專利名稱：用于心律不齊的風險管理的遺傳標記物的制作方法
用于心律不齊的風險管理的遺傳標記物
背景技術：
心律不齊是一類醫(yī)學病癥，其中心臟的電活動不規(guī)律，或與正常 相比更快或更慢。某些心律不齊是危及生命的，可以引起心臟停止或 突然死亡。其它的會引起或傾向于引起其它惡化的癥狀或疾病，包括
中風。纖顫是一種嚴重形式的心律不齊，其中由于收縮性細胞的功能 缺乏統一性而使心肌出現不規(guī)則的或振顫運動。纖顫可以影響心房(心
房纖顫(AF)或心房撲動(AF1))或心室(心室纖顫(VF))。
心房纖顫(AF)是涉及兩個小的、位于上部的心臟腔室(心房) 的異常的心臟節(jié)律(心律不齊)。正常心臟中的心跳，在竇房結在心 房中產生的電通過心臟傳播、并引起心肌收縮和泵出血液之后開始。 在AF中，竇房結的有規(guī)律的電脈沖被混亂的、快速的電脈沖所代替， 導致了不規(guī)則的心跳。
心房纖顫是最常見心律不齊。發(fā)生心房纖顫的風險隨著年齡而增 加——AF在80歲時影響4%的個體。個體可以在AF和正常節(jié)律之間 自發(fā)輪換(突發(fā)性心房纖顫)，或者可能持續(xù)地以AF作為主要心臟節(jié) 律而不返回正常節(jié)律(慢性心房纖顫)。心房纖顫通常是無癥狀的， 但是可能導致心悸、昏厥、胸痛或甚至心力衰竭的癥狀。當心房纖顫 導致心率太快或太慢時，這些癥狀特別常見。此外，心房的不穩(wěn)定運 動導致血流淤積(停滯)，增加了從心臟向腦部和其它區(qū)域移動的血 液凝塊的風險。因此，AF是心房纖顫的最可怕的并發(fā)癥——中風的重 要風險因素。
心房纖顫的癥狀可以用減慢心率的藥物進行治療。幾種藥物以及 心臟電復律可用于將AF轉變?yōu)檎Ｐ呐K節(jié)律。外科和基于支架的療法
15也可用于在某些個體中預防心房纖顫?；加蠥F的人通常被給藥血液稀 釋劑例如華法林，以保護它們免于中風。
任何具有兩次或以上被鑒定的心房纖顫的突然的患者，被說成是 具有復發(fā)的心房纖顫。根據發(fā)病何時不經過治療就結束，而將它進一 步分類為突發(fā)性的和持久性的。當心房纖顫在7天內自發(fā)終止時，最 普遍在24小時內自發(fā)終止，它被說成是突發(fā)性的。持久性的或慢性的
心房纖顫是發(fā)病超過7天的AF。突發(fā)性與慢性或已確立的AF的區(qū)分 是基于AF的復發(fā)史和目前發(fā)作的時間長度(Levy S., / C^^/ovwc 8 Suppl, S78-82 (1998))。
孤立性心房纖顫(LAF)被定義為不存在心肺疾病的臨床或超聲 心動圖發(fā)現的情況下的心房纖顫。
心房纖顫通常伴有與心率快或栓塞有關的癥狀?？焖俚摹⒉灰?guī)則 的心率可能被感受為心悸、運動不耐，并有時產生呼吸短促的心絞痛 和充血癥狀或浮腫。有時，心律不齊伴隨著中風發(fā)作或短暫性缺血性 發(fā)作(TIA)而被鑒定。在常規(guī)的身體檢查或心電圖(ECG/EKG)上檢 測到心房纖顫是不常見的，因為在某些病例中它可能是無癥狀的。突 發(fā)性心房纖顫是短暫發(fā)生的心律不齊，因此難以診斷。突然發(fā)作可能 發(fā)生在睡眠或運動時，它們的突然發(fā)作的本質可能需要長時間的ECG 監(jiān)測(例如Holter監(jiān)測器)來進行診斷。
當懷疑心跳不規(guī)律時，可以在常用的診斷方法一一心電圖上診斷 心房纖顫。特征性的發(fā)現包括缺少P波，在其位置中的混亂的電活性， 以及由于脈沖向心室的不規(guī)則傳導導致的R-R間期的不規(guī)律性。如果 懷疑是突發(fā)性AF，可以使用Holter監(jiān)測來記錄突然發(fā)作(連續(xù)進行ECG 記錄24小時或以上)。
盡管許多AF病例沒有確定的原因，但它可能是各種其它問題的結果(參見下文)。因此，對腎功能和電解質，以及促甲狀腺激素和 血液計數進行了例行測定。通常也進行胸部X-射線檢査。在伴有胸痛 的急性發(fā)作的AF中，可以進行心臟肌鈣蛋白或其它損傷心肌的標記物
的檢測。通常還進行凝結研究(INR/aPTT)，因為可能進行抗凝結藥 物治療。經食道的超聲心動圖可以有助于鑒定任何心臟內血栓(Fuster V.,等，C7rcw/a"o".; 104, 2118-2150 (2001))。
心房撲動(AF1)的特征為心房中的異常快速心臟節(jié)律。出現心房 撲動的患者同樣也經歷心房纖顫，反之亦然(Waldo， A.， /Vogr CWY^owwc/^yeaw, 48:41-56 (2005))。因此，機械上或生物學上，AF 和AF1可能是高度相關的。
AF (和AF1)與幾種心臟原因相關，但是在可能發(fā)生在正常心臟 中。已知的關聯包括高血壓、二尖瓣狹窄(例如由風濕性心臟病或 二尖瓣脫垂引起)、二尖瓣回流、心臟外科手術、冠狀動脈病、肥厚 型心肌病、過量飲酒("狂飲"或"假期心臟")、甲狀腺機能亢進、 迷走神經過度刺激、通常由于過量進食("暴食")、肺病(例如肺 炎、肺癌、肺栓塞、肉狀瘤病)、心包炎、極度情感混亂和先天性心 臟病。
心臟的正常電傳導系統允許由心臟竇房結(SA結)產生的脈沖傳 播到并刺激心肌(心臟的肌肉)。當心肌受到刺激時，它收縮。正是 對心肌的有序刺激使得心臟有效地收縮，從而將血液泵到身體中。在 心房纖顫中，由竇房結產生的提供心臟有節(jié)律的收縮的規(guī)則的脈沖， 被心房組織的較大區(qū)域產生的快速的隨機產生的放電所淹沒。心房中 有組織的電脈沖產生心房收縮；缺少這樣的脈沖，正如在心房纖顫中 那樣，導致血流停滯、特別是在心房附屬部分中，并容易發(fā)生血液凝 結。從心房中中移出凝塊將引起栓塞，產生的損傷取決于血液循環(huán)將 它帶到何處。栓塞到達腦部產生心房纖顫的最可怕的并發(fā)癥一一中風， 而栓塞也可能駐留在腸系膜循環(huán)(為腹部器官供血的循環(huán))或指頭中，
17產生器官特異性損傷。
心房纖顫的治療針對兩個主要目標 防止暫時循環(huán)不穩(wěn)定；(ii) 防止中風。實現前者的最常用方法包括心率和節(jié)律控制，而抗血凝通
常是后者所需要的方法(Prystowsky E. N.， Jm /C^y//o/. ;85， 3D-11D (2000); van Walraven C,等，兒m仏288, 2441-2448 (2002))。心率控
制、即將心率降低到正常水平的常用方法，包括P阻斷劑(美托洛爾)、 強心苷(例如地高辛)和鈣通道阻斷劑(例如維拉帕米)。所有這些 藥物通過減緩脈搏從心房的產生以及從心房向心室的傳導來發(fā)揮作 用。其它常用的藥物包括奎尼丁、氟卡尼、普羅帕酮、丙吡胺 (disopyramide)、索他洛爾和胺碘酮。節(jié)律控制可以通過心臟電復律、 即通過施加DC電擊，或通過心臟化學復律，使用藥物例如胺碘酮、普 羅帕酮和氟卡尼來實現。
用于中風的預防性措施包括抗凝血劑。代表性的抗凝血藥劑的例 子是達肝素(例如法安明)、達那肝素(例如Orgaran)、依諾肝素(例 如Lovenox)、肝素(各種不同的)、Tinzaparin (例如Innohep)、華 法林(例如Coumadin)。某些患有孤立性心房纖顫的患者有時用阿司 匹林或氯吡格雷進行治療。有證據表明，阿司匹林和氯吡格雷當一起 使用時是有效的，但組合的效能仍然低于華法林(ConnollyS.等，Lancet.; 367,1903-1912 (2006)) (2)。新的抗凝劑希美加曲(ximelagatran)已經 被顯示與華法林具有同等的預防中風的效能，沒有與華法林相關的困 難的監(jiān)測過程，并可能具有較少的不利的出血現象。不幸的是， ximegalatran和其它類似的抗血凝藥物(通常被稱為凝血酶直接抑制劑) 還沒有被廣泛批準。
確定誰應該和不應該接受華法林的抗血凝治療，不是直截了當的。 CHADS2分值是用于確定中風風險(以及因此誰應該進行抗血凝治療) 的最好的被批準的方法。UKNICE準則代替了使用算法的選擇。存在 的問題是如果患者的年中風風險低于2%，那么與使用華法林有關的風險將超過患中風的風險(GageB.F.等，S^oAre 29， 1083-1091 (1998))。
心房纖顫有時可以通過治療來控制。但是，心房纖顫的自然趨勢 是變成慢性病癥。慢性AF導致增加的死亡風險?；加行姆坷w顫的患者 具有明顯增加的中風的機會。
心房纖顫常見于老年人。在發(fā)達國家，由于老年個體的比例不斷 增加，在下一個50年中，患有心房纖顫的患者的數量可能增加(Go A. S.等，J^ma., 285, 2370-2375 (2001)) (3)。在Framingham研究中，在 40歲及以上年齡的男性和女性中，在一生中發(fā)生AF的風險是四分之 一。在一生中AF的風險是高的(六分之一)。根據國家醫(yī)院出院調査
(1996年到2001年)關于包含AF作為主要出院診斷的病例的數據， 發(fā)現45%的患者是男性，男性的平均年齡為66.8歲，女性為74.6歲。 入院的種族分類被發(fā)現是71.2%的白人，5.6%的黑人，2%的其它種族， 以及20%未明。此外，非洲裔美國人患者的平均年齡比其它種族更年 青。在男性中的發(fā)病率范圍從年齡為15-44歲的患者的每年每十萬人中 20.58人，到85歲及以上年齡的患者的每年每十萬人中1203人。從 1996-2001年，以AF作為首要列明的診斷的住院治療人數，增加了34y。。
中風是常見的嚴重疾病。在美國，每年有超過600,000人遭受中 風，有超過160,000人死于與中風相關的原因(Sacco， R丄.等，Stroke 28, 1507-17 (1997))。此外，在美國，每年有超過300,000人出現暫時性 缺血性發(fā)作，這是一種溫和形式的中風。在西方國家，中風是嚴重喪 失勞動能力的主導原因，以及死亡的第三主導原因(Bonita, R.,i^"c^ 339,342-4 (1992))。超過40歲的人在生命期中中風的風險超過10%。
中風的臨床表現型是復雜的，但是可以寬泛地分成缺血性(占 80-卯％)和出血性中風(10-20%) (Caplan, L.R. Caplan 's Stroke: A Clinical Approach,《Caplan 中風臨床方法》，1-556 (Butterworth-Heinemann, 2000))。缺血性中風被進一步細分成大血管阻塞性疾病(在本文中稱為頸動脈中風)，它通常由于頸總動脈和頸 內動脈的動脈粥樣硬化引起，以及小血管阻塞性疾病，它被認為是腦 中的小的末端動脈的非動脈粥樣硬化狹窄，以及由通常在心房纖顫或 缺血性(動脈粥樣硬化)心臟病的背景下從心臟產生的血液凝塊造成
的心源性中風(Adams，H. P., Jr.等，Stroke 24, 35-41 (1993))。因此， 看來中風不是一種疾病，而是反映出不同病源性機制的疾病的異源組 (Alberts, MJ. Ge""/c51 o/ Cere6n9wwcw/ar Z)/^cwe《腦血管疾病的遺傳 學》，386 (Futura Publishing Company, Inc., New York, 1999); Hassan, A. & Markus， H. S. 5ra/" 123， 1784- 812 (2000))。但是，所有形式的中風 具有共同的風險因子，例如高血壓、糖尿病、高血脂和吸煙(Sacco, R丄. 等，S^oA:e 28, 1507-17 (1997); Leys, D.等，7Vewro/. 249, 507-17 (2002))。中風的家族史也是一個獨立的風險因子，表明存在可以與環(huán) 境因子相互作用的遺傳因子(Hassan, A. & Markus, H. S. 5ra/" 123, 1784-812 (2000); Brass, L.M. & Alberts, MJ. BflH/Zeres C7/". 7VeMro/. 4， 221-45 (1995))。
常見形式的中風的遺傳決定因素仍然大部分未知的。有特定基因 中的突變可以引起罕見的孟德爾形式的中風的例子，例如CADASIL(伴 皮質下梗塞和白質腦病的常染色體顯性遺傳性腦動脈病)中的A^&W 基因(Tournier-Lasserve， E.等，A^aA 3， 256-9 (1993); Joutel, A.
等，Mm^e 383， 707-10 (1996))、冰島型遺傳性伴淀粉樣病變的腦出血 中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C (Palsdottir， A.等，2, 603-4 (1988))、荷蘭型遺傳性腦出血中的APP (Levy, E.等，Sc/e"ce 248, 1124-6 (1990))和遺傳性海綿狀血管瘤患者中的/^/77基因(Gunel, M. 等，iVoc. Ato/. Jem/. 92, 6620-4 (1995); Sahoo, T.等，/fwm. Mo/,
Ge"". 8,2325-33 (1999))。這些罕見形式的中風中沒有一種發(fā)生在動 脈粥樣硬化的背景下，因此，相應的基因不可能在更通常伴隨動脈粥 樣硬化發(fā)生的常見形式的中風中發(fā)揮作用。
對于衛(wèi)生護理系統來說，非常重要的是開發(fā)預防中風的策略。一旦中風發(fā)生之后，在受中風影響的血管所供應的腦部的大部分區(qū)域中 將發(fā)生不可逆的細胞死亡。不幸的是，死亡的神經元不能夠復活或用 干細胞群體代替。因此，需要一開始就防止中風發(fā)生。盡管我們己經 知道了某些增加中風風險的風險因子(上面列出的)，但對于確定參 與中風的遺傳因子以便更精確地確定中風的風險，仍存在有尚未滿足 的醫(yī)學需求。此外，如果易感性等位基因在普通人群中是常見的，根 據它們的存在預測疾病的特異性低的話，則為了對疾病狀態(tài)的易感性 進行有意義的預測，還需要其它的位點、例如保護性位點。對用于預 防第一次中風或在以前發(fā)生過中風或暫時性缺血性發(fā)作的個體中預防 再次中風的治療性藥劑，也存在著極大的需求。
AF是中風的獨立的風險因子，使風險增加大約5倍?？蓺w因于
AF的中風風險隨年齡而增加。AF對所有中風中的大約15-20%負責。 AF也是中風復發(fā)和中風嚴重性的獨立風險因子。最近的報告顯示，患 有AF并且沒有用抗凝血劑治療的人，復發(fā)中風的風險增加了 2.1倍， 復發(fā)嚴重中風的風險增加了 2.4倍。已報道，患有由AF引起的中風的 人與患有其它原因引起的中風的人相比，臥床不起的可能性是2.23倍。
對于導致對AF和中風的增加的傾向性的易感性因子的理解，存 在著需求。AF的風險變體的鑒定，可用于例如評估哪個個體對于AF 和隨后的中風有特別高的風險。此外，可以對患有AF的個體或AF和 /或中風的風險易感性變體的攜帶者進行預防性治療。最后，AF和/或 中風的風險變體的鑒定，可以導致藥物療法的新的靶的鑒定，以及新 的治療性措施的開發(fā)。
發(fā)明簡述
本發(fā)明涉及發(fā)現了某些遺傳標記物顯示出與心律不齊、特別是心 房纖顫和心房撲動以及中風是相關聯的。該發(fā)現可用于本文描述的各 種方法、步驟、裝置、介質和試劑盒中，涉及了診斷和/或確定易感性 的方法和步驟、對相關變體進行基因分型的方法、預測對治療型藥劑的反應的方法、預測預后的方法、監(jiān)測治療的進展的方法、以及在這 些方法中使用的系統和試劑盒。
本發(fā)明的一個方面，涉及了在人類個體中確定對心律不齊或中風 的易感性的方法，方法包括在從個體獲得的核酸樣品中確定至少一個 多態(tài)性標記物的至少一個等位基因的存在或不存在，其中至少一個多 態(tài)性標記物選自表5中顯示的多態(tài)性標記物、以及與其連鎖不平衡的 標記物，其中至少一個等位基因的存在或不存在的確定，是個體中對 心律不齊或中風易感性的指示。在一個實施方案中，至少一個多態(tài)性
標記物位于LD區(qū)塊C04中，顯示在本文的SEQ ID NO: 50中。在另一 個實施方案中，至少一個多態(tài)性標記物選自表9中顯示的標記物，以 及與其連鎖不平衡的標記物。在一個實施方案中，至少一個標記物選 自標記物rs2220427 (SEQ ID NO: 1)和標記物rsl0033464 (SEQ ID NO:41)，以及與其連鎖不平衡的標記物。在另一個實施方案中，至少 一個多態(tài)性標記物選自表19中顯示的標記物。在一個實施方案中，方 法還包括在個體中評估含有至少兩個多態(tài)性標記物的至少一個單倍型 的步驟。
另一方面，本發(fā)明涉及在人類個體中確定對心律不齊或中風的易 感性的方法，包括確定在源自于個體的基因型數據組中是否存在至少 一個多態(tài)性標記物的至少一個風險等位基因，其中至少一個多態(tài)性標 記物選自表5中顯示的標記物，以及與其連鎖不平衡的標記物，其中 至少一個風險等位基因的存在的確定，表明了個體中對心律不齊或中 風的增加的易感性。
在一個實施方案中，基因型數據組包含關于標記物身份以及個體 的至少一個多態(tài)性標記物的等位基因狀態(tài)的信息，即關于個體攜帶的
標記物的兩個等位基因的身份的信息和/或關于個體是否是至少一個多 態(tài)性標記物的特定風險等位基因的攜帶者的信息?；蛐蛿祿M可以 包含關于一個或多個標記物、包括兩個或兩個以上標記物、三個或三個以上標記物、五個或五個以上標記物、 一百個或以上標記物等的等 位基因信息。在某些實施方案中，基因型數據組包含了來自個體的全 基因組評估的含有成百上千個標記物、或甚至一百萬個或以上標記物 的基因型信息。
另一方面，本發(fā)明涉及了一種方法，包括對來自人類個體的核酸
進行分析，以確定與具有SEQIDNO:50中顯示的序列的基因組序列相 關聯的至少一個多態(tài)性標記物的至少一個等位基因或單倍型的存在或 不存在的步驟；以及根據至少一個標記物或單倍型的存在或不存在， 來確定個體中心律不齊或中風的遺傳指標的狀態(tài)的步驟。因此，個體 的基因型和/或單倍型狀態(tài)被用作個體中心律不齊、包括心房纖顫和心 房撲動以及中風的指標。
本發(fā)明還涉及了在人類個體中評估對心律不齊或中風的易感性的 方法，包括在來自個體的核酸中篩選SEQ ID NO: 50中與心律不齊或中 風在人類群體中的增加的發(fā)病率相關的至少一個多態(tài)性標記物或單倍 型；其中核酸中至少一個多態(tài)性的風險標記物等位基因或風險單倍型 的存在的確定，將個體鑒定為對心律不齊和/或中風具有升高的易感性， 其中核酸中至少一個風險標記物等位基因或風險單倍型的不存在，將 個體鑒定為不具有升高的易感性。
在一個實施方案中，本發(fā)明的過程或方法需要含有SEQ ID NO: 50 中顯示的LD區(qū)塊C04的連續(xù)的核酸片段或其互補序列的至少一個多 態(tài)性標記物或單倍型，其中片段的大小小于500個核苷酸，并與LD區(qū) 塊C04的互補區(qū)段特異性雜交。在一個實施方案中，片段的大小大于 15個核苷酸而小于400個核苷酸，其中片段與SEQ ID NO:50中顯示的 LD區(qū)塊C04的互補區(qū)段特異性雜交。
在可選的實施方案中，多態(tài)性標記物或單倍型賦予的易感性是降 低的易感性，即本發(fā)明的標記物和單倍型賦予了個體發(fā)生心律不齊、包括心房纖顫和心房撲動以及中風的降低的風險。在一個這樣的實施
方案中，降低的易感性的特征為比值比(OR)或相對風險(RR)小于 0.8。在另一個實施方案中，降低的易感性的特征為比值比(OR)小于 0.7。在另一個實施方案中，降低的易感性的特征為OR或RR小于0.6。 在另一個實施方案中，降低的易感性的特征為OR或RR小于0.5。其 它的實施方案涉及其它的OR或RR值，包括值為0.9、 0.85、 0.75、 0.65、 0.55等。
本發(fā)明的另一方面涉及用于在人類個體中評估對與心律不齊和/ 或中風有關的癥狀的易感性的標記物的鑒定方法，方法包括鑒定SEQ ID NO: 50中的至少一個多態(tài)性標記物、或與SEQ ID NO: 50中的至少 一個標記物連鎖不平衡的至少一個多態(tài)性標記物，確定被診斷患有心 律不齊和/或中風的個體的樣品的基因型狀態(tài)和對照個體的樣品的基因 型狀態(tài)，其中在被診斷患有心律不齊和/或中風的個體中至少一個多態(tài) 性的至少一個等位基因的頻率，與對照樣品中至少一個等位基因的頻 率相比的顯著差異，表明了至少一個多態(tài)性可用于評估對心律不齊和/ 或中風的易感性。在一個實施方案中，在被診斷患有心律不齊和/或中 風的個體中至少一個多態(tài)性的至少一個等位基因的頻率，與對照樣品 中至少一個等位基因的頻率相比的增加，表明了至少一個多態(tài)性可用
于評估對心律不齊的增加的易感性。在另一個實施方案中，在被診斷 患有心律不齊和/或中風的個體中至少一個多態(tài)性的至少一個等位基因 的頻率，與對照樣品中至少一個等位基因的頻率相比的降低，表明了 至少一個多態(tài)性可用于評估對心律不齊和/或中風的降低的易感性、或 保護性。在優(yōu)選實施方案中，頻率的顯著差異是通過統計學測量值來 表征的。在一個實施方案中，統計學測量值是P-值。在具體的實施方 案中，顯著的P-值是小于0.05、小于O.Ol、小于0.001、小于0.0001、 小于0.00001、小于0.000001、小于0.0000001、或小于0.00000001。 在其它實施方案中，顯著的差異由具有特定置信區(qū)間(CE)值的比值 比(OR)或相對風險(RR)來表征。另一方面，本發(fā)明涉及對從人類個體獲得的核酸樣品進行基因分 型的方法，包括確定樣品中預測心律不齊和/或中風的增加的風險至少 一個多態(tài)性標記物的至少一個等位基因的存在或不存在，其中至少一 個標記物選自表5中顯示的標記物，以及與其連鎖不平衡的標記物， 其中至少一個多態(tài)性標記物的至少一個等位基因的存在或不存在的確 定，可以預測個體中心律不齊和/或中風的增加的風險。在一個實施方 案中，基因分型使用選自等位基因特異性探針雜交、等位基因特異性 引物延伸、等位基因特異性擴增、核酸測序、5'-外切核酸酶消化、分 子信標分析、寡核苷酸連接分析、大小分析以及單鏈構象分析的方法 來進行。在優(yōu)選的實施方案中，方法包括等位基因特異性探針雜交。 優(yōu)選情況下，基因分型的方法包括使用位于至少一個多態(tài)性標記物兩 側的核苷酸引物對，通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增含有至少一個多態(tài) 性標記物的核酸的區(qū)段。在基因分型的優(yōu)選方法中，進行了下面的步 驟
1. 將核酸的拷貝與檢測寡核苷酸探針和增強子寡核苷酸探針在 允許寡核苷酸探針與核酸特異性雜交的條件下相接觸；其中
a) 檢測寡核苷酸探針長度為5-100個核苷酸，并與含有至少一個多 態(tài)性位點、其核苷酸序列在SEQIDNO:50中給出的核酸的第一個區(qū)段 特異性雜交；
b) 檢測寡核苷酸探針在其3'末端含有可檢測標記，在其5'末端含 有淬滅基團；
c) 增強子寡核苷酸長度為5-100個核苷酸，并與相對于寡核苷酸探 針5'方向的核苷酸序列的第二個區(qū)段互補，以便當兩個寡核苷酸都與 核酸雜交時，增強子寡核苷酸位于檢測寡核苷酸探針的3'方向；以及
