專利名稱：：經(jīng)過(guò)優(yōu)化的非規(guī)范鋅指蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本公開(kāi)內(nèi)容在基因組工程(genomeengineering)、基因打靶(genetargeting)、覃巴向染色體整合(targetedchromosomalintegration)、蛋白質(zhì)表達(dá)(proteinexpression)和夕卜因基因組編輯(epigenomeediting)領(lǐng)域中。
背景技術(shù)：
：蛋白質(zhì)對(duì)DNA、RNA、蛋白質(zhì)和其它分子的序列特異性結(jié)合涉及許多細(xì)胞過(guò)程，諸如例如轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、重組、DNA^f奮復(fù)、RNA加工和翻譯。參與蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-RNA和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的細(xì)胞結(jié)合蛋白的結(jié)合特異性有助于發(fā)育、分化和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。鋅指蛋白(ZFP)是能以序列特異性方式結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)。鋅指最初在來(lái)自非洲爪蟾(Africanclawedtoad)即Xe"o/my/aev&卵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子TFIIIA中鑒定出。這類ZFP的單個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域長(zhǎng)約30個(gè)氨基酸，而且數(shù)項(xiàng)結(jié)構(gòu)研究已經(jīng)證明了它包含P-轉(zhuǎn)角(包含兩個(gè)保守的半胱氨酸殘基)和a-螺旋(包含兩個(gè)保守的組氨酸殘基)，它們經(jīng)由兩個(gè)半胱氨酸和兩個(gè)組氨酸配位鋅原子而保持特定構(gòu)象。這類ZFP也稱為C2H2ZFP。別的類型的ZFP也已經(jīng)有提示。參見(jiàn)例如關(guān)于Cys-Cys-His-Cys(C3H)ZFP討論的Jiang等(1996)J.Biol.Chem.271:10723-10730。迄今為止，已經(jīng)在數(shù)千種已知的或推定的轉(zhuǎn)錄因子中鑒定出超過(guò)10，000種鋅指序列。鋅指結(jié)構(gòu)域不僅參與DNA識(shí)別，而且還參與RNA結(jié)合和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合。目前估計(jì)這類分子會(huì)占到所有人類基因的約2%。大多數(shù)鋅指蛋白具有保守的半胱氨酸和組氨酸殘基，它們?cè)诿總€(gè)指結(jié)構(gòu)域中四面體形地配位單個(gè)鋅原子。具體地，大多ItZFP以通式序列為-Cys-(X)2-4-Cys-(X)12-His-(X)3-5-His-(SEQIDNO:l)的指構(gòu)件為特征，其中X代表任何氨基酸(C2H2ZFP)。這種被最廣泛呈現(xiàn)的類型的鋅配位序列包含具有特定間距的兩個(gè)半胱氨酸和兩個(gè)組氨酸。每個(gè)指的折疊結(jié)構(gòu)包含反向平行的(3—轉(zhuǎn)角、指尖區(qū)和短的兩親性a-螺旋。金屬配位配體結(jié)合鋅離子，并且在zif268型鋅指的情況中，短的、兩親性ct-螺旋在DNA的大溝中結(jié)合。另外，鋅指的結(jié)構(gòu)通過(guò)某些保守的疏水性氨基酸殘基(例如指中就在第一個(gè)保守Cys之前的殘基和螺旋區(qū)段第+4位的殘基)和通過(guò)保守的半胱氨酸和組氨酸殘基的鋅配位而得到穩(wěn)定化。在產(chǎn)生直接堿基接觸的位置、緊鄰堿基接觸位置的"支持性"或"支撐性"殘基、和能夠接觸DNA磷酸酯主鏈的位置中具有改變的規(guī)范(C2H2)鋅指蛋白已經(jīng)有描述。參見(jiàn)例如美國(guó)專利No.6,007,988;6,013,453;6,140,081;6,866,997;6,746,838;6,140,081;6,610,512;7,101,972;6,453,242;6,785,613;7,013,219;PCTWO98/53059;Choo等(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416;Segal等(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.4:34-39。另外，包含具有改良鋅配位殘基的鋅指的鋅指蛋白也已經(jīng)有描述(參見(jiàn)例如美國(guó)專利申請(qǐng)No.20030108880;20060246567;和20060246588;通過(guò)提及收錄其公開(kāi)內(nèi)容)。然而，雖然包含這些非規(guī)范鋅指的鋅指蛋白保留了基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，但是它們起鋅指核酸酶(ZFN)作用的能力在有些情況中相對(duì)于唯獨(dú)由規(guī)范C2H2鋅指組成的鋅指蛋白有所降低。如此，仍需要(特別是在鋅指核酸酶的構(gòu)建中)包含具有經(jīng)過(guò)優(yōu)化的非規(guī)范鋅配位區(qū)的鋅指的別的工程化鋅指結(jié)合蛋白。發(fā)明概述本公開(kāi)內(nèi)容提供了在至少一個(gè)鋅配位殘基中具有改變的鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。具體地，本文中描述了CCHC鋅指。這些CCHC鋅指可進(jìn)一步地在鋅配位殘基附近(例如在鋅指最C端的(C-terminal-most)鋅配位殘基周圍的殘基中)包含別的改變(替代、插入和/或刪除)。還描述了包含一個(gè)或多個(gè)這些CCHC鋅指的鋅指多肽和融合蛋白、編碼這些鋅指和融合蛋白的多核苷酸、及使用這些鋅指多肽和/或融合蛋白的方法。如此，本公開(kāi)內(nèi)容涵蓋但不限于下列編號(hào)的實(shí)施方案61.一種鋅指蛋白，其包含非規(guī)范(非C2H。鋅指，其中所述非規(guī)范鋅指具有牽涉DNA結(jié)合的螺旋部分且其中所述螺旋部分的鋅配位區(qū)包含氨基酸序列HX,X2RCXl(SEQIDNO:2);且其中所述鋅指蛋白被改造成結(jié)合靶序列。2.實(shí)施方案l的鋅指蛋白，其中X!是A,而X2是Q。3.實(shí)施方案l的鋅指蛋白，其中X,是K,而X2是E。4.實(shí)施方案l的鋅指蛋白，其中X,是T，而X2是R。5.實(shí)施方案l的鋅指蛋白，其中Xl是G。6.—種鋅指蛋白，其包含兩個(gè)或更多個(gè)鋅指，其中至少一個(gè)鋅指包含序列Cys-(XA)2.4-Cys-(XB),2-His-(Xc)3—5-Cys-(X\!0(SEQIDNO:3)，其中XA、XB、X^和XD可以是任何氨基酸。7.實(shí)施方案1至6任一項(xiàng)的鋅指蛋白，其包含表l、表2、表3或表4任一中所示任一序列。8.實(shí)施方案6或7的鋅指蛋白，其中xd包含序列QLV或QKP。9.實(shí)施方案8的鋅指蛋白，其中所述序列QLV或QKP是所述鋅指的3個(gè)C端氨基酸殘基。10.實(shí)施方案6至9任一項(xiàng)的鋅指蛋白，其中xD包含l個(gè)、2個(gè)或3個(gè)Gly(G)殘基。11.一種鋅指蛋白，其包含多個(gè)鋅指，其中至少一個(gè)鋅指包含依照實(shí)施方案1至10任一項(xiàng)的CCHC鋅指。12.實(shí)施方案ll的鋅指蛋白，其中所述鋅指蛋白包含3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)或6個(gè)鋅指。13.實(shí)施方案11或12的鋅指蛋白，其中指2包含所述CCHC鋅指。14.實(shí)施方案11至13任一項(xiàng)的鋅指蛋白，其中C端鋅指包含所述CCHC指。15.實(shí)施方案11至14任一項(xiàng)的鋅指蛋白，其中至少兩個(gè)鋅指包含所述CCHC鋅指。16.實(shí)施方案11至15任一項(xiàng)的鋅指蛋白，其中所述鋅指蛋白包含表8中所示任一序列且被改造成結(jié)合IPP2-K基因中的靶序列。17.—種融合蛋白，其包含實(shí)施方案1至16任一項(xiàng)的鋅指蛋白和一個(gè)或多個(gè)功能域。18.—種融合蛋白，其包含(a)切割半結(jié)構(gòu)域(half-domain)，(b)實(shí)施方案1至16任一項(xiàng)的鋅指蛋白，和(c)插入所述切割半結(jié)構(gòu)域和所述鋅指蛋白之間的ZC接頭。19.實(shí)施方案18的融合蛋白，其中所述ZC接頭的長(zhǎng)度是5個(gè)氨基酸。20.實(shí)施方案19的融合蛋白，其中所述ZC接頭的氨基酸序列是GLRGS(SEQIDNO:4)。21.實(shí)施方案18的融合蛋白，其中所述ZC接頭的長(zhǎng)度是6個(gè)氨基酸。22.實(shí)施方案21的融合蛋白，其中所述ZC接頭的氨基酸序列是GGLRGS(SEQIDNO:5)。23.—種多核苦酸，其編碼依照實(shí)施方案1至16任一項(xiàng)的鋅指蛋白或依照實(shí)施方案17至22任一項(xiàng)的融合蛋白。24.—種用于在植物細(xì)胞中靶向切割細(xì)胞染色質(zhì)的方法，所述方法包括在所述細(xì)胞中表達(dá)一對(duì)依照實(shí)施方案18至22任一項(xiàng)的融合蛋白，其中(a)所述融合蛋白的靶序列彼此相距10個(gè)核苷酸之內(nèi)(withintennucleotidesofeachother);且(b)所述融合蛋白二聚化，并切割位于所述靶序列之間的DNA。25.—種在宿主植物細(xì)胞中靶向遺傳重組的方法，所述方法包括(a)在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)一對(duì)依照實(shí)施方案18至22任一項(xiàng)的融合蛋白，其中所述融合蛋白的靶序列存在于選定的宿主靶基因座中；并(b)鑒定在所述宿主靶基因座中展現(xiàn)出序列改變的重組宿主細(xì)胞。26.實(shí)施方案24或25的方法，其中所述序列改變是選自下組的突變遺傳物質(zhì)的刪除、遺傳物質(zhì)的插入、遺傳物質(zhì)的替代及其任何組合。27.實(shí)施方案24至26任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括將外源多核苷酸導(dǎo)入所述宿主細(xì)^^中。28.實(shí)施方案27的方法，其中所述外源多核苷酸包含與所述宿主靶基因座同源的序列。29.實(shí)施方案24至28任一項(xiàng)的方法，其中所述植物選自下組單子葉植物、雙子葉植物、棵子植物和真核藻類。30.實(shí)施方案29的方法，其中所述植物選自下組玉米、稻、小麥、馬鈴薯、大豆、番茄、煙草、蕓苔科(Brassicafamily)成員、和擬南芥屬8(Arabidopsis)。31.實(shí)施方案24至29任一項(xiàng)的方法，其中所述植物是樹(shù)。32，實(shí)施方案24至31任一項(xiàng)的方法，其中所述靶序列在IPP2K基因中。33.—種用于降低種子中植酸水平的方法，所述方法包括依照實(shí)施方案32滅活或改變IPP2-K基因。34.—種用于使磷在種子中更能被代謝利用的方法，所述方法包括依照實(shí)施方案32滅活或改變IPP2-fC基因。35.—種植物細(xì)胞，其包含依照實(shí)施方案1至16任一項(xiàng)的鋅指蛋白、依照實(shí)施方案17至22任一項(xiàng)的融合蛋白、或依照實(shí)施方案23的多核苷酸。36.實(shí)施方案35的植楊細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是種子。37.實(shí)施方案36的植物細(xì)胞，其中所述種子是玉米種子。38.實(shí)施方案35至37任一項(xiàng)的植物細(xì)胞，其中IPP2-K是被部分或完全滅活的。39.實(shí)施方案38的植物細(xì)胞，其中所述種子中的植酸水平是降低的。40.實(shí)施方案35至39的植物細(xì)胞，其中所述細(xì)胞中的磷的代謝可利用水平是提高的。附圖簡(jiǎn)述圖1是描繪在美國(guó)專利No.2005/0064474和下文中所述GFP細(xì)胞報(bào)道測(cè)定系統(tǒng)中以表達(dá)GFP的細(xì)胞的百分比測(cè)量的基因校正率(genecorrectionrate)的圖形。ZFN變體稱為"X-Y,"其中"X"指表號(hào)，而"Y"指給予具體選定表中的鋅指的編號(hào)。例如，"2-21"指具有包含表2中第21行所示序列即HAQRCGLRGSQLV(SEQIDNO:53)的指的ZFN。圖2是描繪由使用各種ZFN變體對(duì)進(jìn)行切割引起的Cel-1信號(hào)的百分比的圖形。通過(guò)查閱樣品編號(hào)為每對(duì)ZFN顯示兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。在右上角在方框中顯示了用于每個(gè)樣品的變體對(duì)，其中"wt5-8"和"wt5-9"指美國(guó)專利申請(qǐng)No.2005/0064474的實(shí)施例14(表17)中披露的規(guī)范ZFN對(duì)。在樣品3-12中，用非規(guī)范序列替換規(guī)范ZFN5-8或5-9的指2或指4的識(shí)別螺旋的C端區(qū)域。在圖形上方在左上角顯示了樣品3-12中稱為20、21、43、45、47和48的非規(guī)范ZFN變體的部分序列和這些變體在4個(gè)指的ZFN內(nèi)的指位置。描繪樣品8和9的實(shí)驗(yàn)2結(jié)果的柱形上方的星號(hào)指示道中的背景，導(dǎo)致ZFN功效的低估。圖3是描繪美國(guó)專利No.2005/0064474和本文中所述GFP細(xì)胞報(bào)道測(cè)定系統(tǒng)中的基因校正率的圖形。在每個(gè)柱形下方顯示了每個(gè)樣品中所測(cè)試的ZFN對(duì)，其中所述鋅指編號(hào)20、21、43、45、47和48是那些在實(shí)施例3中所述的，而CCHC鋅指la至10a包含表3和4中所示序列。圖4中使用鋅指20、21、7a、8a、9a和10a;圖2中使用鋅指43、45、47、48、la、2a、3a、4a、5a、和6a。圖4是質(zhì)粒pDAB1585(—種用于煙草的靶載體)的線性圖示。圖5是質(zhì)粒pDAB1585(—種用于煙草的靶載體)的圖示圖6A和6B描繪了鋅指核酸酶(ZFN)。圖6A是描繪ZFN結(jié)合的示意圖。圖6B顯示了靶序列的序列。圖7是質(zhì)粒pDAB1400的圖示。圖8是質(zhì)粒pDAB782的圖示。圖9是質(zhì)粒pDAB1582的圖示。圖10是質(zhì)粒pDAB354的圖示。圖ll是質(zhì)粒pDAB1583的圖示。圖12是質(zhì)粒pDAB2407的圖示。圖13是質(zhì)粒pDAB1584的圖示。圖14是質(zhì)粒pDAB2418的圖示。圖15是質(zhì)粒pDAB4045的圖示。圖16是質(zhì)粒pDAB1575的圖示。圖17是質(zhì)粒pDAB1577的圖示。圖18是質(zhì)粒pDAB1579的圖示。圖19是質(zhì)粒pDAB1580的圖示。圖20是質(zhì)粒pDAB3401的圖示。圖21是質(zhì)粒pDAB1570的圖示。圖22是質(zhì)粒pDAB1572的圖示。圖23是質(zhì)粒pDAB4003的圖示。圖24是質(zhì)粒pDAB1571的圖示。圖25是質(zhì)粒pDAB7204的圖示。圖26是質(zhì)粒pDAB1573的圖示。圖27是質(zhì)粒pDAB1574的圖示。圖28是質(zhì)粒pDAB1581的圖示。圖29是質(zhì)粒pDAB1576的圖示。圖30是質(zhì)粒pDAB1600的圖示。圖31是質(zhì)粒pDAB3731的圖示。圖32是質(zhì)粒pDAB4322的圖示。圖33是質(zhì)粒pDAB4331的圖示。圖34是質(zhì)粒pDAB4332的圖示。圖35是質(zhì)粒pDAB4333的圖示。圖36是質(zhì)粒pDAB4334的圖示。圖37是質(zhì)粒pDAB4336的圖示。圖38是質(zhì)粒pDAB4339的圖示。圖39是質(zhì)粒pDAB4321的圖示。圖40是質(zhì)粒pDAB4323的圖示。圖41是質(zhì)粒pDAB4341的圖示。圖42是質(zhì)粒pDAB4342的圖示。圖43是質(zhì)粒pDAB4343的圖示。圖44是質(zhì)粒pDAB4344的圖示。圖45是質(zhì)粒pDAB4346的圖示。圖46是質(zhì)粒pDAB4330的圖示。圖47是質(zhì)粒pDAB4351的圖示。圖48是質(zhì)粒pDAB4356的圖示。圖49是質(zhì)粒pDAB4359的圖示。圖50是質(zhì)粒pDAB7002的圖示。圖51是質(zhì)粒pDAB7025的圖示。圖52是質(zhì)粒pDAB1591的圖示。圖53是質(zhì)粒pcDNA3.1-SCD27a-L0-Fokl(用于PCR擴(kuò)增Scd27ZFN的DNA模板)的圖示。圖54是質(zhì)粒pDAB1594的圖示。圖55是質(zhì)粒pDAB1598的圖示。圖56是質(zhì)粒pDAB1577的圖示。圖57是質(zhì)粒pDAB1578的圖示。圖58是質(zhì)粒pDAB1601(PAT基因?qū)φ蛰d體)的圖示。圖59是描繪了預(yù)測(cè)的、由IL-l-Fokl融合蛋白刺激的染色體內(nèi)同源重組的示意圖。圖60是質(zhì)粒pDAB1590(陽(yáng)性GFP表ii^f照)的圖示。圖61是描繪了預(yù)測(cè)的、由IL-l鋅指-Fokl融合蛋白刺激的染色體間同源重組的示意圖。圖62是描繪了預(yù)測(cè)的、由Scd27鋅指-Fokl融合蛋白刺激的染色體間同源重組的示意圖。圖63是描繪了重組體PCR分析的凝膠。在凝膠上方標(biāo)記了左側(cè)前4道。標(biāo)記的第l-5道顯示了來(lái)自用C3HIL-l-Fokl融合蛋白基因進(jìn)行的BY2-380轉(zhuǎn)化的HR事件，標(biāo)記的第6-7道顯示了來(lái)自用C3HSCD27-Fokl融合蛋白基因進(jìn)行的BY2-380轉(zhuǎn)化的HR事件。圖64顯示了玉米IPP2IC基因序列(SEQIDNO:6),其衍生自HiII細(xì)胞培養(yǎng)圖65(小圖A至E)描繪了ZFN表達(dá)載體克隆方案。使用逐步克隆策略來(lái)產(chǎn)生ZFN表達(dá)構(gòu)建體。將各個(gè)ZFN編碼基因克隆入載體pVAX-N2A-NLSop2-EGFP-FokMono(A)和pVAX-C2A-NLSop2-EGFP-FokMono(B)中以創(chuàng)建二元蛋白質(zhì)盒(dual-proteincassette)(C)。將該盒連接入pDAB3872(D)中以生成最終的質(zhì)粒(E),用于表達(dá)ZFN異二聚體。圖66描繪了玉米IPP2K基因中的ZFN結(jié)合。需要兩個(gè)ZFN蛋白來(lái)實(shí)施對(duì)DNA的雙鏈切割。顯示了切割位點(diǎn)(用向下的箭頭指示的)周圍的序列(SEQIDNO:7)。若一個(gè)蛋白質(zhì)(8705)結(jié)合序列CTGTGGGGCCAT(上鏈)(SEQIDNO:8)，則另一個(gè)蛋白質(zhì)(8684、8685、或8686)結(jié)合下游序列(CTTGACCAACTCAGCCAG，下鏈)(SEQIDNO:9)。圖67描繪了野生型(頂部序列，SEQIDNO:IO)和ZFN克隆127(底部序列，SEQIDNO:11)的序列。以灰色框突出顯示了該ZFN的切割靶物。圖68顯示了通過(guò)454測(cè)序所檢測(cè)的玉米IPP2K基因中由ZFN介導(dǎo)的dsDNA斷裂的非同源末端連接(NHEJ)引起的多種刪除的比對(duì)。以灰色框突出顯示了該ZFN的切割靶物。圖69是描繪了在美國(guó)專利No.2005/0064474和本文中所述GFP細(xì)胞報(bào)道測(cè)定系統(tǒng)中的基因校正率的圖形。在每個(gè)柱形下方顯示了每個(gè)樣品中所測(cè)試的ZFN對(duì)。圖70描繪了如實(shí)施例18B所述那樣構(gòu)建的質(zhì)粒pDAB7471。圖71描繪了如實(shí)施例18C所述那樣構(gòu)建的質(zhì)粒pDAB7451。圖72是描繪了例示性自主除草劑耐受基因表達(dá)盒的示意圖。該結(jié)構(gòu)如實(shí)施例18D所述的那樣包含完整啟動(dòng)子-轉(zhuǎn)錄單位(PTU),其包含啟動(dòng)子、除草劑耐受基因和聚腺苷酸化(聚腺苷酸(polyA))終止序列。圖73描繪了如實(shí)施例18E所述那樣構(gòu)建的質(zhì)粒pDAB7422。該質(zhì)粒包含插入位置l質(zhì)粒主鏈(backbone)中的完整啟動(dòng)子-轉(zhuǎn)錄單位(PTU),其包含啟動(dòng)子、除草劑耐受基因和聚腺苷酸化(聚腺香酸)終止序列。圖74描繪了如實(shí)施例18E所述那樣構(gòu)建的質(zhì)粒pDAB7452。該質(zhì)粒包含插入位置2質(zhì)粒主鏈中的完整啟動(dòng)子-轉(zhuǎn)錄單位(PTU),其包含啟動(dòng)子、除草劑耐受基因和聚腺苷酸化(聚腺苷酸)終止序列。圖75是描繪了例示性非自主除草劑耐受基因表達(dá)盒的示意圖。該結(jié)構(gòu)如實(shí)施例18F所述的那樣包含不完整啟動(dòng)子-轉(zhuǎn)錄單位(PTU)，其包含除草劑耐受基因和聚腺苦酸化(聚腺苦酸)終止序列。圖76描繪了如實(shí)施例18G所述那樣構(gòu)建的質(zhì)粒pDAB7423。該質(zhì)粒包含插入位置1質(zhì)粒主鏈中的不完整啟動(dòng)子-轉(zhuǎn)錄單位(PTU),其包含除草劑耐受基因和聚腺苷酸化(聚腺苷酸)終止序列。圖77描繪了如實(shí)施例18G所述那樣構(gòu)建的質(zhì)粒pDAB7454。該質(zhì)粒如實(shí)施例18G所述的那樣包含插入位置2質(zhì)粒主鏈中的不完整啟動(dòng)子-轉(zhuǎn)錄單位(PTU),其包含除草劑耐受基因和聚腺苷酸化(聚腺苷酸)終止序列。圖78描繪了如實(shí)施例18H所述那樣構(gòu)建的質(zhì)粒pDAB7424(—種例示性的經(jīng)Gateway⑧改編(adapt)的位置l自主供體)。圖79描繪了如實(shí)施例18H所述那樣構(gòu)建的質(zhì)粒pDAB7425(—種例示性的經(jīng)Gateway⑧改編的位置1自主供體)。圖80描繪了如實(shí)施例18H所述那樣構(gòu)建的質(zhì)粒pDAB7426。pDAB7426是一種組合質(zhì)粒，其包含位置l自主供體及ZFN表達(dá)盒。圖81描繪了如實(shí)施例18H所述那樣構(gòu)建的質(zhì)粒pDAB7427。pDAB7427是一種組合質(zhì)粒，其包含位置l自主供體及ZFN表達(dá)盒。圖82描繪了來(lái)自基因組DNA的供體DNA特異性序列的擴(kuò)增。317bp產(chǎn)物的存在判斷出插入玉米胼胝體(callus)系弁61-72基因組中的、包含PAT基因的13供體DNA的存在，如實(shí)施例20C所述的。HiII指示野生型陰性對(duì)照。圖83描繪了供體DNA和IPP2K特異的玉米基因組序列間的5，邊界的擴(kuò)增。如實(shí)施例21A所述，根據(jù)1.65Kbp的DNA片段的存在判斷出由供體向IPP2K基因中輩巴向整合而衍生的再次PCR產(chǎn)物(secondaryPCRproduct)。Hill指示野生型陰性對(duì)照。圖84描繪了供體DNA和IPP2K特異的玉米基因組序列間的3，邊界的擴(kuò)增。如實(shí)施例21A所述，根據(jù)1.99Kbp的DNA片段的存在判斷出由供體向IPP2IC&因中靶向整合而衍生的再次PCR產(chǎn)物。HiII指示野生型陰性對(duì)照。圖85描繪了基因組和供體之間的上游(5，)邊界的擴(kuò)增。如實(shí)施例21B邊界)中耙向整合而衍生的PCR產(chǎn)物。HiII指示野生型陰性對(duì)照。圖86描繪了供體和基因組之間的下游(3，)邊界的擴(kuò)增。如實(shí)施例21B邊界)中耙向整合而衍生的PCR產(chǎn)物。HiII指示野生型陰性對(duì)照。圖87描繪了位置15，同源性側(cè)翼的序列(SEQIDNO:171)。圖88描繪了位置13'同源性側(cè)翼的序列(SEQIDNO:172)。圖89描繪了位置25，同源性側(cè)翼的序列(SEQIDNO:139)。圖90描繪了位置23，同源性側(cè)翼的序列(SEQIDNO:140)。圖91描繪了ZFN靶向區(qū)域的上游(5，-)IPP2K基因組序列的序列(SEQIDNO:141)。圖92描繪了ZFN靶向區(qū)域的下游(3，-)IPP2K基因組序列的序列(SEQIDNO:142)。發(fā)明詳述本文中所公開(kāi)的是包含含有Cys-Cys-His-Cys形式非規(guī)范鋅指的鋅指結(jié)合多肽(ZFP)的組合物。由于鋅配位為鋅指提供了主要的折疊能量，鋅配位殘基的調(diào)整提供了一種用于修改指穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)的簡(jiǎn)便手段，穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)對(duì)鋅指蛋白的多種重要功能性特征產(chǎn)生影響，包括例如細(xì)胞半衰期、與其它細(xì)胞因子的相互作用、DNA結(jié)合特異性和親和力、及功能域的相對(duì)取向。已經(jīng)有顯示，包含非規(guī)范鋅指的鋅指蛋白(諸如那些在美國(guó)專利申請(qǐng)No.20030108880;20060246567;和20060246588中所披露的)結(jié)合DNA并改變轉(zhuǎn)錄。然而，在被摻入鋅指核酸酶(ZFN，參見(jiàn)例如美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)文本No.2005/0064474)后，這些先前描述的非規(guī)范鋅指蛋白有時(shí)會(huì)在切割靶DNA方面展現(xiàn)出欠佳的(sub-optimal)活性。本文中所描述的是包含一個(gè)或多個(gè)CCHC鋅指的鋅指蛋白，其中C端鋅配位殘基對(duì)周圍的特定序列已經(jīng)被改變。本文中還描述的是包含這些經(jīng)過(guò)優(yōu)化的非規(guī)范鋅指的融合蛋白，例如鋅指核酸酶(ZFN),其中所述ZFN以與使用包含規(guī)范(CCHH)鋅指的ZFN實(shí)現(xiàn)的切割作用相當(dāng)?shù)乃俾驶虮嚷?rate)切割耙DNA。本文中所公開(kāi)的融合多肽能增強(qiáng)或抑制基因的轉(zhuǎn)錄和/或切割靶序列。還提供了編碼經(jīng)過(guò)優(yōu)化的非規(guī)范鋅指的多核苷酸、和編碼包含一個(gè)或多個(gè)經(jīng)過(guò)優(yōu)化的非規(guī)范鋅指的融合蛋白的多核苷酸。另外提供的是藥用組合物，其包含與藥學(xué)可接受載體組合的治療有效量的本文所述任何鋅指-核苷酸結(jié)合多肽或其功能性片段或治療有效量的編碼任何改良鋅指-核苷酸結(jié)合多肽或其功能性片段的核苷酸序列。還提供的是農(nóng)用組合物，其包含與農(nóng)學(xué)可接受載體組合的農(nóng)藝學(xué)有效量的本文所述任何鋅指-核苷酸結(jié)合多肽或其功能性片段或農(nóng)藝學(xué)有效量的編碼任何改良鋅指-核苷酸結(jié)合多肽或其功能性片段的核苦酸序列。還提供的是用于獲得能結(jié)合基因組序列的改良鋅指-核苷酸結(jié)合多肽的篩選方法?；蚪M序列包括那些存在于染色體、附加體、細(xì)胞器基因組(例如線粒體、葉綠體)、人工染色體和細(xì)胞中存在的任何其它類型的核酸(諸如例如擴(kuò)增序列、雙微染色體、和內(nèi)源的或感染的細(xì)菌和病毒的基因組)中的?；蚪M序列可以是正常的(即野生型)或突變的；突變序列可以包含例如插入、刪除、替代、易位、重排、和/或點(diǎn)突變?；蚪M序列還可以包含許多不同的等位基因之一。通用技術(shù)除非另有說(shuō)明，本文所公開(kāi)組合物的制備和使用以及方法的實(shí)施采用分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、計(jì)算化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA及相關(guān)領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)是在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有全面的解釋。參見(jiàn)例如Sambrook等，MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989及第三版，2001;Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,JohnWiley&Sons,NewYork,1987及定期更新；叢書(shū)METHODSINENZYMOLOGY,AcademicPress,SanDiego;Wolffe,CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION,第三版，AcademicPress,SanDiego，1998;METHODSINENZYMOLOGY,巻304,"Chromatin"(P.M.Wassa腿n和A.P.Wolffe編)，AcademicPress,SanDiego,1999;及METHODSINMOLECULARBIOLOGY，巻119,"ChromatinProtocols"(P.B.Becker編)，HumanaPress,Totowa,1999。定義術(shù)語(yǔ)"核酸"、"多核苷酸"、和"寡核苷酸"可互換使用，指處于線性或環(huán)狀構(gòu)象的，及或是單鏈或是雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。為了本公開(kāi)的目的，這些術(shù)語(yǔ)不解釋為關(guān)于聚合物長(zhǎng)度的限制。該術(shù)語(yǔ)可以涵蓋天然核苷酸的已知類似物以及堿基、糖和/或磷酸模塊中有修飾的核苷酸(例如硫代磷酸酯主鏈)。一般而言，特定核苷酸的類似物具有相同的堿基配對(duì)特異性；即A的類似物會(huì)與T進(jìn)行堿基配對(duì)。術(shù)語(yǔ)"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語(yǔ)還應(yīng)用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸是相應(yīng)天然存在氨基酸的化學(xué)類似物或修飾衍生物的氨基酸聚合物。"結(jié)合"指大分子間(例如蛋白質(zhì)和核酸間)序列特異性的、非共價(jià)的相互作用。結(jié)合相互作用的所有成分并非都必需是序列特異性的(例如與DNA主鏈中磷酸殘基接觸)，只要作為整體的相互作用是序列特異性的。一般地，此類相互作用的特征在于解離常數(shù)(Kd)為10《M"或更低。"親和力"指結(jié)合強(qiáng)度結(jié)合親和力升高與Kd降低相關(guān)。"結(jié)合蛋白，，指能夠非共價(jià)結(jié)合另一分子的蛋白質(zhì)。結(jié)合蛋白可以結(jié)合例如DNA分子(DNA結(jié)合蛋白)、RNA分子(RNA結(jié)合蛋白)和/或蛋白質(zhì)分子(蛋白質(zhì)結(jié)合蛋白)。在蛋白質(zhì)結(jié)合蛋白的情況中，它可以結(jié)合其本身(以形成同二聚體、同三聚體、等等)和/或它可以結(jié)合一個(gè)或多個(gè)分子的不同的一種或多種蛋白質(zhì)。結(jié)合蛋白可以具有超過(guò)一種類型的結(jié)合活性。例如，鋅指蛋白具有DNA結(jié)合、RNA結(jié)合及蛋白質(zhì)結(jié)合活性。"鋅指DNA結(jié)合蛋白"(或結(jié)合結(jié)構(gòu)域)指經(jīng)由一個(gè)或個(gè)鋅指、以序列特異性方式結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)或較大蛋白質(zhì)內(nèi)的結(jié)構(gòu)域，所述鋅指是結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氨基酸序列區(qū)域且其結(jié)構(gòu)通過(guò)鋅離子配位而穩(wěn)定化。術(shù)語(yǔ)鋅指DNA結(jié)合蛋白通常縮寫(xiě)為鋅指蛋白或ZFP。鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以"改造或工程化"(engineer)成結(jié)合預(yù)定的核苷酸序列。設(shè)計(jì)和選擇是用于工程化鋅指蛋白的方法的非限制性例子。設(shè)計(jì)的鋅指蛋白是自然界中不存在的蛋白質(zhì)，其設(shè)計(jì)/組成主要源自合理標(biāo)準(zhǔn)(rationalcriteria)。用于設(shè)計(jì)的合理標(biāo)準(zhǔn)包括應(yīng)用替代規(guī)則和計(jì)算機(jī)化算法，用于處理存儲(chǔ)現(xiàn)有ZFP設(shè)計(jì)和結(jié)合數(shù)據(jù)信息的數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息。參見(jiàn)例如美國(guó)專利6,140,081;6,453,242;6,534,261;及6,785,613;還可參見(jiàn)WO98/53058;WO98/53059;WO98/53060;WO02/016536和WO03/016496;及美國(guó)專利6,746,838;6,866,997;及7,030,215。"選擇的，，鋅指蛋白指自然界中沒(méi)有找到的蛋白質(zhì)，其生成主要源自經(jīng)驗(yàn)方法，諸如噬菌體展示、相互作用陷阱、或雜合物選擇。參見(jiàn)例如US5,789,538;US5,925,523;US6,007,988;US6,013,453;US6,200,759;US6,733,970;USRE39,229;及WO95/19431;WO96/06166;WO98/53057;WO98/54311;WO00/27878;WO01/60970;WO01/88197及WO02/099084。"非規(guī)范的"鋅指蛋白指包含非規(guī)范(非C2H2)鋅指的蛋白質(zhì)。如此，與天然存在C2H2鋅指蛋白相比，非規(guī)范鋅指包含至少一個(gè)氨基酸的替代、添加和/或刪除。非規(guī)范鋅指的非限制性例子包括那些包含Cys-Cys-His-Cys(例如C3H)(從氨基至羧基)鋅配位殘基的。"同源序列，，指與第二序列分享某種程度的序列同一性，而且其序列可以與第二序列的序列相同的第一序列。"同源但不相同的序列"指與第二序列分享某種程度的序列同一性，但其序列與第二序列的序列不相同的第一序列。例如，包含突變型基因之野生型序列的多核苷酸與突變型基因的序列同源但不相同。在某些實(shí)施方案中，兩個(gè)序列之間的同源性程度足以容許它們之間利用正常細(xì)胞機(jī)制進(jìn)行同源重組。兩個(gè)同源但不相同的序列可以是任何長(zhǎng)度，而且它們的非同源性程度可以小至單個(gè)核苷酸(例如用于通過(guò)靶向同源重組來(lái)校正基因組點(diǎn)突變)或大至10千堿基或更多(例如用于在染色體中預(yù)定位點(diǎn)處插入基因)。包含同源但不相同序列的兩個(gè)多核苷酸不必具有相同長(zhǎng)度。例如，可以使用20和10,000個(gè)核苷酸或核苷酸對(duì)之間的外源多核苷酸(即供體多核苷酸)。用于測(cè)定核酸和氨基酸序列同一性的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。典型地，此類技術(shù)包括對(duì)基因測(cè)定mRNA的核苷酸序列和/或測(cè)定由其所編碼的氨基酸序列，并將這些序列與第二核苷酸或氨基酸序列進(jìn)行比較?；蚪M序列也可以以這種方式進(jìn)行測(cè)定和比較。一4殳而言，同一性指兩個(gè)多核苦酸序列間準(zhǔn)確的核苷酸與核苷酸(nucleotide-to-nucleotide)對(duì)應(yīng)或兩個(gè)多肽序列間準(zhǔn)確的氨基酸與氨基酸(aminoacid-to-aminoacid)對(duì)應(yīng)。兩個(gè)或更多個(gè)序列(多核苷酸或氨基酸)可以通過(guò)測(cè)定它們的百分比同一性來(lái)進(jìn)行比較。兩個(gè)序列(無(wú)論是核酸序列還是氨基酸序列)的百分比同一性是兩個(gè)比對(duì)序列之間的準(zhǔn)確匹配的數(shù)目除以較短序列的長(zhǎng)度并乘以100。核酸序列的近似比對(duì)由Smith和Waterman,AdvancesinAppliedMathematics2:482-489(1981)的局部同源性算法提供。該算法可以通過(guò)使用如下評(píng)分矩陣而應(yīng)用于氨基酸序列，所述評(píng)分頭巨陣由Dayhoff，AtlasofProteinSequencesandStructure,M.O.Dayhoff編，5suppl.3:353-358,NationalBiomedicalResearchFoundation,Washington,D.C.,USA開(kāi)發(fā)，并由Gribskov,Nucl.AcidsRes.14(6):6745-6763(1986)標(biāo)準(zhǔn)化。該算法測(cè)定序歹'J百分比同一性的例示性執(zhí)行由GeneticsComputerGroup(Madison,WI)在"最佳擬合"("BestFit")實(shí)用申請(qǐng)(utilityapplication)中提供。這種方法的擊夾省參凄ti己載于WisconsinSequenceAnalysisPackageProgramManual,第8版(1995)(可得自GeneticsComputerGroup,Madison,WI)。在本公開(kāi)的背景中建立百分比同一性的例示性方法是使用MPSRCH程序包，所述MPSRCH程序包的版權(quán)為UniversityofEdinburgh所有，由JohnF.Collins和ShaneS.Sturrok開(kāi)發(fā)，并由IntelliGenetics,Inc.(MountainView,CA)銷售。自這套程序包，可以采用Smith-Waterman算法，其中將缺省參數(shù)用于評(píng)分表(例如缺口打開(kāi)罰分為12,缺口延伸罰分為l,且缺口為6)。自所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，"匹配"值反映序列同一性。其它適于計(jì)算序列間百分比同一性或相似性的程序是本領(lǐng)域普遍知道的，例如，另一種比對(duì)程序是與缺省參數(shù)一起使用的BLAST。例如，可以使用BLASTN和BLASTP,其使用以下缺省參數(shù)遺傳代碼=標(biāo)準(zhǔn)；濾器(filter)-無(wú)；鏈二雙《連(both);截留(cutoff^60;期望(expect"10;矩陣(Matrix"BLOSUM62;描述(Descriptions)二50個(gè)序列；排序(sortby)二HIGHSCORE;數(shù)據(jù)庫(kù)(Databases"非冗余的，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBankCDS翻譯十Swiss蛋白質(zhì)十Spupdate+PIR。這些程序的詳情可以在因特網(wǎng)上找到。關(guān)于本文所述序列，序列同一性的期望程度范圍是大約35%至100%和其間的任何整數(shù)值。典型地，序列間百分比同一性是至少35%-40%;40%-45%;45%-50%;50%-60%;60%-70%;70-75%，優(yōu)選80-82%,更優(yōu)選85%-90%,甚至更優(yōu)選92%，還更優(yōu)選95%,并且最優(yōu)選98%的序列同一性。或者，多核苷酸間序列相似性的程度可以如下測(cè)定，即在容許同源區(qū)間形成穩(wěn)定雙鏈體的條件下進(jìn)行多核苷酸雜交，接著使用單鏈特異性核酸酶進(jìn)行消化，并測(cè)定消化后片段的大小。若根據(jù)使用上述方法的測(cè)定，兩個(gè)核酸序列或兩個(gè)多肽序列在限定長(zhǎng)度的分子里展現(xiàn)至少大約70%-75°/。，優(yōu)選80%-82%,更優(yōu)選85%-90%,甚至更優(yōu)選92%,還更優(yōu)選95%,并且最優(yōu)選98%的序列同一性，則所述兩個(gè)核酸序列或兩個(gè)多肽序列彼此基本上同源。在用于本文時(shí)，基本上同源還指相對(duì)于指定的DNA或多肽序列顯示完全同一性的序列。基本上同源的DNA序列可以在Southern雜交實(shí)驗(yàn)中于例如嚴(yán)格條件(由那種特定系統(tǒng)所確定)下鑒定。確定合適雜交條件是在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的。參見(jiàn)例如Sambrook等，見(jiàn)上文；NucleicAcidHybridization:APracticalApproach,編輯B.D.Hames和SJ.Higgins,(1985)Oxford;Washington,DC;IRLPress。兩個(gè)核酸片段的選擇性雜交可以如下測(cè)定。兩個(gè)核酸分子之間序列同一性的程度影響此類分子間雜交事件的效率和強(qiáng)度。部分相同的核酸序列至少會(huì)部分抑制完全相同序列與靶分子的雜交。