專利名稱：檢測(cè)dna序列的快速試驗(yàn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用(3-D-吡喃半乳糖普(其在糖苦鍵水解后形成水不 溶性染料)標(biāo)記的寡核普酸^r測(cè)細(xì)胞中耙DNA序列的體外方法。本
列組中的成員僅在一個(gè)預(yù)定的核苷酸位置各不相同，該方法采用(3:d-吡喃半乳糖苷(其在糖苷鍵水解后形成水不溶性染料)標(biāo)記的寡核苦 酸。此外本發(fā)明涉及所述寡核苷酸在DNA雜交方法中的應(yīng)用。最后 本發(fā)明涉及實(shí)施上述方法的試劑盒。
背景技術(shù)：
檢測(cè)生物樣本中特定的DNA序列在分子生物學(xué)領(lǐng)域具有決定性 的作用。例如在人和獸醫(yī)學(xué)實(shí)踐中通過(guò)檢測(cè)病原特異性的DNA序列 診斷了大量的感染。此外，檢測(cè)特定DNA序列的方法同樣用于鑒定 特定人類基因中的遺傳性變型。這些遺傳性變型可用作多種疾病中疾 病過(guò)程和治療應(yīng)答中的標(biāo)記物，例如在^青神病和神經(jīng)性疾病中。
通常使用擴(kuò)增技術(shù)(例如PCR或RT-PCR)在病原體診斷中檢測(cè) DNA序列，以增加樣本中含有的病原體特異性DNA數(shù)量。首先，通 常對(duì)各種患者樣本(例如血液、血清、組織等)進(jìn)行DNA純化。依 賴于所要^r測(cè)的病原體性質(zhì)，純化的DNA可從細(xì)菌細(xì)月包或所述患者 的感染組織細(xì)胞中獲得(例如，在病毒感染的情況下，其DNA整合 至感染宿主細(xì)胞的基因組DNA中)。純化的DNA隨后可用于各種擴(kuò) 增方法(采用序列對(duì)各自所要檢測(cè)的病原體特異性的引物)。
DNA雜交方法提供了另一種4企測(cè)病原體特異性DNA序列的可 能，其中通過(guò)與標(biāo)記的探針雜交檢測(cè)所定義的DNA序列是否存在。 進(jìn)行DNA雜交方法的經(jīng)典途徑是Southern印跡。在該方法中，用限 制性內(nèi)切酶斷裂后，分離自細(xì)胞或組織的DNA通過(guò)凝月交電泳分離， 轉(zhuǎn)移至膜上(例如硝酸纖維素或尼龍膜)，固定并與適當(dāng)?shù)臉?biāo)記寡核 普酸探針雜交?；蛘?，可直接將分離的DNA置于膜上，隨后雜交(點(diǎn) 印跡)。Southern印跡通常用于研究基因重排。除Southern印跡外，原位雜交也被用于病原體診斷。原位雜交表 示使用適當(dāng)?shù)奶结樦苯訖z測(cè)切片和細(xì)胞制品中的核酸序列。該方法已 在許多實(shí)驗(yàn)室中用于檢測(cè)組織切片和細(xì)胞中的病毒DNA (巨細(xì)胞病 毒、皰滲病毒等)。此外，該方法可用于分析結(jié)構(gòu)性染色體改變。
DNA雜交方法中使用的探針可以多種方法標(biāo)記，例如用熒光分子 或可通過(guò)與抗體反應(yīng)免疫;f全測(cè)的基團(tuán)標(biāo)記。雜交方法通常也需要純化 所研究的DNA。
現(xiàn)有技術(shù)中到目前為止描述的檢測(cè)DNA的方法的缺點(diǎn)在于相對(duì) 昂貴的儀器(例如PCR熱循環(huán)儀、熒光顯微鏡等)對(duì)于獲得關(guān)于所檢 測(cè)DNA序列存在的信息是必需的。此外，這些方法在相當(dāng)長(zhǎng)的延誤 (源于下游工藝)之后才能提供評(píng)價(jià)。而且，通常所述方法首先需要 純化所用的DNA,從而帶來(lái)更多的費(fèi)用和時(shí)間消耗。
因此本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供能夠可靠且重復(fù)的檢測(cè)細(xì)胞中 特定DNA序列存在的方法。進(jìn)行該方法不需要昂貴的儀器，如果可 能的話在數(shù)分鐘內(nèi)即可獲得結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明，本專利權(quán)利要求的主 題解決了上述的問(wèn)題。
現(xiàn)在令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，標(biāo)記卩-D-吡喃半乳糖苷(其在糖香鍵水解 后形成水不溶性染料)的寡核苷酸可有利地用于檢測(cè)DNA序列的雜 交測(cè)定中。在水性的環(huán)境下，所形成的染料僅在親脂結(jié)構(gòu)區(qū)域中(例 如裂解細(xì)胞的含脂質(zhì)膜)由棵眼分辨，而在水性反應(yīng)溶液中，其最初 并不導(dǎo)致可觀察的變色。因此根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)記的寡核苷酸尤其適用 于快速比色法，其中位于適當(dāng)支持物上的完全或部分裂解的原核和/ 或真核細(xì)胞被？ 1入含有本發(fā)明標(biāo)記的寡核苷酸作為探針的反應(yīng)溶液。 所述寡核苷酸與從細(xì)胞中釋放的DNA雜交后，p-D-吡喃半乳糖苷分 解，在裂解的細(xì)胞區(qū)域形成染料。例如可通過(guò)添加或釋放具有P-半乳 糖香酶活性的多肽進(jìn)行酶促影響分解。
在該快速試驗(yàn)中，在標(biāo)記的寡核苷酸與耙DNA序列雜交之前不 需要對(duì)來(lái)自各種細(xì)胞的DNA進(jìn)行純化。改為在反應(yīng)液中在(部分) 裂解的狀態(tài)下直接使用這些細(xì)胞。令人驚訝的，同樣不需要在進(jìn)行顯 色反應(yīng)之前從反應(yīng)溶液中未結(jié)合的探針中分離雜交到所述細(xì)胞DNA 上的寡核苷酸探針。溶液中探針?lè)肿拥淖杂纱嬖趦H使得反應(yīng)溶液在相 當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間延遲后才開(kāi)始顯色。因此，根據(jù)本發(fā)明提供了一種穩(wěn)定且可重復(fù)的檢測(cè)系統(tǒng)，其在數(shù)分鐘內(nèi)即可給出所尋找的DNA序列在所研 究細(xì)胞中是否存在的信息。
附圖
簡(jiǎn)述
圖l顯示了連接檢測(cè)反應(yīng)(LDR)的原理。把DNA序列(1)與 兩種寡核苦酸(2)和(3)在雜交條件下溫育。所述兩種寡核苦酸具 有至少一個(gè)末端片段(4)或(5),其與靶DNA序列充分互補(bǔ)，使 得所述寡核普酸與靶DNA序列雜交成為可能。當(dāng)與靶DNA序列(1) 在所述兩種寡核苷酸互相直接相鄰的雙鏈區(qū)域完全互補(bǔ)時(shí)，寡核苷酸 的連接和隨后由這兩種寡核苷酸組成的全序列的PCR擴(kuò)增才是可能 的。
發(fā)明描述
本發(fā)明涉及使用J3-D-吡喃半乳糖苷(其在糖苷鍵水解后形成水不 溶性染料)標(biāo)記的寡核普酸檢測(cè)特定DNA序列的方法。本發(fā)明因此 提供了檢測(cè)細(xì)胞中靶DNA序列的體外方法，包括
(a) 提供位于支持物上的細(xì)胞，其中至少部分所述細(xì)胞被裂解；
(b) 使所提供的位于支持物上的細(xì)胞與至少 一種寡核苷酸接觸， 所述寡核苷酸能與靶DNA序列雜交，其中該寡核苷酸用P-D-吡喃半 乳糖苷(其在糖苷鍵水解后形成水不溶性染料)標(biāo)記；
(c) 在所述至少一種寡核苦酸與耙DNA序列可能雜交的條件 下，孵育所述至少一種寡核苷酸；
(d) 通過(guò)水解卩-D-吡喃半乳糖苷的糖苷鍵檢測(cè)雜交產(chǎn)物，
其中支持物上存在的細(xì)胞區(qū)域中染料的形成表明細(xì)胞中存在靶 DNA序列。
根據(jù)本發(fā)明的方法涉及靶DNA序列(即具有至少部分已知的核 苷酸或石咸基序列的DNA序歹ll )的檢測(cè)。靶DNA序列例如可以是基因 或基因的一部分。所述由本發(fā)明方法檢測(cè)的耙DNA序列優(yōu)選具有長(zhǎng) 約20-20000個(gè)核苷酸，其中尤其優(yōu)選長(zhǎng)度約50、 60、 70、 80、 90、 100、 200、 300、 400、 500、 600、 1000、 5000或10000個(gè)核苷酸。本 例中核苷酸表示DNA的構(gòu)建模塊，其由磷酸、戊糖與腺嘌呤、胞嘧 咬、鳥嘌呤和胸腺嘧，定四種石威基之一組成。所述耙DNA序列可以是
7原核、真核或病毒來(lái)源的。根據(jù)選擇用于研究的靶DNA序列的存在、 不存在和具體組成可例如得出特定疾病存在的結(jié)論(例如遺傳性疾病 或傳染病)，或其可以提供能影響治療的其他過(guò)程(例如對(duì)特定的抗 生素耐性的存在)的臨床相關(guān)參數(shù)。使用本發(fā)明的方法尤其可以鑒定 生物樣本中(例如哺乳動(dòng)物組織樣本中)細(xì)菌和/或病毒來(lái)源的DNA 序列。此外，通過(guò)使用合適的探針同樣可能檢測(cè)DNA序列中的序列 偏差，例如單核苷酸多態(tài)性。
在本發(fā)明方法的第一步中，在支持物上提供所研究的假定其可能 含有要檢測(cè)的靶DNA序列的細(xì)胞(靶細(xì)胞)，其中至少部分細(xì)胞被 裂解。這表示所述細(xì)胞的外膜(在真核細(xì)胞中是核膜)被破壞，這樣 細(xì)胞內(nèi)的DNA釋放出來(lái)，從而可進(jìn)行本方法的下面的步驟。優(yōu)選地， 所述DNA是單鏈的形式。在足夠長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)，所述DNA持續(xù)附著到 支持物上，并不溶解。所研究的細(xì)胞可以是多種來(lái)源的，依賴于要檢 測(cè)的耙DNA序列的性質(zhì)。通常所要研究的靶細(xì)胞是混合樣本的形式， 其除了含有靶細(xì)胞外還含有其他類型的細(xì)胞。若能保證足夠多的靶細(xì) 胞用于本發(fā)明的方法，就不會(huì)干擾該方法。優(yōu)選地，用于本發(fā)明方法 中的細(xì)胞來(lái)自拭子，例如來(lái)自口腔粘膜的拭子。
如果要檢測(cè)的靶DNA序列是病原細(xì)菌的DNA序列，應(yīng)用于支持 物上的細(xì)胞可以是得自可能感染所述菌的患者，優(yōu)選來(lái)自人類患者的 樣本。如果要檢測(cè)來(lái)自通常寄居于鼻和/或咽部的細(xì)菌的靶DNA序列， 細(xì)胞可通過(guò)使用來(lái)自患者身體該區(qū)域的組織樣本或通過(guò)拭子的方式 以混合樣本的形式獲得(即與真核細(xì)胞一起，例如患者的粘膜細(xì)胞)。 可直接將該完整混合樣本應(yīng)用于支持物上——不必分離所述樣本中 的各種細(xì)月包。
寄居在人鼻和咽并且醫(yī)療實(shí)踐中重要的病原細(xì)菌的一個(gè)例子是 金黃色葡萄球菌(^a/7/^/oc( cct^ )。該革蘭氏陽(yáng)性微生物的某
