專利名稱：Tnf超家族受體的剪接轉換寡聚物，以及它們治療疾病的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及體內或體外制備TNF α受體(TNFR)的剪接變體的組合物和方法，以及 所得到的TNFR蛋白質變體。利用剪接轉換(splice switching)寡核苷酸或剪接轉換寡聚 物(SSOs)控制前信使RNA分子的剪接和調節(jié)蛋白質的表達可以制備這種變體。依照本發(fā) 明的優(yōu)選的 SSOs 靶向 TNFRl (TNFRSF1A)或 TNFR2 (TNFRSF1A)前信使 RNA (pre-mRNA)的夕卜 顯子7或8，典型地會導致產生分別包含部分或全部外顯子7或8缺失的TNFR變體。發(fā)現(xiàn) 靶向外顯子7的SSOs會產生治療炎性疾病的具有治療用途的可溶形式的TNFR。SSO的特 征在于它們基本上不能或不能補充RNaseH。
背景技術：
在此引入作為參考的W02007/05889記載了與前信使RNA剪接、TNF-α在炎癥和 炎性病癥中的作用以及經由TNFl和TNF2介導的TNF- α活性的媒介作用有關的背景技術。TNF-α是以膜結合的同型三聚體形式存在的炎性細胞因子原，由蛋白酶TNF-α 轉換酶(TACE)釋放到循環(huán)中。被引入循環(huán)中的TNF-α是損傷和感染引起的炎性反應的 介質。炎性疾病，例如類風濕性關節(jié)炎、Crohn氏病、潰瘍性結腸炎、牛皮癬和牛皮癬關節(jié)炎 的進展都涉及 TNF-α 的作用(Palladino, Μ. A.，et al.，2003，Nat. Rev. Drug Discov. 2 736-46)。短時間(acute)接觸高水平的TNF-α將導致膿毒癥發(fā)生，這一現(xiàn)象在重感染期 間已經發(fā)生；膿毒癥的癥狀包括休克、缺氧、多器官衰竭和死亡。長期(chronic)低劑量的 TNF-α可以導致一種特征在于體重減輕、脫水和脂肪減少的與惡性腫瘤有關的疾病一惡 病質。TNF-α的活性主要由兩個不同基因TNFRl和TNFR2編碼的兩個受體介導。TNFRl 是分子量為大約55千道爾頓(kDa)的膜結合蛋白，而TNFR2是分子量為75kDa的膜結合 蛋白。在金屬蛋白酶的作用下，兩個受體的可溶性細胞外域在一定程度上可以從細胞膜上 脫落下來。此外，TNFR2的前信使RNA進行選擇性剪接，可以產生有活性的全長膜結合受 體(mTNFR2)或缺乏外顯子7和8的包含跨膜區(qū)的編碼序列的被分泌的假(decoy)受體 (sTNFR2)。STNFR2結合TNF-α，但不引發(fā)生理反應，因此會降低TNF-α的活性。雖然還沒 有鑒定內源性的被分泌的TNFRl剪接變體，但這兩個受體相似的基因結構明確表明存在產 生這種TNFRl同種型(isotype)的可能性。TNF超家族成員活性過強所產生的效應，導致控制TNFR受體的可選擇性剪接是有 用的，這樣分泌形式的量就增加了，完整膜形式的量就減少了。本發(fā)明提供了實現(xiàn)這一目標 的剪接轉換寡核苷酸或剪接轉換寡聚物(SSOs)。SSOs類似于反義寡核苷酸(ASONs)。然 而，與ASON相反，SSOs能與靶RNA雜交，但不會導致靶RNA被RNase H降解。SSOs已經被用于修飾某些地中海貧血中發(fā)現(xiàn)的異常剪接(KoIe的美國專利No. 5，976，879 ；Lacerra, G.，et al.，2000，Proc. Natl. Acad. Sci. 97 9591)。對 IL-5 受體 α-鏈(IL-5RCI)的研究表明靶向跨膜外顯子的SSOs會增加分泌形式的合成，同時會抑制 完整膜形式的合成(Bennett 的美國專利 No. 6，210，892 ；Karras, J. G.，et al.，2000，MoL Pharm, 58 380)。W000/58512也公開了將IL-5R剪接修改為可溶形式的實施例(實施例25 和 30)。SSOs已經被用于產生Tone中檢測到的主要的⑶40剪接變體，Tone中跨膜區(qū)上游 的外顯子6的缺失導致蛋白質的閱讀框發(fā)生了改變。在SSO產生預期的mRNA剪接變體時， 變體mRNA的翻譯產品也變得好象不穩(wěn)定，因為沒有檢測到分泌的受體(Siwkowski，A.M.， et al. ,2004,Nucleic Acids Res. 32 ;2695)。Tone et al.，PNAS，2001，98(4) :1751_1756 預計缺乏外顯子6的小鼠剪接變體不是穩(wěn)定的分泌形式的⑶40 (參見1756頁，右欄)。W002/088393公開了具有2' MOE翼和脫氧缺口的靶向小鼠TNFR2的gapmer寡核 苷酸，這些寡核苷酸被用來補充(recruit) RNAseH以降解TNFR2mRNA(mRNA下調)。本發(fā)明 的SSO寡核苷酸不是設計用來用來補充RNaseH的，而是用來破壞TNFR前信使RNA的加工 的，因此會導致產生穩(wěn)定分泌形式的結合配體的TNFR剪接變體。 US2005/202531教導了反義寡核苷酸可以用來改變⑶40的可選擇的剪接模式的 內容，但它沒有教導或提供任何有關應被SSOs靶向的CD40剪接元件或區(qū)域的啟示，也沒有 教導或提供任何有關應該使用哪個序列的啟示。發(fā)明概述本發(fā)明使用剪接轉換寡核苷酸或剪接轉換寡聚物(SSOs)控制來自TNFR超家族受 體的可選擇性剪接，這樣，被分泌的穩(wěn)定可溶的配體結合形式的數(shù)量就增加了，完整膜形式 的數(shù)量就減少了。本發(fā)明提供了長度在8和16個核苷酸堿基之間的寡聚物，包含由長度在8和16個 堿基之間的核苷酸組成的毗連(contiguous)核堿基序列，其中所述的毗連核堿基序列與 SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3或SEQ ID N04中存在的毗連核苷酸的對應區(qū)域 互補，而且所述的毗連核堿基序列不包含5個或5個以上毗連的DNA (2’ -脫氧核糖核苷) 單體單位，其包含選自由β -D-氧LNA，硫代-LNA，氨基-LNA和ena-LNA組成的組的至少一 個核苷酸類似物。任選地，在上述實施方案中，Btt連核堿基序列包含或由至少一個更進一步另外的 (further)核苷酸類似物(X)組成。在一個實施方案中，更進一步的核苷酸類似物單位獨立地選自由2' -OMe-RNA單 位，2 ‘-氟-DNA單位，2 ‘ -MOE RNA單位和LNA組成的組。在一個實施方案中，寡聚物或毗連核堿基序列由長度在8和15個堿基之間的核堿 基序列組成，例如，由9、10、11、12、13或14個核堿基組成。在一個實施方案中，Btt連核堿基序列與選自由SEQ ID NO 131-SEQ IDNo 145,SEQ ID NO 147-SEQ ID NO 161和SEQ ID NO 163-177組成的組的核堿基序列或核堿基基序相 同，或者存在于其中。在一個實施方案中，寡聚物選自由SEQ ID NO 245-SEQ ID NO 246、SEQ ID NO 251-263、SEQ ID NO 264-SEQ ID NO 279 和 SEQ ID N0280-SEQ ID NO 295 組成的組。在一個實施方案中，所述的毗連核堿基序列與選自由SEQ ID NO 130、SEQ ID NO146和SEQ ID NO 162組成的組的核堿基序列或核堿基基序相同，或者存在于其中。在一個實施方案中，寡聚物選自由SEQ ID NO 244、SEQ ID NO 264和SEQ ID NO 280組成的組。本發(fā)明涉及剪接轉換寡核苷酸或剪接轉換寡聚物(SSOs)。依照本發(fā)明的優(yōu)選的 SSOs靶向TNFRl (TNFRSF1A)或TNFR2 (TNFRSF1A)前信使RNA的外顯子7，典型地會導致 產生分別包含部分或全部外顯子7缺失的TNFR變體。發(fā)現(xiàn)靶向外顯子7的SSOs會產生 治療炎性疾病的具有治療用途的可溶形式的TNFR。SSO的特征在于它們基本上不能補充 (recruiting)RNaseH0本發(fā)明提供了長度在8和50個核苷酸堿基之間的寡聚物，例如長度在 8和16個 核苷酸堿基之間的寡聚物，包含(或由其組成)由長度在8和50個堿基之間的核苷酸組成 的毗連核堿基序列，其中所述的毗連核堿基序列與SEQID NO 1,SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3 或SEQ ID NO 4中存在的毗連核苷酸的對應區(qū)域互補，優(yōu)選完全互補，而且所述的毗連核堿 基序列不包含5個或5個以上毗連的DNA(2’ -脫氧核糖核苷)單體單位。SEQ ID NO USEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3 或 SEQ ID NO 4 與 PCT/US2006/043651 中的 SEQ ID NO U SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3 或 SEQID NO 4 相同。SEQ ID NO 247 與 SEQ ID NO 1 反向互補。SEQ ID NO 248 與 SEQ ID N02 反向互 補。SEQ IDNO 249 與 SEQ ID NO 3 反向互補。SEQ ID NO 250 與 SEQID NO 4 反向互補。因此，本發(fā)明優(yōu)選包含或由與SEQ ID NO 247、SEQ ID NO 248、SEQID NO 249或 SEQ ID NO 250的對應區(qū)域(即一部分)同源(優(yōu)選100%同源)的毗連核堿基序列組成 的寡聚物。本發(fā)明提供了長度在8和50個核苷酸堿基之間的寡聚物，包含(或由其組成)由 長度在8和50個堿基之間的核苷酸組成的毗連核堿基序列，其中所述的毗連核堿基序列存 在于 SEQ ID NO 247，SEQ ID NO 248，SEQ ID NO 249 或 SEQ ID NO 250 中存在的毗連核苷 酸的(對應)區(qū)域，而且所述的毗連核堿基序列不包含5個或5個以上毗連的DNA(2’ -脫 氧核糖核苷)單體單位。本發(fā)明提供了長度在8和50個核苷酸堿基(nucleobase)之間的寡聚物，包含(或 由其組成)由長度在8和50個核堿基之間的核苷酸組成的毗連核堿基序列，其中所述的毗 連核堿基(nucleobase)序列與 SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3 或 SEQ ID NO 4 中存在的毗連核苷酸的對應區(qū)域互補，優(yōu)選完全互補，當在具有互補mRNA分子的復合物的 雙鏈體(duplex)中形成時，其中所述的寡聚物基本上不能或不能補充RNAseH。本發(fā)明提供了長度在8和50個核堿基之間的寡聚物，包含(或由其組成)由長度 在8和50個堿基之間的核苷酸組成的毗連核堿基序列，其中所述的毗連核堿基序列存在于 SEQ ID NO 247，SEQ ID NO 248，SEQ ID NO 249 或 SEQ ID NO 250 中存在的毗連核苷酸的 (對應)區(qū)域，其中當在具有互補mRNA分子的復合物的雙鏈體中形成時，所述的寡聚物基本 上不能或不能補充RNAseH。更進一步地，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的寡聚物和共價附著于所述寡聚物的至少 一個非核苷酸部分的偶聯(lián)物。更進一步地，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的寡聚物或偶聯(lián)物，以及藥學上可接受的 載體的藥物組合物。