對(duì)完全相同序列的雜交的抑制可以^f吏用本領(lǐng)域公知的雜交測(cè)定法來(lái)評(píng)估(例如Southern(DNA)印跡、Northern(RNA)印跡、溶液雜交等，參見(jiàn)Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版，(1989)ColdSpringHarbor,N.Y.)。此類測(cè)定法可以使用不同程度的選擇性(例如使用從低嚴(yán)格性至高嚴(yán)格性的不同條件)來(lái)實(shí)施。如果采用低嚴(yán)格性條件，那么非特異性結(jié)合的缺乏可以如下評(píng)估，即使用甚至缺乏部分程度序列同一性的第二探針(例如與靶分子具有小于大約30。/。序列同一性的探針)，使得在沒(méi)有非特異性結(jié)合事件時(shí)，所述第二探針不會(huì)與靶物雜交。在利用基于雜交的檢測(cè)系統(tǒng)時(shí)，選擇與參照核酸序列互補(bǔ)的核酸探針，然后通過(guò)選擇合適的條件，使得所述探針和參照序列彼此選擇性雜交或結(jié)合以形成雙鏈體分子。能夠在中等嚴(yán)格雜交條件下選擇性雜交參照序列的核酸分子典型地在如下條件發(fā)生雜交，所述條件容許檢測(cè)與選定核酸探針序列具有至少大約70。/。序列同一性的、長(zhǎng)度為至少大約10-14個(gè)核苷酸的靶核酸序序列同一性的、長(zhǎng)度為至少大約10-14個(gè)核苷酸的靶核S吏序列。對(duì)于探針/參照序列雜交有用的雜交條件(其中探針和參照序列具有特定程度的序列同一性)可以如本領(lǐng)域所知的那樣確定(參見(jiàn)例如NucleicAcidHybridization:APracticalApproach,纟扁I尋B.D.Hames牙口S丄Higgins,(1985)Oxford;Washington:DC;IRLPress)。雜交條件對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。雜交嚴(yán)格性指雜交條件不利于形成含有錯(cuò)配核苷酸的雜合物所達(dá)到的程度，其中較高的嚴(yán)格性與對(duì)錯(cuò)配雜合物較低的耐受性相關(guān)。影響雜交嚴(yán)格性的因素對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的，并且包括但不限于溫度、pH、離子強(qiáng)度、及有機(jī)溶劑(諸如例如曱酰胺和二曱亞砜)濃度。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的，雜交嚴(yán)格性由于溫度升高、離子強(qiáng)度降低及溶劑濃度降低而增加。關(guān)于雜交的嚴(yán)格性條件，本領(lǐng)域公知的是可以采用很多等同條件來(lái)建立特定的嚴(yán)格性，這通過(guò)改變例如下列因素來(lái)實(shí)現(xiàn)序列的長(zhǎng)度和性質(zhì)、各種序列的堿基組成、鹽類和其它雜交溶液成分的濃度、雜交溶液中是否存在封閉齊'J(例如硫酸右旋糖苦和聚乙二醇)、雜交反應(yīng)溫度及時(shí)間參數(shù)；以及改變洗滌條件來(lái)實(shí)現(xiàn)。雜交條件的具體集合的選擇遵循本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行(參見(jiàn)1"列i口Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二片反,(1989)ColdSpringHarbor,N.Y.)。"重組"指兩個(gè)多核苷酸之間交換遺傳信息的過(guò)程。為了本公開(kāi)的目的，"同源重組(HR)"指在例如細(xì)胞中雙鏈斷裂的修復(fù)過(guò)程中發(fā)生的此類交換的專門(mén)化形式。這種過(guò)程要求核苷酸序列同源性，使用"供體"分子來(lái)進(jìn)行"靶物"分子(即經(jīng)歷了雙鏈斷裂的分子)的模板修復(fù)，并且因?yàn)槠鋵?dǎo)致遺傳信息從供體轉(zhuǎn)移至靶物，因而不同地稱為"非交叉型基因轉(zhuǎn)換"("non-crossovergeneconversion")或"4豆道基因?qū)?zhēng)才奐，，("shorttractgeneconversion")。在不希望被任何具體理論限制的前提下，這種轉(zhuǎn)移可以牽涉斷裂的靶物和供體之間所形成的異源雙鏈體DNA的錯(cuò)配校正，和/或"合成依賴性鏈退火"("synthesis-dependentstrandannealing")(其中4吏用供體來(lái)再合成會(huì)變?yōu)檩叞臀镆徊糠值倪z傳信息)，和/或相關(guān)過(guò)程。這種專門(mén)化的HR通常導(dǎo)致靶物分子序列的改變，使得供體多核苷酸序列的部或整個(gè)摻入靶多核苷酸中。"切割，，指DNA分子共價(jià)主鏈的斷裂。切割可以通過(guò)多種方法來(lái)啟動(dòng)，包括但不限于磷酸二酯鍵的酶促或化學(xué)水解。單鏈切割和雙鏈切割兩者都是可能的，而且雙鏈切割可以因?yàn)閮蓚€(gè)不同的單鏈切割事件而發(fā)生。DNA切割可以導(dǎo)致平末端或交錯(cuò)末端的產(chǎn)生。在某些實(shí)施方案中，將融合多肽用于靶向雙《連DNA切割。"切割結(jié)構(gòu)域"包含擁有對(duì)DNA切割的催化活性的一種或多種多肽序列。切割結(jié)構(gòu)域可以包含在單條多肽鏈中，或者切割活性可以源自兩個(gè)(或更多個(gè))多肽的結(jié)合。"切割半結(jié)構(gòu)域"指與第二多肽(或是相同的或是不同的)結(jié)合而形成具有切割活性(優(yōu)選雙鏈切割活性)的復(fù)合物的多肽序列。術(shù)語(yǔ)"切割結(jié)構(gòu)域"和"切割半結(jié)構(gòu)域"包括切割結(jié)構(gòu)域或切割半結(jié)構(gòu)域的野生型結(jié)構(gòu)域和部分或突變體，其保留多聚化(例如二聚化)以形成功能性切割結(jié)構(gòu)域的能力。"染色質(zhì)"指包含細(xì)胞基因組的核蛋白結(jié)構(gòu)。細(xì)胞染色質(zhì)包含核酸(主要是DNA)及蛋白質(zhì)(包括組蛋白和非組蛋白染色體蛋白質(zhì))。大多數(shù)真核細(xì)胞染色質(zhì)以核小體形式存在，其中核小體核心包含大約150個(gè)堿基對(duì)的DNA,該DNA與包含雙份各為組蛋白H2A、H2B、H3和H4的八聚體結(jié)合；并且連接區(qū)DNA(是可變長(zhǎng)度的，取決于生物體)在核小體核心之間延伸。一般地，一分子組蛋白H1與連接區(qū)DNA結(jié)合。為了本公開(kāi)的目的，術(shù)語(yǔ)"染色質(zhì)"意圖涵蓋細(xì)胞核蛋白的所有類型，原核生物的及真核生物的兩者。細(xì)胞染色質(zhì)包括染色體型的和附加體型的染色質(zhì)兩者。"染色體"指包含細(xì)胞基因組的整個(gè)或部分的染色質(zhì)復(fù)合物。通常，細(xì)胞基因組的特征在于其核型，其是構(gòu)成細(xì)胞基因組的所有染色體的集合(collection)。細(xì)胞基因組可包含一個(gè)或多個(gè)染色體。"附加體，，(episome)指復(fù)制型核酸、核蛋白復(fù)合物或包含不是細(xì)胞染色體核型一部分的核酸的其它結(jié)構(gòu)。附加體的例子包括質(zhì)粒和某些病毒基因組。"可及區(qū)"(accessibleregion)指細(xì)胞染色質(zhì)中的如下位點(diǎn)，其中核酸中存在的耙位點(diǎn)可以被識(shí)別該靶位點(diǎn)的外源分子結(jié)合。在不希望被任何具體理論限制的前提下，認(rèn)為可及區(qū)是不被包裝入核小體結(jié)構(gòu)中的區(qū)域。不同的可及區(qū)結(jié)構(gòu)通?？梢酝ㄟ^(guò)其對(duì)化學(xué)和酶探針(例如核酸酶)的敏感性來(lái)檢測(cè)。"靶位點(diǎn)，，或"靶序列，，指對(duì)結(jié)合分子會(huì)結(jié)合(倘若存在足以使結(jié)合發(fā)生的條件的話)的核酸部分進(jìn)行限定的核酸序列。例如，序列5，-GAATTC-3，是EcoRI限制性內(nèi)切核酸酶的靶位點(diǎn)。"外源的，，分子指正常情況下不存在于細(xì)胞中但可以通過(guò)一種或多種遺傳的、生化的或其它方法而導(dǎo)入細(xì)胞中的分子。"正常存在于細(xì)胞中"是相對(duì)于細(xì)胞的特定發(fā)育階段和環(huán)境條件而確定的。如此，例如，僅存在于肌肉休克所誘導(dǎo)的分子是相對(duì)于未熱休克細(xì)胞的外源分子。外源分子可以包含例如機(jī)能失常的(malfunctioning)內(nèi)源分子的機(jī)能(flmctioning)型式或正常機(jī)能的內(nèi)源分子的機(jī)能失常型式。外源分子可以是小分子(諸如通過(guò)組合式化學(xué)方法所生成的)、或大分子(諸如蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、多糖)、上述分子的任何修飾衍生物、或任何包含一種或多種上述分子的復(fù)合物等等。核酸包括DNA和RNA,可以是單鏈或雙鏈；可以是線性的、分枝的或環(huán)狀的；而且可以是任何長(zhǎng)度的。核酸包括那些能夠形成雙鏈體的核酸，以及形成三鏈體的核酸。參見(jiàn)例如美國(guó)專利No.5,176,996和5，422，251。蛋白質(zhì)包括但不限于DNA結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、染色質(zhì)重建因子(chromatinremodelingfactor)、曱基化DNA結(jié)合蛋白、聚合酶、甲基化酶、脫曱基酶、乙?；?acetylase)、脫乙?；?、激酶、磷酸酶、整合酶、重組酶、連接酶、拓樸異構(gòu)酶、促旋酶、及解旋酶。外源分子可以是與內(nèi)源分子相同類型的分子，例如外源蛋白質(zhì)或核酸。例如，外源核酸可以包含感染性病毒基因組、才艮癌土壤桿菌C4gragacfeWwmfwwe/ac&似)T鏈、導(dǎo)入細(xì)胞中的質(zhì)?；蚋郊芋w、或正常情況下不存在于細(xì)胞中的染色體。但是，外源核酸或多核苷酸可包含與內(nèi)源序列同源或相同的序列。相對(duì)于特定內(nèi)源基因組區(qū)域，"外源序列"指不存在于該區(qū)域的核苷酸序列。該外源序列可存在于另一內(nèi)源染色體位置或其可能根本不存在于基因組中。如此，外源多核苦酸可包含外源和內(nèi)源序列兩者例如，側(cè)翼為與基因組區(qū)域同源的序列的轉(zhuǎn)基因。在下文所述用于靶向整合和靶向重組的方法中使用此類外源核酸。用于將外源分子導(dǎo)入細(xì)胞中的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，并且包括但不限于脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移(即脂質(zhì)體，其包括中性脂質(zhì)和陽(yáng)離子脂質(zhì))、電穿孔、直接注射、細(xì)胞融合、粒子轟擊、磷酸鈣共沉淀、DEAE-右旋糖苷介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、及病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移。比較而言，"內(nèi)源的"分子指正常存在于特定環(huán)境條件下處于特定發(fā)育階段的特定細(xì)胞中的分子。例如，內(nèi)源核酸可以包含染色體，線粒體、葉綠體或其它細(xì)胞器的基因組，或天然存在的附加體型核酸。別的內(nèi)源分子可以包括蛋白質(zhì)，例如轉(zhuǎn)錄因子和酶。"融合(物)"分子指其中有兩個(gè)或更多個(gè)亞基分子連接(例如共價(jià)地)在一起的分子。亞基分子可以是相同化學(xué)類型的分子，或者可以是不同化學(xué)類型的分子。第一種類型的融合分子的例子包括但不跟于融合蛋白(例如ZFPDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和切割結(jié)構(gòu)域之間的融合物)和融合核酸(例如編碼上文所述融合蛋白的核酸)。第二種類型的融合分子的例子包括但不限于形成三鏈體的核酸和多肽之間的融合物，及小溝結(jié)合物和核酸之間的融合物。融合蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)可以源自將該融合蛋白投遞至細(xì)胞或者通過(guò)將編碼該融合蛋白的多核香酸投遞至細(xì)胞，其中所述多核苷酸被轉(zhuǎn)錄，而且轉(zhuǎn)錄物被翻譯，以生成所述融合蛋白。蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的表達(dá)還可以牽涉反式剪接、多肽切割和多肽連接。用于將多核苷酸和多肽投遞至細(xì)胞的方法在本公開(kāi)的別處提出。"基因，，為了本公開(kāi)的目的包括編碼基因產(chǎn)物的DNA區(qū)域(見(jiàn)下文)，以及調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物生成的所有DNA區(qū)域，無(wú)論此類調(diào)節(jié)序列是否鄰近編碼序列和/或被轉(zhuǎn)錄序列。因而，基因包括但不必限于啟動(dòng)子序列、終止子、翻譯調(diào)節(jié)序列(諸如核糖體結(jié)合位點(diǎn)和內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn))、增強(qiáng)子、沉默基因(silencer)、絕緣子(insulator)、邊界元件、復(fù)制起點(diǎn)、基質(zhì)附著位點(diǎn)、及基因座控制區(qū)。"基因表達(dá)，，指基因中所含信息轉(zhuǎn)換成基因產(chǎn)物?；虍a(chǎn)物可以是基因的直接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(例如mRNA、tRNA、rRNA、反義RNA、核酶、結(jié)構(gòu)性RNA或任何其它類型的RNA)或通過(guò)mRNA翻譯所生成的蛋白質(zhì)?；虍a(chǎn)物還包括通過(guò)加帽、聚腺苷酸化、曱基化和編輯等過(guò)程所修飾的RNA，及通過(guò)例如曱基化、乙酰化、磷酸化、遍在蛋白化、ADP-核糖基化、肉豆蔻基化和糖基化所修飾的蛋白質(zhì)?；虮磉_(dá)的"調(diào)控，，指基因活性的變化。表達(dá)調(diào)控可以包括但不限于基因激活和基因阻抑。"植物"細(xì)胞包括但不限于單子葉(monocot)或雙子葉(dicot)植物的細(xì)胞。單子葉植物的非限制性例子包括谷類植物，諸如玉米、稻、大麥、燕麥、小麥、高粱、黑麥、甘蔗、菠蘿、洋蔥、香蕉、及椰子。雙子葉植物的非限制性例子包括煙草、番茄、向日葵、棉、甜菜、馬鈴薯、萵苣、甜瓜(melon)、大豆、蕓苔(油菜)、及苜蓿。植物細(xì)胞可以來(lái)自植物的任何部分和/或來(lái)自植物發(fā)育的任何階段。"感興趣區(qū)域"指期望與外源分子結(jié)合的任何細(xì)胞染色質(zhì)區(qū)域，諸如例如基因或基因內(nèi)或與基因鄰近的非編碼序列。結(jié)合可以是為了靶向DNA切割和/或靶向重組的目的。例如，感興趣區(qū)域可以存在于染色體、附加體、細(xì)胞器基因組(例如線粒體的、葉綠體的)、或感染性病毒基因組中。感興趣區(qū)域可以在基因的編碼區(qū)內(nèi)、轉(zhuǎn)錄的非編碼區(qū)(諸如例如前導(dǎo)序列、尾隨序列或內(nèi)含子)內(nèi)、或非轉(zhuǎn)錄區(qū)(或是編碼區(qū)上游或是編碼區(qū)下游)內(nèi)。感興趣區(qū)域的長(zhǎng)度可以小至單個(gè)核苷酸對(duì)或高達(dá)25,000個(gè)核苷酸對(duì)，或任何整數(shù)值的核芬酸對(duì)。術(shù)語(yǔ)"可操作連接"關(guān)于兩個(gè)或更多個(gè)構(gòu)件(諸如序列元件)并列時(shí)可互換使用，其中對(duì)所述構(gòu)件進(jìn)行排列使得兩個(gè)構(gòu)件都正常發(fā)揮功能，并容許所述構(gòu)件中至少一個(gè)可以介導(dǎo)施加于其它構(gòu)件中至少一個(gè)的功能的可能性。舉例而言，若轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列在應(yīng)答一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子存在與否時(shí)控制編碼序列的轉(zhuǎn)錄水平，則該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(諸如啟動(dòng)子)可操作連接至該編碼序列。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列一般順式地與編碼序列可操作連接，但不需直接與其鄰近。例如，增強(qiáng)子是與編碼序列可操作連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，即使它們不是連續(xù)的。關(guān)于融合多肽，術(shù)語(yǔ)"可操作連接"可以指每個(gè)構(gòu)件在連接另一個(gè)構(gòu)件時(shí)執(zhí)行的功能與其在不如此連接時(shí)其會(huì)執(zhí)行的功能相同的實(shí)情。例如，關(guān)于其中ZFPDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合至切割結(jié)構(gòu)域的融合多肽，如果在該融合多肽中，ZFPDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域部分能夠結(jié)合其靶位點(diǎn)和/或其結(jié)合位點(diǎn)，而切割結(jié)構(gòu)域能夠切割靶位點(diǎn)附近的DNA，那么該ZFPDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和該切割結(jié)構(gòu)域是可操作連接的。蛋白質(zhì)、多肽或核酸的"功能性片段"指其序列與全長(zhǎng)蛋白質(zhì)、多肽或核酸不同，但仍保留與全長(zhǎng)蛋白質(zhì)、多肽或核酸相同功能的蛋白質(zhì)、多肽或核酸。功能性片段可以擁有與相應(yīng)天然分子相比更多、更少或相同的殘基數(shù)目，和/或可以包含一處或多處氨基酸或核苷替代。用于測(cè)定核酸功能(例如編碼功能、與另一核酸雜交的能力)的方法是本領(lǐng)域公知的。類似地，用于測(cè)定蛋白質(zhì)功能的方法是公知的。例如，多肽結(jié)合DNA的功能可以通過(guò)例如濾器結(jié)合(filter-binding)、電泳遷移率變動(dòng)、或免疫沉淀測(cè)定法來(lái)測(cè)定。對(duì)DNA的切割可以通過(guò)凝膠電泳來(lái)測(cè)定。參見(jiàn)Ausubd等，見(jiàn)上文。一種蛋白質(zhì)與另一種蛋白質(zhì)相互作用的能力可以通過(guò)例如免疫共沉淀、雙雜交測(cè)定法或互補(bǔ)(遺傳的和生化的兩者)來(lái)測(cè)定。參見(jiàn)例如Fields等，(1989)Nature340:245-246;美國(guó)專利No.5,585,245及PCTWO98/44350。鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域本文中所描述的是非規(guī)范鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和編碼這些鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，本文所述非規(guī)范鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域是C3H鋅指，其中兩個(gè)保守的鋅配位組氨酸殘基之一被轉(zhuǎn)換為半胱氨酸。在別的實(shí)施實(shí)施方案中，最C端的組氨酸殘基被轉(zhuǎn)換為半胱氨酸殘基，生成"CCHC蛋白"。鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域可包含一個(gè)或多個(gè)鋅指(例如2、3、4、5、6、7、8、9或更多個(gè)鋅指)，而且可被改造成結(jié)合任何靶序列(例如基因組序列)。鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域可結(jié)合DNA、RNA和/或蛋白質(zhì)。典型地，單個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度為約30個(gè)氨基酸。鋅指包括規(guī)范C2H2鋅指(即那些其中鋅離子由兩個(gè)半胱氨酸和兩個(gè)組氨酸殘基配位的鋅指)和非規(guī)范鋅指(包括例如C3H鋅指，即那些其中鋅離子由三個(gè)半胱氨酸殘基和一個(gè)組氨酸殘基配位的鋅指)兩者。還可參見(jiàn)美國(guó)專利申請(qǐng)No.20030108880;20060246567;和200602465S8，通過(guò)提及而收錄它們的公開(kāi)內(nèi)容。結(jié)構(gòu)研究已經(jīng)證實(shí)，規(guī)范鋅指結(jié)構(gòu)域(基序)包含兩個(gè)(3片層(保持在包含兩個(gè)不變的半胱氨酸殘基的(3轉(zhuǎn)角中)和一個(gè)a螺旋(包含兩個(gè)不變的組氨酸殘基)，它們通過(guò)兩個(gè)半胱氨酸和兩個(gè)組氨酸配位鋅原子而以特定的構(gòu)象保持。本文中所公開(kāi)的非規(guī)范鋅指保持這種P-P-a結(jié)構(gòu)。本文所述非規(guī)范鋅指可以是天然存在鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域。然而，更典型地，本文所述非規(guī)范鋅指包括一個(gè)或多個(gè)如下鋅指構(gòu)件，其中已經(jīng)用一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換至少一個(gè)鋅配位半胱氨酸或組氨酸殘基。例如，在某些實(shí)施方案中，用Cys殘基替換規(guī)范鋅指結(jié)合模塊的C端His殘基。本文所述CCHC鋅指還可包含氨基酸殘基序列中除鋅配位殘基外的一處或多處改變(相對(duì)于天然存在C2H2鋅指序列)。此類改變可包含替代、刪除、和/或插入?？稍阡\指中任何地方改變氨基酸。改變的非限制性例子包括(1)被改變的鋅配位殘基周圍的單個(gè)殘基替代；(2)被改變的鋅配位殘基之前或之后的額外殘基插入，(例如在最C端的His殘基被轉(zhuǎn)換為Cys的情況中，額外氨基酸殘基的添加可通過(guò)補(bǔ)償較短的半胱氨酸側(cè)鏈而促進(jìn)鋅配位)；和/或(3)將位于天然存在CCHC鋅指的His和Cys殘基間的殘基替換至非規(guī)范CCHC鋅指的相應(yīng)區(qū)i或中。在某些實(shí)施方案中，本文所述鋅指蛋白包含至少一個(gè)鋅指，其包括非規(guī)范(非C2H2)鋅指，其中非規(guī)范鋅指具有牽涉DNA結(jié)合的螺旋部分且其中螺旋部分的鋅配位區(qū)包含氨基酸序列HX,x2rcxl(SEQIDNO:2);且其中鋅指蛋白被改造成結(jié)合靶序列。在某些實(shí)施方案中，X,是A或K或T;x2是Q或E或R;而Xl是G。在其它實(shí)施方案中，本文所述非規(guī)范鋅指具有一般結(jié)構(gòu)Cys-(XA)2—4-Cys-(XB),2-His-(XC)3.5-Cys-(XD)卜k)(SEQIDN0:3)，其中X八、XB、XC和XD代表任何氨基酸。在XC包含3個(gè)殘基的實(shí)施方案中，(i)與規(guī)范CCHC鋅指相比，改變這些殘基中至少一個(gè)；和/或(ii)XD包含與規(guī)范CCHH鋅指相比的至少一處刪除、替代或插入。在某些實(shí)施方案中，XD包含序列QLV或QKP。在其它實(shí)施方案中，XD包含一個(gè)或多個(gè)(例如1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、或10個(gè))Gly(G)殘基。在表l、表2、表3和表4中顯示了例示性非規(guī)范鋅指的部分氨基酸序列(在第3個(gè)鋅配位殘基的C端并包括第3個(gè)鋅配位殘基)。在所有的表中，兩個(gè)最C端(即第3個(gè)和第4個(gè))鋅配位殘基(H和C)加了下劃線。以雙下劃線顯示了與"野生型，'非規(guī)范指序列(表1和表3的第2行)相比的改變(例如替代、插入、刪除)。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>表4<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>如上文所述，ZFP可包括任何數(shù)目的鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如至少3個(gè)鋅指。此外，一個(gè)、超過(guò)一個(gè)、或所有鋅指可以是本文所述非規(guī)范鋅指。在某些實(shí)施方案中，多個(gè)指的鋅指蛋白的最C端指包含規(guī)范鋅指。在其它實(shí)施方案中，多個(gè)指的鋅指蛋白的最C端指包含本文所述CCHC指，例如包含最C端鋅配位Cys殘基C端的一處或多處氨基酸插入的CCHC指。參見(jiàn)實(shí)施例1-5,其描述了4個(gè)指的鋅指蛋白，其中指2(F2)和/或指4(F4)是本文所述非規(guī)范鋅指。鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以改造成結(jié)合所選擇的序列。參見(jiàn)例如Beerli等(2002)NatureBiotechnol.20:135-141;Pabo等(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340;Isalan等(2001)NatureBiotechnol.19:656-660;Segal等(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637;Choo等(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416。與天然存在的鋅指蛋白相比，工程化鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以具有新的結(jié)合特異性。改造方法包括但不限于合理設(shè)計(jì)和各種類型的選擇(例如針對(duì)單個(gè)靶核苷酸序列篩選多種不同鋅指序列的方法)。合理設(shè)計(jì)包括例如使用包含三聯(lián)體(或四聯(lián)體)核苦酸序列的數(shù)據(jù)庫(kù)和各種鋅指氨基酸序列，其中每種三聯(lián)體或四聯(lián)體核苦酸序列與結(jié)合特定三聯(lián)體或四聯(lián)體序列的鋅指的一種或多種氨基酸序列關(guān)聯(lián)。參見(jiàn)例如共有的美國(guó)專利6,453,242和6,534,261。別的設(shè)計(jì)方法披露于例如美國(guó)專利6,746,838;6,785,613;6,866,997;及7,030,215。鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合特異性的增強(qiáng)已經(jīng)記載于例如共有的美國(guó)專利No.6,794,136。例示性的選擇方法(包括噬菌體展示和雙雜交系統(tǒng))披露于美國(guó)專利5,789,538;5，925,523;6,007,988;6'013，453;6，410，248;6'140，466;6,200,759;及6，242，568;以及WO98/37186;WO98/53057;WO00/27878;WO01/88197及GB2,338,237。由于各種鋅指結(jié)合3個(gè)核苷酸的(即三聯(lián)體)序列(或者4個(gè)核苷酸的序列，其可以與相鄰鋅指的4個(gè)核香酸的結(jié)合位點(diǎn)有一個(gè)核普酸的重疊)，所以鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域改造后結(jié)合的序列(例如靶序列)長(zhǎng)度將決定工程化鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域中鋅指的數(shù)目。例如，對(duì)于其中鋅指基序不結(jié)合交疊亞位點(diǎn)的ZFP,6個(gè)核苷酸的靶序列由2個(gè)指的結(jié)合結(jié)構(gòu)域所結(jié)合；9個(gè)核苦酸的靶序列由3個(gè)指的結(jié)合結(jié)構(gòu)域所結(jié)合；等等。靶位點(diǎn)中鋅指?jìng)€(gè)體的結(jié)合位點(diǎn)(即亞位點(diǎn))不必是連續(xù)的，而是可以由一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸分開(kāi)，這取決于多指結(jié)合結(jié)構(gòu)域中鋅指間氨基酸序列(即指間接頭)的長(zhǎng)度和性質(zhì)。參見(jiàn)例如美國(guó)專利6,479,626;6,903,185和7,153,949及美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)文本No.2003/0119023;通過(guò)提及而收錄它們的公開(kāi)內(nèi)容。在多指鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，相鄰的鋅指可以由大約5個(gè)氨基酸的氨基酸接頭序列(所謂"規(guī)范的"指間接頭)或者由一個(gè)或多個(gè)非規(guī)范接頭所分開(kāi)。參見(jiàn)例如共有的美國(guó)專利No.6，453,242及6,534,26L對(duì)于包含超過(guò)三個(gè)指的工程化鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域，在某些鋅指之間插入較長(zhǎng)的("非規(guī)范的")指間接頭序列可提高結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的親和力和/或特異性。參見(jiàn)例如美國(guó)專利No.6,479,626和美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)文本No.2003/0119023，通過(guò)提及而收錄它們的公開(kāi)內(nèi)容。因而，多指鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域還可在非規(guī)范指間接頭的存在和位置方面來(lái)表征。較長(zhǎng)指間接頭的使用還可促進(jìn)鋅指蛋白對(duì)包含非連續(xù)核苷酸的耙位點(diǎn)的結(jié)合。因此，鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域的靶位點(diǎn)中的一個(gè)或多個(gè)亞位點(diǎn)可由l、2、3、4、5或更多個(gè)核苷酸彼此分開(kāi)。僅提供一個(gè)例子，4個(gè)指的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可結(jié)合13個(gè)核苷酸的靶位點(diǎn)，其順次包含兩個(gè)連續(xù)的3個(gè)核苷酸的亞位點(diǎn)、一個(gè)間插核苷酸、和兩個(gè)連續(xù)的三聯(lián)體亞位點(diǎn)。輩巴亞位點(diǎn)是單個(gè)鋅指所結(jié)合的核苦酸序列(通常為3個(gè)或4個(gè)核苷酸)。然而，靶位點(diǎn)不必是三個(gè)核苷酸的倍數(shù)。例如，在發(fā)生交叉鏈相互作用的情況中(參見(jiàn)例如美國(guó)專利6，453,242和6，794，136)，多指結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)鋅指?jìng)€(gè)體可結(jié)合交疊的四聯(lián)體亞位點(diǎn)。還可參見(jiàn)美國(guó)專利6，746,838和6,866,997。僅提供一個(gè)例子，3個(gè)指的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可結(jié)合10個(gè)核苷酸的靶位點(diǎn)，其包含三個(gè)交疊的4個(gè)核苷酸的亞位點(diǎn)?？梢勒绽绻灿械拿绹?guó)專利No.6，453,242(2002年9月17日)中披露的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞染色質(zhì)中鋅指結(jié)構(gòu)域結(jié)合序列(例如靶位點(diǎn))的選擇，該專利還披露了用于設(shè)計(jì)結(jié)合選定序列的ZFP的方法。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的是，還可通過(guò)簡(jiǎn)單目視檢查核苷酸序列來(lái)選擇靶位點(diǎn)。因而，可在本文所述方法中使用任何用于靶位點(diǎn)選擇的手段。多指鋅指蛋白可通過(guò)連接例如通過(guò)設(shè)計(jì)或選擇獲得的鋅指?jìng)€(gè)體來(lái)構(gòu)建?；蛘撸墒褂靡?guī)范的或較長(zhǎng)的、非規(guī)范的指間接頭(參見(jiàn)上文)將由兩個(gè)鋅指組成的結(jié)合模塊(module)彼此連接，以生成4個(gè)指和6個(gè)指的蛋白質(zhì)。此類兩個(gè)指的模塊可通過(guò)例如在多指蛋白質(zhì)(通常為3個(gè)指)的背景中選擇兩個(gè)相鄰的、結(jié)合特定的6個(gè)核苷酸的靶序列的指來(lái)獲得。參見(jiàn)例如WO98/53057和美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)文本No.2003/0119023,通過(guò)提及而收錄它們的公開(kāi)內(nèi)容。或者，兩個(gè)指的模塊可通過(guò)鋅指?jìng)€(gè)體的裝配來(lái)構(gòu)建。如此，可單獨(dú)使用本文所述鋅指結(jié)構(gòu)域或以各種組合使用本文所述鋅指結(jié)構(gòu)域以構(gòu)建能結(jié)合任何靶位點(diǎn)的多指鋅指蛋白。序列(例如靶位點(diǎn))間的距離指間插在兩個(gè)序列之間的核苷酸或核苦酸對(duì)的數(shù)目，正如自彼此最接近的序列邊緣所測(cè)量的。在使用ZFN的實(shí)施方案中，例如其中切割作用依賴于兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域/切割半結(jié)構(gòu)域融合分子對(duì)分開(kāi)的靶位點(diǎn)的結(jié)合，兩個(gè)靶位點(diǎn)可在對(duì)立的DNA鏈上。在其它實(shí)施方案中，兩個(gè)靶位點(diǎn)在相同的DNA鏈上。參見(jiàn)例如WO2005/084190,通過(guò)提及而收錄它的公開(kāi)內(nèi)容。編碼鋅指或鋅指蛋白的多核苷酸也在本公開(kāi)的范圍之內(nèi)。這些多核苷酸可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)構(gòu)建，并可插入載體中，而且可將該載體導(dǎo)入細(xì)胞中(參見(jiàn)下文關(guān)于載體和用于將多核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中的方法的別的公開(kāi))，使得在細(xì)胞中表達(dá)所編碼的蛋白質(zhì)。融合蛋白還提供了包含一個(gè)或多個(gè)本文所述非規(guī)范鋅指構(gòu)件的融合蛋白。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的克隆和生物化學(xué)綴合方法來(lái)構(gòu)建融合分子。融合分子包含含有CCHC的ZFP和例如切割結(jié)構(gòu)域、切割半結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄阻抑結(jié)構(gòu)域、染色質(zhì)重建復(fù)合物的成分、絕緣子結(jié)構(gòu)域、這些結(jié)構(gòu)域之任一的功能性片段；和/或兩個(gè)或更多個(gè)功能域或其片段的任何組合。在某些實(shí)施方案中，融合分子包含改良植物鋅指蛋白和至少兩個(gè)功能域(例如絕緣子結(jié)構(gòu)域或曱基結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域，和另外地，轉(zhuǎn)錄激活或阻抑結(jié)構(gòu)域)。任選地，融合分子還包含核定位信號(hào)(諸如例如來(lái)自SV40T抗原或玉米不透明二號(hào)(Opaque-2)NLS的)和表位標(biāo)簽(諸如例如FLAG或血凝素)。設(shè)計(jì)融合蛋白(和編碼它們的核酸)以使得在融合物的各構(gòu)件之間保持翻譯讀碼框。用于設(shè)計(jì)和構(gòu)建融合蛋白(和編碼它們的多核苷酸)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，用于設(shè)計(jì)和構(gòu)建包含鋅指蛋白的融合蛋白(和編碼它們的多核苷酸)的方法記載于共有的美國(guó)專利6，453，242和6,534,261。編碼此類融合蛋白的多核苷酸也在本公開(kāi)的范圍之內(nèi)。這些多核苷酸可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)構(gòu)建，并可插入載體中，而且可將該載體導(dǎo)入細(xì)胞中(參見(jiàn)用于與ZFPDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合的、要用于阻抑基因表達(dá)的例示性功能域是來(lái)自人KOX-1蛋白的KRAB阻抑結(jié)構(gòu)域(參見(jiàn)例如Thiesen等，NewBiologist2,363-374(1990);Margolin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91,4509-4513(1994);Pengue等，Nucl.AcidsRes.22:2908-2914(1994);Witzgall等:Proc.Natl.Acad.Sci.USA91，4514-4518(1994))。KOX結(jié)構(gòu)域也適于用作阻抑結(jié)構(gòu)域。另一種合適的阻抑結(jié)構(gòu)域是曱基結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白2B(MBD-2B)(關(guān)于MBD蛋白的描述還可參見(jiàn)Hendrich等(1999)MammGenome10:906-912)。另一種有用的阻抑結(jié)構(gòu)域是與v-ErbA蛋白結(jié)合的。參見(jiàn)例如Damm等(1989)Nature339:593-597;Evans(1989)Int.J.CancerSuppl.4:26-28;Pain等(1990)NewBiol.2:284-294;Sap等(1989)Nature340:242-244;Zenke等(1988)Cell52:107-119;及Zenke等(1990)Cell61:1035-1049。別的例示性阻抑結(jié)構(gòu)域包括但不限于曱狀腺激素受體(TR)、SID、MBD1、MBD2、MBD3、MBD4、MBD樣蛋白、D畫(huà)T家族成員(例如DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)、Rb、MeCPl和MeCP2。參見(jiàn)例如Zhang等(2000)AnnRevPhysiol62:439-466;Bird等(1999)Cell99:451-454;Tyler等(1999)Cell99:443-446;Knoepfler等(1999)Cell99:447-450;及Robertson等(2000)NatureGenet.25:338-342。別的例示性阻抑結(jié)構(gòu)域包括但不限于ROM2和AtHD2A。參見(jiàn)例如Chern等(1996)PlantCell8:305-321;及Wu等(2000)PlantJ.22:19-27。適于實(shí)現(xiàn)激活的結(jié)構(gòu)域包括HSVVP16激活結(jié)構(gòu)域(參見(jiàn)例如Hagmann等:J.Virol.71，5952-5962(1997》;核激素受體(參見(jiàn)例如Torchia等，Curr.Opin,Cell.Biol.10:373-383(1998));核因子KB的p65亞基(Bitko和Barik，J.Virol.72:5610-5618(1998);Doyle和Hunt，Neuroreport8:2937-2942(1997);Liu等,CancerGeneTher.5:3-28(1998));或人工嵌合功能域，諸如VP64(Seifpal等,EMBOJ.11,4961-4968(1992))。別的例示性激活結(jié)構(gòu)域包括但不限于p300、CBP、PCAF、SRC1PvALF、和ERF-2。參見(jiàn)例如Robyr等(2000)Mol.Endocrinol.14:329-347;Collingwood等(1999)J.Mol.Endocrinol.23:255-275;Leo等(2000)Gene245:1-11;Manteuffel-Cymbo薩ska(1999)ActaBiochim.Pol.46:77-89;McKe腿等(1999)J.SteroidBiochem.Mol.Biol.69:3-12;Malik等(2000)TrendsBiochem.Sci.25:277-283;及Lemon等(1999)Curr.Opin.Genet.Dev.9:499-504。