些菌抹對(duì)許多臨床治療中重要的抗生素均具有耐性。尤其是近年來(lái)命 名為甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(MRSA)的菌林已經(jīng)成為一個(gè)嚴(yán) 重的問(wèn)題。MRSA是造成許多醫(yī)院感染的原因，其延長(zhǎng)了患者占有床 位的時(shí)間，從而大大增加了醫(yī)院的費(fèi)用。其通常通過(guò)患者或護(hù)理人員 傳播，其無(wú)癥狀的攜帶MRSA,從而無(wú)法被識(shí)別為傳染源。通過(guò)迅速 和方便的方法及時(shí)鑒別這些作為攜帶者的人員可以確保早期引入合適的衛(wèi)生措施，并且預(yù)防該菌抹傳播給患者。
MRSA菌林可通過(guò)例如咽、鼻、傷口或會(huì)陰拭子檢測(cè)。用于檢測(cè) MRSA菌抹的寡核苷酸探針可以衍生自 一 個(gè)或更多個(gè)MRSA特異性序 列。可用于特異性鑒別MRSA菌林的DNA序列對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái) 說(shuō)是公知的。根據(jù)本發(fā)明，特別優(yōu)選衍生自med基因核苷酸序列的寡 核苷酸探針，所述基因編碼修飾的青霉素結(jié)合蛋白PBP2a (Song等 (1987), FEBS Letters, 221: 167-171)。 med基因大小約2.4 kb，在不同 的菌林中可能具有輕微的序列變化。本發(fā)明范圍內(nèi)所使用的寡核普酸 探針優(yōu)選衍生自如SEQ ID NO: 2所示的med基因的核香酸序列。作 為基本上無(wú)害的有機(jī)體，例如表皮葡萄球菌(Wap/^/ococcM e/ zWerm^fo )的各種菌沖朱也同樣具有med基因，在檢測(cè)MRSA的范圍 內(nèi)，需要以平行試驗(yàn)的方式測(cè)定另一種對(duì)金黃色葡萄球菌特異性的 DNA序列。該序列可以，例如是編碼金黃色葡萄球菌某些致病因子的 DNA,例如編碼蛋白A、凝固酶、凝集因子、exofoliatin A和B或類似 的致病因子的DNA。此外，當(dāng)然可采用對(duì)表皮葡萄球菌特異的序列作 為陰性對(duì)照。
包含所研究細(xì)胞的混合樣本還可以是來(lái)自局部感染進(jìn)程的材料， 例如來(lái)自傷口 、膿腫和病變。所述材料例如可以是拭子或活檢標(biāo)本。 在封閉處理的情況下，皮膚消毒后進(jìn)行膿腫經(jīng)皮穿刺，從穿刺中獲得 的材料可通過(guò)本發(fā)明的方法4企查特定病原體的存在?？?全測(cè)的傷口內(nèi) 的細(xì)菌病原體例子包括梭菌(C/oWnWww)屬的各種類，其能引起肌 壞死(氣性壞疽)。它們包括例如產(chǎn)氣莢膜梭菌(C./ ^/H"^朋)、 敗毒梭菌(C. 'c謂)、溶組織梭菌(C. too(y"cwm ) 、 C. "ov沐 譎詐梭菌(C. /g〃gx)。在本例中所述寡核苷酸探針例如可衍生自編 碼產(chǎn)氣莢膜梭菌a毒素的基因的核苷酸序列。根據(jù)本申請(qǐng)的說(shuō)明，眾 多其他臨床相關(guān)細(xì)菌的鑒定對(duì)于所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn) 的。
在細(xì)菌病原體的DNA序列檢測(cè)中，含有要研究細(xì)胞的樣本例如也 可以是液體、尿、關(guān)節(jié)穿刺樣本、唾液或類似物。根據(jù)樣本的性質(zhì)和 來(lái)源，和/或要檢測(cè)的細(xì)菌病原體類型，在實(shí)施本發(fā)明的方法之前首先 濃縮細(xì)胞材料是必要或合理的。如果含有所要研究細(xì)胞的生物樣本是 液體，濃縮可以例如通過(guò)使用適當(dāng)孔徑的濾器過(guò)濾進(jìn)行。細(xì)胞隨后可從濾器直接轉(zhuǎn)移到支持物上。
由于細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，尤其是在革蘭氏陽(yáng)性菌的情況下，必須 在將細(xì)胞置于支持物之前或之后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解或至少部分裂解，以
從細(xì)胞中釋放對(duì)所述細(xì)菌特異的DNA 。細(xì)胞裂解例如可通過(guò)用堿性洗 滌劑處理進(jìn)行(Sambrook等.(1989); Publ.;Molecular Cloning,第二版; Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)。對(duì)于某些纟田菌例如葡
萄球菌屬的細(xì)菌，已證明首先進(jìn)行細(xì)菌細(xì)胞壁的酶解是有效的?？捎?于該目的的適當(dāng)?shù)拿割惏ɡ缛芷咸亚蚓负腿芫?。根?jù)本發(fā) 明，各種細(xì)菌中靶DNA作為質(zhì)粒還是細(xì)菌染色體的組成而存在并無(wú)關(guān) 系。
根據(jù)另 一 個(gè)實(shí)施方案，所要檢測(cè)的DNA序列可以是病毒來(lái)源的核 苷酸序列。在本例中所要檢測(cè)的DNA序列可以是游離的和/或整合到所 感染細(xì)胞的基因組中。在本發(fā)明方法的范圍內(nèi)沖企測(cè)病毒DNA對(duì)于本領(lǐng) 域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，僅考慮從可被相應(yīng)的病毒感染的區(qū)域 或患者身體組織中獲得的細(xì)胞。由于病毒通常具有細(xì)胞或組織特異 性，并不感染任何體細(xì)胞，所研究細(xì)胞的類型取決于要檢測(cè)DNA的病 毒。病毒可以是整合到感染細(xì)胞基因組中的那些，或在細(xì)胞中游離存 在的那些。靶DNA序列例如可衍生自選自包含人免疫缺陷病毒1和2 (HIV-l和HIV-2)、人T細(xì)胞白血病病毒1和2 (HTLV-l和HTLV-2)、 呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝 炎病毒(HCV) 、 EB病毒(EBV)、人乳頭瘤病毒(HPV)、水痘帶 狀皰滲病毒(VZV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、單純皰滲病毒1和2(HSV-1 和HSV-2)、人皰滲病毒8型(HHV-8，亦稱為卡波希肉瘤皰滲病毒) 和黃病毒(包括黃熱病毒、登革熱病毒、日本腦炎病毒和西尼羅病毒) 的組的病毒。然而，本發(fā)明并不限于檢測(cè)上述提到的病毒的DNA序列， 還可無(wú)任何問(wèn)題地用于在獸醫(yī)和/或人類醫(yī)學(xué)中重要的其他病毒。根據(jù) 一個(gè)實(shí)施方案，耙DNA序列是人乳頭瘤病毒的序列，優(yōu)選人乳頭瘤病 毒16或18的序列。
人乳頭瘤病毒可以游離存在和/或整合到感染細(xì)胞的基因組中。乳 頭瘤病毒感染在許多哺乳動(dòng)物中均有發(fā)生，例如人、羊、犬、貓、猴、 兔和牛。乳頭瘤病毒通常感染上皮細(xì)胞，導(dǎo)致感染部位的良性上皮或 纖維上皮瘤。乳頭瘤病毒具有宿主特異性，基于此分成不同的組。人乳頭瘤病毒(HPV)根據(jù)其DNA序列同源性進(jìn)一步細(xì)分為超過(guò)70種不 同的類型。這些類型引起不同的疾病。HPV 1、 2、 3、 4、 7、 IO以及 26-29型引起良性疣，HPV5、 8、 9、 12、 14、 15、 17和19-25以及46畫50 型引起免疫系統(tǒng)削弱的患者的病變。6、 11、 34、 39、 41-44和51-55 型引起生殖器區(qū)域和呼吸道的粘膜上的良性尖形疣。HPV16和18型具 有特別的醫(yī)學(xué)意義，因?yàn)槠湟鹕称髡衬ど掀ぐl(fā)育不良，并與高比 例的宮頸、陰道、外陰和肛管侵襲癌有關(guān)。人乳頭瘤病毒DNA的整合 被認(rèn)為是宮頸癌致癌過(guò)程中決定性的因素。人乳頭瘤病毒例如可從其 衣殼蛋白Ll和L2的DNA序列進(jìn)行^r測(cè)。因此，本發(fā)明的方法尤其適于 檢測(cè)組織樣本中的HPV16和/或18型DNA序列，以評(píng)價(jià)癌癥發(fā)展的風(fēng) 險(xiǎn)。
根據(jù)本發(fā)明，用于研究的細(xì)胞所應(yīng)用的支持物具有由一種或更多 種吸附材料組成的表面，其可以將要研究的細(xì)胞以及從其中釋放的大 分子，尤其是DNA分子，例如基因組DNA固定在表面，以防止在支持
何支持材^"都是合適的"細(xì)胞和^釋放的大分子，尤其是基^組DNA 分子在其上面固定足夠長(zhǎng)時(shí)間以允許耙DNA序列的雜交和隨后的染 料形成。適于用作根據(jù)本發(fā)明建議的方法中的支持物的材料尤其包括 多孔材料，例如纖維素或纖維素衍生物。
所述支持物可以是任何適于支持物各種應(yīng)用的形狀。例如若目的 是收集口腔粘膜細(xì)胞，則支持物例如可以是小刷頭的形式，其被適當(dāng)
設(shè)計(jì)以例如從鼻和/或咽收集細(xì)胞。這類刷子在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的， 其中包括"Omni-Swab"刷，其由Whatman GmbH公司(Dassel,德國(guó)) 市售，等等。同樣有其他供應(yīng)商(例如QIAgen, Baack Laborbedarf or Isohelix Products)提供類似的產(chǎn)品。根據(jù)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用 Omni-Swab刷從口腔粘膜中獲得拭子時(shí)，使人口腔粘膜細(xì)胞部分裂解 并不需要其他的步驟。實(shí)際上，僅取樣操作(即沿頰內(nèi)表面摩擦刷子) 足以使足量的細(xì)胞從口腔粘膜中吸附到刷子上，同時(shí)保證其至少部分 浸漬。形成核的膜也被破壞，由此釋放細(xì)胞的基因組DNA。在該操作 中，作用于粘膜細(xì)胞的基因組DNA的剪切力足夠高，使得部分的DNA 轉(zhuǎn)化成片段化、單鏈的狀態(tài)，其使得與根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)記的探針雜交 成為可能。已證實(shí)在應(yīng)用于口腔區(qū)域后，讓Omni-Swab刷干燥2-3分鐘
ii是合適的，因?yàn)槠鋵?dǎo)致細(xì)胞材料和DNA更強(qiáng)烈的吸附在刷材料上。然 而，同樣當(dāng)然可通過(guò)常規(guī)方法(其不能固定所述細(xì)胞用于后續(xù)的雜交 步驟)獲得所要研究的細(xì)胞，以及隨后將細(xì)胞置于適當(dāng)?shù)闹С治?。?如，口腔粘膜細(xì)胞可首先用常規(guī)棉簽擦拭獲得，在隨后的步驟中擦下 置于具有纖維素表面的支持物上。