更進一步地，本發(fā)明提供了改變TNFa受體前信使RNA mRNA剪接的方法，其中前 信使RNA mRNA選自表達TNFRSFIA TNFa受體或TNFRSF1BTNF α受體的哺乳動物細胞中的 TNFRSF1A或TNFRSF1A，所述方法包括給細胞施用本發(fā)明的寡聚物、偶聯(lián)物或藥物組合物。本發(fā)明也涉及了在表達所述TNF α受體的哺乳動物細胞中制備TNFRSF1A TNFa 受體或TNFRSF1B TNFa受體的可溶形式的方法，所述方法包括給細胞施用本發(fā)明的寡聚 物、偶聯(lián)物或藥物組合物。上述方法可以更進一步地包括純化TNFRSF1A TNFa受體或TNFRSF1BTNF α受體 的可溶形式的步驟。本發(fā)明也提供了在表達所述TNF α受體的哺乳動物細胞中增加TNFRSF1A TNFa 受體或TNFRSF1B TNFa受體的可溶形式表達的方法，所述方法包括給細胞施用本發(fā)明的寡 聚物、偶聯(lián)物或藥物組合物。上述方法可以在體內或體外實施。 本發(fā)明提供了用本發(fā)明的寡聚物制備用于治療炎性疾病或狀態(tài)(condition)的 藥物制劑的用途。本發(fā)明提供了用于治療炎性疾病或狀態(tài)的偶聯(lián)物。本發(fā)明提供了治療或預防炎性疾病或狀態(tài)的方法，所述方法包括給患有或很可能 患有所述炎性疾病的病人施用本發(fā)明的藥物組合物的步驟。本發(fā)明提供了在外顯子7編碼的跨膜結合域包含缺失的TNF α受體的分離或純化 的可溶形式，其中所述TNF α受體選自TNF α受體TNFRSF1A或TNFRSF1B。本發(fā)明提供了缺乏外顯子7編碼的跨膜結合域的TNF α受體的分離或純化的可溶 形式，其中所述TNF α受體選自TNF α受體TNFRSF1A或TNFRSF1B。本發(fā)明更進一步地提供了編碼TNF α受體的可溶形式的核酸。本發(fā)明更進一步地提供了包含本發(fā)明的核酸的載體，例如表達載體。本發(fā)明更進一步地提供了包含本發(fā)明的核酸或載體的宿主細胞。本發(fā)明更進一步地提供了制備可溶形式的TNFa受體的方法，所述方法包括在允 許本發(fā)明的核酸表達的條件下培養(yǎng)本發(fā)明宿主細胞的步驟，以及隨后從所述宿主細胞分離 所述的可溶形式的TNF α受體的步驟。本發(fā)明更進一步地提供了包含本發(fā)明的分離或純化的可溶形式的TNFa受體或 依照本發(fā)明的方法制備的TNFa受體，以及藥學上可接受的載體的藥物組合物。本發(fā)明更進一步地提供了利用本發(fā)明的分離或純化的可溶形式的TNFa受體或 依照本發(fā)明的方法制備的TNFa受體制備用于治療炎性疾病或狀態(tài)的藥物制劑的用途。本發(fā)明更進一步地提供了本發(fā)明的分離或純化的可溶形式的TNFa受體或依照 本發(fā)明的方法制備的TNFa受體用于治療炎性疾病或狀態(tài)的用途。相關案件PCT/US2006/043651、PCT/US2007/10557、US 11/595，485 和 US 11/799，117在此都全部引入作為參考。附圖簡述下列附圖與PCT/US2007/10557中描述的那些附圖相同。圖20對本申請來說是新 的。

圖1概略地描述了人TNFR2的結構。相應的外顯子和內含子分別用盒(box)和線代表。信號序列和跨膜區(qū)域用陰影表示。形成信號序列和跨膜區(qū)邊界的殘基，以及最后的 殘基在圖下面標出。外顯子邊界在圖上面標出；如果外顯子的3’端和下面外顯子的5’端 具有相同的殘基編號，那么剪接接點將位于編碼該殘基的密碼子內。圖2A用圖表解釋了來自SSO處理的原代(primary)人肝細胞的可溶性TNFR2的 數(shù)量。所標示的SSO以50nM的濃度被轉染到原代人肝細胞中。48小時之后，利用從R&D 系統(tǒng)(Minneapolis，MN)獲得的Quantikine 人 sTNFRII ELISA 試劑盒(Quantikine(R) Human sTNF RII ELISA kit)，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)分析細胞外培養(yǎng)基中的可溶 性TNFR2。誤差線表示3個獨立實驗的標準差。圖2B利用人TNFR2特異的引物，通過RT-PCR 分析總RNA中的TNFR2的剪接轉換。靶向外顯子七的SSOs導致從全長TNFR2mRNA (FL)轉 變成TNFR2 Δ 7mRNA ( Δ 7)。SSO 3083是沒有TNFR2剪接轉換能力的對照SS0。圖3顯示了用靶向小鼠TNFR2外顯子7的SSO 10-mers處理的L929細胞的剪接產 物。用標示的SSO濃度(50或IOOnM)轉染L929細胞，并在24小時后用RT-PCR評估TNFR2 的剪接轉換。PCR引物用來擴增外顯子5到外顯子9，這樣486bp的條帶就可以代表"全 長〃(FL)TNFR2。408bp的條帶代表缺乏外顯子7(Δ7)的轉錄產物。 圖4Α和4Β顯示了用靶向小鼠TNFR2外顯子7的SSO 10-mers處理的小鼠的剪接 產物。先將標示的SSOs再次懸浮在鹽水中，然后以25mg/kg/天的劑量通過腹腔(i. p.)注 射到小鼠體內，共注射5天。在SSO注射之前，以及最后的SSO注射之后的10天對小鼠進 行預放血處理，并處死小鼠。在處死小鼠時，通過RT-PCR分析來自肝臟的總RNA中的TNFR2 剪接轉換。FL-全長 TNFR2 ； Δ 7-TNFR2 Δ 7 (圖 4Α)。利用從 R&D 系統(tǒng)(Minneapolis，MN) 獲得的Quantildne 小鼠 sTNF RII ELISA 試劑盒(Quantikine(R)Mouse sTNF RIIELISA kit)，通過ELISA確定在SSO注射之前(前)和之后(后)所獲得的血清中的TNFR2A7的 濃度(圖4B)。誤差線表示來自相同樣品的3個獨立讀數(shù)的標準差。圖5描述了不同長度的SSOs的剪接轉換能力。與圖2相同，用標示的SSO轉染原 代人肝細胞并通過RT-PCR(上部網格)和ELISA(下部網格)分析TNFR2的表達。誤差線 表示來自2個獨立實驗的標準差。圖6A和6B圖解了 SSO處理小鼠肝臟中的TNFR2 Δ 7mRNA的誘導情況。圖6A 對 來自SSO 3274處理小鼠肝臟的總RNA進行RT-PCR分析，在1. 5 %的瓊脂糖凝膠上使產物顯 影。外顯子6-外顯子8接合點的序列顯示在圖6B中。圖7A和7B圖解了 SSO處理的原代人肝細胞中的TNFR2 Δ 7mRNA的誘導情況。圖 7A 對來自SSO 3379處理細胞的總RNA進行RT-PCR分析，在1. 5%的瓊脂糖凝膠上使產物 顯影。外顯子6-外顯子8接合點的序列顯示圖7B中。圖8A和8B圖解說明了 SSO 3378、3379和3384所產生的TNFR2前信使RNA剪接轉 換的劑量依賴性。用所示的1-150ηΜ的SSO轉染原代人肝細胞。48小時后，收獲細胞以獲 取總RNA，并收集細胞外培養(yǎng)基。圖8A 利用人TNFR2特異的引物，通過RT-PCR分析總RNA 中的TNFR2的剪接轉換。對每種SS0，都以剪接轉換數(shù)量作為SSO濃度的函數(shù)進行繪圖。圖 8B 通過ELISA確定細胞外培養(yǎng)基中的可溶性TNFR2的濃度，并將其作為SSO的函數(shù)繪圖。 誤差線表示至少2個獨立實驗的標準差。圖9圖解說明了來自L929細胞的分泌的TNFR2剪接變體的檢測情況。用標示的 SSOs轉染細胞。72小時以后，除去細胞外培養(yǎng)基并通過ELISA進行分析。數(shù)據(jù)表示為pg可溶性TNFR2/mL。圖10顯示了腹腔內(i.p.)注射SSO 3274 (上部)和3305 (底部)的小鼠體內的 剪接產物。以25mg/kg/天的劑量腹膜內注射SSO 32744天(4/1和4/10)或10天(10/1)。 在最后一次注射后1天(4/1和10/1)或10天(4/10)處死小鼠，并通過RT-PCR分析來自 肝臟的總RNA中的TNFR2剪接轉換。每天按照標示劑量注射SSO 3305，共注射4天。第二 天處死小鼠，并采用與3274處理動物相同的方法分析肝臟。圖IlA圖解說明了 SSO處理10天后的小鼠血清中的可溶性TNFR2的數(shù)量。以 25mg/kg/天的劑量給小鼠腹膜內注射標示的SSO或生理鹽水(每組η = 5)，共10天。在 注射開始前4天和最后一次注射后所標示的天數(shù)收集血清。在第10天，通過圖22描述的 ELISA方法分析血清，處死小鼠并按照圖30的描述通過RT-PCR分析肝臟的TNFR2的剪接轉 換(圖11Β)。
圖12Α圖解了 SSO處理27天后的小鼠血清中的可溶性TNFR2的數(shù)量。采用圖11 的描述處理小鼠，除了在最后一次注射后的第27天收集血清樣品外。SSOs 3083和3272是 沒有TNFR2剪接轉換能力的對照。在第27天，處死小鼠并按照圖11的描述通過RT-PCR分 析肝臟的TNFR2的剪接轉換(圖11Β)。圖13Α和13Β描述了以細胞為基礎的測試中，來自SSO處理小鼠的血清的抗 TNF-α活性，其中在SSO處理后第5天(圖16Α)和第27天(圖16Β)收集血清樣品。用 0. Ing/mL的TNF- α，或TNF- α ]和從標示SSO處理小鼠獲取的10%血清處理L929細胞。 24小時后測量細胞生存能力，并參照未處理細胞將其標準化。圖14利用圖13中描述的細胞存活試驗，比較了來自標示SSO寡核苷酸處理小鼠 血清的抗TNF-alpha活性與來自Sigma 和Enbrel 的重組的可溶性TNFR2 (rsTNFR2)細 胞外域的活性。圖15A和15B比較了 muTNFR2 Δ 7蛋白質(圖15A)禾口 mRNA(圖15B)的穩(wěn)定性。以 25mg/kg/天的劑量，每天給小鼠注射SSO 3272、SSO 3274或SSO 3305 (η = 5) 0最后一次 注射后，在所標示的那天對小鼠進行放血處理，并測量血清的TNFR2濃度。在最后一次注射 SSO后所標示的那一天處死小鼠，按照圖10的描述對獲得的總RNA進行RT-PCR分析。圖16描繪了最后一次注射10天后，分別以蛋白質或mRNA含量的百分比表示的 TNFR2 Δ 7蛋白質(虛線)和mRNA(實線)水平隨時間的變化。圖17圖解了用TNFR2 Δ 7哺乳動物表達質粒轉染后，HeLa細胞表達的TNFR2 Δ 7的 抗TNF-alpha活性的劑量依賴性。用標示的小鼠或人TNFR2 Δ 7轉染HeLa細胞，48小時后 收集細胞外培養(yǎng)基。通過ELISA確定培養(yǎng)基(media)中的TNFR2 Δ 7的濃度，并制備系列稀 釋液。通過圖14中的L929細胞毒性試驗測定這些稀釋液的抗TNF-alpha活性。圖18顯示了通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離的已表達的小鼠㈧和人(B) TNFR2D7蛋白。用標示的質粒轉染Hela細胞。48小時后，收集并濃縮細胞外培養(yǎng)基，并 將細胞收集在RIPA溶解緩沖劑中。通過PAGE分離樣品中的蛋白質，并利用識別人和小鼠 TNFR2D7蛋白質C末端的TNFR2第一抗體(Abeam)進行western印跡。培養(yǎng)基，用標示質 粒轉染的Hela細胞的細胞外培養(yǎng)基樣品；裂解物，用標示質粒轉染的Hela細胞的細胞裂解 物。CM，來自未轉染的Hela細胞的對照培養(yǎng)基；CL，來自未轉染的Hela細胞的對照細胞裂 解物。+，分子量標記(kDal)。
圖19顯示了純化的His標記的人和小鼠TNFR2D7。按照圖18制備包含標示的 TNFR2D7蛋白質的未濃縮的細胞外培養(yǎng)基。大約32mL培養(yǎng)基被用到ImL HisPur鈷離心柱 (HisPur cobalt spin column) (Pierce)上，用包含150mM咪唑的ImL緩沖劑洗脫結合的蛋 白質。通過PAGE分析每個樣品，按照圖18進行western印跡分析。1144-4和1319-1道的 多條條帶表明出現(xiàn)了不同糖基化形式的TNFR2D7。圖20本發(fā)明的寡聚物基序與它們的靶序列SEQ ID NO 1 (圖20A)、SEQID NO 2 (圖 20B)、SEQ ID NO 3(圖 20C)和 SEQ ID NO 4(圖 20D)的比對。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了通過控制編碼TNF受體(TNFR1和TNFR2)和來自TNFR超家族的其 他細胞因子受體的前信使RNA的剪接來控制所述受體表達的組合物和方法。更具體地說， 本發(fā)明導致分泌形式的表達增加，完整膜形式的表達減少。此外，本發(fā)明可用于治療與細胞 因子活性過度相關的疾病。存在于完整膜形式mRNA中，但從初級轉錄本(前信使RNA)中被除去以產生分泌 形式的mRNA的外顯子被稱為"跨膜外顯子"。本發(fā)明涉及與跨膜外顯子和/或受體前信使 RNA的鄰近內含子這兩者中的任何一個互補的核酸和核酸類似物。互補性可以以存在于覆 蓋剪接位點的前信使RNA序列中的序列為基礎，包括但不局限于，以覆蓋(或跨越span)外 顯子_內含子接合點的序列為基礎，或者單獨地以內含子的序列或外顯子的序列為基礎。存在本領域技術人員已知的幾種可選擇的化學過程0。一個重要的特征是能夠與 靶RNA雜交，不會導致靶被RNase H降解為2’ -脫氧寡核苷酸(“反義寡核苷酸"在下文 中被稱為"AS0N")。為了清楚起見，這種化合物將被稱為剪接-轉換寡聚物(SSOs)。本 領域技術人員能夠理解SSO包括，但是不局限于2’0_修飾的寡核苷酸、硫代磷酸核糖核苷、 以及肽核酸和缺乏基于呋核亞硝脲(ribofuranosyl)的連接的其他聚合物。本發(fā)明的一個實施方案涉及給病人或活的受試者施用SSOs以治療炎性疾病或狀 況的方法。施用的SSOs會改變前信使RNA的剪接，會產生編碼TNFR超家族受體的穩(wěn)定分 泌的配體結合形式的剪接變體，因此會降低配體結合受體的活性。