AMD有關(guān)的^見力下降的原因。然而現(xiàn)在認為，由血管通透性(VP)的增加和其后血液一見網(wǎng)膜屏障(BRB)的擊穿所引起的黃斑7jc腫在與AMD和其它眼部疾病(包4舌與#唐尿病有關(guān)的失明)有關(guān)的^L力減退中具有主要作用[HughesandChan-Ling(2004),InvestOphthalmolVisSci,vol45:2795-806;FelinskiandAntonetti(2005)，CurrEyeRes,vol30:949-57;Joussen,etal.(2003)，F(xiàn)ASEBJ，vol17:76-8，以及Strom，etal.(2005),InvestOphthalmolVisSci，vol46:3855-8]。尤其是，糖尿病性視網(wǎng)膜病(DR)和糖尿病性黃斑水肺(DME)是糖尿病患者的常見孩支血管并發(fā)癥并且是津唐尿病相關(guān)性失明的最常見原因。DME起因于增加的樣史血管通透性。Joussen,etal.(2003),FASEBJ,vol17:76-8。這些是工作年齡群體中新失明的最常見原因。我們認為，化合物如靶向SIP的抗體將可用于治療這些病癥。下文4笛述4姿照本發(fā)明可治療的若干類眼部疾病的實例。應(yīng)當明了，許多疾病和病癥至少部分地特征為多發(fā)性病理性過程(例如，病理性新血管形成和疤痕)，并且本文才是供的分類是為了描述方侵_而不是限制本發(fā)明。a.缺血性3見網(wǎng)膜病，其與病理性新血管形成和特征為^見網(wǎng)膜前和/或視網(wǎng)膜下膜形成的疾病有關(guān)缺血性視網(wǎng)膜病(IR)是一類病癥，其特征在于視網(wǎng)膜血流量受到損害。IR的實例包括糖尿病性視網(wǎng)膜病(DR)、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病(ROP)、鐮狀細胞視網(wǎng)膜病以及視網(wǎng)膜靜月永閉塞性疾病。所有這些病癥可以4半隨VEGF驅(qū)動的病理'性—見網(wǎng)月莫娘斤血管形成的增殖，其可以最終導(dǎo)致眼內(nèi)出血、視網(wǎng)膜前膜形成以及牽拉性—見網(wǎng)膜脫離。原發(fā)性視網(wǎng)膜前膜(ERM)，還稱作黃斑皺褶或玻璃紙樣^L網(wǎng)膜病變，可以引起視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)變形之后繼發(fā)的一見力減小。盡管進行了手術(shù)切除，但這些膜有時會復(fù)發(fā)，并且有時伴隨視網(wǎng)膜缺血。VEGF以及其受體位于ERM。在伴隨增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病、以及黃斑皺褶的膜中VEGF的存在進一步暗示，這種細胞因子在缺血性^L網(wǎng)膜病的血管發(fā)生中以及在增生性玻璃體視網(wǎng)膜病的膜生長中具有重要作用。此外，還在ERM中的細胞上鑒定了VEGF受體VEGFR1和VEGFR2。這些數(shù)據(jù)表明，VEGF可以是自分泌和/或旁分泌刺j:敫劑，其可以有助于血管禾口無血管ERM的發(fā)展。PDGF和其受體[Robbins，etal.(1994)，InvestOphthalmolVisSci;vol35:3649-3663]已在患有i曽生'性一見網(wǎng)膜病的眼中加以描述[Cassidy,etal.(1998),BrJOphthamol;vol82:181-85,以及Freyberger,etal.(2000),ExpClinEndocrinolDiabetes,vol108:106-109]。這些發(fā)現(xiàn)暗示了PDGF配體和受體廣泛分布在不同來源的增生性視網(wǎng)膜膜中，并且暗示了PDGF的自分泌和旁分泌刺激可能參與ERM發(fā)病機制。轉(zhuǎn)化生長因子-p(TGF-|3)參與ERM的形成[Poumaras，etal.(1998),KlinMonatsblAugenheilkd，vol212:356-358J,如通過TGF染色和免疫反應(yīng)活性所"i正明的。此夕卜，TGF-J3受體II表達在糖尿病和PVR膜的ERM的肌成纖維細胞中。這些結(jié)果暗示，在視網(wǎng)膜和ERM的多種細胞類型中產(chǎn)生的TGF-P是用于治療PVR、糖尿病以及繼發(fā)性ERM的有吸引力的靶。已才艮道，在增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病(PDR)的人玻璃體中白細胞介素-6(IL-6)增力口[LaHeij，etal.(2002),AmJOphthal，134:367-375]，以及在一項研究中100。/。的所研究的^f唐尿病ERM表達IL-6蛋白質(zhì)[Yamamoto，etal.(2001)AmJOphthal,vol132:369-377]。已表明，外源性給予堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)可誘導(dǎo)內(nèi)皮增殖和VEGF表達[Stavri，etal.(1995),Circulation,vol92:11-14]。與這些7見測結(jié)果一致，在來自PDR患者的玻璃體沖羊品中bFGF濃度會增加[Sivalingam,etal.(1990)，ArchOphthalmol,vol108:869-872,以及Boulton，etal.(1997),BrJOphthalmol,vol81:228-233]。bFGF還參與ERM的形成[Hueber，etal.(1996)，Int.Ophthalmol,vol20:345-350]，戈口在所研究的10個PDR月莫中的8個PDR膜中的bFGF所i正明的。此外，這些研究者發(fā)現(xiàn)相應(yīng)受體FGFR1的陽性染色。在非血管性原發(fā)性ERM中還已證明了對于bFGF的免疫反應(yīng)活性。這些結(jié)果意p木著bFGF參與血管和無血管ERM的開j成。Harada，etal.(2006),ProginRetinalandEyeRes,vol25;149-164。在ROP患者的血清中還已^r測到升高的bFGF(Becerril,etal.(2005),Ophthalmology,vol112,2238]。鑒于SIP的已知的多效性以及它與VEGF、bFGF、PDGF、TGF-P以及IL-6的相互作用，我們認為結(jié)合、拮抗、抑制SIP的效應(yīng)或生產(chǎn)的制劑將有效抑制在缺血性視網(wǎng)膜病和后節(jié)疾病(特4正在于血管或無血管ERM形成)中的病理性視網(wǎng)膜新血管形成。至少部分地特4正為異常的新血管形成或血管發(fā)生的其它眼病癥包4舌年齡相關(guān)性黃斑變性、角膜拼接排斥反應(yīng)、新生血管性青光眼、隱形眼鏡超戴癥、角膜感染，包括單純皰滲、帶狀皰滲以及原蟲感染、翼狀胬肉、感染性葡萄膜炎、慢性視網(wǎng)膜脫離、激光損傷、鐮狀細胞視網(wǎng)膜病、靜脈閉塞癥、脈絡(luò)膜新血管形成、視網(wǎng)膜血管瘤增殖、以及原發(fā)性息肉樣脈絡(luò)膜血管病。b.增生性玻璃體一見網(wǎng)膜病(PVR)在原發(fā)性孔源性視網(wǎng)膜脫離以后和在創(chuàng)傷性一見網(wǎng)膜脫離以后，觀觀'JPVR。它是視網(wǎng)膜脫離外科手術(shù)失敗的主要原因。它的特征在于在一見網(wǎng)膜兩側(cè)、在3皮璃體后表面和玻璃體基底部上細力包"莫的生長和收縮。在目艮中這種過度的瘢痕組織發(fā)展會導(dǎo)致牽拉性視網(wǎng)膜脫離的發(fā)展，因此針對防止或抑制增生性玻璃體視網(wǎng)月莫病(PVR)的治療是處理一見網(wǎng)力莫脫離的合理原則。組織病理學(xué)上PVR的4爭4i在于過度的月交原生產(chǎn)、收縮以及細月包增殖[Michels，RetinalDetachment2ndEdition.WilkinsinCP,RiceTAEds,Complicatedtypesofretinaldetachment,pp641-771，MosbyStLouis1997]。在PVR膜中鑒定的細胞類型主要包括視網(wǎng)膜色素上皮細胞、成纖維細胞、巨p藍細胞以及血管內(nèi)皮纟田胞[Jerdan,etal(1989),Ophthalmology,vol96:801-10，以及Vidinova，etal(2005)，KlinMonatsblAugenheilkd;vol222:568-571]。這種過度的疤痕反應(yīng)的病理生理學(xué)似乎是由許多細胞因子介導(dǎo)，其中細胞因子包括血小板衍生生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)p、石咸性成纖維細月包生長因子(bFGF)、白細月包介素-6(IL-6)、以及白細月包介素-8(IL-8)[Nagineni，etal(2005),JCellPhysiol,vol203:35-43;LaHeij,etal(2002),AmJOphthalmol,134:367-75;Planck,etal(1992),CurrEyeRes;vol11:1031-9;Canatarogluetal(2005)OculImmunolInflamm;vol13:375-81,以及Andrews,etal(1999)，OphthalmolVisSci;vol40:2683-9]。這些纟田胞因子的抑制可以有助于防止PVR的發(fā)展(如果及時給予)或限制其嚴重性[Akiyama，etal(2006)，JCellPhysiol,vol207:407-12，以及Zheng，etal(2003),JpnJOphthalmolm，vol47:158-65]。鞘氨醇-l-磷酸(SIP)是具有多效性的生物活性;容血脂質(zhì)(lysolipid)。它是促血管新生的、促炎性的(刺激巨噬細胞和月巴大細胞的征集)以及促纖維化的(刺激瘢痕形成)。SIP通常刺激細月包增殖和遷移并且是4元凋亡的。SIP通過其與i午多細力包因子和生86長因子的相互作用來實現(xiàn)這些生物多樣性的功能。已證明借助于單克隆抗體(SPHINGOMAB)來抑制SIP可以阻斷血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、bFGF、IL-6、以及IL-8的功能[Visentin，Betal.(2006),CancerCell,vol9:1-14]。SIP與SIP!受體的結(jié)合還可以增力口PDGF生產(chǎn)，因而結(jié)合SIP的制劑也將預(yù)期會減少PDGF生產(chǎn)[MilstienandSpiegel(2006)，CancerCell,vol9:148-150]。如在以下實施例中所說明的，現(xiàn)已證明，在體外SIP將人RPE細胞轉(zhuǎn)化成類似于在PVR中所看到類型的肌成纖維細胞樣表型。鑒于在PVR中所看到的最終導(dǎo)致過度的疤痕的病理生理學(xué)以及SIP對這些相同關(guān)鍵介質(zhì)的已知效應(yīng)，可以認為結(jié)合、拮抗、或抑制SIP的效應(yīng)或生產(chǎn)的制劑將有效地消除或最大程度降低PVR的發(fā)展以及其對眼的嚴重損害效應(yīng)。c.葡萄膜炎葡萄膜炎是眼葡萄膜的一種炎性疾病。它可以侵襲眼的前部或脅視力。原發(fā)性葡萄膜炎已與前房中增加的CD4+表達有關(guān)[Calder,etal.(1999)，InvestOphthalmolVisSci,vol40:2019-24]。數(shù)據(jù)還提示，T'淋巴細J包和其趨4匕因子IP-10在葡萄膜炎的發(fā)病才幾制中的病J里'〖生4乍用[AbuEl-Asrar(2004),AmJOphthalmol,vol138:401-11]。在急性前葡萄膜炎中的其它趨化因子包括巨噬細胞炎性蛋白、單核細胞趨化蛋白-1以及IL-8。這些細胞因子可能在急性前葡萄膜炎的白細胞募集中起關(guān)4建作用。Verma，etal.(1997),CurrEyeRes;vol16;1202-8。鑒于S1P信號級耳關(guān);改大的意義深遠的多效性，i人為降低生物活性脂質(zhì)有效濃度的SPHINGOMAB和其它免疫部分^1夸作為一種有效的方法來降低或調(diào)節(jié)與葡萄膜炎有關(guān)的眼內(nèi)炎癥。d.屈光外科手術(shù)角膜傷口愈合反應(yīng)特別相關(guān)于屈光外科手術(shù)，因為它是安全和效力的主要決定因素。進行這些手術(shù)以治療近—見、遠視以及散光。激光原位角膜磨削術(shù)(LASIK)和屈光性角膜切除術(shù)(PRK)是最常見的屈光手術(shù)，然而已開發(fā)了其它手術(shù)以試圖克服并發(fā)癥。這些并發(fā)癥尤其包括矯正過度、矯正不足、消退以及基質(zhì)渾濁化。許多反應(yīng)。在角膜生物學(xué)中最大的挑戰(zhàn)之一是借助于再生而不是纖維化來促進組織1"奮復(fù)。i/w為再生和纖維化之間的選4爭在于成纖維細胞;敫;舌的4空制[Stramer，etal(2003),InvestOphthalmolVisSci;vol44:4237-4246，以及Fini(1999)ProgRetinEyeRes,vol18:529-551]。在外科手術(shù)或損傷后1-2周，在上皮下基質(zhì)中可以出現(xiàn)稱作肌成纖維細胞的細胞。肌成纖維細胞可能在TGF-p的影響下衍生自角膜細月包[Jester,etal.(2003)，ExpEyeRes，vol77:581-592]。角月莫〉'昆濁和基質(zhì)^痕的特征在于降j氐的角膜透明度并且可以伴隨成纖維細胞和月幾成纖維細胞生成。原位和體外研究已提示，TGF-P和PDGF在刺激肌成纖維細胞分化中是重要的[Folger，etal.(2001),InvestOphthalmolVisSci;42:2534-2541]。在某些情況下，在LASIK以后，可以在中心界面觀測到混濁。這些混濁包括彌漫性板層角膜炎、環(huán)形(甜甜圈形，donut-shaped)皮瓣、以及上皮石卒片保留在界面。它們的每一種都可能伴有TGF-p從上皮細胞增加進入激活的角膜細月包[Netto,etal.(2005),Comea，vol24:509-522]。消退很可能是由于提高的上皮-基質(zhì)傷口愈合相互作用如通過角膜成纖維細胞和/或肌成纖維細力包的上皮調(diào)節(jié)生長因子的產(chǎn)生增加[Netto，etal.(2005)，上文]。已表明，用局部的抗TGF-p抗體4卬制TGF-p結(jié)合于受體可減少由PRK"i秀導(dǎo)的混濁[Jester,etal.(1997),Comea,vol16:177-187]。鑒于抗生物活性脂質(zhì)抗體對纖維化進程和TGF-p的已知效應(yīng)，我們認為，它可以有助于治療屈光外科手術(shù)的某些并發(fā)癥如混濁、基質(zhì)疤痕以及消退。e.青光眼過濾外科手術(shù)的調(diào)節(jié)青光眼通常被認為是一種高眼內(nèi)壓引起對^L神經(jīng)的損傷并最終使視野和/或視敏度受到損害的疾病。存在其它形式的青光眼，其中一見神經(jīng)損傷可以發(fā)生在常壓環(huán)境中或所謂的"正常眼壓性青光眼"。對于許多患者來說，藥物能夠控制它們的病情，4旦對于其它患者而言則需要實施青光眼濾過術(shù)，乂人而在眼中手術(shù)產(chǎn)生的瘺使流體可以排出。這可以通過小梁切除術(shù)、植入醫(yī)療裝置或外一牛干預(yù)的其它方法來實現(xiàn)。由于特征在于成纖維細月包增殖的傷口愈^^過程而導(dǎo)致青光眼濾過術(shù)失敗并最終留下疤痕?？勾鷌射物如5-氟尿嗜啶和絲裂霉素C可以減少術(shù)后的疤痕；然而，甚至是在術(shù)后長期使用這些藥物的情況下，手術(shù)失敗仍然是嚴重的臨床問題[MutschandGrehn(2000)，GraefesArchClinExpOphthalmol;vol238:884-91,以及Fontana,etal.(2006)，Ophthalmology,vol113:930-936]。人Tenon嚢成纖維細月包的研究i正明了它們能夠合成bFGF和PDGF以及TGF-p并且這些生長因子參與青光眼濾過術(shù)后的組織修復(fù)過程，其促成了手術(shù)的失敗。Trpathi，etal.(1996),ExpEyeRes，vol63:339-46。另外的研究還涉及在后濾過傷口反應(yīng)中的這些生長因子[Denk，etal.(2003),CurrEyeRes;vol27:35-44]，結(jié)i侖是PDGF的不同同種型是在青光眼濾過術(shù)以后Tenon嚢成纖維細胞增殖的主要刺激劑，而TGF-P是Tenon嚢成纖維細胞轉(zhuǎn)化成肌成纖維細胞所必需的。我們已證明，SIP存在于人Tenon嚢/結(jié)膜成纖維細胞中以及SIP在傷口愈合反應(yīng)中被強烈表達。SIP還刺激多種成纖維細胞細胞類型的促纖維變性功能和轉(zhuǎn)化成力幾成纖維細"包表型以及膠原生產(chǎn)。鑒于SIP的特定的多效性以及其與bFGF、PDGF、以及TGF-p的已知的相互作用，i人為結(jié)合、拮抗、抑制SIP的效應(yīng)或生產(chǎn)的制劑將有效調(diào)節(jié)傷口愈合和/或纖維變性反應(yīng)(其導(dǎo)致青光眼外科手術(shù)的失敗)并且將是增加成功的手術(shù)結(jié)果的有效治療方法。設(shè)想，可以例如借助于玻璃體內(nèi)注射或結(jié)膜下注射或局部地給予上述制劑。89f.角膜拼接角膜拼接(穿透角膜拼接術(shù)(PK))是在人類中最成功的組織拼接手術(shù)。然而每年在美國進行的47,000例角膜拼接中，角膜異體拼接物反應(yīng)仍然是角膜拼接失敗的主要原因[Ing，etal.(1998),Ophthalmology,vol105:1855-1865]。雖然免疫抑制和免疫調(diào)節(jié)可以是一種有希望的方式，但目前還沒有足夠的能力來避免異體拼接物反應(yīng)。最近已發(fā)現(xiàn)，在角膜異體拼接物的排斥中，CD4(+)T細胞直接作為效應(yīng)細胞而不是輔助細胞。Hegde，etal.(2005),Transplantation,vol79:23-31。鼠類研究已表明角膜基質(zhì)中增加數(shù)目的中性粒細胞、巨噬細胞以及肥大細胞經(jīng)受排斥。巨噬細胞是主要的浸潤細胞類型，接著是T細胞、肥大細胞以及中性粒細胞。在高風險角膜拼接中的早期趨化因子表達是IL-8的小鼠同源物(巨噬細胞炎性蛋白-2)和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)[Yamagami，etal.(2005),MolVis，vol11，632-40]。FTY720(FTY)是一種新的免疫抑制藥物，其通過改變、淋巴細胞運輸來起作用；導(dǎo)致外周血淋巴細胞減少和淋巴結(jié)中增加的淋巴細胞計數(shù)。通過結(jié)合于在淋巴細胞上表達的一些S1P受體，F(xiàn)TY介導(dǎo)其免疫調(diào)節(jié)作用[Bohler，etal.(2005),Transplantation,vol79:492-5]?？诜o予藥物并且單口服劑量降低外周淋巴細胞計數(shù)30-70%。在FTY降低T細胞亞群中，CD4(+)細胞多于CD8(+)細胞。Bohler,etal.(2004)，NephrolDialTransplant,vol19:702-13。當口月良給予時，經(jīng)FTY治療的小鼠顯示出原位角膜拼4^存活顯著延長。Zhang,etal.(2003)，Transplantation,vol76:1511-3。在角膜異種拼接的大鼠-小鼠模型中，F(xiàn)TY口服治療還顯著延遲排斥并降低其嚴重性[Sedlakova,etal.(2005)，Transplantation,vol79,297-303]。鑒于異體拼接物反應(yīng)的已知發(fā)病機制并結(jié)合數(shù)據(jù)(其提示調(diào)節(jié)SIP信號的效應(yīng)可以改善角膜*醉接存活)，認為降低生物活性脂質(zhì)(例如，90SPHINGOMAB)的有歲文濃度的免疫部分也將可用于治療免疫病癥如異體拼接物反應(yīng)，例如通過減弱免疫應(yīng)答，因此將可能改善PK以后的角膜4并4妄存活。上述藥物還可以具有另外的優(yōu)點，即除系統(tǒng)《合予之外，可以局部主合予，例如，4昔助于局部眼周或眼內(nèi)遞送。具有炎癥或免疫組成部分的其它眼部疾病包^^曼性^皮璃體炎，感染，其包括單純皰滲、帶狀皰滲、以及原蟲感染，以及眼組織月包漿菌病。g.以癥痕為特征的前節(jié)病還i人為，用把向生物活性脂質(zhì)的抗體進行的治療可以有益于特征為眼前部皰痕的若干病癥。這些病癥包4舌i.創(chuàng)傷作為眼最前部結(jié)構(gòu)的角膜暴露于各種有害物，從氣載碎片到鈍性外傷，其可以產(chǎn)生自機械損傷。眼的角膜和前部表面還可以被暴露于其它由外科手術(shù)形成的創(chuàng)傷、以及化學(xué)(如酸和堿)灼傷。這些類型的損傷的結(jié)果可以是破壞性的，經(jīng)常導(dǎo)致角膜和結(jié)膜疤痕瞼球粘連形成。此外，可以接著發(fā)生角膜新血管形成。釋放白三烯的中性粒細月包積累，以及白細月包介素-1和白細胞介素-6的存在，起到連續(xù)不斷;也募集炎性細月包的作用[Sotozono,etal.(1997),CurrEyeRes,vol19:670-676],炎性細胞浸潤角膜并釋放蛋白水解酶，這導(dǎo)致角膜組織和角膜熔體的進一步損害和破壞。此外，角膜和結(jié)膜成纖維細胞被激活并侵入，從而導(dǎo)致膠原沉積和纖維化。TGF-P會促進過度炎癥和疤痕的不期望的效應(yīng)。Saika,etal.(2006),AmJPatholvol168,1848-60。該過程導(dǎo)致角膜透明度的損失和^L力受損。減少的炎癥，包括降低的中性粒細胞浸潤和降低的纖維化，導(dǎo)致在堿燒al.(2005),OphthalmolVisSci,vol46:4097-106]。ii.眼瘢痕性類天皰瘙(OCP)OCP是一種慢性結(jié)瘢(瘢痕形成)自身免疫病，其主要侵襲結(jié)膜。此病是不可逆地進4亍性的并且預(yù)后相當差。在其最后階段，結(jié)月莫疤痕和伴隨的角膜病變導(dǎo)致雙側(cè)失明。組織學(xué)上結(jié)膜顯示粘膜下癥痕和慢性炎癥，其中肥大細胞參與程度非常高[Yao,etal.(2003)，OculImmunolInflamm,vol11:211-222]。自身抗原導(dǎo)致形成自身抗體。在浸潤T淋巴細胞的情況下，自身抗體與自身抗原的結(jié)合會啟動一系列復(fù)雜的事件，其中CD4(輔助)細胞遠遠多于CD8(抑制)細胞。巨噬細胞和肥大細胞浸潤也接著發(fā)生以及促炎和促纖維化細胞因子的釋放。結(jié)果是細胞因子誘導(dǎo)的結(jié)膜成纖維細胞增殖和激活，并發(fā)生上皮下纖維化(參見以下實施例)。研究已表明在OCP患者中TGF-(3和IL-1在結(jié)月莫纖維4匕中的作用[Razzaque，etal.(2004)，I畫stOphthalmolVisSci，vol45:1174-81]。iii.史蒂文斯-約翰遜綜合征(SJS)和中毒性表皮壞死溶解癥(TEN)SJS和TEN是的威脅生命對藥物的不良反應(yīng)。上述兩種相關(guān)病癥的眼后遺癥可以是嚴重的并且涉及延髓和瞼結(jié)膜、眼瞼、以及角膜的病理性變化。藥物和感染是最常見的參與因素。由于最初的炎性過程，慢性眼結(jié)果包括皰痕、瞼球粘連形成、以及結(jié)膜的瘢痕形成。這導(dǎo)致瞼內(nèi)翻形成、倒睫、以及淚膜的不穩(wěn)定。眼表面的破壞導(dǎo)致角膜疤痕、新血管形成、以及在嚴重情況下導(dǎo)致角質(zhì)化。如在OCP中，則發(fā)生結(jié)膜的上皮下纖維化。人們i人為，對藥物或感染的劇烈的自身免疫淋巴細胞反應(yīng)在SJS/TEN的發(fā)展中起作用。Harilaos:etal.(2005),ErythemaMultiforme,StevensJohnsonSyndrome,andToxicEpidermalNecrolysis,inCornea2nedition.Krachmer,Mannis，Hollandeds.ElesevierMosbyPhiladelphia。在SJS中的浸潤細月包群包括巨p藍細胞、CD4陽性T細胞、以及CD8陽性T細胞。該細胞群類似于在化學(xué)灼傷中所看到的那些細胞群。Kawasaki,etal.(2000),JOphthalmol,vol84:1191-3。iv.翼狀胬肉臨床上翼狀胬肉表現(xiàn)為肉樣、血管團，其發(fā)生在瞼間裂隙中。翼狀胬肉的主體是肉樣纖維血管團?；钚砸頎铈廊獾奶卣髟谟陲@著的血管充血和進行性生長。它們被堅固地恭附眼球。在晚期的情況下翼狀胬肉侵害角膜并且會S1起在視軸內(nèi)角膜透明度損失之后的視覺損失或不規(guī)則散光。在癥狀上，患者會感到有異物感、撕裂感以及^L力才莫糊。組織病理學(xué)"i正明了固有質(zhì)的上皮下結(jié)締組織的透明樣變化、成纖維細胞的數(shù)目增加以及肥大細胞的增加。Butrus,etal.(1995)，AmJOphthalmol,vol119:236-237。翼4犬胬肉的處J里仍然是個問題。經(jīng)常進行手術(shù)切除，然而復(fù)發(fā)率較高[Krag,etal.(1992)，ActaOphthalmol,vol70:530]。為了有助于降低翼狀資肉的復(fù)發(fā)率，已采用各種藥理佐劑，如絲裂霉素C和柔紅霉素。雖然這些藥理佐劑可以是有幫助的，4旦長期數(shù)據(jù)有限并且它們可以伴隨鞏力莫變薄和角膜熔化。Dougherty等[(1996)，Cornea,vol15:537-540，以及Lee，etal.(2001)，Cornea,vol20:238-42]首先證明了，在翼狀胬肉的發(fā)展中VEGF可以具有重要作用以及鑒定了翼^)犬胬肉上皮中的VEGF和一氧化氮。這些研究者假設(shè)，這些以及其它細胞因子是翼狀胬肉的纖維血管向內(nèi)生長特性的原因。已證明在在原發(fā)性或復(fù)發(fā)性翼狀胬肉中均存在石威性FGF和TGF國pi[Kira,etal.(1998)，GraefesArchClinExpOphthalmol,vol236:702-8]并且發(fā)表的形態(tài)計量和免疫組織化學(xué)證據(jù)進一步支持這樣的觀點，即血管發(fā)生可以在翼狀胬肉的形成中發(fā)4軍作用[Marcovich,etal(2002),CurrEyeRes，vol25:17-22]。其它研究已指出IL-6和IL-8以及VEGF作為介質(zhì)，可以與翼狀胬肉發(fā)展有關(guān)[DiGirolamo,etal.(2006),InvestOphthalmolVisSci,vol47:2430-7]。抵抗翼狀箭肉形成和生長的有效制劑可以減少對外科干預(yù)的需要或降低復(fù)發(fā)率。伴隨纖維發(fā)生、纖維化或疤痕組成部分的其它眼部疾病和病癥包括AMD、糖尿病性一見網(wǎng)膜病、早產(chǎn)兒一見網(wǎng)膜病、鐮狀細胞視網(wǎng)膜病、缺血性視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜靜脈閉塞性疾病、以及隱形眼鏡超戴癥?？傊?，過度的疤痕是許多眼和非眼部疾病和病癥的病理生理學(xué)的基本組成部分。生物活性脂質(zhì)如SIP在此過禾呈中具有作用并且用來減少這些制劑的濃度的抗體相關(guān)治療將可能對4妄受該治療的患者產(chǎn)生治療效果。在一種實施方式中，我們i人為，生物活性脂質(zhì)的抑制劑，尤其是針對SlP和/或其變體的單克隆抗體，可用于調(diào)節(jié)手術(shù)反應(yīng)和創(chuàng)傷性傷口愈合反應(yīng)。纖維化、纖維發(fā)生以及瘢痕形成視網(wǎng)膜下纖維化的形成導(dǎo)致對光感受器的不可逆轉(zhuǎn)的損害以及永久性一見力減退。只要新生血管復(fù)合體仍然是完整的，如在用抗VEGF劑治療的患者中似乎是這種情況，視網(wǎng)膜下纖維化的潛力和未來一見力減退會持續(xù)。在RANIBIZUMAB(Lucentis)的PRONTO研究的最新才艮導(dǎo)中，發(fā)現(xiàn)，由于視網(wǎng)膜下纖維化或RPE撕裂，那些失去視力的患者確實如此?？梢詼p少成纖維細胞浸潤和月交原沉積程度的制劑將是有價值的。成纖維細力包，尤其是力幾成纖維細力包，在響應(yīng)細爿包損傷和炎癥的瘢痕形成中是關(guān)4建細月包元件[Tomasek,etal.(2002),NatRevMolCellBiol,vol3:349-63，以及ViragandMurry(2003)，AmJPathol,vol163:2433-40]。通過肌成纖維細胞的膠原基因表達是重建的標志并且是瘢痕形成所必要的[SunandWeber(2000)，CardiovascRes，vol46:250-6，以及SunandWeber(1996),JMolCellCardiol,vol28:851-8]。通過激活成纖維細月包遷移和增殖同時增加月交原生產(chǎn)，SIP可促進傷口愈合[Sun,etal,(1994)，JBiolChem，vol269:16512-7]。由受損細"包局部產(chǎn)生的SIP可以是造成伴隨重建和瘢痕形成的不適當傷口愈合的原因。因此，認為，SIP抑制劑可用于治療至少部分地特征為異常的纖維發(fā)生或纖維化的疾病或病癥。視網(wǎng)膜下纖維化的形成導(dǎo)致對光感受器的不可逆轉(zhuǎn)的損害和永久性視力減退。只要新生血管復(fù)合體是完整的，如在用抗VEGF劑治療的患者中似乎是這種情況，則視網(wǎng)膜下纖維化和未來視力減退的可能性就會繼續(xù)。通過中和SIP來最大程度降低不適當瘢痕形成可以是有益的并且通過限制視網(wǎng)膜下纖維化和其后光感受器損傷的程度可以防止一見力的不可逆喪失。越來越多的i正據(jù)表明SIP可以有助于早期和后期階^:的伴隨滲出性AMD的不適當?shù)膇見網(wǎng)膜重建。SIP具有明顯的非VEGF依賴性促血管再生效應(yīng)。SIP還刺激多種細胞類型的遷移、增殖以及存活，包括成纖維細胞、EC、周細胞以及炎性細胞一參與滲出性AMD和其它眼部疾病的多種不適當過程的相同細胞。SIP與參與滲出性AMD的發(fā)病機制的VEGF、bFGF、PDGF、以及其它生長因子(GF)的生產(chǎn)和激活有關(guān)。最后，SIP可以調(diào)節(jié)初生"永管系統(tǒng)的成熟，該過程導(dǎo)致?lián)p失對抗血管形成劑的壽文感性。4中制SIP的作用可以是用于滲出性AMD的有歲文的治療性治療，其可以4是供相對于<又<又抗VEGF方式的顯著優(yōu)點或可以與它們協(xié)同作用以解決最終導(dǎo)致AMD相關(guān)性—見覺損失的復(fù)雜過程和多個步驟。目前偏愛的用于AMD的治療方法包4舌Lucentis⑧和沖亥準適應(yīng)癥外l吏用(off-lableuse)的Avastin(Genentech，Inc.),兩者均輩巴向單個生長因子(VEGF-A)并且似乎4昔助于抗、滲作用來施加大部分它們的有益歲文應(yīng)，其導(dǎo)致4見網(wǎng)膜下和^L網(wǎng)力莫內(nèi)7jc腫的消退，因為實際的脈絡(luò)膜新生血管(CNV)病變并沒有顯著地退化。然而，滲出性AMD相關(guān)的視力減退并不《叉起因于CNV誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜下和視網(wǎng)膜內(nèi)水腫。由CNV、—見網(wǎng)膜下纖維化、7K肺以及炎癥一起共同引起的視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜下結(jié)構(gòu)的病理性破壞和重建導(dǎo)致伴隨AMD的一見力損失?？捎玫闹委煼椒?包括LucentisTM)并沒有針對這些多種原因。因此，可以治療多種機制(其引起視力減退)的治療劑將具有很大的價值，作為單藥治療或連同另一種制劑，如抗VEGF劑(侈'Ji口，Lucentis⑧或Avastin)。因此，不希望受限于任何特定理i侖，i人為不受歡迎的鞘脂如SIP、和/或它們的一種或多種代謝物的水平51起或有助于各種眼部疾病和病癥的發(fā)展，其中不適當?shù)难装Y、纖維化和/或血管發(fā)生參與疾病的發(fā)病才幾制。目艮的疾病和病癥(其中抗SIP抗體可能是臨床上有用的)包括糖尿病性視網(wǎng)膜病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、糖尿病性黃斑水月中、PVR、前4史病以及年齡相關(guān)黃斑水月中，濕型和干型，以及手術(shù)后如青光眼的d、梁切除術(shù)或瓣膜拼接術(shù)。用于治療》更皮病的抗SIP抗體本發(fā)明的組合物和方法將可用于治療至少部分i也特4正為異常的新血管形成、血管發(fā)生、纖維發(fā)生、纖維化、疤痕、炎癥、以及免疫應(yīng)答的病癥和疾病。一種這樣的疾病是》更皮病，其還稱作系統(tǒng)性-更4b病。