根據(jù)本發(fā)明，至少部分的細(xì)胞在支持物上必須是裂解的形式，以 允許下一步驟中使用的寡核香酸與所述細(xì)胞釋放的DNA接觸。所述 DNA優(yōu)選為單鏈的形式。如上文所提到的，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知多種 裂解細(xì)菌細(xì)胞的方法。如果靶DN A序列是哺乳動(dòng)物的序列或已感染哺 乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒序列，所要研究的細(xì)胞(相應(yīng)DNA從其中釋放)是 動(dòng)物來(lái)源的。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知多種方法適于裂解動(dòng)物細(xì)胞，例如 人類細(xì)胞。與細(xì)菌細(xì)胞相反，動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有抵抗的細(xì)胞壁，因此容易 被破壞。作為真核細(xì)胞，哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有細(xì)胞核，其同樣必須破壞 以釋放哺乳動(dòng)物的基因組DNA。已發(fā)現(xiàn)，擦拭口腔粘膜時(shí)，其施加給 細(xì)胞的機(jī)械應(yīng)力足以裂解部分獲得的細(xì)胞并從細(xì)胞核中釋放基因組 DNA。其他情況下，在將細(xì)胞置于支持物之前或之后進(jìn)行促進(jìn)或造成 (部分)所述細(xì)胞裂解的額外步驟是有用的。這類措施是本領(lǐng)域技術(shù) 人員熟知的，包括例如重復(fù)凍融含有細(xì)胞的樣本，使用吸管重復(fù)吸取、 釋放含有所述細(xì)胞的溶液，添加洗滌劑和/或其他降低細(xì)胞壁完整性的 試劑，以及加熱含有所述細(xì)胞的樣本。這些措施不僅破壞了質(zhì)膜和細(xì) 胞核，通常還同時(shí)保證了單鏈DNA片段的產(chǎn)生，其可在后續(xù)的雜交反 應(yīng)中結(jié)合標(biāo)記的探針。
支持物上的細(xì)胞隨后與能與有關(guān)靶DNA序列雜交的至少 一種寡 核苦酸接觸。所述至少一種寡核苦酸在至少一個(gè)片段中具有足夠的互 補(bǔ)性以通過(guò)互補(bǔ)堿基配對(duì)與選擇的耙DNA序列穩(wěn)定作用。該稱為雜交 的過(guò)程優(yōu)選是特異性的，即用作探針的寡核苷酸在嚴(yán)格度條件下幾乎 唯一 的與預(yù)定的靶DNA序列雜交，而在相當(dāng)大程度上不結(jié)合與所述寡 核苦酸非互補(bǔ)或互補(bǔ)程度不足的DNA序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知任何 雜交測(cè)定中均存在探針與所研究DNA之間 一定程度的非特異性結(jié)合。 然而，選擇探針序列和其他雜交條件以使得探針的非特異性結(jié)合受到 顯著抑制是毫無(wú)問(wèn)題的。嚴(yán)格條件(其中幾乎只發(fā)生特異性雜交)可 例如通過(guò)使用鹽濃度O. 1 M至1 .OM的鈉或鉀離子以及pH值約7.0-8.3的鹽緩沖劑獲得。所述緩沖劑還可含有去穩(wěn)定劑例如甲酰胺。為達(dá)到嚴(yán)
格條件，溫度必須為低于寡核苷酸的熔點(diǎn)約3-8。C,優(yōu)選5-6。C。寡核 香酸的互補(bǔ)片段優(yōu)選包含約5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 22、 24、 26、 28、 30、 40或更多個(gè)核苷酸。
的實(shí)施方案，所述寡核苷酸與靶DNA序列的區(qū)域完全互補(bǔ)。
本文中，術(shù)語(yǔ)"寡核苷酸"指核普酸單體的寡聚物或多聚物。優(yōu)選 的寡核普酸是單鏈的分子形式。寡核苷酸可通過(guò)化學(xué)合成或PCR方法 制備?，F(xiàn)有4支術(shù)中已詳細(xì)描述了相應(yīng)的合成方法，包括例如公知的亞 磷酰胺(phosphoroamidite )方法。
本文中的術(shù)語(yǔ)"寡核苷酸"還包含含有經(jīng)修飾的堿基的寡聚物或多 聚物，所述經(jīng)修飾的堿基相鄰于或替換了天然存在的堿基腺嘌呤、鳥 噤呤、胸腺嘧啶、胞嘧咬和尿嘧啶。所述經(jīng)修飾的堿基包括例如5-曱 基胞嘧啶、5-羥甲基胞嗜啶、黃噪呤、次黃噪呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基腺噪呤、6-曱基鳥。票呤、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、2-硫胞嘧啶、 5-卣代尿嘧啶、5-卣代胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、 8-烷硫基腺噤呤、8-羥基腺嘌呤、8-硫腺嘌呤、烷硫基鳥嘌呤、8-羥基 鳥嘌呤、8-硫鳥"票呤、7-曱基鳥噪呤、7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤和 8-氮雜腺嘌呤、7-去氮鳥嘌呤、7-去氮腺嘌呤、3-去氮鳥嘌呤和/或3-去氮腺嘌呤。
優(yōu)選的，所述寡核苷酸由經(jīng)磷酸二酯鍵橋連接在一起的核苷酸單 體組成。然而，也可以采用糖-磷酸骨架由功能性類似結(jié)構(gòu)替換的寡聚 物或多聚物，例如肽骨架或磷酰胺、硫代磷酸鹽、甲基膦酸鹽或二硫 代磷酸鹽骨架。而且，具有一個(gè)或更多個(gè)修飾的糖殘基的寡核苷酸也 在本發(fā)明范圍內(nèi)。例如， 一個(gè)或更多個(gè)羥基基團(tuán)可被卣素或脂肪族基 團(tuán)取代，或其可以被醚類、胺類或類似的結(jié)構(gòu)功能化。
根據(jù)本發(fā)明，所述寡核苷酸可以是任何長(zhǎng)度，尤其優(yōu)選所述寡核 苷酸具有約6-50個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，例如IO、 12、 14、 16、 18、 20、 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48或50個(gè)核普 酸長(zhǎng)度。用作寡核苷酸探針的寡核苷酸還可包含超過(guò)50個(gè)核苷酸，例 如60、 70、 80、 90或100個(gè)核苷酸。寡核苷酸的長(zhǎng)度和組成取決于各靶DNA序列的組成以及雜交測(cè)定的條件，例如離子強(qiáng)度(其由所使用 的緩沖劑決定)等。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)文獻(xiàn)可充分獲知這些參數(shù)。
根據(jù)本發(fā)明，用作探針的寡核苷酸用(3-D-吡喃半乳糖普標(biāo)記。本 文中，(3-D-吡喃半乳糖苷指由一個(gè)半乳糖殘基和一個(gè)糖普配基 (aglyconic)發(fā)色殘基組成的分子，其通過(guò)p糖普鍵連接。p糖苷鍵可 通過(guò)水解解離，例如酶促水解。水解過(guò)程中形成水不溶性染料，其作 為沉淀物沉降下來(lái)。現(xiàn)有技術(shù)中描述了水解后形成的不溶性染料沉淀 物的各種(3-D-吡喃半乳糖苷。這些p-D-吡喃半乳糖普可在本發(fā)明方法 的范圍內(nèi)用于標(biāo)記寡核苷酸探針。
根據(jù)本發(fā)明，尤其優(yōu)選用于標(biāo)記寡核苷酸探針的P-D-吡喃半乳糖 苷是吲哚基-(3-D-吡喃半乳糖苷。吲哚基-(3-D-p比喃半乳糖苷在本文中 定義為半乳糖殘基通過(guò)(3糖苷鍵與吲咮基殘基連接的化合物。吲咮基 殘基形成負(fù)責(zé)染料形成的發(fā)色殘基，因此，這些優(yōu)選的(3-D-吡喃半乳 糖普具有以下通式結(jié)構(gòu)。
吲哚殘基可以在環(huán)系統(tǒng)的一個(gè)或更多個(gè)位置被取代。例如，雜環(huán) 吲哚基團(tuán)C-H鍵的一個(gè)或更多個(gè)氫原子可被鹵素原子(例如氯、溴或 碘原子取代)。此外，與吲哚氮結(jié)合的氳也可被取代，例如被烷基諸 如曱基、乙基或丙基所取代。
根據(jù)一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，所述吲哚基-P-D-吡喃半乳糖苷是 5一溴-4-氯-3-p引咮氧基-(3-D-吡喃半乳糖苷，其由不同的廠家按名稱 x-Gal才是供(例^口Fermentas， St. Leon-Rot,《老、國(guó)；Invitrogen, Karlsruhe, 德國(guó))。5-溴-4-氯-3-p引哚氧基-(3-D-吡喃半乳糖苷以用于所謂的藍(lán)白篩 選而著稱。無(wú)色的x-Gal可通過(guò)P-半乳糖苷酶作用水解為5-溴-4-氯-吲 咮酚。在空氣中氧存在下，5-溴-4-氯J引哚酚氧化成水不溶的藍(lán)色染料
14(5,5，-二溴-4,4，-二氯靛藍(lán))。
其他結(jié)構(gòu)與x-Gal類似的吲哚基-(3-D-吡喃半乳糖普包括例如N-甲 基-吲哚基-P-D-吡喃半乳糖苷、5-碘-3-吲哚基-p-D-吡喃半乳糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚基-(3-D-吡喃半乳糖苷和6-氯-3-吲哚氧基-(3-D-吡喃半乳 糖普。這些化合物已由例如GENTAUR-BIOXYS, Brussels,比利時(shí)，市 售。GENTAUR-BIOXYS生產(chǎn)的名為Green-b-D-gal的吡喃半乳糖苷N-甲基吲哚基-(3 - D -吡喃半乳糖苷水解后形成綠色染料沉淀物。 GENTAUR-BIOXYS生產(chǎn)的名為Purple-b-D-gal的吡喃半乳糖苷5-碘-3國(guó) 吲哚基-P-D-吡喃半乳糖苷水解后形成紫色染料沉淀物。 GENTAUR-BIOXYS以Red-b-D-gal市售的5-溴-6-氯-3- P5I咮基-卩-D-吡 喃半乳糖普形成紅色沉淀，而名為Rose-b-D-gal的6-氯-3-。引咮氧基 -p-D-吡喃半乳糖苷則產(chǎn)生粉色沉淀。
除了吲咪基-(3-D-吡喃半乳糖苷外，其他水解后形成可檢測(cè)的水不 溶性非彌散型復(fù)合物的(3-D-吡喃半乳糖普也是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知 的。這類化合物包括例如環(huán)己酮七葉亭-P-D-吡喃半乳糖苷和8-羥基喹 啉-P-D-吡喃半乳糖苷，其在鐵離子的存在下形成黑色不溶性復(fù)合物。 現(xiàn)有技術(shù)中描述了這些化合物的制備(James等，Appl. and Env. Microbiol. (1996)， 62，第3868-3870頁(yè))。另 一個(gè)可用于本發(fā)明方法的化 合物是對(duì)-萘酚苯(naphtholbenzein ) -|3-0-吡喃半乳糖苷，其在糖苷鍵 水解后形成不溶性的粉色染料(James等，Appl. and Env. Microbiol. (2000), 66,第5521-5523頁(yè))。顯然，與上述的(3-D-吡喃半乳糖苷各個(gè) 基團(tuán)或取代基的取代不同的化合物同樣被本發(fā)明所覆蓋。