d) 在第一個區(qū)段和第二個區(qū)段之間存在單個堿基缺口，使得當寡 核苷酸探針和增強子寡核苷酸探針都與核酸雜交時，在寡核苷酸之間 存在單個堿基缺口-，
2. 使用當檢測探針與核酸雜交時將從檢測探針的3'末端裂解可 檢測標記以釋放游離的可檢測標記的內切核酸酶來處理核酸；以及
測量游離的可檢測標記，其中游離的可檢測標記的存在表明檢測
25探針與核酸的第一個區(qū)段特異性雜交，并表明多態(tài)性位點的序列與檢 測探針互補。
本發(fā)明的另一方面涉及在人類個體中確定對心律不齊或中風的易 感性的方法，方法包括在從個體獲得的核酸樣品中確定至少一個多態(tài) 性標記物的至少一個等位基因的身份，其中至少一個標記物選自與 PITX2基因相關聯的標記物，其中至少一個等位基因的存在表明了個 體中對心律不齊或中風的易感性。
本發(fā)明的某些實施方案涉及了另一個對心房纖顫、心房撲動或中 風的至少一個其它生物標記物進行評估的步驟，其中從標記物獲得的 遺傳信息的合并提供了對心房纖顫、心房撲動或中風的風險評估。在 某些這樣的實施方案中，生物標記物是遺傳標記物或單倍型，即顯示 出或被設想與心房纖顫、心房撲動或中風的增加的或降低的風險相關 的遺傳風險因子。在其它實施方案中，生物標記物是蛋白生物標記物。 在某些實施方案中，蛋白生物標記物選自纖維蛋白D-二聚體、凝血酶 原活化片段1.2 (F1.2)、凝血酶-抗凝血酶III復合物(TAT)、纖維 蛋白肽A (FPA)、脂蛋白相關的磷脂酶A2 (Ip-PLA2) 、 (3-血小板球 蛋白、血小板因子4、 P-選擇素、von Willebrand因子、利尿鈉肽前體 (BNP)、基質金屬蛋白酶-9 (MMP-9) 、 PARK7、 二磷酸核苷激酶 (NDKA) 、 tau、神經元特異性烯醇化酶、B型神經營養(yǎng)性生長因子、 星形神經膠質蛋白S-100b、神經膠質纖絲酸性蛋白、C-反應性蛋白、 血清淀粉樣肽A、基質金屬蛋白酶-9、血管和細胞內細胞粘附分子、腫 瘤壞死因子cc和白介素，包括白介素-1、 -6和-8。在一個實施方案中， 至少一個生物標記物包括祖細胞。在特定實施方案中，測定了一個以 上的生物標記物。在優(yōu)選實施方案中，生物標記物從個體的血漿中測 量。其它的實施方案還涉及了將非遺傳信息進行合并，在個體中進行 心房纖顫、心房撲動或中風的風險評估、診斷或預后。非遺傳信息可 以包括年齡、發(fā)病時的年齡、性別、種族、以前的疾病診斷例如心律 不齊(例如心房纖顫)和中風的診斷、個體的醫(yī)學史、疾病的家族史、
26生物化學測量和臨床測量(例如血壓、血清脂含量)。通過本技術領 域的專業(yè)人員已知的方法，這種來自各種不同的遺傳標記物、或遺傳 標記物加上非遺傳標記物的合并的信息的分析是可能的。在一個實施 方案中，通過邏輯回歸進行了分析以計算總風險。
本發(fā)明還涉及了在人類個體中診斷對中風的增加的易感性的方 法，包括下列步驟(a)確定個體是否經歷過與心房纖顫、心房撲動或 短暫性缺血性發(fā)作有關的癥狀；(b)確定來自個體的核酸樣品是否含有 選自表5中顯示的標記物以及與其連鎖不平衡的標記物中的至少一個 多態(tài)性標記物的風險等位基因的至少一個拷貝；其中與心房纖顫、心 房撲動和/或短暫性缺血性發(fā)作有關的癥狀的存在，以及風險等位基因 的至少一個拷貝的存在，表明了中風的增加的易感性。
另一方面，本發(fā)明涉及評估個體對預防和/或緩解與心律不齊和/ 或中風相關的癥狀的治療藥劑的反應的可能性的方法，包括在從個 體獲得的核酸樣品中確定至少一個多態(tài)性標記物的至少一個等位基因 的存在或不存在，其中至少一個多態(tài)性標記物選自表9中顯示的標記 物，以及與其連鎖不平衡的標記物，其中至少一個標記物的至少一個 等位基因的存在的確定，表明了對心律不齊和/或中風治療藥劑發(fā)生陽 性反應的可能性。
在一個實施方案中，治療藥劑是抗凝血劑、抗心律失常藥劑、心 率控制藥劑、心臟復律藥劑或心臟節(jié)律控制藥劑。在另一個實施方案 中，治療藥劑選自華法林、肝素、低分子量肝素、因子Xa抑制劑和凝 血酶抑制劑、鈉通道阻斷劑、(3阻斷劑、鉀通道阻斷劑和鈣通道阻斷劑。
在另一個實施方案中，治療藥劑選自華法林、ximelagatran、肝素、 依諾肝素、達肝素、亭扎肝素、阿地肝素、那屈肝素、瑞維肝素、磺 達肝素、艾卓肝素、來匹盧定、比伐盧定、阿加曲班、達那類肝素、 丙吡胺、莫雷西嗪、普魯卡因胺、奎尼丁、利多卡因、美西律、妥卡胺、苯妥英、恩卡尼、氟卡胺、普羅帕酮、阿馬林、西苯唑啉、地他 義銨、艾司洛爾、普萘洛爾、美托洛爾、烯丙洛爾、阿替洛爾、卡維
地洛、比索洛爾、醋丁洛爾、納多洛爾、吲哚洛爾、拉貝洛爾、oxprenotol、
噴布洛爾、噻嗎洛爾、倍他洛爾、卡替洛爾、索他洛爾、左旋布諾洛 爾、胺碘酮、阿齊利特、溴芐銨、多非利特、替地沙米、伊布利特、
司美利特、N-乙酰普魯卡因胺、鹽酸尼非卡蘭、維納卡蘭(vernakalant)、 氨巴利特、維拉帕米、米貝拉地爾、地爾硫卓、地高辛、腺苷酸、伊 布利特、胺碘酮、普魯卡因胺、丙胺苯丙酮和氟卡胺。
本發(fā)明的另一方面涉及對被診斷有心律不齊和/或中風的個體的 預后進行預測的方法，方法包括在從個體獲得的核酸樣品中確定至少 一個多態(tài)性標記物的至少一個等位基因的存在或不存在，其中至少一 個多態(tài)性標記物選自表9中顯示的標記物，以及與其連鎖不平衡的標 記物，其中至少一個等位基因的存在的確定，表明了個體中心律不齊 和/或中風的更糟的預后。
監(jiān)測經歷了心律不齊和/或中風治療的個體的治療進展的方法也 在本發(fā)明的范圍之內，該方法包括在從個體獲得的核酸樣品中確定至 少一個多態(tài)性標記物的至少一個等位基因的存在或不存在，其中至少 一個多態(tài)性標記物選自表9中顯示的標記物，以及與其連鎖不平衡的 標記物，其中至少一個等位基因的存在的確定，表明了個體的治療結 果。
在本發(fā)明的具體實施方案中，例如在本發(fā)明的各種不同方法、應 用、步驟、裝置和試劑盒中，心律不齊的表現型的進一步特征為心房 纖顫或心房撲動。本發(fā)明人已經確定，本文描述的AF風險變體所賦予 的風險，對于發(fā)病年齡早的個體來說比發(fā)病年齡晚的個體更大。因此， 在一個實施方案中，心房纖顫或心房撲動的進一步特征為在個體中的 發(fā)病年齡小于80歲。在另一個實施方案中，心房纖顫或心房撲動的進 一步特征為在個體中的發(fā)病年齡小于70歲。在另一個實施方案中，心房纖顫或心房撲動的進一步特征為在個體中的發(fā)病年齡小于60歲。在 本發(fā)明的可選實施方案中，其它的年齡截止值也是可能的，并也被考
慮到了，包括但不限于年齡截止值小于75歲、小于65歲、小于55歲。 此外，在發(fā)病或診斷時的年齡大于55、 60、 65、 70、 75或80歲也被 考慮到了，并包含在本發(fā)明的范圍內，因此癥狀的診斷或疾病發(fā)作時 的年齡范圍包括但不限于50-80歲、55-75歲、60-80歲、65-75歲，等等。
在本發(fā)明的某些實施方案中，中風被進一步表征為缺血性中風。 在其他實施方案中，中風表現型的特征可以是一種或多種缺血性中風 亞表型大動脈粥樣硬化(LAA)、心源性卒中(CES)和小血管疾病 (SVD)。
在本發(fā)明的具體實施方案中，連鎖不平衡(LD)由特定的定量截 止值確定。正如在本文中詳細描述的，連鎖不平衡可以由測量值例如 一和ID'I來定義。因此，本發(fā)明的某些實施方案涉及由特定的^和/或ID'l 值所指明的某個范圍內的測量值所定義的連鎖不平衡的標記物。在一 個這樣的實施方案中，LD的特征為 一的數值大于0.1。在另一個實施 方案中，LD的特征為—的數值大于0.1。在另一個實施方案中，LD的 特征為 一的數值大于0.5。在另一個實施方案中，LD的特征為一的數 值大于0.8。 ^的其它截止值也被考慮到了，正如在本文中更詳細描述 的。在某些實施方案中，LD用 一和/或ID'l的某些截止值來表征。在一 個這樣的實施方案中，LD的特征為一和/或ID'I分別大于0.2和0.8。這 些或其它LD的度量值的其它組合和排列對于實施本發(fā)明來說也是可 能的，并且也被考慮到了，并包含在本發(fā)明的范圍內。
在某些實施方案中，本發(fā)明的過程、應用或方法還包括給被確定 具有發(fā)生心律不齊或中風的增加的風險的個體，施用含有至少一種有 效治療或預防心律不齊或中風、或預防與心律不齊或中風有關的癥狀 的治療性藥劑的組合物。因此，本發(fā)明可用于確定個體是否適合于特定的治療模式。
在本文描述的各種不同方法和過程中使用的試劑盒也包含在本發(fā) 明的范圍內。因此， 一種情況下，本發(fā)明涉及在人類個體中評估對心 律不齊和/或中風的易感性的試劑盒，試劑盒包含用于在個體的基因組 中選擇性檢測至少一個多態(tài)性標記物的至少一個等位基因的試劑，其
中多態(tài)性標記物選自其序列顯示在SEQ ID NO:50中的區(qū)段中的多態(tài)性 標記物，以及與其連鎖不平衡的標記物，其中至少一個等位基因的存 在表明了對心律不齊和/或中風的易感性。
在一個實施方案中，至少一個多態(tài)性標記物選自表5中顯示的標 記物。在另一個實施方案中，至少一個多態(tài)性標記物選自表9中顯示 的標記物，以及與其連鎖不平衡的標記物。在另一個實施方案中，至 少一個多態(tài)性標記物選自標記物rs2220427 ( SEQ ID NO: 1)和 rsl0033464 (SEQIDNO:41)，以及與其連鎖不平衡的標記物。在一個 優(yōu)選實施方案中，至少一個多態(tài)性標記物選自表19中顯示的標記物。 在另一個優(yōu)選實施方案中，至少一個多態(tài)性標記物選自D4S406 (SEQ ID NO:45) 、 rs263術3 (SEQ ID NO:33 ) 、 rs2200733 (SEQ ID NO:28)、 rs2220427 (SEQIDNO: 1 ) 、 rsl0033464( SEQ ID NO:41 )和rsl3143308 (SEQIDNO:51)。在一個實施方案中，試劑含有至少一個與個體的 基因組的含有至少一個多態(tài)性標記物的區(qū)段雜交的連續(xù)的寡核苷酸、 緩沖液和可檢測標記。
在另一個實施方案中，試劑含有至少一對與從對象獲得的基因組 核酸區(qū)段的反向鏈雜交的寡核苷酸，其中每個寡核苷酸引物對被設計 成能選擇性擴增個體的基因組中包含一個多態(tài)性標記物的片段，其中 片段的大小為至少30個堿基對。在優(yōu)選實施方案中，至少一個寡核苷 酸與個體的基因組完全互補。在一個實施方案中，寡核苷酸的長度為 大約18到大約50個核苷酸。在另一個實施方案中，寡核苷酸的長度 為20-30個核苷酸。在一個優(yōu)選實施方案中，試劑盒含有a. 長度為5-100個核苷酸的檢測寡核苷酸探針；
b. 長度為5-100個核苷酸的增強子寡核苷酸探針；以及 C.內切核酸酶；
其中檢測寡核苷酸探針與其核苷酸序列在SEQ ID NO: 2中給出核 酸的含有至少一個多態(tài)性位點的第一個區(qū)段特異性雜交；其中檢測寡 核苷酸探針在其3'末端含有可檢測標記，在其5'末端含有淬滅基團； 其中增強子寡核苷酸長度為5-100個核苷酸，并與相對于寡核苷酸探針 5'方向的核苷酸序列的第二個區(qū)段互補，以便當兩個寡核苷酸都與核酸 雜交時，增強子寡核苷酸位于檢測寡核苷酸探針的3'方向；其中在第 一個區(qū)段和第二個區(qū)段之間存在單個堿基缺口，使得當寡核苷酸探針 和增強子寡核苷酸探針都與核酸雜交時，在寡核苷酸之間存在單個堿 基缺口；并且其中當檢測探針與核酸雜交時，使用內切核酸酶處理核 酸將從檢測探針的3'末端裂解可檢測標記，以釋放游離的可檢測標記。
本文描述的用于預測心律不齊(例如AF和心房撲動)和中風的 風險的多態(tài)性標記物可用作診斷標記物。因此， 一種情況下，本發(fā)明 涉及寡核苷酸探針在制造用于在人類個體中診斷和/或評估心律不齊和 /或中風的易感性的診斷試劑中的應用，其中探針與其核苷酸序列在 SEQIDNO:50中給出核酸的含有至少一個多態(tài)性位點的區(qū)段雜交，其 中片段的長度為15-500個核苷酸。
在一個這樣的實施方案中，多態(tài)性位點選自表5中顯示的多態(tài)性 標記物，以及與其連鎖不平衡的多態(tài)性。在另一個實施方案中，至少 一個多態(tài)性標記物選自D4S406 (SEQIDNO:45) 、 rs2634073 (SEQ ID NO:33) 、 rs2200733 (SEQIDNO:28) 、 rs2220427 (SEQIDNO: 1)、 rsl0033464 (SEQIDNO:41)和rsl3143308 (SEQIDNO:51)。
用于儲存關于本文描述的疾病相關的標記物的信息的計算機可讀 介質，也在本發(fā)明的范圍內。在一個這樣的情況下，本發(fā)明涉及計算 機可讀介質，其上儲存有至少一個多態(tài)性標記物的識別符；該至少一個多態(tài)性標記物的至少一個等位基因在多個被診斷患有心房纖顫、心 房撲動和/或中風的個體中的頻率的指示符；以及該至少一個多態(tài)性標 記物的至少一個等位基因在多個參比個體中的頻率的指示符；其中至
少一個多態(tài)性標記物選自表5中顯示的多態(tài)性標記物，以及與其連鎖
不平衡的多態(tài)性。在優(yōu)選實施方案中，至少一個多態(tài)性標記物選自
D4S406 (SEQIDNO:45) 、 rs2634073 (SEQIDNO:33) 、 rs2200733 (SEQIDNO:28) 、 rs2220427 (SEQIDNO: 1) 、 rsl0033464 (SEQ ID NO:41)和rsl3143308 (SEQIDNO:51)。
本發(fā)明還涉及了用于在人類個體中測定心律不齊和/或中風的遺
傳指示符的裝置，包含計算機可讀存儲器以及儲存在計算機可讀
存儲器中的例行程序；其中例行程序適用于在處理器上執(zhí)行，以分析
至少一個人類個體的至少一個多態(tài)性標記物的基因型和/或單倍型數
據，其中該至少一個多態(tài)性標記物選自表5中顯示的標記物，以及與
其連鎖不平衡的標記物，并根據標記物或單倍型數據產生輸出，其中
輸出包括作為人類個體的心律不齊和/或中風的遺傳指示符的至少一個
標記物或單倍型的風險測量。在優(yōu)選實施方案中，例行程序還包含測
定多個被診斷患有心律不齊和/或中風的個體中至少一個多態(tài)性標記物 的至少一個等位基因或至少一個單倍型的頻率的指示符，以及多個參
比個體中至少一個多態(tài)性標記物的至少一個等位基因或至少一個單倍 型的頻率的指示符，并在其基礎上計算至少一個等位基因和/或單倍型 的風險測量值；其中個體的風險測量值的計算，是基于個體的至少一 個標記物和/或單倍型狀態(tài)，與多個被診斷患有心房纖顫、心房撲動和/ 或中風的個體的至少一個標記物和/或單倍型信息的計算的風險的比 較。在某些實施方案中，風險測量值被表示為比值比(OR)或相對風 險(RR)，正如在本文中更詳細描述的。
本文描述的在本發(fā)明中發(fā)現的用于預測心律不齊和中風的多態(tài)性 標記物、以及與其連鎖不平衡的標記物，都可用于實施本發(fā)明的各種 不同情況。因此，盡管本發(fā)明人使用了特定的多態(tài)性標記物來檢測4
32號染色體上的特定區(qū)域與心律不齊(例如心房纖顫和心房撲動)和中 風的關聯性，但評估與那些標記物強烈連鎖不平衡的標記物也是同樣 有用的。因此，在本發(fā)明的方法、應用、試劑盒、步驟、裝置和介質 的一個實施方案中，用于本發(fā)明的方法或步驟的至少一個多態(tài)性標記
物或單倍型，包含了在表5 (例如表5A和5B)中顯示的至少一個標記
物，以及與其連鎖不平衡的標記物。在另一個實施方案中，至少一個
多態(tài)性標記物或單倍型包括表9中顯示的至少一個標記物，以及與其
連鎖不平衡的標記物。在一個實施方案中，至少一個多態(tài)性標記物或
單倍型包含表5中顯示的至少一個標記物。在另一個實施方案中，至 少一個多態(tài)性標記物或單倍型包含表9中顯示的至少一個標記物。在 另一個實施方案中，至少一個多態(tài)性標記物選自表4中顯示的標記物。 在一個實施方案中，至少一個標記物選自標記物rs2220427 (SEQ ID NO:l)和標記物rsl0033464 (SEQIDNO:41)，以及與其連鎖不平衡 的標記物。在另一個實施方案中，至少一個多態(tài)性標記物選自表19中 顯示的標記物。
在一個實施方案中，至少一個標記物或單倍型，包含至少一個標 記物D4S406 (SEQ ID IMO:45) 、 rs2723296 (SEQ ID NO:35)、 rsl6997168 (SEQ IDNO:36) 、 rs2723316 (SEQ ID NO:37) 、 rs6419178
(SEQIDNO:38) 、 rsl448817 (SEQIDNO:39) 、 rs263術3 (SEQID NO:33) 、 rs2200733 (SEQIDNO:28) 、 rs2220427 (SEQIDNO:l)、 rsl3105878(SEQ ID NO: 40) 、 rsl0033464(SEQ ID NO:41) 、 rsl3141190
(SEQIDNO:42) 、 rs3853444 (SEQIDNO:43)和rs4576077 (SEQID NO:44)。在另一個實施方案中，至少一個標記物或單倍型包含至少一 個標記物D4S406 (SEQIDNO:45) 、 rs2634073 (SEQIDNO:33)、 rs2200733 (SEQIDNO:28) 、 rs2220427 (SEQIDNO: 1) 、 rsl0033464
(SEQIDNO:41)和rsl3143308 (SEQIDNO:51)。在另一個實施方 案中，至少一個標記物選自rsl0033464、 rs2200733、 rsl3143308和 rs2220427，以及與其連鎖不平衡的標記物。在另一個實施方案中，標記物D4S406的等位基因-2、 -4和/或-8、 標記物rs2723296的等位基因G、標記物rsl6997168的等位基因T、標 記物rs2723316的等位基因T、標記物rs6419178的等位基因A、標記 物rsl 1448817的等位基因G、標記物rs2634073的等位基因A、標記物 rs2200733的等位基因T、標記物rs2220427的等位基因T、標記物 rsl3105878的等位基因C、標記物rsl0033464的等位基因T、標記物 rsl3141190的等位基因A、標記物rs3853444的等位基因A、和/或標記 物rs4576077的等位基因T的存在，表明了個體中心律不齊或中風的增 加的易感性。
在本發(fā)明的特定的實施方案中，風險變體(即多態(tài)性標記物(例 如SNP)的特定等位基因或特定單倍型)所賦予的易感性是增加的易 感性，即本發(fā)明的標記物和單倍型賦予了個體發(fā)生心律不齊、包括心 房纖顫和心房撲動、以及中風的增加的風險。易感性典型情況下通過 度量比值比(OR)、或可選地通過相對風險(RR)來表征。在一個實 施方案中，增加的易感性的特征為比值比(OR)為至少1.3。在另一個 實施方案中，增加的易感性的特征為比值比(OR)為至少1.4。在另一 個實施方案中，增加的易感性的特征為比值比(OR)為至少1.5。在另 一個實施方案中，增加的易感性的特征為比值比(OR)或相對風險(RR) 為至少1.6。在另一個實施方案中，增加的易感性的特征為比值比(OR) 或相對風險(RR)為至少1.8。其它的實施方案涉及了其它的OR值或 相當的RR值，包括值1.25、 1.35、 1.45、 1.55等。
本發(fā)明的某些實施方案涉及了特定的種族或血統。在一個這樣的 實施方案中，人類個體具有選自非洲黑人種族、亞洲種族、高加索人 種族、西班牙人種族和阿拉伯人種族的血統。在特定實施方案中，種 族是自己報告的。在其它實施方案中，血統通過特定的種族特異性遺 傳標記物的評估來確定。
附圖簡述
34從下面對本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的更具體的描述，本發(fā)明的上述 以及其它的目標、特點和優(yōu)點將變得明顯。


圖1顯示了對CEPH群體(HapMap數據)在含有本發(fā)明的變體 的區(qū)域中的連鎖不平衡(LD)作圖。LD區(qū)塊C04 (NCBIBuild35中 4號染色體上111,954,811-112,104,250的位置)在圖上用黑框顯示。圖 中顯示了 LD的兩種度量，即位于圖1的左上部分的D'和圖的右下部 分的r2。
圖2顯示了在LD區(qū)塊中相關區(qū)域的單倍型結構的示意圖。深色 (左邊)圓圈的面積與冰島組中單倍型的單倍型頻率成比例，淺色(右 邊)圓圈的面積與香港組中的單倍型頻率成比例。顯示在圖的中間的 居中的單倍型，不再能夠確定存在于兩個群體中的任何一個中(其估 算的頻率低于0.2%，不能與基因分型誤差區(qū)分開)。
圖3是rs2200733和rs 10033464鄰近的200kb的基因組區(qū)域的概 況。它包含了預測的ESTs，在CEUHapMap樣品中三種主要類型的等 價的SNPs的位置，以及在各種不同種族的HapMap樣品中區(qū)域的LD 結構的概況。
圖4顯示了 PITX2在人類心臟和主動脈中表達的Northern印跡分 析。PITX2 cDNA克隆HU3_p983E0327D被用作探針，分別檢測了左 心房和主動脈中的1.8、 2禾B 3 kb的轉錄本以及2.2和3 kb的PITX2轉
錄本。第l道胎心，第2道整個心臟，第3道主動脈，第4道 心尖，第5道左心房，第6道右心房，第7道左心室，第8道
右心室。印跡使用PITX2 cDNA克隆(HU3_p983E0327D)探測。
發(fā)明詳述
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的描述如下。
定l
在本發(fā)明的文本中，下面的術語將具有所指示的意義
本文描述的心房纖顫(AF)是指按照已建立的醫(yī)學標準所通常定義的AF。 AF按ICD-10分類在類別148中，按ICD-9分類在類別427.3 中。
本文描述的心房撲動(AF1)是指按照已建立的醫(yī)學標準所通常定 義的AF1。AF1按ICD-10分類在類別148中，按ICD-9分類在類別427.3 中。
本文描述的"多態(tài)性標記物"、有時被稱為"標記物"，是指基 因組多態(tài)性位點。每種多態(tài)性標記物具有至少兩個序列變體，其特征 為多態(tài)性位點上的特定等位基因。因此，與多態(tài)性標記物的遺傳關聯 表明存在與該具體多態(tài)性標記物的至少一個特定等位基因的關聯。標 記物可以含有在基因組中發(fā)現的任何變體類型的任何等位基因，包括 SNPs、微衛(wèi)星、插入、缺失、重復和易位。
"等位基因"是指染色體上給定位點(位置)的核苷酸序列。因 此，多態(tài)性標記物等位基因是指染色體上標記物的組成(即序列)。 來自個體的基因組DNA對于任何給定的多態(tài)性標記物來說含有兩個等 位基因，代表了每條染色體上標記物的每個拷貝。
在本文中，在群體中(自然群體或合成的群體，例如合成分子的 文庫)其上可能存在一種以上序列的核苷酸位置被稱為"多態(tài)性位點"。