別的例示性激活結(jié)構(gòu)域包括但不限于OsGAI、HALF-1、Cl、APl，ARF-5、-6、-7、和-8，CPRF1、CPRF4、MYC-RP/GP、和TRAB1。參見(jiàn)例如Ogawa等(2000)Gene245:21-29;Okanami等(1996)GenesCells1:87-99;Goff等(1991)GenesDev.5:298-309;Cho等(1999)PlantMoLBiol.40:419-429;Ulmason等(1999)Proc,Natl.Acad.Sci.USA96:5844-5849;Sprenger-Haussels等(2000)PlantJ.22:1-8;Gong等(1999)PlantMoLBiol.41:33-44;及Hobo等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:15,348-15,353。別的功能域披露于例如共有的美國(guó)專利No.6,933,113。此外，適于在融合分子中使用的絕緣子結(jié)構(gòu)域、染色質(zhì)重建蛋白(諸如含有ISWI的結(jié)構(gòu)域)、和曱基結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白記載于例如共有的國(guó)際公開(kāi)文本W(wǎng)O01/83793和WO02/26960。在其它的實(shí)施方案中，融合蛋白是如下鋅指核酸酶(ZFN),其包含一個(gè)或多個(gè)本文所述CCHC鋅指和切割結(jié)構(gòu)域(或切割半結(jié)構(gòu)域)。鋅指可改造成識(shí)別任何選定基因組區(qū)域中的靶序列，并且在被導(dǎo)入細(xì)胞中之后會(huì)導(dǎo)致融合蛋白對(duì)其結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合，而且在所述基因組區(qū)域內(nèi)或所述基因組區(qū)域附近進(jìn)行切割。該切割可導(dǎo)致非同源末端連接之后的基因組區(qū)域的核苷酸序列改變(例如突變)?；蛘?，若包含與基因組區(qū)域同源的序列的外源多核苷酸也存在于該細(xì)胞中，則在ZFN進(jìn)行的耙向切割之后，以高比率(mte)在基因組區(qū)域和外源多核苷酸之間發(fā)生同源重組。同源重組可導(dǎo)致外源序列的靶向序列替換或靶向整合，這取決于外源多核苷酸的核苷酸序列。本文所述非規(guī)范鋅指在被引入ZFN后提供了改進(jìn)的切割功能。如實(shí)施例中所述，包含至少一個(gè)本文所述CCHC指的4個(gè)指的ZFN至少與唯獨(dú)包含CCHH指的核酸酶一樣好地進(jìn)行切割。在某些實(shí)施方案中，在C端指包含非規(guī)范CCHC鋅指時(shí)，第3個(gè)和第4個(gè)鋅配位殘基之間(即C端His和Cys殘基之間)的殘基與那些存在于規(guī)范CCHH鋅指中的殘基不同，而且在C端Cys殘基之后插入一個(gè)或多個(gè)甘氨酸殘基(例如l、2、3、4、5或更多個(gè))。本文所公開(kāi)的ZFN的切割結(jié)構(gòu)域部分可獲自任何內(nèi)切核酸酶或外切核酸酶。可衍生切割結(jié)構(gòu)域的例示性內(nèi)切核酸酶包括但不限于限制性內(nèi)切核酸酶和歸巢內(nèi)切核酸酶。參見(jiàn)例如2002-2003產(chǎn)品目錄，NewEnglandBiolabs,Beverly,MA;及Belfort等(1997)NucleicAcidsRes.25:3379-3388。別的切割DNA的酶是已知的(例如S1核酸酶；綠豆核酸酶；胰DNA酶I;^U求菌核酸酶；酵母HO內(nèi)切核酸酶；還可參見(jiàn)Linn等(編)Nucleases,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1993)。這些酶(或其功能性片段)中的一種或多種可以作為切割結(jié)構(gòu)域和切割半結(jié)構(gòu)域的來(lái)源使用。類似地，切割半結(jié)構(gòu)域可以^"生自如上文所-提出的任何核酸酶或其部分，倘若切割半結(jié)構(gòu)域的切割活性需要二聚化。一般而言，如果融合蛋白包含切割半結(jié)構(gòu)域，那么對(duì)基因組DNA的靶向切割需要兩個(gè)融合蛋白。或者，可以使用包含兩個(gè)切割半結(jié)構(gòu)域的單個(gè)蛋白質(zhì)。兩個(gè)切割半結(jié)構(gòu)域可以衍生自相同的內(nèi)切核酸酶，或者每個(gè)切割半結(jié)構(gòu)域可以衍生自不同的內(nèi)切核酸酶。另外，兩個(gè)融合蛋白的靶位點(diǎn)相對(duì)于彼此布置成使得兩個(gè)融合蛋白與它們各自靶位點(diǎn)的結(jié)合以容許切割半結(jié)構(gòu)域形成功能性切割結(jié)構(gòu)域(例如通過(guò)二聚化)的彼此空間取向放置切割半結(jié)構(gòu)域。如此，在某些實(shí)施方案中，靶位點(diǎn)的近邊纟彖(nearedge)由5-8個(gè)核苷酸對(duì)或由15-18個(gè)核苷酸對(duì)分開(kāi)。在別的實(shí)施方案中，靶位點(diǎn)彼此相距10個(gè)核苷酸對(duì)之內(nèi)。然而，任何整數(shù)數(shù)目的核苷酸或核苷酸對(duì)可以間插在兩個(gè)靶位點(diǎn)之間(例如從2個(gè)至50個(gè)核苷酸或更多)。一般而言，切割點(diǎn)位于靶位點(diǎn)之間。限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)存在于許多物種中，而且能夠序列特異性結(jié)合DNA(在識(shí)別位點(diǎn)處)，并且在結(jié)合位點(diǎn)處或接近結(jié)合位點(diǎn)處切割DNA。某些限制酶(例如IIS型)在與識(shí)別位點(diǎn)遠(yuǎn)離的位點(diǎn)切割DNA,而且具有可分的結(jié)合和切割結(jié)構(gòu)域。例如，IIS型酶FoA:I催化對(duì)DNA的雙鏈切割，在一條鏈上距離其識(shí)別位點(diǎn)9個(gè)核苷酸處而在另一條上距離其識(shí)別位點(diǎn)13個(gè)核苷酸處進(jìn)行。參見(jiàn)例如美國(guó)專利5，356,802;5，436,150及5，487，994;以及Li等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4275-4279;Li等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2764-2768;Kim等(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:883-887;Kim等(1994b)J.Biol.Chem.269:31,978-31,982。如此，在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白包含來(lái)自至少一種IIS型限制酶的切割結(jié)構(gòu)域(或切割半結(jié)構(gòu)域)和一個(gè)或多個(gè)鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域(其可以是改造的或未改造的)。切割結(jié)構(gòu)域與結(jié)合結(jié)構(gòu)域是可分的例示性IIS型限制酶是/^A:I。這種特定的酶作為二聚體是有活性的。Bitinaite等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:10,570-10,575。因而，為了本公開(kāi)的目的，認(rèn)為所公開(kāi)融合蛋白中所使用的FoAI酶部分是切割半結(jié)構(gòu)域。如此，對(duì)于使用包含鋅指的ZFN-FoyU融合物來(lái)對(duì)細(xì)胞序列進(jìn)行的把向雙鏈切割和/或耙向替換，可以使用兩個(gè)融合蛋白(每個(gè)包含F(xiàn)o/H切割半結(jié)構(gòu)域)來(lái)重建具有催化活性的切割結(jié)構(gòu)域?；蛘撸部梢允褂冒粋€(gè)鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)FdI切割半結(jié)構(gòu)域的單個(gè)多肽分子。使用鋅指-FiI融合物來(lái)進(jìn)行靶向切割和靶向序列改變的參數(shù)提供于本公開(kāi)的別處和例如美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)文本No.2005/0064474，通過(guò)提及而收錄它們的公開(kāi)內(nèi)容。在別的實(shí)施方案中，F(xiàn)iI切割半結(jié)構(gòu)域可包括一處或多處任何影響二聚化的氨基酸殘基處的突變。此類突變可用于阻止一對(duì)ZFP/FoH融合物之一經(jīng)歷可導(dǎo)致在不想要序列處進(jìn)行切割的同二聚化。例如，F(xiàn)oAI的第446位、第447位、第479位、第483位、第484位、第486位、第487位、第490位、第491位、第496位、第498位、第499位、第500位、第531位、第534位、第537位、及第538位氨基酸殘基均與二聚化界面足夠接近以影響二聚化。因而，可使用一處或多處上述位置的氨基酸序列改變來(lái)改變切割半結(jié)構(gòu)域的二聚化特性?？梢酝ㄟ^(guò)例如構(gòu)建在這些位置含有(或編碼)不同氨基酸殘基的文庫(kù)并選擇具有期望特性的變體，或者通過(guò)合理設(shè)計(jì)個(gè)別突變體來(lái)引入此類變化。在阻止同二聚化之外，還可能的是，與使用兩個(gè)野生型切割半結(jié)構(gòu)域所獲得的切割效率相比，這些突變中的一些可以提高切割效率。如此，對(duì)于使用一對(duì)ZFPAPoH融合物進(jìn)行的靶向切割，融合蛋白之一或二者可包含一處或多處如下氨基酸變化，其抑制自我二聚化(self-dimerization)但容許發(fā)生兩種融合蛋白的異二聚化，使得在想要的靶位點(diǎn)發(fā)生切割。在某些實(shí)施方案中，改變存在于兩種融合蛋白中，并且改變具有疊加效應(yīng)；即，使導(dǎo)致異常切割的任一融合物同二聚化最小化或消除，而與使用野生型切割半結(jié)構(gòu)域獲得的異二聚化相比，促進(jìn)了所述兩種融合蛋白的異二聚化。在某些實(shí)施方案中，切割結(jié)構(gòu)域包含兩個(gè)切割半結(jié)構(gòu)域(兩者都是包含結(jié)合結(jié)構(gòu)域的單個(gè)多肽的一部分)，即第一切割半結(jié)構(gòu)域和第二切割半結(jié)構(gòu)域。切割半結(jié)構(gòu)域可具有相同的氨基酸序列或不同的氨基酸序列，只要它們發(fā)揮切割DNA的功能。切割半結(jié)構(gòu)域還可以在分開(kāi)的分子中提供。例如，可在細(xì)胞中表達(dá)兩種融合多肽，其中每種多肽包含結(jié)合結(jié)構(gòu)域和切割半結(jié)構(gòu)域。切割半結(jié)構(gòu)域可具有相同的氨基酸序列或不同的氨基酸序列，只要它們發(fā)揮切割DNA的功能。此外，結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合靶序列，其典型地以如下方式布置，使得融合多肽結(jié)合后，兩個(gè)切割半結(jié)構(gòu)域以容許切割結(jié)構(gòu)域重建(例如通過(guò)半結(jié)構(gòu)域的二聚化)的彼此空間取向呈現(xiàn)，由此將半結(jié)構(gòu)域相對(duì)于彼此放置以形成功能性切割結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致對(duì)感興趣區(qū)域中細(xì)胞染色質(zhì)的切割。一般而言，由重建的切割結(jié)構(gòu)域所進(jìn)行的切割發(fā)生在位于兩個(gè)靶序列之間的位點(diǎn)處。蛋白質(zhì)之一或二者可以改造成結(jié)合其靶位點(diǎn)。兩種融合蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)可以源自將所述兩種蛋白質(zhì)投遞至所述細(xì)胞；將一種蛋白質(zhì)和編碼所述蛋白質(zhì)之一的一種核酸投遞至所述細(xì)胞；將兩種各編碼所述蛋白質(zhì)之一的核酸^:遞至所述細(xì)胞；或通過(guò)將編碼兩種蛋白質(zhì)的單一核酸投遞至所述細(xì)胞。在別的實(shí)施方案中，融合蛋白包含單條多肽鏈，其包含兩個(gè)切割半結(jié)構(gòu)域和一個(gè)鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在這種情況中，在細(xì)胞中表達(dá)單一融合蛋白，并且(在不希望被理論限制的前提下)認(rèn)為其由于形成切割半結(jié)構(gòu)域的分子內(nèi)二聚體而切割DNA。在某些實(shí)施方案中，將ZFP的構(gòu)件排列成使得鋅指結(jié)構(gòu)域距離融合蛋白的氨基端最近，并使得切割半結(jié)構(gòu)域距離羧基端最近。這反映了天然存在的二聚化切割結(jié)構(gòu)域(諸如那些衍生自FoH酶的)中切割結(jié)構(gòu)域的相對(duì)取向，其中DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域距離氨基末端最近而切割半結(jié)構(gòu)域距離羧基末端最近。在這些實(shí)施方案中，切割半結(jié)構(gòu)域二聚化而形成功能性核酸酶是通過(guò)融合蛋白結(jié)合至對(duì)立DNA鏈上的位點(diǎn)而引起的，其中結(jié)合位點(diǎn)的5，端彼此接近。在這種取向中，最C端的鋅指接近FoH切割半結(jié)構(gòu)域。先前已經(jīng)確定，在CCHC型鋅指以最C端指存在時(shí)，非規(guī)范鋅指蛋白最高效地結(jié)合其DNA靶物。因此，有可能的是，與FWI切割半結(jié)構(gòu)域接近的先前所述CCHC型鋅指的存在抑制其功能。若情況如此，則本公開(kāi)的經(jīng)過(guò)優(yōu)化的CCHC鋅指顯然沒(méi)有展現(xiàn)出此假定的抑制活性。在別的實(shí)施方案中，將融合蛋白(例如ZFP-FoH融合物)的構(gòu)件排列成使得切割半結(jié)構(gòu)域距離融合蛋白的氨基末端最近且鋅指結(jié)構(gòu)域距離羧基末端最近。在這些實(shí)施方案中，切割半結(jié)構(gòu)域二聚化而形成功能性核酸酶是通過(guò)融合蛋白結(jié)合至對(duì)立DNA鏈上的位點(diǎn)而引起的，其中結(jié)合位點(diǎn)的3，端彼此接近。在別的實(shí)施方案中，第一融合蛋白包含距離該融合蛋白的氨基末端最近的切割半結(jié)構(gòu)域和距離羧基末端最近的鋅指結(jié)構(gòu)域，并將第二融合蛋白排列成使得鋅指結(jié)構(gòu)域距離該融合蛋白的氨基末端最近且切割半結(jié)構(gòu)域距離羧基末端最近。在這些實(shí)施方案中，兩種融合蛋白結(jié)合相同的DNA鏈，其中包含距離羧基末端最近的鋅指結(jié)構(gòu)域的第一融合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)位于包含距離氨基末端最近的鋅指結(jié)構(gòu)域的第二融合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)的5，側(cè)。還可參見(jiàn)WO2005/084190，通過(guò)才是及收錄其7〉開(kāi)內(nèi)容。鋅指結(jié)構(gòu)域和切割結(jié)構(gòu)域(或切割半結(jié)構(gòu)域)之間的氨基酸序列稱為"ZC接頭"。ZC接頭與上文所述指間接頭有所區(qū)別。關(guān)于獲得優(yōu)化切割的ZC接頭的詳情參見(jiàn)例如美國(guó)專利公開(kāi)文本20050064474A1和20030232410，及國(guó)際專利公開(kāi)文本W(wǎng)O2005/084190,通過(guò)提及而收錄它們的公開(kāi)內(nèi)容。表達(dá)載體可以將編碼一種或多種ZFP或ZFP融合蛋白(例如ZFN)的核酸克隆入載體中，用以轉(zhuǎn)化入原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中以復(fù)制和/或表達(dá)。載體可以是原核載體或真核載體，包括但不限于質(zhì)粒、穿梭載體、昆蟲(chóng)載體、二元載體(參見(jiàn)例如美國(guó)專利No.4,940,838;Horsch等(1984)Science233:496-498，及Fraley等(1983)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA80:4803)等。也可以將編碼ZFP的核酸克隆入表達(dá)載體中，用于給植物細(xì)胞施用。為了表達(dá)融合蛋白，典型地將編碼ZFP或ZFP融合物的序列亞克隆入含有指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的表達(dá)載體中。合適的細(xì)菌和真核啟動(dòng)子在本領(lǐng)域是公^口的，并i己載于例^口Sambrook等,MolecularCloning,ALaboratoryManual(第2版,1989;第3版,2001);Kriegler,GeneTransferandExpression:ALaboratoryManual(1990);及CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel等,見(jiàn)上文)。在例如大腸桿菌(￡、芽孢桿菌(Sac/〃w)和沙門(mén)氏菌屬中可以獲得用于表達(dá)ZFP的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)(Palva等，Gene22:229-235(1983))。這些表達(dá)系統(tǒng)的試劑盒是商品化的。用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母和昆蟲(chóng)細(xì)胞的真核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的，而且也是商品化的。用于指導(dǎo)編碼ZFP的核酸表達(dá)的啟動(dòng)子取決于特定的應(yīng)用。例如，典型地使用適合于宿主細(xì)胞的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子來(lái)表達(dá)和純化ZFP。比較而言，在體內(nèi)施用ZFP以調(diào)節(jié)植物基因時(shí)(參見(jiàn)下文"將核酸投遞至植物細(xì)胞"部分)，使用組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，這取決于ZFP的特定用途。植物啟動(dòng)子的非限制性例子包括自下組衍生的啟動(dòng)子序列擬南芥(/lAa/Za"")遍在蛋白-3(ubi-3)(Callis等，1990,J.Biol.Chem.265:12486-12493);根癌土i裏桿菌(Aft^^c/e""甘露石威合酶(Amas)(Petolino等，美國(guó)專利No.6,730,824);和/或木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)(Verdaguer等,1996,PlantMolecularBiology31:1129-1139)。還可參見(jiàn)實(shí)施例。在啟動(dòng)子之外，表達(dá)載體典型地包含轉(zhuǎn)錄單元或表達(dá)盒，其包含在宿主細(xì)胞(或是原核的或是真核的)中表達(dá)核酸所需的所有別的元件。如此，典型的表達(dá)盒包含與例如編碼ZFP的核酸序列可操作連接的啟動(dòng)子，及所需的信號(hào)，例如用于轉(zhuǎn)錄物的有效聚腺苦酸化、轉(zhuǎn)錄終止、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、或翻譯終止。該盒的別的元件可以包括例如增強(qiáng)子，及異源剪接信號(hào)。根據(jù)ZFP的預(yù)定用途，例如在植物、動(dòng)物、細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物等中表達(dá)載體)。標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌和動(dòng)物表達(dá)載體在本領(lǐng)域中是已知的，并詳細(xì)記載于例如美國(guó)專利7〉開(kāi)文本20050064474A1及國(guó)際專利開(kāi)文本W(wǎng)O05/084190;WO05/014791;和W003/080809,通過(guò)提及而收錄它們的公開(kāi)內(nèi)容?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染方法來(lái)產(chǎn)生表達(dá)大量蛋白質(zhì)的細(xì)菌、哺乳動(dòng)物、酵母或昆蟲(chóng)細(xì)胞系，然后可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)純化所述蛋白質(zhì)(參見(jiàn)例如Colley等，J.Biol.Chem.264:17619-17622(1989);GuidetoProteinPurification,于MethodsinEnzymology,巻182(Deutscher編，1990))。真核細(xì)胞和原核細(xì)月包的轉(zhuǎn)化依照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實(shí)施(參見(jiàn)例如Morrison,J.Bact.132:349-351(1977);Clark扁Curtiss和Curtiss,MethodsinEnzymology101:347-362(Wu等編，1983))。可以使用任何用于將外來(lái)核苷酸序列導(dǎo)入此類宿主細(xì)胞中的公知規(guī)程。這些包括使用磷酸4丐轉(zhuǎn)染、Polybrene、原生質(zhì)體融合、電穿孔、超聲方法(例如聲穿孔(sonoporatkm))、脂質(zhì)體、顯微注射、棵DNA、質(zhì)粒載體、病毒載體(附加體型的和整合型的兩種)、及任何用于將所克隆的基因組DNA、見(jiàn)例如Sambrook等，見(jiàn)上文)。唯一必須的是，所使用的特定遺傳工程規(guī)程能夠成功地將至少一種基因?qū)肽軌虮磉_(dá)選定蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞中。將核酸投遞至植物細(xì)胞如上文所述，DNA構(gòu)建體可以通過(guò)多種常規(guī)技術(shù)來(lái)導(dǎo)入期望的植物宿主中(例如導(dǎo)入其基因組中)。對(duì)于此類技術(shù)的綜述，參見(jiàn)例如Weissbach和Weissbach,MethodsforPlantMolecularBiology(1988,AcademicPress,N.Y.)節(jié)VIII,頁(yè)421-463;及Grierson和Corey,PlantMolecularBiology(1988,第2版)，Blackie，London,章7-9。例如，DNA構(gòu)建體可以使用諸如電穿孔和顯微注射植物細(xì)胞原生質(zhì)體等技術(shù)來(lái)導(dǎo)入植物細(xì)胞中，或者DNA構(gòu)建體可以使用生物射彈法(biolisticmethod)來(lái)直接導(dǎo)入植物組織中，諸如DNA粒子轟擊(參見(jiàn)例如Klein等(1987)Nature327:7073)。或者，DNA構(gòu)建體可以與合適的T-DNA側(cè)翼區(qū)組合，并導(dǎo)入常規(guī)的根癌土壤桿菌宿主載體中。根癌土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)(包括二元載體的^L用和消除(disarming))完全記載于科學(xué)文獻(xiàn)中。參見(jiàn)例如Horsch等(1984)Science233:496498,及Fraley等(1983)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA80:4803。此外，基因轉(zhuǎn)移可以使用非土壤桿菌屬的細(xì)菌或病毒(諸如根瘤菌NGR234(i/zfeoWMmsp.NGR234)、.苜蓿中華根瘤菌(Sz'ww/n'zo^/wwwe似oW)、百脈根中生根瘤菌(M^wWzo6/wm/o")、馬鈴薯X病毒、花椰菜花葉病毒和木薯葉脈花葉病毒和/或煙草花葉病毒)來(lái)實(shí)現(xiàn)。參見(jiàn)例如Chung等(2006)TrendsPlantSci.11(1):1-4。根癌土壤桿菌宿主的毒力功能會(huì)在使用二元TDNA載體(Bevan(1984)Nuc.AcidRes.12:8711-8721)或共培養(yǎng)規(guī)程(Horsch等(1985)Science227:1229-1231)由所述細(xì)菌感染所述細(xì)胞后指導(dǎo)構(gòu)建體和鄰近標(biāo)志物插入植物細(xì)胞DNA中。一般而言，使用土壤桿菌屬轉(zhuǎn)化系統(tǒng)來(lái)改造雙子葉植物(Bevan等(1982)Ann.Rev.Genet16:357-384;Rogers等(1986)MethodsEnzymol.118:627-641)。土壤桿菌屬轉(zhuǎn)化系統(tǒng)還可以用于轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)移DNA至單子葉植物和植物細(xì)胞。參見(jiàn)美國(guó)專利No.5，591,616;Hernalsteen等(1984)EMBOJ3:3039-3041;HooykassVanSlogteren等(1984)Nature311:763-764;Grimsley等(1987)Nature325:1677-179;Boulton等(1989)PlantMol.Biol,12:31-40;及Gould等(1991)PlantPhysiol.95:426-434。備選的基因轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)化方法包括但不限于通過(guò)鈣、聚乙二醇(PEG)或電穿孔介導(dǎo)的棵DNA攝取進(jìn)行的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)Paszkowski等(1984)EMBOJ3:2717-2722;Potrykus等(1985)Molec.Gen.Genet.199:169-177;Fromm等(1985)Proc.Nat.Acad.Sci.USA82:5824-5828;及Shimamoto(1989)Nature338:274-276)和植物組織的電穿孔(D，Halluin等(1992)PlantCell4:1495-1505)。用于植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的別的方法包括顯微注射、碳化硅介導(dǎo)的DNA攝取(Kaeppler等(1990)PlantCellR印orter9:415-418)、及微粒轟擊(參見(jiàn)Klein等(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA85:4305-4309;及Gordon-Kamm等(1990)PlantCell2:603-618)。所公開(kāi)的方法和組合物可以用于將外源序列插入植物細(xì)胞基因組中預(yù)定的位置。這是有用的，因?yàn)閷?dǎo)入植物基因組中的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)關(guān)鍵取決于其整合位點(diǎn)。因而，編碼例如養(yǎng)分、抗生素或治療性分子的基因可以通過(guò)靶向重組而插入植物基因組中有利于其表達(dá)的區(qū)域?；幕蛐秃鸵虼似谕谋硇偷耐暾材?。此類再生技術(shù)依賴于組織培養(yǎng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中某些植物激素的操作，典型地依賴于已經(jīng)與期望的核苷酸序列一起導(dǎo)入的生物殺滅劑和/或除草劑標(biāo)志物。從培養(yǎng)的原生質(zhì)體再生植物記載于Evans等，"ProtoplastsIsolationandCulture"于HandbookofPlantCellCulture,pp.124-176,MacmillianPublishingCompany,NewYork,1983;及Binding,RegenerationofPlants,PlantProtoplasts,pp.21-73,CRCPress,BocaRaton,1985。還可以從植物胼胝體(callus)、外植體、器官、花粉、胚或其部分獲得再生。此類再生技術(shù)一般性地記載于Klee等(1987)Ann.Rev.ofPlantPhys.38:467-486。導(dǎo)入植物細(xì)胞中的核酸可用于賦予基本上任何植物以期望性狀。可以使用本公開(kāi)的核酸構(gòu)建體和上述各種轉(zhuǎn)化方法來(lái)對(duì)極其多種植物和植物細(xì)胞系統(tǒng)改造本文所述期望的生理學(xué)和農(nóng)學(xué)特征。在某些實(shí)施方案中，用于改造的目標(biāo)植物和植物細(xì)胞包括不限于那些單子葉和雙子葉植物，諸如農(nóng)作物，其包括谷類作物(例如小麥、玉米、稻、黍(millet)、大麥)、水果作物(例如番茄、蘋(píng)果、梨、草莓、柑/桔/橙)、草料作物(例如苜蓿)、根菜作物(rootvegetablecrop)(例如胡蘿卜、馬鈴薯、甜菜、薯蕷)、葉菜作物(leafyvegetablecrop)(例如萵苣、菠菜)；有花植物(例如矮牽牛、薔薇/玫瑰、菊)、松柏才直物和+M對(duì)(例如冷杉(pinefir)、云杉)；用于才直物除污(phytoremediation)的才直物(例如重金屬積累檔:物(heavymetalaccumulatingplant));油料作物(例如向日葵、油菜籽)和用于實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡闹参?例如擬南芥屬)。如此，所公開(kāi)的方法和組合物在廣泛的植物上有用途，其包括但不限于來(lái)自如下屬的物種天門(mén)冬屬(Asparagus)、燕麥屬(Avena)、蕓苔屬(Brassica)、柑橘屬(Citrus)、西瓜屬(Citrullus)、辣祐又屬(Capsicum)、南瓜屬(Cucurbita)、胡蘿卜屬(Daucus)、大豆屬(Glycine)、棉屬(Gossypium)、大麥屬(Hordeum)、萵苣屬(Lactuca)、番茄屬(Lycopersicon)、蘋(píng)果屬(Malus)、木薯屬(Manihot)、煙草屬(Nicotiana)、稻屬(Oryza)、聘梨屬(Persea)、豌豆屬(Pisum)、梨屬(Pyrus)、李屬(Pmnus)、蘿卜屬(Raphanus)、黑麥屬(Secale)、茄屬(Solanum)、高粱屬(Sorghum)、小麥屬(Triticum)、葡萄屬(Vitis)、iX豆屬(Vigna)、及玉蜀黍?qū)?Zea)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可的是，在表達(dá)盒被穩(wěn)定摻入轉(zhuǎn)基因植物中并證實(shí)是可操作的后，其可以通過(guò)有性雜交而導(dǎo)入其它植物中?？梢允褂迷S多標(biāo)準(zhǔn)育種技術(shù)之任一種，這取決于待雜交的物種。經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、胼胝體、組織或植抹可以通過(guò)對(duì)改造后的植物材料如，可以如下實(shí)施選擇，即將改造后的植物材料在含有抑制量抗生素或除草劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，所轉(zhuǎn)化基因構(gòu)建體賦予對(duì)所述抗生素或除草劑的抗性。此外，經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物和植物細(xì)胞還可以通過(guò)篩選可以存在于重組核酸構(gòu)建體上的任何可見(jiàn)標(biāo)志基因(例如(3-葡糖醛酸糖苷酶、螢光素酶、B或C1基因)的活性來(lái)鑒定。此類選擇和篩選方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。也可以使用物理和生物化學(xué)方法來(lái)鑒定含有所插入的基因構(gòu)建體的植物或植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化體。這些方法包括但不限于l)Sourthern分析或PCR擴(kuò)增，用于檢測(cè)和測(cè)定重組DNA插入物的結(jié)構(gòu)；2)Northem印跡、S1RNA酶保護(hù)、引物延伸或反轉(zhuǎn)錄酶-PCR擴(kuò)增，用于檢測(cè)和檢查基因構(gòu)建體的RNA轉(zhuǎn)錄物；3)酶測(cè)定法，用于檢測(cè)酶或核酶活性，其中此類基因產(chǎn)物由基因構(gòu)建體編碼；4)蛋白質(zhì)凝膠電泳、Western印跡技術(shù)、免疫沉淀、或酶聯(lián)免疫測(cè)定法，其中基因構(gòu)建體產(chǎn)物是蛋白質(zhì)。也可以使用別的技術(shù)(諸如原位雜交、酶染色、及免疫染色)來(lái)檢測(cè)重組構(gòu)建體在特定植物器官和組織中的存在或表達(dá)。使用本文所公開(kāi)方法進(jìn)行的基因操作的效果可以通過(guò)例如自感興趣組織分離的RNA(例如mRNA)的Northem印跡來(lái)觀察。典型地，如果mRNA的量增加了，那么可以認(rèn)為相應(yīng)的內(nèi)源基因正以比之前更快的速率表達(dá)?？梢允褂脺y(cè)量基因和/或CYP74B活性的其它方法。可以使用不同類型的酶測(cè)定法，取決于使用的底物和檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物或副產(chǎn)物增加或減少的方法。另外，所表達(dá)的蛋白質(zhì)和/或CYP74B蛋白的水平可以通過(guò)免疫化學(xué)方法測(cè)量，即ELISA、RIA、EIA及對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它基于抗體的測(cè)定法，諸如通過(guò)電泳檢測(cè)測(cè)定法(或是使用染色或是使用Westem印跡)。轉(zhuǎn)基因可以在植物的一些組織中或在一些發(fā)育階段選擇性表達(dá)，或者轉(zhuǎn)基因可以在基本上所有的植物組織中，基本上在其整個(gè)生命周期中表達(dá)。然而，任何組合表達(dá)模式也是可應(yīng)用的。本公開(kāi)還涵蓋上文所述轉(zhuǎn)基因植物的種子，其中所述種子具有轉(zhuǎn)基因或基因構(gòu)建體。本公開(kāi)還涵蓋上述轉(zhuǎn)基因植物的后代、克隆、細(xì)胞系或細(xì)胞，其中所述后代、克隆、細(xì)胞系或細(xì)胞具有所述轉(zhuǎn)基因或基因構(gòu)建體。ZFP和編碼ZFP的表達(dá)載體可以直接給植物施用，用于靶向切割和/或重組。有效量的施用通過(guò)通常用于導(dǎo)入ZFP并最終與待處理的植物細(xì)胞接觸的任何路徑進(jìn)行。以任何合適的方式施用ZFP。施用此類組合物的合適方法是可獲得的，并且對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的，并且雖然可以使用超過(guò)一種的路徑來(lái)施用特定的組合物，但是特定的路徑通?？梢蕴峁┍攘硪环N路徑更及時(shí)(immediate)且更有3^的反應(yīng)。還可以使用載體，并且其部分根據(jù)正在施用的特定組合物，以及根據(jù)用于施用該組合物的特定方法來(lái)決定。因而，存有可使用的極其多種合適的藥物組合物酉己制齊'J(參見(jiàn)例如Remington，sPharmaceuticalSciences,第17版，1985))。應(yīng)用包含一個(gè)或多個(gè)本文所述非規(guī)范鋅指的鋅指蛋白可用于目前使用規(guī)范C2H2ZFP進(jìn)行的所有基因組調(diào)控和編輯應(yīng)用，包括但不限于基因激活；基因阻抑；基因組編輯(切割、耙向插入、替換或刪除)；和外因基因組編輯(經(jīng)由組蛋白或DNA的共價(jià)修飾的靶向)。包含本文所公開(kāi)非規(guī)范鋅指的ZFN可用于切割細(xì)胞染色質(zhì)中感興趣區(qū)域處的DNA(例如在基因組中想要的或預(yù)定的位點(diǎn)處，例如在突變型或野生型的基因中)。對(duì)于此類把向DNA切割，鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域改造成結(jié)合預(yù)定切割位點(diǎn)處或附近的靶位點(diǎn)，并在細(xì)胞中表達(dá)包含工程化鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和切割結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。在融合蛋白的鋅指部分結(jié)合至靶位點(diǎn)后，通過(guò)切割結(jié)構(gòu)域在耙位點(diǎn)附近切割DNA。切割的準(zhǔn)確位點(diǎn)可取決于ZC接頭的長(zhǎng)度。或者，在細(xì)胞中表達(dá)兩種各包含鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和切割半結(jié)構(gòu)域的ZFN,并結(jié)合至靶位點(diǎn)，其以使得功能性切割結(jié)構(gòu)域得以重建且DNA在靶位點(diǎn)附近得以切割的方式并列。在一個(gè)實(shí)施方案中，切割發(fā)生在兩個(gè)鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域的靶位點(diǎn)之間。鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域之一或二者可以進(jìn)行改造。對(duì)于使用鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域-切割結(jié)構(gòu)域融合多肽進(jìn)行的靶向切割，結(jié)合位點(diǎn)可以涵蓋切割位點(diǎn)，或者結(jié)合位點(diǎn)的近邊緣可以距離切割位點(diǎn)l個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、IO個(gè)、25個(gè)、50個(gè)或更多核苷酸(或介于1個(gè)和50個(gè)核苷酸之間的任何整數(shù)值)。結(jié)合位點(diǎn)相對(duì)于切割位點(diǎn)的準(zhǔn)確位置會(huì)取決于特定的切割結(jié)構(gòu)域和ZC接頭的長(zhǎng)度。對(duì)于其中使用兩種各包含鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和切割半結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的方法，結(jié)合位點(diǎn)一般跨越切割位點(diǎn)。如此，第一結(jié)合位點(diǎn)的近邊緣可以是切割位點(diǎn)一側(cè)的l個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、IO個(gè)、25個(gè)或更多核普酸(或介于1個(gè)和50個(gè)核苷酸之間的任何整數(shù)值)，而第二結(jié)合位點(diǎn)的近邊緣可以是切割位點(diǎn)另一側(cè)的l個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、IO個(gè)、25個(gè)或更多核苷酸(或介于1個(gè)和50個(gè)核苷酸之間的任何整數(shù)值)。用于在體外和在體內(nèi)對(duì)切割位點(diǎn)作圖的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。一旦導(dǎo)入耙細(xì)胞中或在輩巴細(xì)胞中表達(dá)，融合蛋白結(jié)合至靶序列，并在靶序列處或附近進(jìn)行切割。切割的準(zhǔn)確位點(diǎn)取決于切割結(jié)構(gòu)域的性質(zhì)和/或結(jié)合和切割結(jié)構(gòu)域之間的接頭序列的存在和/或性質(zhì)。在其中使用兩種各包含切割半結(jié)構(gòu)域的ZFN的情況中，結(jié)合位點(diǎn)的近邊緣之間的距離可以是l個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、IO個(gè)、25個(gè)或更多核苷酸(或介于l個(gè)和50個(gè)核苷酸之間的任何整數(shù)值)。切割作用的最佳水平還可以取決于兩個(gè)ZFN的結(jié)合位點(diǎn)之間的距離(參見(jiàn)例如Smith等(2000)NucleicAcidsRes.28:3361-3369;Bibikova等(2001)Mol.Cell.Biol.21:289-297)和每個(gè)ZFN中ZC接頭的長(zhǎng)度兩者。還可參見(jiàn)美國(guó)專利公開(kāi)文本20050064474A1和國(guó)際專利7^開(kāi)文本W(wǎng)O05/084190;WO05/014791;和WO03/080809,通過(guò)才是及而收錄它們的公開(kāi)內(nèi)容。