寡核苷酸探針的(3-D-吡喃半乳糖苷標(biāo)記通過(guò)使相應(yīng)的(3-D-吡喃半 乳糖苷與寡核苷酸偶聯(lián)進(jìn)行。現(xiàn)有技術(shù)中描述了偶聯(lián)的方法，其屬于 本領(lǐng)域技術(shù)人員的平均能力范圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明，尤其優(yōu)選偶聯(lián)在核 苷酸的磷酸殘基和P-D-吡喃半乳糖苦的糖環(huán)上的羥基間進(jìn)行。此外， 偶聯(lián)可由多家商業(yè)供應(yīng)商進(jìn)行(SEQLAB, G6tingen，德國(guó)；MWG Biotech AG， Ebersberg, 德、國(guó) ；Metabion International AG, Planegg-Martinsried,《急國(guó))。
根據(jù)本發(fā)明方法的步驟c)中，所述至少一種寡核苷酸在其與靶 DNA序列可能雜交的條件下孵育。影響互補(bǔ)DNA序列雜交的條件包括 所使用反應(yīng)批次中的離子強(qiáng)度、雜交反應(yīng)過(guò)程中孵育溶液的溫度、以件。相應(yīng)的參數(shù)詳述于文獻(xiàn)中(Sambrook等.(1989);Publ.; Molecular Cloning, 2nd edition; Cold Spring HarborLaboratory Press, New York》 孵育可進(jìn)行數(shù)分鐘，例如5-15分鐘，或最長(zhǎng)至數(shù)小時(shí)(例如12-18h)。
在寡核苷酸探針與靶DNA序列雜交的過(guò)程中，選擇合適的溫度是 尤其重要的。這表示反應(yīng)批次應(yīng)當(dāng)在足夠高的溫度下孵育，以防止所 述至少一種寡核苷酸與支持物上細(xì)胞DNA的非特異性結(jié)合。然而，溫 度不能超過(guò)所述寡核苷酸的熔點(diǎn)，否則寡核苷酸不能結(jié)合預(yù)定的靶 DNA序列。寡核苦酸的熔點(diǎn)Tm定義(在定義的離子強(qiáng)度、pH值和DNA 濃度下)為50。/。平衡狀態(tài)下的寡核苷酸與靶DNA序列雜交的溫度。熔 點(diǎn)的計(jì)算是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可用于建立所述方法的最佳溫度 范圍。其可以由方程Tm-(A+T)x2。C + (G+C)x4。C粗略的估計(jì)。在 本例中，本發(fā)明范圍內(nèi)使用的寡核苷酸熔點(diǎn)根據(jù)與靶序列互補(bǔ)的寡核 普酸區(qū)域而建立。這表示僅與靶序列發(fā)生互補(bǔ)堿基配對(duì)的區(qū)域用于計(jì) 算熔點(diǎn)。這樣，在本發(fā)明方法的范圍內(nèi)，也可以使用具有與靶DNA序 列無(wú)互補(bǔ)性的區(qū)域的寡核苦酸。僅使用與相應(yīng)的靶序列互補(bǔ)區(qū)域雜交 的寡核普酸區(qū)域計(jì)算是重要的。 一價(jià)陽(yáng)離子濃度(例如Na+)和雙鏈 去穩(wěn)定劑濃度(例如曱酰胺)對(duì)于Tm值來(lái)說(shuō)也是決定性的。
如已經(jīng)提到的，在本發(fā)明的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，寡核普酸探針與靶DNA 序列雜交反應(yīng)后不必從未結(jié)合的寡核苷酸探針中分離結(jié)合的寡核苷 酸探針。未結(jié)合的寡核普酸僅導(dǎo)致反應(yīng)溶液在最長(zhǎng)達(dá)15分鐘的延遲后 顯色。相反，與細(xì)胞的DNA結(jié)合的寡核苷酸引起了即刻的顯色反應(yīng)。 因此，根據(jù)本發(fā)明可在相同反應(yīng)批次中連續(xù)進(jìn)行所述方法的步驟(b) 至(d)，而不需要中間步驟，例如分離未結(jié)合的探針。
步驟d)中形成的雜交產(chǎn)物，即標(biāo)記的寡核苷酸和靶DNA序列的 DNA雙鏈體的檢測(cè)通過(guò)水解與寡核苷酸偶聯(lián)的p-D-吡喃半乳糖苷的 糖普鍵進(jìn)行。水解優(yōu)選由具有(3-半乳糖苷酶活性的多肽催化。所述多 肽可在雜交步驟完成后加入到反應(yīng)批中，或可在該時(shí)間點(diǎn)釋放至反應(yīng) 批中。P-半乳糖苷酶活性在本文中表示能切割半乳糖殘基和與之連接 的糖苷配基殘基之間P-糖苦鍵的酶活性。優(yōu)選的，所述(3-糖苷鍵是包 括半乳糖殘基碳原子l的鍵(例如乳糖中的P-l-4-糖普鍵)。所述多肽切割半乳糖殘基和與之連接的糖苷配基殘基之間P-糖苦鍵的能力可通
過(guò)在合適的條件下(緩沖劑、pH值等)用底物例如x-Gal孵育該多肽 進(jìn)行驗(yàn)證。
現(xiàn)有技術(shù)中描述了大量來(lái)自原核和真核有機(jī)體的具有(3-半乳糖苦 酶活性的酶類。根據(jù)一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，所述具有p-半乳糖苦 酶活性的多肽是來(lái)自大腸桿菌(五sc/^n'cA^ co//)的(3-半乳糖苷酶或 其變體或活性片段。來(lái)自大腸桿菌的(3-半乳糖普酶的氨基酸序列如 SEQIDNO: l所示。此外，才艮據(jù)本發(fā)明還包括SEQ ID NO: l所示多 肽的變體，所述多肽的酶活性片段及其變體。多肽的變體應(yīng)當(dāng)理解為 與SEQ ID NO: 1所示多肽的氨基酸序列有 一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代而 不同的那些多肽。所述氨基酸取代可以是保守性或非保守性的氨基酸 取代?；旧?，SEQ ID NO: l所示氨基酸序列的任何氨基酸殘基均可 被其他氨基酸取代，只要該取代不導(dǎo)致酶活性的完全喪失。通常，SEQ ID NO: l所示多肽的變體與SEQ ID NO: l所示的序列具有顯著的匹 配度，優(yōu)選的氨基酸同一性為大于60% 、 70%、 80%、 90%或大于95 %。優(yōu)選的，所述氨基酸序列同一性為大于96% 、 97%、 98%或99%。
變體還包括與SEQ ID NO: l所示多肽區(qū)別在于一個(gè)或更多個(gè)附加 的氨基酸的多肽。這些附加的氨基酸可位于SEQIDNO: l所示序列內(nèi) 部(插入)或連接于所述多肽的一端或兩端。插入原則上可發(fā)生在SEQ ID NO: l所示多肽的任何位置，只要該取代不導(dǎo)致所述多肽酶活性的 完全喪失。尤其優(yōu)選C末端和/或N末端連接有一個(gè)或更多個(gè)附加氨基 酸的變體。因此術(shù)語(yǔ)變體還包括融合多肽，其中SEQIDNO: l所示多 肽與允許異源表達(dá)中純化所述蛋白的側(cè)翼序列融合。所述序列的例子 包括組氨酸模塊，例如6xHis標(biāo)簽，其通過(guò)與固定的鎳離子的親和性 而允許純化所述融合多肽，或蛋白A (來(lái)自金黃色葡萄球菌的一種細(xì) 菌細(xì)胞壁蛋白，具有與G類免疫球蛋白(IgG) Fc區(qū)域的特異親和力) 的區(qū)域。其他可用于純化融合多肽的側(cè)翼序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知 的。
其他被認(rèn)為是SEQ ID NO: l所示多肽變體的多肽是那些與SEQ ID NO: l所示多肽相比缺失一個(gè)或更多個(gè)氨基酸的多肽。此類缺失涉 及SEQIDNO: l序列的任何氨基酸位置，只要所述取代不導(dǎo)致酶活性 的完全喪失。本發(fā)明還包括SEQ ID NO: l所示多肽及其如上文所定義的變體的 酶活性片段。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，片段包括與SEQIDNO: l所示多肽 及其變體相比區(qū)別在于在所述肽或多肽的N末端和/或C末端缺失一個(gè) 或更多個(gè)氨基酸的肽或多肽，其中至少部分的酶活性被保留。
根據(jù)本發(fā)明，還包括SEQIDNO: l所示多肽或其變體的衍生物。 在本例中，衍生物是相對(duì)于SEQIDNO: l所示多肽或其變體具有結(jié)構(gòu) 修飾，例如修飾的氨基酸的多肽。根據(jù)本發(fā)明，這些修飾的氨基酸可 以是巳通過(guò)天然過(guò)程(例如加工或翻譯后修飾)或本領(lǐng)域公知的化學(xué) 修飾方法改變的氨基酸。根據(jù)本發(fā)明，所述多肽之一的氨基酸的典型 修飾包括磷酸化、糖基化、乙?；?、酰化、分枝、ADP-核糖基化、交 聯(lián)、二硫鍵形成、曱?；?、羥化、羧化、曱基化、脫曱基化、酰胺化、 環(huán)化和/或與磷脂酰肌醇、脂質(zhì)或黃素共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合。這類修飾廣 泛的描述于相關(guān)文獻(xiàn)例如Proteins: Structure and Molecular Properties, T. Creighton, 2nd edition, W. H. Freeman and Company, New York (1993)中。
優(yōu)選的，SEQIDNO: l所示多肽的變體或衍生物或所述多肽的酶 活性片段具有最高達(dá)75% 、優(yōu)選最高達(dá)80%、 85%、 90%、 95%或甚 至最高達(dá)99。/。的SEQIDNO: l所示多肽的活性。