"單核苷酸多態(tài)性"或"SNP"是當基因組中特定位置上的單個 核苷酸在物種的成員之間或一個個體中成對的染色體之間不同時發(fā)生 的DNA序列變異。大多數SNP多態(tài)性具有兩個等位基因。在這種情 況下，每個個體或者是多態(tài)性的一個等位基因的純合子(即個體的兩 個染色體拷貝在SNP位置處具有同樣的核苷酸)，或者個體是雜合子 (即個體的兩條姊妹染色體含有不同的核苷酸)。在本文中報告的SNP
的命名是指官方的參考SNP (rs) ID身份標簽，是由國家生物技術信息 中心(National Center for Biotechnological Information) (NCBI)為每個獨特的SNP指定的。
本文描述的"變體"是指與參比DNA不同的DNA區(qū)段。"標記 物"或"多態(tài)性標記物"按照本文的定義，是變體。與參比不同的等 位基因被稱為"變體"等位基因。
"微衛(wèi)星"是在特定位點具有多個小的長度為2-8個核苷酸的堿 基重復(例如CA重復)的多態(tài)性標記物，其中重復長度的數量在總群 體中是變化的。"indel"是常見的多態(tài)性形式，含有一般只有幾個核 苷酸長的小的插入或缺失。
本文描述的"單倍型"是指基因組DNA的一個區(qū)段，其特征為沿 著該區(qū)段排列有等位基因的特定組合。對于二倍體生物例如人類來說， 單倍型含有每個多態(tài)性標記物或位點的等位基因對的一個成員。在某 些實施方案中，單倍型可以含有兩個或兩個以上等位基因、三個或三 個以上等位基因、四個或四個以上等位基因、或五個或五個以上等位 基因。
本文描述的術語"易感性"包含了增加的易感性和降低的易感性。 因此，本發(fā)明的特定多態(tài)性標記物和/或單倍型的特征可以是心房纖顫 或中風的增加的易感性(即增加的風險)，被表征為相對風險(RR) 或比值比(OR)大于1。或者，本發(fā)明的標記物和/或單倍型的特征可 以是心房纖顫或中風的降低的易感性(即降低的風險)，被表征為相 對風險小于1。
"核酸樣品"是從個體獲得的含有核酸的樣品。在某些實施方案、 即特定多態(tài)性標記物和/或單倍型的檢測，核酸樣品包含基因組DNA。 這樣的核酸樣品可以從任何含有基因組DNA的來源獲得，包括例如血 液樣品、羊水樣品、腦脊液樣品，或來自皮膚、肌肉、口腔或結膜粘 膜、胎盤、胃腸道或其它器官的組織樣品。術語"心房纖顫和/或中風治療藥劑"是指可用于緩解或預防與心 房纖顫(AF)、心房撲動(AF1)或中風相關的癥狀的藥劑，在本文中 有更詳細的描述。
本文中描述的術語"與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/
或中風相關的核酸"是指己經被發(fā)現與心律不齊、例如心房纖顫(AF)、 心房撲動(AF1)或中風相關的核酸。這包括但不限于本文描述的標記 物和單倍型，以及與其強烈連鎖不平衡(LD)的標記物和單倍型。在 一個實施方案中，與心房纖顫、心房撲動或中風相關的核酸是指被發(fā) 現與心房纖顫和中風有關的LD區(qū)塊C04。在另一個實施方案中，與心 房纖顫、心房撲動或中風相關的核酸是指PITX2基因。
本文描述的術語"LD區(qū)塊C04"是指4號染色體上位于NCBI(國 立生物技術信息中心)Build 35中的111,954,811-112,104,250的位置之 間的連鎖不平衡(LD)區(qū)塊，其基因組序列顯示在SEQIDNO:50中。
本文描述的"片段"是指核酸或蛋白序列的區(qū)段。片段的大小小
于它們的參比點，即大小為iooo個核苷酸的參比核酸分子的片段的大
小小于1000個核苷酸。本發(fā)明的核酸片段通常大小超過5個核苷酸， 典型情況下大小超過15個核苷酸，其上限由它們的參比核苷酸或核苷 酸片段的實際用途來決定。例如，在本發(fā)明的某些實施方案中，用作 雜交探針的核苷酸片段的大小大于15個核苷酸并小于大約500個核苷 酸。其它的大小范圍適用于本發(fā)明的其它核苷酸片段和蛋白或肽片段。
本文描述的術語"PITX2"是指染色體4q25上的成對同源異型結 構域蛋白轉錄因子2基因。該基因也被稱為腦垂體同源異形盒2 (PTX2) 、 rieg bicoid相關的同源異形盒轉錄因子1 (RIEG1) 、 solurshin 和all-l反應性基因1 (ARP1)。本發(fā)明涉及觀察到人類基因組的染色體4q25上的某些多態(tài)性標記
物，被發(fā)現與心律不齊和中風有關聯。在本發(fā)明的特定實施方案中，
染色體4q25上的多態(tài)性標記物與心律不齊性心房纖顫(AF)和心房撲 動(AF1)和中風相關。正如在本文中進一步詳細描述的，這些觀察與 診斷和治療方法、應用、試劑盒和系統有著重要的、意想不到的牽連。
在賦予對AF的易感性的遺傳變體的全基因組掃描中，在染色體 4q25上發(fā)現了幾個與AF相關的標記物。對于標記物rs2220427和 rs2220733發(fā)現了與AF的最顯著的關聯性，二者都給出了接近10力的 p-值(表2)，以及雖然較小但明顯顯著的與中風的關聯性(表3)。 大量的標記物作為這些標記物的完美的替代物被鑒定到，包括微衛(wèi)星 標記物D4S406 (表l)和許多SNP標記物(表4)。
對結果的進一步精煉，發(fā)現關聯性信號出現在標記物rs2200733 和rsl0033464 (表7)、以及與那些標記物連鎖不平衡的標記物(包括 但不限于表9中列出的SNP標記物)的、用遺傳學術語來說的中心。
最初在冰島人群體中進行的觀察在獨立的冰島人AF/AF1組、瑞典 人AF組和美國AF組中進行了重復(表7)。當將冰島人樣品合并時， 與rs2200733的關聯性是明確的(OR = 1.72，尸=3.3 x 10—41)，與 rsl0033464的關聯性也大大超過了基因組范圍上顯著性的閾值(OR = 1.39， P-6.9xl(T11)。假設乘法模型，兩個變體合并的群體歸因風險 (PAR)在歐洲人血統的群體中是大約20%。此外，關聯性也在來自 香港的中國人AF組中進行了重復(表7)。
本發(fā)明人還發(fā)現，對于冰島人樣品來說，AF/AF1的診斷年齡與兩 個SNPs rs2200733和rsl0033464相關。因此，對于每個rs2200733等 位基因T來說診斷的發(fā)生早2.28年，對于每個rsl0033464等位基因T 來說診斷發(fā)生早1.10年(組合的P-1.29x 1(T6)。這種效應由在診斷 年齡較小的個體中兩個變體的關聯性最強所表明，盡管即使在診斷年齡超過80歲的個體中風險仍然是顯著的(表8)。在美國組中觀察到 了類似的發(fā)病年齡的效應(表8)。
發(fā)明人還觀察到了變體與AF1之間的強烈關聯性，它們看起來比 與AF的關聯性更強。與被診斷患有AF1的冰島患者的亞組(N=116) 的關聯性顯示了這一點(對于rs2200733來說OR^2.60， 95%置信區(qū)間 (CI) =1.83-3.68，尸-7.5xl(T8，對于rsl0033464來說OR = 1.94， 95% CI=1.26-3.00，尸=麓8)。事實上，對于rs2200733來說，這些確定的 AF1病例的OR顯著高于具有AF表型的病例的OR (P = 0.0026),對 于rsl0033464來說，接近于明顯高(P = .084)。與SNPs rs2200733 和rsl0033464的關聯性說明了這些AF和AF1都具有顯著遺傳風險因 子的結果。
本發(fā)明人還進一步確定了與AF/AF1相關的變體也與中風、特別是 缺血性中風相關(表21)。標記物rs2200733在缺血性中風和缺血性 中風(IS)心源性中風亞表型(CES)中得到了顯著的重復。在對其它 的冰島IS病例和對照(總共1,943個病例/25，708個對照)以及4個大 的IS病例/對照重復組(4,294個病例/3，709個對照)進行基因分型之 后，發(fā)現該標記物和標記物rsl0033464與AF是主要病因的CES關聯 性最強(rs2200733: OR= 1.53， P=1.5x 10-12; rsl0033464: OR=1.27， =5.9xl0-4)(表21)。
在含有rs2200733和rsl0033464的LD區(qū)塊中不存在已知的基因 (圖3)。該LD區(qū)塊含有一個剪接EST (DA725631)和兩個單外顯 子ESTs (DB324364和AF017091)。來自各種組織的cDNA文庫的 RT-PCR沒有檢測到這些ESTs的表達(表16)。位于鄰近上游LD區(qū) 塊中的尸/7X2基因是與風險變體最接近的基因。含有尸/7X2基因的LD 區(qū)塊中的幾個標記物與表18中顯示的對AF和Afl顯示出關聯性的標 記物相關。因此，可能P/7X2基因中的變體是潛在的病因變體?？蛇x 地，有可能本文描述的本發(fā)明的變體影響了 PITX2的功能、穩(wěn)定性、表達、翻譯后修飾、剪接、信使穩(wěn)定性，或通過其它的方式影響了基 因，導致了對與心房纖顫、心房撲動和/或中風相關的病癥的傾向性。 該基因編碼的蛋白、成對同源異型結構域轉錄因子2，是AF/AF1的目
的候選物，因為已知它通過指導心臟的不對稱形態(tài)發(fā)生在心臟發(fā)育中
發(fā)揮重要作用(Franco, D" 7>e"& CaWo而c MW 13: 157-63 (2003))。 此外，在小鼠中，敲除模型Pitx2已經被顯示抑制了左心房中竇房結形 成的缺省途徑。在所有容易進入的組織例如血液和脂肪組織中，尸/7X2 的mRNA表達非常低，妨礙了對基因型和表達水平之間的關聯性的研 究。/V7X2上游的下一個基因是^W^尸，是負責在血管內皮中分解血 管緊張肽II的氨肽酶。該基因的表達更加廣泛，但是與AF相關的變體 顯示出與其在血液和脂肪組織中的表達沒有相關性。沒有其它已注解 的基因位于有關聯的變體的上游400kb區(qū)域和下游1.5Mb區(qū)域中。
標記激浙卓倍遭伊仿
當在個體間進行比較時，群體中的基因組序列是不相同的。相反， 個體間在基因組中的許多位置上表現出了基因組序列變異性。這種序 列的變化通常被稱為多態(tài)性，在每個基因組中有許多這樣的位點。例 如，人類基因組表現出在平均每500個堿基對就發(fā)生序列變異。最常 見的序列體包括基因組中單一堿基位置的堿基變化，這種序列變體或 多態(tài)性，通常被稱為單核苷酸多態(tài)性("SNPs")。這些SNPs據信是 在單個突變事件中發(fā)生的，因此通?？赡茉诿總€SNP位點存在兩個可 能的等位基因；原始的等位基因和突變的等位基因。由于自然遺傳漂 移并可能也由于選擇壓力，最初的突變產生了多態(tài)性，其特征為在任 何給定的群體中其等位基因的特定頻率。在人類基因組中發(fā)現了許多 其它類型的序列變異，包括微衛(wèi)星、插入、缺失、倒置和拷貝數變化。 多態(tài)性微衛(wèi)星在特定位點含有多個小的堿基重復(例如CA重復，互補 鏈上的TG重復)，重復的長度的數量在總群體中是變化的。概括地說， 多態(tài)性位點的每個版本的序列都代表了多態(tài)性位點的特定等位基因。 這些序列變體都可以被稱為多態(tài)性，它們發(fā)生在特定多態(tài)性位點，表
明了所述序列變體的特征。概括地說，多態(tài)性可以包含任何數量的特定等位基因。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，多態(tài)性的特征為在 任何給定群體中存在兩種或兩種以上等位基因。在另一個實施方案中， 多態(tài)性的特征為存在三種或三種以上等位基因。在其它實施方案中， 多態(tài)性的特征為四種或四種以上等位基因、五種或五種以上等位基因、 六種或六種以上等位基因、七種或七種以上等位基因、九種或九種以 上等位基因或十種或十種以上等位基因。所有這樣的多態(tài)性都可用于 本發(fā)明的方法和試劑盒中，因此在本發(fā)明的范圍內。
在某些情況下，對多態(tài)性位點處不同等位基因進行參比而不選擇 參比等位基因?；蛘?，對于特定多態(tài)性位點可以指定參比序列。參比 等位基因有時被稱為"野生型"等位基因，它通常被選為第一個被測 序的等位基因或來自"未受影響的"個體(例如沒有顯示出性狀或疾 病表型的個體)的等位基因。
本文指稱的SNP標記物的等位基因，根據在使用的SNP分析中出 現在多態(tài)性位點上的堿基A、 C、 G或T進行指稱。本文使用的SNPs 的等位基因編碼如下1= A， 2=C， 3=G， 4=T。但是，本技術領域的 專業(yè)人員將會認識到，在每種情況下，通過分析或讀取相反的DNA鏈， 可以測量到互補的等位基因。因此，對于其特征為A/G多態(tài)性的多態(tài) 性位點(多態(tài)性標記物)來說，使用的分析方法可以被設計成特異性 檢測兩種可能的堿基即A和G中的一種或兩種的存在。可選地，通過 設計分析方法，使得它被設計成檢測DNA模板上的相反鏈，可以測量 到互補堿基T和C的存在。從定量來說(例如根據相對風險)，從任 一條DNA鏈(+鏈或-鏈)測量獲得的結果是相同的。
典型情況下，對特定序列指定參比序列。與參比不同的等位基因 有時被稱為"變體"等位基因。本文使用的變體序列是指與參比序列 不同但是基本上相似的序列。本文描述的多態(tài)性遺傳標記物處的等位 基因是變體。其它的變體可以包含影響到多肽的變化。當與參比核苷 酸序列進行比較時，序列差異可以包括單個核苷酸或一個以上核苷酸的插入或缺失，從而導致閱讀框移碼；至少一個核苷酸的變化，導致 了所編碼的氨基酸的變化；至少一個核苷酸的變化，導致產生了未成 熟的終止密碼子；幾個核苷酸的缺失，導致了核苷酸編碼的一個或多 個氨基酸的缺失； 一個或幾個核苷酸的插入，例如通過不對稱重組或 基因轉換，導致了閱讀框編碼序列的中斷；序列的全部或一部分的復 制；易位；或核苷酸序列的重排。這樣的序列變化可以改變核酸編碼 的多肽。例如，如果核酸序列中的變化導致了閱讀框移碼，閱讀框移 碼可以導致編碼的氨基酸的變化，和/或導致產生了未成熟的終止密碼 子，導致產生了截短的多肽?？蛇x地，與疾病或性狀有關的多態(tài)性可 以是一個或多個核苷酸中的同義變化(即變化不導致氨基酸序列的變 化)。這樣的多態(tài)性可能例如改變剪接位點、影響mRNA的穩(wěn)定性或 運輸，或影響轉錄或編碼的多肽的翻譯。也可以改變DNA，以增加在 體細胞水平上發(fā)生結構變化、例如擴增或缺失的可能性。參比核苷酸 序列編碼的多肽是具有特定的參比氨基酸序列的"參比"多肽，由變 體等位基因編碼的多肽被稱為具有變異的氨基酸序列的"變體"多肽。 序列或參比序列可以表示雙鏈DNA的(+)或(-)方向。正如專業(yè)技術人員 所熟知的，這樣的序列是相關的，彼此為反向互補序列。
單倍型是指DNA的區(qū)段，其特征為沿著區(qū)段排列有等位基因的特 定組合。對于二倍體生物例如人類來說，單倍型含有每個多態(tài)性標記 物或位點的一對等位基因中的一個成員。在某些實施方案中，單倍型 可以含有兩個或兩個以上等位基因、三個或三個以上等位基因、四個 或四個以上等位基因、或五個或五個以上等位基因，每個等位基因對 應于區(qū)段上的特定多態(tài)性標記物。單倍型可以含有在多態(tài)性位點上具 有特定等位基因的各種多態(tài)性標記物、例如SNPs和微衛(wèi)星的組合。因 此，單倍型含有各種不同遺傳標記物等位基因的組合。
特定多態(tài)性標記物和/或單倍型的檢測可以通過本技術領域已知 的檢測多態(tài)性位點的序列的方法來完成。例如，可以使用用于基因分 型的標準技術檢測SNPs和/或微衛(wèi)星標記物的存在，例如基于熒光的
43技術(Chen, X.等，Ge"owe 7 " ^Y": 492-98 (1999))，利用PCR、 LCR、 巢式PCR以及其它用于核酸擴增的技術。可用于SNP基因分型的具體 的方法包括但不限于TaqMan基因分型分析方法和SNPlex平臺 (Applied Biosystems)、質i普(例如來自Sequenom的MassARRAY系 統)、微型測序方法、實時PCR、 Bio-Plex系統(BioRad) 、 CEQ和 SNPstream系統(Beckman)、分子倒置探針陣列技術(例如Affymetrix GeneChip)以及BeadArray技術(例如Illumina GoldenGate禾B Infinium 分析方法)。通過這些以及其它本技術領域的專業(yè)人員可用的方法， 可以鑒定出多態(tài)性標記物包括微衛(wèi)星、SNPs或其它類型的多態(tài)性標記 物的一個或多個等位基因。
在本文描述的某些方法中，對所研究的任何特定疾病或性狀具有 增加的易感性(即增加的風險)的個體，是在其中鑒定到了賦予對疾 病或性狀的增加的易感性的一個或多個多態(tài)性標記物的至少一個特定 等位基因或單倍型(即風險標記物等位基因或單倍型)的個體。在一 種情況下，風險標記物或單倍型是賦予了對疾病或性狀的明顯增加的 風險(或易感性)的標記物或單倍型。在一個實施方案中，與標記物 或單倍型相關的顯著性通過相對風險(RR)來測量。在另一個實施方 案中，與標記物或單倍型相關的顯著性通過比值比(OR)來測量。在 另一個實施方案中，顯著性通過百分比來度量。在一個實施方案中， 顯著增加的風險被測量為風險(相對風險和/或比值比)為至少1.2，包 括但不限于至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少 1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0、至少2.5、至少3.0、至少4.0和至 少5.0。在具體的實施方案中，至少1.2的風險(相對風險和/或比值比) 是顯著的。在另一個具體實施方案中，至少1.3的風險是顯著的。在另 一個實施方案中，至少1.4的風險是顯著的。在另一個實施方案中，至 少大約1.5的相對風險是顯著的。在另一個實施方案中，至少大約1.7 的風險的顯著增加是顯著的。但是，也考慮到了其它的截止值，例如 至少1.15、 1.25、 1.35等，這些截止值也在本發(fā)明的范圍內。在其它實 施方案中，風險的顯著增加是至少大約20%，包括但不限于大約25%、30%、 35%、 40%、 45%、 50%、 550/0、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 100%、 150%、 200%、 300%和500%。在一個具體 的實施方案中，風險的顯著增加是至少20%。在其它實施方案中，風 險的顯著增加是至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、 至少80%、至少90%和至少100%。但是，也考慮到了本技術領域的專 業(yè)技術人員認為適合于表征本發(fā)明的其它截止值或范圍，它們也在本 發(fā)明的范圍內。
本發(fā)明的風險多態(tài)性標記物或單倍型，是在具有疾病或性狀(例 如心律不齊或中風)(受影響的)風險的個體中至少一個標記物的至 少一個等位基因或單倍型的出現頻率，與它在對比組(對照)中的出 現頻率相比更高的標記物或單倍型，其中標記物或單倍型的存在表明 了對疾病或性狀的易感性。在一個實施方案中，對照組可以是群體樣 品，即來自總群體的隨機樣品。在另一個實施方案中，對照組由一組 沒有患病的個體代表。在一個實施方案中，這些沒有患病的對照的特 征可以是不存在一種或多種與特定疾病相關的癥狀。在另一個實施方 案中，沒有患病的對照組的特征為沒有一種或多種疾病特異性風險因 子。在一個實施方案中，這樣的風險因子是至少一種環(huán)境風險因子。 代表性的環(huán)境因子是已知影響或被考慮到影響發(fā)生特定疾病或性狀的 風險的天然產品、礦物質或其它化學物質。其它環(huán)境風險因子是與生 活方式有關的風險因子，包括但不限于飲食習慣、主要居住地的地理 位置和職業(yè)性風險因子。在另一個實施方案中，風險因子是至少一種 遺傳風險因子。
簡單的相關性檢驗的例子是在2x2表格上進行的Fisher-精確檢驗。 給定一組染色體，使用含有兩種標記物或單倍型、含有一種標記物或 單倍型而不含另一種、以及不含有標記物或單倍型的染色體的數量， 構建出2x2表格。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，對疾病或性狀具有降低的易感性(即降低的風險)的個體，是在其中鑒定到了賦予對疾病或性狀的降 低的易感性的一個或多個多態(tài)性標記物的至少一個特定等位基因或單 倍型的個體。賦予降低的風險的標記物等位基因和/或單倍型也被說成 是保護性的。在一種情況下，保護性標記物或單倍型是賦予了對疾病 或性狀的明顯降低的風險(或易感性)的標記物或單倍型。在一個實 施方案中，顯著降低的風險被測量為相對風險小于0.9，包括但不限于
小于0.9、小于0.8、小于0.7、小于0.6、小于0.5、小于0.4、小于0.3、 小于0.2和小于0.1。在一個具體的實施方案中，顯著降低的風險是小 于0.7。在另一個實施方案中，顯著降低的風險是小于0.5。在另一個 實施方案中，顯著降低的風險是小于0.3。在另一個實施方案中，風險 (或易感性)的降低是至少20%，包括但不限于至少25%、至少30%、 至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、 至少65%、至少70%、至少75%、至少80°/。、至少85%、至少90%、 至少95%和至少98%。在一個具體實施方案中，風險的顯著降低是至 少大約30%。在另一個實施方案中，風險的顯著降低是至少大約50%。 在另一個實施方案中，風險的顯著降低是至少大約70%。但是，也考 慮到了本技術領域的專業(yè)技術人員認為適合于表征本發(fā)明的其它截止 值或范圍，它們也在本發(fā)明的范圍內。
本技術領域的專業(yè)人員將會認識到，在被研究的群體中存在標記 物的兩個等位基因，其中一個等位基因被發(fā)現在群體中具有性狀或疾 病的個體組中的頻率高于對照組，而標記物的另一個等位基因被發(fā)現 在具有性狀或疾病的個體組中的頻率低于對照組。在這種情況下，標
記物的一個等位基因(被發(fā)現在具有性狀或疾病的個體中頻率增加的 等位基因)將是有風險的等位基因，而另一個等位基因將是保護性等 位基因。
遂徵不乎欽
重組這種自然現象，對于每對染色體來說在每次減數分裂事件過 程中平均發(fā)生一次，代表了自然界為序列(因此也為生物學功能)提供變異的一種方式。已經發(fā)現，基因組中的重組不是隨機發(fā)生的；相 反，在重組率的頻率上存在很大的變化，產生了具有高重組頻率的小 區(qū)域(也被稱為重組熱點)和具有低重組頻率的較大的區(qū)域，這通常 被稱為連鎖不平衡(LD)區(qū)塊(Myers, S.等，S/oc/^/w Soc 7>ww 34:526-530 (2006); Jeffreys, A丄，等，GeW 29:217-222 (2001); May, C.A.等，淑訓G匿"1:272-275(2002))。