兩個(gè)各包含切割半結(jié)構(gòu)域的ZFN可以在感興趣區(qū)域中以相同的或?qū)α⒌臉O性結(jié)合，而且它們的結(jié)合位點(diǎn)(即靶位點(diǎn))可以由任何數(shù)目的核苷酸(例如從0至50個(gè)核芬酸對(duì)或其間的任何整數(shù)值)分開(kāi)。在某些實(shí)施方案中，兩個(gè)各包含鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和切割半結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)可以相距介于5個(gè)和18個(gè)核苷酸對(duì)之間，例如相距5-8個(gè)核苦酸對(duì)，或相距15-18個(gè)核苦酸對(duì)，或相距6個(gè)核苦酸對(duì)，或相距16個(gè)核苷酸對(duì)，或〗皮此相距10個(gè)核苷酸對(duì)之內(nèi)，正如根據(jù)各結(jié)合位點(diǎn)與另一結(jié)合位點(diǎn)最接近的邊緣所測(cè)量的，并且切割發(fā)生在結(jié)合位點(diǎn)之間。對(duì)DNA進(jìn)行切割所在的位點(diǎn)一般位于兩個(gè)融合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)之間。DNA的雙鏈斷裂通常源自兩個(gè)偏移(offset)l個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)或更多核苷酸的單鏈斷裂(break)或"切口"(nick)(例如天然FoAI對(duì)雙鏈DNA的切割源自偏移4個(gè)核苷酸的單鏈斷裂)。如此，切割不必在每條DNA鏈上恰好對(duì)立的位點(diǎn)發(fā)生。另外，融合蛋白的結(jié)構(gòu)和靶位點(diǎn)間的距離可影響切割是否鄰近單個(gè)核苷酸對(duì)發(fā)生，或切割是否在數(shù)個(gè)位點(diǎn)發(fā)生。然而，對(duì)于許多應(yīng)用(包括靶向重組和靶向誘變)，一定范圍核苷酸內(nèi)的切割一般是足夠的，并且不需要特定堿基對(duì)間的切割。如上文所述，將多肽和/或多核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中之后可在細(xì)胞中表達(dá)一種或多種融合蛋白。例如，可以將兩種各包含編碼上述多肽之一的序列的多核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中，并在多肽表達(dá)且各多肽結(jié)合至其靶序列后，在靶序列處或附近發(fā)生切割?；蛘撸瑢幋a兩種融合多肽的序列的單個(gè)多核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中。多核苷酸可以是DNA、RNA或DNA和/或RNA的任何修飾形式或類似物。在某些實(shí)施方案中，基因組區(qū)域中由ZFN進(jìn)行的靶向切割導(dǎo)致在通過(guò)非同源末端連接(NHEjyf'務(wù)復(fù)該切割事件后該區(qū)域核苷酸序列的改變。在其它實(shí)施方案中，基因組區(qū)域中由ZFN進(jìn)行的靶向切割還可以是如下替換基因組序列(例如細(xì)胞染色質(zhì)中的感興趣區(qū)域)(即通過(guò)靶向重組)(例如包含外源序列以及一段或多段與預(yù)定基因組序列(即靶位點(diǎn))相同或同源但不相同的序列的供體序列的插入)。因?yàn)榧?xì)胞DNA中的雙鏈斷裂在切割位點(diǎn)附近刺激細(xì)胞修復(fù)機(jī)制達(dá)數(shù)千倍，用本文所述ZFN進(jìn)行的靶向切割容許基因組中實(shí)際上任何位點(diǎn)的序列改變或替換(經(jīng)由同源性指導(dǎo)的修復(fù))。在本文所述ZFN外，選定基因組序列的靶向替換還需要導(dǎo)入外源(供體)多核苷酸?？梢詫⒐w多核苷酸在表達(dá)ZFN之前、同時(shí)、或之后導(dǎo)入細(xì)胞中。供體多核苷酸與基因組序列含有足夠的同源性以支持其和與其具有同源性的基因組序列之間的同源重組(或同源性指導(dǎo)的修復(fù))。大約25個(gè)、50個(gè)、100個(gè)、200個(gè)、500個(gè)、750個(gè)、l,OOO個(gè)、1,500個(gè)、2,000個(gè)核苦酸或更多的序列同源性(或介于10個(gè)和2,000個(gè)核苷酸間的任何整數(shù)值，或更多)會(huì)支持同源重組。供體多核苷酸的長(zhǎng)度范圍可以乂人10至5,000個(gè)核苷酸(或其間核苦酸的任何整數(shù)值)或更長(zhǎng)。顯而易見(jiàn)的是，典型地，供體多核苷酸的核苷酸序列與其替換的基因組序列不相同。例如，供體多核苷酸的序列可以含有一個(gè)或多個(gè)相對(duì)于基因組序列的替換、插入、刪除、倒位或重排，只要與染色體序列存在足夠的同源性。此類序列變化可以是任何大小，而且可以小至單個(gè)核苷酸對(duì)。或者，供體多核苷酸可以包含側(cè)翼為兩個(gè)同源性區(qū)域的非同源序列(即外源序列，其與外源多核普酸相區(qū)別)。另外，供體多核苷酸可構(gòu)成載體分子，其含有與細(xì)胞染色質(zhì)中感興趣區(qū)域沒(méi)有同源性的序列。一般而言，供體多核苷酸的同源區(qū)與期望重組的基因組序列會(huì)具有至少50%的序列同一性。在某些實(shí)施方案中，存在60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、或99.9%的序列同一性?？梢源嬖诮橛趌o/。和100。/。序列同一性之間的任何數(shù)值，這取決于供體多核苷酸的長(zhǎng)度。對(duì)于靶向插入正常情況下不存在于感興趣區(qū)域中的序列，所述序列可以存在于供體核酸分子中，并且其側(cè)翼為與感興趣區(qū)域中的序列具有同源性的區(qū)域。為了筒化用于確定來(lái)自供體多核苷酸的序列得到成功插入的測(cè)定法(例如雜交、PCR、限制酶消化)，供體序列中可以存在與基因組序列相比的某些序列差異。優(yōu)選地，如果位于編碼區(qū)中，那么此類核苷酸序列差異不會(huì)改變氨基酸序列，或者會(huì)產(chǎn)生沉默的氨基酸變化(即不影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能的變化)。供體多核苷酸可以任選地包含感興趣區(qū)域中與鋅指結(jié)構(gòu)域結(jié)合位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的序列中的變化，以阻止對(duì)已經(jīng)通過(guò)同源重組而導(dǎo)入細(xì)胞染色質(zhì)中的供體序列的切割?？梢詫⒍嗪讼闼嶙鳛檩d體分子的一部分導(dǎo)入細(xì)胞中，所述載體分子具有別的序列，諸如例如復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子和編碼抗生素抗性的基因。此外，可以棵核酸形式、以與試劑(諸如脂質(zhì)體或Poloxamer)復(fù)合的核酸形式來(lái)導(dǎo)入供體多核苷酸，或者可以通過(guò)細(xì)菌或病毒(例如土壤桿菌屬、根瘤菌NGR234、苜蓿中華根瘤菌、百脈根中生根瘤菌、煙草花葉病毒、馬鈴薯X病毒、花椰菜花葉病毒和木薯葉脈花葉病毒)來(lái)投遞供體多核苷酸。參見(jiàn)例如Chung等(2006)TrendsPlantSci.ll(l):l-4。對(duì)于染色體序列的改變，不必將供體的全部序列拷貝到染色體中，只要拷貝的供體序列足以實(shí)現(xiàn)期望的序列改變。通過(guò)同源重組進(jìn)行的供體序列插入的效率與細(xì)胞DNA中雙《連斷裂和期望進(jìn)行重組的位點(diǎn)之間的距離成反比。換言之，在雙鏈斷裂與期望進(jìn)行重組的位點(diǎn)較近時(shí)觀察到較高的同源重組效率。在不預(yù)定精確的重組位點(diǎn)的情況中(例如期望的重組事件可以在一段基因組序列里發(fā)生)，對(duì)供體核酸的長(zhǎng)度和序列，及切割位點(diǎn)進(jìn)行選擇以獲得期望的重組事件。在期望的事件設(shè)計(jì)成改變基因組序列中單個(gè)核芬酸對(duì)的序列的情況中，在那個(gè)核苦酸對(duì)的任一側(cè)10,000個(gè)核香酸內(nèi)切割細(xì)胞染色質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，在序列要被改變的核香酸對(duì)的任一側(cè)1,000個(gè)、500個(gè)、200個(gè)、100個(gè)、90個(gè)、80個(gè)、70個(gè)、60個(gè)、50個(gè)、40個(gè)、30個(gè)、20個(gè)、10個(gè)、5個(gè)、或2個(gè)核苷酸，或介于2個(gè)和1,000個(gè)核苷酸間的任何整數(shù)值內(nèi)發(fā)生切割。通過(guò)使用ZFN進(jìn)行的基因組區(qū)域中的靶向切割，同時(shí)提供包含外源序列的外源(供體)多核苷酸，實(shí)現(xiàn)將外源序列靶向插入基因組區(qū)域中。典型地，供體多核苷酸還包含外源序列側(cè)翼的序列，其與基因組區(qū)域含有的同源性足以支持基因組序列中雙鏈斷裂的同源性指導(dǎo)的修復(fù)，由此將外源序列插入基因組區(qū)域中。因此，供體核酸可以是足以支持通過(guò)同源性依賴性修復(fù)機(jī)制(例如同源重組)而整合外源序列的任何大小。不希望被任何具體理論限制，認(rèn)為外源序列側(cè)翼的同源性區(qū)域給斷裂的染色體末端提供了用于再合成雙鏈斷裂位點(diǎn)處遺傳信息的模板。上文所述外源序列的靶向整合可用于在選定染色體位置插入標(biāo)志基因。標(biāo)志基因包括但不限于編碼介導(dǎo)抗生素抗性(例如氨芐青霉素抗性、新霉素抗性、G418抗性、。票呤霉素抗性)的蛋白質(zhì)的序列，編碼有色的或熒光的或發(fā)光的蛋白質(zhì)(例如綠色熒光蛋白、增強(qiáng)型綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、螢光素酶)，及介導(dǎo)增強(qiáng)的細(xì)胞生長(zhǎng)和/或基因擴(kuò)增的蛋白質(zhì)(例如二氫葉酸還原酶)的序列。如此，例示性標(biāo)志基因包括但不限于j3-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、膦絲菌素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT,BAR)、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、(3-內(nèi)酰胺酶、兒茶酚雙加氧酶、a-淀粉酶、酪氨酸酶、(3-半乳糖苷酶、螢光素酶、水母發(fā)光蛋白、EPSP合酶、腈水解酶、乙酰乳酸合酶(ALS)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、茅草枯脫卣素酶、和鄰氨基苯曱酸合酶。在某些實(shí)施方案中，靶向整合可用于插入RNA表達(dá)構(gòu)建體，例如負(fù)責(zé)微小RNA或siRNA的受調(diào)節(jié)表達(dá)的序列。RNA表達(dá)構(gòu)建體中還可以摻入啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或別的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列。包含鋅指/核酸酶融合分子和供體DNA分子的細(xì)胞中靶向重組效率的進(jìn)一步增加是如下實(shí)現(xiàn)的，即將細(xì)胞阻斷在細(xì)胞周期的G2期，此時(shí)同源性驅(qū)動(dòng)的修復(fù)過(guò)程具有最大活性。這種阻滯可以以許多方式來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，可以用例如影響細(xì)胞周期進(jìn)程的藥物、化合物和/或小分子來(lái)處理細(xì)胞，使得將細(xì)胞阻滯在G2期。這種類型的例示性分子包括但不限于影響微管聚合的化合物(例如長(zhǎng)春堿(vinblastine)、諾考達(dá)唑(nocodazole)、泰素(Taxol))、與DNA相互作用的化合物(例如順式-柏(II)二氨二氯化物(cis-platinum(II)diaminedichloride)、順柏(Cisplatin)、多柔比星(doxorubicin))和/或影響DNA合成的化合物(例如胸苷、羥基脲、L-含羞草氨酸(L-mimosine)、依托泊苷(etoposide)、5-氟尿嘧啶)。重組效率的再增加是如下實(shí)現(xiàn)的，即使用改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)的組蛋白脫乙?；?HDAC)抑制劑(例如丁酸鈉、制滴菌素A(trichostatinA))來(lái)使基因組DNA更易被細(xì)胞重組機(jī)器(machinery)接近。的蛋白質(zhì)，例如通過(guò)將編碼該蛋白質(zhì)的cDNA導(dǎo)入細(xì)胞中或通過(guò)將激活編碼所述蛋白質(zhì)的基因表達(dá)的工程化ZFP導(dǎo)入細(xì)胞中來(lái)實(shí)現(xiàn)。細(xì)胞周期阻滯還可以如下實(shí)現(xiàn)，即使用例如RNAi方法(例如美國(guó)專利No.6,506,559)來(lái)抑制細(xì)胞周期蛋白和CDK的活性，或通過(guò)將如下工程化ZFP導(dǎo)入細(xì)胞中，所述工程化ZFP阻抑細(xì)胞周期進(jìn)程中所牽涉的一種或多種基因(諸如例如細(xì)胞周期蛋白和/或CDK基因)的表達(dá)。關(guān)于合成用于調(diào)節(jié)基因表達(dá)的工程化鋅指蛋白的方法參見(jiàn)例如共有的美國(guó)專利No.6,534,261。如上文所述，所公開(kāi)的用于靶向切割的方法和組合物可用于誘導(dǎo)基因組序列中的突變。靶向切割還可用于產(chǎn)生基因敲除(例如用于功能基因組學(xué)或輩巴標(biāo)確認(rèn)(targetvalidation))及用于促進(jìn)序列靶向插入基因組中(即基因敲入)?？梢匀缦聦?shí)現(xiàn)插入，即通過(guò)同源重組或通過(guò)靶向整合來(lái)替換染色體序列，其中將側(cè)翼為與染色體中感興趣區(qū)域同源的序列的新序列(即感興趣區(qū)域中不存在的序列)插在預(yù)定的靶位點(diǎn)。相同的方法還可以用于用突變型序列替換野生型序列，或用于將一種等位基因轉(zhuǎn)換成不同的等位基因。對(duì)所感染的或所整合的植物病原體的靶向切割可以用于治療植物宿主中的病原體感染，例如通過(guò)對(duì)病原體的基因組進(jìn)行切割使得其病原性降低或消除來(lái)實(shí)現(xiàn)。另外，對(duì)編碼植物病毒受體的基因的靶向切割可用于阻斷此類受體的表達(dá)，由此阻止植物中的病毒感染和/或病毒傳播。例示性的植物病原體包括但不限于植物病毒，諸如苜蓿花葉病毒屬(v4^movzyw力、a潛隱病毒屬(y4/p/zac^y/7toWr^s)、4干^犬DNA病毒屬(5ad"avz'n^)、卩潛隱病毒屬(5etoc^/tov^M力、歷gemz'm'v7.n^、雀麥花葉病毒屬(5ramovzVws)、大麥黃4t花葉病毒屬(^ymovzyw;)、毛狀病毒屬(Cop/〃oWn^)、香石竹病毒屬(Car/avz'ntf)、香石竹斑駁病毒屬(a^mov/ra力、花椰菜花葉病毒組(CaM/^(Jw>us)、長(zhǎng)線形病毒組(C7osferav/n^)、iX豆花葉病毒組(ComoWn^)、黃瓜花葉病毒組(CwcMmov/ms)、質(zhì)型彈狀病毒屬(Cyw/2a^/oWn^)、石竹病毒屬(Dz'a"f/zov/ra力、碗豆耳突花葉病毒組C&zamovz>w)、蠶豆萎蔫病毒組CFakm'n^)、變濟(jì)病毒屬CF^'v/nw)、真菌傳桿狀病毒組(Fwrav/n^)、大麥病毒屬(7/onie/v/rM力、場(chǎng)6r/ge附/m,v/n^、懸鉤子病毒屬(/c/aeoWn^)、煙草線條病毒組(//arWra力、甘薯輕型斑駁病毒屬(//70附ov//^)、大麥黃矮病毒組(丄wfeovzVw力、玉米退纟錄斑馬爻病毒屬(Afac/7/o附ov/n^)、才登?；ㄈ~病毒屬(Afflc/wraWn^)、玉米雷亞多非纟內(nèi)病毒屬(Mara力vzVus)、Mo"ogem/"/v/n^s、矮縮病毒屬(iVawavzVitf)、壞死病毒屬(7VecraWn^)、線蟲(chóng)傳多角體病毒組(_/Vepovz>i)、斗亥型5單卄犬病毒屬(7Vwc/eor/7GZ^ov/rR)、？K,舀病毒屬(OjzavzVws)、OMnm'aWn^、才直物呼腸病毒CP/zytowoWra力、馬鈴薯X病毒纟且(戶ofexv/n^)、馬鈴薯Y病毒組(尸oteyWmy)、黑麥草花葉病毒屬(i^mowVw力、衛(wèi)星RNA、衛(wèi)星病毒Oafe〃/Wn^)、伴生病毒屬0Se《w/vzVw"、南方菜豆花葉病毒組0Sb6e附ov/ra"、纖纟田病毒屬(7fewz^vzH^)、煙草花葉病毒組(r。kzmov/n^)、煙草脆裂病毒組(7bZ)rav/ra力、番茄叢矮病毒組(row^wv/n^)、番i5S斑萎病毒屬(7bspovzVw;y)、發(fā)狀病毒屬(7h'c/20vz'ms)、蕪菁黃花葉病毒組(^wov/ms)、傘形才直4勿病毒屬(L^6rav/rw力、巨月永病毒屬()^;n'casav/n^)及^委4匕病毒屬(,汝aWra力；真菌病原體諸如黑粉菌(例如黑粉菌目(t/幼7ag/加/e力)、銹菌(銹菌目(t/w&"a/as))、麥角菌(C7av/cep"pw/wwa)和霉；霉菌(卵菌綱((9o附y(tǒng)cetes))，諸如馬鈴薯晚疫病菌(尸/^o//2f/zora/"/eWa"力(馬鈴薯疫病)；細(xì)菌病原體，諸如歐文氏菌屬CEnWm'a)(例如草生歐文氏菌屬(五./^A/co/a))、假單胞菌屬0P化w^W7Owoy)(例如銅綠假單胞菌(尸.awwg/"ora)、丁香假單胞菌(尸.^yn'"gM)、熒光假單胞菌(尸.yZMomyce"化)和惡臭假單胞菌(尸./w"&))、i^/stom'a(例^口W.so/awacearwm)、土;裏才干菌屬(^4gra6acfeWMm)矛口黃單月包菌屬(Jfom^owo"a力；線蟲(chóng)(線蟲(chóng)纟岡(7Ve/7atoda));及尸/^tomyxea(尸o(ymyxa禾口才艮種菌屬(戶/a纖c^op/zora))。所公開(kāi)的用于靶向重組的方法可用于用同源但不相同的序列替換任何基因組序列。例如，突變型基因組序列可用其野生型對(duì)應(yīng)物(counterpart)替換，由此提供用于治療植物疾病的方法；提供對(duì)植物病原體的抗性；提高作物產(chǎn)量等等。類似地，基因的一種等位基因可以用不同的等位基因替換，使用本文所/>開(kāi)的革巴向重組方法進(jìn)4于。在許多這些情況中，感興趣區(qū)域包含突變，而供體多核苷酸包含相應(yīng)的野生型序列。類似地，野生型基因組序列可以用突變型序列替換，如果想要這樣的話。確實(shí)，以任何方式依賴于特定基因組序列的任何病理可以使用本文所公開(kāi)的方法和組合物來(lái)糾正或緩和。輩巴向切割和耙向重組還可以用于改變非編碼序列(例如調(diào)節(jié)序列，諸如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、起始子、終止子、剪接位點(diǎn))以改變基因產(chǎn)物的表達(dá)水平。此類方法可以用于例如治療目的、細(xì)胞生理學(xué)和生物化學(xué)的改變、功能基因組學(xué)和/或靶標(biāo)確認(rèn)研究。本文所述方法和組合物還可用于激活和阻抑基因表達(dá)，其使用非規(guī)范鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和功能域間的融合物來(lái)實(shí)現(xiàn)。此類方法^L露于例如共有的美國(guó)專利6,534,261;6,824,978;和6，933,113'通過(guò)提及而收錄它們的公開(kāi)內(nèi)容。別的阻抑方法包括靶向待阻抑的基因序列的反義寡核苷酸和/或小干擾RNA(siRNA或RNAi)的4吏用。在別的實(shí)施方案中，在本文所公開(kāi)的鋅指-切割結(jié)構(gòu)域融合物之外或代替本文所公開(kāi)的鋅指-切割結(jié)構(gòu)域融合物，鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和重組酶(或其功能性片段)之間的一種或多種融合物可用于促進(jìn)靶向重組。參見(jiàn)例如共有的美國(guó)專利No.6,534,261及Akopian等(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:8688-8691。與轉(zhuǎn)錄激活或阻抑結(jié)構(gòu)域的融合物，所述轉(zhuǎn)錄激活或阻抑結(jié)構(gòu)域的活性需要二聚化(或是同二聚化或是異二聚化)。在這些情況中，融合多肽包含鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和功能域單體(例如來(lái)自二聚體轉(zhuǎn)錄激活或阻抑結(jié)構(gòu)域的單體)。兩個(gè)此類融合多肽與適當(dāng)定位的靶位點(diǎn)結(jié)合容許進(jìn)行二聚化，使得重建功能性轉(zhuǎn)錄激活或阻抑結(jié)構(gòu)域。實(shí)施例在下述實(shí)施例中進(jìn)一步解釋本發(fā)明，其中除非另作說(shuō)明，所有分?jǐn)?shù)和百分比均按重量計(jì)，而溫度按攝氏溫標(biāo)計(jì)。應(yīng)當(dāng)理解的是，雖然這些實(shí)施例指明了本發(fā)明的某些實(shí)施方案，但是其僅作為例證給出。從上文的討論和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定本發(fā)明的本質(zhì)特征，并且在不背離其精神和范圍的前提下，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改變和修飾以使其適于各種用途和條件。實(shí)施例l:ZFN表達(dá)栽體如下修飾美國(guó)專利公開(kāi)文本2005/0064474(通過(guò)提及而收錄它的公開(kāi)內(nèi)容)(參見(jiàn)該申請(qǐng)的實(shí)施例2)的實(shí)施例2和14中所述包含編碼4個(gè)指的ZFN(稱為"5-8，，和"5-9")的序列的表達(dá)載體。簡(jiǎn)言之，將5-8和5-9ZFN(其包含經(jīng)由4個(gè)氨基酸的ZC接頭與IIS型P艮制酶FWI的核酸酶結(jié)構(gòu)域(Wah等(1998)Proc.Natl.Acad,Sci.USA95:10564-10569的序列的第384-579位氨基酸)融合的4個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域)修飾為CCHC結(jié)構(gòu)。還對(duì)C端His和Cys鋅配位結(jié)構(gòu)間的殘基和/或指2和/或指4的C端Cys的C端殘基進(jìn)行別的修飾(替代和插入)。實(shí)施例2:報(bào)道細(xì)胞系中eGFP的基因校正在Umov(2005)Nature435(7042):646-51和美國(guó)專利^>開(kāi)文本No.20050064474(例如實(shí)施例6-11)所述GFP系統(tǒng)中測(cè)試包含本文所述CCHC鋅指的ZFN促進(jìn)同源重組的能力。簡(jiǎn)言之，依照InvitrogenLipofectamine2000方案，每個(gè)樣品使用2(iLLipofectamine2000將50ng每種ZFN和500ng無(wú)啟動(dòng)子的GFP供體(Umov(2005)Nature)轉(zhuǎn)染入500,000個(gè)報(bào)道細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)添加0.2nM終濃度的長(zhǎng)春堿，并在轉(zhuǎn)染后72小時(shí)除去。轉(zhuǎn)染后5天通過(guò)在Guava臺(tái)式FACS分析儀上每次轉(zhuǎn)染測(cè)量40,000個(gè)細(xì)胞來(lái)對(duì)細(xì)胞測(cè)定GFP表達(dá)。如圖1所示，包含上文表1和2所示經(jīng)改變的CCHC鋅指的大多數(shù)ZFN促進(jìn)報(bào)道(GFP)基因座處的同源重組，導(dǎo)致高于未修飾CCHC鋅指的水平的GFP表達(dá)，而且數(shù)種ZFN的性能與包含CCHH鋅指的ZFN相當(dāng)。性能最佳的變體在被放置于指4(F4)中時(shí)包含如下序列(在His鋅配位殘基的C端并包括His鋅配位殘基)HAQRCGLRGSQLV(SEQIDNO:53)(表2中稱為#21且圖1中以"2-21"所示的鋅指)。性能最佳的變體在被放置于指2(F2)中時(shí)包含如下序列(在His鋅配位殘基的C端并包括His鋅配位殘基)HIRTCTGSQKP(SEQIDNO:75)(表2中稱為#43且圖1中以"2-43，，所示的鋅指)。實(shí)施例3:通過(guò)耙向重組編輯染色體IL2RY基因還在Umov(2005)Nature435(7042):646-51和美國(guó)專利公開(kāi)文本No.使用Nucleofector(Amaxa)將2.5嗎每種ZFN表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染入500,000個(gè)K562細(xì)胞中。收獲基因組DNA，并使用Surveyor內(nèi)切核酸酶試劑盒在內(nèi)源IL2Ry基因座處測(cè)定基因破壞。圖2的左上部顯示了ZFN。具體地，經(jīng)改變的鋅指20指包含序列HTRRCGLRGSQLV的CCHC鋅指；鋅指21包含序列HAQRCGLRGSQLV(SEQIDNO:53);鋅指43包含序列HIRTCTGSQKP(SEQIDNO:75);鋅指45包含序列HIRTGCTGSQKP;鋅指47包含序列HIRRCTGSQKP;而鋅指48包含序列HIRRGCTGSQKP。在4個(gè)指的ZFN的指4中使用鋅指20和21,而在4個(gè)指的ZFN的指2中使用鋅指43、45、47、和48。在上文圖2中且于該圖的右側(cè)及在表5中顯示了所測(cè)試的ZFN對(duì)<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>為了測(cè)定是否已經(jīng)在切割位點(diǎn)處誘導(dǎo)突變，使用Cd-1測(cè)定法來(lái)分析擴(kuò)增產(chǎn)物，在所述Cel-l測(cè)定法中將擴(kuò)增產(chǎn)物變性，并復(fù)性，接著用錯(cuò)配特異性Cel-l核酸酶處理。參見(jiàn)例如Oleykowski等(1998)NucleicAcidsRes.26:4597-4602;Qui等(2004)BioTechniques36:702-707;Yeung等(2005)BioTechniques38:749-758。在圖2中為每個(gè)樣品顯示了兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。樣品8和9的實(shí)驗(yàn)#2在道中具有顯著的背景噪聲，其降低了這些ZFN的表觀功效。如圖2所示，某些CCHC變體基本上與野生型C2H2ZFN等同。指4處的鋅指21(樣品5和9)比指4處的鋅指20(樣品4和8)產(chǎn)生更好的結(jié)果。在指2中，鋅指43產(chǎn)生最好的結(jié)果。實(shí)施例4:報(bào)道細(xì)胞系中eGFP的基因校正基于圖1和2中所示結(jié)果，生成上文表3和4中所示CCHC鋅指(稱為la至10a)。將這些鋅指摻入5-8和5-9ZFN中，并在上文實(shí)施例2所述GFP基因校正測(cè)定法中測(cè)試。在每個(gè)柱形下方顯示了每個(gè)樣品中所測(cè)試的ZFN對(duì)，其中鋅指編號(hào)20、21、43、45、47和48是那些在實(shí)施例3中所述的，并且CCHC鋅指la至10a包含上文表3和4中所示序列。在指4中使用鋅指20、21、7a、8a、9a和10a;在指2中j吏用鋅指43、45、47、48、la、2a、3a、4a、5a、和6a。在圖3中顯示了結(jié)果。每個(gè)柱形下方的首行指摻入ZFN5-8中的鋅指，而每個(gè)柱形下方的末行指摻入ZFN5-9中的鋅指。例如，圖3上自左側(cè)起的第2個(gè)柱形指用5-8和5-9ZFN轉(zhuǎn)染的樣品，其中兩種ZFN的F4包含鋅指20的序歹寸。如所顯示的，許多包含CCHC鋅指的ZFN的性能與野生型(CCHH)ZFN相當(dāng)。實(shí)施例5:靶載體的設(shè)計(jì)和生成A.靶序列的總體結(jié)構(gòu)用于煙草(雙子葉植物)的靶構(gòu)建體包括以下7個(gè)構(gòu)件，如圖4和5所示i)潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)表達(dá)盒，其包含驅(qū)動(dòng)由根癌土壤桿菌C4.^w/acz'em)可讀框-24(orf-24)3，非翻譯區(qū)(UTR)(Gelvin等,1987,EP222493)所終止的大腸桿菌HPT基因(Waldron等，1985，PlantMol.Biol.18:189-200)的擬南芥(^O/za"a朋)遍在蛋白-3(ubi-3)啟動(dòng)子(Callis等，1990,J.Bio.Chem.265:12486-12493);ii)同源序列-1,其包含煙草(7V.tokCMm)RB7基質(zhì)附著區(qū)(MAR)(Thompson等，1997,WO9727207);iii)5'綠色熒光蛋白(GFP)基因片段(EvrogenJointStockCompany,Moscow,Russia),其由改良才艮癌土壤桿菌甘露堿合酶(Amas)啟動(dòng)子(Petolino等，美國(guó)專利No.6，730,824)所驅(qū)動(dòng)；iv)(3-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)表達(dá)盒，其包含驅(qū)動(dòng)由根癌土壤桿菌胭脂堿合酶(nos)3，UTR(DePicker等，1982,J.Mol.Appl.Genet.1:561-573)所終止的GUS基因(Jefferson,1987,PlantMol.Biol.Rep.5:387-405)的木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)啟動(dòng)子(Verdaguer等，1996,PlantMolecularBiology31:1129-1139);v)由根癌土壤桿菌orf-l3，UTR(Huang等，J.Bacteriol.172:1814-1822)所終止的3，GFP基因片段(EvrogenJointStockCompany,Moscow,Russia);vi)同源序列-2,其包含擬南芥4-香豆酰-CoA合酶(4-CoAS)內(nèi)含子-1(基因座At3g21320,GenBankNC003074);及vii)由根癌土壤桿菌ORF-25/263'UTR(Gelvin等，1987，EP222493)所終止的綠色產(chǎn)色鏈霉菌(S.WnWoc/jramoge"es)膦絲菌素磷酸轉(zhuǎn)移酶(PAT)(Wohlleben等，1988，Gene70:25-37)3'基因片段。將鋅指-Fokl融合蛋白結(jié)合位點(diǎn)(IL-l-LO-Fokl)(Urnov等，2005,US2005/0064474)插入CsVMV啟動(dòng)子(Verdaguer等，1996,PlantMolecularBiology31:1129-1139)下游，并與GUS編碼序列(Jefferson,1987,PlantMol.Biol.Rep.5:387-405)在N端融合。在5，和3'GFP基因片段(EvrogenJointStockCompany,Moscow,Russia)側(cè)翼有兩拷貝的第二鋅指-Fokl融合蛋白結(jié)合位點(diǎn)(Scd27-L0-Fokl)(Urnov等，2005，US2005/0064474)。每個(gè)結(jié)合位點(diǎn)含有特定鋅指-Fokl融合蛋白識(shí)別序列的四個(gè)串聯(lián)重復(fù)，使得每個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的大小為約200bp(圖6A)。這種設(shè)計(jì)是為確保識(shí)別序列在復(fù)雜的染色質(zhì)環(huán)境中會(huì)被鋅指-Fokl融合蛋白所易接近。每個(gè)識(shí)別序列包括反向重復(fù)序列，單個(gè)鋅指-Fokl融合蛋白以同二聚體形式結(jié)合至該反向重復(fù)序列并切割雙鏈DNA(圖6B)。5'和3，GFP基因片段交疊達(dá)540bp，這提供了靶序列內(nèi)的同源性，并將終止密碼子插在5，GFP片段的3，端以確保沒(méi)有來(lái)自靶序列的功能性GFP翻譯。如下文所述通過(guò)多步驟克隆方法來(lái)產(chǎn)生包含靶序列的轉(zhuǎn)化載體。B.HPT二元載體(pDAB1584)的構(gòu)建將含有GUS表達(dá)盒的載體pDAB1400用作開(kāi)始的基礎(chǔ)構(gòu)建體(圖7)，所述GUS表達(dá)盒包含驅(qū)動(dòng)由根癌土壤桿菌orf-lUTR(Huang等，J.Bacteriol.172:1814-1822)所終止的GUS基因(Jefferson,1987,PlantMol.Biol.Rep.5:387-405)的擬南芥ubi-3啟動(dòng)子(Callis等，1990,J.Bio.Chem.265:12486-12493)。為了消除靶構(gòu)建體中任何不必要的重復(fù)調(diào)節(jié)元件，用根癌土壤桿菌orf-24UTR(Gelvin等，1987,EP222493)替換pDAB1400中的根癌土壤桿菌orf-lUTR(Huang等，J.Bacteriol.172:1814-1822)，所述根癌土壤桿菌orf-24UTR作為SacI/Xbal片段切自pDAB782(圖8),并克隆入pDAB1400中的相同位點(diǎn)。所得的構(gòu)建體含有驅(qū)動(dòng)由根癌土壤桿菌orf-24UTR(Gelvin等，1987,EP222493)所終止的GUS基因(Jefferson,1987,PlantMol.Biol.Rep.5:387-405)的擬南芥ubi-3啟動(dòng)子(Callis等，1990,J.Bio.Chem.265:12486-12493)，并命名為pDAB1582(圖9)。使用引物Pl和P2從pDAB354質(zhì)粒(圖10)PCR擴(kuò)增HPT編碼序列(Waldron等，1985,PlantMol.Biol.18:189-200)。在引物Pl的5，端添加BbsI位點(diǎn)，而在引物P2的3，端保留SacI位點(diǎn)。將HPTIIPCR片段用BbsI/SacI消化，并克隆入經(jīng)NcoI-SacI消化的pDAB1582中，以用來(lái)自PCR片段的HPT基因替換GUS基因。所得的質(zhì)粒命名為pDAB1583(圖ll)。然后通過(guò)A^I消化從pDAB1583中切出擬南芥ubi-3/HPT/根癌土壤桿菌orf-24片段，并用T4DNA聚合酶處理以產(chǎn)生平末端。將經(jīng)過(guò)末端補(bǔ)平處理的HPT表達(dá)盒在Pmel位點(diǎn)克隆入pDAB2407(圖12)(—種二元基礎(chǔ)載體)，產(chǎn)生質(zhì)粒pDAB1584(圖13)。C.包含同源序列和Scd27鋅指-Fokl融合蛋白結(jié)合位點(diǎn)的載體(pDAB1580)的構(gòu)建用根癌土壤桿菌orf25/26UTR(Gelvin等，1987，EP222493)替換pDAB2418(圖14)中的根癌土壤桿菌orf-lUTR(Huang等，J.Bacteriol.172:1814-1822),以消除靶載體中的重復(fù)調(diào)節(jié)序列。為了進(jìn)行UTP交換，使用引物P3和P4從pDAB4045質(zhì)粒(圖15)中PCR擴(kuò)增根癌土壤桿菌orf25/26UTR(Gelvin等，1987，EP222493)。在PCR片段的3，端添加Smal和Agel位點(diǎn)，而在5，端保留SacI位點(diǎn)。將含有PAT基因表達(dá)盒的pDAB2418質(zhì)粒DNA用SacI和AgeI消化，并回收兩種最大的片段，所述PAT基因表達(dá)盒包含驅(qū)動(dòng)由根癌土壤桿菌orf-lUTR(Huang等，J.Bacteriol.172:1814-1822)所終止的PAT基因(Wohlleben等，1988,Gene70:25-37)的擬南芥泛蛋白-10(ubi-10)啟動(dòng)子(Callis等，1990,J.Biol.Chem.265:12486-12493))和煙草RB7MAIUf列(Thompson等，1997，WO9727207)。將這些片段與經(jīng)SacI和AgeI消化的根癌土壤桿菌orf25/26UTR(Gelvin等，1987,EP222493)PCR產(chǎn)物連接。所得的質(zhì)粒命名為pDAB1575(圖16)。煙草RB7MAR(Thompson等，1997，WO9727207)充當(dāng)耙載體中的同源序列-1。選擇擬南芥4-CoAS的內(nèi)含子-l(基因座At3g21320,GenBankNC003074)充當(dāng)靶載體中的同源序列-2。對(duì)PAT基因(Wohlleben等，1988,Gene70:25-37)編碼序列進(jìn)行了分析，并將起始密碼子下游299/300bp處鑒定為用于插入內(nèi)含子的位點(diǎn)，使得會(huì)形成合適的5，和3，剪接位點(diǎn)。然后通過(guò)DNA合成(PicoscriptLtd.，LLP,Houston,Texas)將全長(zhǎng)內(nèi)含子與253bp的3，部分PAT編碼序列融合。分別將iVo/I和SacI位點(diǎn)添加至DNA片段的5，和3，端。然后將合成的DNA片段用Mfl/Sacl消化，并在相同位點(diǎn)插入pDAB1575以替換全長(zhǎng)PAT編碼序列。所得的構(gòu)建體命名為pDAB1577(圖17)。合成(PicoscriptLtd.,LLP,Houston,Texas)含有Scd27-L0-Fokl識(shí)別位點(diǎn)的4個(gè)串聯(lián)重復(fù)的241bpDNA片段(圖6)，其中將SmaI位點(diǎn)添加至該片段的5，和3，兩端。然后將合成的含鋅指-Fokl結(jié)合位點(diǎn)的片段用SmaI消化，并在MscI位點(diǎn)插入pDAB1577中。所得的載體命名為pDAB1579(圖18)。然后將第二個(gè)經(jīng)Smal消化的含鋅指-Fokl結(jié)合位點(diǎn)的片段在Swal位點(diǎn)插入pDAB1579中。所得的構(gòu)建體命名為pDAB1580(圖19)。該載體包含同源序列1和2(分別是煙草RB7MAR和擬南芥4-CoAS內(nèi)含子l)及兩個(gè)合成的Scd27鋅指-Fokl結(jié)合位點(diǎn)(各含有Scd27-L0-Fokl識(shí)別位點(diǎn)的4個(gè)串聯(lián)重復(fù))。D.包含兩個(gè)部分重復(fù)的非功能性GFP片段的載體(pDAB1572)的構(gòu)建GFP基因CopGFP購(gòu)自EvrogenJointStockCompany(Moscow,Russia),并使用引物P5和P6來(lái)PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)編碼序列。分別將BbsI和SacI位點(diǎn)添加至PCR產(chǎn)物的5，和3，端。然后將CopGFPPCR產(chǎn)物用Bbsl/Sacl消化，并在NcoI/SacI位點(diǎn)克隆入pDAB3401(圖20)(其包含驅(qū)動(dòng)由根癌土壤桿菌orf-l3，UTR(Huang等，J.BacterioL172:1814-1822)所終止的GUS基因(Jefferson,1987:PlantMol.Biol.Rep.5:387-405)的改良根癌土壤桿菌Amas啟動(dòng)子(Petolino等,US6730824))以替換GUS基因。所得的載體命名為pDAB1570(圖21)。為了制備兩種部分重復(fù)的非功能性GFP片段，使用引物P9和P10來(lái)PCR擴(kuò)增如下DNA片段，該DNA片段含有CopGFP編碼序列的大部分但5，端有47bp刪除。將Apal位點(diǎn)添加至5，和3，兩端，并且將額外的StuI位點(diǎn)添加至5，端且在ApaI位點(diǎn)的下游。然后將PCR產(chǎn)物用ApaI消化，并在ApaI位點(diǎn)插入pDAB1570,由此在相同的載體中產(chǎn)生具有540bp重復(fù)序列的兩個(gè)非功能性GFP片段。所得的構(gòu)建體命名為pDAB1572(圖22)。E.包含IL-l鋅指-Fokl融合蛋白結(jié)合位點(diǎn)/GUS基因融合物的載體(pDAB1573)的構(gòu)建由PicoscriptLtd.,LLP,(Houston,Texas)合成包含IL-1JLO-Fokl識(shí)別位點(diǎn)的4個(gè)串聯(lián)重復(fù)的233bpDNA片段(圖6),其中分別將NcoI和AflIII位點(diǎn)添加至5，和3，端。然后將合成的片段用NcoI/AfllII消化，并在NcoI位點(diǎn)插入pDAB4003(圖23),其包含由CsVMY啟動(dòng)子(Verdaguer等，1996,PlantMolecularBiology31:1129-1139)所驅(qū)動(dòng)、由根癌土壤桿菌orf-l3，UTR(Huang等，J.Bacteriol.172:1814-1822)所終止的GUS基因(Jefferson,1987,PlantMol.Biol.Rep.5:387-405)。然后產(chǎn)生了IL-lJLO-Fokl結(jié)合位點(diǎn)和GUS編碼序列之間的N端融合物。所得的載體命名為pDAB1571(圖24)。