除了特別提到的來(lái)自大腸桿菌的P-半乳糖苷酶外，任何具有P-半 乳糖苷酶活性的其他原核和真核酶類均可在本發(fā)明公開(kāi)的方法范圍 內(nèi)使用?，F(xiàn)有技術(shù)已知大量的分離自原核生物的(3-半乳糖苷酶類。細(xì) 菌P-半乳糖苷酶的例子包括例如那些分離自蠟狀芽孢桿菌(5 "7/w cerews ) 、 p耆石威芽孑包斥干菌CSac〃/ws /m/o(iwraws)、 巨大芽孑包4干菌CSac〃/ws wegfl^n'wm)、 4古草芽孑包4干菌CSflc〃/w51 5^6"7z'51)、玉不^R芽孑包4干菌CSac77/w51 c/rcw/aws)、 吝'L酸孝LJ求菌(/fl"ococct^ /ac"51)、 嗜酸享L才干菌(/gc/o6oc/〃w acWo/ /n7ws)、 德、氏享L 4干菌(/a"o6ac〃/ws c/e/6n/ecA:z7)、 天藍(lán)色鏈審菌 (iSVrepfomjces coe"co/or)、脆4茍4以^干菌(5a"ero/c^y/ragz7/s)、，支纟吉才亥^f卩 爾森氏菌(yer57'm'a / 5^i^/c^"6en:"/057、)、 鼠疫耶爾森氏菌(J^r57'm'a 戶eW力、大西洋假別單胞菌CPset^oa/^ramo"os W/a""ca)、胡蘿卜軟腐 歐文氏菌(￡VvW"Za caro/ovora )、卩耆^;棲^(菌(77ienww51 Aermo/ /n7us)、 野油菜黃單胞菌(Z(m^omowos cam/ e"n'力、酸熱月旨環(huán)酸桿菌 (J/一c/o6a"7/i^ a"WocaWan.—、 唾液乳酸桿菌(丄a"o6ac〃/i^sa"van'w力、麥?zhǔn)辖惶鎲卧掳?J/^廠cwio"ay mac/eod")、 海；賓赤纟田菌 (五0^w&"er /"ora/")、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(C/oWnW/wm pez/n'"gew )、拜氏梭狀芽孑包桿菌(C/oWnWwm Z e(/en'wcA:0 、杣爛弧 菌(P7Z n'o 5T /ewA't/i^)、 陰溝腸才干菌(五w"ro6a"er c/oacae)、 屎腸5求菌 (五她rococcws/aecz'聽(tīng))、創(chuàng)傷弧菌(vw/my cm)、石克碌礦硫化葉菌 (iSw^/b/o6^y so(/J^an,ct/51 )、 青春只又4支4干菌(5(/ do6ac&n^m ado/escewfc)、 肺炎鏈球菌(iSVr一ococcw / we謂om'ae)、 mathranii熱厭 氧4干菌(T7zermoawaero6ac^r maZ/^aw" ) 、 "f五其斤氏火3求菌(尸少rococcw51 woe"/)、 geothermalis異常J求菌(Z)e^ococcz^ geoAerma/k)、 海才西熱^包 菌(772mwc^oga m"W"ma)、 abyssi熱球菌(尸jvrococcw51 a6;^/)、 激烈 SA玉求旨(i^y^ococcw^y^^7'osw51) 、 ^4唐*A ^f" #纟,f旨(Ga/c^ce//w/o>s7'^w/^o^ sacc/mro/,'ci^s )、豬鏈球菌(5Vr一ococcw51纖's)或苛養(yǎng)木軒菌(々/e〃a y^"Wosa )。
此外，也可以使用植物來(lái)源的(3-半乳糖苷酶，例如分離自鼠耳芥 (y4raZ zWo/757'"/m/Zawa )、 稻(O，a虛z'va)、 番木瓜(G2n'ca/ a/ a;;a)、 石刁4白(Js/ an2gw51 oj^c7'wg/^s)、,束祐又(Cfl/ Wci/m 、 芒果
(Mawgz/era zWZca)、 西紅柿(丄少co/ er57'cow escw/^Mm)、 鷹嘴豆(C7cer
; eraz'ca)或?qū)m燈百合OSawdewom'a awra""aca)的已經(jīng)4苗述了其序歹'J的那 些。來(lái)自真菌的適當(dāng)酶類包括來(lái)自變灰青霉菌CPem'"7/z'wm caw^cew)、 黑曲霉菌(y45/ erg〃/1^ m'ger)、》因曲霉菌(y^/ erg〃/w51 /wmfga^^)、海藻曲 霉菌C^/ e/^77/w51 p/zoem'c^)、 瑞氏木霉菌(場(chǎng)/ ocrea yecon7za)或疏棉狀 嗜熱絲孢菌(77^rwom少c^ /awwgz72as""的P畫半乳糖苷酶。
此外，還可以采用來(lái)自動(dòng)物有機(jī)體的(3-半乳糖苦酶，尤其是分離 自哺乳動(dòng)物，例如犬、大鼠、小鼠或靈長(zhǎng)類組織的那些。上述所列的
P-半乳糖苷酶可分離自相關(guān)有機(jī)體或在其他有機(jī)體中重組表達(dá)。
當(dāng)然，也可以使用這些p-半乳糖苷酶的活性片段、變體或衍生物，
其中術(shù)語(yǔ)活性片段、變體和衍生物應(yīng)按照上文有關(guān)SEQIDNO: l中給
出的定義類似地理解。
除了 P-半乳糖普酶活性外，用于切割糖苷鍵的多肽還可以具有其
他酶功能，例如在雙功能融合多肽的情況下(例如參見(jiàn)Bulow， Eur J
Biochem (1987), Vol. 163,第443-448頁(yè))。所述至少一種寡核苷酸與來(lái)自細(xì)胞的靶DNA序列雜交足夠長(zhǎng)時(shí) 間后，具有(3-半乳糖苷酶活性的多肽被加入或釋放到反應(yīng)批中。這可 以通過(guò)例如吸取相應(yīng)的酶活性多肽(任選在適當(dāng)?shù)臐饪s》爰沖液中)至 反應(yīng)批中完成。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特別的實(shí)施方案，所述酶活性的多 肽以蠟珠的形式加入到反應(yīng)批中，其中所述蠟具有比用于雜交的溫度 更高的熔點(diǎn)。因此在雜交的步驟中無(wú)酶活性多肽釋放。所述探針與輩巴 DNA序列雜交完成后，升高反應(yīng)混合物的溫度，這樣蠟珠熔化，酶活
的寡核苷酸的熔點(diǎn)^否則寡核苷酸將由于高溫從其靶序:上解離。
卩-D-吡喃半乳糖苷的糖苷鍵水解切割完成后，水不溶性染料開(kāi)始 形成并沉淀。染料在支持物上的親脂結(jié)構(gòu)區(qū)域沉淀(例如在裂解細(xì)胞 區(qū)域、細(xì)胞膜等)，這樣支持物上的這些區(qū)域被染色。染色可通過(guò)視 覺(jué)檢查檢測(cè)。染色表明靶DNA序列存在于支持物上的細(xì)胞內(nèi)。
上述的方法特別可用于鑒定其他位置已知的DNA序列的預(yù)定位 置的未知的核苷酸，例如在人和非人哺乳動(dòng)物的染色體DNA中檢測(cè)單 核苷酸多態(tài)性。單核苦酸多態(tài)性(SNP)是哺乳動(dòng)物中的最常見(jiàn)序列 變化。單核苷酸多態(tài)性中，DNA分子的特定片段(例如基因)中存在 單個(gè)核苷酸的替換。在人類基因組中，大約每1000個(gè)堿基對(duì)就發(fā)現(xiàn)一 個(gè)單核苷酸多態(tài)性。如果該取代位于基因的編碼區(qū)域，其可以導(dǎo)致所 編碼的多肽中氨基酸的取代。因此，單個(gè)核苦酸的取代可帶來(lái)所研究 的個(gè)體嚴(yán)重的生理學(xué)后果。已描述單核普酸多態(tài)性與大量疾病有關(guān)， 例如阿爾茨海默病、囊性纖維化、粘液粘稠病、杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良、 亨廷頓舞蹈癥、鐮刀狀細(xì)胞貧血癥和惡性體溫過(guò)高。此外，單核苷酸 多態(tài)性在藥物過(guò)敏反應(yīng)(例如對(duì)卡馬西平)和史蒂文斯-約翰遜綜合征 (中毒性表皮壞死松解癥)中具有重要作用。而且，單核苷酸多態(tài)性 還可影響生殖醫(yī)學(xué)中對(duì)卯巢刺激的響應(yīng)和慢性阻塞性肺病中對(duì)|3-腎上 腺素能藥物的響應(yīng)。
現(xiàn)有技術(shù)已知多種檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的不同方法。通常所應(yīng)用 的方法是基于對(duì)患者基因組DNA序列中含有所述單核苷酸多態(tài)性的 區(qū)域的擴(kuò)增。Langegren和Hood在US 4988617中描述了 ^r測(cè)單核普酸 多態(tài)性的一種巧妙方法。該方法在本領(lǐng)域內(nèi)稱為連接檢測(cè)反應(yīng) (LDR)。該方法基于兩種寡核苷酸與靶DNA序列的雜交，其中所述兩種寡核苷酸相互直接相鄰地與靶DNA序列雜交，隨后通過(guò)連接酶連 接。連接所形成的更長(zhǎng)的寡核苷酸通過(guò)PCR檢測(cè)，其中僅所述兩種寡 核普酸發(fā)生連接時(shí)形成PCR產(chǎn)物。僅僅當(dāng)所述寡核苦酸相鄰末端區(qū)域 具有與耙DNA序列的完全堿基配對(duì)時(shí)，所述連接才會(huì)發(fā)生。然而，如 果在寡核苷酸之一 的該區(qū)域內(nèi)沒(méi)有與靶DNA序列的堿基配對(duì)(例如由 于靶DNA序列中存在單核普酸多態(tài)性)，則寡核苷酸不會(huì)發(fā)生連接， 從而沒(méi)有PCR產(chǎn)物可擴(kuò)增。基于該原則，通過(guò)使用根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)記 的寡核苷酸，可以設(shè)計(jì)快速試驗(yàn)方法，其在數(shù)分鐘內(nèi)提供各個(gè)單核香 酸多態(tài)性存在的信息，而不需要借助于PCR或其他昂貴的檢測(cè)方法。
根據(jù)本發(fā)明的 一 個(gè)特別的實(shí)施方案，提供了從一 組DNA序列中檢 測(cè)靶DNA序列的體外方法，所述序列組成員之間的區(qū)別在于僅 一 個(gè)預(yù) 定的核苦酸位置不同。該方法包括
(a) 提供位于支持物上的細(xì)胞，其中至少部分所述細(xì)胞被裂解；
(b) 使支持物上的細(xì)胞與第一和第二寡核苷酸接觸，至少其中 一種寡核普酸用p-D-吡喃半乳糖普(其在糖苷鍵水解后形成水不溶性 染料)標(biāo)記，并且其中選擇所述寡核苷酸，使得
(i) 在各種情況下它們可通過(guò)末端的片段以使得所述兩種末
其中靶DNA序列預(yù)定位置的核苷酸與第一寡ii酸末端片段的核苷 酸形成互補(bǔ)堿基配對(duì)，以致于
(ii) 對(duì)于所述兩種末端片l爻與DNA序列組中另一 DNA序 列的雜交，由于所述DNA序列預(yù)定位置的核苷酸與所述第一寡核苷 酸末端片段的核普酸缺乏互補(bǔ)堿基配對(duì)，所述第一寡核苷酸的末端片 段的末端核普酸不能與該DNA序列雜交，這樣所述兩種末端片段的 末端核苦酸不會(huì)相互直接相鄰地排列；
(c) 在所述兩種寡核普酸與靶DNA序列可能雜交的條件下孵育 所述兩種寡核苦酸；
(d) 使兩種雜交的寡核苷酸與連接劑接觸，僅若所述末端片段 的兩個(gè)末端核苷酸相互直接相鄰排列時(shí)，所述連接劑才將它們連接形 成連接產(chǎn)物；
(e) 加熱反應(yīng)批至某一溫度，在該溫度下標(biāo)記的非連接的寡核苷 酸從耙DNA序列上脫離，并且連接產(chǎn)物維持與靶DNA序列雜交；(f)通過(guò)水解P-D-吡喃半乳糖苷的糖苦鍵檢測(cè)與乾DNA序列雜 交的連接產(chǎn)物；
其中在支持物上細(xì)胞區(qū)域中染料的形成說(shuō)明細(xì)胞中存在靶DNA序列。