硬皮病是一種自身免疫病，其引起疤痕或皮膚增厚，并且有時涉及身體的其它區(qū)域，包括肺臟、心臟、和/或腎。硬皮病的特征在于在身體的皮膚和器官中形成瘢痕組織(纖維化)，其可以導(dǎo)致所涉及區(qū)域的增厚和堅實，以及隨之發(fā)生的功能降低。根據(jù)美國硬皮病基金會的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，目前有約300,000美國人患有硬皮病。三分之一或更少的受侵襲患者患有普遍疾病，而其余的三分之二主要具有皮月夫癥狀。當該疾病4曼襲肺臟并引起疤痕時，呼吸可能會受到限制，這是因為肺臟不再能如它們應(yīng)該的那樣進行擴張。為了測量肺活量，醫(yī)生使用了一種用來估計用力肺活量(FVC)的裝置。在FVC小于50%的預(yù)期的人群中，起因于硬皮病相關(guān)的肺部疾病的10年死亡率為約42%。死亡率如此高的一個原因是目前沒有有效的治療方法。不希望受限于<壬<可特定理_淪，i人為脂質(zhì)如S1P和/或其代i射物的不適當?shù)臐舛葧鸹蚣觿∮财げ〉陌l(fā)展。因此，本發(fā)明的組合物和方法可以用來治療石更皮病，尤其是通過降〗氐特定革巴脂質(zhì)例如S1P的有效體內(nèi)濃度。如在本申i青書中其它地方所描述的，現(xiàn)有"i正據(jù)表明，S1P是一種促纖維變性生長因子，其可以有助于成纖維細胞激活、增殖、以及獲得伴隨不適當疤痕和重建的增加的成纖維細胞活性。人們認為，具有生物活性的S1P和抗S1P劑(例如，抗SlPmAb)能夠間4妄纟爰和PDGF和TGF-p的促石更化效應(yīng)。此夕卜，用這才羊的抗S1P劑通過緩和S1P對皮膚和其它形式的成纖維細胞(其有助于疾病進展)的直接影響而進行的治療能夠有益于硬皮病患者。心血管和"畝血管病不希望受限于任何特定理論，不期望的鞘脂如CER、SPH、或S1P、和/或一種或多種它們的代謝物的水平可能是造成心功能不全(心月幾缺血期間或以后如再灌注損傷期間)以及得到的心臟重塑和心力衰竭的直4妄原因。由于鞘脂(如SIP)參與肝組織的纖維發(fā)生和傷口愈合(Davailleetal"J.Biol.Chem.275:34268-34633,2000;Ikeda，etal"AmJ.Physiol.Gastrointest.LiverPhysiol279:G304-G310，2000)，受傷脈管系纟充的愈合(Lee,etal"Am.J.Physiol.CellPhysiol.278:C612-C618，2000),以及其它疾病4犬態(tài)，或與這才羊的疾病有關(guān)的事件，i口癌癥、血管發(fā)生和炎癥(Pyne,etal,Biochem.J.349:385-402,2000),所以本發(fā)明的組合物和方法不僅可以用來治療這些疾病而且還可以用于治療心臟疾病。這表明，來自心臟或其它非腦源的鞘脂可能有助于卒中。因此，干擾鞘脂生產(chǎn)和/或作用可以有益于緩和卒中，尤其是由外周血管疾病引起的卒中、動脈粥樣石更化、以及心臟疾病。最近的證據(jù)表明，外源性給予的SIP會穿越血腦屏障并促進腦血管收縮(Tosaka，etal.，Stroke32:2913-2919.2001)。已表明，在心月幾在夬血(即，供應(yīng)到心臟的血液在夬乏)期間，一個早期事件是由心肌過量產(chǎn)生天然存在的化合物鞘氨醇，以及由心臟組織本身或由血液成分產(chǎn)生其它代謝物，尤其是S1P，這是作為在血液中心肌鞘脂生產(chǎn)和其后轉(zhuǎn)化的結(jié)果。本發(fā)明提供了用特異性人源化單克隆抗體來中和SIP的方法。因此本發(fā)明提供了人源化抗鞘脂抗體和有關(guān)的組合物和方法來降^f氐關(guān)4建鞘脂(SIP)的血液和組織水平。這樣的抗體可用于，例如，結(jié)合并因此降低全血中不希望存在的鞘脂的有效濃度。本發(fā)明的治療方法和組合物被描述成是"基于鞘脂的"以表明這些療法可以改變某些不希望的、毒性或心臟毒性鞘脂的相對、絕對或可用濃度。"毒性鞘脂"是指任何鞘脂，其可以引起或增強細^^的壞死和/或凋亡或在其它情況下?lián)p害器官或組織的功能(例如，通過過度纖維化)，在某些情況下包括在特定組織或器官中發(fā)現(xiàn)的特定細胞類型。"心臟毒性鞘脂"是毒性鞘脂，其通過不適當?shù)陌毯?纖維發(fā)生)直接或間接促進心力衰竭，引起負變力狀態(tài)或引起或增強在心臟中或伴隨心臟發(fā)現(xiàn)的細胞(包括^旦不限于心臟細胞、心臟一申經(jīng)元等)的壞死和/或凋亡，和/或可以引起心臟功能的喪失失，這是由于鞘脂和/或它們的代謝物的負變力效應(yīng)、心律失常冠狀動月永血管收縮/痙攣效應(yīng)。"不期望的鞘脂"包4舌毒性和心臟毒性鞘脂，以及代謝物，尤其是毒性和心臟毒性鞘脂的代謝前體。特別感興趣的不希望的心臟毒性和/或毒性鞘脂包括^f旦不限于神經(jīng)酰胺(CER)、酰基神經(jīng)鞘氨醇-l-磷酸(ClP)、鞘氨醇-l-磷酸(S-l-P)、二氫S1P(DHS1P)、神經(jīng)鞘氨醇磷酸膽石咸(SPC)、鞘氨醇(SPH;D(+)-赤型-2-氨基-4-反式-十八烯-l,3-二醇、或神經(jīng)鞘氨醇)以及各種代謝物。心肌細胞對缺氧和再氧合的最早反應(yīng)之一是中性鞘磷脂酶的激活和神經(jīng)酰胺的蓄積是已知的。Hernandez,etal.(2000),Circ.Res.86:198-204，2000。據(jù)稱SPH涉及介導(dǎo)各種細胞類型中細胞凋亡的早期4言號事4牛(Ohta，etal.,FEBSLetters355:267-270,1994;Ohta，etal"CancerRes.55:691-697,1995;Cuvlilier,etal"Nature381:800-803,1996)?！﹊定缺氧的心臟毒性效應(yīng)可以部分地來自鞘脂生產(chǎn)和/或來自其它代謝物(例如，質(zhì)子、釣、以及某些自由基)或信號分子(例如，MAP激酶、胱冬裂酶)的不適當產(chǎn)生，則會對心臟功能產(chǎn)生有害影響。SIP被存儲在血小板中并且是人血漿和血清的正常組分(Yatomi,etal.,J.Biochem.121:969-973,1997)。SIP是一種冠狀動月永血管收縮劑并且乂十犬心臟具有其它生物歲文應(yīng)。Sugiyama,etal.(2000)，CardiovascularRes.46:119-125。已經(jīng)4,定了SIP在動樂:K粥才羊石更化中的作用(Siess,etal.，IUBMBLife49:161-171，2000)。這已獲得其它資料的支持，包括以下證據(jù)HDL的保護作用起因于阻斷SIP生產(chǎn)(Xia，etal.，PNAS95:14196-14201，1988;Xia,etal.,JBiolChem274:33143-33147,1999)。已報道，鞘磷脂(其為神經(jīng)酰胺的代謝前體)在經(jīng)受缺氧的實馬全動物中會增力口(Sergeev，etal.，Kosm.Biol.Aviakosm.Med.(Russian)15:71-74,1981)。其它研究已才艮道，肌細胞的內(nèi)膜包含大量的SPH和革肖石癢月旨(Sumnicht,etal.，Arch.Biochem.Biophys.215:628-637,1982;Sabbadini,etal"Biochem.Biophys.Res.Comm.193752-758，1993)。用串珠鐮孢菌素B真菌毒素治療實驗動物導(dǎo)致增加SPH和DHSPH的血清水平(未測量S1P),并同時對心臟發(fā)生負變力效應(yīng)(Smithe,etal"ToxicologicalSciences56:240-249,2000)。其它疾病或病癥由于在許多過程(包括新血管形成、血管發(fā)生、異常的纖維發(fā)生、纖維化和疤痕、以及炎癥和免疫應(yīng)答)中涉及生物活性脂質(zhì)信號，所以認為，這些生物活性脂質(zhì)的抑制劑將有助于與一種或多種這些過禾呈有關(guān)的各種疾病和病癥。這樣的疾病和病癥可以是全身的(例如，全身性硬皮病)或位于一個或多個特定身體系統(tǒng)、部分或器官(例如，皮膚、肺臟、心血管系統(tǒng)或眼)。在患者中控制不受歡迎的鞘脂量的一種方式是通過提供一種組合物，其包含一種或多種人源化抗鞘脂抗體以結(jié)合一種或多種鞘脂，從而作為治療性"海綿"，其可以降低游離的不受歡迎的鞘脂的水平。當化合物3皮稱作"游離的"時，則該化合物不以任何方式凈皮限制達到它施加其不受歡迎的效應(yīng)的部位。通常，游離化合物存在于血'液和組織中，其是或包含游離4匕合物的作用部4立，或從其一種化合物可以自由地遷移到其作用部位。一種游離化合物還可以用于被4壬何酶作用，其中酶將化合物轉(zhuǎn)化成不期望的化合物。100不希望受限于^f壬^T特定理"i侖，i人為，不受歡迎的鞘脂如SPH或S1P、和/或一種或多種它們的代j射物的水平引起或有助于心臟和心月幾疾病和病癥的發(fā)展。因為鞘脂還涉及肝組織的纖維發(fā)生和傷口愈合(Davaille，etal.,J.Biol.Chem.275:34268-34633,2000;Ikeda，etal.，AmJ.Physiol.Gastrointest.LiverPhysiol279:G304-G310,2000)、受傷脈管系統(tǒng)的愈合(Lee,etal"Am.J.Physiol.CellPhysiol.278:C612-C618，2000)，以及其它疾病狀態(tài)或病癥，或與上述疾病或病癥有關(guān)的事件，如癌癥、血管發(fā)生、與過度纖維^b和炎癥有關(guān)的各種眼部疾病(Pyneetal.，Biochem.J.349:385-402,2000)，所以本發(fā)明的纟且合物禾口方法可以用來治療這些疾病和病癥以及心臟和心力幾疾病禾口病癥?；谇手寞煼ǖ囊环N形式涉及操作鞘脂的代謝途徑，以降低不受歡迎的毒性鞘脂的實際、相對和/或可用體內(nèi)濃度。本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防疾病、病癥或身體創(chuàng)傷的組合物和方法，其中將人源化抗鞘脂抗體給予患者以結(jié)合不受歡迎的毒性鞘脂、或其代謝物。這樣的人源化抗鞘脂抗體可以被配制在藥物組合物中，其可以用于各種目的，包括治療疾病、病征或身體外傷?？梢詫景l(fā)明的一種或多種人源化抗鞘脂抗體的藥物組合物結(jié)合于用于上述治療的試劑盒和醫(yī)療裝置。醫(yī)療裝置可以用來將本發(fā)明的藥物組合物給予對其有需要的患者，并且根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式，提供了包括上述裝置的試劑盒。上述裝置和試劑盒可以用于常規(guī)給予(包括自我給予)本發(fā)明的藥物組合物。上述裝置和試劑盒還可以在緊急情況下使用，例如，在救護車或急診室中，或在外科手術(shù)期間，或在可能發(fā)生損傷^旦不能立即獲得充分的醫(yī)療條件的活動中(例如，4走步旅行和野營，或戰(zhàn)斗環(huán)境)。給予方法本文描述的疾病和病癥的治療可以通過各種途徑、采用不同的劑型和裝置來給予本發(fā)明的制劑和組合物加以實現(xiàn)。適宜的藥用稀釋劑、載體、以及賦形劑在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中是眾所周知的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了，對于^f壬^r特定治療方法所給予的量可以容易地確定。適宜的量可以預(yù)期為10pg/劑量至10g/劑量，優(yōu)選為10mg/劑量至1g/劑量?？梢酝ㄟ^本4支術(shù)領(lǐng)域已知的方法來鄉(xiāng)合予原料藥，包括4旦不限于全身給予、皮下給予、皮內(nèi)給予、粘膜給予(包括通過吸入)、以及局部給予。粘膜是指上皮組織，其沿著身體的內(nèi)腔。例如，粘膜包括消化道，其包括口、食管、胃、小腸、以及肚門；呼吸道，其包括鼻通道、氣管、支氣管、以及肺臟；以及外生殖器。對本"i兌明書來說，粘膜還包括眼的外表面，即角膜和結(jié)膜。局部給予(與系統(tǒng)給予相反)可以是有利的，因為這種方式可以限制潛在的全身副作用，而仍然可以獲得治療效果。在本發(fā)明中使用的藥物組合物包括但不限于溶液、乳濁液、以及包含脂質(zhì)體的劑型。這些組合物可以產(chǎn)生自各種成分，其包括但不限于預(yù)制液體、自乳化固體以及自乳化半固體。在本發(fā)明中使用的藥劑劑型可以按照制藥行業(yè)熟知的常規(guī)技術(shù)來制備。這樣的技術(shù)包括使活性組分與藥物載體或賦形劑結(jié)合的步驟。優(yōu)選的載體包括那些藥用載體，尤其是當組合物用于人類的治療應(yīng)用。對于非人類治療應(yīng)用(例如，用于伴侶動物、家畜、魚、或家禽的治療)，可以采用獸醫(yī)用載體。通常，劑型的制備如下均勻地和緊密地4吏活性組分締合于液體載體或精細分割的固體載體或兩者，然后如果需要的話，使產(chǎn)品成形。200780048665.8本發(fā)明的組合物可以配制成許多可能劑型的任何一種，如^f旦不限于片劑、膠嚢劑、液體糖漿劑、軟明膠膠嚢、栓劑、以及灌腸劑。本發(fā)明的組合物還可以配制成在含水、非含水或混合介質(zhì)中的混懸劑。含水混懸劑可以進一步包含增加懸浮液粘度的物質(zhì)，其包括，例如，羧甲基纖維素鈉、山梨醇和/或右旋糖酐。該混懸劑還可以包含穩(wěn)定劑。在一種實施方式中，該藥物組合物可以#皮配制并用作泡沫。藥物泡沫包括的劑型例如是，但不限于，乳劑、微乳劑、乳膏劑、膠凍劑、以及脂質(zhì)體。雖然特性基本類似，^L這些劑型在最終產(chǎn)品的組分和稠度方面會有所不同。關(guān)于上述組合物和劑型的制備的專門技術(shù)通常是制藥和配制領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的并且可以用于本發(fā)明的組合物的配制。在一種實施方式中，可以〗昔助于，例如，局部用滴劑或庫欠膏劑、眼周注射、前房內(nèi)進入前房或玻璃體，^昔助于才直入長效制劑、或系統(tǒng)注射或口服，將免疫衍生部分遞送到眼部。所用抗體的量可以容易地由本領(lǐng)域」技術(shù)人員確定。將療法遞送到眼部的傳統(tǒng)方式包4舌局部施加、系統(tǒng)鄉(xiāng)會予以后再分布到眼部或直4妄眼內(nèi)/目艮周注射[Sultana，etal.(2006),CurrentDrugDelivery,vol3:207-217;GhateandEdelhauser(2006)，ExpertOpinion:vol3:275-287;以及KaurandKanwar(2002),DrugDevelopIndustrialPharmacy,vol28:473-493]。抗SIP或其它抗生物活性脂質(zhì)抗體治療可以和任何這些方式一起4吏用，雖然均具有某些發(fā)覺的優(yōu)點和缺點。局部用滴劑是方便的，但主要起因于鼻淚引流的流失經(jīng)常將少于5%的所施加藥物遞送到眼的前部并且甚至將上述劑量的更小部分遞送到眼球后節(jié)。除滴劑以外，噴霧劑還提供了另一種局部給予的方式。第三種方式是眼用軟膏劑或乳劑，其可以用來延長劑型與眼表面的接觸時間，雖然視力模糊和眼瞼無光澤可能是令人煩惱的。上述局部方式仍然是伊C選的，因為治療眼部疾病的療法的系統(tǒng)給予會將全身暴露于藥物的潛在毒性。眼后節(jié)的治療在醫(yī)學(xué)上是重要的，因為在美國和其它發(fā)達國家，年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病、后葡萄膜炎、以及青光眼是一見力衰退的主要原因。Myles,etal.(2005)，AdvDrugDelivRev;57:2063-79。將藥物遞送到后節(jié)的最有效方式是通過3皮璃體的玻璃體內(nèi)注射。然而，直接注射需要熟練的醫(yī)生來實施遞送并且許多患者會對其產(chǎn)生治療受限的憂慮。與玻璃體內(nèi)注射相比，眼周注射(其包括結(jié)膜下注射、球后注射、眼球周注射以及后眼球筋膜下注射)的侵入性稍少一些。重復(fù)的和長期的玻璃體內(nèi)注射會引起并發(fā)癥，如玻璃體出血、視網(wǎng)膜脫離、或眼內(nèi)炎。還可以利用專交新的眼遞送系統(tǒng)中的一種來給予抗生物活性脂質(zhì)4元體治療[Sultana,etal.(2006)，CurrentDrugDelivery,vol3:207-217;以及GhateandEdelhauser(2006),ExpertOpinion,vol3:275-287],其包括持續(xù)或受控釋放系統(tǒng)，如(a)眼用膜劑(可溶的、可侵蝕的、不可侵蝕的或基于水凝膠的)、角膜罩，例如基于膠原的繃帶和隱形眼鏡，其將藥物受控遞送到眼部，(b)原位膠凝系統(tǒng)，其便于以滴劑形式給予，其中滴劑在眼中被轉(zhuǎn)化成凝膠形式，從而提供藥物在眼中的某種持續(xù)效應(yīng)，(c)泡狀系統(tǒng)如脂質(zhì)體、類脂嚢泡/discomes等，其提供以下優(yōu)點靶向遞送、生物相容性以及免于視力模糊，(d)粘膜粘附系統(tǒng)，其提供在眼中的更好保留，(e)前藥，(f)滲透增強子，(g)凍干載體系統(tǒng)，(h)顆粒，(i)亞孩i乳，(j)離子滲入療法，(k)樹技狀聚合物，(l)微球，包括生物粘附微球，(m)納米球和其它納米顆粒，(n)collasomes，以及(o)藥物遞送系統(tǒng)，其包括一種或多種上述系統(tǒng)以提供另外的、甚至協(xié)同的有利影響。大多數(shù)這些104方式靶向眼的前革爻并且可以有益于治療前^:病。然而，這些方式的一種或多種仍然可以有利影響眼后區(qū)中的生物活性脂質(zhì)濃度，因為脂質(zhì)的相對較低分子量將可能允許脂質(zhì)在眼中的大量流動。此外，引入眼前區(qū)中的抗體可以能夠在整個眼中遷移，尤其是如果它^皮制備成更低重量抗體變體如Fab片段。還可以采用用于后節(jié)的持續(xù)藥物遞送系統(tǒng)如那些批準的或開發(fā)中的持續(xù)藥物遞送系統(tǒng)(參見上文的參考文獻)。如前所述，后部視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜、以及黃斑的疾病治療在醫(yī)學(xué)上是非常重要的。在這方面，經(jīng)鞏』莫離子導(dǎo)入[Eljarrat-BinstockandDomb(2006),ControlRelease,110:479-89]是一種重要進展并且可以3是供有效的方式來將抗體遞送到眼后節(jié)。還可以將各種賦形劑加入配制的抗體以改善治療性能，4吏治療更方便或明顯確保配制的抗體僅用于其所期望的、認可的目的。賦形劑的實例包括用來控制pH的化學(xué)制品、抗微生物劑、用來防止抗體潛能損失的防腐劑、用來確定僅眼用的劑型的染料、用增加劑型中抗體濃度的增溶劑、滲透增強子、以及用來調(diào)節(jié)等滲性和/或粘度的制劑的使用。可以加入例如蛋白酶的抑制劑，以延長抗體的半衰期。在一種實施方式中，在包含磷酸緩沖鹽溶液的溶液中并在對眼適宜的pH下，通過if皮璃體內(nèi)注射將抗體遞送到眼部?？筍1P劑(例如，人源化抗體)還可以4皮化學(xué)4奮飾以產(chǎn)生在前述劑型或裝置之一中給予的前藥。然后通過內(nèi)源性酶的作用來釋放抗體的活性形式。在本申請中所考慮的可能的眼酶是各種細胞色素p450、醛還原酶、酮還原酶、酉旨酶或N-乙酰-P-葡萄并唐胺酶。對抗體的其它〗匕學(xué)^^飾可以增力口其分子量，從而增加4元體在眼中的4亭留時間。上述化學(xué)修飾的一個實例是聚乙二醇化[HarrisandChess(2003)，NatRevDrugDiscov;2:214-21]，一種過禾呈，其可以是通用于或?qū)Ｓ糜诠倌軋F如二石克化物[Shaunak,etal.(2006)，NatChemBiol;2:312-3]或硫醇[Doherty,etal.(2005)，BioconjugChem;16:1291-8]。本文以下實施例描述了從治療角度考慮具有所期望性能(包括與鞘脂的強結(jié)合親和力)的人源化和變體抗鞘脂抗體的生產(chǎn)。尤其是，本發(fā)明涉及S1P以及它的變體，其可以包括S1P本身，定義為鞘氨醇-l-磷酸[sphingene-l-磷酸；D-赤型-鞘氨醇-l-磷酸；鞘氨醇-l-磷酸；(E，2S,3R)-2-氨基-3-羥基-十八-4-烯氧基]膦酸(AS26993-30-6)，DHSIP被定義為二氫鞘氨醇-l-磷酸[神經(jīng)鞘氨醇-l-磷酸；[(2S，3R)-2-氨基-3-羥基-十八氧基]膦酸；D-赤型-二氫-D-鞘氨醇-l-磷酸(CAS19794-97-9];SPC是神經(jīng)鞘氨醇磷酸膽堿、溶鞘磷脂、鞘氨醇磷酸膽堿、鞘氨醇磷酸膽堿、三乙基苯酚乙銨鹽；2-((((2-氨基-3-羥基-4-十八烯基)氧基)羥基氧膦基)氧基)-N，N,N-三甲基-氯化物、(R-(R、S、(E)))，2-[[(E，2R，3S)-2-氨基-3-羥基-十八-4-烯氧基]-羥基畫磷酰基]乙氧基國三曱基-氯化銨(CAS10216國23-6)?？贵w生成和表征如在以下實施例中所描述的，可以確定抗體親和力。優(yōu)選的人源化或變體抗體是那些抗體，其結(jié)合鞘脂并且Kd值不大于約lxl(T7M，^f尤選不大于約1x10—8M，并且最^尤選不大于約5xl(T9M。除與鞘脂具有強結(jié)合親和力的抗體之外，還希望選擇從治療角度考慮具有其它有益性能的人源化或變體抗體。例如，抗體可以是降低血管發(fā)生并改變腫瘤進展的抗體。優(yōu)選地，抗體具有不大于約10ug/ml的有效濃度50(EC50)值，優(yōu)選不大于約1ug/ml，以及最優(yōu)選不大于約0.1ug/ml,如用直接結(jié)合ELISA測定所測得的。優(yōu)選地，抗體具有不大于約10ug/ml的有效濃度值，優(yōu)選不大于約1ug/ml,以及最優(yōu)選不大于約0.1ug/ml,如在有1uMS1P存在的條件下用細力包測定所測;得的，例如，在那些濃度下，坑體能夠體外抑制鞘脂-誘導(dǎo)的IL-8釋放至少10%。優(yōu)選地，抗體具有不大于約10ug/ml的有效濃度值，優(yōu)選不大于約1ug/ml，以及最優(yōu)選不大于約0.1ug/ml，如在CNV動物才莫型中在激光燒傷以后所測得的，例如，在那些濃度下抗體能夠體內(nèi)抑制鞘脂-誘導(dǎo)的新血管形成至少50%。用于確定本發(fā)明的抗鞘脂抗體的活性的測定包4舌如在下文實施例中所說明的ELISA測定。優(yōu)選地，在將治療有效量的抗體給予病人以后，人源化或變異抗體沒有誘發(fā)免疫原性應(yīng)答。如果免疫原性反應(yīng)^皮"i秀發(fā)，優(yōu)選地，該應(yīng)答將是這樣的以致抗體仍然向用其治療的患者提供治療效果。才艮據(jù)本發(fā)明的一種實施方式，人源化抗鞘脂抗體結(jié)合如在本文中所定義的"表位"。為了篩選結(jié)合于被感興趣的抗體(例如，那些阻斷抗體結(jié)合于鞘脂的抗體)結(jié)合的鞘脂上的抗體的表位，可以進行如在Antibodies,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,EdHarlowandDavidLane(1988)中所描述的常^見交叉阻斷測定(cross-blockingassay)?？?#才灸;也，可以進4亍表位作圖，例如，如在Champe，etal.[J.Biol.Chem.270:1388-1394(1995)]中所描述的，以確定抗體是否結(jié)合感興趣的表位。本發(fā)明的抗體具有重鏈可變結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含由下式表示的氨基酸序列FR1畫CDRH1畫FR2-CDRH2-FR3-CDRH3-FR4，其中"FR1-4"表示抗鞘脂抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)i或的四個骨架區(qū)而"CDRH1-3"則表示三個高可變區(qū)。FR1-4可以書f生自如在以下實施例中的"共有序列"(例如人免疫球蛋白的重鏈或輕鏈的類、亞類或亞組的最常見氨基酸)或可以衍生自個別人抗體骨架區(qū)或衍生自不同骨架區(qū)序列的組合。例如上文中的Kabat,etal.已搜集了許多人抗體骨架區(qū)序列。在一種實施方式中，由人免疫球蛋白亞組(如由上文的Kabat，etal.所4臾集的)的共有序列纟是供了重《連可變FR。優(yōu)選地，人免疫J求蛋白亞組是人重鏈亞組III(例如，如在SEQIDNO:16中)。人重鏈可變FR序列優(yōu)選其中具有一個或多個取代基，例如，其中人FR殘基被相應(yīng)的非人殘基所替換("相應(yīng)的非人殘基，，是指當對人和非人序列進行序列對比時，和感興趣的人殘基具有相同Kabat位置編號的非人殘基)，但用非人殘基的替換并不是必要的。例如，可以通過噬菌體展示來選4爭不同于相應(yīng)的非人殘基的替4奐FR殘基。可以被取代的典型的重鏈可變FR殘基包括任何一種或多種FR殘基號37H、49H、67H、69H、71H、73H、75H、76H、78H、以及94H(本文采用的Kabat殘基編號)。優(yōu)選地，這些殘基的至少兩個、或至少三個、或至少四個祐JpM戈。FR取^的一種4爭別優(yōu)選的組合是49H、69H、71H、73H、76H、78H、以及94H。關(guān)于重鏈高可變區(qū)，優(yōu)選具有在以下表2中所列的氨基酸序列。本文的優(yōu)選實施方式的抗體具有輕鏈可變結(jié)構(gòu)i或，其包含由下式表示的氨基酸序列FR1-CDRL1-FR2-CDRL2-FR3-CDRL3-FR4,其中"FR1-4"表示抗鞘脂抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域的四個骨架區(qū)而"CDRL1-3"表示三個高可變區(qū)。FR1-4可以書于生自"共有序列，，(例如，人免疫5求蛋白的重鏈或輕鏈的類、亞類或亞組的最常見氨基酸)(如在以下實施例中)或可以衍生自個別人抗體骨架區(qū)或衍生自不同骨架區(qū)序列的組合。在一種優(yōu)選實施方式中，由人免疫J求蛋白亞組(如由Kabat,etal.匯編的，上文)的共有序列提供輕鏈可變FR。^尤選i也，人免疫J求蛋白亞組是人k輕鏈亞組I(例3口，如在SEQIDNO:17中)。人輕鏈可變FR序列優(yōu)選在其中具有取代，例如，其中人FR殘基被相應(yīng)的小鼠殘基所替換，但用非人殘基的替換并不是必要的。例如，可以通過噬菌體展示來選擇不同于相應(yīng)的非人殘基的替換殘基?？梢员蝗〈牡湫偷妮p鏈可變FR殘基包括任何一種或多種FR歹戈基號，其包4舌^f旦不卩艮于F4、Y36、Y49、G64、S67。關(guān)于CDR,優(yōu)選具有在以下表2中所列的氨基酸序列。下文詳細說明用于產(chǎn)生感興趣的人源化抗鞘脂抗體的方法。A,抗體制備在以下實施例中描述了用于對非人抗鞘脂抗體進行人源化并產(chǎn)生抗鞘脂抗體的變體的方法。為了使抗鞘脂抗體人源化，制備了非人抗體起始材料。在要產(chǎn)生變體的情況下，制備了親代抗體。將在以下部分描述用于產(chǎn)生上述非人抗體起始材并+和親代抗體的示例性纟支術(shù)。(i)抗原制備用于生產(chǎn)抗體的鞘脂抗原可以是，例如，完整鞘脂或部分鞘脂(例如，包含"表位"的鞘脂片段)?？捎糜诋a(chǎn)生抗體的其它形式的抗原對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。在以下實施例中描述了用來產(chǎn)生抗體的鞘脂抗原。在一種實施方式中，抗原是衍生形式的鞘脂，并且可以伴隨有載體蛋白。(ii)多克隆抗體優(yōu)選在動物中通過多次皮下(sc)或腹腔內(nèi)(ip)注射有關(guān)抗原和佐劑來產(chǎn)生多克隆抗體。利用雙功能或衍生劑，例如，馬來酰亞胺苯甲酰疏代丁二酰亞胺酯(通過半胱氨酸殘基的共軛作用)、109N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2、或R/N二C-NR,其中R和Ri是不同的烷基基團，它可以用于將有關(guān)抗原共輒于在要免疫的物種中為免疫原性的蛋白，例如，鑰孔戚血藍蛋白、血清白蛋白、牛曱狀球蛋白、或大豆胰蛋白酶抑制劑。通過結(jié)合例如100ug或5ug蛋白或共軛物(分別用于兔或小鼠)與三容積的弗氏完全佐劑并在多個部4立皮內(nèi)注射該溶液，來相對于抗原、免疫原性共輒物、或衍生物對動物進行免疫。一個月以后，在多個部位，通過皮下注射，將在弗氏完全佐劑中的0.1至0.24咅的最初量的肽或共輒物纟會予動物。7至14天以后，對動物進4亍方文血并測定血清的抗體滴度。動物被增加直到滴度達到穩(wěn)定狀態(tài)。優(yōu)選地，用相同抗原、但共軛于不同蛋白的共軛物和/或通過不同的交聯(lián)試劑來對動物追加劑量。還可以在重組細胞培養(yǎng)物中作為蛋白質(zhì)融合來制備共輒物。此外，聚集劑如明風可以適當?shù)赜脕碓鰪娒庖邞?yīng)答。(iii)單克隆抗體可以利用首先由Kohler,etal.，Nature,256:495(1975)描述的雜交瘤方法、或通過其它適當方法，包4舌通過重《且DNA方法(參見例如，美國專利第4,816,567號)來制備單克隆抗體。在雜交瘤方法中，小鼠或其它適合的宿主動物，如倉鼠或獼猴，被免疫(如上文所述)以誘發(fā)淋巴細胞，其產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生將特異性地結(jié)合于用于免疫的蛋白的抗體?？商鎿Q地，可以體外免疫淋巴細胞。然后利用適宜的融合劑，如聚乙二醇，將淋巴細胞融合于骨髓瘤細胞，以形成雜交瘤細胞(Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,pp.59-103(AcademicPress,1986))。將如此制備的雜交瘤細胞接種并生長在適宜的培養(yǎng)基中，其中培養(yǎng)基優(yōu)選包含一種或多種物質(zhì)，其抑制非融合、親代骨髓瘤細月包110的生長或存活。例如，如果親^骨髓瘤細力包缺少次黃"票呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT),則用于雜交瘤細胞的培養(yǎng)基通常將包括次黃嘌呤、氨基蝶呤、以及胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)可防止HGPRT擊失少細力包的生長。優(yōu)選的骨髓瘤細胞是那些細胞，其有效融合、支持抗體的穩(wěn)定的高水平生產(chǎn)(通過所選的抗體生成細胞)，并且對培養(yǎng)基如HAT培養(yǎng)基是敏感的。其中，優(yōu)選的骨髓瘤細胞系是小鼠骨髓瘤細胞系，如那些布亍生自MOP-21和M.C.-11小鼠月中瘤的骨骨逸瘤細月包系，其可獲自SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego,Calif.USA,以及SP-2或X63-Ag8-653細月包，其可獲自AmericanTypeCultureCollection,Rockville，Md.USA。還描述了人骨髓瘤和鼠-人異源骨髓瘤細i包系，用于生產(chǎn)人單克隆抗體(Kozbor，J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur，etal.,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,pp.51-63(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987))。對其中正生長雜交瘤細胞的培養(yǎng)基測定其針對抗原的單克隆抗體的生產(chǎn)。優(yōu)選地，通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合測定，如放射免疫測定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)來確定由雜交瘤細胞生產(chǎn)的單克隆抗體的結(jié)合特異性。單克隆才元體的結(jié)合親和力可以，例^(口，通過Mimson，etal.,Anal.Biochem.，107:220(1980)的其斤卡查《急分4斤法(Scatchardanalysis)力口以確定。在鑒定了產(chǎn)生所期望的特異性、親和力、和/或活性的抗體的雜交瘤細胞以后，可以通過有限稀釋程序和通過標準方法的生長來亞克隆無性系(Goding，MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,第59-103頁(AcademicPress,1986))。用于此目的適宜培養(yǎng)基包括，例如，D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。此外，如動物中的腹水瘤，可以體內(nèi)生長雜交瘤細月包。通過常規(guī)免疫球蛋白純化程序如，例如，A蛋白-瓊脂糖凝膠、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、或親和層析，從培養(yǎng)基、腹水、或血清，適當?shù)胤蛛x由亞克隆分泌的單克隆抗體。