在另一個實施方案中，本 發(fā)明涉及通過給細胞施用SSOs，在細胞中產生TNFR超家族受體的穩(wěn)定分泌的配體結合形 式的方法。本發(fā)明的一個實施方案涉及可以結合TNF的全長或成熟的蛋白質，其由來源于哺 乳動物TNFR基因的cDNA編碼，在該cDNA中，外顯子6的后面直接連接外顯子8，因此缺乏 外顯子7(" TNFR δ 7〃)。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含TNFR δ 7的藥物組合 物。在更進一步的實施方案中，本發(fā)明涉及通過施用包含TNFR δ 7的藥物組合物治療炎性 疾病或狀況的方法。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及編碼TNFR δ 7的核酸。在更進一步的實施方案 中，本發(fā)明涉及包含編碼TNFR δ 7的核酸的藥物組合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含編碼TNFR δ 7的核酸的表達載體。在更進一步的實施方案中，本發(fā)明涉及通過用包含編碼TNFR δ 7的核酸的表達載 體轉化哺乳動物細胞來增加哺乳動物血清中的可溶性TNFR水平的方法。在另一個實施方 案中，本發(fā)明涉及用包含編碼TNFR δ 7的核酸的表達載體轉化的細胞。在更進一步的實施方案中，本發(fā)明涉及在適合于表達TNFR δ 7情況下，通過培養(yǎng)用包含編碼TNFR 57的核酸的表達載體轉化的細胞來生產TNFR δ 7的方法。在另一個實施 方案中，本發(fā)明涉及通過施用包含編碼TNFR δ 7的核酸的表達載體來治療炎性疾病或狀況 (condition)的方法。在另一個實施方案中，公開了改變哺乳動物TNFR2前信使RNA剪接的能產生哺乳 動物TNFR2蛋白質的剪接轉換寡聚物(SSOs)，所述TNFR2蛋白質可以結合TNF，而且其外顯 子6的后面直接連接外顯子8，因此缺乏外顯子7 (“ TNFR2 δ 7")。本發(fā)明的一個實施方 案涉及給病人或活的受試者施用SSOs以治療炎性疾病或狀況的方法。所施用的SSOs能夠 改變哺乳動物TNFR2前信使RNA的剪接以產生TNFR2 δ 7。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉 及通過給細胞施用SSOs以在細胞中產生TNFR2 δ 7的方法。在此處的附圖和下文的說明書中將詳細討論本發(fā)明的上述目標及其他方面。
寡聚物在一個實施方案中，寡聚物由毗連的核酸堿基序列組成。然而，寡聚物可能包括側接在毗連的核酸堿基序列的5’或3’端的其他的核酸堿 基序列，或者5’和3’端的更遠的核酸堿基序列，這一點也是能夠想象到的。這些5’和/ 或3’'側接'區(qū)的合適長度為1、2、3、4、5或6個核酸堿基。在體內使用時，預計位于本發(fā) 明的寡聚物末端的DNA或RNA核堿基可以被內源性外切核酸酶從寡聚物上切割下來，因此， 包含側接的DNA或RNA單位不影響寡聚物的體內性能。在一個實施方案中，毗連核堿基序列3 ’末端側接了 1、2或3個DNA或RNA單位。 在固相合成寡聚物期間經常使用3’ DNA單位。在一個實施方案中，Btt連核堿基序列5’末端側接了 1、2或3個DNA或RNA單位。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了長度在8和50個核堿基之間的寡聚物，包含由 長度在8和50個堿基之間的核苷酸組成的毗連核堿基序列，其中所述的毗連核堿基序列與 存在于SEQ ID NO 1,SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4中的毗連核苷酸的對應區(qū) 域(即所述的毗連核堿基序列存在于SEQ ID NO 247，SEQ ID NO 248，SEQ ID NO 249或 SEQ ID NO 250中的毗連核苷酸區(qū)域(‘對應'或部分))互補，而且所述的毗連核堿基序 列不包含5個或5個以上毗連的DNA (2’ -脫氧核糖核苷)單體單位。在一個實施方案中，當寡聚物在具有互補mRNA分子的復合物的雙鏈體中形成時， 所述的寡聚物基本上不能補充RNAseH。在一個實施方案中，Btt連核堿基序列包含或由核苷酸類似物(X)組成。在一個實施方案中，核苷酸類似物⑴獨立地選自由2’ -0-烷基-RNA單位、 2 ‘ -OMe-RNA單位，2，-氨基-DNA單位、2 ‘-氟-DNA單位，LNA單位、PNA單位、HNA單位、 INA單位組成的組。在一個實施方案中，毗連核堿基序列包含核苷酸類似物(X)和核苷酸(X)。在一個實施方案中，Btt連核堿基序列不包含多于7個毗連核苷酸類似物單位(X) 的區(qū)域，例如不超過6個、不超過5個、不超過4個、不超過3個、不超過2個的毗連核苷酸 類似物單位(X)。在一個實施方案中，Btt連核堿基序列最靠近5’端(5’ most)的核堿基是核苷酸類 似物(X)。在一個實施方案中，Btt連核堿基序列最靠近5’端的核堿基是核苷酸單位(X)，例如DNA(2’ 一脫氧核糖核苷)單體單位。在一個實施方案中，Btt連核堿基序列最靠近3’端的核堿基是核苷酸類似物(X)。在一個實施方案中，Btt連核堿基序列最靠近3’端的核堿基是核苷酸單位(X)，例 如DNA(2’一脫氧核糖核苷)單體單位。在一個實施方案中，Btt連核堿基序列包含或由核苷 酸和核堿基的交替(alternating)序列組成。在一個實施方案中，核苷酸和核堿基的交替 序列選自由 Xx，xX，Xxx，xXx, xxX, XXx，XxX，xXX, XXXx，XXxX，XxXX，xXXX, xxxX, xxXx, xXxx, Xxxx，XXXXx, XXXxX，XXxXX, XxXXX, χΧΧΧΧ, χχχχΧ, χχχΧχ, χχΧχχ, χΧχχχ, Xxxxx 組成的組的 序列，其中所述的交替序列可任意重復。在一個實施方案中，在毗連核堿基序列的全長范圍內重復的序列，其中可以任意 截短5’和或3’端的重復。在一個實施方案中，單鏈寡核苷酸包含所述的至少一個LNA類似物單位和至少一 個不同于LNA的更進一步的核苷酸類似物單位。在一個實施方案中，單鏈寡核苷酸由至少一個X1X2X1或X2X1X2序列組成，其中X1 是 LNA, X2是不同于LNA的核苷酸類似物，例如2，-OMe RNA單位和2，-氟DNA單位。在一個實施方案中，單鏈寡核苷酸的核堿基序列由交替的(alternative)X1和X2 單位組成。在一個實施方案中，核苷酸類似物單位，例如X，獨立地選自由2’ -OMeRNA單位、 2，-氟-DNA單位和LNA單位組成的組。在一個實施方案中，核苷酸類似物單位(X)是LNA單位。在一個實施方案中，LNA單位選自由氧-LNA、氨基-LNA、硫代-LNA和ena_LNA組 成的組。在一個實施方案中，Btt連核堿基序列不包含毗連的由5個或5個以上獨立地選 自DNA和LNA單位的毗連核堿基組成的毗連子序列，其中存在于毗連子序列中的LNA呈 α -L-構型。在一個實施方案中，Btt連核堿基序列不包含毗連的由5個或5個以上獨立地選 自DNA和LNA單位的毗連核堿基組成的毗連子序列，其中存在于毗連子序列中的LNA是 α -L-氧-LNA。在一個實施方案中，所有LNA單位都是β -D構型。在一個實施方案中，毗連核堿基序列只由LNA和DNA單位組成。在一個實施方案中，毗連核堿基序列只由LNA和DNA單位組成。優(yōu)選β -D構型的 LNA單位，例如β-D-氧或β-D-硫代或β-D-氨基。在一個實施方案中，LNA選自由β -D-氧-LNA、β -D-硫代-LNA、β -D-氨基-LNA、 ena-LNA組成的組，任選地包括由α -L-氧-LNA、α -L-硫代-LNA或α -L-氨基-LNA組成 的組。在一個實施方案中，Btt連核堿基序列在8和16之間，例如長度為9、10、11、12、13、 14、15或16個核堿基，或者在10-14、11-14或12-14之間。在一個實施方案中，Btt連核堿基序列在8和15之間，例如長度為8、9、10、11、12、 13、14或15個核堿基。在一個實施方案中，Btt連核堿基序列包含與存在于SEQ ID NO 1或SEQID NO 3中的對應區(qū)域互補的核堿基，即存在于SEQ ID NO 247或SEQ ID N0249中的毗連核苷酸的 (對應)區(qū)域的核堿基。在一個實施方案中，B比連核堿基序列與選自由SEQ ID NO 1的51_164、SEQ ID NO 2的51-79、SEQ ID NO 3的51-127和SEQ ID NO 4的51-85所組成的組中的序列中存在 的毗連核苷酸的對應區(qū)域互補。在一個實施方案中，Btt連核堿基序列與選自由SEQ ID NO
1的 1-50、SEQ ID NO 1 的 165-215、SEQID NO 2 的 1-50、SEQ ID NO 2 的 80-130、SEQ ID NO 3 的 1-50、SEQ ID NO 3 的 128_178、SEQ ID NO 4 的 1-50 和 SEQ ID NO 4 的 86-136 所 組成的組中的序列中存在的毗連核苷酸的對應區(qū)域互補。在一個實施方案中，B比連核堿基序列包含與5’外顯子/內含子3’或3’內含子/ 外顯子5’邊界互補的核堿基序列。在一個實施方案中，5’外顯子/內含子3’或3’內含子/外顯子5’邊界選自由 SEQ ID NO 1 的核堿基 50-51、SEQ ID NO 1 的 164-165、SEQ ID NO 2 的 50-51、SEQ ID NO
2的 79-80、SEQ ID NO 3 的 51_52、SEQ ID NO 3 的 129_139、SEQ ID NO 4 的 50_51、SEQ ID No 4的81-82所組成的組。在一個實施方案中，B比連核堿基序列與選自由SEQ ID NO 74到SEQ IDN0105組成 的組的序列中存在的核堿基序列相同，或者存在于該序列中。在一個實施方案中，Btt連核堿基序列與選自由SEQ ID NO 74,SEQ IDN075、SEQ ID NO 77,SEQ ID NO 78,SEQ ID NO 80,SEQ ID NO 82 禾口 SEQ ID NO 84 組成的組的核堿基序 列相同，或者存在于該序列中。在一個實施方案中，Btt連核堿基序列與選自由SEQ ID NO 85、SEQ IDNO 86、SEQ ID NO 87,SEQ ID NO 88和SEQ ID NO 89組成的組的核堿基序列相同，或者存在于該序列中。在一個實施方案中，寡聚物選自由SEQ ID NO 74、SEQ ID NO 75、SEQID NO 77、SEQ ID NO 78、SEQ ID NO 80、SEQ ID NO 82 和 SEQ ID NO 84 組成的組。在一個實施方案中，寡聚物選自由SEQ ID NO 86、SEQ ID NO 87、SEQID NO 88和 SEQ ID NO 89組成的組。在一個實施方案中，Btt連核堿基序列包含與選自SEQ ID No 3的核苷酸區(qū)域 47-49,54-56和122-124互補的核堿基序列。在一個實施方案中，B比連核堿基序列與選自由SEQ ID NO 130-SEQ IDNo 145,SEQ ID NO 146-SEQ ID NO 161和SEQ ID NO 162-177組成的組的核堿基序列或核堿基基序相 同，或者存在于該序列中。在一個實施方案中，B比連核堿基序列與選自由SEQ ID NO 131-SEQ IDNo 145,SEQ ID NO 147-SEQ ID NO 161和SEQ ID NO 163-177組成的組的核堿基序列或核堿基基序相 同，或者存在于該序列中。一個實施方案中，寡聚物選自由 SEQ ID NO 243,SEQ ID NO 244,SEQID NO 245 或 SEQ ID NO 246組成的組。一個實施方案中，寡聚物包含共價附著于所述寡聚物上的至少一個非核苷酸部 分。剪接轉換寡聚物(SSOs)另一個方面，本發(fā)明使用剪接轉換寡核苷酸或剪接轉換寡聚物(SSOs)控制TNFR2的選擇性剪接，以致缺乏外顯子7的可溶性配體結合形式的數(shù)量增加，完整膜形式的數(shù)量 減少。本發(fā)明的方法和組合物可用于治療與tnf活性過度相關的疾病。因此，本發(fā)明的一個實施方案涉及給病人施用SSOs以治療炎性疾病或狀況的方 法。所施用的SSOs能夠改變前信使RNA的剪接以產生缺乏外顯子7的哺乳動物TNFR2蛋 白質。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及通過給細胞施用SSOs以在細胞中產生缺乏外 顯子7的哺乳動物TNFR2蛋白質的方法。SSO的長度(即寡聚物中單體的數(shù)目)與反義寡核苷酸(ASON)相似，典型地在大 約8-30之間。在優(yōu)選的實施方案，SSO在大約10-16個核苷酸之間?？