專利名稱：：酶催化的高度支化的直鏈淀粉和支鏈淀粉簇的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種酶催化的高度支化的直鏈淀粉和支鏈淀粉簇的制備方法，具體地，本發(fā)明涉及的方法包括以下步驟用分支酶或a-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶水解支鏈淀粉以產(chǎn)生支鏈淀粉簇，同時，用分支酶處理直鏈淀粉以制備支化的直鏈淀粉，該支化的直鏈淀粉中糖苷的側(cè)鏈?zhǔn)侵Щ?；以及利用麥芽糖淀粉酶的轉(zhuǎn)糖基活性，由已制備的支鏈淀粉簇和支化的直鏈淀粉制備得到高度支化的支鏈淀粉簇、高度支化的直鏈淀粉和支化的寡糖。
背景技術(shù)：
：高度支化的支鏈淀粉簇和直鏈淀粉是新的功能性材料，它們是高度水溶性的，并能延緩在小腸內(nèi)的消化，防止血液葡萄糖水平急劇升高，而且能通過持續(xù)的能量供應(yīng)來增強運動力，因此需要一種能夠有效制備此種新的功能性材料的方法。(x-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶或分支酶能水解支鏈淀粉簇之間的片段，從而產(chǎn)生支鏈淀粉簇。此外，當(dāng)分支酶與直鏈淀粉反應(yīng)時能產(chǎn)生支化的直鏈淀粉。麥芽糖淀粉酶水解淀粉后主要產(chǎn)生麥芽糖單位，并且該酶還通過形成多種糖苷鍵而展示出高度的轉(zhuǎn)糖基活性，所述糖苷鍵的形成可以產(chǎn)生高度支化的支鏈淀粉和直鏈淀粉，其中葡萄糖通過a-l，6糖苷鍵而連接在非還原末端。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的目的是利用麥芽糖淀粉酶、以及(x-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶或分支酶提供一種作為新的功能性材料的高度支化的支鏈淀粉和直鏈淀粉。為了實現(xiàn)上述目的，以從枯草桿菌(5flC77/w^Z^7&)168中分離的分支酶或從水生棲熱菌(77ze^wscoto血c加)中分離的a-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶在pH5.5-7.5和30-75'C條件下對支鏈淀粉和直鏈淀粉進行處理，隨后再用從嗜熱脂肪桿菌(Sac/〃^Weflraf/2mT7o;Mw)中分離的麥芽糖淀粉酶在45-65"C下進行處理，結(jié)果產(chǎn)生高度支化的支鏈淀粉簇和直鏈淀粉。本發(fā)明的特征在于提供了通過將淀粉與分支酶或a-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、以及麥芽糖淀粉酶進行反應(yīng)，來制備高度支化的支鏈淀粉簇、高度支化的直鏈淀粉和支化的寡糖的方法。所述淀粉可以選自淀粉、含淀粉的谷物、或支鏈淀粉和直鏈淀粉。本發(fā)明方法的特征在于包括以下步驟向淀粉中加入從枯草桿菌(萬ac/〃w168中分離的分支酶或從水生棲熱菌(77z^7mAswo/o血"wj)中分離的a-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶，在30-75。C下孵育30分鐘到4小時，從而產(chǎn)生支鏈淀粉簇或支化的直鏈淀粉；將上述得到的支鏈淀粉簇或支化的直鏈淀粉，用來源于嗜熱脂肪桿菌(5ac/〃w他ara^^mopMw)的麥芽糖淀粉酶在45-65。C下處理2-4小時。所述a-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、分支酶和麥芽糖淀粉酶可以是從天然的原核或真核生物體分離和純化的典型的酶，或者可以是通過人工表達(dá)的方法用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的所述酶的基因而制備的。