可以容易地分離編碼單克隆抗體的DNA并利用常規(guī)程序進行測序(例如，通過使用寡核普酸探針，其能夠特異性地結(jié)合于編碼單克隆抗體的重鏈和輕鏈的基因)。雜交瘤細胞作為上述DNA的優(yōu)選來源。分離后，可以將DNA放入表達載體，然后被轉(zhuǎn)染進入，不產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細胞如大腸桿菌細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、或骨髓瘤細胞中以在重組宿主細月包中合成單克隆抗體。下面將詳細描述抗體的重組生產(chǎn)。(iv)人源化和氨基酸序列變體以下實施例12描述了用于抗鞘脂抗體的人源化的程序。用于人源化的一般方法在，例如，US5861155、US19960652558、US6479284、US20000660169、US6407213、US19930146206、US6639055、US20000705686、US6500931、US19950435516、US5530101、US5585089、US19950477728、US5693761、US19950474040、US5693762、US19950487200、US19950484537、US2003229208、US20030389155US19950372262、US6350861、US19970862871、US19950458516、US5834597、US19960656586、US19960621751、US5932448、US19910801798、US19970934841、US6129914、US19950397411、US6329511、US19990450520、US2003166871、US20020078757、US5225539、US19910782717、US6548640、US19950452462、US6180370、US5714350、US5777085、US5882644、US6013256、US6210671、US5624821、以及US19950479752中已經(jīng)描述過了。在某些實施方式中，可以希望產(chǎn)生這些人源化抗體的氨基酸序列變體，尤其是可12描述了用于產(chǎn)生抗鞘脂抗體的氨基酸序列變體的方法，其中氨基酸序列變體相對于親代抗體具有增強的親和力。通過將適當?shù)暮塑账嶙兓肟骨手贵wDNA、或通過肽合成，來制備抗鞘脂抗體的氨基酸序列變體。這樣的變體包括，例如，在本文實施例的抗鞘脂抗體的氨基酸序列內(nèi)缺失殘基、和/或插入殘基和/或取代殘基。進行缺失、插入、以及取代的任何組合以獲得最終構(gòu)造物，只要最終構(gòu)造物具有所期望的特性。氨基酸變化還可以改變?nèi)嗽椿蜃凅w抗鞘脂抗體的翻譯后加工，如改變糖基化位點的凄t目或位置?？捎糜阼b定抗鞘脂抗體的某些殘基或區(qū)(其是用于誘變的優(yōu)選位置)的方法:帔稱作"丙氨酸掃描誘變，，，如由CunninghamandWellsScience,244:1081-1085(1989)所描述的。在這里，鑒定了殘基或目標殘基纟且(例如，帶電荷殘基如arg、asp、his、lys、以及glu)并由中性或帶負電荷氨基酸(最優(yōu)選丙氨酸或聚丙氨酸)替換，以影響氨基酸與鞘脂抗原的相互作用。然后通過在取代位點、或為取代位點引入另外的或其它變體來完善那些對取代顯示功能敏感性的氨基酸位置。因此，雖然用于引入氨基^列變化的位點是預(yù)定的，但突變本身的特性無需預(yù)定。例如，為了分析在給定位點的突變性能，在靶密碼子或區(qū)進行ala掃描或隨機誘變，并且對表達的抗鞘脂抗體變體篩選所期望的活性。氨基酸序列插入包括氨基末端融合和/或羧基末端融合，長度范圍是一個殘基至包含一百或更多殘基的多肽，以及單個或多個氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的實例包括具有N-端甲硫氨酰殘基的抗鞘脂抗體或融合于附加表位的抗體?？骨手贵w分子的其它插入變體包括融合于酶或多肽的抗鞘脂抗體的N端或C端，其可以增加抗體的血清半壽期。另一種類型的變體是氨基酸取代變體。這些變體具有至少一個在抗鞘脂抗體分子中的氨基酸殘基被除去并且不同的殘基一皮插入在其位置。用于取代誘變的最感興趣的位點包括高可變區(qū)，<旦還設(shè)想FR改變。保守取代是優(yōu)選的取代。如果上述取代導(dǎo)致生物學(xué)活性的變化，那么更顯著的變化，稱為以下所列的"典型的"取代，或如以下參照氨基酸類型進一步描述的，可以被引入并且產(chǎn)物被篩選。表1:典型的氨基酸殘基取代典型的取/f戈Ala(A)val;leu;ilevalArg(R)lys;gin;asnlysAsn(N)gin;his;asp,lys;ginargAsp(D)glu;asngluCys(C)scr;alascrGin(Q)asn;gluasnGlu(E)asp;ginaspGly(G)alaalaHis(H)asn;gin;lys,argargHe(I)leu;val;met;ala;leuphe;正亮氛酸Leu(L)正亮氛酸；ile;val;ilemet;ala;pheLys(K)arg;gin;asnargMet(M)leu;phe;ileleuPheCF)leu;val;ile;ala;tyrtyrPro(P)^aleiSer(S)thrthrThr(T)ssrssrTrp(W)tyr;phetyrTyr(Y)trp;phe;thr;serpheVal(V)ile;leu;met;phe;leuala;正亮氛酸114抗體生物學(xué)特性的大量修飾是通過選4奪這樣的取代來完成，其在它們對保持下述的影響方面顯著不同(a)在取代區(qū)域中多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如，作為片層或螺旋構(gòu)象，(b)在靶位點處分子的電荷或疏水性，或(c)大部分的側(cè)鏈。基于常見的側(cè)鏈特性，將天然存在的殘基分為若干組；(1)疏水的正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile;(2)中4生親7jc的cys、ser、thr;(3)酉吏'I"生的asp、glu;(4)威性的asn、gln、his、lys、arg;(5)影響鏈取向的殘基gly、pro;以及(6)芳香族的trp、tyr、phe。非保守取代將引起這些類型的一類的成員交換另一類的成員。不參與維持人源化或變體抗鞘脂抗體的適當構(gòu)象的任何半胱氨酸殘基也可以被取代，以改善分子的氧化穩(wěn)定性以及防止異常交聯(lián)。相反地，可以將半胱氨酸鍵加入抗體以改善其穩(wěn)定性(尤其在抗體是抗體片段如一種Fv片段的情況下)。一種類型的耳又代變體涉及取代親代抗體(例如，人源化抗體或人抗體)的一種或多種高可變區(qū)殘基。通常，所獲得的選擇用于進物學(xué)特性。用于產(chǎn)生上述取代變體的一種方便的方式是利用噬菌體展示的親和力成熟。簡單地說，若干高可變區(qū)位點(例如，6-7個位點)被突變以在每個位點產(chǎn)生所有可能的氨基取代。如此產(chǎn)生的抗體變體以來自絲狀噬菌體顆粒的單價方式被展示為與包裝在每個顆粒內(nèi)的Mi3的基因nn產(chǎn)物的融合。然后，如本文中所^皮露的，篩選噬菌體展示變體的生物學(xué)活性(例如，結(jié)合親和力)。為了鑒定用于修飾的候選高可變區(qū)位點，可以進4亍丙氨酸掃描誘變，以鑒定顯著有助于抗原結(jié)合的高可變區(qū)殘基?？商鎿Q地，或此外，可能有益的是，分析抗原-抗體復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)以鑒定抗體和鞘脂之間的接觸點。根據(jù)本文詳細說明的技術(shù)，這樣的接觸殘基和鄰近殘基是用于取代的候選物。在產(chǎn)生上述變體以后，如本文所述對這批變體進行篩選并且在一種或多種有關(guān)測定中具有優(yōu)越性能的抗體可以選擇用于進一步發(fā)展。抗體的另一類型的氨基酸變體可以改變抗體的最初糖基化才莫式。改變是指刪去存在于抗體中的一種或多種>^水化合物部分，和/或添力口一種或多種在抗體中并不存在的糖基化位點?？贵w的糖基化通常是N-連接的和/或O-連接的。N-連接的是指石灰水化合物部分附著于天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸，是最常見的用于》友水化合物部分酶促附著于天冬酰胺側(cè)鏈的識別序列。因此，在多肽中這些三肽序列的任何一種的存在會產(chǎn)生潛在的糖基化位點。O-連接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖之一附著于羥基氨基酸，最常見絲氨酸或蘇氨酸，雖然也可以使用5-羥基脯氨酸或5-羥基賴氨酸?？梢酝ㄟ^改變氨基酸序列來方便地將糖基化位點加入抗體，以致它包含一種或多種上述三肽序列(用于N-連接的糖基化位點))。還可以通過在起始抗體的序列中添加、或耳又^一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基來進行這種改變(用于O-連接的糖基化位點)。編碼抗鞘脂抗體的氨基酸序列變體的核酸分子是通過本才支術(shù)領(lǐng)域已知的各種方法加以制備。這些方法包括但不限于分離自天然源(在自然發(fā)生氨基酸序列變體的情況下)或通過抗鞘脂抗體的早116先制備的變體或非變異變體的寡核苷酸介導(dǎo)(或定位)誘變、PCR-秀變、以及盒式"i秀變加以制備。(v)人抗體作為人源化的替代，可以產(chǎn)生人抗體。例如，現(xiàn)在可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物(例如，小鼠)，其在免疫以后在沒有內(nèi)源性免疫球蛋白生產(chǎn)的情況下能夠生產(chǎn)全套人抗體。例如，已描述了在嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(Jh)基因的純合子缺失導(dǎo)致內(nèi)源性抗體生產(chǎn)的完全抑制。在上述種系突變小鼠中人類種系免疫球蛋白基因陣列的轉(zhuǎn)移將導(dǎo)致在抗原挑戰(zhàn)以后人抗體的生產(chǎn)。參見例如，Jakobovits，etal，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:2551(1993);Jakobovits,etal，Nature,362:255-258(1993);Bruggermann,etal.，Yearinlmmuno.，7:33(1993);以及美國專利第5,591,669號、第5,589,369號和第5,545,807號。人抗體還可以衍生自噬菌體展示文庫(Hoogenboom，etal"J.Mol.Biol,227:381(1991);Marks,etal"J.Mol.Biol,222:581-597(1991)以及美國專利第5,565,332號和第5,573,905號)。如上所述，還可以通過體外激活的B細胞(參見例如，美國專利第5,567,610號和第5,229,275號)或通過其它的方法來產(chǎn)生人抗體。(vi)抗體片段在某些實施方式中，人源化或變體抗鞘脂抗體是抗體片段。已開發(fā)了用于生產(chǎn)抗體片段的各種技術(shù)。通常，借助于完整抗體的蛋白酶消4b來書亍生這些片^殳(參見例如、Morimoto,etal.,JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24:107-117(1992);以及Bre麵n,etal"Science229:81(1985))。然而，通過重組宿主纟田胞，玉見在可以直4妄生產(chǎn)這些片,殳。例如，F(xiàn)ab'-SH片,殳可以直4妄回收自大腸桿菌并且^皮化學(xué)耦耳關(guān)以形成F(ab')2片,殳(Carter,etal.，Bio/Technology10:163-167(1992))。在另一種實施方式中，利用亮氨酸拉鏈GCN4來促進F(ab')2分子的裝配從而形成F(ab')2。根據(jù)另一種方式，F(xiàn)v、Fab或F(ab')2片段可以直接分離自重組宿主細胞培(vii)多特異性抗體在某些實施方式中，可以期望產(chǎn)生對于至少兩種不同表位具有結(jié)合特異性的多特異性的(例如，雙特異性的)人源化抗體或變體抗鞘脂抗體。典型的雙特異性抗體可以結(jié)合于鞘脂的兩種不同的表位。可替換地，抗鞘脂臂可以結(jié)合與結(jié)合不同分子的臂。雙特異性抗體可以制備成全長抗體或抗體片,殳(例如，F(xiàn)(ab')2雙特異性抗體)。才艮據(jù)用于制備雙特異性抗體的另一種方式，一對抗體分子之間的界面可以用來最大化異二聚體的百分比，其中異二聚體回收自重組細胞物。優(yōu)選的界面包含抗體恒定結(jié)構(gòu)域的至少一對CH3結(jié)構(gòu)域。在此方法中，用較大側(cè)鏈(例如，酪氨酸或色氨酸)替換來自第一抗體分子的界面的一種或多種較小氨基酸側(cè)鏈。通過用較小氨基酸側(cè)鏈(例如，丙氨酸或蘇氨酸)代替較大氨基酸側(cè)鏈，可以將相同或類似大小的補償性"孔穴"產(chǎn)生在二抗分子的界面上。這提供了一種增加異二聚體的產(chǎn)率的機制(相對于其它有害的最終產(chǎn)物如同二聚體)。參見例如，美國專利第5，731，168號。雙特異性抗體包括交聯(lián)或"異源共輒物"抗體。例如，在異源共軛物中的抗體之一可以耦聯(lián)于抗生物素蛋白，另一種抗體則耦聯(lián)于生物素?？梢岳萌魏畏奖愕慕宦?lián)方法來制備異源共軛物抗體。適宜的交聯(lián)劑在本
技術(shù)領(lǐng)域：
是眾所周知的，并且披露在，例如，美國專利第4,676,980號中，連同若干交聯(lián)技術(shù)。在文獻中還已描述了用于乂人抗體片4史產(chǎn)生雙特異性抗體的沖支術(shù)。例如，可以利用化學(xué)4定合來制備雙特異性抗體。Brennan，etal.，Science229:81(1985)描述了一種程序，其中完整抗體^皮蛋白酶切割以產(chǎn)生F(ab')2片段。在有雙硫醇絡(luò)合劑亞砷酸鈉存在的條件下還原這些片段以穩(wěn)定鄰位雙硫醇以及防止形成分子間二硫化物。然后將產(chǎn)生的Fab'片段轉(zhuǎn)化成硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后通過用巰基乙胺進行還原，將Fab'-TNB衍生物之一再轉(zhuǎn)化成Fab'-石克醇，并與等摩爾量的另一種Fab'-TNB書f生物混合以形成雙特異性抗體。產(chǎn)生的雙特異性抗體可以用作用來選擇性地固定酶制劑。在又一種實施方式中，直4妄回收自大腸4干菌的Fab'-SH片,殳可以體外-坡化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。Shalaby,etal，J.Exp.Med.175:217-225(1992)。還已經(jīng)描述了直4妾從重組細胞物制備和分離雙特異性抗體片,殳的各種4支術(shù)。例如，已利用亮氨酸4立鏈產(chǎn)生了雙特異性抗體。Kostelny，etal.，J.Immunol.148(5):1547-1553(1992)。通過基因融合，將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽連接于兩種不同抗體的Fab'蛋白。在鉸鏈區(qū)還原抗體同二聚體以形成單體，然后^皮再氧化以形成抗體異二聚體。這種方法還可以用于生產(chǎn)抗體同二聚體由Hollinger，etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)描述的"雙特異抗體"技術(shù)已提供一種用于制備雙特異性抗體片段的可替換機制。這些片段包括重鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vh)，其通過接頭連接于輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(V。，其中接頭太短以致不允許在相同鏈上兩個結(jié)構(gòu)域之間進行配對。因此，一個片段的Vh和Vt結(jié)構(gòu)域被迫使配對于另一片段的互補VL和Vh結(jié)構(gòu)域，從而形成兩個抗原結(jié)合位點。還已經(jīng)報道了通過使用單鏈Fv(sFv)二聚體來制備雙特異性抗體片段的另一種策略。參見例如，Gruber，etal.，J.Immunol.152:5368(1994)?？商鎿Q地，雙特異性抗體可以是"線性抗體"，如在Zapata，etal.ProteinEng.8(10):1057-1062(1995)中所描述的。還預(yù)期具有兩價以上的抗體。例如，可以制備三特異性抗體。Tuttetal"J.Immunol.147:60(1991)。本發(fā)明的抗體(或多聚體或多肽)，其包括一種或多種結(jié)合位點/其臂或片段，將在本文中稱作"多價"抗體。例如本發(fā)明的"二價"抗體包含兩個結(jié)合位點/其Fab或片段，而本發(fā)明的"三價"多肽包含三個結(jié)合位點/其Fab或片段。在本發(fā)明的多價多聚體中，兩個或更多結(jié)合位點/Fab可以結(jié)合于相同或不同的抗原。例如，在本發(fā)明的多價多肽中的兩個或更多結(jié)合位點可以針對相同抗原，例如針對所述抗原的相同部分或表位或針對所述抗原的兩個或更多的相同或不同的部分或表4立，和/或可以4十只于不同4元原；或它們的《且合。因此，本發(fā)明的二價多肽例如可以包含兩個相同的結(jié)合位點，可以包含針對抗原的第一部分或表位的第一結(jié)合位點，以及針對所述抗原的相同部分或表位或4十對所述抗原另一部分或表位的第二結(jié)合位點；或可以包含針對抗原的第一部分或表位的第一結(jié)合位點和針對不同抗原的第二結(jié)合位點。然而，如才艮據(jù)上文描述將明顯的是，本發(fā)明并不限于此，這是基于以下意義上講本發(fā)明的多^f介多肽可以包含針對相同或不同抗原的任何數(shù)目的結(jié)合位點。本發(fā)明的抗體(或多聚體或多肽)，其包含至少兩個結(jié)合位點/其Fab或片段，其中至少一個結(jié)合位點是針對第一抗原以及第二結(jié)合位點是針對不同于第一抗原的第二抗原，還將稱作"多特異性的"。因此，"雙特異性"多聚體包含至少一個針對第一抗原的位點以及至少一個41"對第二抗原的第二^f立點，而"三特異的，，是一種多聚體，其包含至少一個針對第一抗原的結(jié)合位點、至少一個針對第二抗原的結(jié)合位點以及至少一個4十對第三抗原的結(jié)合位點，等等。因此，在它們的最筒單形式中，本發(fā)明的雙特異性多肽是本發(fā)明的二價多肽(每個Fab)。然而，如按照上文描述將明顯看到的，120本發(fā)明并不限于此，這是在下述意義上講本發(fā)明的多特異性多肽可以包含針對兩種或更多種不同抗原的任何數(shù)目的結(jié)合位點。(viii)其它修飾可以i殳想人源化或變體抗鞘脂抗體的其它i^飾。例如，本發(fā)明還涉及免疫偶聯(lián)物，其包含本文描述的共軛于細胞毒性劑的抗體，其中細胞毒性劑如毒素(例如，細菌、真菌、植物或動物來源的酶促活性毒素，或其片段)，或放射性同位素(例如，放射性共軛物)。利用各種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑如N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶基雙硫醇)丙酸酯(SPDP)、巰醇亞胺(IT)、亞氨酸酯的雙功能衍生物(如二亞胺4義己二酸二曱酯鹽酸鹽)、活性酯類(如辛二酸二琥珀酰亞胺酯)、醛類(如戊二醛)、二疊氮化合物(如雙(對疊氮苯甲?；?己二胺)、雙重氮衍生物(如雙(對重氮苯甲?；?-乙二胺)、二異氰酸酯(如曱苯2,6-二異氰酸酯)、以及雙活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)來制備共扼物。本文4皮露的抗鞘脂抗體還可以配制成免疫脂質(zhì)體。包含抗體的脂質(zhì)體是通過本領(lǐng)域已知的方法加以制備，如在Epsteinetal，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3688(1985);Hwang,etal.,Proc.NatlAcad.Sci.USA77:4030(1980);以及美國專利第4,485,045號和第4，544，545號中所描述的方法。具有增強的循環(huán)時間的脂質(zhì)體4皮露在美國專利第5,013,556號中。例如，可以通過反相蒸發(fā)法來產(chǎn)生脂質(zhì)體，其中脂質(zhì)成分包含磷脂酰膽堿、膽固醇以及PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)。通過失見定孔徑的過濾器擠壓脂質(zhì)體以產(chǎn)生具有所期望直徑的脂質(zhì)體。借助于二石克互換反應(yīng)，本發(fā)明的抗體的Fab'片|殳可以共扼于月旨質(zhì)體，3口在Martin,etal.,J.Biol.Chem.257:286-288(1982)中所描述的。另一種活性組分可選地包含在脂質(zhì)體中。通過本領(lǐng)域眾所周知的4支術(shù)如4吏用上述異雙功能交聯(lián)劑，可以將酶或其它多肽共價結(jié)合于抗鞘脂抗體?？商鎿Q地，利用本技術(shù)領(lǐng)i或眾戶斤周^口的重纟且DNA4支術(shù)(參見命'H口，Neuberger，etai.,Nature312:604-608(1984)),可以構(gòu)造融合蛋白，其包含至少本發(fā)明的抗體的抗原結(jié)合區(qū)并連接于至少本發(fā)明的酶的功能活性部分。在本發(fā)明的某些實施方式中，可以期望使用抗體片段，而不是完整抗體，以增加例如輩巴組織和細力包的、滲透。在這種情況下，可以期望〗奮飾抗體片,殳以增加其血清半衰期。這可以例如通過將補救受體結(jié)合表位加入抗體片段來實現(xiàn)(例如，通過抗體片段中適當區(qū)域的突變或通過將表位加入肽標記，其然后在任一端或在中部融合于抗體片,殳，例如，通過DNA或肽合成)。參見例如，美國專利第6,096,871號。人源化或變體抗鞘脂抗體的共fH，務(wù)飾也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如適用的話，可以通過化學(xué)合成或通過抗體的酶促或化學(xué)裂解來進行共價修飾。通過抗體的定向氨基酸殘基與有機衍生劑(其能夠與所選側(cè)鏈或N端或C端殘基起反應(yīng))進行反應(yīng)，可以將抗體的其它類型的共價修飾引入分子。多肽的典型的共價修飾描述在美國專利第5,534,615號中，其以引用方式結(jié)合于本文?？贵w的優(yōu)選類型的共價修飾包括，以在美國專利第4，640，835號、第4,496,689號、第4,301,144號、第4,670,417號、第4,791,192號或第4,179,337號中所陳述的方式，將抗體連接于各種非蛋白質(zhì)多聚體之一，例如，聚乙二醇、聚丙二醇、或聚氧化烯。B.載體、宿主細力包以及重組方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明還提供了編碼人源化或變體抗鞘脂抗體的分離的核酸、載體和宿主細月包(包含核酸)、以及用于生產(chǎn)抗體的重組4支術(shù)。為了抗體的重組生產(chǎn)，可以分離編碼它的核酸并將其插入可復(fù)制載體，用于進一步克隆(DNA的擴增)或用于表達。在另一種實施方式中，可以通過同源重ia來制備4元體，例3口，3口在美國專利第5,204,244號中所描述的。利用常規(guī)4i序(例如，通過4吏用寡核苷酸探針，其能夠特異性地結(jié)合于編碼抗體的重鏈和輕鏈的基因)，可以容易地對編碼單克隆抗體的DNA進行分離和測序。許多載體是可用的。載體成分通常包括但不限于下述的一種或多種信號序列、復(fù)制起點、一種或多種標記基因、增強子元件、啟動子、以及轉(zhuǎn)錄終止序列，例如在美國專利第5,534,615中所描述的。用于在本文的載體中克隆或表達DNA的適宜宿主細胞是上述原核細胞、酵母菌、或高等真核細胞。用于此目的的適宜的原核細胞包括真細菌，如革蘭陰性或革蘭氏陽性生物體，例如，腸桿菌如埃希氏菌屬，例如，大腸桿菌、腸桿菌屬、歐文氏菌屬、克雷伯氏菌屬、變形菌屬、沙門氏菌屬(例如，鼠傷寒沙門氏桿菌)、沙雷氏菌屬(例如，粘質(zhì)沙雷氏菌)、和志賀氏菌屬，以及桿菌如枯草桿菌和地衣芽3包桿菌(例如，地衣芽；包桿菌41P),4叚單胞菌屬如綠膿桿菌，以及鏈霉菌屬。一種優(yōu)選的大腸桿菌克隆宿主是大腸才f菌294(ATCC31，446),雖然其它菌抹如大腸桿菌B、大腸桿菌XI776(ATCC31,537)、以及大腸桿菌W3110(ATCC27，325)也是適宜的。這些實例是說明性的而不是限制性的。除原核細胞以外，真核孩史生物如絲狀真菌或酵母菌也是用于編碼抗鞘脂抗體的載體的適宜的克隆或表達宿主。在低等真核宿主孩史生物中，S良酒酵母、或常見的面包酵母，是最常孑吏用的。然而，在本文中許多其它屬、物種、以及菌株是通?？捎玫暮陀杏玫?，如粟酒裂殖酵母；克魯維酵母宿主如，例如，乳酸克魯維酵母、脆壁克魯維酵母(ATCC12,424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)(ATCC16,045)、K.wickeramii(ATCC24,178)、瓦爾凈爭克魯維123酵母(ATCC56,500)、K.drosophilarum(ATCC36,906)、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)、以及乳清酵母；耶氏酵母(EP402,226);巴斯德畢赤酵母(EP183,070);念J朱菌屬；里氏木霉(Trichodermareesia)(EP244,234);4且并造月7;K孑包霉；"i午旺酵母屬如西方許旺酵母；以及絲狀真菌，例如，脈孢菌屬、青霉屬、彎頸霉、以及曲霉屬宿主如構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。用于表達糖基化抗鞘脂抗體的適宜宿主細胞衍生自多細胞生物。脊推動物細胞的實例包括4i物細胞和昆蟲細胞。已鑒定了許多桿狀病毒菌林和變體以及相應(yīng)的允許昆蟲宿主細胞，其來自宿主如草地夜蛾(毛蟲)、埃及斑蚊(蚊子)、白紋伊蚊(蚊子)、黑腹果蠅(果蠅)、以及家蠶。各種各樣的用于轉(zhuǎn)染的病毒林是公開可獲得的，例如，苜蓿銀紋夜蛾NPV的L-l變體和家蠶NPV的Bm-5林，并且根據(jù)本發(fā)明在本文中上述病毒可以用作病毒，尤其用于草地夜蛾細胞的轉(zhuǎn)染。棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、牽?；?、番茄、以及煙草的才直物細月包;咅養(yǎng)物也可以用作宿主。然而，最感興趣的是脊^^動物細力包，并且在培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中脊推動物細月包的增殖已變成一種例^亍禾呈序。有用的哺乳動物宿主細胞系的實例是用SV40(COS-7,ATCCCRL1651)轉(zhuǎn)化的猴腎CV1系；人類胚胎腎系(293或293細胞，亞克隆用于在懸浮培養(yǎng)物中的生長，Graham，etal,J.GenVirol.36:59(1977));幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCCCCL10);中國倉鼠卵巢細胞ADHFR(CHO，Urlaub，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980));小鼠支持細胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980));猴腎纟田胞(CV1ATCCCCL70);非洲綠猴腎細胞(VERO-76,ATCCCRL-1587);人宮頸癌細月包(HELA,ATCCCCL2);犬腎細月包((MDCK，ATCCCCL34);布法羅大鼠肝細胞(BRL3A,ATCCCRL1442);人肺細胞(W138，ATCCCCL75);人肝細胞(HepG2，HB8065);小鼠乳腺肺瘤(MMT060562,ATCCCCL51);TRI細胞(Mather,etal.，A醒lsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982));MRC5細月包；FS4細月包；以及人肝癌系(HepG2)。用上述用于抗鞘脂抗體生產(chǎn)的表達或克隆載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，并在常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基被改進成適用于誘導(dǎo)啟動子、選擇轉(zhuǎn)化體、或?qū)幋a所期望序列的基因進行擴增。用來產(chǎn)生本發(fā)明的抗鞘脂抗體的宿主細月包可以在各種培養(yǎng)基中力口以i咅養(yǎng)。商業(yè)上可獲4尋的i咅養(yǎng)基^口Ham'sF10(Sigma)、才及P艮必需培養(yǎng)基((MEM),(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、以及Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基((DMEM)，Sigma)適用于培養(yǎng)宿主細胞。此外，在Ham,etal.,Meth.Enz.58:44(1979),Barnes,etal.,Anal.Biochem.102:255(1980),美國專利第4,767,704號、第4,657,866號、第4，927，762號、第4,560,655號、或第5,122,469號，WO90/03430,WO87/00195，或U.S.Pat.Re.30,985中所描述的任何培養(yǎng)基可以用作宿主細胞的培養(yǎng)基。必要時，任何這些培養(yǎng)基可以補兗以激素和/或其它生長因子(如胰島素、運鐵蛋白、或表皮生長因子)、鹽(如氯化鈉、氯化4丐、氯化鎂、以及磷酸鹽)、緩沖劑(如HEPES)、核香酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM藥物)、微量元素(定義為無機化合物，其終濃度通常在微摩爾范圍)，以及葡萄糖或等量能源。還可以包括適當濃度(其是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的)的任何其它必要的補充物。培養(yǎng)條件，如溫度、pH等，是先前用于宿主細胞(選擇用于表達)的那些培養(yǎng)條件，并且對于普通才支術(shù)人員而言將是顯而易見的。當使用重組技術(shù)時，可以在細胞內(nèi)、在細胞周質(zhì)腔中產(chǎn)生抗體，或抗體,皮直4妄分泌進入培養(yǎng)基。如果細胞內(nèi)產(chǎn)生抗體，作為第一步驟，除去顆粒石卒片(宿主細胞或溶解片革史)，例如，通過離心或超125濾。Carter,etal，Bio/Technology10:163-167(1992)描述了一種禾呈序，其用于分離被分泌到大腸桿菌的細胞周質(zhì)腔的抗體。簡單地說，在有乙酸鈉(pH3.5)、EDTA、以及苯甲基磺酰氟化物(PMSF)存在的條件下融化細胞糊約30分鐘以上?？梢噪x心除去細胞碎片。在抗體4皮分泌進入培養(yǎng)基的情況下，通過利用可商購的蛋白質(zhì)濃縮過濾器，例如，Amicon或MilliporePellicon超濾裝置，首先濃縮來自上述表達系統(tǒng)的上清液。在任何上述步驟中，可以包括蛋白酶抑制齊'J如PMSF，以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素以防止偶然污染物的生長?？梢岳茫?，羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、以及親和層析，對制備自細胞的抗體成分進行純化，其中親和層析是優(yōu)選的純化技術(shù)。A蛋白作為親和配體的適合性取決于在抗體中存在的任何免疫J求蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的種類和同種型。A蛋白可以用來純化基于人重鏈的4元體(Lindmark，etal.，J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。G蛋白^皮推薦用于所有小鼠同種型和用于人y3(Guss,etal.,EMBOJ.5:1567-1575(1986))。親和配體附著的基質(zhì)往往是瓊脂糖，但也可以使用其它基質(zhì)。和瓊脂糖相比，機械穩(wěn)定基質(zhì)如受控孔je皮璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯可以實現(xiàn)更快的流速和更短的處理時間。