梢岳肧SOs能與 RNA雜交，但不會象傳統(tǒng)的反義2’-脫氧寡核苷酸那樣激活RNAseH引起的RNA破壞的幾種 化學過程來實施本發(fā)明?？梢岳?’0修飾的核酸寡聚物，例如2’0被-0-CH3、-0-CH2-CH2-0-CH3、-0-CH2-CH2-CH2-NH2、-0-CH2-CH2-CH2-0H 或-F 的修飾的核酸寡聚物來替代(!^placed with)實施本發(fā)明，優(yōu)選2’ 0-甲基或2’ 0-甲氧乙基修飾的核酸寡聚物。核堿基不必 連接 到糖上；可以使用被稱為肽核酸寡聚物或基于嗎啉的寡聚物。在SaZani，p.et al. ,2001, nucleic acids res. 29 :3695中發(fā)現(xiàn)了對這些不同的化學連接過程的比較。術語剪接轉換 寡核苷酸預計包括上述形式。本領域技術人員能夠理解反義寡核苷酸gapmers和SSOs之 間的關系。Gapmers是包含RNAse H活化區(qū)域(典型地為2’ -脫氧核糖核苷硫代磷酸酯 (deoxyribonucleoside))的AS0N，其中活化區(qū)域與不活化的核酸酶抵抗寡聚物的側接。通 常，在SSO中可以使用適合于gapmerASON中的側接序列的任何化學過程?？梢酝ㄟ^公知的固相合成技術制備本發(fā)明的SSOs?？梢粤硗馐褂没蛱鎿Q使用其他 的任何適合這種合成的工具。已經公知可利用類似的方法制備寡核苷酸，例如硫代磷酸酯 和烷基衍生物。SSO的堿基可以是傳統(tǒng)的胞嘧啶、鳥嘌呤、腺嘌呤和尿嘧啶或胸腺嘧啶脫氧核苷。 或者，可以使用修飾的堿基。特別有價值的是結合親合力增加的修飾堿基。優(yōu)選的修飾堿 基的非限制性例子有被稱為g-clamp或9_(氨基乙氧基)吩惡嗪(phenoxazine)的核苷 酸、與鳥嘌呤核苷形成4個氫鍵的胞嘧啶類似物。(Flanagan，W. Μ.，et al.，1999，proc. Natl. Acad. Sci. 96 3513 ；Holmes, S. C, 2003，Nucleic Acids Res. 31 2759)。其他堿基的 具體例子包括，但不限于5-甲基胞嘧啶(fcC)、異胞嘧啶、假胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔尿 嘧啶(propynyluracil)、5-丙炔(propyny)_6、5_甲基噻唑尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基 嘌呤、次黃嘌呤核苷、2，6- 二氨基嘌呤、7-丙炔-7-去氮腺嘌呤(deazaadenine)、7_丙炔 (propyne) -7-去氮鳥嘌呤(deazaguanine)和2_氯6_氨基嘌呤。當在SSO中使用LNA核苷酸時，也存在非LNA核苷酸的情形是優(yōu)選的。LNA 核苷酸在有非常明顯的非特異性結合的雜交中具有如此高的親合力，因此可以降低 游離SSO的有效濃度。當使用LNA核苷酸時，也可以用2’ -脫氧核苷酸方便地替換 (alternate)它們?？梢允褂每商鎿Q的(alternating)核苷酸、可替換的二核苷酸或 其混合形式，例如LDLDLD、LDDLDD或LLDLLD。例如，在一個實施方案中，核苷酸包含 選自由 LDLDDLLDDLDLDLL， LDLDLLLDDLLLDLL, LMLMMLLMMLMLMLL, LMLMLLLMMLLLMLL, LFLFFLLFFLFLFLL, LFLFLLLFFLLLFLL, LDDLDDLDDL, DLDDLDDLDD, DDLDDLDDLD, LMMLMMLMML, MLMMLMMLMM, MMLMMLMMLM, LFFLFFLFFL, FLFFLFFLFF, FFLFFLFFLF, DLDLDLDLDL, LDLDLDLDL,MLMLMLMLML, LMLMLMLML, FLFLFLFLFL, LFLFLFLFL 組成的組的核苷酸序列，其中 L 是 LNA 單 位，D是DNA單位，M是2' Moe，F(xiàn)是2，氟代。當2' _脫氧核苷酸或2’-脫氧核苷硫代磷酸酯與LNA核苷酸混合時，避免RNAse H活化是非常重要的。預計SSO的LNA核苷酸在大約三分之一和三分之二之間比較合適。 當使用增強親合力的修飾，包括但不局限于LNA或g-clamp核苷酸時，本領域技術人員將會 認識到增加這種增強親合力的修飾的比例是必需的?？梢允褂貌换罨疪NAse H的多種可替換的化學過程。例如適當?shù)腟SOs可以是其 中至少一個核苷酸間橋接磷酸鹽殘基是經過修飾的磷酸鹽，例如膦酸甲酯、甲基硫代膦酸 酉旨(methyl phosphonothioate)、phosphoromorpholidate、phosphoropiperazidate禾口氛基 磷酸酯(phosphoroamidate)的寡核苷酸。
例如依照所描述的內容可以每隔(every other) 一個地修飾核苷酸間橋接的磷 酸鹽殘基。在另一個非限制性例子中，這種SSO是其中至少一個核苷酸包含2’位置的低級 烷基部分(例如，C1-C4,線性的或分支的，飽和或不飽合的烷基，例如甲基、乙基、乙烯基、丙 基、1-丙烯基、2-丙烯基和異丙基)的寡核苷酸。例如依照所描述的內容可以每隔一個地 修飾核苷酸(參見參考文獻美國專利5，976，879中的第4欄)。在體內使用時，優(yōu)選硫代磷 酸酯連接。SSO的長度為大約8-30個堿基。本領域熟練技術人員應理解當使用增加親合力的 化學修飾時，SSO可以短些，但仍然保持特異性。本領域熟練技術人員應該能更進一步地理 解SSO長度的上限是通過保持特異性識別靶序列，避免二級結構形成SSO的自身雜交，以及 獲取進入細胞的限制來限定的。這些限制意味著長度增加(超過(above and beyond)依賴 于SSO親合力的一定長度)的SSO經常被發(fā)現(xiàn)是特異性較低、沒有活性或活性很差的SS0。本發(fā)明的SSOs包括，但不局限于涉及通過化學連接將增強SSO活性、細胞分布或 細胞吸收的一個或多個部分或偶聯(lián)物連接到SSO上的SSO修飾。這種部分包括，但不局限 于脂質部分，例如膽固醇部分、膽酸、硫醚，例如己基-硫-三苯甲基硫醇(tritylthiol)、硫 膽固醇、脂肪鏈，例如、十二烷基或十一烷基殘基、磷脂，例如、二-十六基-rac-甘油或三乙 銨-二 -氧-十六烷基-rac-甘油基-3-h-磷酸鹽化合物(phosphonate)、多胺或聚乙二醇 鏈、金剛烷乙酸、棕櫚基部分、十八胺或己氨_羰基-羥膽固醇部分。不必均勻地改變給定SSO中的所有位置，實際上可以在單個化合物，乃至SSOs內 部的單個核苷中引入一種以上的上述修飾。SSOs可以與其他分子、分子結構或化合物的混合物混合、包封、偶聯(lián)在一起，或者 與它們有關聯(lián)，例如，形成有助于吸收、分布和/或吸收的脂質體、受體靶向的分子，口服劑 型、直腸給藥劑型、局部給藥劑型或其他劑型。本領域熟練技術人員應理解細胞分化包括，但不局限于剪接體的分化。因此，任何 特殊SSO的活性取決于將其引入其中的細胞類型。例如，在一種細胞類型中有效的SSOs在 另一種細胞類型中可能是無效的。本發(fā)明的方法、寡核苷酸和劑型(formulation)也是有用的調查人或動物基因剪 接的體外或體內工具。通過此處描述的步驟或本領域技術人員熟知的所述步驟的修飾可以 實施這種方法。此處公開的SSOs可用于治療執(zhí)業(yè)醫(yī)生打算限制tnf作用或tnf活化的信號路徑的任何狀態(tài)。特別是，本發(fā)明可用于治療炎性疾病。在一個實施方案中，所述狀態(tài)是炎性系 統(tǒng)性疾病，例如類風濕性關節(jié)炎或牛皮癬關節(jié)炎。在一個實施方案中，這種疾病是炎性肝 病。炎性肝病的實例包括，但不局限于與甲型、乙型或丙型肝炎病毒有關的肝炎，酒精性肝 病和非酒精性脂肪變性。在另一個實施方案中，炎性疾病是皮膚疾病，例如牛皮癬。補充RNAseH本發(fā)明的寡聚物不介導基于RNAseH的互補單鏈RNA分子的切割。能有效補充 RNAseH的寡核苷酸需要至少5個毗連的DNA核堿基的延伸(stretch)。EP 1222309提供了確定RNaseH活性的體外方法，該方法可以用來確定補充 RNaseH的能力。與互補RNA靶一起提供時，利用EP 1222309的實施例91-95提供的方法進 行測定時，如果以pmol/L/min計，化合物具有同等DNA寡核苷酸至少1 %，例如至少5%，例 如至少10%或小于20%的初始速率，則認為該化合物能夠補充RNase H，其中同等DNA寡核 苷酸沒有2’位點的取代，寡核苷 酸中所有核苷酸之間都是磷酸二酯連接基團的。當與互補RNA靶和RNaseH —起提供時，利用EP 1222309的實施例91_95提供的 方法進行測定時，如果以pmol/L/min計，化合物的RNaseH初始速率小于利用同等DNA寡核 苷酸確定的初始速率的20%，例如小于10%，例如小于5%或優(yōu)選小于0. 1% (甚至小于 0. 1% )，則認為該化合物基本上不補充RNase H，其中同等DNA寡核苷酸沒有2’位點的取 代，寡核苷酸中所有核苷酸之間都是磷酸二酯連接基團的。核苷酸類似物當提到只由核苷酸組成的優(yōu)選的核苷酸序列基序或核苷酸序列時，應該認識到由 該序列限定的本發(fā)明的寡聚物可以包含替換所述序列中存在的一個或多個核苷酸的對應 的核苷酸類似物，例如LNA單位或其他的核苷酸類似物，所述核苷酸類似物提高寡聚物/靶 雙鏈體的雙鏈體穩(wěn)定性/Tm(即增強親合力的核苷酸類似物)。此外，核苷酸類似物可以在體內增強寡聚物的穩(wěn)定性。在一個實施方案中，核苷酸類似物(X)獨立地選自由2’-氧-烷基-RNA單位、 2 ‘ -OMe-RNA 單位、2 ‘ -MOE RNA 單位、2，-氨基-DNA 單位、2 ‘-氟-DNA 單位，LNA 單位、 PNA單位、HNA單位和INA單位組成的組。在一個實施方案中，Btt連核堿基序列不包含2’ OMe核糖核苷酸類似物或2’ -MOE 核糖核苷酸類似物。在一個實施方案中，核苷酸類似物是2’M0E，即2’氧-2甲氧乙基RNA。因此，在一 個實施方案中，此處提到核堿基基序中的X2或M可以是Μ0Ε。在寡聚物中引入增強親合力的核苷酸類似物，例如LNA或T-取代的糖可以允許降 低特異性結合寡聚物的大小，也可以降低非特異性或異常結合發(fā)生前，寡聚物大小的上限。寡聚物的核堿基序列或毗連核堿基序列與TNFR靶序列的對應區(qū)域不完全互補也 是合適的，在一個實施方案中，當寡聚物包含增強親合力的核苷酸類似物，這種核苷酸類似 物與TNFR靶中的對應核苷酸形成互補體。因此寡聚物可以包含或由天然核苷酸，優(yōu)選2’ _脫氧核苷酸(在這里通常被稱 為"DNA")，但也可能由核糖核苷酸(在這里通常被稱為"RNA")的簡單序列組成，或者 它可以包含一個或多個核苷酸"類似物"(也可能完全由其組成)。核苷酸類似物是由糖、和/或堿基和/或磷酸鹽部分的修飾所產生的天然DNA或RNA核苷酸的變體。術語"核堿基"包括天然核苷酸(DNA或RNA類型)，以及它們的這種" 類似物"。原則上類似物可以只是"沉默的"，或者"等同于"寡核苷酸上下文中的天然 核苷酸，即對寡核苷酸抑制聯(lián)蛋白表達的作用方式沒有功能性的影響。如果，例如這 種"等同"類似物更容易制造或者制造起來更便宜，或者在存儲或制造期間更穩(wěn)定，或者 帶有標記或標簽，那么它們無論如何都是有用的。然而，優(yōu)選那些對寡聚物抑制表達的作用 方式有功能性影響的類似物；例如，通過增加對靶的結合親合力、增加對胞內核酸酶的抗性 和/或增加轉運到細胞中的容易性來產生影響的類似物。 這種核苷酸修飾的實例包括改變糖部分以提供2’ _取代基或產生增強結合親 合力和可能提供一些增強的核酸酶抗性的橋接(鎖定的核酸)結構；將核苷酸間連接 由正常的磷酸二酯鍵變?yōu)閷怂崦腹艨剐愿鼜姷倪B接，例如硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯 (boranophosphate)。 優(yōu)選的核苷酸類似物是LNA，例如β -D-氧-LNA、α -L-氧-LNA、β -D-氨基-LNA 和β -D-硫代-LNA，，β -D-氧-LNA是最優(yōu)選的。