為了消除靶載體中的重復(fù)3，UTR元件，將根癌土壤桿菌nos3，UTR(DePicker等,1982，J.Mol.Appl.Genet.1:561-573)作為Sacl/Pmel片段從pDAB7204(圖25)中切出，并克隆入經(jīng)SacI/Nael消化的pDAB1571以替換根癌土壤桿菌orf-l3，UTR(Huang等，J.Bacteriol.172:1814-1822)。所得的質(zhì)粒命名為pDAB1573(圖26)。F.最終的靶載體(pDAB1585)的構(gòu)建為了構(gòu)建最終的靶載體，通過(guò)7Vo/I消化從pDAB1573中切出具有IL-l-Fokl融合蛋白靶位點(diǎn)插入的GUS表達(dá)盒，補(bǔ)平末端，并在StuI位點(diǎn)插入pDAB1572。所得的中間載體命名為pDAB1574(圖27)。從pDAB1574中切出完整的盒，并在Mfl位點(diǎn)插入pDAB1580,所述完整的盒包含改良Amas啟動(dòng)子(Petolino等，US6730824)、5，部分重復(fù)GFP序列(EvrogenJointStockCompany,Moscow,Russia)、CsVMV啟動(dòng)子(Verdaguer等，1996,PlantMolecularBiology31:1129-1139)、IL-l-Fokl融合蛋白靶序列、GUS基因(Jefferson,1987,PlantMol.Biol.Rep.5:387-405)編碼區(qū)、根癌土壤桿菌nos3，UTR(DePicker等,1982,J.Mol.Appl.Genet.1:561-573)、3'部分重復(fù)GFP(EvrogenJointStockCompany,Moscow,Russia)、及才艮癌土i裏沐干菌orf-l3，UTR(Huang等,J.Bacteriol.172:1814-1822)。所得的質(zhì)粒命名為pDAB1581(圖28)。然后將pDAB1581的Agel片段在Agel位點(diǎn)插入pDAB1584,由此產(chǎn)生最終的靶構(gòu)建體pDAB1585(圖4和5)。實(shí)施例6:具有整合的耙序列的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的生成使用煙草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物(其稱為BY2),經(jīng)由土壤桿菌屬轉(zhuǎn)化而向其中穩(wěn)定整合實(shí)施例5的靶序列?；A(chǔ)細(xì)胞系BY2獲自JimUeki(JapanTobacco,Iwata,Shizuoka,Japan)。該培養(yǎng)物在100-150個(gè)細(xì)胞簇(ce11cluster)中增殖為5-10n直徑的細(xì)胞，其中倍增時(shí)間為大致18小時(shí)。將BY2細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物維持在含有下列成分的培養(yǎng)基中LS基礎(chǔ)鹽類(PhytoTechnologyLabsL689)、170mg/LKH2PO4、30g/L蔗糖、0.2mg/L2,4-D及0.6mg/L鹽酸硫胺素，pH6.0。通過(guò)添加50mL基于LS的培養(yǎng)基(LS-basedmedium)至t).25mLPCV來(lái)每7天對(duì)BY2細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將BY2細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物維持在旋轉(zhuǎn)式搖瓶機(jī)(25。C，125RPM)上的250mL燒瓶中。為了產(chǎn)生具有整合的靶序列的轉(zhuǎn)基因BY2細(xì)胞培養(yǎng)物，將一瓶傳代培養(yǎng)后4天的煙草懸浮液分成10-12份4mL的等分試樣，將其與100pL過(guò)夜培養(yǎng)至OD,約1.5的包含pDAB1585的土壤桿菌菌抹LBA4404共培養(yǎng)于100x25mm皮氏皿中。將各皿用石蠟封口膜包裹，并在25。C在不進(jìn)行搖動(dòng)的情況下溫育3天，之后，將過(guò)量的液體除去，并用llmL含有500mg/L羧千青霉素的基于LS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基替換。使煙草細(xì)胞重懸浮后，將lmL懸浮液分配至用8g/LTC瓊脂固化的、含有500mg/L羧節(jié)青霉素和200mg/L潮霉素的適當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的100x25mm平板上，并在28。C以未包裹形式在黑暗中溫育。這導(dǎo)致一次處理產(chǎn)生120-144塊選擇平板。在鋪板后10-14天出現(xiàn)個(gè)別的潮霉素抗性分離群(isolate),并將其轉(zhuǎn)移至各個(gè)60x20mm平板(每塊平板一個(gè)分離群)，其中按照14天傳代培養(yǎng)曰程表將它們以胼胝體形式維持，直至需要用于分析和隨后的再轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例7:耙轉(zhuǎn)基因事件的篩選和表征對(duì)自I巴載體轉(zhuǎn)化入BY2煙草細(xì)胞培養(yǎng)物所產(chǎn)生的潮霉素抗性轉(zhuǎn)基因事件(如實(shí)施例6所述)進(jìn)行如下分析。為了篩選這些轉(zhuǎn)基因事件而進(jìn)行的最初分析包括GUS表達(dá)分析以表明靶序列的可接近性、部分和全長(zhǎng)靶序列的PCR分析以證實(shí)靶載體的存在和完整性、及Southern印跡分析以測(cè)定所整合的靶序列的拷貝數(shù)。顯示GUS表達(dá)的轉(zhuǎn)基因事件的一個(gè)子集包含一個(gè)單拷貝的全長(zhǎng)靶序列；對(duì)它們選擇以用于重建懸浮培養(yǎng)物以產(chǎn)生供隨后再轉(zhuǎn)化用的靶系。這些重建的靶系還經(jīng)歷進(jìn)一步的表征，其包括更徹底的Southern印跡分析、整個(gè)靶插入物的測(cè)序確證、及側(cè)翼基因組序列分析。對(duì)自所選事件啟動(dòng)的轉(zhuǎn)基因煙草胼胝體或懸浮培養(yǎng)物如下分析GUS活性，即將50mg樣品在150)iL測(cè)定緩沖液中在37。C溫育24-48小時(shí)。測(cè)定緩沖液含0.2M磷酸鈉pH8.0、各O.lmM的鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀、l.OmM鈉鹽EDTA、0.5mg/mL5-溴-4-氯-3-P引哚基-卩-葡糖普酸(glucuronide)和0.60/。(v/v)TritonX-100(Jefferson,1987,PlantMol.Biol.Rep.5:387-405)。將藍(lán)色有色區(qū)域的出現(xiàn)用作GUS基因表達(dá)的指示物，其表明耙序列插入是具有轉(zhuǎn)錄活性的，因此在局部的基因組環(huán)境中是可接近的。通過(guò)使用引物對(duì)P15/P16的PCR來(lái)對(duì)表達(dá)GUS的轉(zhuǎn)基因事件進(jìn)行測(cè)定，所述使用引物對(duì)P15/P16的PCR導(dǎo)致從靶序列5，端的HTP表達(dá)盒的3，UTR延伸至靶序列3'端的部分PAT基因盒的3'UTR的10kbDNA片段擴(kuò)增。因?yàn)樗械氖录际窃诔泵顾剡x擇下獲得的，因此認(rèn)為HPT表達(dá)盒在所有靶事件中都是完整的。因此，全長(zhǎng)PCR分析中僅覆蓋HPT表達(dá)盒的3，UTR。還對(duì)事件的一個(gè)子集使用引物對(duì)P15/P17和P18/P19進(jìn)行PCR測(cè)定以分別測(cè)定靶序列的5，和3，端的完整性。通過(guò)Southern印跡分析對(duì)所有經(jīng)PCR分析證實(shí)的靶事件進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)定以測(cè)定所整合的靶序列的拷貝數(shù)。對(duì)所有通過(guò)GUS表達(dá)和全長(zhǎng)PCR篩選的靶事件實(shí)施Southern印跡分析。將1(Vg基因組DNA用靶序列內(nèi)的一次切割者(uniquecutter)Nsil消化。將經(jīng)消化的基因組DNA在0.8。/。瓊脂糖凝膠上分開(kāi)，并轉(zhuǎn)移至尼龍膜上。在交聯(lián)后，用HPT基因探針來(lái)雜交所述膜上的轉(zhuǎn)移DNA以測(cè)定靶序列的5，端的拷貝數(shù)。然后將相同的印跡剝離(strip),并與PAT基因探針再雜交以測(cè)定靶序列的3，端的拷貝數(shù)。選擇多個(gè)顯示了GUS表達(dá)并含有單拷貝全長(zhǎng)靶序列的事件用于進(jìn)一步表征，其包括更徹底的Southern印跡分析、整個(gè)靶序列確證、及側(cè)翼基因組序列分析?；诜肿颖碚鬟x擇一個(gè)稱為BY2-380的事件。從該事件重建懸浮培養(yǎng)物，用于隨后的使用包含供體DNA的載體和非C2H2鋅指-Fokl融合蛋白基因進(jìn)行的再轉(zhuǎn)化。為了確保自靶事件BY2-380建立的懸浮培養(yǎng)物包含預(yù)期的完整靶序列，使用引物對(duì)P15/P16PCR擴(kuò)增靶序列主體(從靶序列5，端的HPT表達(dá)盒的3，UTR至靶序列3，端的部分PAT基因盒的3，UTR)，并克隆入pCR2.1TOPO載體(Invitrogen，Carlsbad,California)。TOPO載體中插入的PCR產(chǎn)物由Larktechnology,Inc.(Houston,Texas)進(jìn)行測(cè)序。序列結(jié)果指明，BY2-380具有預(yù)期的完整靶序列。4吏用通用GenomeAValkeri式劑盒(Clontech,MountainView,California)來(lái)只十BY2-380細(xì)胞系進(jìn)行進(jìn)一步分析以獲得側(cè)翼基因組序列。簡(jiǎn)言之，在分開(kāi)的反應(yīng)中使用三種平端限制酶EcoRV、Dral及StuI來(lái)消化2.5pg基因組DNA。將經(jīng)消化的DNA通過(guò)酚/氯仿抽提來(lái)純化，并與BDGenomeWalker銜接頭連接。實(shí)施嵌套式PCR擴(kuò)增，其中該連接作為模板且引物P20(在靶序列插入的5，端上游步^^)和P21(在靶序列插入的3，端下游步行)用于一級(jí)PCR反應(yīng)，而引物P22(在靶序列插入的5，端上游步行)和P23(在靶序列插入的3，端下游步行)用于二級(jí)嵌套式PCR反應(yīng)。將來(lái)自二級(jí)PCR反應(yīng)的擴(kuò)增片段克隆入pCR2.1TOPO或pCRBluntIITOPO載體(Invitrogen，Carlsbad,California),并使用染料終止物循環(huán)測(cè)序試劑盒(DyeTerminatorCycleS叫uencingKit,BeckmanCoulter,Fullerton,CA)來(lái)測(cè)序。經(jīng)由該方法自BY2-380靶系中獲得側(cè)翼基因組序列。然后基于側(cè)翼基因組序列設(shè)計(jì)引物，并用于擴(kuò)增整個(gè)靶序列。自該靶系獲得的擴(kuò)增片段具有預(yù)期的大小。通過(guò)測(cè)序證實(shí)擴(kuò)增片段的兩末端。實(shí)施例8:供體DNA載體的設(shè)計(jì)和生成供體DNA構(gòu)建體包括同源序歹'J-1(煙草RB7MAR)(Thompson等，1997,WO9727207)、全長(zhǎng)擬南芥ubi10啟動(dòng)子(Callis等，19卯，J.Biol.Chem.265:12486-12493)、299bp的5，部分PAT基因編碼序歹'J(Wohlleben等，1988，Gene70:25-37)及同源序列-2(擬南芥4-CoAS內(nèi)含子-1)(基因座At3g21320,GenBankNC003074)。供體載體中的同源序列-l和序列-2兩者與靶載體(pDAB1585)中相應(yīng)的同源序列-1和序列-2是相同的。為了構(gòu)建供體載體，通過(guò)PicoscriptLtd.,LLP,(Houston,Texas)進(jìn)行的DNA合成來(lái)將299bp的5，部分PAT編碼序列與全長(zhǎng)擬南芥4-CoAS內(nèi)含子-1(基因座At3g21320,GenBankNC003074)融合。分別將NcoI和XhoI位點(diǎn)添加至該片段的5，和3，端。然后將該合成的DNA片段用NcoI/XhoI消化，并在相同位點(diǎn)插入pDAB1575以替換全長(zhǎng)PAT基因編碼序列及其3，UTR。所得的構(gòu)建體命名為pDAB1576(圖29)。然后用Agel消化pDAB1576,并將包含側(cè)翼為同源序列-l和同源序列-2的5，部分PAT表達(dá)盒的整個(gè)片段在相同位點(diǎn)插入pDAB2407(—種二元基礎(chǔ)載體)。所得的構(gòu)建體命名為pDAB1600(圖30)，并且是供植物細(xì)胞再轉(zhuǎn)化用的二元型式的供體載體。實(shí)施例9:鋅指核酸酶表達(dá)載體的設(shè)計(jì)和生成鋅指-Fokl融合蛋白基因由CsVMV啟動(dòng)子和5，UTR所驅(qū)動(dòng)(Verdaguer等,1996,PlantMolecularBiology31:1129-1139)。該盒中還包含的是根癌土壤桿菌可讀框_24(orf-24)3'非翻譯區(qū)(UTR)(Gelvin等，1987,EP222493)。為了構(gòu)建這些載體，上文實(shí)施例l至4中所述IL-l-Fokl和Scd27-Fokl編碼序列的C2H2對(duì)照及其C3H變體從它們的最初設(shè)計(jì)中PCR擴(kuò)增，分別將BbsI或NcoI和SacI位點(diǎn)添加至PCR片段的5，和3，端，并克隆入經(jīng)NcoI-SacI消化的pDAB3731(圖31)中。所得的質(zhì)粒命名為pDAB4322(圖32)、pDAB4331(圖33)、pDAB4332(圖34)、pDAB4333(圖35)、pDAB4334(圖36)、pDAB4336(圖37)、和pDAB4339(圖38)。所有這些載體包含ZFN表達(dá)盒側(cè)翼的attL1和attL2位點(diǎn)，并且與Gateway克隆系統(tǒng)(Invitrogen,Carlsbad,California)相答。為IL-l-FokI融合蛋白構(gòu)建兩套二元型式載體。一套包含PAT選擇標(biāo)志基因，而另一套不包含PAT選擇標(biāo)志基因。對(duì)于SCd27-Fokl融合蛋白，僅構(gòu)建不含PAT選擇標(biāo)志基因的二元型式載體。為了構(gòu)建含PAT選擇標(biāo)志基因的二元載體，使用LRClonaseTM酶混合物(Invitrogen,Carlsbad,Califomia)經(jīng)由LR重組反應(yīng)將pDAB4322、pDAB4331、pDAB4332、pDAB4333、pDAB4334、和pDAB4336中的IL-l-Fokl融合蛋白表達(dá)盒克隆入pDAB4321(圖39)中。所得的質(zhì)粒命名為pDAB4323(圖40)、pDAB4341(圖41)、pDAB4342(圖42)、pDAB4343(圖43)、pDAB4344(圖44)、pDAB4346(圖45)。為了構(gòu)建不含PAT選擇標(biāo)志基因的二元載體，使用LRClonaseTM酶混合物(Invitrogen,Carlsbad，California)經(jīng)由LR重組反應(yīng)分別將分別在pDAB4331、pDAB4336和pDAB4339中的C2H2IL-l-Fokl、C3HIL-l-Fokl和Scd27-Fokl表達(dá)盒克隆入pDAB4330(圖46)中。所得的質(zhì)粒分別命名為pDAB4351(圖47)、pDAB4356(圖48)和pDAB4359(圖49)。為了構(gòu)建SCD27-Fokl的C2H2對(duì)照，用包含驅(qū)動(dòng)GUS的CsVMV啟動(dòng)子及5，UTR和煙草5，UTR的片段(其是用HindlII/SacI從pDAB7025(圖51)中切割的)替換pDAB7002(圖50)中包含驅(qū)動(dòng)PAT的CsVMV啟動(dòng)子和5，UTR的HindlII/SacI片段。所得的質(zhì)粒命名為pDAB1591(圖52)。Scd27-L0-Fokl編碼序列使用引物對(duì)P13/P14從其最初載體pCDNA3.1-SCD27a-L0-Fokl(圖53)PCR擴(kuò)增。分別將BbsI和SacI位點(diǎn)添加至PCR片段的5，和3，端。經(jīng)由SacI/Nco1克隆用鋅指融合蛋白基因PCR片段替換pDAB1591中的PAT基因。所得的質(zhì)粒命名為pDAB1594(圖54)。如下構(gòu)建該載體的二元型式，即從pDAB1594中以Pmel/XhoI片段切出鋅指融合蛋白基因表達(dá)盒，補(bǔ)平末端，并在PmeI位點(diǎn)克隆入pDAB2407。所得的質(zhì)粒命名為pDAB1598(圖55)。表6中總結(jié)了用于植物轉(zhuǎn)化的所有二元載體的詳情。表6:鋅指核酸酶表達(dá)載體<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>*Fokl結(jié)構(gòu)域是植物密碼子偏愛(ài)的。實(shí)施例10:陽(yáng)性對(duì)照載體的^:計(jì)和生成為了評(píng)估非常規(guī)重組頻率并充當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照，使用含有PAT基因表達(dá)盒的載體。為了可與最終的重組體進(jìn)行比較，在PAT編碼序列(Wohlleben等，1988,Gene70:25-37)的299/300bp處插入擬南芥4-CoAS內(nèi)含子-1(基因座At3g2132(XGenBankNC003074)。為了構(gòu)建這種構(gòu)建體，將來(lái)自pDAB1576的2559bpSwal/Clal片段連接經(jīng)相同限制酶消化的pDAB1577(圖56)的主鏈片段。所得的載體包含PAT基因表達(dá)盒且其在PAT編碼序歹'KWohlleben等，1988,Gene70:25-37)中間有1743bp的擬南芥4-CoAS內(nèi)含子-1(基因座At3g21320,GenBankNC003074)(基因座At3g21320，GenBankNC003074)插入。該載體命名為pDAB1578(圖57)。為了構(gòu)建pDAB1578的二元型式，用Pmel/XhoI從pDAB1578中切出具有擬南芥內(nèi)含子-1(基因座At3g21320，GenBankNC003074)的PAT基因表達(dá)盒。在對(duì)該片段的3，端進(jìn)行補(bǔ)平末端處理后，將其在PmeI位點(diǎn)插入二元基礎(chǔ)載體pDAB2407。所得的載體命名為pDAB1601(圖58)，其包含由擬南芥ubilO啟動(dòng)子(Callis等，1990，J.Biol.Chem.265:12486-12493)所驅(qū)動(dòng)的且由根癌土壤桿菌orf25/263，UTR(Gelvin等，1987,EP222493)所終止的包含擬南芥4-CoAS內(nèi)含子-1(基因座At3g21320,GenBankNC003074)的PAT基因(Wohlleben等,1988,Gene70:25-37)。實(shí)施例ll:通過(guò)用C3H鋅指核酸酶基因再轉(zhuǎn)化靶細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)證明染色體內(nèi)的同源重組為了證實(shí)C3H鋅指核酸酶在刺激染色體內(nèi)同源重組中的功能性，如圖59所示，革巴載體中包括具有540bp交疊序列的兩個(gè)非功能性GFP片段。在這兩個(gè)片段之間的是GUS基因表達(dá)盒。將IL-1-Fokl融合蛋白結(jié)合序列與GUS編碼序列在其N端融合。不限于一種理論，假定在IL-l-Fokl融合蛋白存在下，IL-1ZFN結(jié)合序列會(huì)被識(shí)別，并且雙鏈DNA斷裂會(huì)被誘導(dǎo)，這會(huì)刺激內(nèi)源DNA修復(fù)過(guò)程。在沒(méi)有供體DNA存在下，兩個(gè)部分同源的GFP片段會(huì)經(jīng)歷染色體內(nèi)同源重組過(guò)程，并且功能性GFP基因會(huì)被重建。使用BY2-380轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系(其含有單拷貝的、全長(zhǎng)整合的靶序列)來(lái)再次啟動(dòng)懸浮培養(yǎng)，即將約250-500mg胼胝體組織放入40-5OmL含有100mg/L潮霉素的基于LS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，并如上文所述那樣每7天進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在再轉(zhuǎn)化之前，將懸浮培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至不含潮霉素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基達(dá)至少兩代。如上文所述實(shí)施土壤桿菌介導(dǎo)的靶細(xì)胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)化。對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，如下產(chǎn)生8塊共培養(yǎng)平板1塊平板包含與30(VL基礎(chǔ)土壤桿菌菌抹LBA4404共培養(yǎng)的細(xì)胞；1塊平板包含與300)iL包含pDAB1590(功能性GFP構(gòu)建體)的土壤桿菌菌抹共培養(yǎng)的細(xì)胞；6塊平板各包含與300pL分別包含pDAB4323、pDAB4341、pDAB4342、pDAB4343、pDAB4344、和pDAB4346的土壤桿菌菌株共培養(yǎng)的細(xì)胞。在使用上文所述方法進(jìn)行共培養(yǎng)后，將細(xì)胞鋪于裝有補(bǔ)充有500mg/L羧千青霉素而不含選擇劑的基于LS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的8塊平板上。所組建的功能性GFP基因的表觀表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化后約5-8天可見(jiàn)的焚光。通過(guò)觀察每塊平板5個(gè)"隨機(jī)的"顯微鏡視野來(lái)對(duì)每個(gè)視野的綠色焚光位置的數(shù)目計(jì)數(shù)(在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中每種構(gòu)建體8塊平板)，并自6個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)計(jì)算平均值。如表7所總結(jié)，自兩種C3H鋅指核酸酶，即pDAB4346和pDAB4343分別觀察到每個(gè)視野平均9.50和7.57個(gè)綠色熒光位置。IL-l-Fokl的這兩種C3H設(shè)計(jì)比其C2H2對(duì)照，即pDAB4341(每個(gè)視野6.37個(gè)位置)和pDAB4323(每個(gè)視野5.53個(gè)位置)性能更好。同時(shí)，與C2H2對(duì)照相比，IL-l-FokI融合蛋白的另兩種C3H變體即pDAB4344(每個(gè)視野4.39個(gè)位置)和pDAB4342(每個(gè)視野0.25個(gè)位置)的功能顯著地受損，特別是pDAB4342,其中C3H轉(zhuǎn)換僅通過(guò)在第4個(gè)指中用組氨酸替換第二個(gè)半胱氨酸進(jìn)行。在用基礎(chǔ)土壤桿菌菌抹LBA4404轉(zhuǎn)化的陰性對(duì)照中沒(méi)有觀察到超過(guò)輕微背景的可察覺(jué)到的熒光。表7經(jīng)由IL-l-Fokl鋅指融合蛋白刺激的染色體內(nèi)同源重組進(jìn)行的功能性GFP的構(gòu)建<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>^包含非植物密碼子偏愛(ài)的Fokl結(jié)構(gòu)域**不以相同字母聯(lián)系的均值在0.05水平是有顯著性差異的實(shí)施例12:通過(guò)用C3H鋅指核酸酶基因和供體DNA序列再轉(zhuǎn)化耙細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)證明染色體間同源重組為了證實(shí)C3H鋅指-Fokl融合蛋白在刺激例示性煙草系統(tǒng)中染色體間同源重組中的功能性，開(kāi)發(fā)并測(cè)試兩種策略。策略1中，靶構(gòu)建體(圖61)的中部包括鋅指-Fokl融合蛋白結(jié)合位點(diǎn)(IL-1-L0-Fokl)。在該策略中，結(jié)合位點(diǎn)兩側(cè)側(cè)翼均為約3kb的非同源序列，接著上游和下游分別為同源序列-1(煙草RB7MAR)和同源序列-2(擬南芥4-CoAS內(nèi)含子-1)。如先前所證實(shí)(例如美國(guó)專利公開(kāi)文本No.20050064474),在C2H2IL-l鋅指-Fokl融合蛋白存在下，IL-1-L0-Fokl結(jié)合序列被識(shí)別，并且在該特定位點(diǎn)誘導(dǎo)雙鏈DNA斷裂，這刺激內(nèi)源DNA修復(fù)過(guò)程。在供體DNA(其包含與靶序列中的同源序列相同的同源序列)存在下，5'部分PAT基因及其啟動(dòng)子經(jīng)由同源重組來(lái)替換靶物中同源序列間的整個(gè)約6kbDNA片段。通過(guò)這種方法，兩個(gè)部分PAT基因序列(擬南芥4-CoAS內(nèi)含子-l間插其間)重建功能性PAT基因，導(dǎo)致PAT表達(dá)和除草劑抗性表型。策略2中，靶載體中包括兩個(gè)鋅指-Fokl結(jié)合位點(diǎn)(Scd27-L0-Fokl):—個(gè)正好位于煙草RB7MAR下游，而另一個(gè)正好位于擬南芥4-CoAS內(nèi)含子-l上游(圖62)。兩個(gè)鋅指-Fokl融合蛋白結(jié)合位點(diǎn)之間的是約6kb的序列，其包括5，GFP片段、GUS表達(dá)盒和3，GFP片段。如先前所證實(shí)(例如美國(guó)專利公開(kāi)文本No.20050064474),在Scd27鋅指-Fokl融合蛋白存在下，兩個(gè)結(jié)合序列被識(shí)別，并且在兩個(gè)位置誘導(dǎo)雙鏈DNA斷裂，這除去這兩個(gè)結(jié)合序列之間的約6kbDNA片段，并刺激內(nèi)源DNA修復(fù)過(guò)程。與策略l類似，在供體DNA(其包含與靶序列中的同源序列相同的同源序列)存在下，5'部分PAT基因及其啟動(dòng)子通過(guò)在誘導(dǎo)雙鏈DNA斷裂的位點(diǎn)處進(jìn)行的同源重組而被插入靶序列。通過(guò)這種方法，兩個(gè)部分PAT基因序列(擬南芥4-CoAS內(nèi)含子-l間插其間)重建功能性PAT基因，導(dǎo)致PAT表達(dá)和除草劑抗性表型。如上文所述實(shí)施土壤桿菌介導(dǎo)的BY2-380靶細(xì)胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)化。對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，如下產(chǎn)生12塊共培養(yǎng)平板1塊平板包含與50pL包含pDAB1600(供體DNA)的土壤桿菌菌抹和250)iL土壤桿菌基礎(chǔ)菌抹LBA4404共培養(yǎng)的細(xì)胞；土壤桿菌基礎(chǔ)菌一朱LBA4404共培養(yǎng)的細(xì)胞；2塊平板包含與50pL包含pDAB1600(供體DNA)的土壤桿菌菌抹和250iLiL包含pDAB4351(C2H2IL-1ZFP-Fokl)的土壤桿菌菌抹共培養(yǎng)的細(xì)胞；3塊平板包含與50laL包含pDAB1600(供體DNA)土壤桿菌菌株和250nL包含pDAB4356(C3HIL-1ZFP-Fokl)的土i裏桿菌菌抹共培養(yǎng)的細(xì)胞；2塊平板包含與50pL包含pDAB1600(供體DNA)的土壤桿菌菌抹和250iaL包含pDAB1598(C2H2Scd27aZFP-Fokl)的土壤桿菌菌抹共培養(yǎng)的細(xì)胞；3塊平板包含50pL包含pDAB1600(供體DNA)的土壤桿菌菌抹和250pL包含pDAB4359(C3HScd27aZFP-Fokl)的土壤桿菌菌株共培養(yǎng)的細(xì)胞。使用上文所述方法進(jìn)行共培養(yǎng)后，將細(xì)胞鋪入含有500mg/L羧千青霉素和15mg/LBialaphos的基于LS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上。鋪板后2-4周出現(xiàn)個(gè)別的Bialaphos⑧抗性分離群，并將其轉(zhuǎn)移至各個(gè)60x20mm平板(每塊平板一個(gè)分離群)，其中按照14天傳代培養(yǎng)日程表將它們以胼胝體形式維持，直至需要用于分析。自C3HIL-l鋅指核酸酶(pDAB4356)和C3HScd27鋅指核酸酶(pDAB4359)都獲得多個(gè)Bialaphos⑧抗性分離群。通過(guò)使用引物對(duì)P24/25的PCR(其擴(kuò)增跨越重建的PAT基因的DNA片段)來(lái)分析這些分離群。引物P24與供體DNA中PAT編碼序列的5，端是同源的，而引物P25與靶DNA中PAT編碼序列的3，端是同源的。若兩個(gè)部分PAT編碼序列通過(guò)同源重組來(lái)連接，則會(huì)產(chǎn)生2.3kbPCR片段。如圖63所示，從所分析的多個(gè)分離群中獲得2.3kbPCR產(chǎn)物。從C3HIL-l鋅指-Fokl融合蛋白基因/供體DNA和C3HScd27鋅指-Fokl融合蛋白基因/供體DNA的共轉(zhuǎn)化中都獲得這些分離群。將來(lái)自多個(gè)獨(dú)立分離群(其代表自C3HIL-l鋅指-Fokl和C3HScd27鋅指-Fokl融合蛋白基因轉(zhuǎn)化兩者衍生的分離群)的2.3kbPCR產(chǎn)物從瓊脂糖凝膠中純化，并克隆入pCR2.1TOPO載體(Invitrogen,Carlsbad,California)。然后使用染料終止物循環(huán)測(cè)序試劑盒(BeckmanCoulter)對(duì)TOPO載體中插入的2.3kbPCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果證實(shí)，TOPO載體中克隆的所有PCR產(chǎn)物包含預(yù)測(cè)的重組序列，其包括5，和3，部分PAT基因序列以及間插的擬南芥4-CoAS內(nèi)含子-1。這些結(jié)果證實(shí)了經(jīng)由C3H鋅指-Fokl融合蛋白基因表達(dá)發(fā)生了對(duì)所測(cè)試的兩種策略預(yù)測(cè)的染色體間重組及所例示的基因靶向。實(shí)施例13:玉米細(xì)胞培養(yǎng)物中耙基因序列的鑒定A.序列鑒定在本實(shí)施例中，選擇已知功能的內(nèi)源玉米基因的DNA序列作為使用工程化鋅指核酸酶進(jìn)行的基因組編輯的靶物。該基因(稱為IPP2-K，其衍生自專賣的玉米近交系5XH751)的基因組結(jié)構(gòu)和序列已經(jīng)記載于W02006/029296,通過(guò)提及而收錄其公開(kāi)內(nèi)容。特別地，使用BLAST算法，使用IPP2-K基因組序列來(lái)查詢TIGR玉米基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(可在因特網(wǎng)上在http:〃www.tigr.org/tdb/tgi/maize/獲得)。鑒定出數(shù)個(gè)別的基因組片段具有與IPP2-K有交疊同源性的區(qū)段，包括但不限于登錄號(hào)AZM515213和TC311535?；谶@些登錄號(hào)的序列以及IPP2-K序列，使用Primer3程序(Rozen,S.和Skaletsky，H丄(2000)戶nwedo"Ae,『/orge"era/wsersam/7^6,'o/og7.5t/ragra附mera.于KrawetzS,MisenerS(編)BioinformaticsMethodsandProtocols:MethodsinMolecular'Biology.HumanaPress,Totowa，NJ,pp365_386;也可在因特網(wǎng)上獲得)，設(shè)計(jì)多個(gè)短的寡核苷酸，以用作PCR引物。這些引物包括-f旦不限于下列正向寡核苷酸1.5，-ATGGAGATGGATGGGGTTCTGCAAGCCGC-3'(SEQIDNO:104)2.5，-CTTGGCAAGGTACTGCGGCTCAAGAAGATTC-3,(SEQIDNO:161)3.5，-ATGAAGAAAGACAGGGAATGAAGGAC-3，(SEQIDNO:162)4.5，-ATGAAGAAAGACAGGGAATGAAGGACCGCCAC-3，(SEQIDNO:163)5.5,-CATGGAGGGCGACGAGCCGGTGTAGCTG-3'(SEQIDNO:164)6.5,-ATCGACATGATTGGCACCCAGGTGTTG陽(yáng)3，(SEQIDNO:165)另外，引物包括但不限于下列反向寡核苷酸7.5，-TTTCGACAAGCTCCAGAAAATCCCTAGAAAC-3，(SEQIDNO:166)8.5，-ACAAGCTCCAGAAAATCCCTAGAAACAC-3'(SEQIDNO:167)9.5，-TTCGACAAGCTCCAGAAAATCCCTAGAAACAC-3，(SEQIDNO:168)10.5，-TGCTAAGAACATTCTTTTCGACAAGCTCC-3，(SEQIDNO:169)11.5，-GAACATTCTTTTCGACAAGCTCCAGAAAATCC-3，(SEQIDNO:170)所有寡核苷酸引物均由IntegratedDNATechnologies(IDT,Coralville,IA)合成并自其購(gòu)買。B.HiII玉米細(xì)胞培養(yǎng)物為了獲得用于啟動(dòng)胼胝體培養(yǎng)的未成熟胚，在溫室培養(yǎng)的Hi-II親本A和B(Armstrong,C.,Green,C.和PhilIips，R.(1991)MaizeGenet.Coop.NewsLett.65:92-93)之間進(jìn)行F,雜交。從健康的穗中收獲大小約1.0-1.2mm(授粉后約9-10天)的胚，并通過(guò)用Liqui-Nox⑧肥皂擦洗來(lái)進(jìn)行表面滅菌，在70%乙醇中浸沒(méi)2-3分鐘，然后在20。/。商品化漂白劑(0.1%次氯酸鈉)中浸沒(méi)30分鐘。在無(wú)菌的蒸餾水中漂洗穗，并在無(wú)菌條件下切出未成熟的合子胚，并在15Agl0培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基(ChuCC.，WangC.C.,SunC.S.,HsuC.,YinK.C.,ChuC.Y"和BiF,Y.(1975)Sci.Sinica18:659-668)、l.Omg/L2,4-D、20g/L蔗糖、100mg/L酪蛋白水解物(酶促消化物)、25mML-脯氨酸、lOmg/LAgN03、2.5g/LGelrite,pH5.8)上培養(yǎng)2-3周，其中盾片(scutellum)背向培養(yǎng)基。將顯示預(yù)期形態(tài)學(xué)的組織(Welter,ME,Clayton,DS,Miller,MA，Petolino,JF.(1995)PlantCellRep:14:725-729)以兩周一次的間隔選擇性轉(zhuǎn)移至新鮮15AglO培養(yǎng)基上，達(dá)約6周，然而以兩周一次的間隔轉(zhuǎn)移至4培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基、1.0mg/L2,4-D、20g/L蔗糖、100mg/L酪蛋白水解物(酶促消化物)、6mML-脯氨酸、2.5g/LGelrite,pH5.8)上，達(dá)約2個(gè)月。為了啟動(dòng)胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)，將大約3ml充實(shí)細(xì)胞體積(PCV)的源自單個(gè)胚的胼胝體組織添加至大約30mlH9CP+液體培養(yǎng)基(MS基礎(chǔ)鹽混合物(M腿higeT.和SkoogF.(1962)Physiol.Plant.15:473-497)、含有少10倍的煙酸和高5倍的鹽酸硫胺素的改良MS維生素、2.0mg/L2,4-D、2.0mg/La-萘乙酸(NAA)、30g/L蔗糖、200mg/L酪蛋白水解物(酸消化物)、100mg/L肌肉-肌醇、6mML-脯氨酸、5。/。v/v椰子汁(就在傳代培養(yǎng)前添加)，pH6.0)。在黑暗條件下在設(shè)置成125rpm、28。C的溫控?fù)u瓶機(jī)中在125mlErlenmeyer燒瓶中維持懸浮培養(yǎng)物。在細(xì)胞系建立期間(2-3個(gè)月)，通過(guò)使用大孔移液管將3mlPCV細(xì)胞和7ml條件化培養(yǎng)基添加至20ml新鮮H9CP+液體培養(yǎng)基來(lái)每3.5天對(duì)懸浮液進(jìn)行傳代培養(yǎng)。達(dá)到成熟(如通過(guò)生長(zhǎng)倍增所證明的)后，將懸浮液在500ml燒瓶中放大，并維持，由此將12mlPCV細(xì)胞和28ml條件化培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至80mlH9CP+培養(yǎng)基中。在完全建立懸浮培養(yǎng)物后，將等分試樣進(jìn)行低溫保藏，供未來(lái)使用。參見(jiàn)WO2005/107437。C.DNA分離和擴(kuò)增在250ml燒瓶中于標(biāo)準(zhǔn)GN6培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基、2.0mg/L2,4-D、30g/L蔗糖、2.5g/LGelrite，pH5.8)中培養(yǎng)上文所述玉米HilI細(xì)胞培養(yǎng)物，并使用Qiagen(Valencia,CA)植物DNeasy提取試劑盒依照制造商的推薦提取基因組DNA。在如下條件下實(shí)施以所有可能的組合使用上文所述引物的PCR擴(kuò)增反應(yīng)25pl反應(yīng)體積，在酶制造商的緩沖液中含有20nggDNA沖莫板、20pmol每種引物、1%DMSO和10個(gè)單位的AccuprimeTMPf聚合酶(Invitrogen，Carlsbad,CA)。大小范圍500bp至2kb的擴(kuò)增產(chǎn)物源自由95°C-1，，(95°C-30"、57-62°C-30，，、72°C-1，)X30,72°C-5，，4°C-保持組成的擴(kuò)增循環(huán)。使用TA克隆試劑盒(Invitrogen，Carlsbad,CA)依照制造商的推薦將擴(kuò)增片段直接克隆入載體pCR2.1(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。D.序列分析對(duì)玉米近交系5XH751和HiII細(xì)胞培養(yǎng)物中IPP2-K基因的先前分析已經(jīng)指明構(gòu)成小基因家族的2-3個(gè)不同基因的存在(Sun等，印刷中，PlantPhysiology;WO2006029296)。因此，用CEQ染料終止物循環(huán)測(cè)序試劑盒(CEQDyeTerminatorCycleSequencingKit,BeckmanCoulter,Fullerton，CA)依照制造商的推薦對(duì)所分離的克隆片段測(cè)序。對(duì)多個(gè)克隆的序列分析揭示，已經(jīng)從Hill細(xì)胞中分離出2個(gè)不同的基因片段，其衍生自玉米基因組中2個(gè)不同的且先前表征的基因座。自HilI培養(yǎng)細(xì)胞分離的2個(gè)序列的比較指明，在預(yù)測(cè)編碼區(qū)中，2個(gè)旁系同系物之間存在微小的差異(諸如單核苷酸多態(tài)性，SNP),而內(nèi)含子和非編碼區(qū)在核苷酸水平顯著不同。注意到2個(gè)旁系同系物之間的這些差異是因?yàn)樗鼈兺怀鲲@示可被序列依賴性DNA結(jié)合蛋白(諸如鋅指結(jié)構(gòu)域)辨別的序列區(qū)域。本領(lǐng)域技術(shù)人員可設(shè)計(jì)結(jié)合一種基因序列而不結(jié)合另一種高度相似的基因序列的鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。選擇與感興趣旁系同系物對(duì)應(yīng)的1.2kb部分基因序列(圖66)作為供鋅指核酸酶蛋白設(shè)計(jì)用的模板，隨后進(jìn)行上文所述鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域分析。實(shí)施例14:IPP2-K鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的設(shè)計(jì)使用為IPP2-K鑒定的靶位點(diǎn)，為IPP2-K鋅指選擇識(shí)別螺旋。在下表8中顯示了鋅指設(shè)計(jì)。表8:IPP2-K鋅指設(shè)計(jì)<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>將IPP2-K設(shè)計(jì)摻入編碼具有CCHC結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的鋅指表達(dá)載體中。參見(jiàn)上文表1至表4。然后將非規(guī)范鋅指編碼序列與IIS型限制酶FoH的核酸酶結(jié)構(gòu)域(Wah等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:10564-10569的序列的第384-579位氨基酸，經(jīng)由4個(gè)氨基酸的ZC接頭)融合以形成IPP2-KZFN。