在抗體包含CH3結(jié)構(gòu)域的情況下，BakerbondABXtm初于脂(J.T.Baker,Phillipsburg，N丄)可用于純化。取決于要回收的抗體，還可以使用蛋白質(zhì)純化的其它技術(shù)，如離子交換柱分餾、乙醇沉淀、反相HPLC、碰膠層析、肝素SEPHAROSETM層析、陰離子或陽離子交換樹脂層析(如聚天冬氨酸柱)、層析聚焦、SDS-PAGE、以及硫酸銨沉淀。在任何初步純化步驟以后，可以對包含感興趣的抗體和污染物的混合物進行低pH疏水相互作用層析，其中使用pH在約2.5-4.5之間的洗脫緩沖液，并且優(yōu)選在低鹽濃度(例如，約0-0.25M鹽)下進行。C.藥劑劑型通過混合具有所期望純度的抗體和可選的生理用載體、j陚形齊寸、或3急定劑(參見，H口，Remington'sPharmaceuticalSciences16thedition,Osol，A.Ed.(1980))來制備具有凍干制劑或水溶液形式的、用于存儲的本發(fā)明的抗體或免疫衍生部分的治療配方。可接受的載體、賦形劑、或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度對于受體是無毒的，并且包括緩沖劑如磷酸鹽、檸檬酸鹽、以及其它有機酸；抗氧化劑，其包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(如十八烷基二曱基千基氯化銨；氯化六烴季銨；苯扎氯銨、千索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；羥苯烷基酯如羥苯曱酯或羥苯丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；以及間甲苯酚)；低分子量(小于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白；親水多聚體如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸、或賴氨酸；單糖、二糖、以及其它碳水化合物，其葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA;糖類如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽平衡離子如鈉；金屬復(fù)合物(例如，鋅蛋白復(fù)合物)；和/或非離子型表面活性劑3口TWEENtm、PLURONICStm或聚乙二醇(PEG)。必要時本文中的劑型還可以包含用于特定;f寺治療適應(yīng)i正的一種以上的活性化合物，優(yōu)選那些具有并不4皮此有害地影響的互補活性的活性化合物。這樣的分子的適宜用量是對于所期望的目的有效的量。活性組分還可以被截留在微膠嚢中，其中微膠嚢是例如通過凝聚才支術(shù)或通過界面聚合加以制備，例如，分別在月交體藥物遞送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳、納米顆粒以及納米嚢)或在粗乳狀液中的羥曱基纖維素或明膠-微膠嚢以及聚曱基丙烯酸曱酉旨微月交嚢。在Remington'sPharmaceuticalSciences,16thedition,Osol，A.Ed.(1980)中描述了上述技術(shù)。用于體內(nèi)給予的劑型必須是無菌的。這可以容易地例如借助于通過無菌過濾力莫的過濾來實現(xiàn)?？梢灾苽渚忈屩苿?。緩釋制劑的適宜實例包括包含抗體的固體疏水多聚體的半透基質(zhì)，該基質(zhì)具有成形物件的形式，例如，薄膜、或微膠嚢。緩釋基質(zhì)的實例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利第3,773,919號)、L-谷氨酸和Y-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙蹄酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LupronDepotTM(可注射微球，由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成)、以及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然多聚體如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能夠釋力丈分子100天以上，但某些水凝膠釋放蛋白質(zhì)更短的時間。當包膠抗體長期保留在體內(nèi)時，由于在37°C下暴露于水分的結(jié)果，它們可能會變性或聚集，這導(dǎo)致生物學(xué)活性的損失以及免疫原性的可能的變化。取決于所涉及的機制，可以設(shè)計合理的穩(wěn)定策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機制是通過硫代-二硫化物交換的分子間S-S鍵形成，則可以通過修飾巰基殘基、冷凍干燥自酸性溶液、控制水分含量、使用適當?shù)奶砑觿?、以及開發(fā)特定的多聚體基質(zhì)成分，來實現(xiàn)穩(wěn)定。D.^t體的非治療應(yīng)用本發(fā)明的抗體可以用作親和純化劑。在此過禾呈中，利用本^支術(shù)領(lǐng)域眾所周知的方法，抗體^皮固定在固相上如Sephadex樹脂或濾紙。使固定抗體接觸包含待純化鞘脂的樣品，其后用適宜的溶劑洗滌載體，其中適宜的溶劑將基本上除去樣品中除鞘脂之外的所有材料，其中鞘脂結(jié)合于固定抗體。最后，用另一種適宜溶劑，如甘氨酸緩沖液，例如在pH3至pH5.0之間，來洗滌載體，其將從抗體釋放鞘脂。抗鞘脂抗體還可以用于鞘脂的i貪斷測定，例如，；險測其在特定細月包、組織(如活才企才羊品)、或體液中的表達。上述i貪斷方法可以用于i貪斷心血管或"畝血管病或病癥。為了it斷應(yīng)用，抗體通常將^^皮標記有可才僉測部分。許多標記是可用的，其可能通常分為下列幾類(a)放射性同位素，如35S、14C、1251、3H、以及1311?？梢岳贸?J3口在CurrentProtocolsinImmunology,Volumes1and2，Coligenetal.，Ed.Wiley-Interscience,NewYork,N.Y.,Pubs.(1991)中所4苗述的技術(shù)，用》文射性同位素標記抗體，并且可以利用閃爍計數(shù)來測量放射性。(b)熒光標記如稀土螯合物(銪螯合物)或熒光素以及其衍生物、羅丹明以及其衍生物、丹磺酰、麗絲胺、藻紅蛋白以及得克薩其斤纟工是可用的。侈'H口，禾'J用在CurrentProtocolsinImmunology(上文)中披露的技術(shù)可以將熒光標記共軛于抗體。利用熒光計可以量化熒光。(c)各種酶底物標記是可用的。例如，美國專利第4,275,149號4是供了某些酶底物標記的綜述。酶通常催化發(fā)色底物的化學(xué)變化，其可以利用各種l支術(shù)加以測量。例如，酶可以催化底物的顏色變化，其可以用分光光度法加以測量?？蒦辜換地，酶可以改變底物的熒光或化學(xué)發(fā)光。以上描述了用于量化熒光變化的技術(shù)。通過化學(xué)反應(yīng)，化學(xué)發(fā)光底物變成電子激發(fā)的，然后可以發(fā)射可以測量的光(例如，利用化學(xué)發(fā)光計)或?qū)⒛芰拷o予熒光受體。酶標記的實例包括熒光129素酶(例如，螢火蟲熒光素酶和細菌熒光素酶；美國專利第4，737，456號)、螢光素、2,3-二氫氮雜萘二酮、蘋果酸脫氫酶、尿素酶、過氧化物酶如辣根過氧化物酶(HRPO)、^威性磷酸酶、p-半乳if唐苷酶、糖化酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳4唐氧化酶、以及葡萄糖-6-磷酸酯脫氫酶)、雜環(huán)氧化酶(如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化物酶、樣么過氧化物酶等。在O'Sullivan,etal.,MethodsforthePreparationofEnzyme-AntibodyConjugatesforuseinEnzymeImmunoassay,inMethodsinEnzym.(edJ.Langone&H.VanVunakis),Academicpress,NewYork,73:147-166(1981)中描述了用于將酶共軛于抗體的技術(shù)。酶底物組合的實例包4舌，例如(i)具有氫過氧化物酶作為底物的，束才艮過氧化物酶(HRPO)，其中氫過氧化物酶氧化染泮牛前體(例如，鄰苯二胺(OPD)或3,3'，5,5'-四甲基聯(lián)苯胺化鹽酸(TMB));(ii)具有對硝基苯磷酸酯作為發(fā)色底物的堿性磷酸酶(AP);以及(iii)具有發(fā)色底物(例如，對硝基苯基-P-D-半乳糖苷酶)或熒光發(fā)生底物4-甲基傘形基-(3-D-半乳糖苷酶的P-D-半乳糖苷酶((3-D-Gal)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用許多其它酶底物組合。關(guān)于這些酶底物組合的一^殳綜述可以參見美國專利第4,275,149號和第4，318，980有時，將標記間接共輒于抗體。技術(shù)人員將明了用于實現(xiàn)上述的各種技術(shù)。例如，可以將抗體共輒于生物素并且可以將上述三大類標記的任何一種共軛于抗生物素蛋白，反之亦然。生物素選擇性地結(jié)合于抗生物素蛋白，因此可以以這種間接方式將該標記共軛于抗體?？商鎿Q地，為了實現(xiàn)標記與抗體的間接共輒作用，將抗體共軛于小半抗原(例如，地高辛)以及將上述不同類型的標記之一共軛于抗半抗原抗體(例如，抗i也高辛抗體)。因此，可以實現(xiàn)j示記與4元體的間^妄共輒作用。在本發(fā)明的另一種實施方式中，抗鞘脂抗體無需#:標記，并且其存在可以利用結(jié)合于抗鞘脂抗體的標記抗體加以;險測?？梢砸匀魏我阎獪y定方法來使用本發(fā)明的抗體，如竟爭結(jié)合測定、直4妄和間*接夾心測定、以及免疫沉淀測定。參見例如，Zola，MonoclonalAntibodies:AManualofTechniques,pp.147-158(CRCPress,Inc.1987)。竟爭結(jié)合測定依賴于標記標準與試樣分析物竟爭結(jié)合于有限量抗體的能力。試樣中鞘脂的量與結(jié)合于抗體的標準的量成反比。為了Y更于確定已結(jié)合的標準的量，在竟爭以前或以后抗體通常是不溶性的，以致結(jié)合于抗體的標準和分析物可以方便地分離自仍然未結(jié)合的標準和分沖斤物。夾心測定涉及使用兩種抗體，每種能夠結(jié)合于待4企測蛋白的不同免疫原性部分、或表位。在夾心測定中，固定在固體載體上的一抗結(jié)合試樣分析物，其后二抗結(jié)合于分析物，因而形成不溶性的由三部分組成的復(fù)合體。參見例如，美國專利第4,376,110號。二抗可以本身^皮標記有可檢測部分(直接夾心測定)或可以利用標記有可4企測部分的抗免疫^求蛋白抗體加以測量(間4矣夾心測定)。例如，一種類型的夾心測定是ELISA測定，在這種情況下可檢測部分是酵。只寸于免疫組織4b學(xué)，例如，血液或纟且織才羊品可以是新鮮的或冰凍的或可以#:包i里在石蠟中并用防腐劑如福爾馬沖木加以固定?？贵w還可以用于體內(nèi)i貪斷測定。通常，抗體祐:才示記有》文射性核素(如mIn、"Tc、14C、131I、1251、3H、32P、或35S)以致可以利用免疫閃爍顯像來定位結(jié)合的耙分子。E.i會斷試劑盒為方便起見，可以將本發(fā)明的抗體提供在試劑盒中，例如，預(yù)定量的試劑的包裝組合，并帶有用于進行診斷測定的i兌明書。在用酶標記抗體的情況下，試劑盒將包括底物以及酶所需要的輔因子(例如，底物前體，其提供可檢測的發(fā)色團或熒光團)。此外，可以包括其它添加劑如穩(wěn)定劑、緩沖劑(例如，阻斷緩沖劑或裂解緩沖劑)等。各種試劑的相對量可能相差很大以提供基本上優(yōu)化測定敏感性的試劑溶液的濃度。尤其是，試劑可以提供為通常凍干的干粉，包括賦形劑，其在溶解以后將4是供具有適當濃度的試劑〉容液。F.4元體的治療應(yīng)用為了治療應(yīng)用，以藥用劑型如上述那些藥用劑型，將本發(fā)明的抗鞘脂抗體給予哺乳動物，優(yōu)選人，其中藥用劑型包括可以作為大丸劑以靜脈內(nèi)方式或通過經(jīng)一段時間的持續(xù)輸注、通過肌內(nèi)途徑、腹腔內(nèi)途徑、腦脊內(nèi)途徑、皮下途徑、關(guān)節(jié)內(nèi)途徑、滑膜腔內(nèi)途徑、鞘內(nèi)途徑、口服、局部途徑、或吸入途徑，來給予人的那些藥用劑型。為了預(yù)防或治療疾病，抗體的適當劑量將取決于待治療疾病的類型(如上述所定義的)、疾病的嚴重性和病程、纟會予抗體是用于預(yù)防或治療目的、以往治療、患者的臨床病史和對抗體的反應(yīng)、以及主治醫(yī)生的判斷力。一次或經(jīng)一系列治療將抗體適當?shù)?合予患者。取決于疾病的類型和嚴重性，給予患者的起始候選劑量是約1ug/kg至約50mg/kg(例長口，0.1-20mg/kg)的4元體，侈)H口，通過一次或多次分開給予、或通過持續(xù)輸注。取決于上述因素，典型的每日或每周劑量可以是約1jag/kg至約20mg/kg或更多。對于經(jīng)若千天或更長時間的重復(fù)給予(取決于病癥)，重復(fù)治療直到出現(xiàn)對疾病癥狀的所期望的抑制。然而，其它劑量方案可以是有用的?？梢酝ㄟ^常規(guī)技術(shù)和測定，包括，例如，放射線成像，來容易地監(jiān)測這種療法的進展。根據(jù)本發(fā)明的另一種實施方式，可以例如通過按順序或連同另一種制劑(其可有效用于那些目的，如化療抗癌藥物)給予抗體來改善抗體預(yù)防或治療疾病的有效性。上述其它制劑可以存在于要給予的組合物中或可以分開給予?？梢园错樞蚧蜻B同其它制劑適當?shù)亟o予抗體。G.制備的物件在本發(fā)明的另一種實施方式中，提供了制備的物件，其包含可用于治療上述疾病的材料。制備的物件包括容器和標記。適宜的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器、以及試管。這些容器可以形成自各種材料如玻璃或塑料。容器容納可以有效治療病癥的組合物并且可以具有無菌入口(例如容器可以是輸液袋或小瓶，其具有可以通過皮下注射針刺穿的塞子)。組合物中的活性劑是抗鞘脂抗體。在容器上或伴隨容器的標簽指明組合物用于治療所選的病癥。制備的物件可以進一步包括第二容器，其包含藥用緩沖液，如磷酸緩沖鹽溶液、林格氏液以及葡萄糖溶液。它可以進一步包括從商業(yè)和使用者角度所期望的其它材料，其包括其它緩沖液、稀釋劑、過濾器、針、注射器、包裝插件、以及使用說明書。通過參照以下實施例將可以更好地理解本發(fā)明，其中所述實施例4又用于說明目前已知的用于實施本發(fā)明的最好方式，但本發(fā)明的范圍并不限于此。實施例實施例1:SlP(SphingomabTM;LT1002)的鼠單克隆抗體一種類型的治療性抗體特異性地結(jié)合不受歡迎的鞘脂以獲得有利影響如，例如，(l)降低不希望具有的、毒性鞘脂(和/或它們的代謝前體的濃度)的有效濃度，其中鞘脂將促進不受歡迎的效應(yīng)如心臟毒性、致癌的、或生血管效應(yīng)；(2)抑制不希望具有的、毒性的、致癌的、或生血管鞘脂結(jié)合于細胞受體，從而，和/或降^f氐可用于結(jié)合上述受體的鞘脂的濃度。上述治療效果的實例包括但不限于使用抗S1P抗體來降低可用的S1P的有效體內(nèi)血清濃度，從而阻斷或至少限制S1P的致癌和生血管效應(yīng)以及其在后MI心力衰竭、癌癥、或纖維發(fā)生疾病中的作用。合成了石危醇化S1P以包含反應(yīng)基團，其能夠?qū)1P的必要的結(jié)構(gòu)特征交聯(lián)于載體分子如KLH。在免疫以前，利用標準試-驗失見程并借助于IOA或SMCC交聯(lián)將硫代S1P類似物共軛于蛋白質(zhì)載體(例如，KLH)。SMCC是一種異雙功能交耳關(guān)劑，其與伯胺和巰基基團反應(yīng)，并且是一種優(yōu)選的交聯(lián)劑。經(jīng)兩個月時間通過注射用50(ig免疫原(硫醇化1和KLH的SMCC易化共扼物)免疫瑞士韋伯斯特(SwissWebster)或BALB-C小鼠四次。在第二、第三、以及第四次免疫的兩周后收集血清樣品，并通過直接ELISA篩查抗S1P抗體的存在。按照標準融合程序，來自動物并呈現(xiàn)抗體的高滴度的脾臟隨后用來產(chǎn)生雜交瘤細月包。使獲得的雜交瘤細力包生長至匯合，其后收集細"包上清液供ELISA分析。在經(jīng)免疫的55只小鼠中，8只是良好的反應(yīng)者，其呈現(xiàn)乂tSlP具有反應(yīng)性的抗體的顯著血清滴度。隨后，按照已建立的程序，利用那些小鼠的脾臟和骨髓瘤細胞進行融合。然后通過直接ELISA篩查獲纟尋的1,500個雜交瘤細月包，產(chǎn)生287個陽性雜交瘤細胞。在通過直接ELISA篩查的這些287個雜交瘤細胞中，159個細月包顯示出顯著的滴度。然后將159個雜交瘤細胞和每一個擴大進入24孔板。然后再篩查經(jīng)擴大的雜交瘤細胞的細J包條件培養(yǎng)基以鑒定能夠分泌感興趣的抗體的穩(wěn)定的雜交瘤細胞。對60個最高滴度的穩(wěn)定的雜交瘤細胞進行竟爭性ELISA。在篩查的55只小鼠和幾乎1，500個雜交瘤細胞中，發(fā)現(xiàn)一個雜交瘤細胞呈現(xiàn)這樣的性能特點，其i正明有限稀釋法克隆是正當?shù)?，如最終產(chǎn)生真正的單克隆抗體所需要的。此過程產(chǎn)生47個無性系，其大部分被認為對于產(chǎn)生S1P抗體是陽性的。在這些47個無性系中，6個被擴大進入24孔板并隨后通過竟爭性ELISA加以篩查。從仍然陽性的4個無性系中，選擇一個來引發(fā)S1P單克隆抗體的大規(guī)模生產(chǎn)。用這些細胞注射SCID小鼠并且獲得的腹水是A蛋白，其經(jīng)純4匕(產(chǎn)率為50%)并用于分才斤內(nèi)毒素水平(<3EU/mg)。為了一輪腹水生產(chǎn)，注射50只小鼠，產(chǎn)生總共125mL腹水?？贵w被同種型為IgGlK，并且通過HPLC認為純度〉95。/。。將抗體制備在包含150mM氯化鈉(pH7.2)的20mM磷酸鈉中并存儲在-70。C。這種抗體稱為LT1002或SphingomabTM。陽性雜交瘤細胞克隆(稱為克隆306D326.26)保藏在ATCC(安全保藏4諸藏號SD-5362),并且該克隆是針對S1P的第一鼠mAb。該克隆還包含抗體重鏈和輕鏈的可變區(qū)，其可以用于生成"人源化，，抗體變體，以及構(gòu)造嵌合抗體所需要的序列信息。通過直接ELISA并利用碌u醇化SIP類似物作為抗原來篩查血清和細胞上清液的SIP特異性抗體。如下文所述，進行標準ELISA,不同之處在于，在最初溫育期間，用等容積的PBS/O.1%吐溫-20(PBST)稀釋50ul樣品(血清或細胞上清液)。在涂布有O.l昭化學(xué)合成的石克醇化SIP的96孑L高結(jié)合ELISA板(Costar)中進行ELISA，其中硫醇化SIP被共軛于結(jié)合緩沖液(33.6mMNa2C03、lOOmMNaHC03;pH9.5)中的BSA。在ELISA才反孔中，碌iJ享化SIP-BSA在37。C下溫育1小時，然后在4。C下溫育過夜。然后用PBS(137mMNaCl、2.68mMKCl、10.14mMNa2HP04、1.76mMKH2P04;pH7.4)對一反洗滌洗滌四次并在室溫下用PBST阻斷1小時。關(guān)于最初溫育步驟，用稀釋在PBST中的25uL的O.lug/mL抗SIPmAb溫育75uL樣品(包含待測量的SIP)，然后被加入ELISA斗反的孔中。在一式三分的孔中對每種才羊品進4亍處理。在室溫下溫育1小時以后，用PBS洗;條ELISA4反四次，然后在室溫下用100ul/孑L的0.1ug/mLHRP羊才元鼠二#元(secondary)(JacksonImmunoresearch)溫育1小時。然后用PBS洗滌4反四次并暴露于四甲基聯(lián)苯胺(Sigma)1-10分鐘。通過加入等體積的1MH2S04來終止沖企測反應(yīng)。通過利用EL-X-800ELISA平板讀耳又器(Bio-Tech)在450nm處的測量確定了樣品的光密度。關(guān)于交叉反應(yīng)性，如上所述，進行竟爭性ELISA,不同之處在于以下改變。最初溫育包括竟爭劑(S1P、SPH、LPA等)和生物素共專厄的抗S1PmAb。利用EZ-LinkSulfo-NHS-Biotinylation試劑盒(Pierce)進4亍經(jīng)純化單克隆抗體的生物素化。按照試劑盒試驗身見禾呈確定生物素摻入并且其范圍為7至11個生物素分子/抗體。竟爭劑的制備如下超聲處理脂質(zhì)原液，然后在DPBS/BSA[在DPBS(Invitrogen14040-133)中的lmg/ml沒有月旨肪酸的BSA(Calbiochem)]中重建以前在氬氣下干燥。必要時，將經(jīng)純化的抗SIPmAb稀釋在PBS/0.5%TritonX-100中。將竟爭劑和抗體溶液混合在一起以便產(chǎn)生3份竟爭劑與1份抗體。HRP-共軛的鏈霉親合素二抗(JacksonImmunoresearch)用來產(chǎn)生信號。竟爭性ELISA凄t據(jù)(示在圖1中，圖1A)的另一個方面是，它表明抗SIPmAb不能區(qū)別硫醇化SIP類似物與在竟爭實-瞼中加入的天然S1P。它還i正明了，4元體并不識別<壬何氧4匕產(chǎn)物，因為構(gòu)造的類似物沒有任何雙鍵。還相對于包含雙鍵的天然產(chǎn)物試-驗了抗S1PmAb，其允許在室溫下放置48小時。按照先前報道的方法(Deutschman，etal.(July2003),AmHoartJ.，vol.146(1):62-8)進行天然S1P的反相HPLC,并且結(jié)果表明保留時間沒有差異。另夕卜，示于圖1的圖片A的單克隆抗體與各種脂質(zhì)的結(jié)合特性的比較表明，由抗體識別的表位并不涉及在天然SIP的雙4建區(qū)中的烴《連。另一方面，由單克隆抗體識別的表位是包含在鞘氨醇石威基主鏈上的氨基醇加上游離磷酸鹽的區(qū)域。如果游離磷酸鹽被連接于膽堿(如同SPC的情況)，那么結(jié)合被稍微減少。如果氨基基團被酯化成脂肪酸(如同C1P的情況)，則^L測不到抗體結(jié)合。如果用甘油主鏈替換鞘氨醇氨基醇主鏈(如同LPA的情況)，則S1P特異性單克隆沒有呈現(xiàn)任何結(jié)合。這些表位作圖數(shù)據(jù)表明，在由單克隆抗體識別的S1P上^又存在一個表位，并且此表位由S1P的獨特的極性首基加以限定。在利用ELISA測量的類似實驗中，評估了適宜的對照材^F以確4呆這種4元S1P單克隆抗體并不識別蛋白質(zhì)載體或交I關(guān)劑。例力口，在將^5克醇化S1P共軛于BSA作為ELISA中的沉積材料時，通常的交聯(lián)劑SMCC交換IOA。當使用IOA時，抗體的結(jié)合特性幾乎相同于當使用BSA-SMCC-硫醇化S1P時的抗體的結(jié)合特性。類4以地，KLH交換BSA作為蛋白質(zhì)，而BSA復(fù)合于石克醇化S1P作為沉積材料。在此實驗中，抗體的結(jié)合特性也沒有顯著差異。結(jié)合動力學(xué)由于脂質(zhì)的特性，S1P與其受體或其它部分的結(jié)合動力學(xué)傳統(tǒng)上是成問題的。許多問題與脂質(zhì)的不溶性有關(guān)。對于BIAcore測量，這些問題是通過4尋SIP直4妄固定于BIAcore芯片來克服。然后使抗體沿芯片表面流動并測量光密度變化以確定抗體與S1P的結(jié)合特性。為了繞過抗體的二價結(jié)合特性，以低密度將S1P;余布在芯片上。另外，用各種密度的S1P(7、20、以及1000RU)涂布芯片并且抗體結(jié)合數(shù)據(jù)總體上適合于1:1相互作用模型。圖2所示的結(jié)果說明了由于單克隆抗體結(jié)合于S1P(在三種不同密度的S1P的情況下)所引起的光密度變化?？偟膩碚f，單克隆抗體與S1P的親和力^皮確定為非常高，在大約88皮摩爾(pM)至99nM的范圍內(nèi)，其取決于單價或二價結(jié)合;^莫型用來分析結(jié)合數(shù)據(jù)。實施，J2:ELISA測定1.定量ELISA在37°C下用稀釋在1M碳酸鹽緩沖溶液(pH9.5)中的兔抗鼠IgG、F(ab')2片萃殳特異性抗體(Jackson，315-005-047)涂布MicrotiterELISA板(孩史量滴定ELISA板)(Costar，CatNo.3361)1小時。用PBS乂于4反進4亍洗滌并在37°C下用PBS/BSA/吐溫-20阻斷1小時。為了最初溫育，非特異性小鼠IgG或人IgG的稀釋，將要測量的整個分子(用于4文準曲線)和樣品加入孔中。對壽反進行洗滌并在37。C下用稀釋為1:40,000的100ul/孑L的HRP共輒羊抗鼠(H+L)(Jackson，catNo115-035-146)溫育1小時。洗滌以后，用四曱基耳關(guān)苯胺(Sigma，catNoT0440)4企測酶促反應(yīng)并通過力。入1MH2S04來終止。利用ThermoMultiskanEX在450nm處測量光密度(OD)。將原始數(shù)據(jù)傳送到GraphPad軟件供分析。2.直接ELISA2在37°C下用稀釋在1M》友酸鹽《爰沖溶液(pH9.5)中的LPA-BSA涂布MicrotiterELISA板(Costar,CatNo.3361)1小時。用PBS(137mMNaCl、2.68mMKC1、10,1mMNa2HP04、1.76mMKH2P04;pH7.4)對^反進4亍洗滌，然后用PBS/BSA/Tween-20在室溫下阻斷1小時或在4°C下阻斷過夜。將待試驗的樣品稀釋為0.4ug/mL、0.2ug/mL、0.1ug/mL、0.05ug/mL、0.0125ug/mL、以及Oug/mL,然后將100ul力口入每個孑L。對4反進4亍洗滌并在室溫下用100ul/孑L的HRP共輒羊才元鼠(1:20,000稀度)(Jackson,cat.no.115-035-003)溫育1小時。洗滌以后，用四曱基聯(lián)苯胺(Sigma，cat.no.T0440)斥企測酶促反應(yīng)并通過加入1MH2S04來終止。利用ThermoMultiskanEX在450nm處測量光密度(OD)。將原始數(shù)據(jù)傳送到GraphPad軟件供分析。3.竟爭測定用ELISA測定試'驗了mAb的特異性。在37°C下用稀釋在1M碳酸鹽緩沖溶液(pH9.5)中的18:0LPA-BSA涂布MicrotiterELISA斥反(Costar，CatNo.3361)1小時。用PBS(137mMNaCl、2.68mMKCl、10.1mMNa2HP04、1.76mMKH2P04;pH7.4)對板進行洗滌，然后用PBS/BSA/Tween-20在37。C下阻斷1小時或在室溫下阻斷過夜。為了最初溫育，將0.4ug/mL抗LPAmAb和指定量(14:0、16:0、18:0、18:1、18:2以及20:4)的LPA、DSPA、18:1LPC(;容血石岸脂酰月旦石咸)、S1P、神經(jīng)酰胺以及神經(jīng)酰胺-l-石粦酸加入ELISA4反的孔中，然后在37。C下溫育1小時。對^反進^f亍洗滌，然后在37GC下用稀釋為1:50,000的100ul/孑L的HRP共輒羊抗鼠(1:20,000稀度)(Jackson,catNo115-035-003)或HRP共4厄羊抗人(H+L)(Jackson，catNo109-035-003)溫育l小時。；先滌以后，用四曱基聯(lián)苯胺4企測酶促反應(yīng)并通過力口入1MH2S04來終止。利用ThermoMultiskanEX在450nm處測量光密度(OD)。將原始tt據(jù)傳送到GraphPad軟件供分析。實施例3:SPHINGOMAB小鼠mAb對于SIP是高度特異的和其它生物活性脂質(zhì)相比，竟爭性ELISA說明了SPHINGOMAB對于SIP的特異性。SPHINGOMAB對于鞘氨醇(SPH)并沒有顯示交叉反應(yīng)性，其中鞘氨醇是SIP或溶血磷脂酸(LPA)的直接的代謝前體，一種重要的胞外信號分子，其結(jié)構(gòu)和功能上類^以于S1P。SPHINGOMAB并不i。、別其它結(jié)構(gòu)類似、的脂質(zhì)和代謝物，其包括神經(jīng)酰胺-l-磷酸(C1P)、二氫鞘氨醇(DH-SPH)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)、或鞘石岸脂(SM)。SPHINGOMAB確實與二氫鞘氨醇-l-磷酸(DH-S1P)、并且在更小的程度上與鞘氨醇磷脂酰膽堿(SPC),進行交叉反應(yīng)(圖3)。實施例4:在CNV的小鼠模型中SPHINGOMAB顯著降4氐CNV和瘢痕形成使雌性C57BL6/J小鼠經(jīng)受布魯赫膜的激光誘導(dǎo)破裂，然后給予稀釋在2jil生理鹽水中的0.5昭的Sphingomab或同種型-配對的非特異性(NS)抗體。在激光破裂后的第14和第28天處死小鼠。為了誘導(dǎo)CNV病變，用眼用托吡卡胺(0.5%)和去氧腎上腺素(2.5%)擴張瞳孔。將蓋玻片放置在眼上。聯(lián)接于裂隙燈(其設(shè)置為遞送150mW的100毫秒月永沖，光斑大小為50jam)的OculightGL532nm(IridexCorporation,MountainView,CA)用來在右目艮的三個象限(位于離^L盤大約50pm,并成相對的9、12以及3點的位置)破裂布魯赫膜。在所有情況下左眼作為未損傷對照。分析中排除與氣泡沒有關(guān)系的任何病變或成為融合的病變。為了測量CNV病變大小，制備了鞏膜-脈絡(luò)膜-RPE復(fù)合體的脈絡(luò)膜扁平封裝并染色脈管系統(tǒng)(蓖麻凝集素I;紅色)和周細胞(CD140b;綠色)。利用落射焚光ZeissAxioplan2以及RGBSpot高分辨率數(shù)碼相才幾和激光掃描共聚焦顯孩吏鏡(BioRadMRC1024，BioRadCorporation,Temecula,CA)來捕獲凄t字圖虧象。對于容量分析，使用了z系列捕獲并且整個z系列的病變面積的和乘以z厚度(4|^m)以獲纟尋病變?nèi)莘e。為了評估膠原沉積，用馬+>三色染色鞏膜-脈絡(luò)膜-RPE復(fù)合體。將鞏膜-脈絡(luò)膜-RPE復(fù)合體包埋在石蠟中，然后按順序被切片成6微米的厚度。評價了大約30個切片/病變。以和針對CNV病變?nèi)莘e所描述的相同方式，計算了月交原沉積的容積。利用ImageJ軟件(ResearchServicesBranch,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD)形態(tài)計量上評價了捕獲的tt字圖像。圖4A示出在布魯赫膜的激光誘導(dǎo)石皮裂以后的第14和第28天SPHINGOMAB顯著減弱月永纟各月莫新血管形成。圖4B示出在布魯赫膜的激光誘導(dǎo)石皮裂以后的第28天SPHINGOMAB顯著減少與CNV病變形成有關(guān)的纖維化。實施例5:通過多種機制，包括內(nèi)皮細胞遷移和管形成的抑制，SPHINGOMAB4卬制新血管形成SIP促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)的遷移，以及在基質(zhì)膜和其它測定中促進體外從頭BV形成的形成；SPHINGOMAB可以中和SIP的這些-丈應(yīng)。i口由Visentinetal.(CancerCell2006Mar;9(3):225-38)所描述的，進行實驗。圖5A中的數(shù)據(jù)表明在有SIP存在的條件下接種到GF-減少基質(zhì)膜上的HUVEC形成了多種毛細血管樣結(jié)構(gòu)，以及在沒有SIP存在的條件下或當與SPHINGOMAB和SIP共同溫育時，則沒有形成毛細血管沖羊結(jié)構(gòu)。圖5B中的數(shù)據(jù)說明了，相對于非治療HUVEC、或在基質(zhì)膜化學(xué)侵入測定中與SPHINGOMAB共同溫育的HUVEC,0.1-1jiMS1P能夠刺激HUVEC遷移達2-2.5倍。合起來講，這些研究說明了，SPHINGOMAB可以有效地緩和SIP對EC的促血管再生影響。實施侈'j6:通過多種才幾制，包4^體內(nèi)緩解S1P、VEGF以及bFGF的影響，SPHINGOMAB抑制新血管形成基于體內(nèi)研究，其表明S1P增加了內(nèi)皮毛細血管生長進入皮下植入基質(zhì)栓，我們推測SPHINGOMAB可以減少體內(nèi)/人頭BV形成。為對此進行研究，我們采用了用于新血管形成的體內(nèi)基質(zhì)栓測定。在一組實驗中，與lpMSlP、0.5嗎/mLbFGF或1pg/mLVEGF—起補充基質(zhì)膠，然后I.P.注射進入小鼠體內(nèi)(n=4)。在10天后，將小鼠肝素化并被注射熒光凝集素、異凝集素B4-FITC,其結(jié)合于由形成生長中的BV的血管EC表達的黏著分子。然后^f全^皮切除，冰凍在OCT中，切片并觀測FITC染色的BV。圖6A中的凄t據(jù)表明，S1P是比bFGF或VEGF更有效的體內(nèi)新血管形成的剌激劑[Lee,etal，(1999),BiochemBiophysResCommun,.vol264:743-50]，如由以下事實所i正明的與包含bFGF或VEGF的栓相比，在包含SIP的才全中有大量的FITC染色的BV。然后用蘇木素和伊紅對栓的切片進行染色，用于評估EC浸潤(圖6B)。EC的浸潤是新血管形成中的關(guān)鍵步驟。和僅栓的基質(zhì)膜相比。