在一些實施方案中，寡聚物包含3-8個核苷酸類似物，例如6或7個核苷酸類似 物。到目前為止，最優(yōu)選的實施方案中，至少一個所述的核苷酸類似物是鎖定的核酸(LNA)； 例如，至少3或至少4個，或者至少5個，或者至少6個，或者至少7個或8個核苷酸類似物 是LNA。在一些實施方案中，所有的核苷酸類似物都是LNA。在一些實施方案中，本發(fā)明的寡聚物內部存在的核苷酸類似物獨立地選自，例如 2，-氧-烷基-RNA單位、2，-氨基-DNA單位、2 ‘-氟-DNA單位、LNA單位、阿拉伯糖核酸 (ANA)單位、2’ -氟-ANA單位、HNA單位、INA (插入核酸)單位和2 ‘ -MOE RNA單位。2’-氧-甲氧乙基-RNA(2’M0E)、2’_氟-DNA單體和LNA是優(yōu)選的核苷酸類似物， 因此本發(fā)明的寡核苷酸可以包含獨立地選自這三種類似物的核苷酸類似物，或者可以只包 含選自這三種中的一種類似物。依照本發(fā)明的寡聚物優(yōu)選包含至少一個鎖定的核酸(LNA)單位，例如1、2、3、4、5、 6、7或8個LNA單位，優(yōu)選4-8個LNA單位，最優(yōu)選4個、5個或6個LNA單位。寡聚物包含 β -D-氧-LNA和一個或多個下列LNA單位D_ β、L- α構型或其組合構型的硫代-LNA、氨 基-LNA、氧-LNA、ena-LNA和/或α -LNA是合適的。在本發(fā)明的一個實施方案中，寡聚物可以包含LNA和DNA單位。LNA和DNA單位組 合的總數(shù)優(yōu)選為8-24，例如8-15、或10-25，或10-20或12-16。在本發(fā)明的一個實施方案中，寡聚物的核堿基序列，例如毗連核堿基序列由至少 一個LNA組成，剩余的核堿基單位是DNA單位。在依照本發(fā)明的寡聚物的一些實施方案，例如包含LNA的反義寡核苷酸中，所有 LNA C單位都是5-甲基胞嘧啶。在一些實施方案中，所有核苷酸類似物都是LNA。在最優(yōu)選的實施方案中，寡聚物只包含LNA核苷酸類似物和核苷酸(RNA或DNA，最 優(yōu)選DNA核苷酸，具有任意修飾的核堿基間連接，例如硫代磷酸酯)。在一些實施方案中，所述核苷酸類似物的至少一個是2’ -M0E-RNA，例如2、3、4、5、 6、7或8個2’ -MOE-RNA核堿基單位。在一些實施方案中，所述核苷酸類似物的至少一個是2’ -氟-DNA，例如2、3、4、5、 6、7或8個2，氟-DNA核堿基單位。
Freier&Altmann ；Nucl. Acid Res. ，1997，25，4429—4443 禾口 Uhlmann ;Curr. Opinion in Drug Development，2000，3 (2)，293-213，以及略圖 1 描述了核苷類似物的具體實例。 略圖1術語"LNA"指被稱為"鎖定核酸"的二環(huán)核苷酸類似物。它可以指LNA單體， 在"LNA寡核苷酸"的上下文中使用時可以指包含一個或多個這種二環(huán)核苷酸類似物的
寡核苷酸。特別優(yōu)選的化學過程由鎖定核酸(LNA)提供(Koshkin, Α. A.，et al.，1998， Tetrahedron 54 3607 ；Obika, S.，et al.，1998，Tetrahedron Lett. 39 5401)。此處使 用的術語〃 LNA單位〃、“LNA單體〃、“LNA殘基〃、“鎖定的核酸單位〃、“鎖定 的核酸單體〃或〃鎖定的核酸殘基〃指二環(huán)核苷類似物。WO 99/14226、WO 00/56746、WO00/56748、WO 01/25248、WO 02/28875、WO 03/006475 和 WO 03/095467 中描述了 LNA 單位 和它們的合成方法。也可以根據(jù)化學式來限定LNA單位。因此，此處使用的"LNA單位" 具有下文式1所示的化學結構。式1 其中X選自由0、S和NRH組成的組，R是H或C1-C4烷基；Y 是(-CH2) r，r 是 1-4 的整數(shù);B是如上所述的天然或非天然來源的堿基。在一個優(yōu)選的實施方案中，r是1或2，在一個更優(yōu)選的實施方案中，r是1。本發(fā)明的寡核苷酸化合物中使用的LNA優(yōu)選具有如下通式的結構 其中X和Y獨立地選自群組-ο-、-S-、-N(H) -、N(R) -、-CH2-或-CH-(如果是雙鍵 的一部分)、-CH2-0-、-CH2-S-, -CH2-N (H) -、-CH2-N (R) -、-CH2-CH2-或-CH2-CH-(如果是雙鍵 的一部分)、-CH = CH-、其中R選自氫和Cy-烷基；Z和t獨立地選自核苷酸間連接、末端 基團或保護基團；B組成天然或非天然核苷酸堿基部分；在兩個方向的任意一個方向可以 發(fā)現(xiàn)不對稱的基團。本發(fā)明使用的寡聚物中的LNA優(yōu)選包含符合下式中的任何一個的至少一個LNA單
位 其中，Y是-0-、-S-、-N(H)-, N(Rh)-;Z和t獨立地選自核苷酸間連接、末端基團或保護基團；B組成天然或非天然核苷酸堿基部分，Rh選自氫和CV4-烷基。本發(fā)明的寡聚物中使用的LNA優(yōu)選包含選自-O-P (0) 2_0_，-O-P (0，S) _0 -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P (0, S)-0", -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P (0,
S) -S-, -S-P (0) 2-S-，-O-PO (Rh) -ο-，O-PO (OCH3) _0_，-0-P0 (NRh) _0_，-0-P0 (OCH2CH2S-R) -0-，-0-P0 (BH3) -0-，-0-P0 (NHRH) _0_，-O-P (0) 2_NRH_，-NRH-P (0) 2_0_，-NRH-CO-O-,其中 Rh 選自 氫和Cy烷基。具體優(yōu)選的LNA單位如略圖2所示 β-D-氨基酸-LNA略圖(scheme) 2術語〃硫代-LNA 〃包含其中上述通式中的X或Y中的至少一個選自S 或-CH2-S-的鎖定核苷酸。硫代LNA可以是β -D和a -L構型。術語〃氨基-LNA"包含其中上述通式中的X或Y中的至少一個選自-N(H)-， N(R) -，CH2-N(H)-和-CH2-N(R)-的鎖定核苷酸，其中R選自氫和C^4-烷基。氨基-LNA可 以是β-D禾口 a-L構型。術語〃氧-LNA 〃包含其中上述通式中的X或Y中的至少一個代 表-0-或-CH2-O-的鎖定核苷酸。氧LNA可以是β -D和a -L構型。
術語〃 ena-LNA〃包含其中上述通式中的Y是-CH2-O-(其中-CH2-O-的氧原子附 于與堿基B相對的2’ -位置)的鎖定核苷酸。在優(yōu)選的實施方案中，LNA選自β -D-氧-LNA、α -L-氧-LNA、β -D-氨基-LNA和 β -D-硫代、特別是β -D-氧-LNA。依照本發(fā)明的寡聚物優(yōu)選包含至少一個核苷酸類似物，例如鎖定的核酸(LNA)單 位，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸類似物，例如鎖定的核酸(LNA)單位，優(yōu)選3_9 個核苷酸類似物，例如LNA單位，例如4-8個核苷酸類似物，例如LNA單位，例如6_9個核苷 酸類似物，例如LNA單位，優(yōu)選6、7或8個核苷酸類似物，例如LNA單位。 依照本發(fā)明的寡聚物，例如反義寡核苷酸，可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14或15個核苷酸類似物，例如LNA單位，特別是3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸類似 物，例如LNA單位。優(yōu)選的LNA單位包含至少一個0-0-氧-1^離單位，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10 個β -D-氧-LNA單位。本發(fā)明的寡聚物，例如反義寡核苷酸，可以包含一種以上的LNA單位?；衔锇?β -D-氧-LNA和一個或多個下列LNA單位D_ β、L- α構型或其組合構型的硫代-LNA、氨 基-LNA、氧-LNA、ena-LNA和/或α -LNA是合適的。優(yōu)選的寡聚物，例如反義寡核苷酸，可以包含或由核苷酸類似物，例如LNA和DNA 單位組成。優(yōu)選LNA和DNA，但是也可以使用M0E、2’-0_Me，以及其他2’取代的類似物和RNA。優(yōu)選的DNA類似物包括其中2，-H被OH(RNA)以外的基團，例如被-0-CH3，-0-CH2 -CH2-0-CH3, -0-CH2-CH2-CH2-NH2, -0-CH2-CH2-CH2-0H 或-F 替換的 DNA 類似物。優(yōu)選的RNA類似物包括其中2’_0H已經改變，例如被-H(DNA)以外的基團，例如-0-CH3, -0-CH2-CH2-0-CH3, -0-CH2-CH2-CH2-NH2, -0-CH2-CH2-CH2-0H 或-F 基團取代的 RNA 類似物。在一個實施方案中，核苷酸類似物是〃 ΕΝΑ"。在一個實施方案中，本發(fā)明的寡聚物不包含任何RNA單位。與同等的DNA核苷酸的結合親合力相比，高親和性核苷酸類似物是產生與互補 RNA核苷酸形成具有較高熱穩(wěn)定性的雙鏈體的寡核苷酸的核苷酸類似物。典型地通過測量 Tm來確定這一點。與同等的核苷酸相比，增加寡聚物/靶核酸靶的Tm的核苷酸類似物是優(yōu)選的(增 強親合力的核苷酸類似物)。寡聚物可以適當?shù)氐嘏c靶核酸，例如TNFR mRNA雜交，形成Tm 為至少30°C，例如37°C，例如至少40°C，至少50°C，至少55°C或至少60°C的雙鏈體。例如， 在一個方案中，Tm在30-80°C之間，例如在40-70°C之間。在一個實施方案中，本發(fā)明寡聚物的核堿基的至少30%，例如至少33%，例如至 少40 %，例如至少50 %，例如至少60 %，例如至少66 %，例如至少70 %，例如至少80 %，例 如至少90%是核苷酸類似物核堿基，例如LNA。在一個實施方案中，本發(fā)明的寡聚物的所有 核堿基都是核苷酸類似物核堿基，例如LNA。對于較短的寡核苷酸，可能需要增加(高親合力)核苷酸類似物，例如LNA的比 例，這一點是能夠認識到的。
與術語"寡聚物"互換使用的術語"寡核苷酸(或簡單地"低聚"oligo)“在 本發(fā)明上下文中指由兩個或多個核堿基的共價鍵形成的分子。當在本發(fā)明的寡核苷酸(也 稱為單鏈寡核苷酸)的上下文中使用時，術語"寡核苷酸"在一個實施方案中可能具有， 例如8-26個核堿基，例如12-26個核堿基。在此處詳述的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的寡 核苷酸具有10-16個核堿基或8-15個核堿基的長度。寡聚物長度的變化本發(fā)明寡核苷酸的長度可以變化。甚至認為較短的寡核苷酸，例如10-17或10-15 個堿基的寡核苷酸更有利。
在這樣的實施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸具有10、11、12、13、14、15或16個核堿基
的長度。在一個實施方案中，依照本發(fā)明的寡核苷酸的長度為8-24個核堿基，例如10-24 個，12-24 個核苷酸之間，例如長度為 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23 或24個核苷酸，優(yōu)選的長度為10-22個，例如12-22個核苷酸之間，例如長度為10、11、12、
13、14、15、16、17、18、19、20或21個核苷酸，更優(yōu)選的長度為10-20個，例如12-20個核苷酸 之間，甚至更優(yōu)選的長度為10-19個，例如12-19個核苷酸之間，例如長度為10、11、12、13、
14、15、16、17、18或19個核苷酸，例如長度為10-18個，例如12-18個核苷酸之間，例如長度 為10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸，更優(yōu)選的長度為10-17個，例如12-17個核 苷酸之間，例如長度為10、11、12、13、14、15、16或17個核苷酸，最優(yōu)選的長度為10-16個， 例如12-16個核苷酸之間，例如長度為10、11、12、13、14、15或16個核苷酸。核苷酸間連接基團術語"核苷酸間連接基團"被用來指能夠將兩個核堿基共價連接在一起的基團， 例如，DNA單位之間、DNA單位和核苷酸類似物之間、兩個非LNA單位之間、非LNA單位和LNA 單位之間、兩個LNA單位之間的基團等等。優(yōu)選的實例包括磷酸鹽、磷酸二酯基團和硫代磷