根據(jù)本發(fā)明，所述a-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶通過下述方法制得將編碼來自水生棲熱菌(7T^薩s^oto^cto)的a-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶的基因克隆，并轉(zhuǎn)化到枯草桿菌(^^7/^^&//&)ISW1214中，然后將表達(dá)的酶純化。所述分支酶通過下述方法制得將編碼來自枯草桿菌(S""7/ws"Z^'to)168的分支酶的基因克隆，并轉(zhuǎn)化到枯草桿菌中，然后將表達(dá)的酶純化。所述麥芽糖淀粉酶也通過以下的方法制得將編碼來自嗜熱脂肪桿菌(^""7/m他ara/^mo;M^)的麥芽糖淀粉酶的基因克隆，并轉(zhuǎn)化到枯草桿菌LK87中，然后將表達(dá)的酶純化。在上述酶中，分支酶可以從枯草桿菌168中分離得到或利用基因工程方法制備得到。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述分支酶通過如下步驟產(chǎn)生(a)插入從枯草桿菌168中分離的編碼分支酶的DNA序列，從而制備得到重組載體；(b)將重組載體引入宿主細(xì)胞，從而制備得到轉(zhuǎn)化體；以及(c)培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化體以產(chǎn)生淀粉酶。在步驟(a)中，可以將編碼分支酶的序列插入到典型的表達(dá)載體(即pET-22b(+))中，但是最好根據(jù)宿主細(xì)胞來選擇合適的載體。在本發(fā)明的一個實施例中，制備了具有如圖2所示的剪切圖譜的p6xHTKNd載體。在轉(zhuǎn)化的步驟(b)中，所述宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞、真核細(xì)胞或衍生自真核細(xì)胞的細(xì)胞，包括大腸桿菌、乳酸細(xì)菌、酵母、真菌等等，但并不限于此。轉(zhuǎn)化的方法可以利用眾所周知的常用方法進行。在培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的步驟(c)中，培養(yǎng)基可以根據(jù)宿主細(xì)胞進行合適的選擇，且培養(yǎng)條件也可以根據(jù)宿主細(xì)胞而改變。將根據(jù)本發(fā)明的一個實施例中所制備的大腸桿菌MC1061，在含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中于30-37'C下培養(yǎng)16-20小時，即可產(chǎn)生許多分支酶。同時，產(chǎn)生分支酶的方法可以包括從進行步驟(c)后得到的轉(zhuǎn)化體中純化得到淀粉酶重組蛋白的步驟。所述純化的步驟可以包括用超聲波裂解轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和用超聲裂解的上清液進行鎳親和層析的步驟。上述產(chǎn)生分支酶的方法，可以通過在較低的溫度下培養(yǎng)微生物而有效的降低成本，并且還可以提高生產(chǎn)分支酶的生產(chǎn)能力。本發(fā)明的淀粉酶可以通過眾所周知的方法而簡單地制備，這對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是顯而易見的。用上述方法制備的高度支化的支鏈淀粉簇和直鏈淀粉的分子量和組成可以分別用SEC-MALLS(排阻層析法-多角激光散射)和高效離子交換層析來分析。