包含S1P的栓具有3倍增加的EC浸潤。假定細胞浸潤是EC,雖然我們知道其它細胞類型如免疫細胞也可以-故染色。甚至當SIP被加入基質(zhì)膜4全時，每48小時系統(tǒng)給予SPHINGOMAB的小鼠(在^全4直入前1天開始)也顯示出減少量的EC浸潤。這些結(jié)果說明了SPHINGOMAB體內(nèi)抑制EC浸潤的能力。來自血液和周圍癥且織的內(nèi)源性SIP可以向傷口^是供促血管再生刺S敫。研究了在傷口中SPHINGOMAB減少內(nèi)源性SIP的能力。將最佳刺激的栓(基質(zhì)月荑，補充有0.5pg/mLbFGF或10mg/mLVEGF)植入小鼠。在基質(zhì)膜植入前l(fā)天開始，每48小時小鼠接受i.p.注射25mg/kgSPHINGOMAB或鹽水。每個治療組(基質(zhì)月莫、基質(zhì)力莫加上GF或基質(zhì)力莫加上GF和纟會予的SPHINGOMAB)包括至少6只小鼠。在10天以后，用肝素治療小鼠，注射異凝集素B4-FITC,將栓切除，包埋在OCT冷凍介質(zhì)中并切片。通過凝集素-FITC染色血管來定性了解微血管密度，如圖6C所示。在對照(未治療)栓中BV染色是偶爾發(fā)生的，而包含bFGF或VEGF的栓呈現(xiàn)顯著的血管形成的i正據(jù)。和來自經(jīng)鹽水治療的小鼠的bFGF或VEGF栓相比，來自經(jīng)SPHINGOMAB治療的小鼠的栓呈現(xiàn)出BV形成的顯著減少。染色血管的量化揭示了，與用鹽水治療的動物相比，來自用SPHINGOMAB治療的動物的包含VEGF或bFGF的栓分別減少5至8.54咅的新血管形成(圖6C)。這種估計進一步i正明了內(nèi)源性血清和組織SIP增強孩史血管形成的能力以及SPHINGOMAB中和內(nèi)源性SIP的促血管再生效應(yīng)的能力。實施例7:SPHINGOMAB4卬制體內(nèi)瘢痕形成通過激活成纖維細胞遷移、增殖以及"交原生產(chǎn)，S1P對于傷口愈合具有深遠的貢獻；SPHINGOMAB則中和這些影響。利用多種類型的成纖維細胞進行的若干研究證實了SIP促進傷口愈合的能力1)S1P增加了Swiss-3T3成纖維細胞增殖，如通過311-胸普摻入并利用標準方法所測得的(圖7A)，2)在標準4爪傷傷口愈合測定中S1P促進心臟成纖維細月包的遷移(圖7B);3)S1P促進了分離自轉(zhuǎn)基因小鼠(具有月交原laGFP受體)的心臟成纖維細胞的月交原表達，如通過免疫熒光顯微鏡所指明的(圖7C);以及4)S1P誘導(dǎo)WI-38肺成纖維細胞分化成肌成纖維細胞(在瘢痕重建中具有活性的細胞)，如由肌成纖維細胞標記蛋白、平滑肌肌動蛋白的增加的表達所指明的，其中使用了免疫印跡分析(圖7D)。在每種這些測定中，SPHINGOMAB均中和S1P的效應(yīng)。預(yù)計眼成纖維細胞將類似地回應(yīng)S1P和SPHINGOMAB。已注意到心血管疾病和AMD的新生血管病變(包括瘢痕重建和其后不適當?shù)睦w維組織形成)之間的類合乂'〖生(Vine，etal.(2005),Ophthalmology,vol112:2076-80以及SeddonandChen(2004),IntOphthalmolClin,,vol44:17-39);因此，i人為SPHINGOMAB對眼新血管形成和疤痕的影響類似于它對心血管系統(tǒng)的影響。研究評價了在小鼠中在借助于左冠狀動脈前降支的連接作用永久性心月幾梗死(MI)以后SPHINGOMAB減少心臟瘢痕形成的效力。在外-+手術(shù)后48小時，開始系統(tǒng)鄉(xiāng)會予25mg/kg的SPHINGOMAB或鹽水。選擇在48小時給予抗體以使正常的修復(fù)性瘢痕形成可以在早期重建階萃殳發(fā)生并且在MI后立即允"i午有益的S1P刺激的血管發(fā)生。梗塞后兩周，將小鼠處死并通過心臟組織的馬松三色染色來了解纖維化。接受SPHINGOMAB治療的動物呈現(xiàn)出幾乎完全消除了血管周纖維化(圖7，圖片)。作為任何非特異性傷口-愈合反應(yīng)的對照，使假動物經(jīng)受沒有冠狀動脈結(jié)扎飛開胸術(shù)(圖7E)。實施例8:SIP促進眼上皮細胞和成纖維細胞轉(zhuǎn)化成產(chǎn)生收縮性瘢jU且織的肌成纖維細胞在許多眼部疾病中，病理性組織纖維化(瘢痕形成)是主要的促成因素，其中眼部疾病包4舌年齡相關(guān)性黃斑變性、并唐尿病性一見網(wǎng)膜病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病以及青光眼外科手術(shù)的后果。在i午多這些疾病中，循環(huán)生長因子和趨化因子會促進正常眼細刀包轉(zhuǎn)化成產(chǎn)生纖維收縮性瘢痕組織的細力包，其稱作"肌成纖維細胞"。通常，肌成纖維細胞負責組織修復(fù)一部分作為損傷后傷口愈合反應(yīng)。然而"幾成纖維細力包凄t目和功能的改變與一些疾病有關(guān)，這些疾病的特征在于肝臟、皮膚、肺臟、腎、心臟以及眼中的病理性瘕痕組織形成。在眼中，視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細胞轉(zhuǎn)化成肌成纖維細胞表型涉及纖維收縮膜的形成，其引起視網(wǎng)膜脫離以及隨后的禍」覺在夾陷。此外，在眼損傷以后，眼成纖維細月包的月幾成纖維細月包轉(zhuǎn)化可以導(dǎo)致產(chǎn)生異常的瘢痕組織，,人而導(dǎo)致隨后的^L力減退。雖然已鑒定了在眼中促進肌成纖維細胞形成的許多循環(huán)蛋白因子(circulatingproteinfactor)，^f旦并不^口道〉容月旨質(zhì)^口SIP在jt匕過禾呈中的作用。因此，我們檢查了S1P對若干人眼細胞系的肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化的影響。如圖8所示，S1P刺激在人^L網(wǎng)膜色素上皮細胞(圖8A)和人結(jié)月莫成纖維細月包(圖8B)中產(chǎn)生a-平滑月幾月幾動蛋白(a-SMA;—種肌成纖維細胞標記)。這些教:據(jù)首次說明了，S1P處于循環(huán)4匕學(xué)因子的環(huán)境中，這些循環(huán)化學(xué)因子促進眼上皮細月包和成纖維細"包轉(zhuǎn)^f匕成產(chǎn)生收縮性、瘢痕組織的"幾成纖維細力包，其可以有助于視網(wǎng)膜脫離、目艮纖維化以及隨后的視覺缺陷。在這些實驗中，S1P促進a-SMA表達的能力以濃度依賴性方式在一見網(wǎng)膜色素上皮細胞和結(jié)膜成纖維細胞之間有差異。如所示，在上皮細胞中在0.001pM濃度下觀測到a-SMA表達的顯著增加，其然后降低到在10(nM濃度下的基礎(chǔ)水平。與此相反，在結(jié)膜成纖維細胞中4又在10|liM濃度下觀測到a-SMA表達的顯著增加。認為這種差異起因于，與成纖維細月包相比，在上皮細月包中增加的S1P受體表達。由于增加的S1P受體表達水平，視網(wǎng)膜色素上皮細胞可能對低濃度的S1P更敏感。與此相反，在高S1P水平下，受體變得敏感或可能甚至內(nèi)在化，從而導(dǎo)致S11P的降低的刺激。145膠原是主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，其支持體內(nèi)的所有組織并且是瘢痕組織的主要成分之一。在非病理性環(huán)境中，借助于通過成纖維細胞的月交原生產(chǎn)和通過某些酶的降解之間的平#f來維持組織內(nèi)的總膠^原含量。許多涉及增加水平的瘢痕組織的疾病部分起因于生理及分子過程，其抑制瘢痕形成所需要的膠原的降解。據(jù)推測，S1P促進瘢痕組織形成的能力可能起因于其抑制膠原降解的能力，從而導(dǎo)致器官內(nèi)瘢痕組織的凈增加。因此，檢查了在人結(jié)膜成纖維細胞中S1P對纖:;容酶原激活物^^卩制劑(PAI-1)的表達的影響。增加的PAI-1表達與結(jié)締組織的蛋白降解的降低相關(guān)并且伴隨若干纖維變性疾病(其涉及增加的疤痕)；故正調(diào)節(jié)。如圖8C所示，S1P以劑量依賴性方式刺激PAI-1表達。這些數(shù)據(jù)表明，通過刺激抑制其降解的蛋白質(zhì)的表達也可以促進瘢痕組織形成，這4是示S1P是通過多種途徑來發(fā)4軍4乍用，以促進和維持與眼部疾病有關(guān)的病理性疤痕。實施例9:SPHINGOMAB4卬制炎'性和免疫細胞浸潤炎癥是重建過程中的第一反應(yīng)。它由缺血和由細胞損傷所觸發(fā)并且導(dǎo)致細胞因子表達的正調(diào)節(jié)，其刺激巨嗟細胞和中性粒細胞遷移到受傷區(qū)域以吞噬死細胞，以及進一步正調(diào)節(jié)炎性應(yīng)答[Jordan，etal.(1999),CardiovascRes,,vol43:860-78]。月巴大細胞也是炎性應(yīng)答的重要細胞介質(zhì)。由肥大細胞釋放的S1P是在炎癥的實驗動物模型中看到的"i午多不良反應(yīng)的原、因[Jolly,etal(2004),JExpMed,，vol199:959-70以及Jollyetal(2005),Blood，，vol105:4736-42]?；谠贑NV和CVD中免疫和炎性應(yīng)答的類似性，用鼠梗塞模型評價了SPHINGOMAB緩和免疫細胞浸潤進入傷口的效力，作為在AMD期間SPHINGOMAB緩和這些損傷的潛在效應(yīng)的指征[Vine:etal.(2005)，Ophthalmology,vol112:2076-80;以及SeddotiandChen(2004),IntOphthalmolClin，，vol44:17-39〗。MI四天后，分另'J矛J用146MAC-1和MCG35抗體評價了在危險區(qū)域內(nèi)巨噬細胞和肥大細胞浸潤。SPHINGOMAB顯著減小炎性巨噬細胞(圖9A)和肥大細胞(圖9B)的密度，這提示了SPHINGOMAB可以中和AMD期間的免疫和炎性損害。實施例10:SIP小鼠單克隆抗體(LT1002;SDhingomab)的可變結(jié)構(gòu)域的克隆和表征此實施例凈艮道了相對于SIP的小鼠mAb的克隆。整體策略包^括克隆輕鏈(VL)和重鏈(VH)的小鼠可變結(jié)構(gòu)i或。306DVH的共有序列顯示，恒定區(qū)片段是與丫2b同種型一致的。連同輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域(CL)和連同重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域(CH1、CH2、以及CH3)一起來克隆鼠可變結(jié)構(gòu)i或，乂人而導(dǎo)致嵌合抗體構(gòu)造物。1.鼠mAb的克隆使來自抗S1P雜交瘤細胞系306D326.1(ATCC#SD-5362)的克隆在DMEM(Dulbecco改良的4尹格爾培養(yǎng)基，包含GlutaMAXI、4500mg/LD畫葡萄灃唐、丙酮酸鈉；Gibco/Invitrogen，Carlsbad,CA，111-035-003)、10%FBS(SterileFetalCloneI,PerbioScience)、以及IX谷氨酰胺/青霉素/鏈霉素(Gibco/Invitrogen)中生長。利用基于RNeasyMini"i式劑盒(Qiagen,HildenGermany)的一呈序，總RNA分離自107個雜交瘤細力包。按照制造商的"i兌明，RNA用來產(chǎn)生第一《連cDNA(第一鏈合成i式齊'J盒，AmershamBiosciences)。通過PCR并利用MHV7引物(MHV7:5'國ATGGRATGGAGCKGGRTCTTTMTCTT-3'[SEQIDNO:I])連同IgG2b恒定區(qū)引物MHCGl/2a/2b/3混合物(MHCG1:5'-CAGTGGATAGACAGATGGGGG隱3'[SEQIDNO:2];MHCG2a:5'-CAGTGGATAGACCGATGGGGC-3[SEQIDNO:3];MHCG2b:5'-CAGTGGATAGACTGATGGGGG畫3'[SEQIDNO:4];MHCG3:5'-CAAGGGATAGACAGATGGGGC畫3'[SEQIDNO:5])來擴增免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH)cDNA。利用TOPO-TAcloning⑧試劑盒和序列將反應(yīng)產(chǎn)物連4妄于pCR2.1⑧-TOPO⑧載體(Invitrogen)。然后通過PCR從此載體擴增重鏈的可變結(jié)構(gòu)域并作為HindIII和ApaI片段插入，接著連接于表達性載體pGlD200(參見美國專利第7,060,808號)或pG4D200(同上)，其包含HCMVi啟動子、前導(dǎo)序列、以及y-1恒定區(qū)，以產(chǎn)生質(zhì)粒pGlD200306DVH(圖10)。306DVh的共有序列(如下所示)顯示恒定區(qū)片,殳是與y2b同種型一致的。類似地，利用MKV20引物(5'-GTCTCTGATTCTAGGGCA畫3'[SEQIDNO:6])連同k恒定區(qū)引物MKC(5'-ACTGGATGGTGGGAAGATGG-3'[SEQIDNO:7])來擴增免疫J求蛋白k鏈可變區(qū)(VK)。利用TOPO-TA^011^^@試劑盒和序列將此反應(yīng)的產(chǎn)物連接于pCR2.1⑧-TOPO⑧載體。然后通過PCR來擴增輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域，接著作為BamIII和HindIII片段插入表達性載體pKNIOO(參見美國專利第7,060,808號)，其包含HCMV啟動子、前導(dǎo)序歹ll、以及人k恒定結(jié)構(gòu)i或，乂人而產(chǎn)生質(zhì)并立pKN100306DVK。將重鏈和輕鏈質(zhì)粒pGlD200306DVH加上pKN100306DVK轉(zhuǎn)化進入DH4a細菌并貯存在甘油中。如由制造商(Qiagen,沒有內(nèi)毒素的MAXIPREPTM試劑盒)所描述的，來制備大型質(zhì)粒DNA。利用ABI3730x1自動測序〗義，其還將熒光信號翻譯成它們的相應(yīng)的才亥》威基序歹'J,乂于矛J用Qiagen'sQIAprepSpinMiniprepKit或EndoFreePlasmidMega/MaxiKit力口以純4b的DNA才羊品進4亍測序。將引物設(shè)計在5'和3'端，以致獲得的序列會發(fā)生重疊。引物的長度是18-24個堿基，并且優(yōu)選地它們包含50%GC含量以及沒有預(yù)測的二聚體或二級結(jié)構(gòu)。來自SphingomabTM的用于小鼠Vh和Vl結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列分別是SEQIDNO:8和9(表2)。在表2中，CDR殘基(參見Kabat,EA(1982)，PharmacolRev,vol.34:23-38)-波下劃線，并且分別示于以下的表3中。表2:來自小鼠mAb,Sphingomab,的Vh和Vl結(jié)枸域OAHLOOSDAELVKPGASVKISCKVSGFIFIDHTIHWMKOR小鼠VHPEOGLEWIGCISPRHDITKYNEMFRGKATLTADKSSTTAYISEQID結(jié)構(gòu)域OVNSLTFEDSAVYFCARGGFYGSTIWfDFWGOGTTLTVSNO:8小鼠VLETTVTOSPASLSMAIGEKVTIRCnTroiDDDMNWFQOKPGEPP結(jié)構(gòu)域NLLISEGNILRPGWSRFSSSGYGTDFLFnENMLSEDVADYYCLQSDMJFTFGSGTKLEIK表3:小鼠VH和VL結(jié)構(gòu)域的小鼠SphingomabCDR序列VtCDRCDRITTTDIDDD畫(SEQIDNO:10)CDR1EGNILRP(SEQIDNO:11)CDR2LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)CDR3VnCDRDHTIH(SEQIDNO:13)CDR1CISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:14)CDR2GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)CDR3在表4中比較了若干嵌合抗體可變(VH和VO結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。將這些變體克隆到Lonza表達載體中。小鼠VH和VL結(jié)構(gòu)域的序列用來構(gòu)造分子才莫型以確定應(yīng)爿奪哪些骨架殘基加入人源化抗體。149<table>tableseeoriginaldocumentpage150</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage151</column></row><table>相應(yīng)的核苷酸序列示在表5中表5:pATH和CDR序歹'〗<table>tableseeoriginaldocumentpage152</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage153</column></row><table>2.嵌合抗體的表達和結(jié)合性能將pGlD200306DVH加上pKN100306DVK的重鏈和輕鏈質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH4a細菌并貯存在甘油中。如由制造商(Qiagen，沒有內(nèi)毒素的MAXIPREPTM試劑盒Cat.No.12362)所描述的，制備大型質(zhì)粒DNA。對于在非人哺乳動物系統(tǒng)中的抗體表達，通過電穿孔(0.7ml,1(f個細胞/ml)并利用10ug的每種質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到非洲綠猴腎成纖維細胞細胞系COS7。在8ml生長培養(yǎng)基中平皿培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞4天。在瞬時共轉(zhuǎn)染COS細胞條件培養(yǎng)基中，以1.5pg/ml表達嵌合306DH1x306DVK-2抗體。利用SIPELISA測量了此抗體與S1P的結(jié)合。用定量ELISA確定嵌合抗體的表達水平，具體如下。用稀釋在PBS中的100(ill等分部分的0.4(uig/ml羊抗人IgG抗體(Sigma，St.Louis,MO)〉余布樣史量滴定^反(NuncMaxiSorp多孑14反，Invitrogen)，然后在4。C溫育過夜。然后用200pl/孔的洗滌緩沖液(1xPBS、0.1%TWEEN)洗滌滴定一反三次。將等分部分的200的每種稀釋的血清樣品或融合上清液轉(zhuǎn)移到涂布有毒素的滴定板，然后在37°C下溫育1小時。在用洗滌^1沖液洗滌6次以后，以1:5000稀度將羊抗人k輕鏈過氧化物酶共輒物(JacksonImmunoResearch)力口入每個孑L。在室溫下進行反應(yīng)1小時，用洗滌緩沖液洗涂滴定板6次，然后在每孔中加入150]LiL的K-BLUE底物(Sigma)，在室溫下并在黑暗中溫育10分鐘。通過加入50(il的REDSTOP溶液(SkyBioLtd.)來纟冬止反應(yīng)，然后利用MicroplaterReader3550(Bio-RadLaboratoriesLtd.)在655nm處測定吸收。來自抗體結(jié)合測定的結(jié)果示在圖11中。3.293F表達將重鏈和輕鏈質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Top10大腸桿菌(OneShotTop10化學(xué)上能勝任的大腸桿菌細胞(Invitrogen,C4040-10))并5&存在甘油中。如由制造商所描述的(Qiagen,沒有內(nèi)毒素的MAXIPREPTM試劑盒CatNo12362),制備大規(guī)才莫質(zhì)粒DNA。》于于在人體系鄉(xiāng)充中的4元體表達，利用293fectin(Invitrogen)和利用用于i咅養(yǎng)的293F-FreeStyleMedia(Invitrogen),3尋質(zhì)并立4爭染到人類胚胎腎細胞系293F(Invitrogen)。均以0.5g/mL轉(zhuǎn)染輕鏈和重鏈質(zhì)粒。以1(^個細胞/mL的細胞密度進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染3天后，在25GC下，離心(1100rpm)收集上清液5分鐘。通過定量ELISA來量4t表達水平(參見先前實施例)，并且對于嵌合抗體，表達水平為~0.25-0.5g/mL。4.抗體純化借助于使培養(yǎng)上清液以0.5mL/分鐘通過A蛋白/G蛋白柱(Pierce,Cat.No53133)以從培養(yǎng)上清液純化單克隆抗體。流動相包括IXPierceIgG結(jié)合緩沖液(Cat.No21001)和O.lM甘氨酸pH2.7(Pierce,ElutionBuffer,CatNo21004)。用IM石舞酉交鹽纟爰沖液，pH8.0，對在0.1M甘氨酸中的抗體收集物稀釋10%(v/v)，以中和上述pH。合并IgG!收集物，并相對于IXPBS(PierceSlide-A-LyzerCassette,3,500MWCO，Cat.No66382)充分透析。利用CentriconYM-3(10,000MWCOAmiconCat.No4203)并通過在2,500rcf下離心1小時來濃縮洗脫液。通過如上所述的定量ELISA并利用商用骨髓瘤IgGi貯存液作為標準來確定抗體濃度。通過ELISA并利用單克隆4元體同種型i式劑盒(MonoclonalAntibodyIsotypingKit,Sigma,ISO-2)來確定mAb的重鏈類型。5.抗體變體與SIP的比較結(jié)合下表6示出了突變體與嵌合抗體的比較分析。為了產(chǎn)生這些結(jié)果，通過對于小鼠或人IgG特異的并共輒于HRP的二抗來檢測結(jié)合的抗體。測量顯色反應(yīng)并才良告為光密度(OD)?？贵w小組(panelofantibody)的濃度為0.1ug/ml。沒有沖金測到二抗與僅涂布SIP的基質(zhì)之間的相互作用。表6:比較結(jié)合于嵌合抗SIP抗體的變體上的SIP可變域突變質(zhì)粒結(jié)合嵌合pATH50+pATH101.5CysAlapATH50+pATH112HCCysSerpATH50+pATH120.6CysArgpATH50+pATH140.4CysPhepATH50+pATH162IXpATH53+pATH101.66.通過表面等離子體共4展(SPR)來確定結(jié)合動力學(xué)用Biacore2000光學(xué)生物傳感器(BiacoreAB,UppsalaSweden)收集所有結(jié)合數(shù)據(jù)。將SIP耦聯(lián)于馬來酰亞胺CM5傳感器芯片。首先，用NHS/EDC的等量混合物激活CM5芯片7分鐘，接著用乙二胺進行7分鐘阻斷步驟。接著，使石黃基-MBS(PierceCo.)以在HBS流動緩沖液(10mMHEPES、150mMNaCl、0.005%p20、pH7.4)中的0.5mM的濃度通過表面。將S1P稀釋到HBS流動緩沖液中至O.lmM的濃度并注射不同長度的時間，以產(chǎn)生兩種不同密度的S1P表面(305和470RU)。4妄著，收集mAb的結(jié)合數(shù)據(jù)，其中<吏用34咅稀釋系歹0，只t于小》鼠、201308、201309、以及207308*1體分別開始于16.7nM、50.0nM、50.0nM、16.7nM、以及16.7nM。重復(fù)試驗每個濃度。用50mMNaOH來再生表面。所有數(shù)據(jù)是在25。C下收集。利用參考表面以及空白注射來處理反應(yīng)數(shù)據(jù)。將數(shù)據(jù)集(來自兩個表面的反應(yīng)并且每種變體試驗兩次)適合于相互作用模型以獲得結(jié)合參數(shù)。利用1:1(小鼠)或1:2(變體)相互作用模型總體上擬合來自不同mAb濃度的數(shù)據(jù)，以確定表觀結(jié)合速率常數(shù)。圓括號內(nèi)的數(shù)目表示在最后一位數(shù)的誤差。實施例11:與S1P的嵌合mAb如在本文中所使用的，術(shù)語"嵌合"抗體(或"免疫球蛋白")是指一種分子，該分子包含重鏈和/或輕鏈，其相同于或同源于在衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類或亞類的抗體中的對應(yīng)序列，而鏈的其余部分相同于或同源于在彩t生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類或亞類的抗體中的對應(yīng)序列，以及上述抗體的片段，只要它們呈現(xiàn)所期望的生物學(xué)活性(Cabilly，etal.,上文；Morrisonetal，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6851(1984))。利用可變區(qū)(Fv),從包含人IgGl免疫球蛋白的Fc區(qū)的特定的雜交瘤細胞(ATCC安全保存保藏號SD-5362)產(chǎn)生與SIP的嵌合抗體，其中可變區(qū)(Fv)包含鼠抗體的活性SIP結(jié)合區(qū)。Fc區(qū)包含人抗體的CL、ChL、以及Ch3結(jié)構(gòu)域。不受限于特定的方法，嵌合抗體還可以產(chǎn)生自人IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、或IgM的Fc區(qū)。如那些本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了的，可以通過4并接鼠抗S1PmAb的互補決定區(qū)(CDR,例如，CDR1-4)來產(chǎn)生"人源化，，抗體，其中鼠抗SlPmAb包含人抗體骨架區(qū)(例如，F(xiàn)rl、Fr4等)，如IgGl的骨架區(qū)。圖11示出了在利用石克醇化S1P作為沉積材一牛的直4妾ELISA測量中嵌合的以及全小鼠mAb的結(jié)合。對于圖11所示的直接ELISA實驗，與S1P的嵌合抗體具有與全小鼠單克隆抗體類似的結(jié)合特性。在結(jié)合纟爰沖液(33.6mMNa2C03、lOOmMNaHC03;pH9.5)中，并在96孑L高結(jié)合ELISA平板(Costar)中實施ELISA,其中平板涂布有0.1ug化學(xué)合成的、共軛于BSA的石克醇化S1P。在ELISA平板中，在37°C下溫育硫醇化S1P-BSA—'h時，或在4。C下溫育過夜。然后用PBS(137mMNaCl、2.68mMKCl、10.14mMNa2HP04、1.76mMKH2P04;pH7.4)洗滌平4反四次，4妄著在室溫下用PBST阻斷1小時。對于最初溫育步驟，用在PBST中稀釋的25jaL的0.1jag/mL抗SIP單克隆抗體溫育75uL樣品(包含待測量的SIP),然后將其加入ELISA平板的孑L中。在三個孔中對每個樣品進行測試。在室溫下溫育1小時以后，用PBS洗滌ELISA平板四次，然后在室溫下用100ul/孔的0.1ug/mL的HRP羊4元鼠二4元(JacksonImmunoresearch)S顯育1小時。然后用PBS洗滌平板四次并暴露于四曱基聯(lián)苯胺(Sigma)1-10分鐘。通過加入等容積的lMH2S04來終止^r測反應(yīng)。利用EL-X-800ELISA平才反讀取器(Bio-Tech)在450nm處進4亍測量以確定才羊品的光密度。而且，測量免疫動物血清或產(chǎn)生抗體細"包如雜交瘤細"包的細胞條件培養(yǎng)基(例如，上清液)中的抗體滴度的優(yōu)選方法涉及用靶配體(例如，S1P的疏醇化類似物、LPA等)涂布ELISA平板，其中該輩巴配體已共^f介連4妄于如BSA的蛋白質(zhì)載體。不受特定的方法或?qū)嵤├南拗?，可以相對于其它脂質(zhì)輩巴如LPA、PAF、神經(jīng)酰胺、石危普脂、腦苷脂、心磷脂、石粦脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、類花生酸、以及其它白三烯等來產(chǎn)生嵌合抗體。另外，如果需要的話，許多這些脂質(zhì)還可以#皮糖基化和/或乙酰化。實施例12:人源4匕抗S1P單克隆抗體LT1009(Sonepcizumab)的產(chǎn)已表明特異性地結(jié)合S1P的鼠抗S1P單克隆抗體306D(LT1002;Sphingomab)可以在各種動物才莫型中有效地抑制血管發(fā)生和腫瘤生長。如下所述，利用序列同一性和同源性搜索將小鼠CDR拼接到其中的人骨架和用來指導(dǎo)某些骨架回復(fù)突變的計算機生成的才莫型來對LT1002進4亍人源化。兩種變體，HuMAbHCLC(LT1004)(在輕鏈中具有3個回復(fù)突變)和HuMAbHCLCs(LT1006)(在輕鏈中具有5個回復(fù)突變)，在納摩爾范圍內(nèi)呈現(xiàn)結(jié)合親和力。進行進一步的設(shè)計以努力改善人源化變體的生物物理特性和生物學(xué)特性。人源4b變體HuMAbHCCysAlaLC3(LT1007)和HuMAbHCCysAlaLC5(LT1009),其中HCDR2中的游離半胱氨酸殘基被丙氨酸替換，在皮摩爾范圍內(nèi)呈現(xiàn)結(jié)合親和力。所有人源化變體在年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)的力永絡(luò)力莫新血管形成(CNV)模型中抑制血管發(fā)生，其中和親代鼠抗體相比，HuMAbHCCysAlaLC5(LT1009)呈現(xiàn)優(yōu)越的穩(wěn)定性和體內(nèi)效力。變體huMAbHCcysalaLQ(LT1009)稱作SonepcizumabTM。a.用于抗SIP抗體的人源化設(shè)計借助于CDR拼接來人源化小鼠mAbLT1002(Sphingomab)的可變結(jié)構(gòu)域(Winter美國專利第5,225,539號)。如Kabatetal.1991所描述的，基于序列高變性而鑒定CDR殘基。在此研究中，基于利用結(jié)構(gòu)序列對比程序(SRv7.6)在IMGT和Kabat數(shù)據(jù)庫中進行的人抗體的同源性搜索來選擇適宜的受體結(jié)構(gòu)。最初步驟是分別用LT1002VH和VL蛋白質(zhì)序列查詢這些人重鏈可變(VH)和輕鏈可變(VL)序列數(shù)據(jù)庫，以鑒定在FR中、在Vernier(Foote，J.&Winter，G.Antibodyframeworkresiduesaffectingtheconformationofthehypervariableloops.JMol.Biol.224，487-499(1992))、Canonical(Morea,etal.，Antibodymodeling:implicationsforengineeringanddesign,Methods20,267-279(2000))以及VH-VL界面(Chothia，C,NovotnyJ.,Bruccoleri，R.,&Karplus,M.Domainassociationinimmunoglobulinmolecules.Thepackingofvariabledomains.JMol.Biol.186,651-663(1985))殘基處具有高序列同一性以及具有相同標準類和/或長度的CDR的人骨架(FR)。利用上述程序計算了此文庫的每個成員與鼠抗體的單個序列對比殘基的同一性。鑒定了那些人序列，其具有大部分相同于小鼠FR的FR序列，從而產(chǎn)生人"受體，，序列的最初短清單。還計算了在《鼓調(diào)(Vernier)、標準(Canonical)以及VH-VL界面(VCI)殘基處與鼠抗體具有最大同一性的那些序列。在人和d、鼠之間在這些位置的差異分為保守取代和非保守取代，從而最好的骨架選擇將具有與LT1002的最小凄t目的非4呆守VCI差異。LT1002的CDR環(huán)L3和HI可以分為典型結(jié)構(gòu)。這些L3和HI結(jié)構(gòu)用來選4奪具有相同典型結(jié)構(gòu)的人抗體FR。對于未分類的CDR，則試圖選擇具有相同于鼠抗體的CDR長度的人骨架?；纠碛稍谟?，CDR環(huán)結(jié)構(gòu)不僅取決于CDR環(huán)序列本身而且還取決于基礎(chǔ)的骨架殘基(典型殘基)。因此，具有匹配的典型的CDR結(jié)構(gòu)和/或CDR長度的人骨架可以以最合適的取向容納拼接的小鼠CDR,以保持抗原結(jié)合親和力。對于除CDRH3之外的所有CDR，這可以通過選擇人骨架序列來實現(xiàn)。另外，在可能的情況下，排除具有異常半胱氨酸或月甫氨酸殘基的骨架。分別對重鏈和輕鏈序列進行這些計算。最后，在整個骨架區(qū)，比較了在最好匹配序列中的單個序列差異。在最適合上述比專交計算的人抗體中，分別選才奪抗體AY050707和AJ002773作為輕鏈和重鏈的最合適的人骨架提供者。第二步驟是產(chǎn)生LT1002的可變區(qū)的分子模型以及鑒定FR殘基，其可能影響抗原結(jié)合但并不包括在Vernier、Canonical以及界面殘基的組中。