酸酯基團。核苷酸間連接基團可以選自由如下基團組成的組-0-P(0)2-0-，-0-P(0，S)-0-，_ O-P(S)2-0，-S-P(0)2-0，-S-P(CS)_0_，-S-P(S)2-0,-O-P(0)2_S_，-O-P(CS)-S-,-S-P(0)2-S-，-0-P0(RH)-0-，O-PO(0CH3)_0_，-0-P0(NRH)_0_，-0-P0(0CH2CH2S-R)_0_，-0-P0(BH3)_0_，-O-PO (NHRH) -0-，-O-P (0) 2-NRH-, -NRH-P (0) 2-0-, -NRH-CO-O-, -NRH-CO-NRH-,和 / 或核苷酸 間連接基團可以選自由如下基團組成的組-0-C0-0-，-O-CO-NRH-, -NRH-C0-CH2-, -0-CH2-CO-NRH-,-0-CH2-CH2-NRH-,-C0-NRH-CH2-,-CH2-NRH-C0-,-0-CH2-CH2-S-，-S-CH2-CH2-0-，-S -CH2-CH2-S-,-CH2-S02-CH2-,-CH2-C0-NRH-，-0-CH2-CH2-NRH-C0-, -CH2-NCH3-0-CH2-，其 中RH選自氫和C1-4烷基。合適地，在一些實施方案中，上文提供的包含硫的核苷酸間連接 是優(yōu)選的。核苷酸間連接的修飾寡核苷酸中的核苷酸間連接基團是磷酸基，但是可以用不同于磷酸鹽的核苷酸間 連接基團取代這些磷酸基。在本發(fā)明的一個有趣的更進一步地實施方案中，本發(fā)明的寡核 苷酸的核苷酸間連接基團的結構被改變，即修飾的寡核苷酸包含不同于磷酸鹽的核苷酸間 連接基團。因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸包含至少一個不同于磷酸鹽 的核苷酸間連接基團。
不同于磷酸鹽(-0-P (0) 2-0-)的核苷酸間連接基團的具體實例包括-0-P (0， S) -0", -0-P(S)2-0-, -s-p (0)2-0-，-s-p (0, S)_0_，-S-P(S)2_0-，-0-P(0)2_S-，_0_P(0， S)-S-,-S-P(0)2-S-,-0-P0(RH)-0-，0-P0(0CH3)-0-，-0-P0(NRH)-0-，-0-P0(0CH2CH2S-R)-0-，-0-P0(BH3)-0-，-0-P0(NHRH)-0-，_0_P(0)2-NRH-，-NRH-P(0)2-0-,-NRH-CO-O-，-NRH-CO-NRH-,-0-C0-0-,-O-CO-NRH-，-NRH-C0-CH2-，-0-CH2-C0-NRH-，-0-CH2-CH2-NRH-，-CO-NRH-C H2-,-CH2-NRH-C0-,-0-CH2-CH2-S-，-S-CH2-CH2-0-，-S-CH2-CH2-S-，-CH2-S02-CH2-，-CH2-C0 -NRH-, -0-CH2-CH2-NRH-C0-, -CH2-NCH3-0-CH2，其中 RH 是氫或 Cl_4_ 烷基。當修飾核苷酸間連接基團時，優(yōu)選的核苷酸間連接基團是硫代磷酸酯基團 (-0-p(0, s)-o-)。在一個優(yōu)選的實施方案中，依照本發(fā)明的寡核苷酸的所有核苷酸間連接 基團都是硫代磷酸酯。寡核苷酸完全被硫代磷酸酯化在大多數(shù)治療應用中是優(yōu)選的，但在CNS，例如其中 硫代磷酸酯化可能有毒的腦或脊柱(spine)中使用的治療性寡核苷酸除外，因為缺乏核酸 酶，甚至可以在毗連的DNA單位之間使用磷酸二酯鍵。在一個實施方案中，寡聚物包含交替的LNA和DNA單位(Xx)或(xX)。在一個實施方案中，寡聚物包含后面連接有2個DNA單位的交替的LNA基序 (Xxx)、xXx 或 xxX0在一個實施方案中，至少一個DNA或非LNA核苷酸類似物單位在選自上文所述的 任何一個實施方案中被確定為LNA核堿基單位的位置被LNA核堿基取代。在一個實施方案中，“X"代表LNA單位。 在一個實施方案中，寡聚物包含至少3個核苷酸類似物單位，例如至少4個核苷酸 類似物單位，例如至少5個核苷酸類似物單位，例如至少6個核苷酸類似物單位，例如至少7 個核苷酸類似物單位，例如至少8個核苷酸類似物單位，例如至少9個核苷酸類似物單位， 例如至少10個，例如至少11個，例如至少12個核苷酸類似物單位。在一個實施方案中，寡聚物包含至少3個LNA單位，例如至少4個LNA單位，例如 至少5個LNA單位，例如至少6LNA單位，例如至少7個LNA單位，例如至少8個LNA單位， 例如至少9個LNA單位，例如至少10個LNA單位，例如至少11個LNA單位，例如至少12個 LNA單位。在一個實施方案中，至少一個核苷酸類似物，例如LNA單位是胞嘧啶或鳥嘌呤，例 如核苷酸類似物，例如LNA單位中的1-10個是胞嘧啶或鳥嘌呤，例如核苷酸類似物，例如 LNA單位中的2、3、4、5、6、7、8或9個是胞嘧啶或鳥嘌呤。在一個實施方案中，至少兩個核苷酸類似物，例如LNA單位是胞嘧啶或鳥嘌呤。在 一個實施方案中，至少三個核苷酸類似物，例如LNA單位是胞嘧啶或鳥嘌呤。在一個實施方 案中，至少四個核苷酸類似物，例如LNA單位是胞嘧啶或鳥嘌呤。在一個實施方案中，至少 五個核苷酸類似物，例如LNA單位是胞嘧啶或鳥嘌呤。在一個實施方案中，至少六個核苷酸 類似物，例如LNA單位是胞嘧啶或鳥嘌呤。在一個實施方案中，至少七核苷酸類似物，例如 LNA單位是胞嘧啶或鳥嘌呤。在一個實施方案中，至少八個核苷酸類似物，例如LNA單位是 胞嘧啶或鳥嘌呤。在一個優(yōu)選的實施方案中，與同等DNA核苷酸對互補RNA核苷酸的結合親合力相 比，核苷酸類似物與所述互補RNA核苷酸形成具有較高熱穩(wěn)定性的雙鏈體。
在一個實施方案中，核苷酸類似物賦予單鏈寡核苷酸增強的血清穩(wěn)定性。更進一步地設計本發(fā)明的寡聚物在一個實施方案中，從3’末端開始數(shù)起的話，依照本發(fā)明的寡聚物的第一個核堿 基是核苷酸類似物，例如LNA單位。在一個實施方案中，從3’末端開始數(shù)起的話，依照本發(fā)明的寡聚物的第二個核堿 基是核苷酸類似物，例如LNA單位。在一個實施方案中，‘‘x〃表示DNA單位。在一個實施方案中，寡聚物在5’末端包含核苷酸類似物單位，例如LNA單位。 在一個實施方案中，核苷酸類似物單位，例如X獨立地選自由2’ -氧-烷基-RNA單位、 2 ‘ -OMe-RNA 單位、2，-氨基-DNA 單位、2，-氟-DNA 單位，2 ‘ -M0E RNA 單位、LNA 單位、 PNA單位、HNA單位和INA單位組成的組。在一個實施方案中，本發(fā)明的寡聚物的所有核堿基都是核苷酸類似物單位。在一個實施方案中，核苷酸類似物單位，例如X獨立地選自由2 ‘ -OMe-RNA單位， 2'-氟-DNA單位和LNA組成的組。在一個實施方案中，寡聚物包含所述的至少一個LNA類似物單位和至少一個另外 的不同于LNA的核苷酸類似物單位。在一個實施方案中，非LNA核苷酸類似物單位獨立地選自2’ -OMe RNA單位和 2，-氟-DNA單位。在一個實施方案中寡聚物由XTX1或X2X￥中的至少一個序列組成，其中X1是 LNA, X2 是 2，-OMe RNA 單位或 2，-氟-DNA 單位。在一個實施方案中，寡聚物的核堿基序列由交替的X1和X2單位組成。在一個實施方案中，依照本發(fā)明的寡聚物不包含超過5個毗連DNA核苷酸單位的 區(qū)域。在一個實施方案中，依照本發(fā)明的寡聚物不包含超過6個毗連DNA核苷酸單位的區(qū) 域。在一個實施方案中，依照本發(fā)明的寡聚物不包含超過7個毗連DNA核苷酸單位的區(qū)域。 在一個實施方案中，依照本發(fā)明的寡聚物不包含超過8個毗連DNA核苷酸單位的區(qū)域。在 一個實施方案中，依照本發(fā)明的寡聚物不包含超過3個毗連DNA核苷酸單位的區(qū)域。在一 個實施方案中，依照本發(fā)明的寡聚物不包含超過2個毗連DNA核苷酸單位的區(qū)域。在一個實施方案中，寡聚物包含至少一個由至少兩個毗連的核苷酸類似物單位， 例如至少兩個毗連的LNA單位組成的區(qū)域。在一個實施方案中，寡聚物包含至少一個由至少三個毗連的核苷酸類似物單位， 例如至少三個毗連的LNA單位組成的區(qū)域。在一個實施方案中，依照本發(fā)明的寡聚物不包含超過7個毗連的核苷酸類似物單 位，例如LNA單位的區(qū)域。在一個實施方案中，依照本發(fā)明的寡聚物不包含超過6個毗連的 核苷酸類似物單位，例如LNA單位的區(qū)域。在一個實施方案中，依照本發(fā)明的寡聚物不包含 超過5個毗連的核苷酸類似物單位，例如LNA單位的區(qū)域。在一個實施方案中，依照本發(fā)明 的寡聚物不包含超過4個毗連的核苷酸類似物單位，例如LNA單位的區(qū)域。在一個實施方 案中，依照本發(fā)明的寡聚物不包含超過3個毗連的核苷酸類似物單位，例如LNA單位的區(qū) 域。在一個實施方案中，依照本發(fā)明的寡聚物不包含超過2個毗連的核苷酸類似物單位，例 如LNA單位的區(qū)域。
在一個實施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸包含的至少50%，例如55%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%或例如100%的寡聚物的核堿基單位(優(yōu)選具有高親合 力)是核苷酸類似物，例如鎖定的核酸(LNA)核堿基單位，下文的表3和4提供了可以被本發(fā)明的寡核苷酸方便靶向的短microRNA序列的 非限制性實例。在一個實施方案中，依照本發(fā)明的寡核苷酸具有選自由下列基序組成的組的
5，-3，走向的核堿基序列
LxLxxLLxxLL
LxLxLLLxxLL
LxxLxxLxxL
xLxxLxxLxx'每:三個
xxLxxLxxLx'每:三個
xLxLxLxLxL'每兩個
LXLXLXLXL’ 每兩個，
Ld Ld d LLddLL
LdLdLLLddLLL
LMLMMLLMMLL
LMLMLLLMMLL
LFLFFLLFFLL
LFLFLLLFFLLL
LLLLLL
LLLLLLL
LLLLLLLL
LLLLLLLLL
LLLLLLLLLL
LLLLLLLLLLL
LLLLLLLLLLLL
LMMLMMLMML
MLMMLMMLMM'每:三個
MMLMMLMMLM'每:三個
LFFLFFLFFL’每:三個
FLFFLFFLFF，每:三個
FFLFFLFFLF，每:三個
dLdLdLdLdL，每兩個
LdLdLdLdL’ 每兩個’
MLMLMLMLML，每兩個
LMLMLMLML，每兩個，
FLFLFLFLFL，每兩個
LFLFLFLFL’ 每兩個，
(third)
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變體，片段或同系物。在一個實施方案中，依照本發(fā)明的分離或純化的可溶形式的TNFa受體缺乏外顯 子7編碼的跨膜結合域。在一個實施方案中，分離或純化的可溶形式的TNFa受體是人TNFR1TNF a受體 (SEQ ID NO 123的殘基1-455，殘基30-455，其變體，片段或同系物。)，其中所述缺失在殘 基209和246之間(或相當于SEQ ID No 123的殘基209和246的區(qū)域)。在一個實施方案中，分離或純化的可溶形式的TNFa具有由SEQ ID N0119的殘基 1-208，殘基30-208，其變體，片段或同系物組成的序列。在一個實施方案中，分離或純化的可溶形式的TNFa受體是人TNFR2TNF a受體(SEQ ID NO 127的殘基1-435，殘基23-435，其變體，片段或同系物，其中所述缺失在殘基 263和289之間(或相當于SEQ ID No 123的殘基209和246的區(qū)域)。在一個實施方案中，分離或純化的可溶形式的TNF a受體具有由SEQ IDN0 127的 殘基1-262或23-262組成的序列，或者是其變體，片段或同系物。在一個優(yōu)選的實施方案中，可溶形式的TNF a受體是分離純化的。本發(fā)明的一個實施方案是由來源于哺乳動物TNFR基因的cDNA編碼的全長或成熟 的蛋白質，其中cDNA的外顯子6的后面直接連接外顯子8，因此缺乏外顯子7。此外，蛋白 質可以結合TNF，優(yōu)選TNF-alpha，可以作為TNF，優(yōu)選TNF-alpha的拮抗劑。與單獨的可溶 性細胞外域相比，本發(fā)明的TNFR優(yōu)選能夠抑制TNF介導的細胞毒性到更大程度，更優(yōu)選地 到與TNFR :Fc相當或超過它的程度。本發(fā)明公開的哺乳動物TNFR包括，但不局限于人、靈 長類動物、鼠科動物、犬科動物、貓科動物、牛、羊、馬和豬TNFR。此外，本發(fā)明公開的哺乳動 物TNFR包括，但不局限于由一個或多個單核苷酸多態(tài)性，例如EP專利申請1，172，444中公 開的那些實例產生的蛋白質序列，只要蛋白質保持與用于進行比較的參考序列可比的生物 活性就可以。在一個實施方案中，哺乳動物TNFR是哺乳動物TNFR1，優(yōu)選人TNFR1。對于人 TNFR1，如SEQ ID NO 122所示的包括信號序列的huTNFRl A 7和缺乏信號序列的成熟 huTNFRl A 7 (SEQ ID NO 122的氨基酸30-417)給出了實施方案中的兩個非限制性實例。這 些huTNFRl八7蛋白質的序列是包含信號序列的野生型人1順1 1(3￡0 ID No 118)的氨基酸 1-208或缺乏信號序列的成熟huTNFRl A 7的序列，即野生型人TNFR1的氨基酸30-208，兩 種情況下上述序列都是直接連接野生型人TNFR1的氨基酸247-455。