所檢測(cè)的靶DNA序列優(yōu)選為基因或基因的部分。根據(jù)一個(gè)特別 優(yōu)選的實(shí)施方案，其為人基因或其部分的序列。根據(jù)本發(fā)明，靶DNA 序列是完全或部分已知的。這表明至少預(yù)定的核苷酸位置周圍區(qū)域其 核苷酸或堿基序列是已知的，這樣可制備與該區(qū)域雜交的相應(yīng)的寡核 苷酸。該方法用于將靶DNA序列從其他與之區(qū)別在于至少一個(gè)、優(yōu) 選正好一個(gè)預(yù)定的核苷酸位置(即一個(gè);威基)的其他DNA序列中區(qū) 分出來(lái)。術(shù)語(yǔ)"預(yù)定的"在本文中表示多種DNA序列之間區(qū)別的位置 就其在DNA序列中的定位來(lái)說(shuō)是已知的。靶DNA序列優(yōu)選具有長(zhǎng)度 為約20-20000個(gè)核苷酸，其中尤其優(yōu)選長(zhǎng)度為約50、 60、 70、 80、 90、 100、 200、 300、 400、 500、 600、 1000、 5000或10000個(gè)核普酸。
DNA序列組的成員可以例如是人基因的不同等位變體。例如如果 檢查特定的人基因序列，其相關(guān)編碼序列在已知的位置具有單個(gè)可變 的位置，則理論上除了野生型序列外，還可能存在其他三種序列變體， 其中每種在該位置具有具有另一種堿基的核苷酸。這表示耙DNA序 列和該三種變體序列組成一組，其成員與該組其他成員之間的區(qū)別正 好在于一個(gè)預(yù)定的核苦酸位置不同。
此外，支持物上提供的細(xì)胞(其中至少部分細(xì)胞被裂解，這樣 DNA從細(xì)胞中釋放出來(lái)，附著于支持物上)作為所述方法的起點(diǎn)。優(yōu) 選的，所述DNA是單鏈的形式。細(xì)胞優(yōu)選來(lái)自哺乳動(dòng)物，例如人類， 而所述方法使用身體的何種細(xì)胞無(wú)關(guān)緊要。由于檢測(cè)哺乳動(dòng)物體內(nèi)每 個(gè)細(xì)胞基因組DNA中待鑒定的核苷酸(例如單核普酸多態(tài)性)是可 能的，所述方法可選擇特別易于裂解和/或特別容易獲得的細(xì)胞。所述 細(xì)胞可以是粘膜細(xì)胞，優(yōu)選人粘膜細(xì)胞。特別優(yōu)選人口腔粘膜細(xì)胞。 上文中所述材料可用作支持物，特別優(yōu)選使用"omni-Swab"刷或類似產(chǎn)品。
支持物上提供的細(xì)胞與第 一和第二寡核苷酸接觸，其中至少一種 用(3-D-吡喃半乳糖苷標(biāo)記(其在糖苷鍵水解后形成水不溶性染料)。 然而，同樣也可以用同一種p-D-吡喃半乳糖苷或不同的(3-D-吡喃半乳糖苷標(biāo)記兩種寡核苷酸。由于標(biāo)記物數(shù)目更高，這強(qiáng)化了所述信號(hào)。
上文中描述了可用于該方法的(3-D-吡喃半乳糖普。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí) 施方案，所述(3-D-吡喃半乳糖苷選自包含5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-P-D-吡喃半乳糖苷(x-Gal) 、 N-曱基p引咮基-P-D-p比喃半乳糖苷、5-硤-3-吲哚基-卩-D-p比喃半乳糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚基-P-D-吡喃半乳糖苷、 6-氯-3-吲哚氧基-(3-D-p比喃半乳糖苷、對(duì)-萘酚苯-P-D-吡喃半乳糖苷、 環(huán)己酮七葉亭-卩-D-吡喃半乳糖苷和8-羥基喹啉-(3-D-p比喃半乳糖苷的 組。根據(jù)一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案，所述p-D-吡喃半乳糖苷是5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-P-D-p比喃半乳糖苷(x-Gal)。
選擇寡核苷酸使得各種情況下其均可通過(guò)末端片段與靶DNA序 列雜交。這表示這兩種寡核苷酸均具有至少一個(gè)與靶DNA序列相應(yīng)片 段充分互補(bǔ)的末端片段，以能夠與靶DNA序列雜交。優(yōu)選的，所述片 段允許特異性雜交，即僅與靶DNA序列的目標(biāo)片段雜交，而不與其他 與耙DNA序列無(wú)相似性或相似性4艮低的序列雜交。與耙DNA序列互補(bǔ) 的片段是末端的，即其包含各寡核苷酸的一個(gè)末端(5'末端或3，末端) 并向同一寡核苷酸的另一末端方向延伸。優(yōu)選的，與靶序列雜交所需 要的寡核苷酸末端片段具有至少5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 22、 24、 26、 28、 30、 40、 50或更多 個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。該片段中每個(gè)核普酸與靶DNA序列中相應(yīng)核苷酸的 互補(bǔ)并不是絕對(duì)需要的，只要該片段整體與靶DNA序列的預(yù)定片段充 分互補(bǔ)以能夠與之進(jìn)行足夠高特異性的雜交即可。優(yōu)選的，寡核苷酸
發(fā)明，也可li用^耙DNA序列完丄互/卜的寡核苷酸。根:二個(gè)特別優(yōu) 選的實(shí)施方案，因此，所述第一和/或第二寡核苷酸在其全長(zhǎng)上與靶 DNA序列互補(bǔ)。如果所述寡核苷酸具有不與靶序列互補(bǔ)的片段(例如 如圖l中所示)，這些片段可用于用P-D-吡喃半乳糖苷標(biāo)記。然而，標(biāo) 記也可以在寡核苷酸的任何其他位置進(jìn)行。
所述第一和第二寡核苷酸的末端片段互相直接相鄰地雜交到靶 DNA序列上，即，末端片段與靶DNA序列雜交后，末端片段的兩個(gè)末 端核苷酸互相直接相鄰。若末端片段的末端核苷酸雜交至靶DNA序列 中的兩個(gè)直接相鄰的核苷酸，則其將排列為互相直接相鄰。末端片段
23兩種寡核苷酸連接形成連接產(chǎn)物的必需的前提條件。只有在這種直接 相鄰的排列方式下，所述寡核普酸的鄰接末端片段的兩個(gè)末端核苷酸 才足夠接近以可以通過(guò)連接試劑(例如連接酶)連接。若所述兩個(gè)末
則不會(huì)發(fā)生末端-核苷酸6;連接。、 、；.、、.'
此外，安排寡核苷酸使得靶DNA序列中預(yù)定位置的核苷酸在第一 寡核苷酸雜交后分配給第一寡核普酸末端片段的核苷酸。僅在雜交至 需要的靶序列時(shí)，所述第 一寡核苷酸的該核苷酸和靶DNA序列中的預(yù) 定位置之間發(fā)生互補(bǔ)堿基配對(duì)。在所述第一寡核苷酸與另一DNA序列 (其在預(yù)定的位置不同于靶DNA序列)結(jié)合時(shí)，該位置不會(huì)發(fā)生互補(bǔ) 堿基配對(duì)。該錯(cuò)配表示末端片段的末端核苦酸不能與所述DNA序列雜 交。因此，在與DNA序列雜交后，所述第一和第二寡核苦酸的兩個(gè)末 端片段并不位于互相直接相鄰的位置，連接也不會(huì)發(fā)生。
由于在不同于靶DNA序列的DNA序列情況下，預(yù)定位置的錯(cuò)配能 有效防止所述第一寡核苷酸的末端片段的末端核苷酸的雜交，所研究 DNA序列中預(yù)定位置必須分配給第一寡核苷酸中位置接近末端片段 的末端核苷酸的核普酸。優(yōu)選的，分配給所研究DNA序列預(yù)定的位置
(i照^1 ):然而，所研究DNA序列預(yù)定的位置被分配給第一i核 苦酸中離末端片段的末端核苷酸l、 2或3個(gè)位置遠(yuǎn)的核苷酸也是可能 的，即所研究DNA序列的預(yù)定位置可分配給所述第一寡核苷酸末端片 段中最后4個(gè)核苷酸之一。這些位置的錯(cuò)配同樣能導(dǎo)致所述第一寡核 苷酸的末端片段中的末端核苷酸不能再與其他方面互補(bǔ)的DNA序列 雜交。
圖l作為一個(gè)實(shí)施方案的例子顯示了兩種寡核苷酸結(jié)合的原理。 耙序列(1)具有預(yù)定的核苷酸位置(6)。該核苷酸位置例如可以是單核苷 酸多態(tài)性的位置。雜交至靶DNA序列(1)的寡核苷酸(2)和(3)其序列是 互相配對(duì)的，這樣寡核苦酸(2)具有與靶DNA序列上游(即相對(duì)于從5， 到3 ，延伸的耙DNA序列靶DNA序列預(yù)定的核苷酸位置(6)的5 ，方向) 雜交的末端序列片段(4)。第二寡核苷酸(3)具有與靶DNA序列下游(即 相對(duì)于從5 ，到3 ，延伸的靶DNA序列靶DNA序列預(yù)定的核苷酸位置(6) 的3，方向)雜交的末端序列片段(5)。由于這兩個(gè)末端序列片段(4)和(5)在末端區(qū)域內(nèi)與靶DNA序列完全雜交，末端片段(4)和(5)的兩 個(gè)末端核香酸都排列為相互直接相鄰，即相對(duì)于從5，到3，延伸的耙 DNA序列，與預(yù)定的核普酸位置(6)上游雜交的所述寡核普酸的5，末端 核普酸和與預(yù)定的核苷酸位置(6)下游雜交的所述寡核苷酸的3，末端 核苷酸鄰接。
圖l顯示了根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案，其中靶DNA序列中 預(yù)定的核苷酸位置(6)與寡核普酸(2)的5，末端核苷酸相對(duì)。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，預(yù)定的核苷酸位置(6)與寡核苷酸(3)的3，末端核苷酸相對(duì)。 此外，預(yù)定的核苷酸位置(6)相對(duì)于末端片段(4)和(5)之一的倒數(shù)第二、 倒數(shù)第三或倒數(shù)第四個(gè)核苷酸的實(shí)施方案也是可能的。在給出的例子 中，互補(bǔ)堿基配對(duì)發(fā)生在靶DNA序列中預(yù)定的核苷酸位置(6)和寡核苷 酸(2)的5，末端核苷酸之間，這樣末端片段(4)和(5)的兩個(gè)末端核苷酸排 列為相互直接相鄰。這樣，隨著過(guò)程的繼續(xù)，兩種寡核苷酸形成連接 產(chǎn)物，進(jìn)而在檢測(cè)連接產(chǎn)物過(guò)程中形成染料。
在該方法的下一步，兩種寡核苷酸有機(jī)會(huì)與耙DNA序列雜交。允 許雜交的條件很大程度上取決于寡核苷酸的組成。在各種情況下，本 領(lǐng)域技術(shù)人員能夠無(wú)任何問(wèn)題地選擇這些條件。特異性的雜交尤其發(fā) 生在足夠高的溫度下，在該溫度下所述兩種寡核苷酸與基因組DNA的 非互補(bǔ)區(qū)域的非特異性雜交受到抑制。然而，選擇的溫度也不能高到 雖然有充分互補(bǔ)的片段，但寡核苷酸不能結(jié)合靶DNA序列的程度。優(yōu) 選的，該方法中雜交步驟的溫度為低于兩種寡核苷酸中熔點(diǎn)較低值約 5-10。C。本領(lǐng)域技術(shù)人員在計(jì)算所述寡核苷酸的熔點(diǎn)方面無(wú)任何問(wèn)題， 其中計(jì)算僅包括與靶序列互補(bǔ)的區(qū)域。優(yōu)選的選擇兩種寡核苷酸，使 之具有相似的熔點(diǎn)。這使得可能與靶DNA序列基本上一致的雜交。
在下一步驟中，使雜交的寡核苷酸與連接試劑接觸，僅僅當(dāng)末端 片段的兩個(gè)末端核普酸排列為相互直接相鄰，所述連接試劑將它們連 接形成連接產(chǎn)物。這表示僅在互補(bǔ)堿基配對(duì)的情況下，在靶DNA序列 預(yù)定的位置的核苷酸(例如建立多態(tài)性的位置)和雜交的寡核苷酸的 末端片段中相應(yīng)的核苦酸之間可進(jìn)行連接，因?yàn)榉駝t，所述寡核苷酸