實(shí)施例15:使用IPP2-K鋅指核酸酶進(jìn)行的基因校正在Urnov(2005)Nature435(7042):646-51和美國(guó)專利公開(kāi)文本No.20050064474(例如實(shí)施例6-11)所述GFP系統(tǒng)中測(cè)試本文所述IPP2-KZFN促進(jìn)同源重組的能力。簡(jiǎn)言之，依照InvitrogenLipofectamine2000方案，每個(gè)樣品使用2jiLLipofectamine2000,將50ng每種ZFN和500ng無(wú)啟動(dòng)子的GFP供體(Urnov(2005)Nature)轉(zhuǎn)染入500,000個(gè)報(bào)道細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)添加0.2pM終濃度的長(zhǎng)春堿，并在轉(zhuǎn)染后72小時(shí)除去。轉(zhuǎn)染后5天通過(guò)在Guava臺(tái)式FACS分析儀上每次轉(zhuǎn)染測(cè)量40,000個(gè)細(xì)胞來(lái)對(duì)細(xì)胞測(cè)定GFP表達(dá)。結(jié)果顯示于圖69。實(shí)施例16:在玉米HilI細(xì)胞中表達(dá)C3HlZFNA.載體i殳計(jì)構(gòu)建用于在玉米細(xì)胞中表達(dá)ZFN蛋白的質(zhì)粒載體。為了優(yōu)化形成功能性鋅指核酸酶異二聚體所需的2個(gè)不同蛋白質(zhì)的表達(dá)和相對(duì)化學(xué)計(jì)量，采用如下表達(dá)策略，其導(dǎo)致在單個(gè)載體上插入兩種ZFN單體的可讀框，它們由單個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。該策略利用自T7zeyoaa^z'g"a病毒衍生的2A序列(Mattion，N.M.,Harnish,E.C，Crowley,J.C.和Reilly,P.A.(1996)J.Virol.70，8124-8127)、來(lái)自不透明二號(hào)基因(o/a，e-2,cp-2)的玉米核定位信號(hào)(NLS)(Maddaloni，M.,DiFonzo,N.,Hartings,H.,Lazzaroni,N.,Salaminil,F.,Thompson,R.,和MottoM.(1989)NucleicAcidsResearchVol.17(18):7532)、和自玉米遍在蛋白-l基因衍生的啟動(dòng)子(ChristensenA.H.，SharrockR.A.，和QuailP.H.(1992)PlantMolBiol.18(4):675-89)的功能性。設(shè)計(jì)逐步模塊(modular)克隆方案以開(kāi)發(fā)這些表達(dá)載體，用于任何自圖書(shū)館檔案選擇的或從頭合成的給定成對(duì)ZFN編碼基因。首先，修飾pVAX載體(參見(jiàn)例如美國(guó)專利公開(kāi)文本2005-0267061,通過(guò)提及而收錄其公開(kāi)內(nèi)容)以包含圖65小圖A-E所示N端表達(dá)結(jié)構(gòu)域。該改良質(zhì)粒(pVAX-N2A-NLSop2-EGFP-FokMono)(圖65A)的特征包括重新設(shè)計(jì)并合成的、編碼自玉米o(hù);-2衍生的NLS(RKRKESNRESARRSRYRK,SEQIDNO:133)的區(qū)段和重新設(shè)計(jì)并合成的、編碼利用玉米密碼子偏愛(ài)的FokI核酸酶結(jié)構(gòu)域的區(qū)段。另外，在唯一的XhoI位點(diǎn)下游的單個(gè)核香酸插入(C)創(chuàng)建額外的Sacl位點(diǎn)以方^f更克隆。其次，還修飾pVAX載體(參見(jiàn)例如美國(guó)專利公開(kāi)文本2005-0267061)以包含C端表達(dá)結(jié)構(gòu)域。該改良質(zhì)粒(pVAX-C2A-NLSop2-EGFP-FokMono)(圖65B)的特征包括重新設(shè)計(jì)并合成的、編碼自玉米o(hù);-2衍生的NLS(RKRKESNRESARRSRYRK,SEQIDNO:133)的區(qū)段和重新設(shè)計(jì)并合成的、編碼利用玉米密碼子偏愛(ài)的FokI核酸酶結(jié)構(gòu)域的區(qū)段。另外，為了2個(gè)蛋白質(zhì)編碼結(jié)構(gòu)域的隨后連接，在ZFNORF的N端引入來(lái)自T7zo^aaWgm7病毒的2A序列(EGRGSLLTCGDVEENPGP,SEQIDNO:134)。使用限制酶KpnI和BamHI來(lái)產(chǎn)生相容本端，經(jīng)由連接將編碼各個(gè)鋅指蛋白的ORF的基因盒克隆入N2A或C2A載體中。接著，將來(lái)自C2A載體的BglII/XhoI片段經(jīng)由相同的限制性位點(diǎn)插入N2A載體中，產(chǎn)生包含如下盒的中間構(gòu)建體，所述盒包括側(cè)翼有NcoI和SacI限制性位點(diǎn)的2個(gè)ZFN編碼結(jié)構(gòu)域。最后，包含兩個(gè)ZFN基因的NcoI/SacI盒使用那些酶經(jīng)由限制性消化從該中間構(gòu)建體中切出(圖65C)，并連接至質(zhì)粒主鏈pDAB3872中(圖65D)。所得的質(zhì)粒包括ZFN基因加上相關(guān)啟動(dòng)子和終止子序列，加上用于維持質(zhì)粒的選擇標(biāo)志。在最終的構(gòu)建體(它們的一個(gè)例子顯示于圖65E)中，ZFN表達(dá)盒(包括啟動(dòng)子和終止子元件)側(cè)翼有attL位點(diǎn)以方便使用Gateway系統(tǒng)(Invitrogen,Carlsbad,CA)進(jìn)行的操作。將使用該克隆方案生成的每種ZFN構(gòu)建體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a細(xì)胞(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，隨后在合適的選擇下維持。B.DNA4更遞和瞬時(shí)表達(dá)使用無(wú)內(nèi)切核酸酶的Gigaprep試劑盒(Qiagen,Valencia,CA)依照制造商的推薦從2L在加有抗生素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生如圖65E所述構(gòu)建的ZFN表達(dá)載體的質(zhì)粒制備物。使用多種方法將質(zhì)粒DNA直接^:遞至玉米HilI培養(yǎng)細(xì)胞。在一個(gè)例子中，經(jīng)由WhiskersTM對(duì)玉米細(xì)胞進(jìn)行DNA投遞。DNA投遞前大約24小時(shí)，將加有7ml條件化培養(yǎng)基的3mlPCVHiII玉米懸浮細(xì)胞傳代培養(yǎng)至20ml在125mlErlenmeyer燒瓶中的GN6液體培養(yǎng)基(缺乏Gelrite的GN6培養(yǎng)基)中，并在搖瓶機(jī)(125rpm，28°C)上放置24小時(shí)。取出2mLPCV,并添加至12ml在125mlErlenmeyer燒瓶中的GN6S/M滲透培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基、2.0mg/L2,4-D、30g/L蔗糖、45.5g/L山梨醇、45.5g/L甘露醇、100mg/L肌肉-肌醇，pH6.0)。在黑暗中在28。C在中等攪動(dòng)(125rpm)情況下溫育燒瓶達(dá)30-35分鐘。這此期間，通過(guò)將合適體積的GN6S/M液體培養(yǎng)基添加至預(yù)先稱重的無(wú)菌晶須(whisker)來(lái)制備50mg/ml碳化硅晶須(AdvancedCompositeMaterials,Inc.,EurekaSprings,AK)懸浮液。在GN6S/M中溫育后，將每個(gè)燒瓶的內(nèi)容物倒入15mL錐底離心管中。在細(xì)胞沉降后，吸取大約(allbut)lmLGN6S/M液體，并收集在125mL燒瓶中，供未來(lái)使用。以最高速度使預(yù)先濕潤(rùn)的晶須懸浮液渦旋60秒，使用大孔的、過(guò)濾式移液管管尖將160iiL添加至離心管，并添加20嗎DNA。對(duì)該管進(jìn)行"手指渦旋，，("fmgervortexed")，并立即放置在Caulk"Vari-MixH，，牙科汞合金攪拌機(jī)(其被修改成能容納17xl00mm的培養(yǎng)管)中，然后以中等速度攪動(dòng)60秒。攪動(dòng)后，將細(xì)胞、培養(yǎng)基、晶須和DNA的混合物連同18ml添加的GN6液體培養(yǎng)基一起返回Erlenmeyer燒瓶。容許細(xì)胞在搖瓶機(jī)(125RPM,28°C)上在黑暗中恢復(fù)2小時(shí)。使用與室內(nèi)真空管線連接的玻璃細(xì)胞收集器單元(glasscellcollectorunit)將大約5-6mL分散的懸浮液過(guò)濾至Whatman弁4濾紙(5.5cm)上，使得每個(gè)樣品獲得5-6張濾紙。將濾紙放置至60x20mm的GN6培養(yǎng)基平板上，并在28。C在黑暗條件下培養(yǎng)。24、48、或72小時(shí)后，刮下來(lái)自2-5張濾紙的細(xì)胞，收集至管中，放置在干冰上，然后在-80。C冷凍。在DNA投遞的另一個(gè)例子中，使用從儀器制造商的方案改編的微粒轟擊技術(shù)將純化的無(wú)內(nèi)切核酸酶的質(zhì)粒制備物直接投遞至玉米細(xì)胞。用生物射彈PDS-1000/HeTM系統(tǒng)(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)進(jìn)行所有的轟擊。對(duì)于粒子包被，將3mgl.O微米直徑的金顆粒用100%乙醇清洗1次，用無(wú)菌蒸餾水清洗2次，并在硅化Eppendorf管中的50pl水中重懸。將5ng質(zhì)粒DNA、20|li1亞精胺(0.1M)和50jil氯化鈣(2.5M)添加至金懸浮液。將混合物在室溫溫育10分鐘，以10Krpm沉淀10秒，在60|11冷的100%乙醇中重懸，并將8-9)al分配至每個(gè)宏載體(macrocarrier)上。為了制備用于轟擊的細(xì)胞，傳代培養(yǎng)后3天從液體培養(yǎng)物中取出細(xì)胞簇(cellcluster),并在皮氏皿中由加有各0.256M的甘露醇和山梨醇的生長(zhǎng)培養(yǎng)基組成的滲透培養(yǎng)基上放置成直徑為2.5cm的一個(gè)圓。轟擊前將細(xì)胞在滲壓劑中溫育4小時(shí)。在上文所述儀器中發(fā)生轟擊，這通過(guò)在1100psi和27英寸Hg(inofHg)的真空條件下將組織放置在中間的支架上并遵循操作手冊(cè)來(lái)進(jìn)行。在處理后24小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)，收獲經(jīng)轟擊的細(xì)胞簇，在液氮中冷凍，并貯存在-80。C。玉米細(xì)胞中DNA投遞和ZFN瞬時(shí)表達(dá)的另一個(gè)例子牽涉原生質(zhì)體制備物的利用。使用自Mitchell和Petolino(1991)J.Plant.Physiol.137:530-536和Lyznik等(1995)PlantJ.8(2):177-186改良的方法，自HiII玉米細(xì)胞培養(yǎng)物制備原生質(zhì)體。通過(guò)以1000rpm離心5分鐘，在傳代培養(yǎng)后48小時(shí)(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期)收獲懸浮培養(yǎng)物。除去培養(yǎng)基，并在10mlW5培養(yǎng)基(154mMNaCl2;125mMCaCl2-H20;5mMKCl2;5mM葡萄糖;pH5.8)中溫和清洗5ml充實(shí)的PCV。通過(guò)以100rpm離心5分鐘來(lái)收集清洗后的細(xì)胞，隨后在如下酶混合物中溫育，所述酶混合物在25ml經(jīng)過(guò)濾法除菌的K3培養(yǎng)基(2.5gKN03;250mgNH4N03;卯0mgCaCl2(二水合物)；250mgMg2SO4;250mgNH4SO4;150mgNaP04(單堿的)；250mg木糖；10ml硫酸亞鐵/螯合物(chealate)儲(chǔ)液(F318);lmlB5樣i量營(yíng)養(yǎng)物(IOOOX儲(chǔ)液-750mg碘化鉀；250mg鉬酸(鈉鹽)脫水物；25mg氯化鈷；25mg硫酸銅)；10mlK3維生素(IOOX儲(chǔ)液-lg肌肉-肌醇；10mg鹽酸吡。多醇；100mg鹽酸硫胺素；10mg煙酸)；+0.6M甘露醇；pH5.8)中含有3。/o纖維素酶Y-C+0.3。/。果膠溶酶Y23(pectolyaseY23)(KarlanResearchProductsCorp.,Cottonwood,AZ)。在溫和攪動(dòng)(50rpm)情況下在25。C溫育細(xì)胞達(dá)5-6小時(shí)以便消化次生植物細(xì)胞壁。細(xì)胞壁降解后，將酶-細(xì)胞混合物流經(jīng)100微米的細(xì)胞濾網(wǎng)(cellstrainer)過(guò)濾，并用等體積的K3+0.6M甘露醇培養(yǎng)基清洗包含原生質(zhì)體和細(xì)胞碎片的流出液。以800rpm離心原生質(zhì)體達(dá)5分鐘，棄去上清液，并重復(fù)清洗。清洗原生質(zhì)體沉淀物，并在20mlK3+0.6M甘露醇+9%Ficoll400溶液中重懸。將10ml該溶液分配至2個(gè)無(wú)菌塑料管中，并將2mlTM培養(yǎng)基(19.52gMES;36.45g甘露醇；40ml2MCaCl2.H20儲(chǔ)液；pH5.5))溫和地覆蓋在懸浮液上，形成不連續(xù)的梯度。通過(guò)以800rpm離心5分鐘來(lái)將能存活的原生質(zhì)體與不能存活的原生質(zhì)體、細(xì)胞碎片和完整的懸浮細(xì)胞分開(kāi)。用移液管取出在梯度界面形成的不同原生質(zhì)體帶，并用10ml新鮮TM溶液清洗，接著以800rpm離心5分鐘。在lmlTM培養(yǎng)基中重懸所得的原生質(zhì)體沉淀物，并在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器中用25mg/mg熒光素二乙酸酯(FDA)染色來(lái)對(duì)能存活的原生質(zhì)體數(shù)目定量。將原生質(zhì)體溶液調(diào)節(jié)至TM培養(yǎng)基中l(wèi)xl(T個(gè)原生質(zhì)體/ml的終濃度。將大約lxl(^個(gè)原生質(zhì)體(100)ul)轉(zhuǎn)移至裝有10-80iig純化的質(zhì)粒DNA的2mlEppendorf管。逐滴添加100pl40%PEG-3350(SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO)溶液，并溫和地混合懸浮液。將原生質(zhì)體/DNA混合物在室溫溫育30分鐘，接著用lmlGN6生長(zhǎng)培養(yǎng)基逐滴稀釋。將經(jīng)稀釋的原生質(zhì)體在該培養(yǎng)基中在25。C溫育24小時(shí)，隨后收獲，在液氮中冷凍，并貯存在-80。C。實(shí)施例17:體內(nèi)ZFN功能性在本實(shí)施例中ZFN的功能性理解為包拾(但不限于)ZFN在作物物種的細(xì)胞中表達(dá)的能力及ZFN通過(guò)識(shí)別、結(jié)合和切割其期望的靶物來(lái)介導(dǎo)該作物的內(nèi)源基因組中的雙鏈斷裂的能力。還應(yīng)理解的是，在本實(shí)施例中，ZFN的靶物是作物基因組內(nèi)內(nèi)源基因座和構(gòu)造中的基因。為了評(píng)估工程化ZFN是否具有針對(duì)基因組環(huán)境中預(yù)測(cè)靶基因的功能性，開(kāi)發(fā)了基于DNA序列的測(cè)定法。預(yù)測(cè)ZFN誘導(dǎo)的雙鏈DNA斷裂誘導(dǎo)修復(fù)機(jī)制，諸如非同源末端連接(NHEJ)(綜述見(jiàn)Cahill等，(2006)MechanismsFrontBiosci.1(11):1958-76)。NHEJ的一個(gè)結(jié)果是斷裂DNA鏈的一部分會(huì)以不完善的方式被修復(fù)，導(dǎo)致在切割位點(diǎn)處少量的刪除、插入或替代。本領(lǐng)域技術(shù)人A.基于PCR的克隆和測(cè)序在一個(gè)例子中，在轉(zhuǎn)化后24小時(shí)分離表達(dá)ZFN蛋白的玉米HiII培養(yǎng)細(xì)胞，冷凍，并使用Qiagen(Valencia,CA)植物DNeasy提取試劑盒依照制造商的推薦進(jìn)行基因組DNA提取。使用對(duì)靶基因特異的且在預(yù)測(cè)的ZFN切割位點(diǎn)側(cè)翼的寡核香酸引物來(lái)實(shí)施PCR擴(kuò)增。組合使用對(duì)靶定IPP2-K基因旁系同系物特異的正向PCR虧1物(5，-GGAAGCATTATTCCAATTTGATGATAATGG-3，)(SEQIDNO:135)和反向PCR引物(5，-CCCAAGTGTCGAGGTTGTCAATATGTTAC-3，)(SEQIDNO:136)來(lái)在如下條件下擴(kuò)增純化的基因組DNA:25lal反應(yīng)體積，在酶制造商的緩沖液中含有20nggDNA模板、20pmol每種引物、1%DMSO和10個(gè)單位的AccuprimePf聚合酶(Invitrogen,Carlsbad,CA)。具有預(yù)期大小的擴(kuò)增產(chǎn)物源自由95。C-l，，(95。C-30"、61。C-30"、72。C-r)X30，72°C-5，，4°C-保持組成的擴(kuò)增循環(huán)。使用TA克隆試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)將擴(kuò)增片段直接克隆入載體pCR2.1(Invitrogen，Carlsbad,CA)中。用CEQ染料終止物循環(huán)測(cè)序試劑盒(BeckmanCoulter,Fullerton,CA)依照制造商的推薦以96孔形式對(duì)所分離的克隆片段測(cè)序。在該實(shí)馬全中，預(yù)測(cè)ZFN蛋白結(jié)合2個(gè)短的IPP2-K基因特異性序列以產(chǎn)生能切割圖66所示ds-DNA的異二聚體核酸酶。對(duì)來(lái)自多個(gè)克隆的測(cè)序結(jié)果的分析揭示克隆#127包含正好在預(yù)測(cè)的ZFN切割位點(diǎn)處的小刪除，指明NHEJ機(jī)制已經(jīng)在此位點(diǎn)處介導(dǎo)了DNA序列的不完善修復(fù)(圖67)。座處誘導(dǎo)靶向的雙鏈斷裂的能力。B.大規(guī)模平行測(cè)序分析在另一個(gè)例子中，應(yīng)用PCR和大規(guī)模平行高溫測(cè)序(pyrosequencing)方法的組合來(lái)詢問(wèn)(interrogate)表達(dá)靶向此相同序列的不同ZFN蛋白的多個(gè)細(xì)胞樣品的基因組。合成正向PCR引物的三種變體(5，-XXXCACCAAGTTGTATTGCCTTCTCA-3，)(SEQIDNO:137)(其中XXX:GGG、CCC或GGC)和反向PCR引物的三種變體(5，-XXXATAGGCTTGAGCCAAGCAATCTT-3')(SEQIDNO:138)(其中XXX:GCC、CCG或CGG)(IDT，Coralville,IA)。每個(gè)引物5，端的3bp標(biāo)簽充當(dāng)標(biāo)識(shí)符密匙，并指明擴(kuò)增子源自哪個(gè)細(xì)胞樣品。組合^f吏用具有匹配標(biāo)識(shí)符標(biāo)簽(密匙)的引物對(duì)以在如下條件下擴(kuò)增純化的、自玉米細(xì)胞樣品衍生的基因組DNA:50}11反應(yīng)體積，在酶制造商的緩沖液中含有40nggDNA模板、20pmol每種引物、1%DMSO和10個(gè)單位的AccuprimePf聚合酶(Invitrogen,Carlsbad，CA)。具有預(yù)期大小的擴(kuò)增產(chǎn)物源自由95。C-1',(95。C-30"、61。C-30"、72。C-1,)X30，4。C-保持組成的擴(kuò)增循環(huán)，并使用MinElutePCR純化試劑盒(Qiagen,Valencia,CA)依照制造商的推薦來(lái)純化。由454LifeSciences(B腦ford,CT)如(Margulies等(2005)Nature437:376-380)中所述對(duì)PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行大規(guī)模平行高溫測(cè)序反應(yīng)(也稱為454測(cè)序)。通過(guò)鑒定包含DNA分子內(nèi)預(yù)期大小和位置的刪除的序列讀出來(lái)實(shí)施454測(cè)序結(jié)果的分析。這些分析的結(jié)果指明在這些ZFN的預(yù)期切割位點(diǎn)處存在多種小的刪除，如圖68中所示的。這些刪除精確地定位于ZFN靶位點(diǎn)，并指明在基因組中產(chǎn)生由ZFN所誘導(dǎo)的雙鏈斷裂，隨后通過(guò)NHEJ進(jìn)行修復(fù)。這些結(jié)果進(jìn)一步證雙鏈斷裂的能力。實(shí)施例18:用于靶向整合的供體DNA設(shè)計(jì)在本實(shí)施例中，供體DNA理解為包括被投遞至植物細(xì)胞中并摻入核基因組中的雙鏈DNA分子。該摻入發(fā)生的機(jī)制可以是經(jīng)由核DNA中雙鏈斷裂位點(diǎn)處的不依賴同源性的非同源末端連接(NHEJ;綜述見(jiàn)Cahill等，(2006)MechanismsFrontBiosci.1:1958-76)或者另一種相似機(jī)制。供體DNA向基因組中的此類NHEJ驅(qū)動(dòng)的、連接樣摻入稱為隨機(jī)整合，因?yàn)楣wDNA的整合位置主要由雙鏈DNA斷裂的存在決定。在該機(jī)制中，供體DNA向基因組中的整合不依賴于基因組中斷裂位點(diǎn)處的核苷酸序列或者供體自身的核苷酸序列。因此，隨機(jī)整合過(guò)程中，基因組中摻入供體DNA的"地址"不是基于供體DNA序列規(guī)定的或預(yù)測(cè)的。隨機(jī)整合是標(biāo)準(zhǔn)植物轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)生供體DNA基因轉(zhuǎn)移的主要機(jī)制，所述標(biāo)準(zhǔn)植物轉(zhuǎn)化經(jīng)由土壤桿菌介導(dǎo)的或生物射彈介導(dǎo)的DNA向活植物細(xì)胞中的投遞實(shí)現(xiàn)。與隨機(jī)整合相反，還可經(jīng)由靶向整合在基因組中摻入供體DNA。靶向整合理解為經(jīng)由同源性依賴性機(jī)制，諸如同源性依賴性單鏈退火或同源重組(綜述見(jiàn)vandenBosch等(2002)BiolChem.383(6):873-892)在雙鏈斷裂位點(diǎn)(位置)發(fā)生。在同源性依賴性DNA斷裂修復(fù)的情況中，可在此位點(diǎn)處摻入包含與斷裂位點(diǎn)處的DNA具有同一性或相似性的核苷酸序列的供體DNA。因此，供體DNA整合至基因組中的"地址，'取決于基因組和供體DNA分子之間的核苷酸序列同一性或序列相似性。在植物系統(tǒng)中，已知DNA中雙鏈斷裂的修復(fù)利用NHEJ和同源性依賴性途徑兩者(綜述見(jiàn)Puchta(2005)J.Exp.Bot.56:1-14)。在本實(shí)施例中，我們描述了經(jīng)由在序列特異性ZFN蛋白誘導(dǎo)的雙鏈斷裂位點(diǎn)處的靶向整合而要被整合至基因組中的供體DNA分子的設(shè)計(jì)和構(gòu)建。不同ZFN蛋白可在靶基因序列中的不同核苷酸處誘導(dǎo)雙鏈斷裂；所誘導(dǎo)的雙鏈斷裂的特定位點(diǎn)稱為位置。如實(shí)施例13中所述，我們已經(jīng)表征了來(lái)自玉米的靶基因IPP2K的核苷酸序列。隨后，我們?cè)O(shè)計(jì)了結(jié)合該靶基因特定堿基的ZFN蛋白(實(shí)施例14),并證實(shí)其在兩種異源系統(tǒng)中的靶基因內(nèi)的該序列處和針對(duì)玉米細(xì)胞中內(nèi)源基因的結(jié)合/切割活性(實(shí)施例15-17)。這里，我們描述了設(shè)計(jì)用于經(jīng)由靶向整合而在IPP2K基因中ZFN介導(dǎo)的雙鏈斷裂位置摻入玉米基因組中的各種供體分子的構(gòu)建。對(duì)于核苷酸序列已知且預(yù)測(cè)該序列包含雙鏈斷裂的任何基因組中的任何位置，本領(lǐng)域技術(shù)人員可構(gòu)建設(shè)計(jì)用于經(jīng)由同源性驅(qū)動(dòng)的靶向整合而被摻入ZFN誘導(dǎo)的雙鏈斷裂中的供體DNA分子。在本文所述的一個(gè)實(shí)施方案中，供體DNA分子包含以與靶定位置的耙基因IPP2K的核苦酸序列相同的核苷酸序列區(qū)段為界的自主除草劑耐受基因表達(dá)盒。奉該實(shí)施方案中，自主除草劑耐受盒理解為包括完整啟動(dòng)子-轉(zhuǎn)錄單位(PTU)，其包含啟動(dòng)子、除草劑耐受基因和已知在植物細(xì)胞中為功能性的終止子序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可選^^任何啟動(dòng)子、基因和終止子組合來(lái)構(gòu)成自主PTU。該質(zhì)粒構(gòu)建體上還包括的是與玉米中所示位置的靶基因(IPP2K)具有序列同一性的DNA片段。這些片段充當(dāng)供體DNA的"同源性側(cè)翼"，并經(jīng)由靶向整合在指定位置將該供體直接摻入靶基因中。在PTU的上游和下游以相對(duì)于PTU的正確5，-3，取向放置同源性側(cè)翼。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解供體DNA構(gòu)建中具有不同大小和取向的同源性側(cè)翼。在本文所述的另一個(gè)實(shí)施方案中，供體DNA分子包括如下質(zhì)粒構(gòu)建，其包含以與耙位置的IPP2K核普酸序列相同的核苷酸序列區(qū)段為界的非自主除草劑耐受基因表達(dá)盒。在該實(shí)施方案中，非自主除草劑耐受盒理解為包括缺乏功能性啟動(dòng)子的不完整啟動(dòng)子-轉(zhuǎn)錄單位(PTU)。非自主PTU確實(shí)包含除草劑耐受基因和已知在植物細(xì)胞中為功能性的終止子序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇任何基因和終止子組合來(lái)構(gòu)成非自主PTU。在非自主供體的該例子中，除草劑耐受基因的表達(dá)依賴于供體區(qū)段向與功能性啟動(dòng)子接近的基因組位置中的摻入，所述功能性啟動(dòng)子可驅(qū)動(dòng)該基因的表達(dá)。可了解相對(duì)罕見(jiàn)的如下情形，其中供體會(huì)經(jīng)由隨機(jī)整合而摻入其中存在偶然發(fā)現(xiàn)的啟動(dòng)子且該啟動(dòng)子可用于驅(qū)動(dòng)除草劑耐受基因表達(dá)的遺傳基因座中?；蛘撸诠wDNA構(gòu)建內(nèi)與玉米中特定位置的靶基因具有序列同一性的、合適長(zhǎng)度的DNA片段的同源性側(cè)翼的存在，可發(fā)生供體DNA向特定位置的靶基因中的精確靶向整合(如關(guān)于自主供體所述的)，因此使用所述靶基因的內(nèi)源啟動(dòng)子。在該實(shí)施方案中，在PTU的上游和下游以相對(duì)于PTU的正確5，-3，取向放置同源性側(cè)翼。本領(lǐng)域技術(shù)人員連接供體DNA構(gòu)建中具有不同大小和取向的同源性側(cè)翼。在本文所述的兩個(gè)實(shí)施方案(自主的和非自主的供體設(shè)計(jì))中，質(zhì)粒構(gòu)建典型地包含實(shí)現(xiàn)除草劑耐受基因克隆、表達(dá)、和隨后分析的別的元件。此類元件包括細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)、改造的限制性位點(diǎn)等，并且在下文有記載。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解構(gòu)成供體DNA分子的不同元件的利用。A.細(xì)菌菌抹和培養(yǎng)條件使用Luria-Bertani肉湯(LB:10g/L細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨，10g/LNaCl、5g/L細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物)、LB瓊脂(加有15g/L細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂的LB肉湯)、或Terrific肉湯(TB:12g/L細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨，24g/L細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物、0.4%v/v甘油，17mMKH2P04、72mMK2HP04)在37。C培養(yǎng)大腸桿菌菌株(OneShotTop10化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞；MAXEfficiencyDH5ciTm化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)達(dá)16小時(shí)。以200rpm搖動(dòng)液體培養(yǎng)物。在需要時(shí)將氯霉素(5(Vg/ml)、卡那霉素(50pg/ml)、或氨芐青霉素(100^ig/ml)添加至培養(yǎng)基。本研究中使用的所有抗生素、培養(yǎng)基和緩沖試劑均購(gòu)自Sigma-AldrichCorporation(St.Louis,MO)或DifcoLaboratories(Detroit,MI)。B.質(zhì)粒主鏈位置-l將包含IPP2K位置-1的同源性側(cè)翼的質(zhì)粒主鏈改造成容許將任何供體DNA序列整合至IPP2K^因的相應(yīng)靶位點(diǎn)中。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解使用各種克隆位點(diǎn)、模塊設(shè)計(jì)元件和與感興趣基因組內(nèi)的任何靶序列同源的序列的質(zhì)粒主鏈。這里例示的質(zhì)粒主鏈由基礎(chǔ)質(zhì)粒載體pBCSK(-)噬菌粒(3.4Kbp)(Stratagene,LaJolla,CA)開(kāi)始。使用下文所述4步合成來(lái)構(gòu)建位置-l質(zhì)粒主鏈。在步驟#1中，制備基礎(chǔ)質(zhì)粒。在37。C使用10個(gè)單位5^el和10個(gè)單位A^1(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)P艮制性內(nèi)切核酸酶達(dá)l小時(shí)來(lái)使3pgpBCSK(-)線性化。在補(bǔ)充有0.5。/。溴化乙錠(Sigma-AldrichCorporation,St.Louis,MO)的1.00/0TAE(0.04MTris-乙酸鹽，0.002MEDTA)瓊脂糖凝膠中在100V對(duì)限制性DNA電泳1小時(shí)。用紫外線顯現(xiàn)DNA片段，并通過(guò)與lKbpDNA梯(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)比較來(lái)估計(jì)片段大小。對(duì)3.4Kbp經(jīng)SpeI消化的亞克隆載體pBCSK(-)進(jìn)行凝膠切割，并使用QIA快速凝膠提取試劑盒(QIAqukkGelExtractionKit,QIAGENInc.,Valencia,CA)依照制造商的指導(dǎo)進(jìn)行純化。在步驟#2中，分離來(lái)自IPP2K位置-1的5，和3，同源性側(cè)翼。由IntegratedDNATechnologies,Inc.(Coralville，IA)在標(biāo)準(zhǔn)脫鹽條件下合成下列寡核苦酸引物，并用水稀釋至0.125iag/ul的濃度(SEQIDNO:143)5'-ACTAGTGATATGGCCCCACAGGAGTTGCTCATGACTTG-3,(SEQIDNO:144)IDNO:145)5，-GTCGACCTTGATGCTACCCATTGGGCTGTTGT-3，(SEQIDNO:146)。4吏用由丁aKaRaBiotechnologyInc.,Seta3-4-1,Otsu,Shiga,520-2193,Japan提供的試劑實(shí)施PCR擴(kuò)增反應(yīng)，其組成如下5|il10XLAPCRtm緩沖液II(Mg2+)、20ng雙鏈gDNA模板(玉米HiII)、10pmol正向寡核苷酸引物、lOpmol反向寡核苷酸引物、8(ildNTP混合物(各2.5mM)、33.5|ilH20、0.5|al(2.5個(gè)單位)TaKaRaLATaqTMDNA聚合酶、1滴礦物油。使用Perkin-ElmerCetus48樣品DNA熱循環(huán)儀(Norwalk，CT)在如下循環(huán)條件下進(jìn)行PCR^應(yīng)94°C4分鐘/l個(gè)循環(huán)；98。C20秒，65°Cl分鐘，68。Cl分鐘/30個(gè)循環(huán);72°C，5分鐘/l個(gè)循環(huán)；4。C/保持。在補(bǔ)充有0.5。/o溴化乙錠的1.0。/。TAE瓊脂糖凝膠中在100V對(duì)15pl每個(gè)PCR^應(yīng)電泳H、時(shí)。用紫外線顯現(xiàn)擴(kuò)增片段，并通過(guò)與lKbpDNA梯比較來(lái)估計(jì)片段大小。根據(jù)0.821Kbp(5'同源性側(cè)翼)或0.821Kbp(3，同源性側(cè)翼)DNA片段的存在來(lái)判斷預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物。對(duì)這些片段進(jìn)行凝膠切割，并使用QIA快速凝膠提取試劑盒(QIAGENInc.,Valencia,CA)依照制造商的指導(dǎo)進(jìn)行純化。然后使用TOPOTACloning試劑盒(含pCR⑧2.1載體)和OneShotTOP10化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)依照制造商的方案將純化的片段克隆入pCR2.1質(zhì)粒中。將個(gè)別菌落接種至14ml含2ml補(bǔ)充有50)^l/ml卡那霉素的TB的Falcon管(Becton-Dickinson,FranklinLakes,NJ)中，并在以200rpm搖動(dòng)的情況下在37。C溫育16小時(shí)。溫育后，將1.5ml細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.7mlCostar微量離心管(FisherScientific,Pittsburgh,PA)中，并以16,000xg沉淀l分鐘。除去上清液，并使用NucleoSpin⑧質(zhì)4立i式劑盒(BDBiosciences/Clontech/Macherey-Nagel,PaloAlto,CA)如上文所述那樣分離質(zhì)粒DNA。用10個(gè)單位S/eI和7VofI消化自5，同源性側(cè)翼克隆質(zhì)粒分離的3pg質(zhì)粒。用10個(gè)單位S;eI和20個(gè)單位Sa/I(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)消化3，同源性側(cè)翼克隆質(zhì)粒。將所有的質(zhì)粒消化物在37。C溫育1小時(shí)。在補(bǔ)充有0.5%溴化乙錠的1.0%TAE瓊脂糖凝膠中在100V對(duì)限制性DNA電泳1小時(shí)。用紫外線顯現(xiàn)片^R，并通過(guò)與lKbpDNA梯比較來(lái)估計(jì)片段大小。根據(jù)3.9KbppCR⑧2.1載體外的0.821Kbp(5，同源性側(cè)翼)或0.821Kbp(3'同源性側(cè)翼)的插入DNA片段的存在來(lái)判斷預(yù)期的質(zhì)?？寺?。使用CEQTMDTCS-快速開(kāi)始試劑盒(CEQTmDTCS-QuickStartKit,Beckman-Coulter,PaloAlto,CA)如制造商所述的那樣實(shí)施質(zhì)?？寺〉碾p鏈測(cè)序反應(yīng)。使用PerformaDTR凝月交過(guò)濾筒(PerformaDTRGelFiltrationCartridges,EdgeBioSystems，Gaithersburg,MD)如制造商的方案所述的那樣純化反應(yīng)。在Beckman-CoulterCEQ2000XLDNA分析系統(tǒng)上分析序列反應(yīng)，并寸吏用SequencherTM4.1.4片反(GeneCodesCorporation,AnnArbor,MI)來(lái)進(jìn)行核苷酸表征。在圖87中顯示了與自IPP2K衍生的位置-15'同源性側(cè)翼對(duì)應(yīng)的0.821Kbp片段的序列(SEQIDNO:171)。在圖88中顯示了與自IPP2K衍生的位置-13'同源性側(cè)翼對(duì)應(yīng)的0.821Kbp片段的序列(SEQIDNO:172)。在步驟#3中，將位置-15，同源性側(cè)翼連接至基礎(chǔ)質(zhì)粒中。對(duì)與包含正確位置-15'同源性側(cè)翼序列的克隆對(duì)應(yīng)的限制性片段進(jìn)行凝膠切割，并使用QIA快速凝膠提取試劑盒(QIAGENInc.,Valencia,CA)依照制造商的指導(dǎo)進(jìn)行纟屯化。然后使用500個(gè)單位T4DNA連接酶(IrwitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)將與位置-15，同源性側(cè)翼對(duì)應(yīng)的片段(0.821Kbp)以1:5載體:插入物比例在20pl反應(yīng)體積中在16。C水浴中溫育16小時(shí)的條件下連接至用^e1/MfI消化的純化的基礎(chǔ)質(zhì)粒(步驟#1)。隨后將5pl連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌OneShotTop10化學(xué)感受態(tài)細(xì)月包(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)中，并在制造商所述的選擇條件下鋪板。將個(gè)別菌落接種至14ml含2ml補(bǔ)充有50pl/ml卡那霉素的TB的Falcon管(Becton-Dickinson,FranklinLakes,NJ)中，并在以200rpm搖動(dòng)的情況下在37。C溫育16小時(shí)。溫育后，將1.5ml細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.7mlCostar微量離心管(FisherScientific,Pittsburgh,PA)中，并以16,000xg沉淀1分鐘。除去上清液，并使用CA)如上文所述那樣分離質(zhì)粒DNA。用10個(gè)單位SpeI和7VWI(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)消化3iag分離的質(zhì)粒DNA,并在37。C溫育1小時(shí)。在補(bǔ)充有0.5%溴化乙錠的1.0%TAE瓊脂糖凝膠中在100V對(duì)限制性DNA電泳1小時(shí)。用紫外線顯現(xiàn)片段，并通過(guò)與lKbpDNA梯比較來(lái)估計(jì)片段大小。根據(jù)3.4Kbp基礎(chǔ)質(zhì)粒外的0.821Kbp插入DNA片段(5'同源性側(cè)翼)的存在來(lái)判斷預(yù)期的質(zhì)?？寺　Ｔ诓襟E#4中，將位置-13，同源性側(cè)翼連接至步驟#3的產(chǎn)物中。在37。C使用10個(gè)單位&e1和20個(gè)單位&/1(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA)限制性內(nèi)切核酸酶達(dá)l小時(shí)來(lái)使3pg步驟弁3中所述改造產(chǎn)物線性化。在補(bǔ)充有0.5%溴化乙錠(Sigma-AldrichCorporation,St.Louis,MO)的1.00/。TAE(0.04MTris-乙酸鹽，0.002MEDTA)瓊脂糖凝膠中在100V對(duì)限制性DNA電泳1小時(shí)。用紫外線顯現(xiàn)DNA片段，并通過(guò)與1KbpDNA梯(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)比較來(lái)估計(jì)片段大小。對(duì)約4.2Kbp經(jīng)5^eI消化的來(lái)自步驟#3的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠切割，并使用QIA快速凝膠提取試劑盒(QIAGENInc.，Valencia,CA)依照制造商的指導(dǎo)進(jìn)行純化。隨后使用1:5的載體:插入物比例和500個(gè)單位T4DNA連接酶(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)將步驟存2中生成的3，同源性側(cè)翼供體的分離片段(0.821Kbp)與如上文所述用&eI消化并純化的步驟#3產(chǎn)物在20|^1連接反應(yīng)中混合。將連接反應(yīng)在16。C水浴中溫育16小時(shí)。連接之后，將5pl連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化至MAXE伍ciency⑧DH5oiTm化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)中，這依照制造商的推薦進(jìn)行。將個(gè)別菌落接種至14ml含2ml補(bǔ)充有50jil/ml氯霉素的TB的Falcon管(Becton-Dickinson,FranklinLakes,NJ)中。將培養(yǎng)物在200rpm搖動(dòng)的情況下在37。C溫育16小時(shí)。