檢查了拼接供體和受體可變結(jié)構(gòu)域的許多結(jié)構(gòu)特征，以更好地理解各種FR殘基如何影響CDR環(huán)的構(gòu)象，并且反之亦然。按照Vernier和Canonical定義(參見上文)鑒定了在LT1002中可能影響CDR的非保守FR殘基，由此將人FR的若干殘基恢復(fù)到原來的小鼠氨基酸(回復(fù)突變)。b.誘變壽ll用QuikChangeSite-DirectedMutagenesisKit(Stratagene,Catalog#200524)在可變結(jié)構(gòu)域序列內(nèi)產(chǎn)生突變。用50ng雙鏈DNA沖莫板、2.5U的PfuUltreHFDNA聚合酶和其相應(yīng)的纟爰沖液(Stratagene,Catalog#200524)、10mMdNTP混合物和125ng每種再懸浮在5mMTris-HCl(pH8.0)中的誘變寡核苷酸、以及0.1mMEDTA進行個別反應(yīng)。在95°C下進行預(yù)變性30秒，4妄著進行16次擴增循環(huán)95。持續(xù)C30秒，55°C持續(xù)60秒以及68。C持續(xù)8分鐘。在溫度循環(huán)以后，然后在37。C下借助于Dpnl消化而消化最終反應(yīng)1小時以除去甲基化親代DNA。將獲得的突變體轉(zhuǎn)化成感受態(tài)的XL1-Blue大腸桿菌并平皿培養(yǎng)在包含50昭/ml氨爺西林的160LB-瓊脂上。然后通過測序來4企查集落。然后將每種突變體在1升搖并瓦中；咅養(yǎng)并利用來自Qiagen的EndoFreePlasmidPurificationKit(catalog#12362)力口以純化。c.人源化抗體變體的生成通過將LT1002的可變結(jié)構(gòu)域克隆到載體來構(gòu)建小鼠-人嵌合抗體(chMAbSlP),其中載體包含k和重鏈的人恒定區(qū)以^f吏全長抗體可以表達進入哺乳動物細月包。人源化重鏈的產(chǎn)生是KabatCDR1、2以及3從LT1002VH拼接到AJ002773的受體骨架的結(jié)果。AJ002773的最近的種系基因是VH5-51,其前導(dǎo)序列凈皮結(jié)合到人源化重鏈變體中作為前導(dǎo)序列。表4示出了pATH200的蛋白質(zhì)序列、LT1002VH的第一人源化變體，并具有VH5-51前導(dǎo)序列。在LT1002的VH結(jié)構(gòu)域的情況下，在位置2、27、37、48、67以及69處的殘基是Vernier殘基或在Vh和VL結(jié)構(gòu)域界面處的殘基，由此可能影響CDR耳又向。位置37對于Vh和VL結(jié)構(gòu)域之間的界面似乎是關(guān)4建的。在人骨架中在這些位置的殘基與存在于相應(yīng)位置的鼠殘基發(fā)生回復(fù)突變。逐個地試驗了突變V37M、M48I以及Y27F。一種變體(pATH205)包含所有3種突變連同V67A加上I69L,而另一種變體(pATH206)包含所有5種突變加上V2A。人源化輕鏈的產(chǎn)生是KabatCDR1、2以及3從LT1002Vl掛接進入AY050707的受體骨架的結(jié)果。AY050707的最近的種系基因是Lll，其前導(dǎo)序列被結(jié)合到人源化輕鏈構(gòu)建體中。pATF300(LTl002輕鏈)的蛋白質(zhì)和DNA序列分別是SEQIDNO:17和28(關(guān)于氨基酸序列，參見表4)。在VL的情況下，選擇四個非保守Vernier位置4、36、49、64用于回復(fù)突變到鼠殘基，因為它們參與支持CDR環(huán)的結(jié)構(gòu)。LT1002的分子才莫型的檢查表明，Tyr67靠近CDR表面并取向于抗原結(jié)合平面并且能夠與S1P相互作用。因此，將S67Y回復(fù)突變也加入到之后的人源化變體中。分別引入兩種突變以產(chǎn)生包含Y49S或Y36F的兩種變體?！轿糁谕蛔兊囊韵隆肚液袭a(chǎn)生了若干變體(Y49S,F4V)、(Y49S，Y36F)、(Y49S,Y36F，F(xiàn)4V)、(Y49S,G64S)、(Y49S，Y36F,F4V,G64S)、(Y49S，Y36F，F(xiàn)4V，G64S，S67Y)、(Y49S，G64S，S67Y)。d.人源化前導(dǎo)候選物的選擇將基本拼接本(basicgraftedversion)(pATH200和pATH300)和所有包含回復(fù)突變的變體的可變區(qū)克隆到包含人VH或VL恒定區(qū)的表達性載體中。在與嵌合(chMAb)抗體相同的條件下在哺乳動物細胞中產(chǎn)生所有人源化變體，然后通過ELISA試驗與S^P的結(jié)合。對于人源化變體，產(chǎn)率為大約10-20mg/l，而對于chMAbSlP，產(chǎn)率則為0.3-0.5mg/1。在還原條件下的SDS-PAGE揭示了在25kDa和50kDa處并具有高純度(>98%)的兩個條帶，其與輕《連和重鏈的預(yù)期質(zhì)量一致。在非還原條件下觀測到預(yù)期質(zhì)量約為~150k的單條帶。在人源化抗體結(jié)合測定中使用chMAb作為標準，因為它包含與親4義鼠抗體相同的可變區(qū)并且攜帶與人源4b抗體相同的恒定區(qū)，因而可以利用相同的ELISA試-驗失見程加以一僉測。最初的人源化抗體，其中將6個鼠CDR^H妄到未突變的人骨架中，該抗體并不顯示與SIP的任何可檢測的結(jié)合(圖11)。包含4個回復(fù)突變(Y49S、Y36F、F4V以及G64S)的K輕鏈，連同嵌合重鏈，呈現(xiàn)與S1P的次優(yōu)結(jié)合(如通過ELISA測得的)。在位置Y67結(jié)合另外的突變可顯著改善結(jié)合。包含回復(fù)突變Y49S、Y36F、F4V、G64S以及S67Y的變體pATH308以及包含回復(fù)突變Y49S、G64S以及S67Y的變體pATH309,連同嵌合重鏈，均產(chǎn)生抗體，其與嵌合抗體類似地結(jié)合S1P(如通過ELISA確定的)。從SIP結(jié)合的角度考慮，并不認為兩個突變Y36F和F4V是回復(fù)突變所必需的。需要在VL骨架中設(shè)計3至5個回復(fù)突變以恢復(fù)活性。Vernier回復(fù)突變V37M連同嵌合輕鏈結(jié)合到重鏈的人骨架中，足以恢復(fù)類似于嵌合抗體的結(jié)合特性(圖11)?？傊?，LT1002VH結(jié)構(gòu)域的人源化僅需要來自鼠類骨架序列的一個氨基酸，而鼠VL骨架結(jié)構(gòu)域，必須保留三個或五個鼠類殘基以實現(xiàn)相當于鼠親代LT1002的結(jié)合。e.人源化前導(dǎo)候選物的優(yōu)化鼠抗S1P抗體包含在重鏈的CDR2(Cys50)中的游離半胱氨酸殘基，其能夠潛在地引起抗體分子的某種不穩(wěn)定性。利用定點誘變，并通過用丙氨酸(huMAbHCcysalaLC)(pATH207)、甘氨酸(huMAbHCcysalaLC3)、絲氨酸(huMAbHCcysserLC3)、以及苯丙氨酸(huMAbHCcyspheLC3)來取代半胱氨酸殘基乂人而產(chǎn)生pATH201的變體。還用包含5個回復(fù)突變(huMAbHCcysalaLC5=LT1009)的人源化輕鏈(pATH308)測試了半胱氨酸突變重鏈。將變體在哺乳動物細胞中表達，然后用一小組體外測定加以表征。重要的是，人源化變體的表達率顯著高于chMAbS1P。f.人源化前導(dǎo)候選物的深入表征i.特異性。相對于S1P和若千其它生物脂類,用竟爭性ELISA測定測試了人源化變體的特異性(圖1)。這種測定具有i更于表位作圖的另外益處。人源化抗體LT1009表明對于鞘氨醇(SPH)，S1P的直接代謝前體，或LPA(溶血磷脂酸)沒有交叉反應(yīng)性，其中LPA是一種重要的胞外信號分子，其結(jié)構(gòu)和功能上類似于S1P。此外，rhuMAbSIP并不識別其它結(jié)構(gòu)類似的脂質(zhì)和代謝物，包括神經(jīng)酰胺(CER)、神經(jīng)酰胺-l-磷酸酯(C1P)。然而，正如所預(yù)期的，LT1009確實與鞘氨醇磷酸膽堿(SPC)交叉反應(yīng)，鞘氨醇磷酸膽堿是一種脂質(zhì)，其中S1P的游離磷酸基團連接于膽堿殘基。重ii.結(jié)合親和力。如圖11所示，IgG結(jié)合于S1P涂布芯片的Biacore測量結(jié)果表明變體LT1004或LT1006在4氐納摩爾范圍內(nèi)(類似于chMAbS1P)呈現(xiàn)結(jié)合親和力。其中半胱氨酸殘基被丙氨酸替換的人源化變體LT1007和LT1009在皮摩爾范圍內(nèi)呈現(xiàn)結(jié)合親和力，其類似于小鼠親代LT1002(SphingomabTM)。穩(wěn)定性。在高溫刺激以后，測試人源化變體的穩(wěn)定性。通過使上清液經(jīng)受60至74°C的溫度范圍，確定每種人源化變體的熱解折疊轉(zhuǎn)變溫度(rM)和適當?shù)闹悬c。這些溫度的選擇是基于在50和80。C之間的專交寬溫度范圍內(nèi)在熱攻擊以后針7于鼠抗體分子所7見測到的變性輪廓。在熱攻擊前后確定每種變體的結(jié)合性能。鼠抗體呈現(xiàn)65。C的rM。和所有其它變體相比，變體huMAbHCcysalaLC5(LT1009)呈現(xiàn)優(yōu)越的rM。表7示出前導(dǎo)人源化候選物以及它們的特性。表7:前導(dǎo)人源4匕SIPmAb4吳選物和^i指出在重鏈和輕鏈中的突變數(shù)目。i兌明欄給出重鏈和輕鏈的同一性。<table>tableseeoriginaldocumentpage165</column></row><table>iv.序列如同天然存在的抗體一樣，在每兩個輕鏈多肽和每個重鏈多肽(其包含每種抗體分子)中LT1009包括三個互補決定區(qū)(每個"CDR")。下面提供了這些6個CDR的每一個的氨基酸序歹'J("VL，，表示免疫J求蛋白輕鏈的可變區(qū)，而"VH"表示免疫球蛋白重鏈的可變區(qū))CDR1VLCDR2VLCDR3VLCDR1VH165:ITTTDIDDD畫[SEQIDNO:10]:EGNILRP[SEQIDNO:11]:LQSDNLPFT[SEQIDNO:12]:DHTIH[SEQIDNO:13]CDR3VH:GGFYGSTIWFDF[SEQIDNO:15]CDR2VH:AISPRHDITKYNEMFRG[SEQIDNO:31]LT1009的重《連和輕鏈多肽的核苷酸和氨基酸序列列于如下可變結(jié)構(gòu)域的LT1009HC氨基酸序列[SEQIDNO:32]:1mewswvflfflsvttgvhsevqlvqsgaevkkpgeslkiscqsfgyifid51htihwmrqmpgqglewmgaisprhditkynemfrgqvtisadkssstayl101qwsslkasdtamyfcarggfygstiwfdfwgqgtmvtvss可變結(jié)構(gòu)j或的LT1009LC氨基酸序列[SEQIDNO:33]:imsvptqvlgilllwltdareettvtqspsflsasvgdt:vtiteitttdid51.cidmnwfqqepgkap.kllisegnilrpgvpsrfsssgygt.dftltisklqp10iedfatyyclqsdnlpftfgqgtkleik1661aagettgrecgeeac:c;at:gga51cgtgaccdcaggcgtgcatt101aggtgaaaa.agcccggggag151.tscatc;tttategaeeatae20.1a.gg'ectgg的tggatggggg25ia.caatgagatgttcaggggc301agcaccgcct.acttgcagtg351gtatttctgtgega，gggg40itttggggccaagggacd:atg451ecatcggtcttceccctgge5G1agcggccctgggctgectgg551tgtcgtgga:actcaggcgcc601gtcctac:agtcct.caggact651ctccagcagcttgggcaccc701ccagcatacatGcaaggtggee751，ga冊gtgtctgctggaag801cc;ggctatgcagtcccagteS5ittcacccggaggcctctgcc901ctggetttttecdcaggcte351c.aggccctgcaeacs歸ggg1001catatccgggaggaccctge1051etct.ec;3etc;cctC3ge七cgllOl.cteccaatcttctctctgca1151tgcccacGgtg'cccsggtaa1201gcgggacaggtgc.cctagag1251.gg'tgctgacacgtccacctcI30igggaccg'tca.gtc.tt.cctct1351tctcccgga.c.ccctgaggtc1401gacec'tgaggtea'ag'ttcaa1451tgecaagacaaagcegcggg1501teagegtecteaecgtectg1551aagtgcaaggtctccaac.aa160:1ctccaa.agccaaag:gtggga165iggccggctcggcccaecctc1701tgtccetac'agggcagccec175icccgggagga.訴tg'accaagggcttctatcccagcgacat1851ggagaacaactacaagacca1901tcttcctcta:tagcaagcte1951.aacgtcttctcatgctccgt2001gcagaagagectctccctgtat的agctgggtgttcctgttctttctgtectgaggtgcagc.tggtgcdgtctggagctetctgaagatctcctgtcagagttttggatatteaet的atgcgccagatgccc萌gcaetatttcteecagacatgartattactaaatcaggtcaccatctcagccgacaagtccagc■gagcagcctgaaggcctcggracaccgccat的ttetac的tagtactatctgg比tgactgtcaccgtG仁cttcagcctccaccaagrggcacectcctccaagagpcacetct的gggcactcaaggactacttccccgaaceggt.gacggctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctetactcccteagcagcgtggtgaccgtgccagacctacatctgcaacgtgaatc'acaagcaagag恩gttggt:gagraggc:cagedc呵ggacca鄉(xiāng)ctcagcgctcctgcctggacgcatccagggcageaaggcaggccccgtctgcctccgccccacitcat.gctcagg'gagagggtct.ttgggeaggeacaggctaggtgeceetaaccgcaggtgctgggctc的acctgccaagagcccctgacctaa.gcccaccccaaaggccaaagaeaccttctcteeteec改gattceagtaag:ageec歸atcttgtgacaaaacteacacagccdgcccsggcctcgccctccagctcaagtag.cctgcatccagggacaggccccagccgc.atctcttcctcagc:acctgaactcctgggtcccccc歸aac.cc歸ggaeaccetcatgaacatgcgt冊tggtggacgtgagcc.acgaactg'gtacgtggaGggcgtgga.ggtgcataaagga'gcagtac'aacagcacgt'accgtgtggeaecaggae.tggetgaatggeaa的agtaeagccctccc.agccccestcgagaa縣ccatcccgt.ggggtgcgag，ccatcatggacagatgccctgagagftgaccgctgt.acca,acetcgaga.aceacaggtgtacaceetgeccccatMeeagg'tcagcctgacctgcctggtc歸acgccgtggag'tgggagagcaatgggcagc:cegcetcccgtgctggac'teegacggctcc;taccgtggacaagagcaggtggcageagggggatgcatgaggctctgcaeaaecactacacctccgggt.綠atagLT1009HC氨基酸序列[SEQIDNO:35]:■mewswvflfflsvttgvhsevqlvqsga.evkkpgesl'kiseqsfgyifi(i■51hti.hw匿qmp10]，sslfeasdl:151lapsskstsg201glyslsswt251fppkpkdtlm301eeqynstyrv351pi:epqvytip401ttp.pvldsdg451l鄰g'ka,fcarggfgtaalgelvkvpsssigtqtvsvltvlhqdpsreemtknqsfflyskltvsprhciitkynygstiwfdfwyicnv油kps■vvdvshedpewlngke.ykck柳frgqvtisgqgt醇t.vsswnsgaltsgvntkvdkr-va'pvkfrjwyvclgvv.snkaipapifscsvmheslhtfpaviqsseliggpsvf1evhnaktkprektiskakgqsngqpe加ykhnhytqkslsLT1009LC核普酸序列[SEQIDNO:36〗:1aagcttgccg51gctgtggctg101ccttcctgtci51accact.gata■201a.gcccct站g■251catcaa.gatt.301agc餘Attge351taacttacca401cggt.ggctgc451aaatctggaa501agaggcc33a.551cccaggagagSOIagcagc.aecc651cgcctgcgaa.;'01tcaaca.ggggccaccatgtcacagacgccctgcatctgtattgatgatgactcctgatctcagcagcagtagectgaagattcactttcgacc改.tctgtcctgcctctgtgtacagtggatgtcacagagtgacgctgaggtcacccatcagagtgtt.agtgtgcctscc.getgtgaaacg'gragac'agagtatgaactggggatatg'gcattttgcaact.gccaagg'gacttcstcttcctgtgtgcctgaggtggat為acaggacagcacaggtgctgggacagtgacgtcscc3tcacttccagcaggtattcttcgteaga.tttcactattaetgttcaa.gctggagcgccatctg3ctgaataa.ctaggacagcactacgagaaacctc.gcccgtc■gactgctgctca.gtctccattt.gcataaccaaccagggaacetggggtcctCtC3CC3tCtgcagagtgatgagcagttgtc'tatcccatgtegggtaactctacagcctcacaaagtctaacaaag'agctLT1009LC氨基酸序列[SEQIDNO:37]:.1msvptqvlgllUwltciarc:ett:vtqspsfisasvgdrTrtitcitttdid51dW啦wfqqepgkapkllisegniirpgvpsrfsssgygtclftlt.isklqp101edfaty:yelqsdnlpftfgqgtkieikrtvaapsvfifppsd夠lksgta151svvcll加fypreakvqwkvdnalqsgnsq;esvteqdskcistyslsstlt201lsikadyekhkvyace'vt.hqglsspvtksfnrgec實施例13:人源化SIPmAb的生產(chǎn)和純化此實施例描述了重組人源化單克隆抗體(LT1009;SonepcizumabTM)的生產(chǎn)，其高親和力地結(jié)合于生物活性脂質(zhì)鞘氨醇-l-磷酸(SlP)。LT1009是全長IgGlk同種型抗體，由兩個相同的輕鏈和兩個相同的重鏈組成，并且總分子量為150kDa。重鏈包含N連接的糖基化位點。寡糖結(jié)構(gòu)的特性還未確定，但預(yù)計是具有核心巖藻糖的復(fù)合雙觸角結(jié)構(gòu)。目前并不知道將占主導(dǎo)地位的糖型的特性。由于在重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域中存在賴氨酸殘基，預(yù)計會存在某種C端異質(zhì)性。兩個重鏈通過兩個鏈間二硫鍵彼此共價耦聯(lián)，其與人IgGl的結(jié)構(gòu)是一致的。LT1009最初來源于鼠單克隆抗體(LT1002;Sphingomab),其是利用雜交瘤細il包所產(chǎn)生，其中雜交瘤細^^產(chǎn)生自用S1P免疫的小鼠。鼠抗體的人源化涉及插入6個鼠CDR來代^,人抗體骨架的CDR，其選用是基于與鼠親代抗體的結(jié)構(gòu)類似性。在骨架中進行了一系列取代以設(shè)計人源化抗體。這些取代稱作回復(fù)突變并且用鼠殘基代替人殘基，其中鼠殘基在抗體與抗原的相互作用中具有重要作用。最后的人源化變體包含在重鏈的可變結(jié)構(gòu)域的人骨架中的一個鼠回復(fù)突變和在輕4連的可變結(jié)構(gòu)域的人骨架中的五個鼠回復(fù)突變。此外，在重鏈的CDR#2中存在的一個殘基一皮替換為丙氨酸殘基。這種取代顯示可增加抗體分子的穩(wěn)定性和潛能。將人源化可變結(jié)構(gòu)域克隆到Lonza的GS基因表達系統(tǒng)以產(chǎn)生質(zhì)粒pATH1009。該表達系統(tǒng)由攜帶抗體基因的恒定結(jié)構(gòu)域的表達性載體和選擇標記谷氨酰胺合成酶(GS)構(gòu)成。GS是負責從谷氨酸酯和氨生物合成谷氨酰胺的酶。攜帶抗體基因和選擇標記的載體被轉(zhuǎn)染到適合于在無血清培養(yǎng)基中生長的專有的中國倉鼠卵巢(CHOK1SV)宿主細胞系并為細胞在沒有外源性谷氨酰胺的情況下的存活提供足夠的谷氨酰胺。此外，在培養(yǎng)基中補兗特異性GS抑制劑，蛋氨酸亞石風亞胺(MSX)，以抑制內(nèi)源性GS活性，以致僅由載體提供的具有GS活性的細胞系可以存活。根據(jù)在有MSX存在的條件下在無谷氨酰胺培養(yǎng)基中的生長能力來選擇轉(zhuǎn)染細胞，并169且依據(jù)活性LT1009的高水平分泌來選4奪分離才朱。然后產(chǎn)生用于毒理學(xué)研究和臨床開發(fā)的材料，用于毒性和臨床開發(fā)。ATCC保藏包含pATH1009質(zhì)粒的大腸桿菌StB12保藏在美國典型i備養(yǎng)物4果藏中心(AmericanTypeCultureCollection,4呆藏號PTA-8421)。用DNA質(zhì)粒pATH1009轉(zhuǎn)染的CHO細胞系LH1275也保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,保藏號PTA-8422)。實施例14:人源4匕mAb的制備通常，生產(chǎn)過程涉及三個階段種子繁殖(seedtrain)、接種繁殖(inoculumtrain)、以及生產(chǎn)培養(yǎng)。所有階賴使用無血清試劑和低蛋白細胞培養(yǎng)生長培養(yǎng)基。為了引發(fā)種子繁殖，使用了來自工作細胞庫的細胞；傳代培養(yǎng)細胞每次三至四天并且在種子繁殖培養(yǎng)物規(guī)定時間以后，引發(fā)接種繁殖。非選擇性培養(yǎng)基(無MTX培養(yǎng)基)優(yōu)選用來擴大細胞，用于引入生產(chǎn)階段。通過連續(xù)移種將細胞擴大進入增加容積的血管。在接種物繁殖的一定天數(shù)，引發(fā)生產(chǎn)階4殳。在容積為200L、400L、2000L、或20000L的生物反應(yīng)器進4亍生產(chǎn)培養(yǎng)。以下描述生物反應(yīng)器的一個實例。生物反應(yīng)器的實例從2L生物反應(yīng)器的按比例增加將首先開始于Applikon15L攪拌槽，然后順序地進行到50L生物反應(yīng)器、200L生物反應(yīng)器并且最后是2000L生物反應(yīng)器(均建造成相同規(guī)模)。這些槽的特性如下制造商ABEC,Inc.4要照ASME,SectionVIIIPressureVesselCode加以制造。4姿觸表面是316LSS。底部偏置,驅(qū)動，ABECi殳計低剪切葉輪316LSS，拋光到15-20微英寸并鈍化。直徑約血管直徑的1/2。4空制AllenBradleyControlLogicPLC,具有Versa查看才乘作者界面。攪拌AllenBradley傳感器，A-BPLC控制輸出，用于RPM<控制的VFI。溫度雙重控制100歐姆鉑RTD傳感器，A-BPLC控制熱、冷和蒸汽閥w/循環(huán)泵。生物反應(yīng)器為空的情況下，自動消毒周期。pH:Ingold傳感器，凝膠填充，可力口壓的，A-BPLC控制C02噴射。溶解氧Ingold極譜電極傳感器，A-BPLC控制02噴射?？諝夂蜌怏w流量傳感器是FourBrooksThermalMassFlowmeters,用于空氣02、N2以及C02噴射，還提供Brooks熱質(zhì)量，用于空氣覆蓋，A-BPLC控制氣體流量，用于pH自動、DO自動或手動控制通過A-BPLC的總氣體流量。容器壓力傳感器是Rosemount衛(wèi)生膜片式傳感器，控制是傳感器的A-BPLC控制，其中使用背壓控制閥?？删幊踢壿嬁刂破?PLC):AllenBradleyControlLogixSystem,當指示時，用于過程的連續(xù)環(huán)控制。軟件PLC編程是利用RockwellSoftware(AllenBradley)RSLogix5000。人才幾界面(HMI):局部才喿作員界面是AllenBradleyHMIVersoViewIndustrial計算機，其具有集成FPD/觸摸屏輸入，以通過以太網(wǎng)與PLC通訊。庫欠件是RockwellSoftwareRSView32。生產(chǎn)過程的實例。攪拌不銹鋼生物反應(yīng)器，同時控制溫度、溶解氧以及pH。確定接種密度，以獲得最優(yōu)產(chǎn)率。通常使用無血清培養(yǎng)基。通常使用分批補料過程。通常具有溫度變化。在生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)持續(xù)時間預(yù)期是8至14天。在規(guī)定收獲時的生存力。將通過過濾來澄清收獲物。在澄清以后并在純化以前，收獲物將^皮存^f諸在2-8。C。實施例15:人源化mAb的:Ui^純化藥物物質(zhì)凈化工藝通常由四個步驟構(gòu)成A蛋白層片斤、陰離子交換層析(Q瓊脂糖凝膠)、陽離子交換層析(CM瓊脂糖凝膠)、以及超濾/滲濾(UF/DF)。親和柱通常是收獲和澄清后的第一步驟。該柱通常采用固定A蛋白樹脂。親和步驟可以相對于宿主細胞蛋白和DNA來純^:抗體。為了滅活潛在的病毒，洗脫液經(jīng)常經(jīng)受病毒滅活過程，4妄著是陰離子交換層析步驟，以減少宿主細胞蛋白、DNA、A蛋白、以及潛在病毒。接著，陽離子交換層析步驟通常用來進一步減少殘余量的宿主細胞蛋白和抗體聚集物。最后，對池進4亍'滲濾并進一步;農(nóng)縮。典型的純4b工藝在A蛋白柱以前，可以對收獲物進行濃縮和緩沖液交換。上述工藝的下一步驟是A蛋白柱親和層析。用^f氐pH值緩沖液對結(jié)合抗體進行洗脫。保持A蛋白洗脫液一,殳時間以滅活病毒。172上述工藝的下一步驟可以是在其中抗體產(chǎn)物流過而污染物如DNA和宿主細胞蛋白結(jié)合于樹脂柱的條件下用Q(+)柱進行離子交換層析。上述工藝的下一步驟可以是在其中污染物流過柱的條件下用S(-)柱進4亍第二離子交才奐層析?？梢浴嚼粲檬杷嗷プ饔弥襟E來代替S(-)柱步驟。上述工藝的下一步驟可以是納濾病毒清除步驟，其中使用DV20或Planova過濾器。產(chǎn)物流過過濾器。上述工藝的最后步驟是滲濾進入最后藥物物質(zhì)配制緩沖液并超濾以獲得目標蛋白濃度。實施例16:鼠抗S1P抗體的人源z化變體的生物學(xué)活性體外細力包測定試驗了在有化療藥物存在的條件下，人源化抗體改變腫瘤細胞存活的能力，如圖12所示。將SKOV3腫瘤細胞暴露于泰素，一種化療藥物，通過激活凋亡^5M于劑，胱冬裂酶-3，其i秀導(dǎo)腫瘤細月包死亡。與作為^t照的未經(jīng)處理的細力包相比，S1P能夠降j氐泰素"i秀導(dǎo)的月光冬裂酶-3;敫活和/或細月包死亡。二換照制造商的建"i義(Promega，Cat.NoG7792)進4亍凋亡測定。簡單地說，將A549纟田胞(2500個細胞/孔)接種到96孔板并在處理以前允許生長至80°/。匯合。然后用和不用0.1-1|iM紫杉醇(Sigma，Cat.NoT7409)、0.1-1S1P以及l(fā)|ig/mL的抗S1PmAb,并在McCoy培養(yǎng)基中，處理細月包48小時。48以后，將胱冬裂酶測定緩沖液加入細胞。通過Apo-OneHomogeneousCaspase-3/7Assay試劑盒(Promega,Cat.NoG7792)并按照制造商的議定書，測得在上清液中的胱冬裂酶-3活性。胱冬裂酶-3/7活性表示為相對于經(jīng)賦形劑處理的細胞的熒光信號的倍數(shù)增力口。173在有SIP存在的條件下，抗SIPmAb的力。入增力o了胱冬裂酶-3激活，這4是示抗體對SIP的選擇性吸收消除了SIP的^f呆護性抗凋亡效應(yīng)。和LT1002相比，人源化抗體變體，huMAbHCLC3(LT1004)和huMAbHCLC5(LT1006)，均呈現(xiàn)優(yōu)越的活性。同時，試驗了所有變體對從癌細胞的S1P誘導(dǎo)的細胞因子釋放的影響。已知SIP會誘發(fā)IL-8從癌細胞顯著釋放進入細胞條件培養(yǎng)基。小鼠對照抗SIPmAb的加入以濃度依賴性方式減少從卵巢癌細胞的IL-8釋放。和HuMAbHCLC3(LT1004)和huMAbHCLQ(LT1006)相比，兩種人源4匕變體huMAbHCcysalaLC3(LT1007)和huMAbHCcysalaLC5(LT1009)呈5見IL-8釋》丈的更大減少。實施例17:在新血管形成的動物模型中，鼠mAb(SDhingomab)與人源化mAb(Sonencizumab)的體內(nèi)效力月永絡(luò)膜新血管形成(CNV)是指在眼中來自l永絡(luò)膜的新血管通過布魯赫膜的破碎而生長進入視網(wǎng)膜下色素上皮(sub-RPE)或視網(wǎng)膜下腔隙。CNV是黃斑變性和其它眼病癥中一見覺損失的主要原因。在此實施例中，CNV的小鼠模型用來相對于SlP對mAb進行評估。在AMD的CNV動物模型中比較了人源化抗體變體和鼠抗體的抑制新血管形成的能力，如圖13所示。通過玻璃體內(nèi)給予，兩次(第0天和第6天)給予小鼠0.5ug的鼠(Mu;LT1002)、人源化變體[LC3(LT1004)、LC5(LT1006)、HCcysLC3(UT1007)以及HCcysLC5(LT1009)]或非特異性mAb(NS),然后受到布魯赫膜的激光破裂。激光外科手術(shù)后第14天處死小鼠。用含水緩沖液(PBS)或同種型配對的非特異性抗體治療對照小鼠。如通過測量CNV面積所評估的，三種人源化變體對血管發(fā)生的抑制基本上等效于鼠抗體。CNV病變?nèi)莘e表示為平均值土SEM。在輕鏈中包含5個回復(fù)突變以及在重鏈的CDR2中包含半胱氨酸突變的人源化變體(huMAbHCcysLC5;LT1009)顯著地抑制新血管形成。這種差異是高度統(tǒng)計上顯著的。為了誘導(dǎo)CNV,用在無菌鹽水中的氯胺酮(14mg/kg)和賽拉。秦(30mg/kg)的混合物以5|_iL/20g體重的劑量腹腔內(nèi)給予來麻醉小鼠。然后用各一滴眼用托吡卡胺(0.5%)和去氧腎上腺素(2.5%)來擴張它們的瞳孔。然后用連接于裂隙燈(用來遞送150mW的100毫秒脈沖，光斑大小為50nm)的氬綠眼用激光器(OculightGL532nm,IridexCorporation,MountainView,CA)在右目艮的三個象卩艮(大約位于離視盤50(am處并在相對的9、12以及3點鐘的位置)破裂布魯赫膜。在所有情況下，左眼作為未損傷對照。形態(tài)計量和容積CNV病變的測量如下。激光誘導(dǎo)CNV兩周后，通過過量的氯胺酮-賽拍秦混合物z使動物安樂死，然后借助于心臟穿刺并用在PBS中6ml4%多聚甲醛，pH7.5(固定液)進4亍全身灌注，如先前所描述的(Senguptaetal,2003)。然后將眼摘除，用27g4十并在》彖后面1mm處穿刺，并在室溫下浸沒在固定、液中1小時，然后通過浸沒在PBS中30分鐘加以洗滌2X。然后將眼切開以分離后節(jié)，其由視網(wǎng)膜色素上皮、脈絡(luò)膜毛細血管層以及鞏膜構(gòu)成。然后滲透此組織并與羅丹明共輒蓖麻凝集素I(VectorLaboratories,Burlingame,CA)進4亍反應(yīng)以4企測CNV病變，4o先前所描述的(Senguptaetal，2003;Senguptaetal，2005)。然后后尖被切割成4-7個4圣向4刀片，并扁平安力丈在含有一滴Vectashield抗4逸色介質(zhì)(VectorLaboratories,Burlingame,VT)的顯孩吏4竟載3皮片上，用于通過落射熒光ZeissAxioplan2(帶有RGBSpot高分辨率數(shù)碼相機)和激光掃4笛共聚焦顯樣H竟(BioRadMRC1024,BioRadCorporation,Temecula,CA)進行數(shù)字圖像采集。