的5 ，末端:苷^與下游雜交的曰寡^苷酸的3 ，末:核苦酸的連接成S可 能。如果由于與雜交的寡核苷酸末端片段的相應(yīng)核苷酸互補(bǔ)性不足，核苷酸在所研究的DNA序列預(yù)定的位置不能形成堿基配對(duì)，兩種寡核 苷酸的兩個(gè)末端核香酸的連接就不可能，因?yàn)橐粭l寡核苷酸的5，末端 磷酸基團(tuán)與連接試劑要連接的另一條寡核苷酸的3，末端OH基團(tuán)并非 足夠接近。僅當(dāng)所述寡核香酸的兩個(gè)末端核普酸通過(guò)與靶DNA序列核 苷酸的互補(bǔ)堿基配對(duì)固定在相應(yīng)的空間有利的位置時(shí)，所述連接才可 能發(fā)生。
所述連接試劑優(yōu)選為DNA連接酶。在本例中，DNA連接酶應(yīng)當(dāng)理 解為連接DNA鏈的酶類。其在 一條DNA鏈的5 ，磷酸殘基與另 一條DNA 鏈的OH基團(tuán)間形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶可以是來(lái)自噬菌體T4的 連接酶。該連接酶使用ATP作為輔助因子。此外，也可應(yīng)用來(lái)自嗜熱 或超嗜熱細(xì)菌的連接酶。在本發(fā)明的范圍內(nèi)也可以 <吏用來(lái)自大腸桿菌 的DNA連接酶。該酶使用NAD作為輔助因子。根據(jù)一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí) 施方案，所述DNA連接酶是T4-DNA連接酶。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施 方案，所述與該方法相聯(lián)系的連接酶是熱穩(wěn)定連接酶，例如Barany, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88: 189-193 (1991)中所述的。
反應(yīng)批隨后加熱至一定的溫度，此時(shí)標(biāo)記的未連接的寡核苷酸從 靶DNA序列和/或組中其他DNA序列上脫離下來(lái)，而形成的連接產(chǎn)物 仍然與靶DNA序列雜交。這表示該步驟中選擇的溫度高于標(biāo)記的寡核 苷酸的熔點(diǎn)。如果還使用未標(biāo)記的寡核苷酸，它們也可保持與靶DNA 序列雜交的形式，不會(huì)對(duì)隨后的顯色反應(yīng)產(chǎn)生任何影響。優(yōu)選的，所 選定的溫度高于兩種寡核苷酸的熔點(diǎn)。如果兩種核苷酸未發(fā)生連接以 形成更長(zhǎng)的連接產(chǎn)物，當(dāng)加熱反應(yīng)批時(shí)這兩種單獨(dú)的寡核苷酸將從靶 DNA序列上脫離。然而，如果從這兩種寡核苷酸作為連接的結(jié)果形成 了連接產(chǎn)物，其具有更長(zhǎng)的與靶DNA序列互補(bǔ)的區(qū)域，因此具有高得 多的熔點(diǎn)。因而在該反應(yīng)步驟中設(shè)定溫度使之高于兩種單獨(dú)的寡核苷 酸的熔點(diǎn)，而低于連接產(chǎn)物的熔點(diǎn)是可能的。所述連接產(chǎn)物因此保持 與耙DNA序列的雜交，可隨后在支持物上的細(xì)胞區(qū)域內(nèi)形成染料。
在最后一步中，雜交產(chǎn)物通過(guò)水解P-D-吡喃半乳糖苷的糖苷鍵進(jìn) 行檢測(cè)。如已經(jīng)描述的，該顯色反應(yīng)可通過(guò)加入或釋放具有(3-D-半乳 糖苷酶活性的多肽完成。優(yōu)選的，所述多肽是SEQIDNO: l的來(lái)自大 腸桿菌的P-半乳糖苷酶或其變體或活性片段。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)特別優(yōu) 選的實(shí)施方案，酶活性多肽的釋放可通過(guò)將加入反應(yīng)批的所述多肽結(jié)
26合到蠟珠中完成。所述蠟珠的制備和使用方法在本領(lǐng)域是公知的，尤
其是與所謂的熱起始P C R方法有關(guān)的。適于結(jié)合酶活性蛋白或多肽的 合適的蠟珠描述于例如美國(guó)專利5,413，924中。由于上述方法范圍內(nèi)的 顯色反應(yīng)僅由雜交的連接產(chǎn)物引起，必須選擇熔化蠟珠需要的溫度， 這樣熔化僅發(fā)生在高于兩種寡核苷酸熔點(diǎn)的 一個(gè)溫度范圍內(nèi)。這樣， 標(biāo)記的未連接寡核苷酸從靶DNA序列上解離下來(lái)之后，顯色反應(yīng)才開(kāi) 始進(jìn)行。進(jìn)一步選擇熔化蠟珠的溫度，使得連接產(chǎn)物不從耙DNA序列 上解離，即，所述溫度低于連接產(chǎn)物的熔點(diǎn)。
支持物上細(xì)胞區(qū)域內(nèi)染料的形成直接表明兩種寡核苷酸連接產(chǎn) 物的存在。由于形成連接產(chǎn)物需要靶DNA序列中預(yù)定核苷酸位置與相 對(duì)于該位置的第一寡核苷酸中的核苷酸之間形成互補(bǔ)堿基配對(duì)，根據(jù) 支持物上細(xì)胞區(qū)域內(nèi)染料的形成可直接推斷出靶DNA序列中預(yù)定核 苦酸位置與相對(duì)于該位置的第一寡核苷酸中的核苷酸之間是互補(bǔ)的。 如果沒(méi)有觀察到染料的形成，可使用具有在預(yù)定位置具有另一種堿基 的核苷酸的DNA序列重復(fù)本方法，直到觀察到染料形成。
根據(jù)本發(fā)明 一 個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，靶DNA序列包括在基因的野生 型序列中。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，靶DNA序列包括在基 因的變體序列中，即與基因的野生型序列具有點(diǎn)突變區(qū)別的序列中。 優(yōu)選的，所述靶DNA序列對(duì)應(yīng)于基因的野生型或變體序列。這樣，例 如靶DNA序列可包括在編碼人突觸小泡蛋白2A的基因中。編碼突觸小 泡蛋白2A ( SV2A)的野生型基因具有SEQIDNO: 3所示的序列?；?者，耙DNA序列可包括SEQ ID NO: 3所示基因的變體中，其與野生 型在8348位不同。
已發(fā)現(xiàn)SV2A基因在內(nèi)含子6中具有單核苷酸多態(tài)性，其對(duì)于患者 對(duì)特定治療劑的應(yīng)答是決定性的。所述多態(tài)性的描述詳見(jiàn)2006年9月 28日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)(PCT/EP2006/ 066832)。所述多態(tài)性涉及 SEQIDNO: 3的8348位由鳥噪呤(野生型)取代為腺嘌呤(突變體)。 該單核苷酸多態(tài)性可預(yù)觀'J患者對(duì)多種物質(zhì)的抗癲癇治療的反應(yīng)，例如 左乙拉西坦(Keppra。； UCB GmbH, Kerpen,德國(guó))。左乙拉西坦描述于 EP0 162 036中。其是吡拉西坦的一種乙基類似物。
在SEQ ID NO: 3的8348位具有堿基"A"而非堿基"G"的患者對(duì)所 述物質(zhì)沒(méi)有在臨床顯著程度上的反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)是大約5倍。因此，確定癲癇患者的基因型在用左乙拉西坦治療方面具有很高的預(yù)測(cè)價(jià)值。本 發(fā)明的方法使得在醫(yī)生和患者首次見(jiàn)面時(shí)就能確定是否該患者對(duì)左 乙拉西坦治療具有高的反應(yīng)概率。通過(guò)本發(fā)明范圍內(nèi)描述的方法，該
多態(tài)性可迅速并可靠的測(cè)定，其中例如可使用SEQIDNO: 4和SEQ ID NO: 5所述的寡核普酸。SEQIDNO: 4所示的寡核苦酸相應(yīng)于根據(jù)本 發(fā)明的方法的第一寡核苷酸，其與SV2A基因的序列雜交，這樣3，末端 "T"直接相對(duì)于SEQ ID NO: 3的8348位可能的多態(tài)性位置。SEQ ID NO: 4所示的寡核普酸因此與SEQIDNO: 3序列從8349位延伸至8361 位的區(qū)域雜交。SEQIDNO: 5所示的寡核苷酸相應(yīng)于第二寡核苷酸， 其與SEQIDNO: 3在8348位5，方向雜交。其與SEQIDNO: 3序列/人 8338延伸至8347位的區(qū)域雜交，這樣5，末端"G"直接與SEQ ID NO: 4 的寡核苦酸的末端"T"鄰接。當(dāng)然也可以使用更長(zhǎng)的寡核苷酸，其包 含SEQIDNO: 4和SEQIDNO: 5的序列。
本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)，用于檢測(cè)多態(tài)性的范圍內(nèi)的本發(fā)明的 方法可以設(shè)計(jì)為僅當(dāng)所研究的個(gè)體DNA不具有多態(tài)性，而是對(duì)應(yīng)于野 生型的時(shí)候形成連接產(chǎn)物(以及由此在細(xì)胞區(qū)域內(nèi)的染料形成)。在 這種情況下，所述野生型的DNA序列對(duì)應(yīng)于檢測(cè)的靶DNA序列，選擇 與單核普酸多態(tài)性相對(duì)的各寡核苷酸的核苷酸，使其具有與野生型中 該位置核苷酸;威基互補(bǔ)的;威基。
當(dāng)然，寡核苷酸也可以如下安排當(dāng)實(shí)施本方法時(shí)，雜交的寡核 苷酸的連接和染料的形成僅在本發(fā)明方法范圍內(nèi)研究的基因組DN A
具有不同于野生型的序列時(shí)(例如單核苷酸多態(tài)性)發(fā)生。在這種情 況下，變體或突變體的DNA序列相應(yīng)于要檢測(cè)的靶DNA序列，與單核 苦酸多態(tài)性位置相對(duì)的各寡核苷酸的核苷酸具有與多態(tài)性過(guò)程中該 位置所描述的;威基互補(bǔ)的堿基。
由于已經(jīng)提到的原因，本發(fā)明的方法步驟(b)至(f)可以在同 一反應(yīng) 批中依次進(jìn)行，而不需要中間步驟。
根據(jù)另 一 方面，本發(fā)明涉及用如上文所定義的P-D-吡喃半乳糖苷 標(biāo)記的寡核苷酸在DNA雜交方法中的應(yīng)用。在這些方法中，所述寡核 苷酸用作探針。(3-D-吡喃半乳糖苷優(yōu)選為吡喃半乳糖苷5-溴-4-氯-3-吲 哚氧基-P-D-p比喃半乳糖苷(x-Gal)。