在另一個優(yōu)選的實施方案，哺乳動物TNFR是哺乳動物TNFR2，最優(yōu)選人TNFR2。對 于人TNFR2，如SEQ ID NO 126所示的包括信號序列的huTNFR2 A 7或缺乏信號序列的成熟 huTNFR2 A 7 (SEQ ID NO 126的氨基酸23-435)給出了實施方案中的兩個非限制性實例。這 些huTNFR2A7蛋白質的序列是包含信號序列的野生型人TNFR2(SEQ ID No 120)的氨基酸 1-262或缺乏信號序列的成熟huTNFR2 A 7的的序列，即野生型人TNFR2的氨基酸23-262， 兩種情況下，上述序列后都因為外顯子6-8接合點處獨特密碼子的形成而直接連接氨基酸 谷氨酸，外顯子6-8接合點的后面連接有野生型人TNFR2的氨基酸290-461。本發(fā)明的蛋白質也包含被化學修飾的那些蛋白質。蛋白質的化學修飾是指其中至 少一個氨基酸殘基被自然過程，例如加工或其他的翻譯后修飾，或者本領域已知的化學修 飾方法改變的蛋白質。這種修飾包含，但不局限于乙?；Ⅴ；?、酰胺化、ADP核糖基化、糖 基化、甲基化、聚乙二醇化、異戊烯化、磷酸化或偶聯(lián)膽固醇。在一個實施方案中，本發(fā)明的蛋白質也可以包括本發(fā)明的蛋白質的變體、片段和 同系物。然而，這種蛋白質在此處解釋的外顯子7或外顯子8編碼的氨基酸序列中包含缺失。核酸本發(fā)明更進一步地提供了編碼本發(fā)明的TNF a受體的可溶形式的核酸。在一個實施方案中，核酸選自由下列核酸組成的組SEQ ID NO 121的核苷酸 1-1251，SEQ ID NO 121 的 88-1251，SEQ ID NO 125 的 1-1305 和 SEQID NO 125 的 67-1305， 或者其變體，同系物或片段，包括由于遺傳密碼的簡并性而與該核酸編碼相同的原始氨基酸序列的核酸。本發(fā)明的一個實施方案是編碼由來源于哺乳動物TNFR基因的cDNA編碼的全長或 成熟蛋白質的核酸，其中cDNA的外顯子6的后面直接連接外顯子8，因此缺乏外顯子7。優(yōu)選以開放閱讀框未被內部的非翻譯序列或典型地存在于真核基因中的內含子 中斷的形式提供這種序列。也可以使用包含相關序列的基因組DNA。在一個實施方案中，核 酸是mRNA或cDNA。在另一個實施方案中，它是基因組DNA。在一個實施方案中，哺乳動物TNFR是哺乳動物TNFR1。適合于該實施方案的哺乳 動物TNFR1優(yōu)選是人TNFR1。對于人TNFR1，如SEQ ID NO 122所示的包含信號序列的編碼 huTNFRl A 7和缺乏信號序列的成熟huTNFRl A 7 (SEQ ID NO 122的氨基酸30-417)的核酸 給出了實施方案中的兩個非限制性實例。這些huTNFRl A 7核酸的序列優(yōu)選是包含信號序 列的SEQ ID NO :121的核苷酸1-1251和缺乏信號序列的SEQ ID NO :121的核苷酸88-1251。 這些huTNFRl A 7核酸的序列是包含信號序列的野生型人TNFR1 (SEQ IDNo 117)的核苷酸 1-625或野生型人TNFR1的核苷酸88-625，即缺乏信號序列的成熟huTNFR2 A 7，兩種情況下 上述序列的后面都直接連接野生型人TNFR1的核苷酸740-1368。在另一個優(yōu)選的實施方案，哺乳動物TNFR是哺乳動物TNFR2，最優(yōu)選人TNFR2。對 于人TNFR2，如SEQ ID NO 126所示的包含信號序列的編碼huTNFR2 A 7或缺乏信號序列的 成熟huTNFR2 A 7 (SEQ ID NO 126的氨基酸23-435)的核酸給出了實施方案中的兩個非限 制性實例。這些huTNFR2A7核酸的序列優(yōu)選是包含信號序列的SEQ ID NO 115的核苷酸 1-1305和缺乏信號序列的SEQ ID NO :115的核苷酸67-1305。這些huTNFR2 A 7核酸的序 列是包含信號序列的野生型人TNFR2(SEQ ID No 119)的核苷酸1-787或野生型人TNFR2 的核苷酸67-787，即缺乏信號序列的成熟huTNFR2 A 7，兩種情況下上述序列的后面都直接 連接野生型人TNFR2的氨基酸866-1386。本發(fā)明的核酸的堿基可以是傳統(tǒng)的胞嘧啶、鳥嘌呤、腺嘌呤和尿嘧啶或胸腺嘧啶 脫氧核苷堿基?；蛘?，可以使用修飾的堿基。其他適當?shù)膲A基包括，但不限于5-甲基胞嘧 啶(fcC)、異胞嘧啶、假胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔尿嘧啶、5-丙炔_6、5_甲基噻唑尿嘧 啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、次黃嘌呤核苷、2，6_ 二氨基嘌呤、7-丙炔-7-去氮腺嘌呤 (deazaadenine)、7_ 丙塊 _7_ 去氣鳥口票吟(deazaguanine)、2_氣(aminoethoxy) _6_ M■基口票 呤和9_(氨乙氧)吩惡嗪。本發(fā)明合適的核酸包括許多的選擇性化學變化。例如本發(fā)明適當?shù)暮怂岚?，?不局限于其中至少一個核苷酸間橋接磷酸鹽殘基是經過修飾的磷酸鹽，例如硫代磷酸酯、 膦酸甲酯、甲基硫代膦酸酯、phosphoromorpho 1 idate、phosphoropiperazidate和氨基磷酸 酯(phosphoroamidate)的核酸。在另一個非限制性例子中，本發(fā)明適當?shù)暮怂岚切┢?中至少一個核苷酸包含2’位置的低級烷基部分(例如，(；_(；，線性的或分支的，飽和或不飽 合的烷基，例如甲基、乙基、乙烯基、丙基、1-丙烯基、2-丙烯基和異丙基)的核酸。本發(fā)明的核酸也包括，但不局限于那些其中至少一個核苷酸是核酸類似物的 核酸。這種類似物的實例包括，但不局限于己糖醇(HNA)核苷酸、2’ 0-4’ C-連接的二 環(huán)的呋核亞硝脲(LNA)核苷酸、肽核酸(PNA)類似物、N3’ 一 P5’的氨基磷酸酯類似物、 phosphorodiamidate嗎啉代核苷酸類似物和它們的組合。本發(fā)明的核酸包括，但不局限于涉及將一個或多個部分或偶聯(lián)物化學連接到核酸上的核酸修飾。這種部分包括，但不局限于脂質部分，例如膽固醇部分、膽酸、硫醚，例如己 基-硫-三苯甲基硫醇(tritylthiol)、硫膽固醇、脂肪鏈，例如、十二烷基或十一烷基殘基、 磷脂，例如、二-十六基-rac-甘油或三乙銨、1，2- 二-氧-十六烷基-rac-甘油-硫-H-磷 酸鹽化合物、多胺或聚乙二醇鏈、金剛烷乙酸、棕櫚基部分、十八胺或己氨-羰基-羥膽固醇 部分。表達載體和宿主細胞本發(fā)明也提供了包含本發(fā)明的核酸的載體。在一個實施方案中，載體包含能夠驅動所述核酸在宿主細胞中表達的表達盒。本發(fā)明也提供了包含本發(fā)明的核酸或載體的宿主細胞。本發(fā)明也提供了制備可溶形式的TNFa受體的方法，所述方法包括在允許所述核 酸表達的條件下培養(yǎng)本發(fā)明宿主細胞的步驟，以及隨后從所述宿主細胞分離所述的可溶形 式的TNFa受體的步驟。本發(fā)明提供的表達載體能夠擴增或表達編碼本發(fā)明的哺乳動物TNFR的DNA。本發(fā) 明也提供了用上述表達載體轉化的宿主細胞。表達載體是可復制的DNA構建體，其具有合 成的或cDNA衍生的編碼哺乳動物TNFR或生物等效類似物的DNA片段，所述DNA片段與來源 于哺乳動物、細菌、病毒或昆蟲基因的適當?shù)霓D錄或翻譯調節(jié)元件操作性連接。轉錄單位通 常包含(a)在基因表達中具有調節(jié)作用的遺傳成分，例如轉錄啟動子或增強子，(b)被轉錄 成mRNA和翻譯成蛋白質的結構或編碼序列，和(c)適當?shù)霓D錄和翻譯起始和終止序列的組 合。這種調節(jié)元件包括控制轉錄的操縱序列，編碼適當?shù)膍RNA核醣體結合部位的序列?？?以另外整合通常賦予在宿主細胞中復制能力的復制起點和有助于識別轉化體的選擇基因。DNA區(qū)域在功能上彼此相關時，可以將它們操作性的連接。例如如果表達物順序 參與多肽分泌的前體，那么編碼信號肽(分泌引導物)的DNA操作性地與編碼多肽的DNA 連接；如果啟動子控制編碼序列的轉錄，那么它就操作性地與編碼序列連接；或者如果將 核糖體結合部位定位使其允許翻譯，那么核糖體結合部位就操作性地與編碼序列連接。通 常操作性連接意味著鄰接，而且對分泌引導物來說，也意味著鄰接和位于閱讀框內。設計的 在酵母表達系統(tǒng)中使用的結構元件優(yōu)選包括允許宿主細胞將翻譯的蛋白質分泌到細胞外 的引導序列。換句話說，重組蛋白質的表達沒有引導或運輸序列，它可以包含N末端甲硫氨 酸殘基。隨后可以任意地從表達的蛋白質上切割該殘基以提供終產品?？梢栽诨旧习m當宿主微生物，例如細菌，例如大腸桿菌或酵母，例如啤酒酵 母的均一的單一培養(yǎng)物的重組表達系統(tǒng)中表達或擴增哺乳動物TNFR DNA，其中所述的重組 表達系統(tǒng)已經穩(wěn)定將重組轉錄單位整合(通過轉化或轉染)到染色體DNA上，或者攜帶有 作為固有質粒組分的重組轉錄單位。此處限定的重組表達系統(tǒng)將組成性地表達或者在與表 達的DNA序列或人工基因有聯(lián)系的調節(jié)元件的誘導下表達異種蛋白。轉化的宿主細胞是利用重組DNA技術構建的哺乳動物TNFR載體轉化或轉染的細 胞。轉化的宿主細胞通常表達TNFR，但對克隆或擴增TNFR DNA來說，轉化的宿主細胞不需 要表達TNFR。表達哺乳動物TNFR的適當?shù)乃拗骷毎松铩⒔湍?、真菌或高級真?細胞。原核生物包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如大腸桿菌或芽胞桿菌。高級的 真核細胞包括，但不局限于已建立的昆蟲和哺乳動物細胞系。利用來源于本發(fā)明DNA構建 體的RNAs，還可以使用沒有細胞的翻譯系統(tǒng)來生產哺乳動物TNFR。供細菌、真菌、酵母和哺乳動物細胞宿主使用的適當?shù)目寺『捅磉_載體在本領域是公知的。原核表達宿主可以用來表達不需要廣泛蛋白水解作用和二硫化物加工的TNFR。 原核表達載體通常包含一個或多個表型的可選擇標記物，例如編碼賦予抗生素抗性或供給 自養(yǎng)需求的蛋白質的基因，以及宿主可以識別的保護在宿主內部擴增的復制起點。轉化的 適當?shù)脑怂拗靼ù竽c桿菌、枯草桿菌、鼠傷寒沙門氏菌，以及假單胞菌屬、鏈霉菌屬和 Staphyolococcus屬內的不同種細菌，不過也可以使用其他細菌作為選擇的宿主。供細菌使用的有用的表達載體可以包含可選擇的標記物和細菌復制起點，其中復 制起點來源于包含公知的克隆載體PBR322的遺傳成分的可商業(yè)獲得的質粒(ATCC37017)。 這些PBR322"骨架"部分與適當?shù)膯幼雍鸵磉_的結構序列組合。pBR322包含對氨芐 青霉素和四環(huán)素具有抗性的基因，因此提供了鑒定轉化細胞的簡單方式。這種商業(yè)載體包 括，例如Novagen pET 載體系列(EMD Biosciences, Inc.，Madison, Wis.)。通常在重組的微生物表達載體中使用的啟動子包括乳糖啟動子系統(tǒng)、啟動 子、T7啟動子和T71ac啟動子。特別有用的細菌表達系統(tǒng)，Novagen p ET系統(tǒng)(EMD Biosciences, Inc.，Madison, Wis.)使用了 T7或T71ac啟動子和大腸桿菌菌株，例如包含 T7RNA聚合酶基因的染色體拷貝的BL21 (DE3)。TNFR蛋白質也可以在酵母和真菌宿主中表達，優(yōu)選在來自酵母菌種，例如其他屬 的啤酒酵母中表達，例如也可以使用畢赤氏酵母或克魯維酵母菌。酵母載體通常包含來自 2U酵母質?；蜃灾鲝椭菩蛄?ARS)的復制起點、啟動子、編碼TNFR的DNA、多聚腺苷酸化 和終止轉錄的序列，以及選擇基因。酵母載體優(yōu)選包括允許酵母和大腸桿菌轉化的復制起 點和可選擇的標記物，例如大腸桿菌的氨芐青霉素抗性基因、為在色氨酸或尿嘧啶中分別 缺乏生長能力的酵母突變株提供可選擇標記物的啤酒酵母的TRP1或URA3基因，以及來源 于高表達酵母基因的用于誘導下游結構基因轉錄的啟動子。酵母宿主細胞基因組中TRP1 或URA3病變的存在為通過分別不存在色氨酸或尿嘧啶時的生長來檢測轉化提供了有效環(huán)