利用ImageJ軟件(ResearchServicesBranch,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD)對捕獲的數(shù)字圖4象進行形態(tài)計量評價。圖像^皮分成分開的RGB通道，用于分析紅色和綠色通道如下1)進行用于特定物鏡和顯微鏡的校準以設(shè)置像素與長度之比；2)利用Otsu算法施加閾值；3)圖像將被制成二值的；4)畫出感興趣區(qū)域(ROI)的輪廓以包括整個病變區(qū)；5)進行顆粒分析以量化在ROI內(nèi)在閾值水平以上的像素面積。對于容量分析，方法類似于上述方法，不同之處在于使用了z系列捕獲。然后在整個z系列的病變區(qū)的總和乘以z厚度(通常為4|im)以獲得病變?nèi)莘e。用此模型試驗的藥物產(chǎn)品是LT1002(相對于SIP的小鼠mAb;Sphingomab);LT1004(人源化mAb)、LT1006(人源化mAb)、LT1007(人源4bmAb)以及LT1009(人源4bmAb;SonepcizumabTM)。還包括鹽水賦形劑和非特異性抗體(NSA)對照。如圖13所示，小鼠mAbLT1002(Sphingomab)和人源化mAbLT1009(Sonepcizumab)在CNV的此小鼠模型中均顯著使病變的大小減小。所有試^r的mAbs都顯示大約80-98%的病變大小的減小，在所有情況下，其都是顯著的(p<0.001，相對于鹽水)。此外，和非特異性抗體對照相比，LT1007和LT1009還顯示顯著的抑制(p<0.05)。病變大小的抑制百分比對于LT1002(小鼠)大約為80%,對于LT1004(人源化)為82%，對于LT1006為81%以及對于LT1009為990/。。因此，在新血管形成的此體內(nèi)才莫型中，LT1009是最具有活性的人源化mAb變體。實施伊J18:Sonepcizumab劑量^^的多角定在布魯赫膜的激光誘導(dǎo)破裂前一天，小鼠(n=10)接受單次、乂又側(cè)3皮璃體內(nèi)注射逐步增力口劑量的sonepcizumab(0.05、0.5、1.0或3.0嗎/目艮)或高劑量非特異性(NS)抗體(3.0lag/目艮)。激光破176裂后14天，小鼠^皮麻醉并灌注熒光素標記右禱^唐酐，然后制^f月永絡(luò)月莫扁平封裝，用于分析CNV病變大小。在此研究中，利用量化CNV面積的另一種得到驗證的方法(其中在處死前動物4皮灌注熒光素才示i己右4^f唐酐)才全查了sonepcizumab劑量和劑量間隔對CNV抑制的的影響。Sonepcizumab誘導(dǎo)CNV面積的劑量依賴性減少，在3.0(Lig/眼的劑量下，產(chǎn)生約50%的最大抑制。這種減小是顯著的(pO.OOOl，和非特異性抗體對照相比，使用非配對t4企-瞼)。在用藥頻率研究中，在用Sonepcizumab治療的組之間，在14天研究期間在單時間點(第0天)或在多個時間點(第0天和第7天)，觀測到類似效力。用Sonepcizumab治療(3.0ug/眼)所看到的大約50%的最大抑制有利地相比于先前用相同才莫型和由相同研究者所發(fā)表的數(shù)據(jù)，其表明通過VEGF-Trap(4.92昭/眼)可以減小CNV面積。Saishin，etal.JCe〃P/z戸o/，2003.195(2):p.241畫8。"Traps"(RegeneronPharmaceuticals,Inc.)是兩種不同受體成分和抗體分子的Fc區(qū)(稱4乍Fc區(qū))之間的融合并且Regeneron正尋求VEGF-Trap用于目艮部疾病和癌癥。上述兩項3蟲立研究的比較i曷示了，通過Sonepcizumab所獲得的CNV病變大小的減小比用VEGF-Trap所，現(xiàn)測到的高20個百分點。因此，這些數(shù)據(jù)不僅證實我們的初步調(diào)查結(jié)果(在CNV的小鼠才莫型中抗S1P療法減少病變形成的能力)，而且它們證明了人源4b4元體，sonepcizumab,承卩制CNV病變形成的增力。的凌文力，并且提供了對抗?jié)B效果的深入了解。實施例19:在早產(chǎn)JL^見網(wǎng)膜病的小鼠模型中Sonepcizumab在減少3見網(wǎng)膜新血管形成的;^方面的效力在降生的第7天將C57BL/6小鼠(n=7)放置在75%氧氣中，以及在降生的第12天恢復(fù)為室內(nèi)的空氣，并在一只眼中眼內(nèi)注射3昭的sonepcizumab而在對側(cè)眼給予賦形劑。在第17天，小鼠接受眼內(nèi)注射標記有FITC的抗PECAM抗體，并在8小時以后，使小鼠安樂死，將眼摘除并在室溫下固定在PBS1￡沖的福爾馬林中5小時。切開4見網(wǎng)膜并用含有0.25%TritonX-100的磷酸緩沖鹽溶液洗f條，然后全部去于固。用NikonFluorescenceMicroscope7見察載iE皮片并通過圖像分析來測量視網(wǎng)膜NV的面積/視網(wǎng)膜。與在小鼠激光-皮裂才莫型中所)現(xiàn)測到的CNV的減小一致，我們還觀察到在早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病(ROP)的小鼠模型中CNV的顯著減小。與鹽水對照相比，玻璃體內(nèi)給予Sonepcizumab(3.0昭/眼)導(dǎo)致視網(wǎng)膜新血管形成減小大約4倍。這些數(shù)據(jù)證實了在視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜血管床中sonepcizumab抑制病理性眼部血管發(fā)生的效力(不論是否經(jīng)由缺血或布魯赫膜的破裂所誘導(dǎo))。實施例20:在J^"膜栓測定中Sonepcizimiab對VEGF-i秀導(dǎo)血管發(fā)生的影響矛J用^口在Staton,etal,IntJExpPathol,2004.85(5):p.233-48中所描述的GFR基質(zhì)膜栓測定進行體內(nèi)新血管形成。在4-6周齡nu/nu小鼠的左脅腹注射500uL冰冷的GFR基質(zhì)膜。僅注射GFR基質(zhì)膜(對照)或在添加補兗有100ug/ml肝素的10ug/mLVEGF以后注射GFR基質(zhì)膜。《且包4舌用于對照和sonepcizumab治療的3只動物。在才直入GFR基質(zhì)月莫前一天用鹽水或sonepcizumab(10mg/kg)治療動物，并在實驗期間每72小時i.p.給予劑量。在12天以后，處死動物；將對全切除并立即固定在沒有鋅和福爾馬林的固定液中過夜，包埋在石蠟中并切片(5um)。然后石蠟包埋的切片一皮染色用于CD31(Pharmingen)。通過數(shù)碼相機以20xit大率獲取圖Y象(9個圖4象/切片，3個切片/栓)，然后通過PhotoShop6.0禾呈序量化CD31正染色并通過ImageJ表示為血管發(fā)生得分U象素2)。178在此基質(zhì)力莫神全測定中sonepcizumab的抗血管形成歲文應(yīng)是明顯的。如預(yù)期的，在補充有10ug/mlVEGF的基質(zhì)膜栓中誘導(dǎo)了廣泛新血管形成(大約是在缺少VEGF或sonepcizumab的未治療對照中所看到的5.75倍)。重要的是，在基質(zhì)月莫注射前，用sonepcizumab進行的全身i.p.治療可防止幾乎80%的這種VEGF刺激的細胞結(jié)構(gòu)和微血管密度的增加。這種減小是顯著的(p<0.05,和單獨的VEGF相比)并且i正實了當全身《會予動物時sonepcizumab的有效的抗血管生成活性以及強烈提示sonepcizumab能夠顯著抑制VEGFi秀導(dǎo)的血管發(fā)生。此發(fā)現(xiàn)是與來自Lpath的肺瘤研究計劃的數(shù)據(jù)一致的，其中在小鼠原位乳腺癌模型中S1P抗體降低了若干生血管因子(包括VEGF)的血清7jc平。與AMD有關(guān)的血管生長的主要成分是周細胞的征集，其鞘化,口支持生長的內(nèi)皮管。Jo,etal.，AmJPathol,2006.168(6):p.2036-53。轉(zhuǎn)基因小鼠研究已表明，VEGF和PDGF-B是主要因子，其刺激周細胞的浸潤和分化，從而導(dǎo)致血管成熟和穩(wěn)定。Guo，etal.,AmJPathol，2003.162(4):p.1083-93;Benjamin,L.E.，I.Hemo，andE.Keshet,Development,1998.125(9):p.l591國8。重要的是，SIP促進VEGF和PDGF的反式;敫活。因此，sonepcizumab間4秦中和這些生長因子的能力提示son印cizumab可以在AMD期間防止異常的血管生長。實施例21:Sonepcizumab顯著減少布魯赫膜的激it^皮裂以后的血管滲漏用布魯赫膜的激光破裂的小鼠^t型評價了給予用來抑制血管》參漏(除4。上所述水卩制新血管形成之夕卜)的sonepcizumab的歲丈力。在每只眼的3個位置C57BL/6小鼠(n=10)經(jīng)受布魯赫膜的激光石皮裂并在一只眼中眼內(nèi)注射3jig的sonepcizumab而在只十側(cè)目艮中則眼內(nèi)注射賦形劑。在激光破裂后一周，對小鼠腹腔內(nèi)注射12pl/g體重的1。/。熒光素鈉并在5分鐘以后被安樂死。將眼除去并在室溫下固定在PBS緩沖的福爾馬林中5小時。然后切開碎見網(wǎng)膜，洗滌，并用一級抗PECAM-1加以溫育。然后洗滌一見網(wǎng)膜，用二抗(羊抗鼠IgG,共軛于羅丹明)溫育，^接著扁平封固。通過PECAM-1染色來測量CNV病變面積。通過焚光素鈉染色來測量血管滲漏的量。從CNV的滲漏總面積-CNV+滲漏(綠色)-CNV面積(紅色)。數(shù)值表示r^lO小鼠/組的平均值士SEM。脈絡(luò)月莫襟斤血管形成(由PECAM-1染色)的面積只于于用LT1009治療的動物大約是0.015mm2，而對于經(jīng)鹽水治療的對照動物則大約是0.03mm2。這是新血管形成減少50%(p-0.018)。從脈絡(luò)膜新血管形成(用熒光素染色)的滲漏面積對于用LT1009治療的動物大約是0.125mm2,而對于經(jīng)鹽水治療的對照動物則大約是0.2mmo這是血管'滲漏的大約38%的減小(p-0.017)。在用3.0嗎/眼的Sonepcizumab或PBS對照治療的小鼠中，脈絡(luò)膜新血管形成和血管滲漏的減小的典型的免疫組織化學(xué)圖像是與這些結(jié)果一致的。因此，除減少CNV之外，sonepcizumab還顯著減小布魯赫膜視網(wǎng)膜水胂的激光破裂以后的血管滲漏，其在視力損失中具有主要作用，并且與下述有關(guān)(i)在AMD中的脈絡(luò)膜新脈管系統(tǒng)滲漏(ii)在糖尿病中血視網(wǎng)膜屏障的擊穿。Gerhardt，H.andC.Betsholtz，CellTissueRes,2003.314(1):p.l5-23。Sonepcizumab可以減少眼中病理性血管形成以及導(dǎo)致視網(wǎng)膜水腫的血管滲漏。這些發(fā)現(xiàn)是與乂人CNV面積量化實-驗所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)一致的，其中小鼠祐L灌注焚光素標記的右礎(chǔ)j唐肝。4昔助于這種方法的CNV量化確實受到血管通透性的影響。這些高度有利的結(jié)果支持在脈絡(luò)膜血管床中的抗?jié)B效果。鑒于這些lt據(jù)，我們認為sonepcizumab具有作為單藥180治療的潛力。還存在與目前的泛VEGF-A阻斷劑的協(xié)同效應(yīng)的可能性。實施例22:在用相對于SIP的抗體i^阡治療以后，減小在浮見網(wǎng)膜中的巨虔細胞浸潤年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)是一種與老化有關(guān)的疾病，其中老化會逐漸^皮壞壽文銳的、中央—見覺。存在兩種主要類型的黃斑變性。干燥或萎縮形式，其占AMD病例的85-90%，而AMD的濕形式的特點在于異常血管的生長。當黃色斑點(稱作玻璃疣)開始積累自來自日益惡化組織(主要在黃斑區(qū)域)的沉積物或石卒片時，則診斷為干黃斑變性?？梢园l(fā)生逐步中央^L力減退。對于AMD的最流4亍的萎縮性(干)形式，目前沒有有效的治療方法。萎縮性AMD是由^L網(wǎng)膜色素上皮(RPE)的異常所觸發(fā)，其中^L網(wǎng)膜色素上皮位繼發(fā)于RPE功能障礙，黃斑棒和纟見錐會退化，^人而導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的碎見力喪失。氧化應(yīng)激、缺血、玻璃疣的形成、脂褐素的蓄積、局部炎癥以及反應(yīng)性膠質(zhì)增生是涉及萎縮性AMD的發(fā)病機制的病理性過程。在這些過程中，炎癥成為組織損傷的關(guān)4建促成因素。巨噬細胞浸潤進入干AMD患者的黃斑已證明是破壞性炎性應(yīng)答的重要組成部分。因此，可以緩和巨噬細胞浸潤的制劑將是有價值的治療劑，因為巨噬細胞浸潤的抑制將可能減少黃斑組織損傷。這樣的制劑還可以降^f氐干AMD轉(zhuǎn)化成濕AMD的速率。在缺血性和炎性視網(wǎng)膜病變的模型中，現(xiàn)已證明，在用抗S1P抗體治療以后，可以抑制巨噬細胞浸潤55%。這些數(shù)據(jù)是利用已4艮好確立的小鼠氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型(還稱作早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病(ROP)模型)所產(chǎn)生。具體來說，在生活的第7天將C57BL/6小鼠;故置在75%氧氣中，以及在生活的第12天^皮恢復(fù)到房間空氣，并在一只眼中眼內(nèi)注射3fxg的人源化抗SIP抗體(LT1009，SonepcizumabTM)而在》于側(cè)眼中給予1!武形劑。在生活的第17天，小鼠接受眼內(nèi)注射相對于F4/80(泛巨噬細胞標記)的FITC標記的抗體，并在8小時以后，使小鼠安樂死。將眼球除去并在室溫下固定在PBS鄉(xiāng)爰沖的福爾馬;f木中5小時。切開^見網(wǎng)膜并用含有0.25%TritonX-100的石粦酸緩沖鹽溶液洗滌，然后全部封固。用NikonFluorescenceMicroscope觀察載玻片并量化視網(wǎng)膜巨噬細胞。結(jié)果示在以下的表8中。表8:通過用相對于S1P的人源化單克隆抗體進行處理來減小視網(wǎng)膜中的巨噬細胞浸潤<table>tableseeoriginaldocumentpage182</column></row><table>基于這些數(shù)據(jù)和巨噬細胞在干AMD的發(fā)病4幾制中的已知作用，認為抗SIP抗體是用于治療干AMD的有效治療劑。實施例23:在棵NCr小鼠中SCCOLO205結(jié)腸直腸肺瘤異種^f接對用25-75mg/kgLT1009(單獨以及連同阿瓦斯汀或紫杉醇)治療此研究的目的是確定LT1009(單獨和連同其它抗癌劑)延緩人結(jié)腸直腸(COLO205)癌腫瘤進展的效力，其中上述癌腫瘤是皮下(sc)拼接的并且確立在雌性Ncr(nu/nu)小鼠中。在右脅腹附近，從體內(nèi)通道，棵鼠#皮sc植入一卓爻/小鼠的COLO205肺瘤。當在每項實-驗中60只小鼠的確立的腫瘤大小為大約100至200mm3的當天，開始所有治療。然后用25mg/kg的LT1009、50mg/kg的LT1009、40mg/kg阿瓦^t汀、50mg/kg的LT1009加上40mg/kg阿瓦斯汀、15mg/kg紫杉醇或賦形劑(鹽水)對小鼠(11=10/組)進4亍治療。在實'險期間每三天ip給予25或50mg/kgLT1009和鹽7K—次，容積為0.1mL/20g體重。基于q7d計劃表，以40mg/kg/劑量的劑量iv給予阿瓦斯汀，注射容積為0.1mL/20g體重?；趒ldx5計劃表，以15mg/kg/劑量的劑量iv主合予紫杉醇(陽性;寸照)，注射容積為0.1mL/10g體重。在第21天，在研究期間，將25mg/kgLT1009的劑量增加到75mg/kgLT1009。每天》見測動物的死亡率。乂人治療的第一天開始并且包纟舌研究終止曰，每周兩次收集腫瘤尺寸和體重。當在每項研究中用U武形劑治療的對照組中的正中肺瘤達到大約4，000mg時，終止研究。收獲來自每只動物的肺瘤，記錄濕重，對肺瘤進行處理，以通過CD-31染色來確定孩i血管密度(MVD)。利用用于橢球的方程(/xw2)/2=mm3來計算腫瘤重量(mg)，其中/和w是指在每次測量時收集的更大和更小尺寸并且假設(shè)單位密度(1mm3=lmg)。表9:發(fā)現(xiàn)的4fet值總結(jié)-Co10205治療貝武形劑50mg/kgLT100925/75mg/kgLT幽9阿瓦斯汀阿瓦斯汀+50mg/kgLT簡9紫杉醇最終肺瘤重量(mg)3047.252071.172465.601967.901614.400和賦形劑治療小鼠;t目比，^?。?2%20%35%48%100%如通過最終腫瘤重量所測得的，當和來自鹽水治療動物的腫瘤相比時，50mg/kgLT1009顯著抑制腫瘤進展(p<0.018),為32%。25/75mg/kgLT1009也有效降低最終腫瘤重量20%;然而，這種降4氐并不是統(tǒng)計顯著的。50mg/kgLT1009和阿瓦斯汀一樣有效降《氐最終肺瘤重量(分別為降低32%和35%)。LT1009和阿瓦斯汀的組合比任何單獨的制劑更有效，并顯示當和鹽水治療動物相比時腫瘤重量減少48%。因此，LT1009和阿瓦斯汀的效應(yīng)似乎是累積的。陽性對照，紫杉醇，完全消除了預(yù)先確定的胂瘤。實施例24:在棵NCr小鼠中SCHT29結(jié)腸直腸腫瘤異種^f接對用50mg/kgLT1009(單獨以及連同阿瓦斯汀和5-FU)所J^f亍治療的反應(yīng)此研究的目的是相對于sc植入雌性無胸腺HCr-nu/nu小鼠中的人HT29結(jié)腸肺瘤異種拼接評估LT1009(單獨和連同其它抗癌劑)的抗胂瘤效力。在右脅腹附近，從體內(nèi)通道，棵鼠被sc植入一革殳/小鼠的HT29腫瘤。當在每項實-驗中60只小鼠的確立的腫瘤大小為大約100至200mm3的當天，開始所有治療。每治療組有IO只小鼠。在實驗期間每兩天ip給予50mg/kgLT1009和鹽水一次，容積為0.1mL/20g體重。q4d，以75mg/kg/劑量和20mg/kg/劑量的的劑量分別ip和iv給予75mg/kg5-FU和20mg/kg阿瓦斯汀，注射容積為0.1mL/10g體重。LT1009的首;欠劑量包4舌iv鄉(xiāng)合予的100mg/kg。每天觀測動物的死亡率。從治療的第一天開始并且包括研究終止曰，每周兩次收集胂瘤尺寸和體重。當在每項研究中用I武形劑治療的對照組中的正中胂瘤達到大約4，000mg時，終止研究。收獲來自每只動物的胂瘤，記錄濕重，對腫瘤進行處理，以通過CD-31染色來確定MVD。利用用于橢J求的方程(/xw2)/2=mm3來計算腫瘤重量(mg)，其中/和w是指在每次測量時收集的更大和更小尺寸并且假設(shè)單位密度(1mm3=lmg)。表10:最終腫瘤重量-HT29治療最終腫瘤重量(mg)顯著性(p值)和H武形劑治療小鼠才目比，減小%賦形劑LT1009阿瓦斯汀2723.672390.631927.441624.901.000.390.00113%30%41%LT1009+阿瓦斯汀5-FU1963.711948.000.0990.04928%29%LT1009+5-FU如通過腫瘤重量所測得的，當和來自鹽水治療動物的肺瘤比較時，50mg/kgLT1009會降低腫瘤進展13%,而阿瓦斯汀降〗氐腫瘤重量30%。LT1009和阿瓦斯汀的組合比1^壬何單獨的制劑更有效，并顯示當和鹽水治療動物相比時月中瘤重量統(tǒng)計顯著;也減少41%。用5-FU進行的治療降低了腫瘤重量28%。5-FU顯示最小累積效應(yīng)，其中LT1009顯示抑制最終肺瘤重量29%。實施例25:在棵NCr小鼠中，SCDU145前列腺腫瘤異種拼接對用50mg/kgLT1009(單獨或連同阿瓦斯汀或紫杉醇)所進4亍治療此研究的目的是確定LT1009(單獨和連同其它抗癌劑)延緩人前列腺(DU145)癌肺瘤進展的效力，其中上述癌腫瘤是皮下(sc)拼4妾的并建立在雌性Ncr(nu/nu)小鼠中。在右脅腹附近，從體內(nèi)通道，棵鼠被sc植入一^殳/小鼠的DU145腫瘤。當在每項實驗中60只小鼠的確立的腫瘤大小為大約100至200mm3的當天，開始所有治療。然后用50mg/kg的LT1009、20mg/kg阿瓦斯汀、7.5mg/kg紫杉醇、50mg/kg的LT1009加上20mg/kg阿瓦斯汀、50mg/kg的LT1009加上7.5mg/kg紫杉醇或賦形劑(鹽水)來治療小鼠(11=10/組)。在實-驗期間，ip給予50mg/kg的LT1009和鹽水，q2d,容積為0.1mL/20g體重。以7.5mg/kg/劑量和20mg/kg/劑量的劑量，分別qldx5和q4d，iv和ip給予紫杉醇和阿瓦斯汀，注射容積為0.1mL/10g體重。LT1009的首次劑量包4舌iv#會予的100mg/kg。在研究期間，通過測量在三個軸向的sc腫瘤并if算容積、來監(jiān)測肺瘤生長。在研究結(jié)束時，確定最終胂瘤重量和容積，然后處死小鼠，并收獲腫瘤。然后通過CD-31染色來確定腫瘤的微血管密度(MVD)。表ll:發(fā)現(xiàn)的^t值總結(jié)-DU145<table>tableseeoriginaldocumentpage186</column></row><table>如通過最終肺瘤重量所測得的，50mg/kg的LT1009顯著(pO.00)降低肺瘤進展28%。當和來自鹽水治療動物的肺瘤相比時，阿瓦斯汀和紫杉醇也顯著(pO.00)降低最終腫瘤重量80%。LT1009并不顯著增加阿瓦斯汀或紫杉醇的抗肺瘤活性，如通過最終腫瘤容積所測4尋的。實施例26:在CB17SCID小鼠中，RPMI8226人骨髓瘤腫瘤異種拼接對用25mg/kg或50mg/kg的LT1009(單獨和連同Bortezomib)所進行治療的AJl此研究的目的是相對于sc才直入在雌性CB17SCID小鼠中的人RPMI人骨髓瘤腫瘤異種^H妾評估LT1009(單獨和連同抗癌劑Bortezomib)的#元月中瘤歲丈力?？檬?CB17SCID,4-5周齡，重量18-22g,雌性小鼠，獲自Harlan)#皮sc注射收獲自組織培養(yǎng)物的RPMI8226細月包(lx107個細力包/小鼠)。當肺瘤生長到大約100mn^的大小時，通過腫瘤大小動物;波配對成治療和對照組(10只小鼠/組)。在配對后的第1天開始初次《合藥。對于所有組的動物，是4姿重量,會藥(0.01ml/g;10ml/kg)。通過腹腔內(nèi)(IP)注射來給予賦形劑中的LT1009，每三天一次，直到研究結(jié)束(Q3D至結(jié)束)。通過經(jīng)由尾靜3永的靜月永注射來纟合予Bortezomib,每三天一次，共6;欠治療(Q3Dx6)。為了用作陰性對照，按照Q3D至結(jié)束的計劃表，IP主會予LT1009賦形劑(0.9%鹽水)。開始于第1天，每周兩次記錄個體和纟且的平均肺瘤容積士SEM，直到研究完成。在研究完成時，才艮道每組的最終平均腫瘤容積士SEM;按照這些計算結(jié)果，檢查經(jīng)受部分或完全腫瘤消退的動物或經(jīng)受纟支術(shù)或藥物相關(guān)死亡的動物。表12:最終胂瘤^P、-RPMI治療最終肺瘤重量(mg)和賦形劑治療小鼠相比，減小％貝武形劑20830Bortezomib166420%25mg/kgLT1009186011%50mg/kgLT層919785%50mg/kgLT1009183212%+Bortezomib*承*依據(jù)本文披露的內(nèi)容，可以制備和實施本文描述和要求的所有組合物和方法而無需過度的實-驗。雖然已參照優(yōu)選實施方式描述了本發(fā)明的組合物和方法，4旦本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了，可以對組合物和方法作出一些變化。對本領(lǐng)域沖支術(shù)人員來說顯而易見的所有這樣的類似替代和改進被認為是在如由所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的沖青神和范圍內(nèi)。在本說明書中提及的所有專利、專利申請、以及出版物表明與本發(fā)明有關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員的水平。所有專利、專利申請、以及出版物(包括對其要求優(yōu)先權(quán)或另外益處的那些專利、專利申請、以及出片反物)以引用方式結(jié)合于本文?？梢栽跊]有本文未具體描述的任何要素的條件下適當?shù)貙嵤┍景l(fā)明。因此，例如，在本文的每種情況下，任何術(shù)語"包含"、"基本上包括，，、以及"包括"可以與其它兩個術(shù)語的任何一個替換。已采用的術(shù)語和措辭是用作描述性而不是限制性術(shù)語，并且在使用這樣的術(shù)語和4晉辭時并不排除所顯示和描述特點的任何等效物或其部分，而是應(yīng)當明了在本發(fā)明的范圍內(nèi)各種改進是可能的。因此，應(yīng)當明了，雖然已通過優(yōu)選實施方式具體披露了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用本文所披露構(gòu)想的可選的特點、改進和變化，并且這樣的改進和變化被認為是在如由所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.一種分離的抗S1P抗體重鏈，所述抗S1P抗體重鏈包含具有選自由SEQIDNO27和SEQIDNO35組成的組中的氨基酸序列的可變結(jié)構(gòu)域。2.—種分離的抗SIP抗體輕鏈，所述抗SIP抗體輕鏈包含具有選自由SEQIDNO:30和SEQIDNO:37組成的組中的氨基酸序列的可變結(jié)構(gòu)jt或。3.—種分離的抗S1P抗體，其中，每個免疫球蛋白重鏈包含具有選自由SEQIDNO:27和SEQIDNO:35組成的組中的氨基酸序列的可變結(jié)構(gòu)域，而每個免疫球蛋白輕鏈包含具有選自由SEQIDNO:30和SEQIDNO:37組成的組中的氨基酸序列的可變結(jié)構(gòu)域。4.一種組合物，包含載體，可選地包含藥用載體，以及選自下述纟且中的4元SIP劑a.包含抗SIP抗體重鏈的抗SIP劑，所述抗SIP抗體重鏈包含選自由SEQIDNO:27和SEQIDNO:35組成的組中的具有氨基酸序列的可變結(jié)構(gòu)域；b.包含抗SIP抗體輕鏈的抗SIP劑，所述抗SIP抗體輕鏈包含具有選自由SEQIDNO:30和SEQIDNO:37組成的組中的氨基酸序列的可變結(jié)構(gòu)域；以及c.包含抗SIP抗體的抗SIP劑，其中每個免疫J求蛋白重鏈包含具有選自由SEQIDNO:27和SEQIDNO:35組成的組中的氨基酸序列的可變結(jié)構(gòu)域，而每個免疫球蛋白輕鏈包含具有選自由SEQIDNO:30和SEQIDNO:37組成的組中的氨基酸序列的可變結(jié)構(gòu)i戈。5.—種試劑盒，包含包裝在容器中的根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，并且可選地進一步包括所述組合物的使用說明。6.—種抗SIP劑，所述抗SIP劑在生理條件下對于鞘氨醇-l-石粦酸(SIP)是具有反應(yīng)性的并且包含至少一種具有氨基酸序列的CDR肽，所述氨基酸序列與肽氨基酸序列具有至少50%、可選地至少65%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的序列同一性，其中所述肽氨基酸序列選自由DHTIH(SEQIDNO:13)、CISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:14)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)、ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)組成的組。7.才艮據(jù)權(quán)利要求6所述的抗S1P劑，選自由抗體、抗體衍生物、以及非抗體源性成分組成的組，其中所述抗體可以是嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、全長抗體、抗體片段、以及親和力成熟的4元體。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗S1P劑，其中，所述抗S1P劑是由兩個重鏈和兩個輕鏈組成的抗體，其中每個重鏈包含SEQIDNO:27的氨基酸序列而每個輕鏈包含SEQIDNO:30的氨基酸序列，或其中每個重鏈包含SEQIDNO:35的氨基酸序列而每個輕鏈包含SEQIDNO:37的氨基酸序列。9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗SIP劑，其中，所述抗SIP劑共軛于選自由多聚體、；改射性核素、化療藥物、以及4企測劑組成的組中的部分。10.—種組合物，包含才艮據(jù)纟又利要求6所述的抗S1P劑和載體，可選地包含藥用載體。11.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗S1P劑，與第二制劑結(jié)合，所述第二制劑可選地選自由抗體、抗體片,殳、抗體衍生物、抗體變體、不同于抗S1P劑的治療劑、或包含對不同于S1P的分子具有反應(yīng)性的結(jié)合部分的制劑組成的組，其中所述結(jié)合可選地是借助于所述抗S1P劑與所述第二制劑之間的4建，可選地共<介4建而結(jié)合的。12.—種分離的核酸分子，包含核香酸殘基的序列，其中所述核苦酸殘基的序列編碼至少一個具有氨基S臾序列的CDR肽，其中所述氨基酸序列與肽氨基酸序列具有至少50%、可選地至少65%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的序列同一性，其中所述肽氨基酸序列選自由DHTIH(SEQIDNO:13)、CISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:14)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)組成的組。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的分離的核酸分子，其中，所述CDR肽具有肽氨基S臾序列，所述肽氨基酸序列選自由DHTIH(SEQIDNO:13)、CISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:14)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)組成的組，以及可選地其中所述分離的核酸分子編碼至少兩種CDR肽，其中每種CDR肽具有獨立地選自由DHTIH(SEQIDNO:13);CISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:14)或AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31);以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)組成的組的氨基酸序列，并且可選地其中所述分離的核酸分子編碼第一、第二、以及第三CDR肽，其中所述第一、第二、以及第三CDR肽中的每一種具有獨立地選自由DHTIH(SEQIDNO:13);CISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:14)或AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31);以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)組成的組中的氨基酸序列。14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的分離的核酸分子，其中，所述第一CDR肽包含氨基序列DHTIH(SEQIDNO:13)，所述第二CDR肽包含氨基序列CISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:14)或AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)，以及所述第三CDR肽包含氨基序列GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)。15.才艮據(jù)權(quán)利要求12所述的分離的核酸分子，編碼包含SEQIDNO:27的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域。16.根據(jù)權(quán)利要求12所述的分離的核酸分子，編碼包含SEQIDNO:35的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域。