連鎖不平衡(LD)是指兩個遺傳元件的非隨機的搭配。例如，如 果特定遺傳元件(例如多態(tài)性標記物的等位基因，或單倍型)在群體 中出現的頻率為0.25 (25%)，另一個元件出現的頻率為0.25 (25%)， 假設元件隨機分配，那么一個個體具有兩個元件的預計的發(fā)生率為 0.125 (12.5%)。但是，如果發(fā)現兩個元件一起出現的頻率高于0.125， 那么元件被說成是連鎖不平衡的，因為它們傾向于以比根據它們獨立 的出現頻率(例如等位基因或單倍型頻率)預測的比例更高的比例一 起遺傳。粗略地說，LD—般與兩個元件之間的重組事件的頻率相關。 群體中等位基因或單倍型的頻率可以通過對群體中的個體進行基因分 型并確定群體中每個等位基因或單倍型出現的頻率來測定。對于二倍 體群體例如人類群體來說，個體一般對每個遺傳元件(例如標記物、 單倍型或基因)具有兩個等位基因。
為了評估連鎖不平衡(LD)的強度已經提出了許多不同的測量方 法。大多數捕獲成對的雙等位基因位點之間關聯的強度。LD的兩個重 要的成對度量是r2 (有時稱為A2)和ID'I。兩種度量的范圍都是從0 (沒 有不平衡)到1 ("完全"不平衡)，但是它們的解釋稍微有些不同。 ID'I被定義為如果僅存在兩個或三個可能的單倍型則等于1，如果所有 四個可能的單倍型都存在則小于1。因此，小于l的ID'I值表明在兩個 位點之間可能在歷史上已經發(fā)生過重組(回復突變也能導致ID，I小于1， 但是對于單核苷酸多態(tài)性(SNPs)來說，通常認為這種情況發(fā)生的可 能性比重組低)。度量 一表示兩個位點之間的統計學相關性，如果只 出現兩個單倍型則取值為1。
47r2度量大概是相關性作圖的最具相關性的度量，因為在—和檢測 易感性位點與SNPs之間的關聯性所需的樣品大小之間存在簡單的反 比關系。這些度量是針對成對位點定義的，但是對某些應用來說，可
能需要確定在含有許多多態(tài)性位點的整個區(qū)域上LD有多強(例如測試 在位點之間或群體范圍內LD的強度是否有顯著的差別，或者區(qū)域中的 LD比在特定模型下預測的更高還是更低)。對整個區(qū)域的LD的測量 不是直接進行的，而是使用一種方法測量r，這種方法是在群體遺傳學 中開發(fā)的。簡單來說，r測量了在特定的群體模型下為了產生在數據中 觀察到的LD將需要多少重組。這種類型的方法也可能可以為確定LD 數據是否為重組熱點的存在提供了證據的難題提供統計學上嚴格的方 法。對于本文描述的方法和過程來說，顯著的—值可以是至少0.1，例 如至少O.l、 0.15、 0.2、 0.25、 0.3、 0.35、 0.4、 0.45、 0.5、 0.55、 0.6、 0.65、 0,7、 0.75、 0.8、 0.85、 0.9、 0.91、 0.92、 0.93、 0.94、 0.95、 0.96、 0.97、 0.98、 0.99或1.0。在一個優(yōu)選實施方案中，顯著的rM直可以是 至少0.2?？蛇x地，本文描述的連鎖不平衡是指其特征為ID'I的值為至 少0.2，例如0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7、 0.8、 0.85、 0.9、 0.95、 0.96、 0.97、 0.98、 0.99的連鎖不平衡。因此，連鎖不平衡表示了不同標記物的等位 基因之間的相關性。它由相關性系數或ID，沐度量(一最高為1.0， |D，| 最高為1.0)。連鎖不平衡可以如本文描述在單一人類群體中測定，或 者可以在含有來自一個以上人類群體的個體的樣品集合中測定。在本 發(fā)明的一個實施方案中，LD在來自一個或多個HapMap群體(高加索 人，非洲人，日本人，中國人)的樣品中，按照(http:〃www.hapmap.org) 的定義來測定。在一個這樣的實施方案中，LD在HapMap樣品的CEU 群體中測定。在另一個實施方案中，LD在YRI群體中測定。在另一個 實施方案中，LD在來自冰島人群體的樣品中測定。
如果在群體水平上基因組中的所有多態(tài)性是一致的，那么它們中 每個單獨的多態(tài)性將需要在關聯性研究中進行調查。但是，由于多態(tài) 性之間的連鎖不平衡，緊密連鎖的多態(tài)性是強烈相關的，這減少了在關聯性研究中為了觀察到顯著相關性所需調査的多態(tài)性的數量。LD的 另一個結果是，許多多態(tài)性由于它們是強烈相關的，可能給出關聯性信號。
已經在基因組范圍內產生了基因組LD譜圖，這樣的LD譜圖已經 被建議用作框架對疾病基因進行作圖(Risch, N. & Merkiangas, K, 5We"ce 273:1516-1517 (1996); Maniatis, N.等，/Voc 7VaW ^cac/"&4 99:2228-2233 (2002); Reich，DE等，A^wre 411:199-204 (2001))。
現在已經確定，人類基因組的許多部分可以被分成一系列不連續(xù) 的含有幾個共同的單倍型的單倍型區(qū)塊；對于這些區(qū)塊來說，連鎖不 平衡數據幾乎沒有提供表明重組的證據(參見例如Wall.， J.D.和 Pritchard, J.K.,淑匿i ev/縮￥:587-597 (2003); Daly, M.等， 淑匿":229-232 (2001); Gabriel, S.B.等，Sc/置e腐:2225-2229 (2002);Patil， N.等，S"'匿e廁:1719-1723 (2001); Dawson, E.等，淑匿 福:544-548 (2002); Phillips, M.S.等，淑訓":382-387 (2003))。
有兩種主要的方法用于定義這些單倍型區(qū)塊區(qū)塊可以被定義為
具有有限的單倍型多樣性的DNA區(qū)域(參見例如Daly, M.等，7Va&"
":229-232 (2001); Patil, N.等，Sc/置e "(1719-1723 (2001); Dawson, E.等，A^m^e WS:544-548 (2002); Zhang， K.等，iVoc. Wfl〃，力c"cf.
tAS^4 99:7335-7339 (2002))，或者定義為使用連鎖不平衡鑒定的具 有延長的歷史上重組的過渡區(qū)之間的區(qū)域(參見例如Gabriel, S.B.等， Scie騰 296:2225-2229 (2002) ; Phillips, M.S.等，胸訓 W:382-387 (2003); Wang, N.等，顛.i/畫.G匿t 77:1227-1234 (2002); Stumpf, MP.，和Goldstein, D.B., Cw".所o/. /3:1-8 (2003))。更 近些時候，在人類基因組范圍上重組率的精細圖的和相應的熱點的圖 譜已經被產生(Myers, S.等，5We"ce 310:321-32324 (2005); Myers, S. 等，Soc 7>ww 34:526530 (2006))。圖譜顯示出在基因組范圍 內的重組中存在大量變化，在熱點處重組率高達10-60 cM/Mb，而在過渡區(qū)中接近于0，因此代表了有限單倍型多樣性和高LD的區(qū)域。因此， 譜圖可用于將單倍型區(qū)塊/LD區(qū)塊定義為重組熱點兩翼的區(qū)域。在本文
中使用的術語"單倍型區(qū)塊"或"LD區(qū)塊"包含了由任何上述的特征、
或本技術領域的專業(yè)人員用于定義這種區(qū)域所用的其它可選方法定義 的區(qū)塊。
使用單個標記物或含有多個標記物的單倍型，單倍型區(qū)塊可用于 對表型和單倍型狀態(tài)之間的相關性進行作圖?？梢栽诿總€單倍型區(qū)塊
中鑒定主要的單倍型，然后可以鑒定一組"標簽"SNPs或標記物(在 單倍型中進行辨別所需的最小組的SNPs或標記物)。這些標簽SNPs 或標記物然后可用于評估來自個體組的樣品，以便鑒定表型和單倍型 之間的相關性。如果需要，可以對鄰近的單倍型區(qū)塊同時進行評估， 因為在單倍型區(qū)塊之間也可能存在連鎖不平衡。
因此，顯然，對于任何給定的觀察到的與基因組中的多態(tài)性標記 物的關聯性來說，可能基因組中的其它標記物也顯示出關聯性。這是 基因組范圍內LD的不均衡分布的自然結果，正如通過重組率的大的變 化所觀察到的。因此，在某種意義上，用于檢測關聯性的標記物代表 了與給定疾病或性狀有關的基因組區(qū)域(即單倍型區(qū)塊或LD區(qū)塊)的 "標簽"，并因此可用于本發(fā)明的方法和試劑盒中。在被發(fā)現與疾病 或性狀有關的區(qū)域中可以存在有一個或多個引起結果的(功能性)變 體或突變。這樣的變體可能賦予比用于檢測關聯性的標簽標記物觀察 到的更高的相對風險(RR)或比值比(OR)。因此，如本文所述，本 發(fā)明涉及了用于檢測與疾病的關聯性的標記物，以及與標記物連鎖不 平衡的標記物。因此，在本發(fā)明的某些實施方案中，與本文所述的標 記物和/或單倍型連鎖不平衡的標記物可以被用作替代標記物。在一個 實施方案中，替代標記物具有比最初被發(fā)現與本文所述的疾病相關的 標記物或單倍型更小的相對風險(RR)和/或比值比(OR)值。在其 它實施方案中，替代標記物具有比最初被發(fā)現與本文所述的疾病相關 的標記物所最初測定的更大的RR或OR值。這樣的實施方案的一個例子是與最初被發(fā)現與疾病相關的更常見的變體(>10%群體頻率)、例 如本文描述的變體連鎖不平衡的稀有的或相對稀有的(<10%等位基因 群體頻率)變體。鑒定和使用這些標記物用于檢測本文描述的本發(fā)明 人發(fā)現的關聯性，可以通過本技術領域的專業(yè)人員熟知的常規(guī)方法來 進行，因此也在本發(fā)明的范圍內。
與本文顯示的與心律不齊(例如心房纖顫和心房撲動)和中風有 關聯的標記物連鎖不平衡的某些多態(tài)性標記物，有可能位于本文SEQ
ID NO: 50中顯示的序列所定義的LD區(qū)塊C04的物理邊界之外。這是 所述區(qū)域中歷史上的重組率的結果，歷史上的重組可能導致產生了強 烈連鎖不平衡的區(qū)域(LD區(qū)塊)，它帶有與區(qū)塊內的標記物連鎖不平 衡的區(qū)塊外的剩余標記物。這樣的標記物也在本發(fā)明的范圍內，因為 利用它們與在本文中顯示出的與心律不齊和中風相關聯的標記物的遺 傳關系，它們同樣可用于實施本發(fā)明。這樣的標記物的例子顯示在表 18中(rs7668322 (SEQIDNO:46) 、 rs2197815 (SEQIDNO:47)、 rs6831623 (SEQIDNO:48) 、 rs2595110 (SEQIDNO:49))。
卓舒微率顏定
患者和對照組中單倍型的頻率可以使用期望最大化算法來估算 (Dempster A.等，《/ 兄5, 39:1-38 (1977))?？梢允褂眠@種算 法來操作丟失的基因型和階段的不確定性。在虛假設下，患者和對照 被假定具有同樣的頻率。使用或然性方法，測試可選的假說，其中候 選的風險單倍型、可以包含本文描述的標記物、被允許在患者中比對 照中具有更高的頻率，而兩個組中其它單倍型的頻率的比率被假設是
相同的。在兩種假說下分別將或然性最大化，并使用相應的l-df或然 性比率統計數值來評估統計學顯著性。
為了在連鎖區(qū)域中尋找有風險和保護性標記物，研究了例如被基 因分型的標記物的所有可能組合的關聯性，只要那些標記物分布在可 實踐的區(qū)域中。可以將合并的患者和對照組隨機分成兩組，其大小與
51原始的患者和對照組相等。然后重復標記物和單倍型分析，確定記錄 到的最顯著的p-值。這種隨機化的流程可以被重復例如超過100次， 以構建p-值的經驗性分布。在優(yōu)選實施方案中，p-值〈0.05是顯著的標 記物和/或單倍型關聯性的指示。
卓燈麥分折
進行單倍型分析的一種通用方法包括將基于或然性的推論用于
NEstedMOdels (Gretarsdottir S.等，A^aA 35:131-38 (2003))。該
方法在NEMO程序中執(zhí)行，允許使用許多多態(tài)性標記物、SNPs和微衛(wèi) 星。所述方法和軟件被特別設計用于病例-對照研究，其目的是鑒定賦 予了不同風險的單倍型組。它也是用于研究LD結構的工具。在NEMO 中，在EM算法的幫助下，直接計算了最大或然性估算值、或然性比 率和p-值，對于觀察到的數據，將其作為缺失數據問題進行處理。
盡管基于從觀察到的數據直接計算的或然率的或然率比率檢驗捕 捉到了由于階段的不確定性和缺失的基因型而丟失的信息，可用于可 靠地給出有效的p-值，但了解由于信息的不完整而丟失了多少信息， 仍然是有趣的。用于單倍型分析的信息測量測量描述在Nicolae和Kong (技術報告537號，芝加哥大學統計學院統計學系；S/ome^"， 60(2):368-75 (2004))中，作為為連鎖分析定義的信息測量的自然延伸， 并在NEMO中執(zhí)行。
對于單個標記物與疾病的關聯性來說，可以使用Fisher精確檢驗 來計算每個單獨等位基因的雙邊p-值。通常來說，除非特別指明，所 有顯示的p-值沒有對多重比較進行調整。顯示的頻率(對于微衛(wèi)星、 SNPs和單倍型來說)是與攜帶者頻率相反的等位基因頻率。為了最小 化由于作為連鎖分析的家庭召集的患者的親緣性造成的任何偏差，一 級和二級親屬可以從患者名單中消除。此外，通過擴展在Risch， N. & Teng, J. (Ge"omei e、 8:1273-1288 (1998))中描述的偏差調整步驟， 合并具有親緣關系的DNA (/^丄)以便它可以適用于普通家族關系、并呈遞調整過的和未調整的p-值進行比較，可以重復檢驗，對患者間 任何殘留的親緣性進行關聯性校正。差異一般來說正如預期一樣非常 小。為了評估通過多次檢驗校正的單個標記物關聯性的顯著性，我們 可以使用同樣的基因型數據執(zhí)行隨機測試?？梢詫⒒颊吆蛯φ战M隨機
化，將關聯性分析重做多次(例如多達500,000次)，在某些重復中對
某些標記物等位基因產生的p-值小于或等于我們使用最初的患者和對 照組時觀察到的p-值，p-值即是這樣的重復的分數。
對于單個標記物和單倍型分析來說，通過假設的乘法模型(單倍
型相對風險模型)可以計算相對風險(RR)和群體歸因風險度(PAR) (Terwilliger, J.D. & 。tt, J.， //匿//e^W. 42:337-46 (1992)和Falk， C.T. & Rubinstein, P, J朋，//wm. 5/ 3」:227-33 (1987))，即一個人
攜帶的兩個等位基因/單倍型的風險的乘積。例如，如果A相對于a的 風險是RR，那么純合子AA的人的風險將是雜合子Aa的人的風險的 RR倍，以及純合子aa的人的風險的RR"咅。乘法模型具有簡化分析 和計算的良好性質一一單倍型在受影響的群體中以及對照群體中是獨 立的，即處于Hardy-Weinberg平衡。因此，受影響的和對照的單倍型 的數量每個都具有多項式分布，但是在可選假設下具有不同的單倍型 頻率。具體來說，對于兩個單倍型&和^來說，風險(/z,)/風險化)=
(/^,)/W/乃)，其中/和P分別是指受影響的群體和對照群體中的頻率。 盡管如果真正的模型不是乘法的將會損失一些效能，但除了極端情況 下之外，損失趨于輕微。最重要的是，p-值總是有效的，因為它們是針 對虛假設計算的。
A^MO汙,遂綴不^翁—
成對標記物之間的LD可以使用標準定義的D'和r2來計算 (Lewontin, R.， Ge""/" 49:49-67 (1964); Hill， W.G. & Robertson, A. 7Tzeor 4p; /. 22:226-231 (1968))。使用NEMO，通過最大或然
性來估算兩個標記物等位基因組合的頻率，通過或然性比率檢驗來評 估連鎖不平衡的偏差。通過平均由邊緣等位基因概率權重的兩個標記物的所有可能的等位基因組合的值，D'和r2的定義被擴展到包含微衛(wèi) 星。當對所有標記物組合進行作圖以闡明特定區(qū)域中的LD結構時，我 們將D'作圖于左上角，將p-值作圖于右下角。在LD圖中，如果需要 的話，標記物可以等間距作圖而不按照它們的物理位置作圖。
^Ai伊仿浙珍銜學
正如本文所述，某些多態(tài)性標記物和含有這樣的標記物的單倍型 被發(fā)現可用于心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)或中風的風險評 估。風險評估可以包括使用標記物來診斷對心律不齊(例如心房纖顫 或心房撲動)或中風的易感性。多態(tài)性標記物的特定等位基因，在患 有心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)或中風的個體中發(fā)現的頻率， 比在沒有診斷出心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)或中風的個體 中的頻率更高。因此，這些標記物等位基因對于在個體中檢測心律不 齊(例如心房纖顫或心房撲動)或中風、或對心律不齊(例如心房纖 顫或心房撲動)或中風的易感性，具有預測價值。含有風險標記物、 例如本文描述的標記物的單倍型區(qū)塊或LD區(qū)塊中的標簽標記物，可用 作單倍型區(qū)塊或LD區(qū)塊中其它標記物和/或單倍型的替代物。具有等 于1的^值的標記物是風險變體的完美的替代物，即一個標記物的基 因型完美地預測了另一個的基因型。具有小于1的—值的標記物也可 以作為風險變體的替代物，或者可選地代表相對風險值等于或可能甚 至高于風險變體的變體。鑒定到的風險變體本身可以不是功能變體， 但是在這種情況下與真正的功能變體連鎖不平衡。本發(fā)明包括了為本 文公開的標記物評估這樣的替代標記物。這樣的標記物被注解、作圖 和列表在專業(yè)技術人員熟知的公共數據庫中，或者可選地，可以通過 對使用本發(fā)明的標記物在一組個體中鑒定到的區(qū)域或區(qū)域的一部分進 行測序，并在得到的序列組中鑒定多態(tài)性，來容易地鑒定。結果，本 技術領域的專業(yè)人員可以容易地并且不需要繁瑣的實驗，對與本文描 述的標記物和/或單倍型連鎖不平衡的替代標記物進行基因分型。與檢 測到的風險變體連鎖不平衡的標簽或替代標記物，對于在個體中檢測 與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風的關聯性或對心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風的易感性，也具有預測價 值。這些與本發(fā)明的標記物連鎖不平衡的標簽或替代標記物也可以包 括其它在單倍型中不同的標記物，因為它們同樣對于檢測對心律不齊 (例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風的易感性，具有預測價值。
本發(fā)明的標記物和單倍型，例如在表5和9中顯示的標記物以及 與其連鎖不平衡的標記物，可單獨或組合地用于風險評估和診斷目的。
因此，即使是在單個標記物造成的風險增加相對溫和、即在10-30%的 級別的情況下，關聯性也可以具有明顯的暗示。因此，相對普通的變 體可能對總的風險有顯著的貢獻(群體歸因風險度高)，或者標記物的 組合可用于定義基于標記物的組合風險、對發(fā)生疾病有顯著的組合風 險的個體組。
因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，多個變體(標記物和/或單倍 型)被用于總體風險評估。在一個實施方案中，這些變體選自本文公 開的變體。其它實施方案包括了使用本發(fā)明的變體與其它已知可用于 診斷對心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風的易感性的變 體的組合。在這樣的實施方案中，在個體中確定了多個標記物和/或單 倍型的基因型狀態(tài)，并將個體的狀態(tài)與相關變體的群體頻率、或在臨 床健康的對象例如年齡匹配和性別匹配的對象中變體的頻率進行比 較。然后可以使用本技術領域已知的方法、例如多變量分析或聯合風 險分析，來確定根據多個位點處的基因型狀態(tài)所賦予的總的風險。然 后可以將基于這樣的分析進行的風險評估用于本文描述的本發(fā)明的方 法和試劑盒中。
如上所述，人類基因組的單倍型區(qū)塊結構具有這樣的作用，即與 最初與疾病或性狀相關的變體連鎖不平衡的大量變體(標記物和/或單 倍型)可以用作替代標記物，用于評估與疾病和性狀的關聯性。這樣 的替代標記物的數量依賴于幾種因素，例如區(qū)域中的歷史重組率、區(qū) 域中的突變頻率(即區(qū)域中多態(tài)性位點或標記物的數量)、以及區(qū)域中連鎖不平衡的程度(LD區(qū)塊的大小)。這些標記物通常位于使用本文 描述的方法或通過本技術領域的專業(yè)人員已知的其它方法確定的所述 LD區(qū)塊或單倍型區(qū)塊的物理邊界內。但是，有時會發(fā)現標記物和單倍 型關聯性延伸到定義的單倍型區(qū)塊的物理邊界之外。在這樣的情況下， 這些標記物和/或單倍型也可用作物理上位于定義的單倍型區(qū)塊內的標 記物和/或單倍型的替代標記物和/或單倍型。因此，與本發(fā)明的標記物
和單倍型連鎖不平衡(典型的特征為—大于0.1，例如r2大于0.2，包 括一大于0.3，也包括—大于0.4)的標記物和單倍型也在本發(fā)明的范 圍之內，即使它們在物理上位于所定義的單倍型區(qū)塊的邊界之外。這 包括了本文描述的標記物(例如表5和表9)，但是也可以包括與表5 和9中列出的一種或多種標記物強烈連鎖不平衡(例如特征為 一大于 0.1或0.2，和/或|0'|>0.8)的其它標記物。
對于本文描述的SNP標記物來說，與在患者中被發(fā)現是過量的等 位基因(風險等位基因)相反的等位基因，在心律不齊(例如心房纖 顫或心房撲動)和/或中風患者中被發(fā)現具有降低的頻率。這些標記物 和單倍型與這樣的標記物連鎖不平衡和/或含有它們，因此對心律不齊
(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風具有保護性，即它們賦予了攜 帶有這些標記物和/或單倍型的個體以降低的發(fā)生心律不齊(例如心房 纖顫或心房撲動)和/或中風的風險或易感性。
本發(fā)明的某些變體、包括某些單倍型，在某些情況下包含各種遺 傳標記物例如SNPs和微衛(wèi)星的組合。單倍型的檢測可以通過本技術領 域已知的和/或本文描述的用于檢測多態(tài)性位點的序列的方法來進行。 此外，某些單倍型或標記物組與疾病表型之間的關聯性可以使用標準 的技術來證實。用于關聯性的簡單檢驗的一個代表性例子是在2x2表 格上進行的Fisher精確檢驗。
在特定實施方案中，被發(fā)現與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲 動)和/或中風有關的標記物或單倍型(例如列于表5 (表5A和5B)、表9和/或表19中的標記物，以及與其連鎖不平衡的標記物)，是其中 標記物或單倍型在具有心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中 風風險的個體(受影響的人)中出現的頻率，比它在健康個體(對照) 中出現的頻率高的標記物或單倍型，其中標記物等位基因或單倍型的 存在是心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風或對心律不齊 (例如心房纖顫或心房撲動)禾P/或中風易感性的指示。在其它實施方 案中，與一個或多個被發(fā)現與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)