換言之，高度支化的支鏈淀粉和直鏈淀粉的分子量可以用SEC-MALLS(排阻層析法-多角激光散射)來測定，并且在它們與異淀粉酶反應(yīng)而去分枝后，可以用高效離子交換層析來分析高度支化的支鏈淀粉和直鏈淀粉的組成。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，高度支化的支鏈淀粉簇可以通過如下步驟產(chǎn)生和測定將膠凝化的糯米淀粉與50-100U/g(每克糯米淀粉用50單位)的a-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶一起孵育，以產(chǎn)生支鏈淀粉簇；將所產(chǎn)生的支鏈淀粉簇用100-500U/g(每克支鏈淀粉簇用100-500單位)麥芽糖淀粉酶在45-65'C下處理3-5小時，以產(chǎn)生高度支化的支鏈淀粉簇。當(dāng)在各步驟中用SEC-MALLS測定它們的分子量時，支鏈淀粉簇的分子量確定為約105，高度支化的支鏈淀粉簇的分子量為約104，相反，糯米淀粉的分子量為108?？梢詫⑺鲋ф湹矸鄞睾透叨戎Щ闹ф湹矸鄞赜?.2-lU/mg的異淀粉酶(每毫克底物用0.2-1單位)在45-6(TC下處理24-48小時，以使a-l，6糖苷鍵去分支化，并且可以使用高效離子交換層析來確定它們的組成。為了確認(rèn)大于13DP的高度支化的支鏈淀粉簇，由于鑒定它們的支化度很困難，因此應(yīng)該用P-淀粉酶進行處理。預(yù)計最終產(chǎn)生分子量為104-105、a-l，6糖苷鍵長度為6-23DP的高度支化的支鏈淀粉簇。同時，根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，高度支化的直鏈淀粉通可以過如下步驟產(chǎn)生將直鏈淀粉(來源于馬鈴薯的III型直鏈淀粉，Sigma)與50-100U/mg(每毫克底物用50-100單位)的分支酶一起孵育，以獲得支化的直鏈淀粉;用0.2-lU/mg(每毫克底物用0.2-1單位)的麥芽糖淀粉酶處理上述支化的直鏈淀粉，以產(chǎn)生高度支化的直鏈淀粉。用0.2-lU/mg的異淀粉酶處理支化的直鏈淀粉和高度支化的直鏈淀粉以去分支化，隨后進行高效離子交換層析，可以產(chǎn)生具有新的8-18DP的a-l,6糖苷鍵及a-l,4糖苷鍵的高度支化的直鏈淀粉。另外，根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，當(dāng)用硅膠K5F薄層層析板分析在產(chǎn)生高度支化的支鏈淀粉簇的過程中產(chǎn)生的寡糖時，可以確認(rèn)較長的麥芽糖寡糖被轉(zhuǎn)變?yōu)?-5BDP的支化的寡糖。本發(fā)明中所用的術(shù)語"支化的"定義為葡萄糖通過(x-l,6糖苷鍵及a-1,4糖苷鍵而連接的狀態(tài)。另外，"DP"是"聚合度"的縮寫，指葡萄糖的數(shù)目。在本發(fā)明中"DP"具體指被異淀粉酶去支化的葡萄糖的數(shù)目，即分支鏈的長度。在本發(fā)明中，"高度支化的"定義為DP大于6。另外，"BDP"是"支化的聚合度"的縮寫，且支化的寡糖不用異淀粉酶處理即可以用BDP表示，因為它的分子量較低，它的支化度可以通過薄層層析法(TLC)分析來確定。本發(fā)明的特征在于提供了一種加工的健康保健食品，該加工的健康保健食品具有抗糖尿病、抗肥胖或持續(xù)供應(yīng)能量的作用。本發(fā)明中所述的"持續(xù)供應(yīng)能量的作用"指所述高度支化的支鏈淀粉或直鏈淀粉可以被緩慢地水解，從而能夠持續(xù)地供應(yīng)能量。如表l中所示，當(dāng)比較支鏈淀粉簇和高度支化的支鏈淀粉簇通過葡糖淀粉酶(能水解a-l，6糖苷鍵和a-l，4糖苷鍵，但是對a-1,4糖苷鍵的水解力較高)的水解動力學(xué)時，可以推測支鏈淀粉簇由于K^值高和Km值低而更容易被葡糖淀粉酶所水解。