17.4艮據(jù)權(quán)利要求12所述的分離的核酸分子，編碼免疫球蛋白重鏈的片段或全長免疫球蛋白重鏈。18.才艮據(jù)4又利要求12所述的分離的核酸分子，其中，所述免疫球_蛋白重鏈衍生自無脊推動物或脊推動物免疫球蛋白重鏈。19.根據(jù)權(quán)利要求12所述的分離的核酸分子，其中，所述脊推動物選自由魚、可選地軟骨魚、鳥、以及哺乳動物組成的組，其中所述哺乳動物可選地選自由犬、貓、靈長類、嚙齒動物、以及有^帝類動物《且成的纟且。20.—種載體，包含根據(jù)權(quán)利要求12所述的分離的核酸分子。21.—種用才艮據(jù)4又利要求10所述的分離的核酸分子或用才艮據(jù)^又利要求20所述的載體轉(zhuǎn)染的宿主細胞。22.—種包含核苦酸殘基序列的分離的核酸分子，編碼至少一種具有氨基酸序列的CDR肽，其中所述氨基酸序列與肽氨基酸序列具有至少50%、可選;也至少65°/。、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的序列同一性，其中所述肽氨基酸序列選自由ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)組成的組。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的分離的核酸分子，其中，所述CDR肽具有肽氨基酸序列，其中所述肽氨基酸序列選自由ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)組成的組，并且可選地其中所述分離的核酸分子編碼至少兩種CDR肽，其中每種CDR肽獨立地選自由ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)纟且成的組，并且可選i也其中所述分離的核酸分子編碼第一、第二、以及第三CDR肽，其中所述第一、第二、以及第三CDR肽中的每一種具有獨立地選自由ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)組成的《且中的氨基酸序列。24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的分離的核酸分子，其中，所述第一CDR肽包含氨基序列ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)。25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的分離的核酸分子，編碼包含SEQIDNO:27的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。26.根據(jù)權(quán)利要求22所述的分離的核酸分子，編碼包含SEQIDNO:37的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。27.根據(jù)權(quán)利要求22所述的分離的核酸分子，編碼免疫球蛋白輕鏈的片段或全長免疫球蛋白輕鏈。28.根據(jù)權(quán)利要求22所述的分離的核酸分子，其中，所述免疫球蛋白重鏈衍生自無脊推動物或脊推動物免疫球蛋白重鏈。29.根據(jù)權(quán)利要求22所述的分離的核酸分子，其中，所述脊推動物選自由魚、可選地軟骨魚、鳥、以及哺乳動物組成的組，其中所述哺乳動物可選地選自由犬、貓、靈長類、嚙齒動物、以及有蹄類動物組成的組。30.—種載體，包含根據(jù)權(quán)利要求22所述的分離的核酸分子。31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的載體，進一步包含根據(jù)權(quán)利要求22所述的分離的核酸分子。32.根據(jù)權(quán)利要求21所述的宿主細胞，所述宿主細胞還被根據(jù)權(quán)利要求22所述的分離的核酸分子所轉(zhuǎn)染。33.—種用根據(jù)權(quán)利要求22所述的核酸分子或用根據(jù)權(quán)利要求30所述的載體或才艮據(jù)纟又利要求31所述的載體轉(zhuǎn)染的宿主細胞。34.—種用第一載體和第二載體轉(zhuǎn)染的宿主細胞，其中，所述第一載體是根據(jù)權(quán)利要求20所述的載體而所述第二載體是根據(jù)權(quán)利要求30所述的載體。35.—種分離的多肽，所述多肽包含至少一個來自動物免疫^求蛋白重鏈的可變結(jié)構(gòu)i或的骨架區(qū)，所述多肽在生理范圍內(nèi)對S1P具有反應(yīng)性并且包含至少一個具有氨基酸序列的CDR肽，其中所述氨基酸序列與肽氨基酸序列具有至少50%、優(yōu)選至少65%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的序列同一性，其中所述肽氨基酸序列選自由DHTIH(SEQIDNO:13)、CISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:14)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)組成的組。36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的分離的多肽，其中，所述CDR肽具有肽氨基酸序列，所述肽氨基酸序列選自由DHTIH(SEQIDNO:13)、CISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:14)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)組成的組；以及可選地其中每種CDR肽具有氨基酸序列，其中所述氨基酸序列獨立地選自由DHTIH(SEQIDNO:13)、CISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:14)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)組成的組，可選地其中所述第一、第二、以及第三CDR肽中的每一種具有獨立地選自由DHTIH(SEQIDNO:13)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)組成的《且中的氨基酸序列。37.根據(jù)權(quán)利要求35所述的分離的多肽，其中，所述第一CDR肽包含氨基序列DHTIH(SEQIDNO:13)，所述第二CDR肽包含氨基序列CISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:14)或AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)，以及所述第三CDR肽包含氨基序列GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)。38.根據(jù)權(quán)利要求35所述的分離的多肽，選自由動物免疫球蛋白重鏈的片段、免疫球蛋白重鏈的全長可變結(jié)構(gòu)域以及全長免疫S求蛋白重鏈組成的組。39.根據(jù)權(quán)利要求35所述的分離的多肽，其中，所述免疫球蛋白重鏈衍生自無脊推動物或脊推動物免疫球蛋白重鏈。40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的分離的多肽，其中，所述脊推動物選自由魚、可選;也岸欠骨魚、鳥、以及哺乳動物組成的組，其中所述哺乳動物可選地選自由犬、貓、靈長類、嚙齒動物、以及有^帝類動物組成的組。41.一種分離的多肽，所述多肽包含至少一個來自動物免疫王求蛋白輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域的骨架區(qū)，所述多肽對S1P具有反應(yīng)性并且包含至少一個具有氨基酸序列的CDR肽，其中所述氨基酸序列與肽氨基酸序列具有至少50%、可選地至少65%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少至少95%的序列同一'性，其中所述肽氨基酸序列選自由ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)組成的組。42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的分離的多肽，其中，所述CDR肽具有肽氨基酸序列，其中所述肽氨基酸序列選自由ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)組成的組，可選地其中所述分離的多肽包含至少兩個CDR肽，其中每個CDR肽具有獨立地選自由ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)組成的組中的氨基酸序列，可選地其中所述分離的多肽包含第一、第二、以及第三CDR肽，其中所述第一、第二、以及第三CDR肽的每一個具有獨立地選自由ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)組成的組中的氨基酸序列，可選地其中所述第一CDR肽包含氨基序列ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10),所述第二CDR肽包含氨基序列EGNILRP(SEQIDNO:11),以及所述第三CDR肽包含氨基序列LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)。43.根據(jù)權(quán)利要求41所述的分離的多肽，選自由動物免疫球蛋白輕鏈的片段、免疫球蛋白輕鏈的全長可變結(jié)構(gòu)域以及全長免疫球蛋白輕鏈組成的組。44.才艮據(jù)片又利要求41所述的分離的多肽，其中，所述免疫J求蛋白重鏈衍生自無脊推動物或脊推動物免疫球蛋白重鏈。45.才艮據(jù)4又利要求41所述的分離的多肽，其中，所述脊才,動物選自由魚、可選地軟骨魚、鳥、以及哺乳動物組成的組，其中所述哺乳動物可選地選自由犬、貓、靈長類、嚙齒動物、以及有^帝類動物纟且成的纟且。46.—種分離的抗體分子，包含a.兩個免疫球蛋白重鏈，其中每個免疫球蛋白重鏈是在生理范圍內(nèi)對S1P具有反應(yīng)性的動物免疫王求蛋白重鏈，所述重鏈包含至少一個來自免疫J求蛋白重鏈的可變結(jié)構(gòu)域的骨架區(qū)并且包含至少一個具有氨基酸序列的CDR肽，其中所述氨基酸序列與肽氨基酸序列具有至少50%、可選;也至少65%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的序列同一性，其中所述肽氨基酸序列選自由DHTIH(SEQIDNO:13)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)組成的組；并且與所述兩個免疫球蛋白重鏈功能上相關(guān)，b.兩個免疫球蛋白輕鏈，其中每個免疫球蛋白輕鏈是在生理范圍內(nèi)對SIP具有反應(yīng)性的動物免疫5求蛋白輕鏈，所述輕鏈包含至少一個來自免疫J求蛋白輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域的骨架區(qū)并且包含至少一個具有氨基酸序列的CDR肽，其中所述氨基酸序列與肽氨基酸序列具有至少50%、可選;也至少65%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的序列同一性，其中所述肽氨基酸序列選自由ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)組成的組。47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的分離的抗體分子，其中，每個所述免疫球蛋白重鏈包含第一、第二、以及第三CDR肽，其中所述第一、第二、以及第三免疫球蛋白重鏈CDR肽中的每一個具有獨立t也選自由DHTIH(SEQIDNO:13)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)組成的組中的氨基酸序列，并且其中每個所述免疫球蛋白輕鏈還包含第一、第二、以及第三CDR肽，其中每個所述第一、第二、以及第三免疫球NO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)組成的組中的氨基酸序列，可選地其中每個所述免疫球蛋白重鏈包含第一、第二、以及第三CDR肽，其中所述第一免疫球蛋白重鏈CDR肽包含氨基序列DHTIH(SEQIDNO:13),所述第二免疫球蛋白重鏈CDR肽包含氨基序列AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)，以及所述第三免疫球蛋白重鏈CDR肽包含氨基序列GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)，而其中每個所述免疫球蛋白輕鏈包含第一、第二、以及第三CDR肽，其中所述第一免疫球蛋白輕鏈CDR肽包含氨基序列ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10),所述第二免疫球蛋白輕鏈CDR肽包含氨基序列EGNILRP(SEQIDNO:11),以及所述第三免疫3求蛋白輕鏈CDR肽包含氨基序列LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)。48.—種分離的人源化抗體分子，包含a.兩個免疫球蛋白重鏈，其中每個免疫球蛋白重鏈在生理范圍內(nèi)對SIP具有反應(yīng)性并且包含至少一個來自人免疫^求蛋白重鏈的可變結(jié)構(gòu)域的骨架區(qū)，所述重鏈包含至少一個具有氨基酸序列的CDR肽，其中所述氨基酸序列與肽氨基酸序列具有至少50%、可選i也至少65%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的序列同一'l"生，其中所述肽氨基臥臾序歹'J選自由DHTIH(SEQIDNO:13)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)纟且成的纟且；并且與所述兩個免疫球蛋白重鏈功能上相關(guān)，b.兩個免疫球蛋白輕鏈，其中每個免疫球蛋白輕鏈在生理范圍內(nèi)對SIP具有反應(yīng)性并且包含至少一個來自人免疫J求蛋白輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域的骨架區(qū)，所述輕《連包含至少一個具有氨基酸序列的CDR肽，其中所述氨基酸序列與肽氨基酸序列具有至少65%、可選i也至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的序列同一性，其中所述肽氨基酸序列選自由ITTTDIDDD畫(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)組成的組。49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的分離的人源化抗體分子，其中每個所述免疫球蛋白重鏈包含第一、第二、以及第三CDR肽，其中每個所述第一、第二、以及第三免疫球蛋白重鏈CDR肽具有3蟲立i也選自由DHTIH(SEQIDNO:13)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)組成的組中的氨基酸序歹'J，而其中每個所述免疫球蛋白輕鏈也包含第一、第二、以及第三CDR肽，其中每個所述第一、第二、以及第三免疫球蛋白輕鏈CDR肽具有獨立地選自由ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)組成的組中的氨基酸序列，可選地其中所述第一免疫球蛋白重鏈CDR肽包含氨基序列DHTIH(SEQIDNO:13),所述第二免疫球蛋白重鏈CDR肽包含氨基序列AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)，以及所述第三免疫J求蛋白重鏈CDR肽包含氨基序列GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15),并且所述第一免疫球蛋白輕鏈CDR肽包含氨基序列ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)，所述第二免疫球蛋白輕鏈CDR肽包含氨基序列EGNILRP(SEQIDNO:11),以及所述第三免疫球蛋白輕鏈CDR肽包含氨基序列LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)。50.—種分離的人源化抗體分子，包含a.兩個免疫球蛋白重鏈，其中每個免疫球蛋白重鏈在生理范圍內(nèi)對SIP具有反應(yīng)性并且包含至少一個來自人免疫球蛋白重鏈的可變結(jié)構(gòu)域的骨架區(qū)，其中每個免疫球蛋白重鏈包含第一、第二、以及第三CDR肽，其中所述第一免疫球蛋白重鏈CDR肽包含氨基序列DHTIH(SEQIDNO:13)，所述第二免疫球蛋白重鏈CDR肽包含氨基序列AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)，以及所述第三免疫球蛋白重鏈CDR肽包含氨基序列GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15);并且與所述兩個免疫J求蛋白重鏈功能上相關(guān)，b.兩個免疫球蛋白輕鏈，其中每個免疫球蛋白輕鏈在生理范圍內(nèi)乂于SIP具有反應(yīng)性并且包含至少一個來自人免疫^求蛋白輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域的骨架區(qū)，其中每個免疫球蛋白輕鏈包含第一、第二、以及第三CDR肽，并且其中所述第一免疫球蛋白輕鏈CDR肽包含氨基序列ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)，所述第二免疫球蛋白輕鏈CDR肽包含氨基序列EGNILRP(SEQIDNO:11)，以及所述第三免疫球蛋白輕鏈CDR肽包含氨基序歹'JLQSDNLPFT(SEQIDNO:12)。51.—種多i"介結(jié)合分子，包含至少第一和第二配體結(jié)合元件，其中所述第一配體結(jié)合元件對SIP具有反應(yīng)性并且包含至少一個具有氨基酸序列的CDR肽，其中所述氨基酸序列與肽氨基商交序列具有至少50%、可選;1也至少65%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的序列同一')~生，其中所述肽氨基酸序列選自由DHTIH(SEQIDNO:13)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)組成的組。52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的多價結(jié)合分子，其中所述CDR肽具有選自由DHTIH(SEQIDNO:13)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)組成的組中的肽氨基酸序列，可選地其中所述多^f介結(jié)合分子包含至少兩個CDR肽，其中每個CDR肽具有獨立地選自由DHTIH(SEQIDNO:13)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)組成的組中的氨基酸序列，可選地其中所述多價結(jié)合分子包含第一、第二、以及第三CDR肽，其中每個所述第一、第二、以及第三CDR肽具有獨立i也選自由DHTIH(SEQIDNO:13)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGST!WFDF(SEQIDNO:15)組成的組中的氨基酸序列。53.根據(jù)權(quán)利要求51所述的多價結(jié)合分子，其中所述第一CDR肽包含氨基序列DHTIH(SEQIDNO:13),所述第二CDR肽包含氨基序列AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31),以及所述第三CDR肽包含氨基序列GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)。54.根據(jù)權(quán)利要求51所述的多價結(jié)合分子，所述多價結(jié)合分子是動物免疫球蛋白重鏈的片段，其中所述片段可選地選自由免疫球蛋白重《連的全長可變結(jié)構(gòu)域和全長免疫^求蛋白重鏈組成的組。55.根據(jù)權(quán)利要求51所述的多價結(jié)合分子，其中，所述免疫球蛋白重鏈衍生自無脊推動物或脊推動物免疫5求蛋白重鏈。56.根據(jù)權(quán)利要求51所述的多價結(jié)合分子，其中，所述第二配體結(jié)合元件也3寸S1P具有反應(yīng)寸生。57.根據(jù)權(quán)利要求51所述的多價結(jié)合分子，進一步包含至少一個另外的配體結(jié)合元件，可選地包含2至約IO，OOO個配體結(jié)合元件，可選地其中每一個所述配體結(jié)合元件對S1P具有反應(yīng)性。58.根據(jù)權(quán)利要求51所述的多價結(jié)合分子，其中所述配體結(jié)合元件連接于支架。59.—種多價結(jié)合分子，包含至少第一和第二配體結(jié)合元件，其中所述第一配體結(jié)合元件對SIP具有反應(yīng)性并且包含至少一個具有氨基酸序列的CDR肽，其中所述氨基酸序列與肽氨基酸序列具有至少50%、可選地至少65%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的序列同一性，其中所述肽氨基酸序列選自由ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)組成的組。60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的多價結(jié)合分子，其中所述CDR肽具有選自由ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)纟且成的纟且中的肽氨基酸序列，可選地其中所述多價結(jié)合分子包含至少兩個CDR肽，其中每個CDR肽具有獨立地選自由ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)組成的組中的氨基酸序列，可選地其中所述多價結(jié)合分子包含第一、第二、以及第三CDR肽，其中每個所述第一、第二、以及第三CDR肽具有獨立地選自由ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)組成的組中的氨基酸序列。61.根據(jù)權(quán)利要求59所述的多價結(jié)合分子，其中所述第一CDR肽包含氨基序列ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)，所述第二CDR肽包含氨基序列EGNILRP(SEQIDNO:11)，以及所述第三CDR肽包含氨基序列LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)。62.根據(jù)權(quán)利要求59所述的多價結(jié)合分子，所述多價結(jié)合分子是動物免疫球蛋白輕鏈的片段，其中所述片段可選地選自由免疫球蛋白輕鏈的全長可變結(jié)構(gòu)域和全長免疫球蛋白輕鏈組成的組。63.根據(jù)權(quán)利要求59所述的多價結(jié)合分子，其中所述免疫球蛋白輕鏈衍生自無脊推動物或脊推動物免疫球蛋白重鏈。64.根據(jù)權(quán)利要求59所述的多價結(jié)合分子，其中，所述第二配體結(jié)合元4牛也對S1P具有反應(yīng)性。65.根據(jù)權(quán)利要求59所述的多價結(jié)合分子，進一步包含至少一個另外的配體結(jié)合元件，可選地包含2至約IO，OOO個配體結(jié)合元件，可選地其中每一個所述配體結(jié)合元件對S1P具有反應(yīng)性。66.根據(jù)權(quán)利要求59所述的多價結(jié)合分子，其中，所述配體結(jié)合元件連接于支架。67.—種多價結(jié)合分子，包含連接于至少第一和第二配體結(jié)合元件的支架，其中所述第一配體結(jié)合元件對S1P具有反應(yīng)性并且包含功能上相關(guān)的第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽包含至少一個具有氨基酸序列的CDR肽，其中所述氨基酸序列與肽氨基酸序列具有至少50%、可選地至少65%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的序列同一寸生，其中所述月太氨基酸序列選自由DHTIH(SEQIDNO:13)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)纟且成的纟且，以及所述第二多肽包含至少一個具有氨基酸序列的CDR肽，其中所述氨基酸序列與肽氨基酸序列具有至少50%、可選地至少65%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的序列同一性，其中所述肽氨基酸序列選自由ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)組成的組。68.根據(jù)權(quán)利要求67所述的多價結(jié)合分子，其中，所述第一配體結(jié)合元件的所述第一多肽包含免疫球蛋白重鏈的可變結(jié)構(gòu)域而所述第一配體結(jié)合元件的所述第二多肽包含免疫J求蛋白輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域，其中所述多價結(jié)合分子可選地包含2至約IO，OOO個配體結(jié)合元件，可選地其中每個所述配體結(jié)合元<牛乂于SIP具有反應(yīng)寸生。69.—種用于治療或予貞防與高水平的SIP有關(guān)的疾病或病癥的方法，包括對需要上述治療的受治療者給予降〗氐SIP體內(nèi)有效濃度的有效量的制劑，所述制劑選自由下述組成的組a.抗S1P劑，所述制劑在生理條件下對于鞘氨醇-l-磷酸(SIP)具有反應(yīng)性并且包含至少一個具有氨基酸序列的CDR肽，其中所述氨基酸序列與肽氨基酸序列具有至少50%的序列同一性，其中所述肽氨基酸序列選自由DHTIH(SEQIDNO:13)、CISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:14)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)、ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)組成的組；b.分離的多肽，包含至少一個來自動物免疫^求蛋白重鏈的可變結(jié)構(gòu)域的骨架區(qū)，所述多肽在生理范圍內(nèi)對SIP具有反應(yīng)性并且包含至少一個具有氨基酸序列的CDR肽，其中所述氨基酸序列與肽氨基酸序列具有至少50%的序列同一性，其中所述肽氨基酸序列選自由DHTIH(SEQIDNO:13)、CISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:14)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)組成的組；c.分離的抗體分子，包含(i)兩個免疫球蛋白重鏈，其中每個免疫球蛋白重鏈是在生J里范圍內(nèi)只于SIP具有反應(yīng)性的動物免疫王求蛋白重鏈，所述重鏈包含至少一個來自免疫球蛋白重鏈的可變結(jié)構(gòu)域的骨架區(qū)并且包含至少一個具有氨基酸序列的CDR肽，其中所述氨基酸序列與肽氨基酸序列具有至少50%的序列同一性，其中所述肽氨基酸序列選自由DHTIH(SEQIDNO:13)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)組成的組；并且與所述兩個免疫J求蛋白重鏈功能上相關(guān)，(ii)兩個免疫球蛋白輕鏈，其中每個免疫球蛋白輕鏈是在生理范圍內(nèi)對SIP具有反應(yīng)性的動物免疫J求蛋白輕鏈，所述輕鏈包含至少一個來自免疫5求蛋白輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域的骨架區(qū)并且包含至少一個具有氨基酸序列的CDR肽，其中所述氨基酸序列與肽氨基酸序列具有至少50%的序列同一性，其中所述肽氨基酸序列選自由ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)組成的組；d.多價結(jié)合分子，包含至少第一和第二配體結(jié)合元件，其中所述第一配體結(jié)合元件對SIP具有反應(yīng)性并且包含至少一個具有氨基酸序列的CDR肽，其中所述氨基酸序列與肽氨基酸序列具有至少50%的序列同一性，其中所述肽氨基酸序列選自由DHTIH(SEQIDNO:13)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)組成的組；e.分離的抗S1P抗體重鏈，包含具有選自由SEQIDNO:27和SEQIDNO:35組成的組中的氨基S臾序列的可變結(jié)構(gòu)域；f.分離的抗S1P抗體輕鏈，所述抗SIP抗體輕鏈包含具有氨基酸序列的可變結(jié)構(gòu)域，其中所述氨基酸序列選自由SEQIDNO:30和SEQIDNO:37纟且成的組；以及g.分離的抗S1P抗體，其中每個免疫J求蛋白重鏈包含具有選自由SEQIDNO:27和SEQIDNO:35組成的組中的氨基酸序列的可變結(jié)構(gòu)域，而每個免疫球蛋白輕鏈包含具有選自由SEQIDNO:30和SEQIDNO:37組成的組中的氨基酸序列的可變結(jié)構(gòu)域；,人而治療或予貞防f斤述疾病或病癥。70.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其中，所述疾病或病癥選自由癌癥、炎性疾病、腦血管病、心血管疾病、目艮部疾病、與過多的纖維發(fā)生有關(guān)的疾病和障礙、以及與病理性血管發(fā)生有關(guān)的疾病或病癥纟且成的纟且。71.才艮據(jù)4又利要求69所述的方法，其中，所述受治療者是人。72.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其中，連同另一種治療劑一起給予所述抗SIP劑、分離的多肽或抗體、多《介結(jié)合分子或分離的4元SIP#元體，以治療或子貞防所述疾病或病癥。73.—種用于檢測SIP或SIP代謝物的方法，包括將懷疑包含鞘脂的樣品暴露于相對于SIP具有反應(yīng)性的化合物，其中所述分離的抗SIP抗體、根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗SIP劑、根據(jù)權(quán)利要求35所述的分離的多肽以及根據(jù)權(quán)利要求51所述的多1"介結(jié)合分子組成的組，以及確定所述相對于SIP具有反應(yīng)性的化合物與所述樣品的結(jié)合。74.根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中，如果存在于所述樣品中，在相對于SIP具有反應(yīng)性的化合物結(jié)合于所述SIP或SIP代謝物的條件下，檢測已知或懷疑包含所述SIP或SIP代謝物的樣品暴露于所述相對于SIP具有反應(yīng)性的化合物所獲得的結(jié)合結(jié)果。75.根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中，所述樣品是組織或液體才羊品。76.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中，所述液體樣品選自由全血、血漿、血清、尿、^青液、月旦汁、水才羊液、3皮璃體液、粘液、以及痰組成的組。77.4艮據(jù)4又利要求73所述的方法，其中，所述相對于S1P或S1P代謝物具有反應(yīng)性的化合物選自由單克隆抗體、抗體片段、抗體變體、以及抗體書于生物組成的組。78.才艮據(jù)片又利要求73所述的方法，其中，所述相對于S1P或S1P代謝物具有反應(yīng)性的化合物被附著于載體。79.根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法是ELISA試驗。全文摘要本發(fā)明涉及抗S1P劑，例如，人源化單克隆抗體，以及它們用于檢測S1P或應(yīng)用于治療與S1P有關(guān)的疾病和病癥的應(yīng)用。文檔編號C12N5/10GK101679506SQ200780048665公開日2010年3月24日申請日期2007年10月26日優(yōu)先權(quán)日2006年10月27日發(fā)明者史蒂文·塔蘭·瓊斯,吉納維芙·漢森,威廉·A·加蘭,戴維·加雷斯·威廉斯,羅格·A·薩巴迪尼申請人:勒帕斯公司