和/或中風有關的標記物(例如列于表5A和5B中的標記物等位基因， 以及與其連鎖不平衡的標記物)連鎖不平衡的風險標記物，是在具有 心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風風險的個體(受影響 的人)中出現的頻率比它們在健康個體(對照)中出現的頻率高的標 簽標記物，其中標簽標記物的存在是對心律不齊(例如心房纖顫或心 房撲動)和/或中風的增加的易感性的指示。在另一個實施方案中，與 一個或多個被發(fā)現與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風 有關的標記物(例如列于表5A和5B中的標記物等位基因，以及與其 連鎖不平衡的標記物)連鎖不平衡的風險標記物等位基因(即賦予增 加的易感性)，是含有一個或多個在具有心律不齊(例如心房纖顫或心 房撲動)禾n/或中風風險的個體中出現的頻率，比它們在健康個體(對 照)中出現的頻率高的等位基因的標記物，其中標記物的存在是對心 律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)禾P/或中風增加的易感性的指示。
研究薦沐
從普遍意義上講，本發(fā)明的方法和試劑盒可以使用含有來自任何 來源、即任何個體的基因組DNA的樣品。在優(yōu)選實施方案中，個體是 人類個體。個體可以是成年人、兒童或胎兒。本發(fā)明還提供了對屬于 耙群體的成員的個體中標記物和/或單倍型的評估。在一個實施方案中， 這樣的靶群體是根據其它遺傳因子、生物標記物、生物物理參數(例 如體重、BMD、血壓)、或總體健康和/或生活方式參數(例如疾病或 相關疾病史、以前對疾病的診斷、疾病的家族史)，具有發(fā)生疾病的 風險的個體的群體或組。
57本發(fā)明提供了包含特定年齡亞組的個體的實施方案，例如超過40
歲、超過45歲、或超過50、 55、 60、 65、 70、 75、 80或85歲的年齡 亞組。本發(fā)明的其它實施方案對應于其它的年齡組，例如年齡小于85 歲的個體，例如小于80歲、小于75歲、或小于70、 65、 60、 55、 50、 45、 40、 35或30歲。其它實施方案涉及發(fā)病時的年齡在任何上述年齡 范圍內的個體。在某些實施方案中，還考慮到了年齡的范圍可以是相 關的，例如發(fā)病時的年齡大于45歲但小于60歲。但是，其它的年齡 范圍也被考慮到了，包括由上面列出的年齡值界定的所有范圍。
其它實施方案涉及了發(fā)病年齡在特定年齡或年齡段的個體。因此， 遺傳的和非遺傳的傾向性因子可能在什么年齡影響個體發(fā)生疾病，這 是已知的。對于心血管疾病、包括心律不齊和中風來說，常見的風險 因子可以影響個體是否以及在什么年齡發(fā)生疾病。因此，本發(fā)明的某 些實施方案涉及了在某個年齡段中心律不齊(例如心房纖顫和/或心房 撲動)或中風的發(fā)病年齡或診斷時的年齡。在一個實施方案中，具有 發(fā)生中心律不齊(例如心房纖顫和/或心房撲動)或中風的風險的個體 的發(fā)病年齡或診斷年齡在40歲以上。在其它實施方案中，個體的發(fā)病 年齡或診斷年齡超過45歲，或超過50、 55、 60、 65、 70、 75、 80或 85歲。本發(fā)明的其它實施方案I涉及了發(fā)病年齡或診斷年齡在85歲以 下，例如在80歲以下、75歲以下或70、 65、 60、 55、 50、 45、 40、 35或30歲以下的個體。 一個優(yōu)選實施方案包含了在80歲以下被診斷 患有心房纖顫或心房撲動或中風的個體。另一個優(yōu)選實施方案涉及了 在70歲以下被診斷患有心房纖顫或心房撲動或中風的個體。另一個優(yōu) 選實施方案涉及了在60歲以下被診斷患有心房纖顫或心房撲動或中風 的個體。另一個優(yōu)選實施方案涉及了在50歲以下被診斷患有心房纖顫 或心房撲動或中風的個體。其它實施方案涉及了發(fā)病年齡在上面描述 的具體年齡段中的個體。也考慮到了在某些實施方案中，年齡段可以
是相關的，例如發(fā)病年齡大于45歲但小于60歲，發(fā)病年齡大于60歲 但小于70歲，發(fā)病年齡大于70歲但小于80歲，或發(fā)病年齡大于60歲但小于80歲。但是，其它的年齡段也被考慮到了，包括由上面列出 的年齡值界定的所有年齡段。
本發(fā)明還涉及了任何性別、男性或女性的個體。它還提供了涉及 來自一個或多個人類種群的人類對象的實施方案，包括但不限于班圖
人、Mandenk、約魯巴人、San、木布提矮人、奧克尼群島人、Adygel、 俄羅斯人、薩丁尼亞人、托斯卡尼人、莫扎比特人、貝多因人、Dmze、 巴勒斯坦人、俾路支人、布拉灰人、莫克蘭人、信德人、帕坦人、布 魯肖人、哈扎拉人、維吾爾人、kalash、漢族人、傣族人、達斡爾人、 赫哲族人、拉祜族人、苗族人、鄂倫春族人、畬族人、土家族人、土 族人、錫伯族人、彝族人、內蒙古族人、納西族人、柬埔寨人、曰本 人、雅庫特人、美拉尼西亞人、巴布亞人、加里提亞拿人、Sumi、哥 倫比亞人、瑪雅人和皮瑪族人。本發(fā)明還涉及了歐洲人群體、美洲人 群體、歐亞人群體、亞洲人群體、中/南亞人群體、東亞人群體、中東 人群體、非洲人群體、西班牙人群體和大洋洲人群體。歐洲人群體包 括但不限于瑞典人、挪威人、芬蘭人、俄羅斯人、丹麥人、冰島人、 愛爾蘭人、凱爾特人、英格蘭人、蘇格蘭人、荷蘭人、比利時人、法 國人、德國人、西班牙人、葡萄牙人、意大利人、波蘭人、保加利亞 人、斯拉夫人、塞爾維亞人、波斯尼亞人、捷克人、希臘人和土耳其 人群體。
在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及了含有非洲黑人血統的群體， 例如含有非洲人血統或譜系的人的群體。非洲黑人血統可以通過自己 報告確定為非洲裔美國人(African-Americans )、非裔美國人 (Afro-Americans)、美國黑人(BlackAmericans)，是黑色人種的一 個成員，或黑人人種的一個成員。例如，非洲裔美國人或美國黑人是 居住在北美并且起源于任何非洲黑色人種組的人。在另一個例子中， 自己報告的非洲黑人血統的人可以具有至少一個非洲黑人血統的父 母，或至少一個非洲黑人血統的祖父母。
59個體對象中的種族組成也可以通過遺傳分析來確定。血統的遺傳
分析可以使用不連鎖的微衛(wèi)星標記物來進行，例如在Smith等"m / //wmGe"W74, 1001-13 (2004))中提出的那些。
在某些實施方案中，本發(fā)明涉及了如上所述在特定群體中鑒定到 的標記物和/或單倍型。本技術領域的專業(yè)人員將會認識到，在對不同 的群體使用時，連鎖不平衡(LD)測量將給出不同的結果。這是由于 不同人類群體的不同群體史，以及在特定基因組區(qū)域中可能導致LD差 異的不同選擇壓力。對于本技術領域的專業(yè)人員來說，某些標記物例 如SNP標記物在一個群體中是多態(tài)性的但在另一個群體中不是，這種 情況是熟知的。但是，本技術領域的專業(yè)人員將使用可用的或如本文 教導的方法，在任何給定的人類群體中實施本發(fā)明。這可以包括評估 本發(fā)明的LD區(qū)域中的多態(tài)性標記物，以便鑒定出那些在特定群體中表 現出最強關聯性的標記物。因此，本發(fā)明的有風險變體可以在不同的 單倍型背景上、并以不同的頻率存在于各種不同人類群體中。但是， 使用本技術領域己知的方法和本發(fā)明的標記物，可以在任何給定人類 群體中實施本發(fā)明。
遺傳/Jf試游賴遂
本技術領域的專業(yè)人員將會認識到并理解， 一般來說，本文描述 的變體本身不能提供將發(fā)生心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/ 或中風的個體的絕對鑒定。但是，本文描述的變體表明了攜帶有本發(fā) 明的風險或保護性變體的個體將發(fā)生與心律不齊(例如心房纖顫或心 房撲動)和/或中風有關的癥狀的增加的和/或降低的可能性。但是，該 信息本身是極具價值的，正如在下文中更詳細指出的，因為它可以用 于例如在早期階段啟動預防性措施，進行定期的生理和/或心理檢查以 監(jiān)測癥狀的發(fā)展和/或出現，或計劃定期的檢査以鑒定所述的病癥，以 便能夠在早期階段實施治療。
關于賦予了發(fā)生心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風的風險的遺傳變體的知識，為使用遺傳測試辨別具有發(fā)生疾病的增加 的風險的個體(即風險變體的攜帶者)和具有發(fā)生疾病的降低的風險 的個體(即保護性變體的攜帶者)提供了機會。對于屬于上述兩個組 的個體來說，遺傳測試的核心價值是能夠在早期階段診斷心律不齊(例 如心房纖顫或心房撲動)和/或中風的可能性，或心律不齊(例如心房 纖顫或心房撲動)和/或中風的傾向性，以及為臨床醫(yī)師提供關于心律 不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風的預后的信息，以便能夠 實施最合適的治療。
具有心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風家族史的個 體和風險變體的攜帶者可以從遺傳測試中獲益，因為對遺傳風險因子 的存在的了解、或成為一個或多個風險因子的攜帶者的增加的風險的 證據，可以為通過避免或最小化與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲 動)和/或中風相關的心血管疾病的已知環(huán)境風險因子，來實行更健康 的生活方式提供增加的激勵。心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動) 和/或中風患者的遺傳測試，可以進一步給出關于疾病的首要原因的有 價值的信息，可以幫助臨床醫(yī)生為每個個體選擇最適合的療法和藥物 治療。
本發(fā)明還涉及對心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風 的風險評估，包括確定個體是否具有發(fā)生心律不齊(例如心房纖顫或 心房撲動)和/或中風的風險。本發(fā)明的多態(tài)性標記物可以單獨或組合 使用，以及與其它因子、包括其它遺傳風險因子或生物標記物相組合， 用于對個體進行心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風的風 險評估。許多已知影響個體對發(fā)生心血管疾病的風險的傾向性的因子， 是心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風的易感性因子，它 們對于本技術領域的專業(yè)人員來說是已知的，并可用于這樣的評估的 中。這些包括但不限于年齡、性別、吸煙狀態(tài)、體育活動、腰圍臀圍 比、心律不齊(特別是心房纖顫和/或心房撲動)和/或中風的家族史、 以前診斷的心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風、肥胖癥、高甘油三酯血癥、低HDL膽固醇、高血壓、升高的血壓、膽固醇水平、
HDL膽固醇、LDL膽固醇、甘油三酯、載脂蛋白AI和B水平、纖維 蛋白原、鐵蛋白、C反應性蛋白和白三烯水平。已經與心房纖顫/心房 撲動和中風相關聯的具體的生物標記物被討論在Allard等(C//" C/z， 51:2043-2051 (2005))禾Q Becker (J77womZ) 7T^om6o/" 19:71-75 (2005)) 中。它們包括但不限于纖維蛋白D-二聚體、凝血酶原活化片段1.2 (F1.2)、凝血酶-抗凝血酶III復合物(TAT)、纖維蛋白肽A (FPA)、 脂蛋白相關的磷脂酶A2 (Ip-PLA2) 、 (3-血小板球蛋白、血小板因子4、 P-選擇素、von Willebrand因子、利尿鈉肽前體(BNP)、基質金屬蛋 白酶-9 (MMP-9) 、 PARK7、 二磷酸核苷激酶(NDKA) 、 tau、神經 元特異性烯醇化酶、B型神經營養(yǎng)性生長因子、星形神經膠質蛋白 S-100b、神經膠質纖絲酸性蛋白、C-反應性蛋白、血清淀粉樣肽A、基 質金屬蛋白酶-9、血管和細胞內細胞粘附分子、腫瘤壞死因子a和白介 素，包括白介素-1、 -6和-8。循環(huán)系統祖細胞也已經被暗示可以作為 AF的有用的生物標記物。在具體的實施方案中，對于個體確定了一個 以上的生物標記物，并與本文描述的至少一個多態(tài)性標記物的確定結 果相結合。優(yōu)選情況下，測量來自個體的血漿或血清中的生物標記物， 可選地，可以在其它含有可測量量的生物標記物的適合的組織中測量 生物標記物，這樣的實施方案也在本發(fā)明的范圍之內。
本技術領域已知的方法可用于總體風險評估，包括多變量分析或 邏輯回歸。
心房纖顫對于個體患者和衛(wèi)生護理系統整體來說都是非常重要的 疾病。它可能是永久性的病癥，但是也可以是突發(fā)性的并復發(fā)，在這 種病例中它對診斷可能非常具有挑戰(zhàn)性。心房纖顫和心房撲動的最具 破壞性的并發(fā)癥是衰弱性中風的發(fā)生。重要的是，中風在永久性和突 發(fā)性心房纖顫中風險是相等的。已經重復地顯示出，使用華法林抗凝 結的療法在心房纖顫的情況下可以顯著降低中風的第一次和進一步的 突然發(fā)作。因此，法華令的抗凝結作用對于幾乎所有患有心房纖顫的患者來說是用于預防中風的標準療法，不論它們是永久性的還是突發(fā) 性類型。唯一不強烈推薦使用華法林的患者是年齡小于65歲的被認為 是低風險的患者，即它們不具有器質性心臟病，包括沒有高血壓、沒 有冠狀動脈疾病、沒有以前的中風或暫時性缺血性發(fā)作史、沒有糖尿 病。該組患者對中風具有較低的風險，推薦使用阿司匹林進行中風預 防。
由于突發(fā)性心房纖顫的本質，它可能非常難以診斷。當患者由于 疾病相關的癥狀例如心悸、胸痛、呼吸短促、眩暈、心衰、暫時性缺 血性發(fā)作或甚至中風而尋求醫(yī)學關注時，可能已經恢復到正常的心臟 節(jié)律，從而妨礙了心律不齊的診斷。在這些情況中，頻繁實施心律監(jiān)
控以診斷病癥。心律通常被連續(xù)監(jiān)測24到48小時。不幸的是，心房
纖顫的發(fā)作時無法預料的，使用這種方法經常會錯過。診斷心律不齊、 建立推薦的療法、以及可能防止使人衰弱的第一次或復發(fā)的中風的機 會，可能被錯過，導致對病人的毀滅性結果。當對心房纖顫的懷疑非 常強時，有時可以獲得并使用延長的和更復雜的心律監(jiān)測測量。這些 測試是昂貴的，使用現有方法的診斷率通常較低，它們被零散地用于 這種指征。在這些情況下，使用遺傳測試的其它風險分級作用可能是 極其有用的。了解所述個體攜帶有風險還是保護性遺傳變體，對于診 斷和/或治療決定的做出可能是無法估價的貢獻。在某些情況下，這種 方式可以避免不必需的測試和治療，在其它情況下，在更具攻擊性的 診斷方法的幫助下，心律不齊可以被診斷，和/或可以開始適當的治療， 從而消除了后來的疾病的并發(fā)癥。
發(fā)明方法
在這里描述了對心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風 進行風險評估的方法，這些方法包含在本發(fā)明中。本發(fā)明還包含了評 估個體對心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風的治療藥劑 發(fā)生反應的可能性的方法，以及用于預測治療藥劑對治療患者心律不 齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風的有效性的方法。本發(fā)明還
63包含了用于分析來自對象的樣品、以檢測對心律不齊(例如心房纖顫 或心房撲動)和/或中風的易感性的試劑盒。
本發(fā)明的診斷和篩選分析方法
在某些實施方案中，本發(fā)明涉及了通過檢測在心律不齊(例如心 房纖顫或心房撲動)和/或中風對象、或對心律不齊(例如心房纖顫或 心房撲動)和/或中風易感的對象中出現得更頻繁的遺傳標記物的特定 等位基因，來診斷、或幫助診斷心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動) 和/或中風或對心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風易感性 的方法。在特定實施方案中，本發(fā)明是通過檢測至少一個多態(tài)性標記 物(例如本文描述的標記物)的至少一個等位基因，來診斷對心律不 齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風的易感性的方法。通過本發(fā) 明描述的方法，特定標記物的特定等位基因或單倍型的檢測，是對心 律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風易感性的指示。這樣的 預后或預測分析也可用于在心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/ 或中風的癥狀發(fā)作之前，確定對象的預防性治療。
在某些實施方案中，本發(fā)明涉及了診斷、例如由專業(yè)醫(yī)務人員執(zhí) 行的診斷的臨床應用的方法，該方法可以包括評估或確定遺傳風險變 體及其說明。在其它實施方案中，本發(fā)明涉及了由外行人或非專業(yè)醫(yī) 務人員執(zhí)行的風險評估(或診斷)的方法?；蚍中图夹g中的最新技
術進展，包括SNP標記物的高通量基因分型、例如分子倒置探針陣列 技術(例如Affymetrix GeneChip)禾口 BeadArray技術(例如Illumina GoldenGate和Infmium分析)，已經使個體對他們自己的基因組的大量 變體、或多達一百萬個SNPs同時進行評估成為可能。得到的對個體可 用的基因型信息，可以與來自公開的科學文獻的關于與各種SNPs有關 的疾病或性狀風險的信息相比較。因此，本文描述的與疾病相關的等 位基因的診斷應用，可以由健康專業(yè)人員根據臨床測試的結果來進行， 也可以由外行人或非專業(yè)醫(yī)務人員，包括通過SNP基因分型為執(zhí)行 SNPs的評估提供服務的個體，在個體SNP的基礎上或通過大規(guī)模的高通量的方法、例如陣列技術來進行。換句話說，根據遺傳風險對易感 性進行的診斷或評估，可以由健康專業(yè)人員、遺傳顧問、基因分型服 務提供者或外行人，根據他/她的基因型的信息以及關于各種不同風險 因子的出版物，來做出。在本發(fā)明的上下文中，術語"診斷"和"診 斷易感性"，意指任何可用的診斷方法，包括上面提到的診斷方法。
此外，在某些其它的實施方案中，本發(fā)明涉及通過檢測在心律不 齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風患者中比在沒有診斷出心律 不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風的個體中或總人群中出現 頻率低的特定遺傳標記物等位基因或單倍型，來診斷或幫助診斷對心 律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)禾卩/或中風的降低的易感性的方法。
正如本文所述和示例的，特定的標記物等位基因或單倍型(例如
在表5(表5A和5B)中列出的標記物和單倍型，以及與其連鎖不平衡 的標記物，例如在表4和/或9中列出的標記物以及與其連鎖不平衡的 標記物，例如表19中顯示的標記物)與心律不齊(例如心房纖顫或心 房撲動)和/或中風有關。在一個實施方案中，標記物等位基因或單倍 型是賦予了對心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風的顯著 風險或易感性的標記物等位基因或單倍型。在另一個實施方案中，本 發(fā)明涉及了在人類個體中診斷對心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動) 和/或中風的易感性的方法，方法包括在從個體獲得的核酸樣品中確定 至少一個多態(tài)性標記物的至少一個等位基因的存在或不存在，其中至 少一個多態(tài)性標記物選自表5A和表5B中列出的多態(tài)性標記物，以及 與其連鎖不平衡的標記物。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及通過篩 選在表5A和5B中列出的至少一個標記物等位基因或單倍型、或與其 連鎖不平衡的標記物，在人類個體中診斷心律不齊(例如心房纖顫或 心房撲動)和/或中風的易感性的方法。在另一個實施方案中，標記物 等位基因或單倍型在患有心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或 中風或對心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風易感的對象 (受影響的)中出現的頻率，與它在健康的對象(對照，例如群體對照)中出現的頻率相比，更高。在某些實施方案中，至少一個標記物 等位基因或單倍型的關聯性的顯著性的特征為p-值〈0.05。在其它實施 方案中，關聯性的顯著性的特征為p-值更小，例如<0.01、 <0.001、 <0.0001 、 <0.00001 、 <0.000001 、 <0.0000001 、 <0細00001 或 <0.000000001。
在這些實施方案中，至少一個標記物等位基因或單倍型的存在是 對心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)禾p/或中風的易感性的指示。 這些診斷方法包括檢測與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或 中風有關的至少一個標記物等位基因或單倍型的存在或不存在。本文
描述的單倍型包括各種不同遺傳標記物(例如SNPs、微衛(wèi)星)的等位
基因的組合。構成特定單倍型的特定遺傳標記物等位基因的檢測，可 以通過本文描述的和/或本技術領域已知的各種不同方法來進行。例如， 遺傳標記物可以在核酸水平上(例如通過直接的核苷酸測序或通過其 它本技術領域的專業(yè)人員已知的方法)檢測，也可以在氨基酸水平上 檢測，如果遺傳標記物影響了由心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動) 和/或中風相關核酸編碼的蛋白的編碼序列的話(例如，通過蛋白測序 或通過使用識別這樣的蛋白的抗體的免疫分析)。本發(fā)明的標記物等 位基因或單倍型對應于與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或
中風有關的基因組DNA序列的片段。這樣的片段含有所述的多態(tài)性標 記物或單倍型的DNA序列，但是也可以含有與標記物或單倍型強烈 LD(連鎖不平衡)的DNA區(qū)段。在一個實施方案中，這樣的區(qū)段含有 由 一值大于0.2和/或ID'l > 0.8所確定的與標記物或單倍型連鎖不平衡 的區(qū)段。