如果Km值低，那么它的效率就高，會誘導(dǎo)與底物之間的較強結(jié)合，并產(chǎn)生許多產(chǎn)物。相反，如果Km值高，那么它的效率就低，與底物的結(jié)合會較弱。K^值較高意味著存在更多的能夠?qū)⒌孜镛D(zhuǎn)化成產(chǎn)物的分子。相應(yīng)的，推測出高度支化的支鏈淀粉簇被葡糖淀粉酶水解的較慢。換言之，高度支化的形成使水解更緩慢，并且由此可以持續(xù)地供應(yīng)能量。本發(fā)明涉及酶催化的高度支化的直鏈淀粉和支鏈淀粉簇的制備方法。a-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶或分支酶能水解淀粉中支鏈淀粉簇之間的片段的連接，從而產(chǎn)生支鏈淀粉簇，同時，分支酶將支化的側(cè)鏈連接到直鏈淀粉上，從而產(chǎn)生支化的直鏈淀粉，隨后用麥芽糖淀粉酶處理所述支鏈淀粉簇或支化的直鏈淀粉，從而將長的側(cè)鏈剪切為短的側(cè)鏈并將葡萄糖轉(zhuǎn)移到側(cè)鏈上，從而從淀粉中有效地產(chǎn)生高度支化的支鏈淀粉簇、高度支化的直鏈淀粉或支化的寡糖。圖1為使用BSMA(嗜熱脂肪桿菌(Sac/〃ws)麥芽糖淀粉酶)和a-GTase(4-a-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶)或分支酶由支鏈淀粉或淀粉制備高度支化的支鏈淀粉簇和直鏈淀粉的流程示意圖。圖2為克隆編碼枯草桿菌(萬^///^^^^7&)168的分支酶的基因的流程示意圖。圖3為用大腸桿菌MC1061產(chǎn)生的枯草桿菌168的分支酶的電泳照片。圖4為顯示了重組蛋白質(zhì)(分支酶)在多種pH值條件下的活性的曲線圖。圖5為顯示了重組蛋白質(zhì)(分支酶)在多種溫度條件下的活性的曲線圖。圖6為SEC-MALLS分析結(jié)果，該結(jié)果顯示用a-GTase制備的支鏈淀粉簇的分子量降低。圖7為顯示了支鏈淀粉簇和高度支化的支鏈淀粉簇的側(cè)鏈分布的層析圖。圖8為顯示了支化的直鏈淀粉和高度支化的直鏈淀粉的側(cè)鏈分布的層析圖。圖9為支化的寡糖的TLC層析圖，該支化的寡糖是在用BSMA制備高度支化的直鏈淀粉和支鏈淀粉簇的過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品。具體實施例方式在下文中，通過下述實施例詳細(xì)說明本發(fā)明。然而，所述實施例是為了說明本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。實施例l:來源于枯草桿菌(^a"7/^w^/to)168的分支酶的克隆、產(chǎn)生和特征1-1.編碼分支酶的基因的克隆為了分離分支酶，分別制備了正向引物F-glgB(5，-GAAAGGATGATTCCATGGCCGCTGCCAGC-3，)和反向引物R-glgB(5，-AAAGAGGAGAGATAAAAAGATGAAAAAACAATGTGTAGCCA-3，)。然后，用含有枯草桿菌168(ATCC23857D-5)的染色體DNA、ExTaq聚合酶(TakaraPhuzo，東京，日本)、ExTaq緩沖液和dNTP混合物的混合液進行PCR。使用US/7500實時PCR系統(tǒng)(Corbett公司)進行PCR。反應(yīng)按如下條件進行第一個步驟，95"變性5分鐘，一個循環(huán)；第二個步驟，94°C變性30秒、55'C退火30秒、72'C延伸3分鐘，30個循環(huán)；最后72'C延伸7分鐘。在4'C冷卻4分鐘以終止反應(yīng)。上述反應(yīng)的結(jié)果獲得了1.8kb的PCR產(chǎn)物。