溫育后，將1.5ml細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.7mlCostaH效量離心管(FisherScientific,Pittsburgh,PA)中，并以16,000xg沉淀l分鐘。除去上清液，并使用NucleoSpin⑧質(zhì)粒試劑盒(BDBiosciences/Clontech/Macherey-Nagel，PaloAlto，CA)如上文所述那才羊分離質(zhì)粒DNA。用10個(gè)單位&/I和A^fI(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)消化3)ig分離的質(zhì)粒，并在37。C溫育1小時(shí)。在補(bǔ)充有0.5。/。溴化乙錠的1.0。/。TAE瓊脂糖凝膠中在100V對(duì)限制性DNA電泳1小時(shí)。用紫外線顯現(xiàn)片段，并通過(guò)與1KbpDNA梯比較來(lái)估計(jì)片段大小。根據(jù)1.64Kbp(插入物)和3.33Kbp(基礎(chǔ)質(zhì)粒)的兩種DNA片段的存在來(lái)判斷預(yù)期克隆。所得的質(zhì)粒命名為pDAB7471(圖70)。C.質(zhì)粒主鏈位置-2將包含IPP2K位置-2的同源性側(cè)翼的質(zhì)粒主鏈改造成容許將任何供體DNA序列整合至IPP2K基因的相應(yīng)靶位點(diǎn)中。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解使用各種克隆位點(diǎn)、模塊設(shè)計(jì)元件和與感興趣基因組內(nèi)的任何靶序列同源的序列的質(zhì)粒主鏈。這里例示的質(zhì)粒主鏈由基礎(chǔ)質(zhì)粒載體pBCSK(-)噬菌粒(3.4Kbp)(Stratagene,LaJolla,CA)開(kāi)始。使用下文所述4步合成來(lái)構(gòu)建位置-2質(zhì)粒主鏈。在步驟#1中，制備基礎(chǔ)質(zhì)粒。在37。C使用10個(gè)單位5^el和10個(gè)單位Mn(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)限制性內(nèi)切核酸酶達(dá)l小時(shí)來(lái)使3pgpBCSK(-)線性化。在補(bǔ)充有0.5。/。溴化乙錠(Sigma-AldrichCorporation,St.Louis,MO)的1.00/。TAE(0.04MTris-乙酸鹽，0.002MEDTA)瓊脂糖凝膠中在100V對(duì)限制性DNA電泳1小時(shí)。用紫外線顯現(xiàn)DNA片段，并通過(guò)與lKbpDNA梯(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad，CA)比較來(lái)估計(jì)片段大小。對(duì)3.4Kbp經(jīng)&eWofI消化的亞克隆載體pBCSK(-)進(jìn)行凝膠切割，并使用QIA快速凝膠提取試劑盒(QIAquickGelExtractionKit,QIAGENInc.,Valencia,CA)依照制造商的指導(dǎo)進(jìn)行純化。在步驟#2中，分離來(lái)自IPP2K位置-2的5，和3，同源性側(cè)翼。由IntegratedDNATechnologies,Inc.(Coralville,IA)在標(biāo)準(zhǔn)脫鹽條件下合成下列寡核苷酸引物，并用水稀釋至0.125)ig/ul的濃度5，-GCGGCCGCTAGATAGCAGATGCAGATTGCT-3，(SEQIDNO:147)5，-ACTAGTATTGGCACCCAGGTGTTGGCTCA-3，(SEQIDNO:148)5，-ACTAGTCATGTCGATGGTGGGGTATGGTTCAGATTCAG醫(yī)3'(SEQIDNO:149)5,-GTCGACGTACAATGATTTCAGGTTACGGCCTCAGGAC-3，(SEQIDNO:150)。4吏用由TaKaRaBiotechnologyInc.，Seta3-4-1，Otsu,Shiga,520-2193,Japan提供的試劑實(shí)施PCR擴(kuò)增反應(yīng)，其組成如下5pl10XLAPCRtm緩沖液II(Mg2+)、20ng雙鏈gDNA模板(玉米HiII)、10pmol正向寡核苦酸引物、lOpmol反向寡核苷酸引物、8)^1dNTP混合物(各2.5mM)、33.5|alH20、0.5^1(2.5個(gè)單位)TaKaRaLATaqTMDNA聚合酶、1滴礦物油。使用Perkin-ElmerCetus48樣品DNA熱循環(huán)儀(Norwalk,CT)在如下循環(huán)條件下實(shí)施PCR^應(yīng)94。C4分鐘/l個(gè)循環(huán)；98。C20秒，55。Cl分鐘，68°Cl分鐘/30個(gè)循環(huán);72°C5分鐘/1個(gè)循環(huán)；4。C/保持。在補(bǔ)充有0.5。/。溴化乙錠的1.0。/。TAE瓊脂糖凝膠中在100V對(duì)15pl每個(gè)PCR反應(yīng)電泳l小時(shí)。用紫外線顯現(xiàn)擴(kuò)增片段，并通過(guò)與lKbpDNA梯比較來(lái)估計(jì)片段大小。根據(jù)0.855Kbp(5，同源性側(cè)翼)或0.845Kbp(3，同源性側(cè)翼)DNA片段的存在來(lái)判斷預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物。對(duì)這些片段進(jìn)行凝膠切割，并使用QIA快速凝膠提取試劑盒(QIAGENInc.,Valencia,CA)依照制造商的指導(dǎo)進(jìn)行純化。然后使用TOPOTACloning⑧試劑盒(含pCR⑧2.1載體)和OneShotTOP10化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)依照制造商的方案將純化的片段克隆入pCR2.l質(zhì)粒中。將個(gè)別菌落接種至14ml含2ml補(bǔ)充有50^il/ml卡那霉素的TB的Falcon管(Becton-Dickinson，F(xiàn)ranklinLakes,NJ)中，并在以200rpm搖動(dòng)的情況下在37。C溫育16小時(shí)。溫育后，將1.5ml細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.7mlCostar微量離心管(FisherScientific,Pittsburgh,PA)中，并以16,000xg沉淀l分鐘。除去上清液，并使用NucleoSpin⑧質(zhì)斗立i式劑盒(BDBiosciences/Clontech/Macherey-Nagel，PaloAlto,CA)如上文所述那樣分離質(zhì)粒DNA。用10個(gè)單位S;eI和MfI消化自5，同源性側(cè)翼克隆質(zhì)粒分離的3jig質(zhì)粒。用10個(gè)單位SpeI和20個(gè)單位&7/I(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)消化3，同源性側(cè)翼克隆質(zhì)粒(threeprime-homologyflankcloneplasmid)。將所有的質(zhì)粒消化物在37。C溫育l小時(shí)。在補(bǔ)充有0.5%溴化乙錠的1.0%TAE瓊脂糖凝膠中在100V對(duì)限制性DNA電泳1小時(shí)。用紫外線顯現(xiàn)片段，并通過(guò)與1KbpDNA梯比較來(lái)估計(jì)片段大小。根據(jù)3.9KbppCR⑧2.1載體外的0.855Kbp(5'同源性側(cè)翼)或0.845Kbp(3，同源性側(cè)翼)的插入DNA片段的存在來(lái)判斷預(yù)期的質(zhì)?？寺?。使用CEQTMDTCS-快速開(kāi)始試劑盒(CEQTMDTCS-QuickStartKit,Beckman-Coulter,PaloAlto,CA)如制造商所述的那樣實(shí)施質(zhì)粒克隆的雙鏈測(cè)序反應(yīng)。使用PerformaDTR凝膠過(guò)濾筒(PerformaDTRGelFiltrationCartridges,EdgeBioSystems,Gaithersburg,MD)如制造商的方案所述的那樣純化反應(yīng)。在Beckman-CoulterCEQTM2000XLDNA分析系統(tǒng)上分析序列反應(yīng)，并使用Sequencher4.1.4版(GeneCodesCorporation,AnnArbor,MI)來(lái)進(jìn)行核苷酸表征。在圖89中顯示了與自IPP2K衍生的位置-25'同源性側(cè)翼對(duì)應(yīng)的0.855Kbp片段的序列(SEQIDNO:139)。在圖90中顯示了與自IPP2K衍生的位置-23，同源性側(cè)翼對(duì)應(yīng)的0.845Kbp片段的序列(SEQIDNO:140)。在步驟弁3中，將位置-15'同源性側(cè)翼連接至基礎(chǔ)質(zhì)粒中。對(duì)與包含正確位置-25'同源性側(cè)翼序列的克隆對(duì)應(yīng)的限制性片段進(jìn)行凝膠切割，并使用QIA快速凝膠提取試劑盒(QIAGENInc.,Valencia,CA)依照制造商的指導(dǎo)進(jìn)行纟屯化。然后使用500個(gè)單位T4DNA連接酶(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad，CA)將與位置-15，同源性側(cè)翼對(duì)應(yīng)的片段(0.855Kbp)以l:5載體:插入物比例在20pl反應(yīng)體積中在16。C水浴中溫育16小時(shí)的條件下連接至用SpeI消化的純化的基礎(chǔ)質(zhì)粒(步驟#1)。隨后將5ial連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌OneShotTopIO化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)中，并在制造商所述的選擇條件下鋪板。將個(gè)別菌落接種至14ml含2ml補(bǔ)充有50pl/ml卡那霉素的TB的Falcon管(Becton-Dickinson,FranklinLakes,NJ)中，并在以200rpm搖動(dòng)的情況下在37。C溫育16小時(shí)。溫育后，將1.5ml細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.7mlCostar微量離心管(FisherScientific,Pittsburgh,PA)中，并以16,000xg沉淀l分鐘。除去上清液，并使用NucleoSpin⑧質(zhì)4立i式劑盒(BDBiosciences/Clontech/Macherey-Nagel,PaloAlto,CA)如上文所述那樣分離質(zhì)粒DNA。用10個(gè)單位S;eI和MfI(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA)消化3嗎分離的質(zhì)粒DNA，并在37。C溫育1小時(shí)。在補(bǔ)充有0.5°/。溴化乙錠的1.0%TAE瓊脂糖凝膠中在100V對(duì)限制性DNA電泳1小時(shí)。用紫外線顯現(xiàn)片段，并通過(guò)與lKbpDNA梯比較來(lái)估計(jì)片段大小。根據(jù)3.4Kbp基礎(chǔ)質(zhì)粒外的0.855Kbp插入DNA片段(5'同源性側(cè)翼)的存在來(lái)判斷預(yù)期的質(zhì)粒克隆。在步驟#4中，將位置-23，同源性側(cè)翼連接至步驟#3的產(chǎn)物中。在37。C使用10個(gè)單位S。eI和20個(gè)單位fe/1(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)限制性內(nèi)切核酸酶達(dá)l小時(shí)來(lái)使3iig步驟弁3中所述改造產(chǎn)物線性化。在補(bǔ)充有0.5°/。溴化乙錠(Sigma陽(yáng)AldrichCorporation,St.Louis,MO)的1.00/。TAE(0.04MTris-乙酸鹽，0.002MEDTA)瓊脂糖凝膠中在100V對(duì)限制性DNA電泳1小時(shí)。用紫外線顯現(xiàn)DNA片段，并通過(guò)與1KbpDNA梯(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad，CA)比較來(lái)估計(jì)片段大小。對(duì)4.25Kbp經(jīng)S/7eI消化的來(lái)自步驟#3的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠切割，并使用QIA快速凝膠提取試劑盒(QIAGENInc.,Valencia,CA)依照制造商的指導(dǎo)進(jìn)行純化。隨后使用1:5的載體:插入物比例和500個(gè)單位T4DNA連接酶(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)將步驟弁2中生成的3，同源性側(cè)翼供體的分離片段(0.845Kbp)與如上文所述用5^I消化并純化的步驟弁3產(chǎn)物在20jil連接反應(yīng)中混合。將連接反應(yīng)在16。C水浴中溫育16小時(shí)。連接之后，將5(il連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化至MAXEfficiencyDH5(xTm化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad，CA)中，這依照制造商的推薦進(jìn)行。將個(gè)別菌落接種至14ml含2ml補(bǔ)充有50)^l/ml氯霉素的TB的Falcon管(Becton-Dickinson，F(xiàn)ranklinLakes,NJ)中。將培養(yǎng)物在200rpm搖動(dòng)的情況下在37。C溫育16小時(shí)。溫育后，將1.5ml細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.7mlCostar微量離心管(FisherScientific,Pittsburgh,PA)中，并以16,000xg沈淀1分鐘。除去上清液，并使用NucleoSpin⑧質(zhì)粒試劑盒(BDBiosciences/Clontech/Macherey-Nagel,PaloAlto,CA)如上文所述那樣分離質(zhì)粒DNA。用10個(gè)單位^/I和MfI(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)消化3嗎分離的質(zhì)粒，并在37。C溫育1小時(shí)。在補(bǔ)充有0.5。/。溴化乙錠的1.0。/。TAE瓊脂糖凝膠中在100V對(duì)限制性DNA電泳1小時(shí)。用紫外線顯現(xiàn)片段，并通過(guò)與1KbpDNA梯比較來(lái)估計(jì)片段大小。根據(jù)約1.7Kbp(插入物)和3.33Kbp(基礎(chǔ)質(zhì)粒)的兩種DNA片段的存在來(lái)判斷預(yù)期克隆。所得的質(zhì)粒命名為pDAB7451(圖71)。D.自主除草劑耐受基因表達(dá)盒構(gòu)建構(gòu)建包含完整啟動(dòng)子-轉(zhuǎn)錄單位(PTU)的自主除草劑耐受基因表達(dá)盒(圖72)，所述完整啟動(dòng)子-轉(zhuǎn)錄單位(PTU)包含啟動(dòng)子、除草劑耐受基因、和聚腺苷酸化(聚腺苷酸)終止序列。在該實(shí)施方案中，啟動(dòng)子序列衍生自稻(O.sa"va)肌動(dòng)蛋白l[McElroy等(PlantCell2,163-171;1990);GenBank登錄號(hào)S44221和GenBank登錄號(hào)X63830]。除草劑耐受基因包含PAT(膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶)基因，其賦予對(duì)除草劑Bialaphos的抗性(最初自綠色產(chǎn)色鏈霉菌Wohlleben等Gene70,25-37;1988)的修飾型式)。對(duì)M22827的最長(zhǎng)可讀框的最初序列的修飾是實(shí)質(zhì)性的，并包括改變密碼子利用樣式以優(yōu)化植物中的表達(dá)。除用曱硫氨酸替換纈氨酸作為第一個(gè)編碼氨基酸，并添加丙氨酸作為第二個(gè)編碼氨基酸之外，自pDAB3014的PAT可讀框編碼的蛋白質(zhì)與登錄號(hào)M22827的最長(zhǎng)可讀框編碼的蛋白質(zhì)相同。以GenBank登錄號(hào)I43995找到PAT的再建(rebulit)型式。終止子序列4汙生自玉蜀黍(Z.L.)脂肪酶[GenBank登錄號(hào)L35913的玉米脂肪酶cDNA克隆，只是用pDAB3014中第2468位G替換L35913第1093位C。該玉米序列為PAT基因包含3，非翻譯區(qū)/轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)]。由IntegratedDNATechnologies,Inc.(Coralville,IA)在標(biāo)準(zhǔn)脫鹽條件下合成下列寡核苷酸引物，并用水稀釋至0.125pg/jil濃度5，-ACTAGTTAACTGACCTCACTCGAGGTCATTCATATGCTTGA-3'(SEQIDNO:151)5，-ACTAGTGTGAATTCAGCACTTAAAGATCT匿3，(SEQIDNO:152)。寸吏用由TaKaRaBiotechnologyInc.,Seta3-4-1,Otsu，Shiga,520-2193，Japan提供的試劑實(shí)施PCR擴(kuò)增反應(yīng)，其組成如下5|al10XLAPCRJM緩沖液II(Mg2+)、20ng雙鏈模板[pDAB3014質(zhì)粒DNA]、10pmol正向寡核苷酸引物、10pmol反向寡核苷酸引物、8pldNTP混合物(各2.5mM)、33.5plH20、0.5pl(2.5個(gè)單位)TaKaRaLATaqDNA聚合酶、1滴礦物油。使用Perkin-ElmerCetus48樣品DNA熱循環(huán)儀(Norwalk,CT)在如下循環(huán)條件下實(shí)施PCRA應(yīng)94。C4分鐘/l個(gè)循環(huán);98。C20秒，55°Cl分鐘，68°C3分鐘/30個(gè)循環(huán);72°C5分鐘/l個(gè)循環(huán)；4。C/保持。在補(bǔ)充有0.5。/。溴化乙錠的1.0。/。TAE瓊脂糖凝膠中在100V對(duì)15pl每個(gè)PCR^應(yīng)電泳1小時(shí)。用紫外線顯現(xiàn)擴(kuò)增片段，并通過(guò)與lKbpDNA梯比較來(lái)估計(jì)片段大小。根據(jù)2.3KbpDNA片段的存在來(lái)判斷預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物。對(duì)該片段進(jìn)行凝膠切割，并使用QIA快速凝膠提取試劑盒(QIAGENInc.,Valencia,CA)依照制造商的指導(dǎo)進(jìn)行純化。然后使用TOPOTACloning⑧試劑盒將純化片段克隆入pCR2.1質(zhì)粒中，并轉(zhuǎn)化至OneShotTOP10化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)中，均依照制造商的方案進(jìn)行。將個(gè)別菌落接種至14ml含2ml補(bǔ)充有50pl/ml卡那霉素的TB的Falcon管(Becton-Dickinson,FranklinLakes,NJ)中，并在以200rpm搖動(dòng)的情況下在37。C溫育16小時(shí)。溫育后，將1.5ml細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.7mlCostar微量離心管(FisherScientific,Pittsburgh,PA)中，并以16,000xg沉淀l分鐘。除去上清液，并使用NucleoSpin⑧質(zhì)4立i式劑盒(BDBiosciences/Clontech/Macherey-Nagel,PaloAlto,CA)如上文所述那樣分離質(zhì)粒DNA。用10個(gè)單位S/eI和MI消化3)ag分離的質(zhì)粒。將所有質(zhì)粒消化物在37。C溫育1小時(shí)。在補(bǔ)充有0.5%溴化乙錠的1.0%TAE瓊脂糖凝膠中在100V對(duì)限制性DNA電泳1小時(shí)。用紫外線顯現(xiàn)片段，并通過(guò)與1KbpDNA梯比較來(lái)估計(jì)片段大小。根據(jù)3.9KbppCR⑧2.1栽體外的2.325Kbp的插入DNA片段的存在來(lái)判斷預(yù)期的質(zhì)?？寺　Ｊ褂肅EQDTCS-快速開(kāi)始試劑盒(Beckman-Coulter,PaloAlto，CA)如制造商所述的那樣實(shí)施質(zhì)?？寺〉碾p鏈測(cè)序反應(yīng)。使用PerformaDTR凝膠過(guò)濾筒(EdgeBioSystems,Gaithersburg,MD)如制造商的方案所述的那樣純化反應(yīng)。在Beckman-CoulterCEQ2000XLDNA分析系統(tǒng)上分析序列反應(yīng)，并4吏用SequencherTM4.1.4W反(GeneCodesCorporation,AnnArbor,MI)來(lái)進(jìn)行核苷酸表4正。E.自主除草劑耐受基因盒插入質(zhì)粒主鏈一一自主供體中為了創(chuàng)建供體質(zhì)粒，將實(shí)施例18D中所述自主除草劑耐受基因盒插入實(shí)施例18B和18C中所述質(zhì)粒主鏈構(gòu)建體中。對(duì)自包含上文所述預(yù)期2.325Kbp序列的克隆衍生的限制性片段(圖72)進(jìn)行凝膠切割，'并使用QIA快速凝膠提取試劑盒(QIAGENInc.,Valencia,CA)依照制造商的指導(dǎo)來(lái)進(jìn)行純化。然后將該片段與已經(jīng)用限制酶&eI消化、且隨后去磷酸化的純化的pDAB7471(位置-l質(zhì)粒主鏈，圖70)或pDAB7451(位置-2質(zhì)粒主鏈，圖71)在連接反應(yīng)中組合。在如下條件下實(shí)施連接在20pl的反應(yīng)體積中l(wèi):5載體:插入物比例和500個(gè)單位T4DNA連接酶(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA),在16。C水浴中溫育16小時(shí)的條件下。隨后將5pl連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化至50iil大腸桿菌MAXE伍ciency⑧DH5aTM化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)中，并在制造商所述選擇條件下鋪板。將個(gè)別菌落接種至14ml含2ml補(bǔ)充有50pd/ml氯霉素的TB的Falcon管(Becton-Dickinson,FranklinLakes,NJ)中，并在以200rpm搖動(dòng)的情況下在37。C溫育16小時(shí)。溫育后，將1.5ml細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.7mlCostar微量離心管(FisherScientific,Pittsburgh,PA)中，并以16,000xg沉淀l分鐘。除去上清液，并使用NucleoSpin⑧質(zhì)粒試劑盒(BDBiosciences/Clontech/Macherey-Nagel，PaloAlto,CA)如上文所述那樣分離質(zhì)粒DNA。用10個(gè)單位SpeI(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA)消化3叫分離的質(zhì)粒DNA，并在37。C溫育1小時(shí)。在補(bǔ)充有0.5%溴化乙錠的1.0%TAE瓊脂糖凝膠中在100V對(duì)限制性DNA電泳1小時(shí)。用紫外線顯現(xiàn)片段，并通過(guò)與lKbpDNA梯比較來(lái)估計(jì)片段大小。根據(jù)2.325Kbp和約4.9Kbp(pDAB7471載體)或2.325Kbp和約5.0Kbp(pDAB7451載體)DNA片段的存在來(lái)判斷預(yù)期的質(zhì)?？寺?。所得的質(zhì)粒分別命名為pDAB7422(位置-1自主供體)(圖73)和pDAB7452(位置-2自主供體)(圖74)。F.非自主除草劑耐受基因表達(dá)盒構(gòu)建構(gòu)建包含不完整啟動(dòng)子-轉(zhuǎn)錄單位(PTU)的非自主除草劑耐受基因表達(dá)盒(圖75)。在該實(shí)施方案中，使用利用自77z&waa^z'g"a病毒衍生的2A序列(Mattion，N.M.,Harnish,E.C.，Crowley,J.C.和Reilly，RA.(1996)J.Virol.70,8124-8127)、除草劑耐受基因和聚腺苷酸化(聚腺普酸)終止序列(但沒(méi)有啟動(dòng)子)的功能性的策略。在該實(shí)施方案中，2A翻譯終止信號(hào)序列已經(jīng)被改造成與除草劑耐受基因以符合讀碼框的方式翻譯。另外，2A/除草劑編碼序列已經(jīng)被改造成與IPP2K基因靶物的翻譯讀碼框相符。除草劑耐受基因包含PAT(膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶)基因，其賦予對(duì)除草劑Bialaphos的抗性(最初自綠色產(chǎn)色鏈霉菌衍生的PAT編碼區(qū)(GenBank登錄號(hào)M22827;Wohlleben等,Gene70，25-37;1988)的修飾型式)。對(duì)M22827的最長(zhǎng)可讀框的最初序列的修飾是實(shí)質(zhì)性的，并包括改變密碼子利用樣式以優(yōu)化植物中的表達(dá)。除用曱硫氨酸替換纈氨酸作為第一個(gè)編碼氨基酸，并添加丙氨酸作為第二個(gè)氨基酸之外，自pDAB3014的PAT可讀框編碼的蛋白質(zhì)與M22827的最長(zhǎng)可讀框(其開(kāi)始于M22827第244位的GTG)編碼的蛋白質(zhì)相同。以GenBank登錄號(hào)I43995找到PAT的再建(rebulit)型式。終止子序列衍生自玉蜀黍脂肪酶[GenBank登錄號(hào)L35913的玉米脂肪酶cDNA克隆，只是用pDAB3014中第2468位G替換L35913第1093位C]。該玉米序列為PAT基因包含3，非翻譯區(qū)/轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)。由IntegratedDNATechnologies,Inc.(Coralville,IA)在標(biāo)準(zhǔn)脫鹽條件下合成下列寡核苷酸引物，并用水稀釋至0.125ligl濃度AGGAGACCAGTTGA-3(SEQIDNO:153)5'-ACTAGTATGCATGTGAATTCAGCACTTAAAGATCT-3，(SEQIDNO:154)。使用由TaKaRaBiotechnologyInc.(Seta3-4-1,Otsu,Shiga,520-2193,Japan)提供的試劑實(shí)施PCR擴(kuò)增反應(yīng)，其組成如下5)al10XLAPCRtm緩沖液II(Mg2+)、20ng雙鏈模板(pDAB3014質(zhì)粒DNA)、10pmol正向寡核苷酸引物、10pmol反向寡核苷酸引物、8pldNTP混合物(各2.5mM)、33.5|ilH20、0.5ji(2.5個(gè)單位)TaKaRaLATaqTMDNA聚合酶、1滴礦物油。使用Perkin-ElmerCetus48樣品DNA熱循環(huán)儀(Norwalk,CT)在如下循環(huán)條件下實(shí)施PCRA應(yīng)94。C4分鐘/l個(gè)循環(huán);98。C20秒，55°Cl分鐘，68°C2分鐘/30個(gè)循環(huán);72°C5分鐘/l個(gè)循環(huán)；4。C/保持。在補(bǔ)充有0.5。/。溴化乙錠的1.0。/oTAE瓊脂糖凝膠中在100V對(duì)15nl每個(gè)PCR^應(yīng)電泳l小時(shí)。用紫外線顯現(xiàn)擴(kuò)增片段，并通過(guò)與1KbpDNA梯比較來(lái)估計(jì)片段大小。根據(jù)約1KbpDNA片段的存在來(lái)判斷預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物。對(duì)該片段進(jìn)行凝膠切割，并使用QIA快速凝膠提取試劑盒(QIAGENInc.,Valencia,CA)依照制造商的指導(dǎo)進(jìn)行純化。然后使用TOPOTACloning⑧試劑盒將純化片段克隆入pCR2.1質(zhì)粒中，并轉(zhuǎn)化至OneShotTOP10化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌纟田胞(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)中，均依照制造商的方案進(jìn)行。將個(gè)別菌落接種至14ml含2ml補(bǔ)充有50|al/ml卡那霉素的TB的Falcon管(Becton-Dickinson,FranklinLakes,NJ)中，并在以200rpm搖動(dòng)的情況下在37。C溫育16小時(shí)。溫育后，將1.5ml細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.7mlCostar微量離心管(FisherScientific,Pittsburgh,PA)中，并以16,000xg沉淀l分鐘。除去上清液，并使用CA)如上文所述那樣分離質(zhì)粒DNA。用10個(gè)單位5^eI消化3iig分離的質(zhì)粒。將所有質(zhì)粒消化物在37。C溫育1小時(shí)。在補(bǔ)充有0.5%溴化乙錠的1.0%TAE瓊脂糖凝膠中在100V對(duì)限制性DNA電泳1小時(shí)。用紫外線顯現(xiàn)片段，并通過(guò)與1KbpDNA梯比較來(lái)估計(jì)片段大小。根據(jù)約1.0Kbp插入DNA片段和3.9Kbp(pCR⑧2.1載體)的存在來(lái)判斷預(yù)期的質(zhì)?？寺?。使用CEQTMDTCS-快速開(kāi)始試劑盒(Beckman-Coulter,PaloAlto,CA)如制造商所述的那樣實(shí)施質(zhì)?？寺〉碾p鏈測(cè)序反應(yīng)。使用PerformaDTR凝膠過(guò)濾筒(EdgeBioSystems,Gaithersburg,MD)如制造商的方案所述的那樣純化反應(yīng)。在Beckman-CoulterCEQTM2000XLDNA分析系統(tǒng)上分析序列反應(yīng)，并使用SequencherTM4丄4版(GeneCodesCorporation,AnnArbor,MI)來(lái)進(jìn)行核苷酸表征。G.非自主除草劑耐受基因盒插入質(zhì)粒主鏈一_非自主供體中為了創(chuàng)建供體質(zhì)粒，將實(shí)施例18F中所述非自主除草劑耐受基因盒插入實(shí)施例18B和18C中所述質(zhì)粒主鏈構(gòu)建體中。對(duì)與包含正確的1Kbp序列的克隆對(duì)應(yīng)的限制性片段進(jìn)行凝膠切割，并使用QIA快速凝膠提取試劑盒(QIAGENInc.,Valencia,CA)依照制造商的指導(dǎo)來(lái)純化。然后將該片段與已經(jīng)用限制酶SpeI消化、且隨后去磷酸化的純化的pDAB7471(位置-l質(zhì)粒主鏈)(圖70)或pDAB7451(位置-2質(zhì)粒主鏈)(圖71)在連接反應(yīng)中組合。在如下條件下實(shí)施連接在20(il的反應(yīng)體積中的1:5載體:插入物比例和500個(gè)單位T4DNA連接酶(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA),在16。C水浴中溫育16小時(shí)的條件下。隨后將5^1連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化至5(V1大腸桿菌MAXEfficiencyDH5aTM化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞(IrwitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)中，并在制造商所述選擇條件下鋪板。將個(gè)別菌落接種至14ml含2ml補(bǔ)充有50pl/ml氯霉素的TB的Falcon管(Becton-Dickinson,FranklinLakes,NJ)中，并在以200rpm搖動(dòng)的情況下在37。C溫育16小時(shí)。溫育后，將1.5ml細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.7mlCostar微量離心管(FisherScientific,Pittsburgh,PA)中，并以16,000xg沉淀l分鐘。除去上清液，并使用CA)如上文所述那樣分離質(zhì)粒DNA。用lO個(gè)單位S;eI(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)消化3)iig分離的質(zhì)粒DNA,并在"。C溫育l小時(shí)。在補(bǔ)充有0.5%溴化乙錠的1.0%TAE瓊脂糖凝膠中在100V對(duì)限制性DNA電泳1小時(shí)。用紫外線顯現(xiàn)片段，并通過(guò)與lKbpDNA梯比較來(lái)估計(jì)片段大小。根據(jù)1.0Kbp和4.96Kbp(pDAB7471載體)或1.0Kbp和約5.0Kbp(pDAB7451載體)DNA片段的存在來(lái)判斷預(yù)期的質(zhì)?？寺　Ｋ玫馁|(zhì)粒分別命名為pDAB7423(位置-l非自主供體)(圖76)和pDAB7454(位置-2非自主供體)(圖77)。H.位置1ZFN+HR供體序列組合質(zhì)粒作為兩個(gè)分開(kāi)的質(zhì)粒向植物細(xì)胞中投遞(例如一個(gè)質(zhì)粒包含ZFN元件而另一個(gè)包含除草劑耐受供體序列)的替代策略，單一的質(zhì)粒被改造成包含本專利中例示的所有必要元件。本實(shí)施例中所述組合質(zhì)粒包含設(shè)計(jì)用于靶向特定IPP2K基因座并在那里產(chǎn)生雙鏈斷裂的ZFN以及設(shè)計(jì)用于整合至那些斷裂位點(diǎn)中的自主PATPTU和/或非自主2A7PATPTU和供體側(cè)翼兩者。利用Gateway⑧技術(shù)(其使用基于X噬菌體的位點(diǎn)特異性重組(Landy,A.(1989)Ann.Rev,Biochem.58:913))來(lái)將載體pDAB7422和pDAB7423(實(shí)施例6E和6G中所述的)轉(zhuǎn)變成Gateway⑧目的載體。一旦被轉(zhuǎn)變，可容易地將包含ZFN表達(dá)盒(收容在Gateway⑧進(jìn)入載體(entryvector)中)的質(zhì)粒動(dòng)員(mobilize)至目的載體，創(chuàng)建ZFN/供體組合質(zhì)粒。在37。C用10個(gè)單位A^I(NewEnglandBiolabs,Beveriy，MA)消化各1嗎此類質(zhì)粒達(dá)1小時(shí)。在65。C將7VWI限制性內(nèi)切核酸酶加熱滅活15分鐘，隨后使用3個(gè)單位壞石成性磷酸酶(SAP)(RocheDiagnosticsGmbH,Mannheim,Germany)在37。C對(duì)片段末端進(jìn)行去磷酸化達(dá)l小時(shí)。在補(bǔ)充有0.5%溴化乙錠的1.0%TAE瓊脂糖凝膠中在100V對(duì)限制性DNA電泳1小時(shí)。用紫外線顯現(xiàn)載體片,殳(pDB7422=7.317Kbp，pDAB7423=5.971Kbp)，通過(guò)與1KbpDNA梯比較來(lái)估計(jì)大小,進(jìn)行凝膠切割，隨后使用QIA快速凝膠提取試劑盒(QIAGENInc.,Valencia,CA)依照制造商的指導(dǎo)進(jìn)行純化。和attR2的2.274KbpA^I片段在以如下條件下實(shí)施的連接反應(yīng)中組合在20(il的反應(yīng)體積中1:5的載體:插入物比例和500個(gè)單位T4DNA脂肪酶(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA),在16。C水浴中溫育16小時(shí)的條件下。隨后將5pl的連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化至50iLd大腸桿菌OneShotccdBSurvivaFM化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad，CA)中，并在制造商所述選擇條件下鋪板。將個(gè)別菌落接種至14ml含2ml補(bǔ)充有50|il/ml氯霉素的TB的Falcon管(Becton-Dickinson,FranklinLakes,NJ)中，并在以200rpm搖動(dòng)的情況下在37。C溫育16小時(shí)。溫育后，將1.5ml細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.7mlCostar微量離心管(FisherScientific,Pittsburgh,PA)中，并以16,000xg沉淀l分鐘。除去上清液，并使用NucleoSpin⑧質(zhì)4立i式劑盒(BDBiosciences/Clontech/Macherey-Nagel,PaloAlto,CA)如上文所述那樣分離質(zhì)粒DNA。用10個(gè)單位五coRII(NewEnglandBioLabs,Inc.,Beverly,MA)消化3pg分離的質(zhì)粒DNA,并在37。C溫育1小時(shí)。在補(bǔ)充有0.5%溴化乙錠的1.0%TAE瓊脂糖凝膠中在100V對(duì)限制性DNA電泳l小時(shí)。用紫外線顯現(xiàn)片段，并通過(guò)與lKbpDNA梯比較來(lái)估計(jì)片段大小。根據(jù)1.448Kbp、1.946Kbp、和6.197Kbp的DNA片段(自主PATPTU位置-1HR供體)和5.807Kbp和2.438Kbp的DNA片段(非自主PAT位置-1HR供體)的存在來(lái)判斷預(yù)期的質(zhì)?？寺　Ｋ玫馁|(zhì)粒分別命名為pDAB7424(經(jīng)Gateway改編的位置-1自主供體)(圖78)和pDAB7425(經(jīng)Gateway⑧改編的位置-1非自主供體)(圖79)。作為這些克隆操作的結(jié)果，將質(zhì)粒pDAB7424和pDAB7425設(shè)計(jì)為Gateway目的載體。pDAB7412具有作為包含如下元件的Gateway進(jìn)入載體的功能性ZmUbilv.2/ZFN12/ZmPer53，UTR。為了將ZFN表達(dá)盒(Gateway進(jìn)入載體)轉(zhuǎn)移至自主的或非自主的供體分子(Gateway目的載體)中，以50ng(進(jìn)入載體)150ng/pl(目的載體)的比例實(shí)施LRClonaseTMII(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)反應(yīng)，如制造商所概述的那樣進(jìn)行。所得的陽(yáng)性組合載體命名為pDAB7426(位置-1自主HR供體/ZFN12)(圖80)和pDAB7427(非自主HR供體/ZFN12)(圖81)。實(shí)施例19:ZFN和供體DNA向植物細(xì)胞中的投遞為了經(jīng)由靶向整合而實(shí)現(xiàn)ZFN介導(dǎo)的、供體DNA向植物基因組中的整合，應(yīng)理解的是，需要投遞編碼ZFN的DNA,接著在植物細(xì)胞中表達(dá)功能性ZFN蛋白。還需要的是供體DNA向所述植物細(xì)胞的相伴投遞，使得功能性ZFN蛋白可在耙DNA上誘導(dǎo)雙鏈斷裂，然后所述雙鏈斷裂經(jīng)由供體DNA向耙基因座中的同源性驅(qū)動(dòng)整合而得到修復(fù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，可通過(guò)數(shù)種方法來(lái)實(shí)現(xiàn)功能性ZFN蛋白的表達(dá)，包括但不限于ZFN編碼構(gòu)建體的基因轉(zhuǎn)移、或ZFN編碼構(gòu)建體的瞬時(shí)表達(dá)。在這兩種情況中，在植物細(xì)胞中同時(shí)實(shí)現(xiàn)功能性ZFN蛋白的表達(dá)和供體DNA的投遞以驅(qū)動(dòng)靶向整合。在這里引用的實(shí)施例中，我們演示用于向植物細(xì)胞中相伴投遞ZFN編碼DNA和供體DNA的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用多種適于植物細(xì)胞的DNA投遞方法之任一種，包括但不限于土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、基于生物射彈的DNA投遞或WhiskersTM介導(dǎo)的DNA投遞。在這里所述的一個(gè)實(shí)施方案中，使用供體DNA與ZFN編碼DNA構(gòu)建體的各種組合來(lái)實(shí)施Whiskers介導(dǎo)的DNA投遞實(shí)驗(yàn)。這些組合包括l)包含ZFN編碼序列和供體DNA兩者的單一質(zhì)粒和2)兩個(gè)不同的質(zhì)粒，一個(gè)包含ZFN編碼序列而另一個(gè)包含供體DNA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用供體DNA與ZFN編碼DNA構(gòu)建體的各種組合來(lái)實(shí)施基于生物射彈的DNA投遞。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解這些組合可包括l)包含ZFN編碼序列和供體DNA兩者的單一質(zhì)粒和2)兩個(gè)不同的質(zhì)粒，一個(gè)包含ZFN編碼序列而另一個(gè)包含供體DNA。A.WhiskersTM介導(dǎo)的DNA投遞如本文較早所述，生成玉米的胚發(fā)生Hi-II細(xì)胞培養(yǎng)物，并用作證實(shí)靶向整合的活植物細(xì)胞的來(lái)源。本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用自多種植物物種衍生的細(xì)胞培養(yǎng)物、或自多種植物物種衍生的分化植物組織作為證實(shí)靶向整合的活植物細(xì)胞的來(lái)源。