在一個實施方案中，對心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/ 或中風的易感性的診斷可以使用雜交方法來實現，例如Southern分析、 Northern分析、和/或原位雜交(參見《分子生物學現代方法》(Current Protocols in Molecular Biology) , Ausubel， F.等主編， John Wiley & Sons,包括所有附錄)。來自測試對象或個體的基因組DNA、 RNA或CDNA生物樣品("測試樣品")是從懷疑患有心律不齊(例如心房纖顫 或心房撲動)和/或中風、對心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)禾口/ 或中風易感或對心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風有傾 向性的對象("測試對象")獲得的。對象可以是成年人、兒童或胎兒。
測試樣品可以來自于任何含有基因組DNA的來源，例如血液樣品、羊
水樣品、腦脊液樣品、或來自皮膚、肌肉、口腔或結膜粘膜、胎盤、
胃腸道或其它器官的組織樣品。來自胚胎細胞或組織的DNA測試樣品 可以通過適當的方法獲得，例如通過羊膜穿刺術或絨毛膜絨毛取樣。 然后檢測DNA、 RNA或cDNA樣品。特定標記物等位基因的存在可以 通過特異性針對特定等位基因的核酸探針的序列特異性雜交來指示。 一種以上特定標記物等位基因或特定單倍型的存在，可以通過使用幾 種序列特異性核酸探針來指示，每種探針特異性針對特定等位基因。 在一個實施方案中，單倍型可以通過特異性針對特定單倍型的(即與 含有單倍型特征性的特定標記物等位基因的DNA鏈特異性雜交的)單 一核酸探針來指示。序列特異性探針可以被導向以與基因組DNA、RNA 或cDNA雜交。本文使用的"核酸探針"可以是與互補序列雜交的DNA 探針或RNA探針。本技術領域的專業(yè)人員將了解如何設計這樣的探針， 使得只有在測試樣品的基因組序列中存在特定等位基因時，才發(fā)生序 列特異性雜交。
為了診斷對心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)禾P/或中風的易 感性，通過將含有與心房纖顫和/或中風相關的核酸的測試樣品、例如 基因組DNA樣品，與至少一種核酸探針相接觸來形成雜交樣品。用于 檢測mRNA或基因組DNA的探針的非限制性例子是能夠與本文描述 的mRNA或基因組DNA序列雜交的標記的核酸探針。核酸探針可以 是例如全長的核酸分子或其一部分，例如長度為至少15、 30、 50、 100、 250或500個核苷酸、在嚴緊條件下足以與適當的mRNA或基因組DNA 特異性雜交的寡核苷酸。核苷酸探針的長度可以多達IOOO個或以上的 核苷酸，包括多達500個核苷酸、400個核苷酸、300個核苷酸、200 個核苷酸或100個核苷酸。某些實施方案包含了長度為15到1000個核苷酸的核苷酸探針。其它的實施方案涉及長度為15到500個核苷酸、
或長度為15到400個核苷酸、或長度為20到400個核苷酸的核苷酸 探針的使用。本發(fā)明的核苷酸探針的其它大小范圍也被考慮到了，正 如專業(yè)技術人員所熟知的。在一個實施方案中，核酸探針可以包含本 文描述的LD區(qū)塊C04的核苷酸序列的全部或一部分，可選地含有本 文描述的標記物的至少一個等位基因，或本文描述的至少一個單倍型， 或者探針可以是與這樣的序列互補的序列。在特定的實施方案中，核 酸探針是本文描述的SEQ ID NO: 50中顯示的LD區(qū)塊C04的核苷酸序 列的一部分，可選地含有本文描述的標記物的至少一個等位基因，或 一個多態(tài)性標記物的至少一個等位基因或包含本文描述的至少一個多 態(tài)性標記物的單倍型，或者探針可以是這樣的序列的互補序列。其它 適合用于本發(fā)明的診斷分析的探針在本文中進行了描述。雜交可以通 過本技術領域的專業(yè)人員熟知的方法來進行(參見例如《分子生物學 現代方法》(Current Protocols in Molecular Biology) ， Ausubel, F.等主 編，John Wiley & Sons,包括所有附錄)。在一個實施方案中，雜交是 指特異性雜交，即沒有錯配的雜交(精確雜交)。在一個實施方案中， 特異性雜交的雜交條件是高度嚴緊的。
特異性雜交、如果存在的話，使用標準方法來檢測。如果在核酸 探針與測試樣品的核酸之間發(fā)生了特異性雜交，那么樣品含有與核酸 探針中存在的核苷酸互補的等位基因。對于本發(fā)明的任何標記物、或 構成本發(fā)明的單倍型的標記物可以重復這個過程，或者可以同時使用 多個探針在同一時間檢測一個以上的標記物等位基因。設計含有一個 以上特定單倍型的標記物等位基因的單個探針(例如探針含有與構成 特定單倍型的2、 3、 4、 5個或所有標記物互補的等位基因)，也是可 能的。樣品中單倍型的特定標記物的檢測表明樣品源具有特定單倍型 (例如單倍型)，因此對心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)禾P/或中 風易感。
在另一種雜交方法中，Northern分析(參見《分子生物學現代方
68法》 (Current Protocols in Molecular Biology) , Ausubel, F.等主編，John Wiley & Sons，同上)被用于鑒定與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動) 和/或中風相關的多態(tài)性的存在。對于Northern分析來說，RNA測試樣 品通過適合的方法從對象獲得。如本文所述，核酸探針與來自對象的 RNA的特異性雜交表明了特定等位基因與探針互補。關于核酸探針的 使用的代表性的例子，參見例如美國專利Nos. 5,288,611和4,851,330。
此外或可選地，在本文描述的雜交方法中，可以在核酸探針以外 或代替核酸探針而使用肽核酸(PNA)探針。PNA是DNA模擬物，具 有類似肽的無機骨架例如N-(2-氨基乙基)甘氨酸單位，以及通過亞甲基 羰基鍵連接到甘氨酸的氮上的有機堿基(A、 G、 C、 T或U)(參見例 如Nielsen, P.等，S/oco")wg, C&m. 5:3-7 (1994)) 。 PNA探針可以被設 計成與懷疑含有一個或多個與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動) 和/或中風相關的標記物等位基因或單倍型的樣品中的分子特異性雜 交。因此，PNA探針的雜交可用于診斷心律不齊(例如心房纖顫或心 房撲動)和/或中風或對心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中 風的易感性。
在本發(fā)明的一個實施方案中，收集從對象獲得含有基因組DNA的 測試樣品，并可以使用聚合酶鏈反應(PCR)擴增含有一個或多個本發(fā) 明的標記物或單倍型的片段。如本文所述，與心律不齊(例如心房纖 顫或心房撲動)和/或中風相關的特定標記物等位基因或單倍型的鑒定， 可以使用各種不同的方法來進行(例如序列分析、限制性消化分析、 特異性雜交、單鏈構象多態(tài)性分析(SSCP)、電泳分析等)。在另一個 實施方案中，診斷通過使用定量PCR (動力學熱循環(huán))進行表達分析 來實現。該技術可以使用例如商業(yè)化的技術，例如TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA)。該技術可以評估由與心律不齊(例如心房 纖顫或心房撲動)和/或中風相關的核酸編碼的多肽或剪接變體的表達 或組成中的變化的存在。此外，變體的表達可以作為物理上或功能上 的差異進行定量。在本發(fā)明的另一個方法中，通過限制性消化進行的分析可用于檢 測特定的等位基因，如果等位基因導致相對于參比序列來說產生或消 除了限制性位點的話。可以進行限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析，
例如按照《分子生物學現代方法》(Current Protocols in Molecular Biology,局匸上)中的描述來進行。相關DNA片段的消化圖譜表明了樣 品中特定等位基因的存在或不存在。
序列分析也可用于檢測與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動) 和/或中風相關的特定等位基因或單倍型(例如表5 (表5A和5B)、表 9和/或表19的多態(tài)性標記物)。因此，在一個實施方案中，特定標記 物等位基因或單倍型的存在或不存在的確定，包括了從對象或個體獲 得的DNA或RNA的測試樣品的序列分析。可以使用PCR或其它適合 的方法擴增與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風相關的 核酸的一部分，然后可以通過對樣品中基因組DNA的多態(tài)性位點(或 單倍型中的多個多態(tài)性位點)進行測序，來直接檢測特定等位基因的 存在。
通過使用擴增的寡核苷酸與等位基因特異性寡核苷酸(ASO)探 針的斑點印跡雜交(參見例如Saiki， R.等，A^ w"， 324:163-166 (1986))， 等位基因特異性寡核苷酸也可用于檢測與心律不齊(例如心房纖顫或 心房撲動)和/或中風相關的核酸中特定等位基因的存在(例如表5 (表 5A和5B)、表9和/或表19的多態(tài)性標記物)。"等位基因特異性寡核 苷酸"(在本文中也稱為"等位基因特異性寡核苷酸探針")是大約 10-500個堿基對、大約15-400個堿基對、大約15-200個堿基對、大約 15-100個堿基對、大約15-50個堿基對、或大約15-30個堿基對的寡核 苷酸，與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風相關的核酸 特異性雜交，并在多態(tài)性位點上含有特定等位基因(例如本文描述的 標記物或單倍型)。特異性針對一個或多個特定的與心律不齊(例如心 房纖顫或心房撲動)和/或中風相關的核酸的等位基因特異性寡核苷酸探針，可以使用標準的方法來制備(參見例如《分子生物學現代方法》，
(Current Protocols in Molecular Biology), /^J:)。可以使用PCR來擴 增所需區(qū)域。含有擴增的區(qū)域的DNA可以使用標準方法進行斑點印跡
(參見例如《分子生物學現代方法》，(Current Protocols in Molecular Biology),廚J:)，并將印跡與寡核苷酸探針相接觸。然后可以檢測探 針與擴增區(qū)域的特異性雜交的存在。等位基因特異性寡核苷酸探針與 來自對象的DNA的特異性雜交，是與心律不齊(例如心房纖顫或心房 撲動)和/或中風相關的多態(tài)性位點上特定等位基因的指示(參見例如 Gibbs, R.等，iVwc/e/c^c/^si 仏，〃:2437-2448 (1989)和WO 93/22456)。
通過加入類似物例如鎖核酸(LNAs)，引物和探針的大小可以被 減小到8個堿基。LNAs是一類新的雙環(huán)狀DNA類似物，其中呋喃糖 環(huán)中的2'和4'位置通過O-亞甲基(氧-LNA)、 S-亞甲基(硫-LNA)或 氨基亞甲基(氨基-LNA)基團相連接。所有這些LNA變體的共同之處 是與互補核酸的親和性，到目前為止在DNA類似物中是被報道的最高 的。例如特別是所有的氧-LNA九聚體當與互補的DNA或RNA復合時， 熔點溫度(Tm)分別為64。C和74。C，相反，對應的DNA九聚體與DNA 和RNA的熔點溫度均為28°C。當LNA單體與標準的DNA或RNA的 單體組合使用時，也可以獲得Tm的顯著增加。對于引物和探針來說， 取決于含有LNA單體的位置(例如在3'末端、5'末端、或在中間)，Tm 可以得到相當大的提高。
在另一個實施方案中，與來自對象的靶核酸序列區(qū)段互補的寡核 苷酸探針的陣列，可用于在與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動) 和/或中風相關的核酸(例如表5A和5B的多態(tài)性標記物以及與其連鎖 不平衡的標記物)中鑒定多態(tài)性。例如，可以使用寡核苷酸陣列。寡 核苷酸陣列典型地包含多個連接到基質表面上不同已知位置上的不同 的寡核苷酸探針。這些寡核苷酸陣列、也被稱為"基因芯片" (Genechips ),在本技術領域中已經廣泛描述過了 (參見例如美國專 利No. 5,143,854、 PCT專利公開Nos. WO 90/15070和92/10092)。 一般來說，這些陣列可以使用機械合成方法或組合了光蝕刻方法和固相 寡核苷酸合成方法的光指導的合成方法，或通過本技術領域的專業(yè)人
員已知的其它方法來生產(參見例如Fodor, S.等，S"'e"ce, Z5/:767-773 (1991); Pirrung等，美國專利No.5,143,854 (也參見已出版的PCT申 請No. WO 90/15070);和Fodor. S.等，已出版的PCT申請No. WO 92/10092和美國專利No. 5,424,186，每個文件的全部教導在此引為參 考)。使用機械合成方法合成這些陣列的技術描述在例如美國專利No. 5,384,261中，其全部教導在此引為參考。在另一個實施方案中，可以 使用線性陣列。關于使用寡核苷酸陣列檢測多態(tài)性的其它描述可以在 例如美國專利Nos. 5,858,659和5,837,832中發(fā)現，這兩個專利的全部 教導在此以其全文引為參考。
本技術領域的專業(yè)人員可以獲得的其它核酸分析方法可用于檢測 與心房纖顫和/或中風相關的多態(tài)性位點中的特定等位基因(例如表5 (表5A和5B)、表9和/或表19的多態(tài)性標記物)。代表性的方法包括 例如直接手動測序(Church和Gilbert,尸rac.胸/.爿c^/.園'W: 1991-1995 (1988); Sanger, F.等，iVoc.胸/.」cad "&4' 7￥:5463-5467
(1977) ; Beavis等，美國專利No. 5,288,644);自動化熒光測序；單鏈 構象多態(tài)性分析(SSCP);均一變性凝膠電泳(CDGE);變性梯度凝 膠電泳(DGGE) ( Sheffield, V.等，/Voc. A^". Jcad Sc/. S6:232-236 (1989));遷移率變動分析(Orita, M.等，Prac. Zc"d Sc/. 敝2766-2770 (1989));限制性酶分析(Flavell, R.等，Ce〃， 15:25-41
(1978) ; Geever, R.等；iVoc, A^/.爿cac/. Sc/, L^i 7&5081-5085 (1981)); 異源雙鏈分析；化學錯配裂解(CMC) (Cotton, R.等，尸亂淑"cad
園,S5:4397-4401 (1985)); RNase保護分析(Myers， R.等，5W眞e, 230:1242-1246 (1985));使用識別核苷酸錯配的多肽例如大腸桿菌mutS 蛋白；以及等位基因特異性PCR。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，對心律不齊(例如心房纖顫或心 房撲動)和/或中風或對心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風的易感性的診斷，在本發(fā)明的遺傳標記物或單倍型導致了多肽的組 成或表達發(fā)生改變的情況下，可以通過檢査與心律不齊(例如心房纖 顫或心房撲動)和/或中風相關的核酸編碼的多肽的表達和/或組成來進 行。因此，對心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風易感性 的診斷，在本發(fā)明的遺傳標記物或單倍型導致了多肽的組成或表達發(fā) 生改變的情況下，可以通過檢測這些多肽中的一個、或與心律不齊(例 如心房纖顫或心房撲動)和/或中風相關的核酸編碼的另一個多肽的表 達和/或組成來進行。本發(fā)明的顯示出與心律不齊(例如心房纖顫或心 房撲動)和/或中風的關聯性的單倍型和標記物，可能通過它們對這些 鄰近基因中的一個或多個(例如尸/7X2基因)的影響來發(fā)揮作用。影
響這些基因的可能機制包括例如影響轉錄、影響RNA剪接、改變mRNA 可選剪接形式的相對量、影響RNA穩(wěn)定性、影響從細胞核向細胞質的 運輸、以及影響翻譯的效率和精確性。
因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明的顯示出與心律不齊(例如 心房纖顫或心房撲動)和/或中風的相關性的變體(標記物或單倍型)， 影響了鄰近基因的表達。眾所周知，影響基因表達的調控元件可以位 于與基因的啟動子區(qū)域相距幾十或幾百kb的位置。因此，通過分析本 發(fā)明的至少一個多態(tài)性標記物的至少一個等位基因的存在或不存在， 評估這樣的鄰近基因的表達水平是可能的。因此設想，本發(fā)明的標記 物或單倍型的檢測，可用于評估與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲 動)和/或中風有關聯的一個或多個基因的表達。
各種不同的方法可用于檢測蛋白表達水平，包括酶聯免疫吸附分 析(ELISA)、 Western印跡、免疫沉淀和免疫熒光。評估了來自對象的 測試樣品中由與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風相關 的核酸編碼的多肽在表達中的變化和/或組成中的變化的存在。由與心 律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風相關的核酸編碼的多肽 在表達中的變化可以是例如定量的多肽表達(即產生的多肽的量)的 變化。由與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風相關的核酸編碼的多肽的組成的變化是定性的多肽表達(例如突變體多肽的表 達或不同剪接變體的表達)的變化。在一個實施方案中，對心律不齊 (例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風易感性的診斷，通過檢測由與 心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風相關的核酸編碼的特
定剪接變體或剪接變體的特定圖譜來進行。
也可以同時存在這兩種變化(定量的和定性的)。本文中使用的多 肽表達或組成中的"變化"，是指測試樣品中多肽的表達或組成、與對 照樣品中多肽的表達或組成相比的變化。對照樣品是與測試樣品相應 的樣品(例如來自于同樣類型的細胞)，來自于沒有感染心律不齊(例 如心房纖顫或心房撲動)和/或中風、和/或不具有對心律不齊(例如心 房纖顫或心房撲動)和/或中風易感性的對象。在一個實施方案中，對 照樣品來自于不具有本文描述的標記物等位基因或單倍型的對象。同 樣地，與對照樣品相比，測試樣品中一個或多個不同剪接變體的存在， 或測試樣品中明顯不同量的不同剪接變體的存在，可以表明對心律不 齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風的易感性。在等位基因相對 于對照樣品中的參比改變了剪接位點的情況下，與對照樣品相比，測 試樣品中多肽的表達或組成的變化可以指示特定的等位基因。用于檢 測核酸編碼的多肽的表達和組成的各種不同的方法對于本技術領域的 專業(yè)人員來說是已知的，并且都可以使用，包括光譜法、比色法、電
泳、等電聚焦和免疫分析(例如David等，美國專利No. 4,376,110)例 如免疫印跡(參見例如《分子生物學現代方法》，(Current Protocols in Molecular Biology),特別是第10章，y^J:)。
例如，在一個實施方案中，可以使用能夠與心律不齊(例如心房 纖顫或心房撲動)和/或中風相關的核酸編碼的多肽結合的抗體(例如 具有可檢測標記的抗體)?？贵w可以是多克隆的，也可以是單克隆的。 可以使用完整的抗體，也可以使用其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2)。 對于探針或抗體來說，術語"標記的"意指包含了通過將可檢測物質 連接(即物理連接)到探針或抗體上以對探針或抗體直接標記，以及
74通過與被直接標記的另一種試劑進行反應而對探針或抗體的間接標 記。間接標記的例子包括使用標記的第二抗體(例如熒光標記的第二 抗體)檢測第一抗體，以及用生物素對DNA探針進行末端標記，以便 可以使用熒光標記的鏈親和素來檢測它。
在這種方法的一個實施方案中，將測試樣品中與心律不齊(例如 心房纖顫或心房撲動)和/或中風相關的核酸編碼的多肽的水平或量， 與對照樣品中多肽的水平或量進行比較。測試樣品中多肽的水平或量 高于或低于對照樣品中多肽的水平或量，使得差異在統計學上顯著， 表明了核酸編碼的多肽的表達發(fā)生了變化，并且診斷了負責引起表達 差異的特定等位基因或單倍型?？蛇x地，將測試樣品中多肽的組成與 對照樣品中多肽的組成進行比較。在另一個實施方案中，可以對測試 樣品和對照樣品中的多肽的水平或量以及組成二者都進行評估。
在另一個實施方案中，對心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動) 和/或中風的易感性的診斷，通過檢測至少一個本發(fā)明的標記物或單倍
型(例如與表5A和5B中列出的標記物以及與其連鎖不平衡的標記物 相關的等位基因)，以及與其它基于蛋白的、基于RNA的或基于DNA 的分析方法相結合來進行。本發(fā)明的方法也可以與對象的家族史和風 險因子(例如環(huán)境風險因子、生活方式風險因子)的分析組合起來使 用。
試微
用于本發(fā)明的方法和步驟的試劑盒包含可用于本文描述的任何方 法的組分，包括例如雜交探針，限制性酶(例如用于RFLP分析)，等 位基因特異性寡核苷酸，與本文描述的本發(fā)明的核酸(例如含有至少 一個本發(fā)明的多態(tài)性標記物和/或單倍型的基因組區(qū)段)編碼的改變的 多肽、或本文描述的本發(fā)明的核酸編碼的未改變的(天然)多肽結合 的抗體，用于擴增與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風 有關的核酸的手段，用于分析與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風有關的核酸的核酸序列的手段，用于分析與心律不齊(例如 心房纖顫或心房撲動)和/或中風有關的核酸編碼的多肽的氨基酸序列 的手段，等。試劑盒可以包含例如必需的緩沖液、用于擴增本發(fā)明的 核酸(例如本文描述的一個或多個多態(tài)性標記物)的核酸引物、以及 使用這些引物對擴增的片段進行等位基因特異性檢測的試劑和必需的 酶(例如DNA聚合酶)。此外，試劑盒可以提供與本發(fā)明的方法組合 使用的分析方法的試劑，例如用于心律不齊(例如心房纖顫或心房撲 動)和/或中風的診斷分析方法的試劑。