將所述PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶iVcoI和屈oI處理，并與相應(yīng)的表達(dá)載體p6xHTKNd連接，制成p6xHTKNDglgB。p6xHTKNDglgB的剪切圖譜在圖2中顯示。所述p6xHTKNDglgB載體具有編碼分支酶的基因，并且在分支酶基因的3'-末端具有附加的6-組氨酸標(biāo)簽。為了轉(zhuǎn)化，將大腸桿菌MC1061(NewEnglandBiolabinc.)在5mLLB培養(yǎng)基中于37t:預(yù)培養(yǎng)12小時。將lmL預(yù)培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到50mL新鮮LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到600nm處的O.D值達(dá)到0.5。然后，將1.5mL培養(yǎng)液在4°C離心(7000xg，5分鐘)，并收集沉淀，將沉淀重懸于0.75mL轉(zhuǎn)化溶液(50mLCaCl2)中，在冰上放置30分鐘。將15mL的所述重懸溶液與500ng含p6xHTKNDglgB的連接溶液混合，在冰上放置1小時，在42'C熱激2分鐘。在熱激后的溶液中補充0.8mLLB培養(yǎng)基，于37"C培養(yǎng)1小時，然后將該溶液涂布于含卡那霉素(終濃度為100mg/mL)的LB瓊脂培養(yǎng)基上，來篩選有抗性的微生物。將所篩選的微生物接種于5mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)12小時，并離心收集微生物。使用質(zhì)粒分離試劑盒從收集的微生物中分離質(zhì)粒，并用限制性內(nèi)切酶A^oI和J^oI切割質(zhì)粒，該切割顯示所述質(zhì)粒含有約1.8kb的分支酶。1-2.轉(zhuǎn)化體的制備將上述制備的p6xHTKNDglgB載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MC1061中，篩選卡那霉素抗性的微生物。將上述篩選的轉(zhuǎn)化體接種于3L含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，并于37'C培養(yǎng)16小時。1-3.純化通過離心(4'C，7000xg，離心30分鐘)收集上述培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化體，并將其重懸于含300mMNaCl和10mM咪唑的50mM的Tris-HCl緩沖溶液(pH7.5)中，然后進行超聲波裂解。將超聲裂解的溶液離心獲得上清液，并將該上清液在7(TC熱處理20分鐘。熱處理之后，將該溶液離心(10000xg，離心30分鐘)收集上清液。用鎳-NTA親和層析從所述上清液中純化分支酶溶液。1-4.酶的活性和pH值特征將溶于50mMTris-HCl緩沖液中的所述酶溶液(25|iL)與溶于50mMTris-HCl緩沖液(pH7.5)中的0.1%直鏈淀粉溶液混合，并于37'C孵育20分鐘。用碘化物-HCl溶液終止反應(yīng)并染色。測量660nm處的吸光度。1單位分支酶定義為與直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較，每分鐘降解lpg/mL直鏈淀粉的酶量。ii為了確定所述酶的最適pH值，以P-環(huán)糊精的多種pH值來測量該酶的相對活性。25pL0.1%(w/v)的直鏈淀粉溶液，分別溶解于50mM的醋酸鈉緩沖液(pH4.0-6.0)、50mM的磷酸鈉緩沖液(pH6.0-8.0)和50mM的Tris-HCl緩沖液(pH7.0-10.0)中，將它們分別加入到25pL用各自緩沖液溶解的底物溶液中，并在30'C孵育20分鐘，以測定酶的相對活性。