在本實(shí)施例中，將12ml來(lái)自先前低溫保存細(xì)胞系的PCV加上28ml條件化培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)至500mlErlenmeyer燒瓶中的80mlGN6液體培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基(Chu等，1975),2.0mg/L2,4-D，30g/L嚴(yán)糖，pH5.8)中，并在搖瓶機(jī)(125rpm，28。C)上放置。使用相同的細(xì)胞系重復(fù)該步驟兩次，使得總共36mlPCV在3個(gè)燒瓶間分配。24小時(shí)后，除去GN6液體培養(yǎng)基，并用72mlGN6S/M滲透培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基，2.0mg/L2,4-D，30g/L蔗糖，45.5g/L山梨醇，45.5g/L甘露醇，100mg/L肌肉-肌醇，pH6.0)替換。在中等攪動(dòng)(125rpm)情況中在28。C在黑暗中溫育燒瓶達(dá)30-35分鐘。溫育期期間，通過(guò)將8.1mlGN6S/M液體培養(yǎng)基添力口至405mg無(wú)菌的、石友化石圭晶須(AdvancedCompositeMaterials,LLC,Greer,SC)來(lái)制備50mg/ml碳化硅晶須懸浮液。在GN6S/M滲透培養(yǎng)基中溫育后，將每個(gè)燒瓶的內(nèi)含物合并至250ml離心瓶中。在燒瓶中的所有細(xì)胞沉降至底部后，吸取超過(guò)約14mlGN6S/M液體的內(nèi)含物體積，并收集在無(wú)菌的1L燒瓶中，供未來(lái)使用。以最高速度使預(yù)先濕潤(rùn)的晶須懸浮液渦旋混合60秒，然后添加至離心瓶。在將包含ZFN編碼序列加上供體DNA兩者的單一質(zhì)粒投遞至植物細(xì)胞中的一個(gè)例子中，將170pg純化的環(huán)狀質(zhì)粒DNA添加至瓶中。在將兩個(gè)不同的質(zhì)粒進(jìn)行共投遞(一個(gè)包含ZFN編碼序列而另一個(gè)包含供體DNA)的一個(gè)備選例子中，評(píng)估關(guān)于DNA量的多種策略。一種策略利用85)ig供體DNA和85嗎鋅指編碼DNA。其它改良形式利用10、5、或1倍供體DNA比1倍鋅指DNA的摩爾比例，這基于質(zhì)粒個(gè)體的大小(以千個(gè)堿基對(duì)計(jì))，使得每個(gè)瓶子添加總共170pgDNA。在所有共投遞的情況中，在管中預(yù)先冷卻DNA，之后添加至離心瓶中。一旦添加DNA,立即將瓶子放置在改良的RedDevil5400商用涂料混合器(RedDevilEquipmentCo.,Plymouth,MN)中，并攪動(dòng)10秒。攪動(dòng)后，將細(xì)胞、培養(yǎng)基、晶須和DNA的混合物連同125ml新鮮的GN6液體培養(yǎng)基一起添加至1L燒瓶的內(nèi)含物以降低滲壓劑(osmoticant)。容許細(xì)胞在設(shè)置成125rpm的搖瓶機(jī)上恢復(fù)2小時(shí)。使用與室內(nèi)真空管線連接的玻璃細(xì)胞收集器單元將6mL分散的懸浮液過(guò)濾至Whatman弁4濾紙(5.5cm)上，使得每個(gè)瓶子獲得60張濾紙。將濾紙放置在60x20mmGN6固體培養(yǎng)基(與GN6液體培養(yǎng)基相同，只是具有2.5g/LGelrite膠凝劑)平板上，并在28。C在黑暗條件下培養(yǎng)1周。B.生物射彈介導(dǎo)的DNA投遞在這里引用的例子中，將玉米的胚發(fā)生懸浮液傳代培至GN6液體培養(yǎng)基中24小時(shí)，之后進(jìn)行本文較早所述實(shí)驗(yàn)。取出過(guò)量的液體培養(yǎng)基，并將約0.4PCV細(xì)胞在含有用2.5g/LGelrite凝固的GN6S/M培養(yǎng)基的100x15mm皮氏皿的中心上稀疏地涂布成直徑2.5cm的一個(gè)圓。將細(xì)胞在黑暗條件下培養(yǎng)4小時(shí)。為了用DNA包被生物射彈顆粒，將3mg1.0微米直徑的金顆粒用100%乙醇清洗l次，用無(wú)菌蒸餾水清洗2次，并在5(Hil在硅化Eppendorf管中的水中重懸。將總共5pg質(zhì)粒DNA、20pl亞精胺(0.1M)和50^il氯化鈣(2.5M)分開(kāi)添加至金懸浮液，并渦旋混合。將混合物在室溫溫育10分鐘，在臺(tái)式樣i型離心積a中以10,000rpm沉淀10秒，在60)111冷的100%乙醇中重懸，并將8-9|11分配至每個(gè)宏載體上。使用生物射彈PDS-1000/HeTM系統(tǒng)(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)進(jìn)行轟擊。在1100psi和27英寸Hg真空條件下將含有細(xì)胞的平板放置在中間的支架上，并遵循操作手冊(cè)來(lái)進(jìn)行轟擊。轟擊后16小時(shí)，將組織以小塊轉(zhuǎn)移至GN6(1H)培養(yǎng)基，并在28。C在黑暗條件下培養(yǎng)2-3周。每2-4周繼續(xù)轉(zhuǎn)移，直至出現(xiàn)源自供體DNA整合的推定轉(zhuǎn)基因分離群。經(jīng)由生物射彈介導(dǎo)的DNA投遞產(chǎn)生的推定供體DNA整合事件的鑒定、分離和再生與用于經(jīng)由WhiskersTM介導(dǎo)的DNA投遞產(chǎn)生的推定供體DNA整合事件的方法相同，并在下文描述。C.推定靶向整合轉(zhuǎn)基因事件的鑒定和分離DNA投遞后l周，將濾紙轉(zhuǎn)移至60x20mmGN6(1H)選擇培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基，2.0mg/L2，4-D,30g/L蔗糖，100mg/L月幾肉-肌醇，1.0mg/L來(lái)自Herbiace(MeijiSeika,Japan)的Bialaphos，2.5g/LGelrite,pH5.8)平4反上。將這些選4奪平板在28。C在黑暗中溫育1周。在黑暗中選擇l周后，通過(guò)將一半來(lái)自每塊平板的細(xì)胞刮入裝有3.0mL保持在37-38。C的GN6瓊脂糖培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基，2.0mg/L2,4-D,30g/L蔗糖，100mg/L肌肉-肌醇，7g/LSeaPlaque⑧瓊脂糖，pH5.8,在121。C高壓滅菌僅10分鐘)和lmg/L來(lái)自Herbiace的Bialaphos的管中來(lái)將組織埋置于新鮮培養(yǎng)基上。用刮伊打碎瓊脂糖/組織混合物，隨后將3mL瓊脂糖/組織混合物均勻地倒到100x15mm包含GN6(lH)培養(yǎng)基的皮氏皿的表面上。對(duì)每塊平板中兩邊半塊重復(fù)該過(guò)程。一旦包埋所有組織，則用Nescofilm⑧或ParafilmM⑧各個(gè)密封平板，并在28。C在黑暗條件下培養(yǎng)長(zhǎng)達(dá)10周。從包埋平板中取出在這些選擇條件下生長(zhǎng)的推定轉(zhuǎn)化分離群，并轉(zhuǎn)移至60x20mm平板中的新鮮選擇培養(yǎng)基。若在約2周后持續(xù)生長(zhǎng)是明顯的，則事件視為對(duì)所應(yīng)用的除草劑(Bialophos)有抗性，隨后將細(xì)胞的等分試樣收獲至2mLEppendorf管中，用于基因型分析?；罴?xì)胞應(yīng)用相當(dāng)?shù)倪x擇條件。例如，可執(zhí)行備選的選擇標(biāo)志基因(諸如AAD-l,如WO2005/107437A2所述的)作為供體，用于本文所述玉米細(xì)胞中整合事件的選擇和回收。實(shí)施例20:經(jīng)由PCR基因型分型來(lái)篩選靶向整合事件在本實(shí)施例中，PCR基因型分型理解為包括但不限于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增自分離的玉米胼胝體(其預(yù)測(cè)包含嵌入基因組中的供體DNA)衍生的基因組DNA，接著是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)克隆和序列分析。PCR^因型分型的方法已經(jīng)有詳細(xì)記載(例如Rios,G等(2002)PlantJ.32:243-253),并可應(yīng)用于自任何植物物種或組織類型(包括細(xì)胞培養(yǎng)物)衍生的基因組DNA。本領(lǐng)域技術(shù)人員可設(shè)計(jì)用于PCRj^因型分型的策略，其包括(但不限于)植物基因組中特定序列的擴(kuò)增、植物基因組中多個(gè)特定序列的擴(kuò)增、植物基因組中非特定序列的擴(kuò)增、或其組合。擴(kuò)增后接著可以是克隆和測(cè)序(如本實(shí)施例中所述的)，或擴(kuò)增產(chǎn)物的直接序列分析。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解可用于分析本文所產(chǎn)生擴(kuò)增片段的備選方法。在本文所述的一個(gè)實(shí)施方案中，在PCR擴(kuò)增中采用對(duì)基因靶物特異的寡核苷酸引物。在本文所述的另一個(gè)實(shí)施方案中，在PCR擴(kuò)增中采用對(duì)供體DNA序列特異的寡核苦酸引物。另一個(gè)實(shí)施方案包括結(jié)合基因靶序列和供體DNA序列兩者的寡核苷酸引物的組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員可設(shè)計(jì)用于詢問(wèn)基因組的別的引物組合和擴(kuò)增反應(yīng)。A.基因組DNA提取自分離的、除草劑耐受的實(shí)施例19所述玉米細(xì)胞中提取基因組DNA(gDNA)，并用作PCR基因型分型實(shí)驗(yàn)的模板。依照DNeasy⑧96植物試劑盒(QIAGENInc.,Valencia,CA)詳述的制造商方案自約100-300|^1充實(shí)細(xì)胞體積(PCV)的如上文所述分離的除草劑耐受的HiII胼胝體提取gDNA。在1OOiil試劑盒提供的洗脫緩沖液中洗脫基因組DNA，產(chǎn)生20-200ngl的終濃度，隨后經(jīng)由下文概述的基于PCR的基因型分型方法來(lái)分析。B.用于PC緣因型分型的引物設(shè)計(jì)本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用多種用于設(shè)計(jì)和實(shí)施基于PCR的基因型分型的策略。設(shè)計(jì)用于退火至基因靶物、供體DNA序列和/或兩者組合的寡核苷酸1物是可行的。為了設(shè)計(jì)能退火至不為被構(gòu)建至供體DNA分子中的同源性側(cè)翼所包圍的區(qū)域中的IPP2JC&因靶物的寡核苷酸引物，經(jīng)由DNA測(cè)序來(lái)表征包含別的基因靶序列數(shù)據(jù)的質(zhì)?？寺?。使用CEQTMDTCS-快速開(kāi)始試劑盒(Beckman-Coulter,PaloAlto,CA)如制造商所述進(jìn)行質(zhì)粒克隆的雙鏈測(cè)序反應(yīng)。使用PerformaDTR凝膠過(guò)濾筒(EdgeBioSystems,Gaithersburg，MD)如制造商方案所述的那樣純化反應(yīng)。在Beckman-CoulterCEQ2000XLDNA分析系統(tǒng)上分析序列反應(yīng)，并使用SequencherTM4.1.4版(GeneCodesCorporation,AnnArbor,MI)進(jìn)行核芬酸表征。這些序列對(duì)應(yīng)于ZFN耙定區(qū)域上游(5，-)和下游(3，-)的IPP2K基因區(qū)域，并描繪在圖91(SEQIDNO:141)和圖92(SEQIDNO:142)中。在這里提出的例子中，由IntegratedDNATechnologies,Inc.(Coralville,IA)在標(biāo)準(zhǔn)脫鹽條件下合成所有的寡核苷酸引物，并用水稀釋至100iiM濃度。下IPP2IC基因靶物特異的gDNA序列。這些寡核苷酸如下5,-TGGACGGAGCGAGAGCCAGAATTCGACGCTG-3，(SEQIDNO:153)5'-GTGCAAGAATGTATTGGGAATCAACCTGATG-3，(SEQIDNO:154)。第二組正向和反向寡核苷酸引物也設(shè)計(jì)用于退火至供體DNA序列的邊界外的、IPP2K基因靶物特異的gDNA序列，但是其嵌套在第一對(duì)之內(nèi)5，-CTGTGGTACCAGTACTAGTACCAGCATC-3，(SEQIDNO:155)5，TGGATCAAGGCATCAAGCATTCCAATCT-3,(SEQIDNO:156)。另外設(shè)計(jì)用于特異性退火至與除草劑耐受基因的編碼區(qū)對(duì)應(yīng)的供體DNA的正向和反向寡核香酸引物5，-TGGGTAACTGGCCTAACTGG-3，(SEQIDNO:157)5，-TGGAAGGCTAGGAACGCTTA-3，(SEQIDNO:158)5，-CCAGTTAGGCCAGTTACCCA-3，(SEQIDNO:159)5，TAAGCGTTCCTAGCCTTCCA-3，(SEQIDNO:160)。C.供體DNA特異的PCR擴(kuò)增4吏用由TaKaRaBiotechnologyInc.,Seta3-4-1，Otsu，Shiga,520-2193，Japan提供的試劑實(shí)施初次PCR擴(kuò)增反應(yīng)，其組成如下2.5^110XExTaqPCRtm緩沖液、40-200ng雙鏈基因組DNA模板、1OiiM正向寡核苷酸引物、10pM反向寡核芬酸引物、2^1dNTP混合物(各2.5mM)、16^1H20、0.5|il(2.5個(gè)單位)ExTaqTMDNA聚合酶。使用Bio-Rad，96樣品DNAEngineTetrad2,Peltier熱循環(huán)儀(Hercules,CA)在如下循環(huán)條件下進(jìn)行PCR^應(yīng)94。C3分鐘/1個(gè)循環(huán)；94。C30秒，64°C30秒，72°C5分鐘/35個(gè)循環(huán)；72°C10分鐘/1個(gè)循環(huán)；4。C/保持。隨后在包含如下成分的再次PCIL良應(yīng)中再次擴(kuò)增初次PCR^應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物2.5|il10XExTaqPCRtm緩沖液、2|_11模板(初次PCRA應(yīng)在H20中1:100稀釋)、lOiuM正向寡核苷酸引物、1(^M反向寡核苦酸引物、2pldNTP混合物(各2.5mM)、16jilH20、0.5pl(2.5個(gè)單位)ExTaqTMDNA聚合酶。使用Bio-Rad,96樣品DNAEngineTetrad2，Peltier熱循環(huán)儀(Hercules，CA)在如下循環(huán)條件下進(jìn)行PCR^應(yīng)95°Cl分鐘/l個(gè)循環(huán)；94°C15秒，61。C30秒，72°C30秒/30個(gè)循環(huán)；72。Cl分鐘/l個(gè)循環(huán)；4。C/保持。在補(bǔ)充有0.5°/。溴化乙錠的1.0%TAE瓊脂糖凝膠中在100V對(duì)10ial各擴(kuò)增產(chǎn)物電泳l小時(shí)。用紫外線顯現(xiàn)擴(kuò)增片,史，并通過(guò)與1KbpPlusDNA沖弟(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)比較來(lái)估計(jì)片段大小。如圖82所示，根據(jù)0.317KbpDNA片段的存在來(lái)判斷包含預(yù)期片段的PCR產(chǎn)物。實(shí)施例21:靶向整合事件的檢測(cè)在包含編碼除草劑耐受基因盒的整合供體DNA分子的除草劑耐受事件中，一定比例的所述事件是供體DNA靶向整合入ZFN誘導(dǎo)的雙鏈斷裂位點(diǎn)中的產(chǎn)物。為了區(qū)分這些靶向整合事件與那些自除草劑耐受基因盒隨機(jī)整合衍生的事件，利用基于PCR的基因型分型策略，其使用基因組特異的PCR引物和隨后的基因組特異的加上供體特異的PCRi1物的組合。A.基因組特異的擴(kuò)增和隨后的基因組/供體特異的擴(kuò)增在本實(shí)施方案中，初次PCR反應(yīng)利用供體整合區(qū)上游和下游IPP2K基因耙物區(qū)特異的寡核苷酸引物(例如圖92和93)。使用由TaKaRaBiotechnologyInc.,Seta3-4-1,Otsu,Shiga,520-2193,Japan提供的試劑實(shí)施初次PCR擴(kuò)增反應(yīng)，其組成如下2.5|al10XExTaqPCRTM緩沖液、40-200ng雙鏈玉米gDNA模板、10pM正向寡核苷酸引物、lO)uM反向寡核苦酸引物、2lildNTP混合物(各2.5mM)、16^1H20、0.5pl(2.5個(gè)單位)ExTaqTMDNA聚合酶。使用Bio-Rad96樣品DNAEngineTetrad2，Peltier熱循環(huán)儀(Hercules,CA)在如下循環(huán)條件下進(jìn)行PCRA應(yīng)94。C3分鐘/l個(gè)循環(huán);94。C30秒，64。C30秒，72°C5分鐘/35個(gè)循環(huán)；72°C10分鐘/1個(gè)循環(huán)；4。C/保持。隨后將初次PCR反應(yīng)產(chǎn)物在H20中1:1OO稀釋，并用作兩個(gè)不同的再次PCR反應(yīng)的模板DNA。在本實(shí)施方案中，再次反應(yīng)利用在IPP2K基因組區(qū)和供體分子中結(jié)合的引物，產(chǎn)生橫跨基因組和供體之間的整合邊界的擴(kuò)增子。第一個(gè)反應(yīng)聚焦于基因組和供體之間的5，邊界。第二個(gè)反應(yīng)聚焦于供體和基因組之間的3，邊界。兩個(gè)反應(yīng)均組成如下2.5pl10XExTaqPCRTM緩沖液、2)il模板[初次PCR反應(yīng)物l:100稀釋]、lO)iiM正向寡核苦酸引物、10pM反向寡核苷酸引物、2pldNTP混合物(各2.5mM)、16plH20、0.5pl(2.5個(gè)單位)ExTaqTMDNA聚合酶。使用Bio-Rad,96樣品DNAEngineTetrad2,Peltier熱循環(huán)儀(Hercules,CA)在io下循環(huán)條件下進(jìn)行PCR^應(yīng)94°C3分鐘/l個(gè)循環(huán)；94°C30秒，60°C30秒,72°C2分鐘/35個(gè)循環(huán);72°C10分鐘/1個(gè)循環(huán);4°C/保持。在補(bǔ)充有0.5%溴化乙錠的1.0%TAE瓊脂糖凝膠中在100V對(duì)2(V1各再次PCRA應(yīng)物電泳1小時(shí)。用紫外線顯現(xiàn)擴(kuò)增片段，并通過(guò)與1KbpPlusDNA梯(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)比較來(lái)估計(jì)片段大小。根據(jù)DNA片段1.65Kbp(5，邊界)(圖83)或1.99Kbp(3'邊界)(圖84)的存在來(lái)判斷自供體向IPP2tt因中的靶向整合衍生的PCR產(chǎn)物。對(duì)這些片段進(jìn)行凝膠切割，并使用QIA快速凝膠提取試劑盒(QIAGENInc.,Valencia,CA)依照制造商的指導(dǎo)進(jìn)行純化。隨后使用TOPOTACloning⑧試劑盒(含pCR⑧2.1載體)和OneShotTOP10化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(IrwitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)依照制造商的方案將純化的片段克隆入pCR2.1質(zhì)粒中。將個(gè)別菌落接種至14ml含2ml補(bǔ)充有50pl/ml卡那霉素的TB的Falcon管(Becton-Dickinson,FranklinLakes,NJ)中，并在以200rpm搖動(dòng)的情況下在37。C溫育16小時(shí)。溫育后，將1.5ml細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.7mlCostar微量離心管(FisherScientific,Pittsburgh,PA)中，并以16,000xg沉淀l分鐘。除去上清液，并使用NucleoSpin⑧質(zhì)粒試劑盒(BDBiosciences/Clontech/Macherey-Nagel,PaloAlto,CA)如上文所述那樣分離質(zhì)粒DNA。用10個(gè)單位五coRI(NewEnglandBioLabs,Beverly,MA)消化3)ig分離的質(zhì)粒。將所有質(zhì)粒消化物在37。C溫育1小時(shí)。在補(bǔ)充有0.5°/。溴化乙錠的1.0%TAE瓊脂糖凝膠中在100V對(duì)限制性DNA電泳1小時(shí)。用紫外線顯現(xiàn)片段，并通過(guò)與1KbpPlusDNA梯(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)比較來(lái)估計(jì)片段大小。根據(jù)3.9KbppCR⑧2.1載體外的合適大小的插入DNA片段的存在來(lái)判斷預(yù)期的質(zhì)?？寺?。使用CEQTMDTCS-快速開(kāi)始試劑盒(Beckman-Coulter,PaloAlto,CA)如制造商所迷的那樣實(shí)施質(zhì)?？寺〉碾p鏈測(cè)序反應(yīng)。使用PerformaDTR凝膠過(guò)濾筒(EdgeBioSystems,Gaithersburg,MD)如制造商的方案所述的那樣純化反應(yīng)。在Beckman-CoulterCEQ2000XLDNA分析系統(tǒng)上分析序列反應(yīng)，并葉吏用SequencherTM4.1.4片反(GeneCodesCorporation,AnnArbor,MI)來(lái)進(jìn)行核苦酸表征。使用VectorNTi10.1版(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)進(jìn)行核苷酸比對(duì)。如下進(jìn)行來(lái)自靶向整合事件(事件#073)的序列數(shù)據(jù)分析。對(duì)橫跨整個(gè)基因組整合位點(diǎn)的初次PCR產(chǎn)物進(jìn)行聚焦于基因組和供體之間的5，或3，邊界的再次擴(kuò)增。與這些再次擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的克隆片段與野生型IPP2K基因組序列以及靶向整合事件的預(yù)期序列的比對(duì)清楚指明在靶位點(diǎn)發(fā)生了供體DNA的精確整合。IPP2K基因組基因座的核苷酸序列、基因組/供體邊界、與IPP2K同源性側(cè)翼對(duì)應(yīng)的供體區(qū)域的核苦酸序列和除草劑耐受盒的核苷酸序列均保存在自該事件衍生的多個(gè)克隆PCR產(chǎn)物中。因此，該事件代表在特定基因靶物處發(fā)生ZFN介導(dǎo)的雙鏈斷裂的同源性驅(qū)動(dòng)修復(fù)和供體DNA的靶向整合的基因組。已經(jīng)獲得了代表發(fā)生獨(dú)特靶向整合的別的轉(zhuǎn)化事件，證實(shí)本文所教導(dǎo)的方法在玉米胼胝體中是可再現(xiàn)的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可將這些方法應(yīng)用于任何植物物種中認(rèn)為想要靶向整合的任何基因耙物。B.嵌套式基因組/供體特異的擴(kuò)增在本實(shí)施方案中，初次的和隨后再次的PCR^應(yīng)兩者均利用供體整合區(qū)域上游或下游的IPP2K基因靶物區(qū)域特異的寡核苷酸引物(附錄V和VI)與供體序列特異的寡核苷酸引物的組合。在本例子中，使用由TaKaRaBiotechnologyInc.,Seta3-4-1,Otsu,Shiga,520-2193,Japan提供的試劑實(shí)施初次PCR擴(kuò)增反應(yīng)，其組成如下2.5|ul10XExTaqPCRTM緩沖液、40-200ng雙鏈玉米gDNA^f莫板、10pM正向寡核苷酸引物、10nM反向寡核苷酸引物、2(^1dNTP混合物(各2.5mM)、16)ilH20、0.5|nl(2.5個(gè)單位)ExTaqTMDNA聚合酶。使用Bio-Rad，96樣品DNAEngineTetrad2,Peltier熱循環(huán)儀(Hercules,CA)在如下循環(huán)條件下進(jìn)行PCR^應(yīng)94°C3分鐘/l個(gè)循環(huán)；94°C30秒，52。C或64。C30秒，72。C2分鐘/35個(gè)循環(huán)；72°C10分鐘/1個(gè)循環(huán)；4。C/保持。然后將初次PCR反應(yīng)在H20中稀釋1:100，并用作再次PCR反應(yīng)的模板DNA。在本實(shí)施方案中，再次反應(yīng)也利用在IPP2K^因組區(qū)域和供體分子中結(jié)合的引物，產(chǎn)生橫跨基因組和供體之間的整合邊界的擴(kuò)增子。所使用的具體引物決定擴(kuò)增子是聚焦于基因組和供體之間的5，還是3，邊界。這些反應(yīng)的試劑組成如下2.5|^110XExTaqPCRTM緩沖液、2pl模板[初次PCRA應(yīng)1:100稀釋]、10pM正向寡核苷酸引物、lOitiM反向寡核苷酸引物、2pldNTP混合物(各2.5mM)、16plH20、0.5pl(2.5個(gè)單位)ExTaqTMDNA聚合酶。使用Bio-Rad96樣品DNAEngineTetrad2,Peltier熱循環(huán)儀(Hercules，CA)在如下循環(huán)條件下進(jìn)行PCRA應(yīng)94°C3分鐘/l個(gè)循環(huán)；94°C30秒，54。C或60。C30秒，72°C2分鐘/35個(gè)循環(huán)；72。C10分鐘/l個(gè)循環(huán)；4。C/保持。在補(bǔ)充有0.5°/。溴化乙錠的1.0%TAE瓊脂糖凝膠中在100V對(duì)20pl各再次PCR^應(yīng)電泳l小時(shí)。用紫外線顯現(xiàn)擴(kuò)增片段，并通過(guò)與1KbpPlusDNA梯(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)比較來(lái)估計(jì)片段大小。根據(jù)DNA片段1.35Kbp(5，邊界)(圖85)或1.66Kbp(3'邊界)(圖86)的存在來(lái)判斷自供體向IPP2tt因中的靶向整合衍生的PCR產(chǎn)物。對(duì)這些片段進(jìn)行凝膠切割，并使用QIA快速凝膠提取試劑盒(QIAGENInc.,Valencia,CA)依照制造商的指導(dǎo)進(jìn)行純化。然后使用TOPOTACloning⑧試劑盒(含pCR⑧2.1載體)和OneShotTOP10化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)依照制造商的方案將純化的片段克隆入pCR2.1質(zhì)粒中。C.基因型分型PCR產(chǎn)物的核苷S吏序列分析將實(shí)施例21B中所述個(gè)別菌落接種至14ml含2ml補(bǔ)充有50nl/ml卡那霉素的TB的Falcon管(Becton-Dickinson,FranklinLakes,NJ)中，并在以200rpm搖動(dòng)的情況下在37。C溫育16小時(shí)。溫育后，將1.5ml細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.7mlCostar微量離心管(FisherScientific,Pittsburgh,PA)中，并以16，000xg沉淀l分鐘。除去上清液，并使用NucleoSpin質(zhì)粒試劑盒(BDBiosciences/Clontech/Macherey-Nagel,PaloAlto,CA)如上文所述那樣分離質(zhì)粒DNA。用10個(gè)單位EcoRI(NewEnglandBioLabs,Beverly,MA)消化3pg分離的質(zhì)粒。將所有的質(zhì)粒消化物在37。C溫育l小時(shí)。在補(bǔ)充有0.5。/。溴化乙錠的1.0。/oTAE瓊脂糖凝膠中在100V對(duì)限制性DNA電泳1小時(shí)。用紫外線顯現(xiàn)片段，并通過(guò)與1KbpPlusDNA梯(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)比較來(lái)估計(jì)片段大小。根據(jù)3.9KbppCR⑧2.1載體外的插入DNA片段的存在來(lái)判斷質(zhì)?？寺　Ｊ褂肅EQTMDTCS-快速開(kāi)始試劑盒(Beckman-Coulter,PaloAlto,CA)如制造商所述的那樣實(shí)施質(zhì)?？寺〉碾p鏈測(cè)序反應(yīng)。使用PerformaDTR凝膠過(guò)濾筒(EdgeBioSystems，Gaithersburg，MD)如制造商的方案所述的那樣純化反應(yīng)。在Beckman-CoulterCEQTM2000XLDNA分析系統(tǒng)上分析序列反應(yīng)，并使用SequencherTM4丄4版(GeneCodesCorporation,AnnArbor,MI)來(lái)進(jìn)行核芬酸表征。使用VectorNTi10.l版(Invi加genLifeTechnologies,Carlsbad,CA)進(jìn)行核苷酸比對(duì)。還獲得涵蓋自多個(gè)靶向整合事件衍生的在上游(5，-)IPP2K基因組序列和供體DNA之間的邊界的序列數(shù)據(jù)，包括涵蓋自多個(gè)靶向整合事件衍生的在供個(gè)轉(zhuǎn)化胼胝體事件(#114)衍生的上游(5，-)邊界序列的序列數(shù)據(jù)。轉(zhuǎn)化的靶向整合事件(#114)是自主供體整合至IPP2K基因靶物中的結(jié)果。在這些分析中，初次的和再次的PCR擴(kuò)增反應(yīng)兩者都聚焦于基因組和供體之間的5，或3，邊界。與這些再次擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的克隆片段與野生型IPP2K基因組序列以及靶向整合事件的預(yù)期序列的比對(duì)揭示在靶位點(diǎn)發(fā)生供體DNA的整合。IPP2K基因組基因座的核苷酸序列、基因組/供體邊界、與IPP2K同源性側(cè)翼對(duì)應(yīng)的供體區(qū)域的核香酸序列和除草劑耐受盒的核香酸序列均保存在自該事件衍生的多個(gè)克隆PCR產(chǎn)物中。因此，該事件代表在特定基因靶物處發(fā)生了ZFN介導(dǎo)的雙鏈斷裂的同源性驅(qū)動(dòng)修復(fù)的基因組。已經(jīng)獲得了代表發(fā)生獨(dú)特靶向整合的別的轉(zhuǎn)化事件，證實(shí)本文所教導(dǎo)的方法在玉米胼胝體中是可再現(xiàn)的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可將這些方法應(yīng)用于任何植物物種中認(rèn)為想要靶向整合的任何基因靶物。實(shí)施例22:從玉米胼胝體組織再生能育的完整植抹可將自HiII細(xì)胞培養(yǎng)物衍生的、除草劑耐受的玉米細(xì)胞的分離的胼胝體再生為完整的、能育的玉米植抹。本領(lǐng)域技術(shù)人員可從多種胚發(fā)生玉米細(xì)胞培養(yǎng)物再生完整的、能育的玉米植才朱。在本實(shí)施例中，通過(guò)將分離的胼胝體組織轉(zhuǎn)移至基于細(xì)胞分裂素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基28(1H)來(lái)啟動(dòng)分離的、Bialophos抗性的HiII胼胝體的再生，所述基于細(xì)胞分裂素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基28(1H)包含MS鹽類和維生素、30.0g/L蔗糖、5mg/L千氨基噪呤、0.25mg/L2,4-D、lmg/LBialaphos、和2.5g/LGelrite;pH5.7。容許細(xì)胞在低光照(13|LiEm-2s-l)中生長(zhǎng)l周，接著轉(zhuǎn)移至較高光照條件(40pEm-2s-l)達(dá)l周。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基36(1H)，其與誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同，只是其缺乏植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。用手工工具切出小的(3-5cm)小植林，并放入包含SHGA培養(yǎng)基(Schenk和Hildebrandt基礎(chǔ)鹽類和維生素，1972,Can.J.Bot50:199-204;lg/L肌肉-月幾醇、10g/L蔗糖、2.0g/LGelrite,pH5.8)的無(wú)菌150x25-mm玻璃培養(yǎng)管中。一旦小植抹發(fā)育為足夠大的且分化的根系和莖軸系，將它們移植入裝有Metro-Mix360生長(zhǎng)培養(yǎng)基(SunGroHorticultureCanadaLtd.)的4英寸罐中，并放置在溫室中。用透明的塑料杯完全或部分覆蓋小植抹達(dá)2-7天，然后移植至裝有由95%Metro-Mix360生長(zhǎng)培養(yǎng)基和5%粘土"裏土組成的混合物的5加侖罐，并培養(yǎng)至成熟?？蓪?duì)植抹進(jìn)行自花傳粉或與近交系進(jìn)行異花傳粉以分別產(chǎn)生T1或F1種子。本領(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)再生的植株進(jìn)行自花傳粉或者將再生的植抹與多種種質(zhì)進(jìn)行異花傳粉以實(shí)現(xiàn)玉米育種。可以在美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)文本US-2003-0232410;US-2005-0026157;US-2005-0064474;US-2005-0208489及US-2006-0188987;和2006年7月26日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)11/493,423中找到與靶向切割、靶向重組及靶向整合相關(guān)的別的信息，通過(guò)提及而完整收錄這些申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容以用于所有目的。以此通過(guò)提及而完整收錄本文中所提及的所有專利、專利申請(qǐng)和出版物以用于所有目的。盡管為了理解清楚的目的已經(jīng)較詳細(xì)地通過(guò)舉例說(shuō)明來(lái)提供公開(kāi)內(nèi)容，但是對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，可以在不背離本公開(kāi)內(nèi)容的精神或范圍的前提下實(shí)施各種變化和修飾。因而，以上說(shuō)明書(shū)和實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)解釋為限制。權(quán)利要求1.一種鋅指蛋白，其包含非規(guī)范(非C2H2)鋅指，其中所述非規(guī)范鋅指具有牽涉DNA結(jié)合的螺旋部分且其中所述螺旋部分的鋅配位區(qū)包含氨基酸序列HX1X2RCXL(SEQIDNO2)；且其中所述鋅指蛋白被改造成結(jié)合靶序列。2.權(quán)利要求l的鋅指蛋白，其中X1是A,而X2是Q。3.權(quán)利要求l的鋅指蛋白，其中X1是K，而X2是E。4.權(quán)利要求l的鋅指蛋白，其中X1是T,而X2是R。5.權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的鋅指蛋白，其中XL是G。6.權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的鋅指蛋白，其中至少一個(gè)鋅指包含序列Cys陽(yáng)(XA)2-4-Cys畫(huà)(XB)12陽(yáng)His-(XC)3-5-Cys-(XD)1-10(SEQIDNO:3),其中XA、XB、XC和XD可以是任何氨基酸。7.權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)的鋅指蛋白，其包含表l、表2、表3或表4任一中所示任一序列。8.權(quán)利要求6或7的鋅指蛋白，其中XD包含序列QLV或QKP。9.權(quán)利要求8的鋅指蛋白，其中所述序列QLV或QKP是所述鋅指的3個(gè)C端氨基酸殘基。10.權(quán)利要求6至9任一項(xiàng)的鋅指蛋白，其中XD包含1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)Gly(G)殘基。11.一種鋅指蛋白，其包含多個(gè)鋅指，其中至少一個(gè)鋅指包含依照權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)的CCHC鋅指。12.權(quán)利要求ll的鋅指蛋白，其中所述鋅指蛋白包含3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)或6個(gè)鋅指。13.權(quán)利要求11或12的鋅指蛋白，其中指2包含所述CCHC鋅指。14.權(quán)利要求11至13任一項(xiàng)的鋅指蛋白，其中C端鋅指包含所述CCHC指。15.權(quán)利要求11至14任一項(xiàng)的鋅指蛋白，其中至少兩個(gè)鋅指包含所述CCHC鋅指。16.權(quán)利要求11至15任一項(xiàng)的鋅指蛋白，其中所述鋅指蛋白包含表8中所示任一序列且被改造成結(jié)合IPP2-K基因中的靶序列。17.—種融合蛋白，其包含權(quán)利要求1至16任一項(xiàng)的鋅指蛋白和一個(gè)或多個(gè)功能域。18.—種融合蛋白，其包含(a)切割半結(jié)構(gòu)域，(b)權(quán)利要求1至16任一項(xiàng)的鋅指蛋白，和(c)插入所述切割半結(jié)構(gòu)域和所述鋅指蛋白之間的ZC接頭。19.權(quán)利要求18的融合蛋白，其中所述ZC接頭的長(zhǎng)度是5個(gè)氨基酸。20.權(quán)利要求19的融合蛋白，其中所述ZC接頭的氨基酸序列是GLRGS(SEQIDNO:4)。21.權(quán)利要求18的融合蛋白，其中所述ZC接頭的長(zhǎng)度是6個(gè)氨基酸。22.權(quán)利要求21的融合蛋白，其中所述ZC接頭的氨基酸序列是GGLRGS(SEQIDNO:5)。23.—種多核苷酸，其編碼依照權(quán)利要求1至16任一項(xiàng)的鋅指蛋白或依照權(quán)利要求17至22任一項(xiàng)的融合蛋白。24.—種用于在植物細(xì)胞中耙向切割細(xì)胞染色質(zhì)的方法，所述方法包括在所述細(xì)胞中表達(dá)一對(duì)依照權(quán)利要求18至22任一項(xiàng)的融合蛋白，其中(a)所述融合蛋白的靶序列彼此相距10個(gè)核苷酸之內(nèi)；且(b)所述融合蛋白二聚化，并切割位于所述靶序列之間的DNA。25.—種在宿主植物細(xì)胞中靶向遺傳重組的方法，所述方法包括(a)在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)一對(duì)依照權(quán)利要求18至22任一項(xiàng)的融合蛋白，其中所述融合蛋白的靶序列存在于選定的宿主靶基因座中；并(b)鑒定在所述宿主靶基因座中展現(xiàn)出序列改變的重組宿主細(xì)胞。26.權(quán)利要求24或25的方法，其中所述序列改變是選自下組的突變遺傳物質(zhì)的刪除、遺傳物質(zhì)的插入、遺傳物質(zhì)的替代及其任何組合。27.權(quán)利要求24至26任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括將外源多核苷酸導(dǎo)入所述宿主細(xì)胞中。28.權(quán)利要求27的方法，其中所述外源多核苷酸包含與所述宿主靶基因座同源的序列。29.權(quán)利要求24至28任一項(xiàng)的方法，其中所述植物選自下組單子葉植物、雙子葉植物、棵子植物和真核藻類。30.權(quán)利要求29的方法，其中所述才直物選自下組玉米、稻、小麥、馬鈴薯、大豆、番茄、煙草、蕓苔科成員、和擬南芥屬。31.權(quán)利要求24至29任一項(xiàng)的方法，其中所述植物是樹(shù)。32.權(quán)利要求24至31任一項(xiàng)的方法，其中所述耙序列在IPP2Kj^因中。33.—種用于降低種子中植酸水平的方法，所述方法包括依照權(quán)利要求32滅活或改變IPP2-IC基因。34.—種用于使磷在種子中更能被代謝利用的方法，所述方法包括依照權(quán)利要求32滅活或改變IPP2-IC基因。35.—種植物細(xì)胞，其包含依照權(quán)利要求1至16任一項(xiàng)的鋅指蛋白、依照權(quán)利要求17至22任一項(xiàng)的融合蛋白、或依照權(quán)利要求23的多核苷酸。36.權(quán)利要求35的植物細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是種子。37.權(quán)利要求36的植物細(xì)胞，其中所述種子是玉米種子。38.權(quán)利要求35至37任一項(xiàng)的植物細(xì)胞，其中IPP2-K是被部分或完全滅活的。全文摘要本文中所公開(kāi)的是包含CCHC鋅配位殘基的鋅指。還描述了包含這些CCHC鋅指的鋅指蛋白和融合蛋白以及編碼這些蛋白質(zhì)的多核苷酸。還描述了使用這些蛋白質(zhì)進(jìn)行基因編輯和基因調(diào)控的方法。文檔編號(hào)C12N15/62GK101668856SQ200780051258公開(kāi)日2010年3月10日申請(qǐng)日期2007年12月13日優(yōu)先權(quán)日2006年12月14日發(fā)明者喬恩·C·米歇爾,其華·C·蔡,妮科爾·L·阿諾德,杰弗里·米勒,瑞安·C·布盧,約瑟夫·F·皮托利諾,維普拉·K·舒克拉,羅比·J·加里森,莉薩·W·貝克,菲奧多·厄諾夫,薩拉·E·沃登申請(qǐng)人:陶氏益農(nóng)公司;桑格摩生物科學(xué)股份有限公司