在一個實施方案中，本發(fā)明是用于分析從對象獲得的樣品、以在 對象中檢測心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風的存在、 或對心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風的易感性，其中 試劑盒含有在個體的基因組中選擇性檢測本發(fā)明的至少一個多態(tài)性的 至少一個等位基因所需的試劑。在特定的實施方案中，試劑含有與個 體的基因組中含有至少一個本發(fā)明的多態(tài)性的片段雜交的至少一個連 續(xù)的寡核苷酸。在另一個實施方案中，試劑含有至少一對與從對象獲 得的基因組區(qū)段的相反鏈雜交的寡核苷酸，其中每個寡核苷酸引物對 被設計成選擇性擴增個體的基因組中含有至少一個多態(tài)性的片段，其
中多態(tài)性選自表5A和5B中列出的多態(tài)性，以及與其連鎖不平衡的多 態(tài)性標記物。在另一個實施方案中，片段的大小為至少20個堿基對。 這樣的寡核苷酸或核酸(例如寡核苷酸引物)可以使用表明了心律不 齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風的多態(tài)性(例如SNPs或微 衛(wèi)星)兩側的核酸序列的部分來設計。在另一個實施方案中，試劑盒 含有一個或多個標記的核酸，能夠對與心律不齊(例如心房纖顫或心 房撲動)和/或中風有關的一個或多個特定多態(tài)性標記物或單倍型進行 等位基因特異性檢測，以及用于檢測標記的試劑。適合的標記包括例 如放射性同位素、熒光標記、酶標記、酶輔助因子標記、磁性標記、 自旋標記、表位標記。
在特定實施方案中，通過試劑盒的試劑檢測的多態(tài)性標記物或單倍型包含一個或一個以上標記物、兩個或兩個以上標記物、三個或三 個以上標記物、四個或四個以上標記物或五個或五個以上標記物，標
記物選自表5A和5B中顯示的標記物。在另一個實施方案中，被檢測 的標記物或單倍型包含表5A和5B中顯示的標記物。在另一個實施方 案中，被檢測的標記物或單倍型包括表4和9中列出的標記物。在另 一個實施方案中，被檢測的標記物或單倍型包括與含有表5A和5B中 列出的標記物的組中的至少一個標記物強烈連鎖不平衡的標記物組中 的至少一個標記物，其中強烈連鎖不平衡由1"2的值大于0.2所定義。在 另一個實施方案中，被檢測的標記物或單倍型包括與含有表4和9中 列出的標記物的組中的至少一個標記物強烈連鎖不平衡的標記物組中 的至少一個標記物，其中強烈連鎖不平衡由一的值大于0.2所定義。在 另一個實施方案中，被檢測的標記物或單倍型含有標記物rs2220427 (SEQ ID NO: 1)或標記物rsl033464 (SEQ ID NO:41)，或與其連鎖 不平衡的標記物。在另一個實施方案中，被檢測的標記物或單倍型含 有表19中顯示的至少一個標記物。在另一個實施方案中，被檢測的標 記物或單倍型含有標記物D4S406 (SEQ IDNO:45)、 rs2634073 (SEQ IDNO:33)、 rs2200733 (SEQ ID NO:28)、 rs2220427 (SEQ ID NO: 1)、 rsl0033464 (SEQIDNO:41)和rsl3143308 (SEQ ID NO:51 )，以及與 其連鎖不平衡的標記物。在另一個實施方案中，標記物或單倍型含有 標記物D4S406的等位基因-2、 -4和/或-8、標記物rs2634073的等位基 因A、標記物rs2200733的等位基因T、標記物rs2220427的等位基因 T、標記物rsl0033464的等位基因T、和/或標記物rsl3143308的等位 基因G。在一個這樣的實施方案中，連鎖不平衡由—的值大于0.1所定 義。在另一個這樣的實施方案中，連鎖不平衡由—的值大于0.2所定義。
在一個優(yōu)選實施方案中，用于檢測本發(fā)明的標記物的試劑盒含有 與含有被檢測的SNP多態(tài)性的模板DNA區(qū)段雜交的檢測寡核苷酸探 針，增強子寡核苷酸探針和內切核酸酶。正如前面解釋的，檢測寡核 苷酸探針在其3'末端含有熒光部分或基團，在其5'末端含有淬滅劑， 增強子寡核苷酸按照Kutyavin等(M/c/e/c34:el28 (2006))的描述使用。熒光部分可以是Gig Harbor綠或Yakima黃，或其它適合的 熒光基團。檢測探針被設計成與含有被檢測的SNP多態(tài)性的短核苷酸 序列雜交。優(yōu)選情況下，SNP位于從末端殘基到離檢測探針的3'末端 -6個殘基之間的任何位置。增強劑是在檢測探針3'方向上與DNA模板 雜交的短的寡核苷酸探針。探針被設計成當兩個探針都與模板結合時， 在檢測探針和增強子核苷酸探針之間存在單個核苷酸缺口。缺口產生 了合成的脫堿基位點，可以被內切核酸酶例如內切核酸酶IV識別。酶 將染料從完全互補的檢測探針上切下，但是不能裂解含有錯配的檢測 探針。因此，通過測量釋放出的熒光部分的熒光，可以對由檢測探針 的核苷酸序列定義的特定等位基因的存在進行評估。
檢測探針可以具有任何適合的大小，盡管優(yōu)選情況下探針相對較 短。在一個實施方案中，探針的長度為5-100個核苷酸。在另一個實施 方案中，探針長度為10-50個核苷酸，在另一個實施方案中，探針長度 為12-30個核苷酸。其它長度的探針也是可能的，并在本技術領域的專 業(yè)人員的普通技能的范圍內。
在優(yōu)選實施方案中，含有SNP多態(tài)性的DNA模板在檢測前通過 聚合酶鏈反應(PCR)進行擴增，用于這種擴增的引物被包含在試劑盒 中。在這樣的實施方案中，被擴增的DNA被用作檢測探針和增強子探 針的模板。
在檢測探針、增強子探針和/或用于通過PCR擴增模板的引物的某 些實施方案中，包括了使用修飾的堿基，包括修飾的A和修飾的G。 使用修飾的堿基可用于調整核苷酸分子(探針和/或引物)與模板DNA 的熔點溫度，例如在含有低百分率G或C堿基的區(qū)域中增加熔點溫度， 其中可以使用具有與其互補的T形成三個氫鍵的能力的修飾的A，或 者用于在含有高百分率G或C堿基的區(qū)域中降低熔點溫度，例如使用 在雙鏈DNA分子中與其互補的C堿基只能形成兩個氫鍵的修飾的G 堿基。在優(yōu)選實施方案中，修飾的堿基被用于設計檢測核苷酸探針。
78在這些方法中可以選擇任何專業(yè)技術人員已知的修飾堿基，根據本文 的教導對適合的堿基進行選擇也在專業(yè)人員的能力范圍內，已知的堿 基可以從專業(yè)人員已知的商業(yè)來源獲得。
在一個這樣的實施方案中，標記物或單倍型的存在是對心房纖顫 和/或中風的易感性(增加的易感性或降低的易感性)的指示。在另一 個實施方案中，標記物或單倍型的存在是對心房纖顫和/或中風治療試 劑的反應的指示。在另一個實施方案中，標記物或單倍型的存在是對 心房纖顫和/或中風預后的指示。在另一個實施方案中，標記物或單倍 型的存在是對心房纖顫和/或中風治療的進展的指示。這樣的治療可以 包括外科干預、藥物治療或通過其它手段(例如生活方式改變)。
治療藥劑
本發(fā)明的變體(例如本發(fā)明的標記物和/或單倍型，例如表5A和 5B和/或表19中列出的標記物)可用于鑒定新的心律不齊(例如心房 纖顫或心房撲動)和/或中風的治療性靶。例如，含有與心律不齊(例 如心房纖顫或心房撲動)和/或中風相關的變體(標記物和/或單倍型) 的基因或與其連鎖不平衡的基因或它們的產物，以及被這些變體基因 或它們的產物直接或間接調控或與它們相互作用的基因或它們的產 物，可以成為開發(fā)治療性藥劑的靶，以治療心律不齊(例如心房纖顫 或心房撲動)和/或中風、或阻止或延遲與心律不齊(例如心房纖顫或 心房撲動)和/或中風有關的癥狀的出現。治療性藥劑可以含有一種或
多種例如小的非蛋白和非核酸分子、蛋白、肽、蛋白片段、核酸(DNA、 RNA)、 PNA (肽核酸)，或它們的可以調節(jié)靶基因或它們的基因產物 的功能和/或水平的衍生物或模擬物。
本發(fā)明的核酸和/或變體、或含有它們的互補序列的核酸，可用作 反義構建物以控制細胞、組織或器官中的基因表達。與反義技術有關 的方法對于專業(yè)技術人員來說是眾所周知的，被描述和綜述在《反義 藥物技術原理，策略與應用》(J"^e""Z>Mg 7fec/mo/ogy:/V/"c^/m, flfeg/es, 0""; /7//( 加.0叫Crooke主編，Marcel Dekker Inc., New York
(2001) )中。 一般來說，反義核酸分子被設計成與基因表達的mRNA 的區(qū)域互補，使得反義分子與mRNA雜交，從而阻斷mRNA翻譯成蛋 白。對于本技術領域的專業(yè)人員來說，已知有幾類反義寡核苷酸，包 括裂解物和阻斷物。前者與靶RNA位點結合，激活細胞內核酸酶(例 如RnaseH或Rnase L)，其裂解耙RNA。阻斷物與耙RNA結合，通過 對核糖體進行空間位阻來抑制蛋白的翻譯。阻斷物的例子包括核酸、 嗎啉代化合物、鎖核酸和甲基膦酸酯(Thompson, i>wgZXscoveo; 7bda_y， 7:912-917 (2002))。反義寡核苷酸可直接用作治療性藥劑，也可用于確 定和證實基因的功能，例如通過基因敲除或基因擊落實驗。反義技術 被進一步描述在Lavery等，Cwr, O/ /". i>wg D&cov. ￡>eve/. 6:561-569 (2003)， Stephens等，Cwr. C^". Mo/. rAer. 5:118-122 (2003)， Kurreck，
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本文描述的變體可用于選擇和設計特異性針對特定變體的反義試 劑。使用關于本文描述的變體的信息，可以設計出特異性靶向含有本 發(fā)明的一個或多個變體的mRNA分子的反義寡核苷酸或其它反義分 子。通過這種方式，含有一個或多個本發(fā)明的變體(標記物和/或單倍 型)的mRNA分子的表達可以被抑制或阻斷。在一個實施方案中，反 義分子被設計成與耙核酸的特定等位基因形式(即一個或幾個變體(等 位基因和/或單倍型))特異性結合，從而抑制源自于該特定等位基因 或單倍型的產物的翻譯，但是不與靶核酸分子在特定多態(tài)性位點上的 其它或可選的變體結合。
由于反義分子可用于失活mRNA以便抑制基因表達，從而抑制蛋 白表達，因此分子可用于治療疾病或紊亂，例如心律不齊(例如心房 纖顫或心房撲動)和/或中風。方法可以包括用含有與mRNA中的一個或多個區(qū)域互補的核苷酸序列的核酶進行裂解，以減弱mRNA被翻譯 的能力。這樣的mRNA區(qū)域包括例如蛋白編碼區(qū)，特別是對應于蛋白 的催化活性、底物和/或配體結合位點或其它功能性結構域的蛋白編碼 區(qū)。
自從最初在線蟲(C. e/ega似)中發(fā)現以來(Fire等，A^Zww 391:806-11 (1998))，在最近的十年中，對RNA干擾(RNAi)現象的 研究非?；钴S，在近年中，也在積極推行它在治療人類疾病中的潛在 應用(綜述在Kim & Rossi, jVa&re i ev. 8:173-204 (2007)中)。
RNA干擾(RNAi)，也被稱為基因沉默，其基礎是使用雙鏈RNA分子
(dsRNA)關閉特定的基因。在細胞中，細胞質雙鏈RNA分子(dsRNA) 被細胞復合物加工成小干擾RNA (siRNA)。 siRNA指導蛋白-RNA復 合物耙向耙mRNA上的特定位點，導致mRNA的裂解(Thompson, Z>wg Z)/"ove^7b^^, 7:912-917 (2002))。典型情況下，siRNA分子長度為大 約20、 21、 22或23個核苷酸。因此，本發(fā)明的一個方面涉及分離的 核酸分子，以及將那些分子用于RNA干擾，即作為小干擾RNA分子
(siRNA)。在一個實施方案中，分離的核酸分子的長度為18-26個核 苷酸，優(yōu)選長度為19-25個核苷酸，更優(yōu)選長度為20-24個核苷酸，更 優(yōu)選長度為21、 22或23個核苷酸。
RNAi介導的基因沉默的另一個途徑源自于內源性編碼的原始微 型RNA (pri-miRNA)轉錄本，它在細胞中被加工以產生前體miRNA (pre-miRNA)。這些miRNA分子從細胞核輸出到細胞質中，在這里 經歷加工以產生成熟的miRNA分子(miRNA)，它們通過識別mRNAs 的3'非翻譯區(qū)中的耙位點，然后通過加工性P-體降解mRNA，來直接 抑制翻譯(綜述在Kim & Rossi,i ev. 8:173-204 (2007)中)。
RNAi的臨床應用包括摻入合成的siRNA雙鏈體，它們優(yōu)選大小 為20-23個核苷酸，并優(yōu)選具有2個核苷酸的3'重疊。基因表達的低是通過耙mRNA的序列特異性設計建立起來的。幾個用于這種分子
的最適設計和合成的商業(yè)化位點對于本技術領域的專業(yè)人員來說是已 知的。
其它的應用提供了較長的siRNA分子(典型長度為25-30個核苷 酸，優(yōu)選為大約27個核苷酸)，以及小的發(fā)夾RNAs (shRNAs;典型 長度為大約29個核苷酸)。后者是天然表達的，描述在Amarzguioui 等579:5974-81 (2005))中?；瘜W合成的siRNAs和shRNAs 是體內加工的底物，在某些情況下提供了比較短的設計更強有力的基 因沉默(Kim等，A^w"歷o&c/mo/. 23:222-226 (2005); Siolas等，M^w" S/o/ec/mo/. 23:227-231 (2005))。 一般來說，siRNAs提供暫時的基因表 達沉默，因為它們的細胞內濃度被隨后的細胞分裂稀釋了。相反，表 達的shRNAs介導長期的、穩(wěn)定的靶轉錄本的降低，只要shRNA的轉 錄發(fā)生就行(Marques等，7VWwre歷Wec/7"o/. 23:559-565 (2006); Bmmmelkamp等，296: 550-553 (2002))。
因為RNAi分子、包括siRNA、 miRNA和shRNA、以序列依賴性 的方式起作用，因此本發(fā)明的變體(例如與LD區(qū)塊C04相關的標記 物和單倍型，例如表5A和5B中列出的標記物)可用于設計RNAi試 劑，它們識別含有特定等位基因和/或單倍型(例如本發(fā)明的等位基因 和/或單倍型)的特定核酸分子，同時不識別含有其它等位基因或單倍 型的核酸分子。因此，這些RNAi試劑可以識別并破壞靶核酸分子。與 反義試劑相同，RNAi試劑可用作治療性藥劑(即用于關閉與疾病相關 的基因或與疾病相關的基因的變體)，但是也可以用于對基因功能進 行表征和證實(例如通過基因敲除或基因擊落實驗)。
RNAi的遞送可以通過本技術領域的專業(yè)人員已知的各種方法來 進行。使用非病毒遞送的方法包括膽固醇、穩(wěn)定的核酸-脂類顆粒 (SNALP)、重鏈抗體片段(Fab)、適體和納米顆粒。病毒遞送的方 法包括使用慢病毒、腺病毒和腺相關病毒。在某些實施方案中，siRNA分子被化學修飾以增加它們的穩(wěn)定性。這可以包括在核糖的2'位置的
修飾，包括2'-0-甲基嘌呤和2'-氟代嘧啶，它們提供了對Rnase活性的 抗性。其它的化學修飾也是可能的，并為本技術領域的專業(yè)人員所知。
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導致發(fā)生疾病包括心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中 風的增加的傾向性或風險的遺傳缺陷、或引起疾病的缺陷，可以通過 給帶有缺陷的對象施用含有修復序列的核酸片段，在遺傳缺陷的位點 處提供正常的/野生型核苷酸，來永久地校正。這樣的位點特異性修復 序列可以包含被操作以促進對象的基因組DNA的內源修復的 RNA/DNA寡核苷酸。修復序列的施用可以通過適當的載體來進行，例 如與聚乙烯亞胺復合、包裹在陰離子脂質體中、病毒載體例如腺病毒 載體、或其它適合于促進施用的核酸的細胞內攝入的藥物組合物。然 后可以克服遺傳缺陷，因為嵌合的寡核苷酸誘導正常的序列整合到對 象的基因組中，導致正常的/野生型基因產物的表達。替換是可繁殖的， 因此提供了永久性的修復和與疾病或病癥有關的癥狀的緩解。
本發(fā)明提供了鑒定可用于治療心律不齊、例如心房纖顫或心房撲 動、和/或中風的化合物或藥劑的方法。因此，本發(fā)明的變體可用作鑒
83定和/或開發(fā)治療性藥劑的靶。這樣的方法可以包括分析藥劑或化合物 調節(jié)含有至少一個本發(fā)明的變體(標記物和/或單倍型)的核酸或核酸 編碼的產物的活性和/或表達的能力。這反過來可用于鑒定抑制或改變 編碼的核酸產物的不需要的活性或表達的藥劑或化合物。用于執(zhí)行這 樣的實驗的分析方法可以在專業(yè)技術人員巳知的基于細胞的系統或無 細胞系統中進行?；诩毎南到y包括天然表達目標核酸分子的細胞， 或已經被遺傳修飾以表達某些所需核酸分子的重組細胞。
在患者中變體的基因表達可以通過含有變體的核酸序列的表達 (例如含有本發(fā)明的至少一個變體的基因，它可以被轉錄成含有至少
一個變體的RNA，并進一步翻譯成蛋白)、或通過由于變體影響了正常
轉錄本的表達水平或圖譜、例如在基因的調節(jié)或控制區(qū)域中的變體而 導致的正常/野生型核酸序列的改變的表達，來進行評估。用于基因表
達的分析方法包括直接的核酸分析(mRNA)、表達的蛋白水平的分析、 或參與途徑例如信號途徑的并行化合物的分析。此外，對于信號途徑 作出響應而被上調或下調的基因的表達，也可以被分析。 一個實施方 案包括了將報告基因例如熒光素酶與目標基因的調控區(qū)可操作連接。
在一個實施方案中，將細胞與候選化合物或藥劑相接觸，并測定 mRNA的表達，可以鑒定基因表達的調節(jié)劑。將存在候選化合物或藥 劑的情況下mRNA的表達水平與不存在化合物或藥劑的情況下的表達 水平進行比較。根據這種比較，用于治療疾病例如心房纖顫、心房撲 動和中風的候選化合物或藥劑可以被鑒定為調節(jié)變體基因的基因表達 的化合物或藥劑。當在存在候選化合物或藥劑的情況下與不存在它的 情況下相比，mRNA或編碼的蛋白的表達統計學顯著地增加時，候選 化合物或藥劑被鑒定為核酸表達的刺激劑或上調物。當在存在候選化 合物或藥劑的情況下與不存在它的情況下相比，核酸的表達或蛋白水 平統計學顯著地降低時，候選化合物被鑒定為核酸表達的抑制劑或下 調物。本發(fā)明還提供了使用通過藥物(化合物和/或藥劑)篩選鑒定到的 化合物作為基因調節(jié)劑(即基因表達的刺激劑和/或抑制劑)來進行治 療的方法。
本發(fā)明的另一方面，提供了藥物包(試劑盒)，藥物包包含治療性 藥劑，以及一套本文公開的給人類施用治療性藥劑以診斷性測試本發(fā) 明的一種或多種變體的說明書。治療性藥劑可以是小分子藥物、抗體、 肽、反義或RNAi分子，或其它治療性分子。在一個實施方案中，被鑒 定為本發(fā)明的至少一種變體的攜帶者的個體被要求服用處方劑量的治 療性藥劑。在一個這樣的實施方案中，被鑒定為本發(fā)明的至少一個變 體的純合的攜帶者的個體被要求服用處方劑量的治療性藥劑。在另一 個實施方案中，被鑒定為本發(fā)明的至少一個變體的非攜帶者的個體被 要求服用處方劑量的治療性藥劑。
伊仿對潛^性藥淑賄應游^虔絲效方法、盧M治^^遂展游方法
正如本技術領域已知的，個體對具體的療法(例如治療性藥劑或 治療方法)可能有不同的響應。藥物基因組學致力于由于藥物特性的 改變和/或藥物作用的異?；蜃兓?，遺傳變異(例如本發(fā)明的變體(標 記物和/或單倍型))是如何影響藥物響應的問題。因此，響應差異的基 礎可以部分通過遺傳學方法來確定。由于遺傳變異影響藥物響應而產 生的臨床結果，在某些個體中(例如本發(fā)明的遺傳變體的攜帶者或非 攜帶者)可能導致藥物的毒性或藥物的治療失敗。因此，本發(fā)明的變 體可以確定治療性藥劑和/或方法作用于身體的方式，或者身體代謝治 療性藥劑的方式。
因此，在一個實施方案中，多態(tài)性位點上特定等位基因或單倍型 的存在是對特定治療方式的不同、例如不同響應率的指示。這意味著 被診斷患有心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風的患者， 以及攜帶有本發(fā)明的多態(tài)性的某些等位基因或單倍型(例如本發(fā)明的有風險和保護性等位基因和/或單倍型)的患者，將對特定的治療、藥 物和/或用于治療疾病的其它療法具有較好的、或較糟的響應。因此， 標記物等位基因或單倍型的存在或不存在，可以幫助確定對患者應該 使用什么療法。例如，對于新診斷的患者來說，可以評估本發(fā)明的標 記物或單倍型的存在(例如如本文描述的通過測試源自于血液樣品的 DNA)。如果患者對標記物等位基因或單倍型陽性(也就是說存在標記 物的至少一個特定等位基因或單倍型)，那么醫(yī)生可以推薦一種特定的 療法，而如果患者對標記物的至少一個等位基因或單倍型陰性，那么 可以推薦不同的療法過程(可以包括推薦進行除了連續(xù)監(jiān)測疾病的進 展之外，不進行即時的療法)。因此，患者的攜帶者狀態(tài)可用于幫助確 定是否應該進行特定的治療方式。價值在于能夠在早期階段診斷疾病、 以選擇最適合的療法的可能性，并給臨床醫(yī)生提供關于疾病的預后/攻 擊性的信息，以便能夠使用最適合的療法。
心房纖顫和心房撲動的治療一般針對兩個主要目標(i)預防中 風和(ii)治療癥狀。
W相層像
在心房纖顫中，抗血凝是用于預防中風的選擇療法，并被表明適 合于絕大多數患有這種心律不齊的患者。唯一不強烈推薦使用抗血凝 的患者是年齡小于65歲的被認為是低風險的患者，即它們不具有器質 性心臟病，沒有高血壓、沒有以前的中風或暫時性缺血性發(fā)作史、沒 有糖尿病。該組總體來說對中風具有較低的風險，推薦使用阿司匹林 進行中風預防。對于所有其它患者來說，不論心房纖顫是永久性的、 復發(fā)突發(fā)性的還是復發(fā)永久性的，都建議使用抗血凝療法。不能歸納 出出現首次突發(fā)性心房纖顫的發(fā)作的患者應該被如何治療，而是需要 根據每個患者的個人情況來決定。即使當感覺到患有心房纖顫的患者 在使用抗心律不齊療法(控制節(jié)律)后維持了竇性心律時，也建議使 用抗血凝療法，因為這種類型的抗心律不齊療法不能影響中風的風險。^"逾/凝^/。正如上面詳細描述的，在心房纖顫中，推薦使用抗血 凝來預防心源性腦栓塞和中風。研究得最廣泛的口服抗血凝劑是華法 林，這種藥物被普遍推薦用于心房纖顫中的長期口服抗血凝治療。華 法林除了出血之外幾乎沒有副作用，但是在療法過程中需要定期仔細 地監(jiān)測血液值(以測量抗血凝的效果)?？诜寡齽╋@示出在患有心 房纖顫的患者中預防中風的前途，并且具有不需要象華法林那樣定期
監(jiān)測的優(yōu)點。但是，已經發(fā)現ximdagatran引起了無法解釋的肝損傷， 并在2006年從市場上撤回。幾種藥劑可用于靜脈內和/或皮下療法，包 括肝素和低分子量肝素(例如依諾肝素、達肝素、亭扎肝素、阿地肝 素、那屈肝素和瑞肝素)。當需要快速起始抗血凝作用，或者如果在高 風險患者中口服抗血凝療法必需被中斷、或者例如由于一系列步驟使 得在其它患者中口服抗血凝療法長于一周時，推薦使用這些藥物治療。 其它的腸胃外抗血凝劑也是可用的，但是不特別推薦用在心房纖顫的 療法中；例如因子Xa抑制劑磺達肝素和艾卓肝素、凝血酶抑制劑 lepimdin、比伐蘆定和阿加曲班以及達那肝素。