圖4顯示了重組蛋白質(zhì)(分支酶)在多種pH條件下的活性，該分支酶在pH7.5的條件下顯示出最大活性，在pH9.0-10.0的條件下具有大于50%的活性。1-5.酶的溫度特征為了確定所述分支酶的最適溫度，在多種溫度下將25pL溶解于50mMTris-HCl緩沖液(pH7.5)中的直鏈淀粉溶液熱處理5分鐘。然后，將熱處理后的溶液與25pL分支酶混合，在各溫度下孵育20分鐘，以測定該酶的相對活性。圖5顯示了重組蛋白質(zhì)(分支酶)在多種溫度條件下的活性，該分支酶在3(TC的條件下顯示出最大活性。實施例2:支鏈淀粉簇的制備2-1.制備使用糯米淀粉作為淀粉的來源。a-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶通過下述方法制得將水生棲熱菌(7T2enm^■scoto^c^s)ATCC27978的a-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)化到枯草桿菌(Bac/〃wsw&z7&)ISW1214(TakaraPhuzo公司)中，然后將表達(dá)的酶用鎳親和層析純化。用25mM磷酸緩沖液(pH6.5)制備5%的糯米淀粉溶液，并將該溶液置于沸水中20分鐘進行膠凝化。然后，向膠凝化的淀粉溶液中加入100U/g的a-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(每克糯米淀粉用100單位)，將混合液在75T:下孵育30分鐘。將混合液煮沸30分鐘以終止反應(yīng)。2-2.用SEC-MALLS(排阻層析法-多角激光散射)測量分子量將0.5%(5mg/mL)的糯米淀粉和0.5%(5mg/mL)的支鏈淀粉簇煮沸超過1小時，分別注射到SEC-MALLS中測量它們的分子量。用WyattTechnology制造的MALLS系統(tǒng)以及Shodex公司制造的由連接的SUGARKS-806(8.0mmlDx300mm)禾卩SUGARKS-804(8.0mmlDx300mm)組成的柱進行測量。結(jié)果在圖6中顯示。實施例3:從支鏈淀粉簇制備高度支化的支鏈淀粉簇3-1.高度支化的支鏈淀粉簇的制備麥芽糖淀粉酶通過以下的方法制得將嗜熱脂肪桿菌(S^7/MWearaAemopMw)KCTC0114BP的麥芽糖淀粉酶基因轉(zhuǎn)化到枯草桿菌LK87(高麗大學(xué)研究生院，Improvementoftheproductionofforeignproteinsusingaheterologoussecretionvectorsystemin5ac/〃z^s由版effectsofresistancetoglucose-mediatedcataboliterepression.Molcells.1997Dec31;7(6):788-94.)中，然后將表達(dá)的酶用鎳親和層析純化。然后，將100U/g麥芽糖淀粉酶(每克支鏈淀粉簇用100單位)與實施例1中反應(yīng)已終止的反應(yīng)溶液一起在55X:下孵育4小時。煮沸超過30分鐘來終止此反應(yīng)，并將反應(yīng)溶液在12000rpm離心20分鐘，以除去變性的蛋白質(zhì)。為了除去殘留在反應(yīng)溶液中的鹽，將反應(yīng)溶液通過陰離子交換樹脂(C100FL，Prolite公司)和陰離子交換樹脂(A400,Prolite公司)。然后，為了除去殘余的多糖，加入兩倍體積的乙醇，以沉淀大分子的糖，然后將溶液再離心并去除上清液，將沉淀凍干制成粉末。3-2.用高效離子交換層析分析反應(yīng)溶液為了確認(rèn)支鏈淀粉簇和高度支化的支鏈淀粉簇中側(cè)鏈的分布和組成，將上述簇分別溶解于25mM醋酸鈉緩沖液(pH4.3)制備成1%的溶液。