此外，本發(fā)明提供了實(shí)施本發(fā)明范圍內(nèi)所述方法的試劑盒。所述試劑盒包括至少一種用p-D-吡喃半乳糖苷(其在糖苷鍵水解后形成水 不溶性染料)標(biāo)記的寡核苷酸。所述試劑盒還包括一種或更多種以此 方式標(biāo)記的其他寡核苷酸。所述(3-D-吡喃半乳糖苷優(yōu)選為吡喃半乳糖 苷5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-(3-D-吡喃半乳糖普(x-Gal)。此外所述試劑盒含 有緩沖劑和其他可用于進(jìn)行雜交方法的試劑。所述試劑盒例如可含有 (3-半乳糖普酶或合適的支持物，例如前述的小刷。如果該試劑盒用于 從一組DNA序列中檢測(cè)耙DNA序列，該組的成員之間僅在一個(gè)預(yù)定的 核苷酸位置不同(例如檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性)，其還可以含有連接試 劑，例如T4-DNA連接酶，以及互相直接相鄰地雜交至特定草巴序列的 寡核苷酸。所述試劑盒還可含有實(shí)施上述檢測(cè)方法的說(shuō)明書。
實(shí)施例
下述實(shí)施例說(shuō)明了涉及突觸小泡蛋白2A(SV2A)單核苷酸多態(tài)性 的檢測(cè)。在1.5ml的反應(yīng)管中準(zhǔn)備以下溶液 40 U P-半乳糖苷酶(結(jié)合到蠟珠中) 20 U T4-DNA連接酶 50 一 ATP
66 mM Tris畫HCl (pH 7.6)
150 nM NaCl
10% PEG
6.6 mM MgCl2
10 mM DTT
力口至歸0 fxl A. dest
加入下列寡核苷酸
寡核苷酸l: 5'-AACATCGGCCAGGT-3' 寡核苷酸2: 5'-GCCTCAGCC-3'-X-Gal
寡核苷酸l的3，末端核苷酸是"T",這樣僅當(dāng)與野生型序列不同， 在基因組DNA的相應(yīng)位置(SEQ IDNO:3的8348位)是"A"(代替"G") 時(shí)，該核苷酸才與試驗(yàn)受試者的基因組DNA發(fā)生石威基配對(duì)?？谇徽?膜細(xì)胞采用"0mni-Swab"刷(Whatman)從患者獲得。將該刷在空氣中干 燥2-3分鐘后，將刷頭置于前述的反應(yīng)器中。反應(yīng)溶液首先保留在22°C
29下。3分鐘后用熱電偶將反應(yīng)批的溫度增加到32。C。發(fā)現(xiàn)在上述的條
件下，僅在經(jīng)測(cè)序證實(shí)具有SV2A單核苷酸多態(tài)性的試驗(yàn)受試者中， 在反應(yīng)溶液中的刷頭細(xì)胞材料上形成染料。5分鐘后刷子區(qū)域中藍(lán)色 染料的形成可清楚的分辨，約15分鐘后整個(gè)反應(yīng)溶液均被染成藍(lán)色。
權(quán)利要求
1、檢測(cè)細(xì)胞中靶DNA序列的體外方法，包括(a)提供位于支持物上的細(xì)胞，其中至少部分所述細(xì)胞被裂解；(b)使位于支持物上的細(xì)胞與至少一種寡核苷酸接觸，所述寡核苷酸能與靶DNA序列雜交，其中該寡核苷酸用β-D-吡喃半乳糖苷標(biāo)記，所述β-D-吡喃半乳糖苷在糖苷鍵水解后形成水不溶性染料；(c)在所述至少一種寡核苷酸與靶DNA序列可能雜交的條件下，孵育所述至少一種寡核苷酸；(d)通過(guò)水解β-D-吡喃半乳糖苷的糖苷鍵檢測(cè)雜交產(chǎn)物，其中支持物上細(xì)胞區(qū)域中染料的形成表明細(xì)胞中存在靶DNA序列。
2、 權(quán)利要求l的方法，其中所述P-D-吡喃半乳糖苷選自5-溴-4-氯 -3-吲咮氧基-卩-D-吡喃半乳糖普(x-Gal) 、 N-曱基吲哚基-P-D-p比喃半 乳糖苷、5-碘-3-吲哚基-p-D-吡喃半乳糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚基-(3-0-吡喃半乳糖苷、6-氯-3-吲哚氧基-卩-D-吡喃半乳糖苷、對(duì)-萘酚苯-p-D-吡喃半乳糖苷、環(huán)己酮七葉亭-p-D-吡喃半乳糖苷和8-羥基喹啉-p-D-吡喃半乳糖苷。
3、 權(quán)利要求2的方法，其中所述|3-0-吡喃半乳糖苷是5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-P-D-吡喃半乳糖苷(x-Gal)。
4、 權(quán)利要求l-3任一所述的方法，其中(3-D-吡喃半乳糖苷的糖苷 鍵被具有P-半乳糖苷酶活性的多肽水解。
5、 權(quán)利要求4的方法，其中所述具有(3-半乳糖苷酶活性的多肽是 來(lái)自大腸桿菌的根據(jù)SEQIDNO: l的p-半乳糖苷酶，或其變體或活性 片段。
6、 權(quán)利要求l-5任一所述的方法，其中所述細(xì)胞從拭子獲得。
7、 權(quán)利要求6的方法，其中所述拭子是口腔粘膜拭子。
8、 權(quán)利要求l-7任一所述的方法，其中要檢測(cè)的靶DNA序列是細(xì) 菌DNA序列。
9、 權(quán)利要求8的方法，其中所述細(xì)菌DNA序列是細(xì)菌抗性基因。
10、 權(quán)利要求9的方法，其中所述細(xì)菌抗性基因是mecA基因。
11、 權(quán)利要求l-7任一所述的方法，其中要檢測(cè)的靶DNA序列是病 毒DNA序列。
12、 權(quán)利要求ll的方法，其中所述病毒DNA序列是人乳頭瘤病毒 的序列。
13、 權(quán)利要求12的方法，其中所述病毒DNA序列是人乳頭瘤病毒 16或18的序列。
14、 任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中步驟(b)至(d)在同一反應(yīng) 批中連續(xù)進(jìn)行。
15、 從一組DNA序列中檢測(cè)耙DNA序列的體外方法，所述序列組 成員之間的區(qū)別在于僅一個(gè)預(yù)定的核普酸位置不同，該方法包括(a) 提供位于支持物上的細(xì)胞，其中至少部分所述細(xì)胞被裂解；(b) 使支持物上的細(xì)胞與第一和第二寡核苷酸接觸，至少其中 一種寡核苷酸用p-D-吡喃半乳糖苷標(biāo)記，所述(3-D-吡喃半乳糖苷在糖 苷鍵水解后形成水不溶性染料，并且其中選擇所述寡核苷酸，使得(i) 在各種情況下它們可通過(guò)末端的片段以使得所述兩種末其中耙DNA序列預(yù)定位置的核苷酸與第一寡^i酸末端片段的核苷 酸形成互補(bǔ)石咸基配對(duì)，以致于(ii) 對(duì)于所述兩種末端片段與DNA序列組中另一 DNA序 列的雜交，由于所述DNA序列預(yù)定位置的核苷酸與所述第一寡核苷 酸末端片段的核苦酸缺乏互補(bǔ)堿基配對(duì)，所述第一寡核香酸的末端片 段的末端核香酸不能與該DNA序列雜交，這樣所述兩種末端片段的 末端核苷酸不會(huì)排列為互相直接相鄰；(c) 在所述兩種寡核苷酸與靶DNA序列可能雜交的條件下孵育 所述兩種寡核苷酸；(d) 使兩種雜交的寡核苷酸與連接劑接觸，僅當(dāng)所述末端片段 的兩個(gè)末端核苷酸排列為互相直接相鄰時(shí)，所述連接劑才將它們連接 形成連接產(chǎn)物；(e) 加熱反應(yīng)批至某一溫度，在該溫度下標(biāo)記的非連接的寡核苷 酸從耙DNA序列上脫離，并且連接產(chǎn)物維持與靶DNA序列的雜交；(f) 通過(guò)水解p-D-吡喃半乳糖苷的糖苷鍵檢測(cè)與耙DNA序列雜 交的連接產(chǎn)物；其中在支持物上細(xì)胞區(qū)域染料的形成說(shuō)明細(xì)胞中存在靶DNA序列。
16、 權(quán)利要求15的方法，其中所述P-D-吡喃半乳糖苦選自包含5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-(3-D-p比喃半乳糖苷(x-Gal) 、 N-甲基p引味基-卩-D-吡喃半乳糖苷、5-碘-3-吲哚基-p-D-吡喃半乳糖苷、5-溴-6-氯-3H哚 基-(3-D-p比喃半乳糖苷、6-氯-3-吲哚氧基-卩-D-p比喃半乳糖香、對(duì)-萘酚 苯-(3-D-吡喃半乳糖苷、環(huán)己酮七葉亭-J3-D-p比喃半乳糖苷和8-羥基喹啉 -卩-D-吡喃半乳糖普的組。
17、 權(quán)利要求16的方法，其中所述P-D-吡喃半乳糖普是5-溴-4-氯 -3-吲哚氧基-卩-D-p比喃半乳糖苷(x-Gal)。
18、 權(quán)利要求15-17任一所述的方法，其中p-D-吡喃半乳糖普的糖 苷鍵被具有P-半乳糖苦酶活性的多肽水解。
19、 權(quán)利要求18的方法，其中所述具有(3-半乳糖苷酶活性的多肽 是來(lái)自大腸桿菌的根據(jù)SEQIDNO: l的(3-半乳糖普酶，或其變體或活 性片4爻。
20、 權(quán)利要求15-19任一所述的方法，其中靶DNA序列包括在基因 的野生型或變體序列中。
21、 權(quán)利要求20的方法，其中靶DNA序列包括在具有SEQIDNO: 3所示的序列的編碼突觸小泡蛋白2A的基因或其變體中。
22、 權(quán)利要求21的方法，其中所述寡核苷酸具有SEQ ID NO: 4 和SEQIDNO: 5所示的序列。
23、 權(quán)利要求15-22任一所述的方法，其中所述細(xì)胞從拭子獲得。
24、 權(quán)利要求23的方法，其中所述拭子是口腔粘膜拭子。
25 、用(3-D-p比喃半乳糖苷標(biāo)記的寡核普酸在DNA雜交方法中的應(yīng) 用，所述P-D-吡喃半乳糖苷在糖苷鍵水解后形成水不溶性染料。
26、 權(quán)利要求25的應(yīng)用，其中所述P-D-吡喃半乳糖苷是5-溴-4-氯 -3-吲哚氧基-(3-D-p比喃半乳糖苷(x-Gal)。
27、 實(shí)施權(quán)利要求l-14或15-22任一所述方法的試劑盒，其包括至 少 一 種用(3-D-吡喃半乳糖苷標(biāo)記的寡核苷酸，所述(3-D-吡喃半乳糖苷 在糖苷鍵水解后形成水不溶性染料。
28、 權(quán)利要求27的試劑盒，其中所述P-D-吡喃半乳糖苷是5-溴 -4-氯-3-吲哚氧基-P-D-吡喃半乳糖苷(x-Gal)。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用用β-D-吡喃半乳糖苷標(biāo)記的寡核苷酸檢測(cè)靶DNA序列的體外方法，所述β-D-吡喃半乳糖苷在糖苷鍵水解后形成水不溶性染料。本發(fā)明尤其涉及從一組DNA序列中檢測(cè)靶DNA序列的體外方法，所述序列組成員之間的區(qū)別在于僅一個(gè)預(yù)定的核苷酸位置不同，所述方法通過(guò)利用用β-D-吡喃半乳糖苷標(biāo)記的寡核苷酸，所述β-D-吡喃半乳糖苷在糖苷鍵水解后形成水不溶性染料。本發(fā)明還涉及所述寡核苷酸在DNA雜交方法中的應(yīng)用。本發(fā)明最后涉及用于實(shí)施上述方法的試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101600806SQ200780050981
公開(kāi)日2009年12月9日 申請(qǐng)日期2007年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月13日
發(fā)明者D·佩茨, M·曾特格拉夫 申請(qǐng)人:德西丁醫(yī)藥有限責(zé)任公司