"y #拔控^。用于控制心房纖顫的癥狀的醫(yī)藥和外科療法按照 患者個體量身定做，包括使用藥物進行心率和/或節(jié)律控制、射頻切除 和/或外科手術。
/力心淳不一齊藥激。 一般來說，抗心律不齊藥劑被用于抑制心臟心 律不齊、包括心房纖顫和心房撲動特征性的心臟異常節(jié)律。抗心律不 齊藥劑的一種分類方法是Vaughan Williams分類，其中定義了五種主要 的抗心律不齊藥劑。I類藥劑是快速鈉通道阻斷劑，并基于阻斷的動力 學和強度以及他們對復極化的影響進行亞分類。Ia類型包括丙吡胺、 莫雷西嗪、普魯卡因胺和奎尼丁。 Ib類型的藥劑是利多卡因、美西律、 妥卡尼和苯妥英。Ic類型的藥劑是恩卡胺、氟卡胺、普羅帕酮、阿馬 靈、西苯唑啉和地他銨。n類型的藥劑是(3阻斷劑，它們阻斷兒茶酚胺 對p-腎上腺素能受體的效應。(3阻斷劑的例子是艾司洛爾、普萘洛爾、 美托洛爾、阿普洛爾、阿替洛爾、卡維地洛、比索洛爾、醋丁洛爾、納多洛爾、心得靜、拉貝洛爾、氧烯洛爾、噴布洛爾、噻嗎洛爾、倍 他洛爾、卡替洛爾、索他洛爾和左旋布諾洛爾。III類型的藥劑具有混 合的性質，但是總的來說是鉀通道阻斷劑，并延長復極化。該類型中 的藥物是胺碘酮、阿齊利特、溴芐銨、多非利特、替地沙米、伊布利 特、司美利特、索他洛爾、N-乙酰普魯卡因胺、鹽酸尼非卡蘭、維那 卡蘭和氨巴利特。IV類型的藥劑是鈣通道阻斷劑，包括維拉帕米、米 貝拉地爾和地爾硫卓。最后，V類型含有混雜的抗心律不齊藥物，包 括地高辛和腺苷。
心率挖虔y。心率控制的維持的藥理學測量包括P阻斷劑、鈣通道
阻斷劑和地高辛。所有這些藥物減緩了通過房室結的電傳導，并減緩 了心室速率對快速心房纖顫的反應。某些主要用于節(jié)律控制的抗心律
不齊藥物(參見下文)也減緩房室結傳導速度，因此也減緩了心室的 心率反應。這些包括某些III類型的和Ic類型的藥物，例如胺碘酮、索 他洛爾和氟卡胺。
心i 復律。從心房纖顫或心房撲動的心律復律到竇性心律，可以 使用同步直流電心臟復律來電學實現，或使用藥物例如伊布利特、胺 碘酮、普魯卡因胺、普羅帕酮和氟卡胺來完成。
心靴^
用于維持竇性心律、即心律控制的藥物，主要包括來自III、 Ia和 Ic類型的抗心律不齊藥物例子是來自III類型的索他洛爾、胺碘酮和多 非利特，來自Ia類型的丙吡胺、普魯卡因胺和奎尼丁，以及來自Ic類 型的氟卡胺和普羅帕酮。使用這些抗心律不齊藥物的治療是復雜的， 可能是危險的，應該在特別訓練過使用這些藥物的醫(yī)生的指導下進行。 許多抗心律不齊的藥物具有嚴重的副作用，只應該在特定人群中使用。 例如，Ic類型的藥物不應該用于患有冠狀動脈疾病的患者，即使它們 可以抑制心房纖顫，它們實際上可以在心房撲動中促進快速心室反應。 Ia類型的藥物在沒有結構性心臟病的患者中應該用作最后的手段。索
88他洛爾(與大部分ni類型的抗心律不齊藥物一樣)，可以導致QT間期
的顯著延長、特別是在患有腎衰的患者中，并促進了嚴重的心室性心 律不齊。索他洛爾和多非利特以及Ia類型的藥物都需要在住院患者的 基礎上開始，以監(jiān)測QT間期。盡管胺碘酮通常具有好的耐受性并被廣
泛使用，但在長期療法中，胺碘酮具有許多嚴重的副作用。
遺傳#/試_勿/ ^以直接嚴賄洽#游選^
當個體出現第一次(被診斷的)突發(fā)性心房纖顫的發(fā)作，并且或
者自發(fā)轉變成竇性心律、或者在發(fā)作后48小時內經歷了電復律或化學 復律時，開始或者不開始抗血凝療法的決定，根據所討論患者的風險 情況和管理醫(yī)生的偏好性而各不相同。這可能是難以作出的選擇，因 為對患者進行抗血凝療法對于患者的生活來說有巨大的影響。通常在 這樣的情況下選擇不進行抗血凝療法，這可能對患者沒有顯著的結果。 另一方面，患者后來可能發(fā)生中風，對其進行預防的機會因此可能錯 過了。在這樣的情況下，了解到患者是風險變體的攜帶者可能是極其 重要的，支持了抗血凝療法的開始。
在65歲以下被診斷患有心房纖顫并被認為具有低的中風風險、即 沒有器質性心臟病、沒有高血壓、沒有糖尿病并且以前沒有中風史的 個體， 一般僅僅用阿司匹林治療來預防中風，而不使用抗血凝療法。 如果這樣的患者被發(fā)現是本文描述的風險變體的攜帶者，這可以被認 為是支持了比推薦的更早開始抗血凝療法。這將是合理的考慮，因為 從心房纖顫導致的中風的結果可能是毀滅性的。
缺血性中風根據被懷疑的病因一般被分類成5種亞類；大動脈動 脈粥樣硬化、小動脈阻塞、心源性栓塞(大部分由于心房纖顫)、其它 已確定病因的中風和未確定病因(沒有發(fā)現病因或存在一種以上似乎 合理的病因)的中風。重要的是，由于心源性栓塞引起的中風具有最 高的復發(fā)率，最容易使人喪失行動能力，并與最低的存活率相關。因 此，必須不能忽視作為中風的主要病因的心房纖顫，特別是因為治療措施根據亞類而變化。因此，如果個體被診斷患有中風或暫時性缺血 性發(fā)作，并且盡管標準逐步建立，但合理的病因還沒有被鑒定出來， 那么了解到患者是風險變體的攜帶者可能是極有價值的，并且支持了 或者開始進行抗血凝治療，或者開始更具攻擊性的診斷測試，以試圖 診斷心房纖顫。
此外，本發(fā)明的標記物可用于增加臨床試驗的能力和有效性。因 此，是本發(fā)明的至少一個風險變體的攜帶者的個體、即是賦予發(fā)生心 律不齊(例如心房纖顫或心房撲動)和/或中風的增加的風險的至少一 個多態(tài)性標記物的至少一個等位基因的攜帶者的個體，可能更可能對 特定的治療方式、例如上面描述的治療方式做出響應。在一個實施方 案中，攜帶有特定的治療(例如小分子藥物)所靶向的途徑和/或代謝 網絡中的基因的風險變體的個體，更可能是治療的響應者。在另一個 實施方案中，攜帶有其表達和/或功能被風險變體改變的基因的個體， 更可能是靶向該基因、其表達或其基因產物的治療方式的響應者。本 應用可以提高臨床試驗的安全性，但是也可以增加臨床試驗證明出統 計學顯著的效能的機會，否則這種效能僅限于群體的某些亞組。因此， 這種試驗的一個可能的結果是，某些遺傳變體例如本發(fā)明的標記物和 單倍型的攜帶者，統計學顯著地可能顯示出對治療性藥劑的陽性響應， 即當按照處方服用治療性藥劑或藥物時，經歷了與心律不齊(例如心 房纖顫或心房撲動)和/或中風有關的癥狀的緩解。
另一方面，本發(fā)明的標記物和單倍型可用于指導對特定個體的藥 物試劑的選擇。利用本發(fā)明的風險變體，可以實現治療方式的個性化 選擇、生活方式的改變或二者的組合。因此，關于本發(fā)明的特定標記 物的個體狀態(tài)的信息，在靶基因或基因產物受到本發(fā)明的風險變體影 響的情況下，可用于選擇治療選項。變體的某些組合可能適合于治療 選項的一種選擇，而其它基因變體組合可以靶向其它治療選項。根據 需要，這樣的變體組合可以包括一種變體、兩種變體、三種變體或四 種或四種以上的變體，以臨床可靠的精確性確定治療模式的選擇。
90##"教溈^游/^賴
本發(fā)明還涉及本文描述的與心律不齊(例如心房纖顫和心房撲動) 和中風有關聯的多態(tài)性標記物和單倍型的計算機執(zhí)行的應用。這樣的 應用可以用于儲存、操作或分析在本發(fā)明的方法中有用的基因型數據。 一個例子涉及在可讀介質上儲存來自于個體的基因型信息，以便能夠 給第三方(例如個體)提供基因型信息，或用于從基因型數據衍生信 息，例如通過將基因型數據與關于對心律不齊(例如心房纖顫和心房 撲動)和中風的增加的易感性有貢獻的遺傳風險因子的信息進行比較， 并在這些比較的基礎上報告結果。
一種這樣的情況涉及計算機可讀介質。 一般來說，這樣的介質有 能力儲存(i)至少一個多態(tài)性標記物或單倍型的識別信息；(ii)在患
有心律不齊(例如心房纖顫和心房撲動)禾n/或中風的個體中該至少一
個標記物的至少一個等位基因的頻率、或單倍型的頻率的指示符；以 及在參比群體中該至少一個標記物的至少一個等位基因的頻率、或單 倍型的頻率的指示符。參比群體可以是無疾病的個體的群體?？蛇x地， 參比群體是來自總群體的隨機樣品，因此充分地代表了群體。頻率指 示符可以是計算出的頻率、等位基因和/或單倍型拷貝的計數、或實際 頻率的歸一化的或操作過的值，它們適合用于特定的介質。
其它關于個體的信息也可以儲存在介質上，例如血統信息、性別 信息、身體屬性或特征(包括身高和體重)、生物化學測量值(例如血 壓、血脂水平、空腹葡萄糖水平、胰島素反應測量值)、生物標記物結 果、或其它希望與特定個體的基因型狀態(tài)一起儲存或操作的有用信息。
本發(fā)明還涉及適合用于測定或操作遺傳數據的裝置，這些遺傳數 據可用于確定人類個體中對心律不齊(例如心房纖顫和心房撲動)和 中風的易感性。這樣的裝置可以包含計算機可讀存儲器，以及儲存在 計算機可讀存儲器中的用于操作數據的例行程序，以及用于產生含有遺傳數據的測量值的輸出的例行程序。這樣的測量值可以包括例如等 位基因或單倍型頻率、基因型計數、性別、年齡、表現型信息的值，
比值比(OR)或相對風險(RR)、群體可歸因風險(PAR)的值，或
其它作為原始基因型數據的直接統計數據或基于遺傳數據的計算值的 有用信息。
上述的應用都可以使用本發(fā)明的標記物和單倍型來進行實踐，這 些標記物和單倍型已經在評估對心律不齊(例如心房纖顫和心房撲動) 和中風的易感性的方法中進行了更詳細的描述。因此， 一般來說，這
些應用可以被減少到使用表5、表4、表9和表19中列出的標記物、 以及與其連鎖不平衡的標記物，來進行實施。在一個實施方案中，標 記物或單倍型出現在其序列顯示在SEQ ID NO: 50中的基因組區(qū)段中。 在另一個實施方案中，標記物和單倍型包括選自表19所示的標記物的 至少一個標記物。在另一個實施方案中，標記物和單倍型包括至少一 個選自D4S406(SEQ ID NO:45 )、rs2634073( SEQ ID NO:33)、rs2200733 (SEQ IDNO:28)、 rs2220427 (SEQIDNO: 1)、 rsl0033464 (SEQID NO:41)禾B rsl3143308 (SEQIDNO:51)的至少一種標記物，任選地包 括與其連鎖不平衡的標記物。在一個這樣的實施方案中，連鎖不平衡 由r2的數值大于0.1來定義。在另一個這樣的實施方案中，連鎖不平 衡由r2的數值大于0.2來定義。在另一個實施方案中，標記物或單倍 型含有選自標記物D4S406中的等位基因-2、 -4和/或-8、標記物 rs2634073的等位基因A、標記物rs2200733的等位基因T、標記物 rs2220427的等位基因T、標記物rsl0033464的等位基因T、和/或標記 物rsl3143308的等位基因G的至少一個等位基因。
拔虔浙豬
本文描述的核酸和多肽可用于上面描述的本發(fā)明的方法和試劑盒中。
本文使用的"分離"的核酸分子，是與正常情況下位于基因或核苷酸序列兩側(例如在基因組序列中)的核酸分開的，和/或已經從其 它轉錄的序列中(例如在RNA文庫中)完全或部分純化出的核酸分子。 例如，本發(fā)明的分離的核酸，相對于它自然發(fā)生的復雜的細胞環(huán)境、 或通過重組技術生產時的培養(yǎng)基、或化學合成時的化學前體或其它化 學物質來說，可以是基本上分離的。在某些情況下，分離的物質將形 成組合物(例如含有其它物質的粗提液)、緩沖系統或試劑混合物的 一部分。在其它情況下，物質可以被純化到例如通過聚丙烯酰胺凝膠
電泳(PAGE)或柱層析(例如HPLC)測定時基本上均一。本發(fā)明的 分離的核酸分子可以占所有存在的大分子物質的至少大約50%、至少 大約80。/?；蛑辽俅蠹s90%(摩爾數的基礎上)。對于基因組DNA來說， 術語"分離的"也可以指從與基因組DNA天然關聯的染色體分離出的 核酸分子。例如，分離的核酸分子可以含有少于大約250 kb、 200 kb、 150 kb、 100 kb、 75 kb、 50 kb、 25 kb、 10 kb、 5 kb、 4 kb、 3 kb、 2 kb、 1 kb、 0.5 kb或O.l kb的、在核酸分子所源自的細胞的基因組DNA中 位于核酸分子兩側的核苷酸。
核酸分子可以與其它編碼或調節(jié)序列融合，并仍被當作是分離的。 因此，載體中包含的重組DNA包含在本文使用的"分離的"的定義內。 分離的核酸分子也包含異源宿主細胞或異源生物體中的重組DNA分 子，以及溶液中的部分純化的或基本上純化的DNA分子。"分離的" 核酸分子也包括本發(fā)明的DNA分子的體內和體外RNA轉錄本。分離 的核酸分子或核苷酸序列可以包括化學合成的或通過重組方法產生的 核酸分子或核苷酸序列。這樣的分離的核苷酸序列可用于例如編碼的 多肽的制造、作為探針用于分離同源序列(例如從其它哺乳動物物種)、 用于基因作圖(例如通過與染色體原位雜交)、或用于檢測組織(例 如人類組織)中基因的表達，例如通過Northern印跡分析或其它雜交 技術。
本發(fā)明還涉及了在高度嚴緊雜交條件下、例如用于選擇性雜交的 條件下，與本文描述的核苷酸序列雜交的核酸分子(例如與含有本文描述的標記物或單倍型相關的多態(tài)性位點的核苷酸序列特異性雜交的 核酸分子)。在一個實施方案中，本發(fā)明包含了在在高度嚴緊雜交和清
洗條件(例如用于選擇性雜交的條件)下，與含有LD區(qū)塊C04 (SEQ ID NO: 50)的核苷酸序列的核苷酸序列雜交的變體。這樣的核酸分子 可以通過等位基因特異性或序列特異性雜交(例如在高度嚴緊條件下) 來檢測和/或分離。用于核酸雜交的嚴緊條件和方法對于專業(yè)技術人員 來說是眾所周知的(參見例如《分子生物學現代方法》(a^7TW iVo/oco/s Mo/ecw/ar BZo/ogyJ， Ausubel， F.等，John Wiley & Sons, (1998)，以及Kraus, M.和Aaronson, S., M"/w^五wzy/no/., 200:546-556 (1991)，在此以其全文引為參考)。
兩個核苷酸或氨基酸序列的百分同一性可以通過出于最適比較的 目的將序列進行比對(例如可以在第一個序列的序列中引入缺口)來 確定。然后比較相應位置上的核苷酸或氨基酸，兩個序列之間的百分 同一性是序列共有的同樣的位置的數量的函數(即％同一性=同一的 位置的數量/總的位置的數量x100)。在某些實施方案中，出于比較目 的進行比對的序列的長度是參比序列的長度的至少30%、至少40%、 至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%。 兩個序列的實際比較可以通過眾所周知的方法來進行，例如使用數學 算法。這樣的數學算法的非限制性的例子描述在Karlin， S.和Altschul， S.,AAa" ^cac/. Sc/. 7&4,卯:5873-5877 (1993)中。這樣的算法被整 合在NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中，描述在Altschul, S.等， 7V"c/e〖c 25:3389-3402 (1997)中。在使用BLAST和帶缺口
BLAST程序時，可以使用相應程序(例如NBLAST)的缺省參數。參 見萬維網ncbi.nlm.nih.gov網點。在一個實施方案中，用于序列比較的 參數可以被設置為分值=100，字長=12，或可以是不同的(例如W=5 或W=20)。
其它的例子包括了 Myers和Miller, CABIOS (1989)的算法，在 Torellis, A.和Robotti, C., Com;n^ ^ / /. B/os"',川:3-5 (1994)中描述的ADVANCE和ADAM算法；以及在Pearson, W.和Lipman, D.,Wa". 」cfld t/&4， S5:2444-48 (1988)中描述的FASTA。在另一個實施方 案中，兩個氨基酸序列之間的百分同一性可以使用GCG軟件包 (Accelrys, Cambridge, UK)中的GAP程序來完成。
本發(fā)明還提供了分離的核酸分子，它們含有的片段或一部分在高 度嚴緊條件下，與含有或包含LD區(qū)塊C04 (SEQIDNO:50)的核苷 酸序列、或含有或包含LD區(qū)塊C04 (SEQIDNO:50)的核苷酸序列 的互補序列的核苷酸序列的核酸雜交，其中核苷酸序列含有本文描述 的標記物和單倍型中包含的至少一個多態(tài)性等位基因。本發(fā)明的核酸 片段的長度為至少大約15、至少大約18、 20、 23或25個核苷酸，可 以是30、 40、 50、 100、 200、 500、 1000、 10,000個或以上的核苷酸長。
本發(fā)明的核酸片段在例如本文描述的分析方法中被用作探針或引 物。"探針"或"引物"是以堿基特異性的方式與核酸分子的互補鏈雜 交的寡核苷酸。除了DNA和RNA之外，這樣的探針和引物包括多肽 核酸(PNA)，它描述在Nielsen, P.等，Sc/e"ce 2^:1497-1500 (1991)中。 探針或引物含有與核酸分子的至少大約15個、典型為大約20-25個、 在某些實施方案中大約40、 50或75個連續(xù)的核苷酸雜交的核苷酸序 列區(qū)域。在一個實施方案中，探針或引物含有本文描述的至少一個多 態(tài)性標記物的至少一個等位基因或至少一個單倍型，或其互補序列。 在特定實施方案中，探針或引物可以含有100個或以下的核苷酸；例 如，在某些實施方案中從6到50個核苷酸，或例如從12到30個核苷 酸。在其它實施方案中，探針或引物與連續(xù)的核苷酸序列或連續(xù)的核 苷酸序列的互補序列至少70%同一、至少80%同一、至少85%同一、 至少90%同一或至少95%同一。在另一個實施方案中，探針或引物能 夠與連續(xù)的核苷酸序列或連續(xù)的核苷酸序列的互補序列選擇性雜交。 通常情況下，探針或引物還含有標記，例如放射性同位素、熒光標記、 酶標記、酶輔助因子標記、磁性標記、自旋標記和表位標記。本發(fā)明的核酸分子、例如本文描述的那些，可以使用專業(yè)技術人 員熟知的標準分子生物學技術來鑒定和分離?？梢詫U增的DNA標記
(例如放射性標記)并用作探針，篩選來自人類細胞的cDNA文庫。 cDNA可以源自于mRNA并包含在適合的載體中?？梢苑蛛x到相應的 克隆，在體內切除后可以獲得DNA，然后可以通過本技術領域現有的 方法在任一或兩個方向上對克隆的插入片段進行測序，以鑒定編碼具 有適合分子量的多肽的正確的閱讀框架。使用這些以及類似的方法， 可以對多肽和編碼多肽的DNA進行分離、測序和進一步的表征。
一般來說，本發(fā)明的分離的核酸序列在Southern凝膠中可以用作 分子量標準品，并作為被標記的染色體標記物以對相關基因位置進行 作圖。核酸序列也可用于與患者中的內源DNA序列進行比較，以鑒定 心律不齊(心房纖顫或心房撲動)和/或中風、或對心律不齊(心房纖 顫或心房撲動)禾P/或中風的易感性，以及例如作為探針用于雜交和發(fā) 現相關的DNA序列或從樣品中扣除已知的序列(例如扣除雜交)。核 酸序列還可以用于產生引物用于遺傳指紋法、使用免疫技術產生抗多 肽抗體、和/或作為抗原產生抗DNA抗體或引發(fā)免疫應答。
拔伴
還提供了特異性結合一種形式的基因產物但是不結合另一種形式 的基因產物的多克隆抗體和/或單克隆抗體。還提供了與含有多態(tài)性位 點或多個位點的變體或參比基因產物的一部分結合的抗體。本文使用 的術語"抗體"是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白的免疫活性部分， 即含有與抗原特異性結合的抗原結合位點的分子。與本發(fā)明的多肽特 異性結合的分子，是與該多肽或其片段結合、但是與樣品、例如天然 含有多肽的生物學樣品中的其它分子基本上不結合的分子。免疫球蛋 白分子的免疫活性部分的例子包括F(ab)和F(ab')2片段，可以通過用 酶例如胃蛋白酶處理抗體來產生。本發(fā)明提供了與本發(fā)明的多肽結合 的多克隆和單克隆抗體。本文使用的術語"單克隆抗體"或"單克隆 抗體組合物"是指一群抗體分子，只含有一種能夠與本發(fā)明的多肽的
96特定表位發(fā)生免疫反應的抗原結合位點。因此，單克隆抗體組合物典 型地表現出對與其發(fā)生免疫反應的本發(fā)明的特定多肽的單一結合親和 性。
多克隆抗體可以按照以前的描述通過用所需的免疫原例如本發(fā)明 的多肽或其片段免疫適當的對象來制備?？梢酝ㄟ^標準的技術隨時間 監(jiān)測被免疫的對象中的抗體滴度，例如使用固定化的多肽的酶聯免疫 吸附分析(ELISA)。如果需要，可以從哺乳動物(例如從血液)中分 離針對多肽的抗體分子，并通過眾所周知的技術例如蛋白A層析進一
步純化以獲得IgG級份。在免疫后適當的時間，例如當抗體滴度最高
時，可以從對象獲得生產抗體的細胞，用于通過標準技術制備單克隆
抗體，例如最初由Kohler和Milstein, A^w" 256:495-497 (1975)描述的 雜交瘤技術、人類B細胞雜交瘤技術(Kozbor等，/mmtmo/. 7bd">;4: 72 (1983)) 、 EBV雜交瘤技術(Cole等，《單克隆抗體與癌癥療法》
(Mowoc/(9"a/ ^W6o(i/ej1 Cawcer 77zera"y) , Alan R. Liss,1985， Inc.， 卯.77-96)或trioma技術。用于生產雜交瘤的技術是眾所周知的(一 般來說，參見《免疫學現代方法》(C"we"http://VWoco/"w/mww"o/ogy ) (1994) Coligan等主編，John Wiley & Sons, Inc., New York, NY)。簡 單來說，將永生的細胞系(典型為骨髓瘤)與用來自上述的免疫原免 疫的哺乳動物的淋巴細胞(典型為脾細胞)融合，并篩選獲得的雜交 瘤細胞的培養(yǎng)上清液，以鑒定產生與本發(fā)明的多肽結合的單克隆抗體 的雜交瘤。
多種眾所周知的用于融合淋巴細胞和永生細胞系的方案中的任何 一種都可用于產生針對本發(fā)明的多肽的單克隆抗體(參見例如《免疫 學現代方法》(Cwrewf尸raZoco/s /w扁wo/ogy^ , 同上；Galfre等， A^we 266:55052 (1977); R.H. Kenneth,《單克隆抗體生物學分析中 的新次兀》(Mo"oc/owa/ y4""6oWes.' j臉w D/wews/o" /" 勘a/戸W , Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); 以及 Lerner, Fa/e SZo/. MW. 54:387-402 (1981))。此外，普通技術人員將會認識到，這種方法的許多變化形式也將可以使用。
或者，為了制備分泌單克隆抗體的雜交瘤，可以通過用多肽篩選 重組組合免疫球蛋白文庫(例如抗體噬菌體展示文庫)，從而分離與 多肽結合的免疫球蛋白文庫成員，來鑒定和分離針對本發(fā)明的多肽的 單克隆抗體。用于產生和篩選噬菌體展示文庫的試劑盒是可商購的(例
如Pharmacia的重組噬菌體抗體系統，目錄號No. 27-9400-01;以及 StratageneSw^/ZAPTM噬菌體展示試劑盒，目錄號No. 240612)。此外， 特別適合用于產生和篩選抗體展示文庫的方法和試劑的例子可以在下 列文獻中發(fā)現，例如美國專利No. 5,223,409,PCT
發(fā)明者丹尼爾·古德布雅爾特森, 安娜·海爾格多蒂爾 申請人:解碼遺傳學私營有限責任公司