將該溶液用0.5U/mg(每毫克底物用0.5單位)異淀粉酶在6(TC處理48小時。各反應(yīng)物中a-l,6糖苷鍵被切割，用高效離子交換層析(GP40梯度泵，Dionex公司)以CaroboPACTMPA1(4x50mm)柱來分析各反應(yīng)物。由于DP大于13的高度支化的支鏈淀粉簇的分枝部分很難區(qū)分，因此使用P-淀粉酶處理以使分析更容易。(圖7)實施例4:用葡糖淀粉酶水解高度支化的支鏈淀粉簇的水解動力學(xué)用分離自黑曲霉(^y^^/〃^"/ger)的葡糖淀粉酶(FlukaBiochemica.)來研究支鏈淀粉簇和高度支化的支鏈淀粉簇的水解動力學(xué)。將50mL多種濃度的溶于50mM醋酸鈉緩沖液(pH4.5)的底物溶液在5(TC預(yù)熱5分鐘。然后向底物溶液中加入50pL(0.3U)的葡糖淀粉酶，在60'C每隔30秒或1分鐘收集部分的(20pL)反應(yīng)混合物，持續(xù)收集5分鐘。加入20pL0.1NNaOH來終止上述反應(yīng)。支鏈淀粉簇或高度支化的支鏈淀粉簇的水解量用GOD-POD方法(葡萄糖檢測試劑，AsanPharmaceutical)測表1顯示用GOD-POD方法對支鏈淀粉簇和高度支化的支鏈淀粉簇的葡糖淀粉酶水解動力學(xué)的測量和定量結(jié)果。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實施例5:支化的直鏈淀粉和高度支化的直鏈淀粉的制備5-1.支化的直鏈淀粉的制備為了產(chǎn)生支化的直鏈淀粉，使用10mL溶解在90%DMSO中的0.2%的直鏈淀粉(馬鈴薯中提取的III型直鏈淀粉，Sigma)。在振蕩中向所述直鏈淀粉溶液中加入10mL200mMTris-HCl緩沖液(pH7.5)和50U/mg分支酶(每毫克底物用50單位)。然后，加入蒸餾水使終體積達(dá)到40mL。反應(yīng)混合物在30'C預(yù)熱4小時，并在沸水中加熱IO分鐘來終止反應(yīng)。為了除去不可溶的鹽，加入兩倍體積的100%乙醇，于-2(TC放置30分鐘，在12000rpm、4i:離心20分鐘。離心后，除去上清液，收集含有支化的直鏈淀粉的沉淀。5-2.高度支化的直鏈淀粉的制備為了產(chǎn)生高度支化的直鏈淀粉，將實施例5-1的反應(yīng)物混合并重懸于50mM檸檬酸鈉緩沖液(pH6.5)中，并加入0.5U/mgBSMA(每毫克底物用0.5單位)。將反應(yīng)混合物在5(TC孵育12小時，在IO(TC沸水中加熱10分鐘來終止反應(yīng)。為了除去產(chǎn)生的寡糖，加入兩倍體積的100%乙醇，并將溶液于-2(TC放置30分鐘，在12000rpm、4'C離心20分鐘，除去上清液，沉淀為高度支化的直鏈淀粉。5-3.支化的直鏈淀粉和高度支化的直鏈淀粉的側(cè)鏈分析為了分析支化的直鏈淀粉和高度支化的直鏈淀粉的側(cè)鏈分布和組成，通過重懸于25mM醋酸鈉緩沖液(pH4.3)來制備1%的樣品溶液。該溶液與0.5U/mg異淀粉酶(酶毫克底物用0.5單位)一起在6(TC下孵育48小時。用高效離子交換層析(GP40梯度泵，Dionex公司)結(jié)合CaroPAVPA1(4x50mm)柱來分析去支化的(ci-l,6糖苷鍵被切割)樣品。圖8揭示了與支化的直鏈淀粉相比，高度支化的直鏈淀粉具有新支化的部分。實施例6:高度支化的支鏈淀粉簇反應(yīng)溶液中寡糖的分析為了分析作為高度支化的支鏈淀粉簇的產(chǎn)生過程中的副產(chǎn)物的寡糖，在麥芽糖淀粉酶和支鏈淀粉簇的反應(yīng)過程中的多個時間(例如0.5、1、3、5、15小時)收集樣品。將該樣品與兩倍體積的乙醇混合，并于-2(TC放置30分鐘，以沉淀大分子，在12000rpm、4t:離心20分鐘獲得上清液。用薄層層析分析各上清液。在層析板(WhatmanK5F硅膠TLC板)上點lpL樣品，在含異丙醇/乙酸乙酯/水(3:1:1，v/v/v)的溶劑混合物的TLC容器中展開一次。將層析板徹底干燥，并通過將其迅速浸入含0.3%(w/v)N-(l-萘基)-乙二胺和5%(w/v)H2S04的甲醇溶液中來展開。將該層析板晾干，并在ll(TC以上的烘箱中放置IO分鐘，直到白色背景上出現(xiàn)黑色的點。如圖9中所示，證實了隨反應(yīng)的進行，較長的麥芽糖寡糖被轉(zhuǎn)變?yōu)?-5BDP的支化的寡糖。權(quán)利要求1、一種制備高度支化的直鏈淀粉、高度支化的支鏈淀粉簇或支化的寡糖的方法，該方法是將淀粉與分支酶或α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、以及麥芽糖淀粉酶一起孵育。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，該方法包括以下步驟將淀粉與從枯草桿菌(Ba"7/Mra^'fc)中分離的分支酶或從水生棲熱菌(7T2mm^scoto甴"w)中分離的a-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶，在30-75。C下孵育30分鐘到4小時，以產(chǎn)生支鏈淀粉簇或支化的直鏈淀粉；以及將得到的支鏈淀粉簇或支化的直鏈淀粉，用來源于嗜熱脂肪桿菌(萬a"7/wWearaAwmo//n7wj)的麥芽糖淀粉酶在45-65°。下處理2-4小時，以制備高度支化的直鏈淀粉、高度支化的支鏈淀粉簇或支化的寡糖。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述淀粉是選自由淀粉、含淀粉的谷物、支鏈淀粉和直鏈淀粉所組成的組中的一種。4、一種高度支化的支鏈淀粉簇，該高度支化的支鏈淀粉簇由權(quán)利要求1-3中的任意一項所述的方法制備，該高度支化的支鏈淀粉簇具有104-105的分子量和6-23DP的a-1,6糖苷鍵。5、一種高度支化的直鏈淀粉，該高度支化的直鏈淀粉由權(quán)利要求1-3中的任意一項所述的方法制備，該高度支化的直鏈淀粉具有8-18DP的a-1,6糖苷鍵及a-l，4糖苷鍵。6、一種支化的寡糖，該支化的寡糖由權(quán)利要求1-3中的任意一項所述的方法制備，該支化的寡糖通過薄層層析法測定具有2-5BDP。7、一種加工的健康保健食品，該加工的健康保健食品含有高度支化的直鏈淀粉或高度支化的支鏈淀粉簇作為有效成分。該高度支化的直鏈淀粉或高度支化的支鏈淀粉簇由權(quán)利要求1-3中的任意一項所述的方法制備。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的加工的健康保健食品，其中，該加工的健康保健食品具有抗糖尿病、抗肥胖或持續(xù)供應(yīng)能量的作用。全文摘要本發(fā)明涉及酶催化的高度支化的直鏈淀粉和支鏈淀粉簇的制備方法。α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶或分支酶能水解淀粉中支鏈淀粉簇之間的片段的連接，從而產(chǎn)生支鏈淀粉簇，同時，分支酶將支化的側(cè)鏈連接到直鏈淀粉上，從而產(chǎn)生支化的直鏈淀粉，隨后用麥芽糖淀粉酶處理所述支鏈淀粉簇或支化的直鏈淀粉，以將長的側(cè)鏈剪切為短的側(cè)鏈并將葡萄糖轉(zhuǎn)移到側(cè)鏈上，從而由淀粉有效地產(chǎn)生高度支化的支鏈淀粉簇、高度支化的直鏈淀粉或支化的寡糖。文檔編號C12P19/00GK101595226SQ200780050622公開日2009年12月2日申請日期2007年5月9日優(yōu)先權(quán)日2007年2月1日發(fā)明者宋相勛,樸真姬,李康杓申請人:Cj第一制糖株式會社