^Mi o酵母載體中適當?shù)膯幼有蛄邪ń饘倭虻鞍住?-磷酸甘油酸激酶或其他的糖 酵解酶，例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡 糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構化酶、磷酸葡糖異構 酶和葡糖激酶的啟動子。在酵母表達中使用的適當載體和啟動子在本領域是公知的。可以使用來自pUC18的用于在大腸桿菌中選擇和復制的DNA序列(An^基因和復 制起點)，以及包含葡萄糖可抑制的ADH2啟動子和[a ]_因子分泌引導物的酵母DNA序列 組裝優(yōu)選的酵母載體。以在啟動子和要表達的結構基因之間插入指導異種蛋白質分泌的酵 母因子引導物(leader)。可以修飾引導序列，使其在靠近3’末端的地方包含一個或 多個有用的限制性內切酶位點以促進引導序列與外源基因的融合。適當?shù)慕湍皋D化操作方 法是本領域熟練技術人員已知的。用包含ADH2啟動子的載體轉化的宿主菌株可以生長在由酵母抽提物、2%蛋 白胨、以及補充有80mg/ml腺嘌呤和80mg/ml尿嘧啶的1 %或4%葡萄糖組成的豐富培養(yǎng)基 中進行表達。培養(yǎng)基中的葡萄糖一耗盡，ADH2啟動子就會發(fā)生去阻遏。在更進一步地提純 之前，通過過濾收獲粗提的酵母上清液，并保持在4°C。也可以方便地使用多種哺乳動物或昆蟲細胞培養(yǎng)物系統(tǒng)表達TNFR蛋白質。特別優(yōu)選在哺乳動物細胞中表達重組蛋白質，因為這種蛋白質通常能夠正確折疊，適當修飾，并 且是完全有功能的。適當?shù)牟溉閯游锼拗骷毎档膶嵗ê锬I臟細胞的C0S-7系，以及 其他能夠表達適當載體的細胞系，例如，包括L細胞，例如L929、C127、3T3、中國倉鼠卵巢 (CHO)、HeLa和BHK細胞系。哺乳動物表達載體可以包含非轉錄元件，例如復制起點，適當?shù)?啟動子，例如CMVie啟動子、雞0 -肌動蛋白啟動子或合成的hEFl-HTLV啟動子，與要表達 的基因相連的增強子，以及其他5’或3’端側接的非轉錄序列，5’或3’端的非翻譯序列，例 如必需的核糖體結合部位，多腺苷酸化位點，剪接供體和受體位點，以及轉錄終止序列。在 昆蟲細胞中生產異種蛋白的桿狀病毒系統(tǒng)是本領域技術人員已知的?？梢酝ㄟ^病毒源提供在轉化脊椎動物細胞中使用的表達載體的轉錄和翻譯控制 序列。例如，通常使用的啟動子和增強子來源于多瘤、腺病毒2、猴腎病毒40(SV40)、人巨細 胞病毒，例如CMVie啟動子、HTLV，例如合成的hEFl-HTLV啟動子。來源于SV40病毒基因組 的DNA序列，例如SV40起點，早期和晚期啟動子，增強子，剪接和多腺苷酸化位點可以用于 提供另一種表達異源DNA序列所需要的遺傳成分。更進一步地，可以使用哺乳動物基因組TNFR啟動子，例如控制和/或信號序列，如 果這種控制序列與所選擇的宿主細胞相容的話。在本發(fā)明的優(yōu)選方案中，包含TNFR cDNAs的重組表達載體被穩(wěn)定地整合到宿主細 胞的DNA中。蛋白質表達和純化當使用哺乳動物或昆蟲細胞時，適當表達的TNFR蛋白質將被分泌到細胞外培養(yǎng) 基中。利用標準的生物化學技術從培養(yǎng)基中回收蛋白質，并進行濃縮和純化。在哺乳動物 細胞中通過慢病毒(lentiviral)轉導、AAV轉導、質粒轉染或任何類似的程序進行表達后， 或者在昆蟲細胞中通過桿狀病毒轉導進行表達后，利用具有合適的濾過分子量的濃縮過濾 器，例如Amicon 過濾單元濃縮這些細胞的細胞外培養(yǎng)基，為了避免TNFR蛋白質的損失， 過濾器應允許等于或低于50kDal的蛋白質流過。當在細菌培養(yǎng)物中表達TNFR蛋白質時，可以通過標準生物化學技術進行純化。溶 解細菌，除去包含TNFR的細胞提取物中的鹽分并使其濃縮。在兩種情況下都優(yōu)選通過親和層析法純化TNFR蛋白質。優(yōu)選使用具有包含 TNF-a的親合基質的柱層析。換句話說，親合力純化標記可以被添加到TNFR蛋白質的N或 C末端。例如聚組氨酸標記(His-標記)可以用于實現(xiàn)這一目的，其中聚組氨酸標記是具 有至少六個組氨酸的氨基酸基序(Hengen，P.，1995，Trends Biochem. Sci. 20 :285_86)。通 過框內添加將編碼His-標記的核苷酸序列直接添加到表達載體中的TNFR開放閱讀框的5’ 或3，端可以實現(xiàn)His-標記的添加。SEQ ID NO: 126中給出了這樣一種適合于添加羧基末 端His標記的核苷酸序列。當His標記被整合到蛋白質中時，使用鎳或鈷親和層析柱來純 化標記的TNFR，然后可以任意地將His標記切割下來。其他適當?shù)挠H合純化標記和具有這 種標記的蛋白質的提純方法是本領域公知的?；蛘?，可以使用基于非親合力的純化方案，包括在基于大小(分子篩色譜)、電荷 (陰離子和陽離子交換色譜法)和疏水性(反相色譜法)的一系列柱上分級分離TNFR提取 物。高效液相色譜法可用于簡化這些步驟。表達和純化TNFR蛋白質的其他方法是本領域公知的(參見，例如，Jacobs的美國專利 No. 5，605，690)。定義術語"核苷酸間連接基團"被用來指能夠將兩個核堿基共價連接在一起的基團， 例如，DNA單位之間、DNA單位和核苷酸類似物之間、兩個非LNA單位之間、非LNA單位和LNA 單位之間、兩個LNA單位之間的基團等等。優(yōu)選的實例包括磷酸鹽、磷酸二酯基團和硫代磷
酸酯基團。此處，使用的術語〃含氮堿基〃(nitrogenous base)包括嘌呤和嘧啶，例如DNA 核堿基A、C、T和G，RNA核堿基A、C、U和G，以及非DNA/RNA核堿基，例如5-甲基胞嘧啶 (fcC)、異胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔尿嘧啶、5-丙炔-6-氟尿嘧啶、5-甲基噻 唑尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、次黃嘌呤核苷、2，6- 二氨基嘌呤、7-丙炔-7-去氮籃 嘌呤(deazaadenine)、7_丙炔_7_去氮鳥嘌吟(deazaguanine)和2_氯6_氨基嘌呤，特別 是MeC。應理解非DNA/RNA核堿基的實際選擇將取決于寡核苷酸用來靶向的小RNA鏈中存在 的對應(或匹配)核苷酸。例如，如果對應的核苷酸是G，選擇能夠與G建立氫鍵的非DNA/ RNA核堿基通常是必需的。在這種具體情況下，對應核苷酸是G時，優(yōu)選的非DNA/RNA核堿 基的典型實例為fec。這里使用的術語〃腫瘤壞死因子受體〃、“TNF受體〃和〃 TNFR"指具有天然哺 乳動物TNF受體序列的氨基酸序列的蛋白質或基本上與天然哺乳動物TNF受體序列相似的 蛋白質，它能夠結合TNF分子。在上下文中，這種受體的"天然"受體或基因指天然存在的 受體或基因，以及這種受體和基因天然存在的等位基因變化。與TNFR結合使用的術語"成熟"指以缺乏可能存在于天然基因的全長轉錄產物 中的引導序列或信號序列的形式表達的蛋白質。這里使用的TNFR蛋白質的命名法遵循蛋白質的命名(例如TNFR2)放在種類命 名，例如hu(適合于人)或mu(適合于鼠科動物)之前，后面是△(指缺失)和刪除的外顯 子的數(shù)目的慣例。例如huTNFR2 A 7指缺乏外顯子7的人TNFR2。缺少任何物種指定時， TNFR從種屬上來說是指哺乳動物TNFR。術語"分泌的"指蛋白質是可溶的，也就是說，它不與細胞膜結合。在上下文中， 如果利用本領域技術人員已知的常規(guī)試驗，在不與膜相關聯(lián)的組分，例如細胞上清液或血 清中可以檢測到大部分的某種形式，那么這種形式就是可溶性的。術語〃穩(wěn)定的〃是指利用本領域技術人員已知的常規(guī)試驗，例如western印跡、 ELISA試驗在收獲的細胞、細胞上清液或血清中可以檢測到的分泌形式的TNFR。這里使用的術語"腫瘤壞死因子"和"TNF"指結合TNF受體的天然發(fā)生的蛋白 質配體。TNF包括，但不局限于TNF- a和TNF- 3。這里使用的術語"炎性疾病或狀態(tài)"指至少部分由TNF與其受體結合引起，或者 因為這種結合而加重的疾病、紊亂或其他的醫(yī)學狀況。這種疾病或狀態(tài)包括，但不局限于與 升高的TNF水平、升高的TNF受體水平、增強的致敏性或對應信號路徑的失調有關的那些疾 病。該術語也包括其中已知的TNF拮抗劑已經顯示有用的疾病和狀態(tài)。炎性疾病或狀態(tài)包 括，但不局限于類風濕性關節(jié)炎、幼年型類風濕性關節(jié)炎、牛皮癬、牛皮癬關節(jié)炎、強直性脊 柱炎(ankylosing spondylitis)、炎性腸病(包括Crohn氏病和潰瘍性結腸炎)、肝炎、敗 血癥、酒精性肝病和非酒精性脂肪變性。
這里使用的術語"肝炎"指以至少部分肝臟發(fā)炎為特征的胃腸疾病、狀態(tài)或紊 亂。肝炎的實例包括，但不局限于與甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒有關的肝 炎，或者與局部缺血/再灌注有關的肝臟炎癥。這里使用的術語"TNF拮抗劑"指利用本領域公知的標準試驗測量時，能夠可測 量性地抑制TNF介導的細胞毒性的蛋白質(例如參見下文實施例中描述的L929細胞毒性 試驗)。術語"結合TNF"指通過本領域眾所周知的標準結合試驗測定時，蛋白質可以結 合可檢測水平的TNF,優(yōu)選TNF-a (參見，例如Smith的美國專利No. 5，945，397的16-17 欄)。在使用標準的結合測試實驗時，本發(fā)明的每納摩爾受體優(yōu)選能夠結合大于0. 1納摩爾 的TNF-alpha，更優(yōu)選能結合大于0. 5納摩爾的TNF- a。這里使用的術語"調節(jié)元件"指涉及分子相互作用的有助于核酸功能調節(jié)，包括 但不限于核酸復制、復制、轉錄、剪接、翻譯或降解調節(jié)的核苷酸序列。在自然界中，調節(jié)可 以是增強或抑制。本領域已知的調節(jié)元件包括，例如翻譯調節(jié)序列，例如啟動子和增強子。 啟動子是在一定條件下，能幫助通常位于啟動子下游(3’方向)的編碼區(qū)域開始轉錄的DNA 區(qū)域。表達載體典型地包含與本發(fā)明的核酸操作性連接的這種調節(jié)元件。術語〃寡聚物〃、“剪接轉換寡聚物〃和〃寡核苷酸〃在此處可交換使用。這里使用的術語"操作性連接"指遺傳元件的并置，其中元件的關系允許它們以 預期方式發(fā)生作用。例如，如果啟動子幫助編碼序列開始轉錄，那么啟動子與編碼區(qū)域就是 操作性連接的(例如在表達載體中)。只要維持了這種功能關系，就可以在啟動子和編碼區(qū) 域之間插入殘基。這里使用的術語"轉化"或"轉染"指將外源核酸插入細胞，不考慮插入所使用 的方法，例如脂轉染、轉導、感染或電穿孔。外源核酸可以保持在非整合載體，例如質粒中， 或者可以整合到細胞基因組中。這里使用的術語"載體"指能運輸另一個核酸到已經被連接的分子上的核酸分 子。一種載體是"質粒"，指附加的DNA序列可以連接到其中的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種 載體是病毒載體，其中附加的DNA部分可以連接到病毒基因組中。某些載體能夠在將它們 引入其中的宿主細胞中自主復制(例如，具有細菌復制起點的細菌載體和游離型哺乳動物 載體)。其他載體(例如，非游離型哺乳動物載體)被引入宿主細胞時，會整合到宿主細胞 的基因組中，因此能夠隨宿主基因組一起復制。此外，某些載體、表達載體能夠指導與它們 操作性連接的基因的表達。通常，在重組DNA技術中使用的表達載體經常是質粒或病毒載 體形式(例如，反轉錄病毒、腺病毒和腺病毒相關病毒)。這里使用的術語"分離的蛋白質"指非天然發(fā)生的蛋白質或多肽，或者從與其天 然有關的一種或多種組分中分離的蛋白質或多肽。這里使用的術語"分離的核酸"指非天然發(fā)生的核酸，和/或處于分離片段形式 或作為較大的構建體的組分的核酸，其中所述的片段或組分來源于至少分離一次的基本上 純的核酸，即沒有污染的內源性原料，而且其數(shù)量或濃度允許通過標準生物化學方法，例如 使用克隆載體的方法鑒別和操作。這里使用的術語"純化的蛋白質"指基本上沒有其他蛋白質存在的蛋白質。然 而，這種純化的蛋白質可以包含作為穩(wěn)定劑、載體、賦形劑或共同治療劑添加的其他蛋白質。這里使用的術語"純化的"優(yōu)選指占存在的蛋白質的干重的至少50%，例如至少 80%，更優(yōu)選占存在的蛋白質的重量的95-99%，最優(yōu)選99.8%，其中存在的蛋白質排除了 作為穩(wěn)定劑、載體、賦形劑或共同治療劑添加的蛋白質。這里使用的術語"改變前信使RNA的剪接"指改變細胞前信使RNA靶的剪接，導 致剪接產品的比率改變?？梢酝ㄟ^本領域技術人員公知的多種技術檢測這種剪接改變。例 如，總細胞RNA的RT-PCR可用于檢測存在和缺少SS0時的剪接產物的比率。這里使用的術語"互補的"用來指互補性如此充分或配對如此精確以致寡核苷 酸和包含靶序列的DNA或RNA之間發(fā)生了穩(wěn)定和特異性的結合。應理解在本領域，寡核苷 酸序列不必與靶序列100%互補。例如，對于SS0來說，在允許剪接的情況下，如果存在充分 的互補性，就會發(fā)生與靶的結合，而且會避免非特異性結合。然而，優(yōu)選與靶序列(例如這 里提到的SEQ ID N01-4的區(qū)域)完全互補(即完全)的寡核苷酸或毗連核堿基序列。在寡核苷酸的上下文中使用的術語"相當于"和"相當"指本發(fā)明的化合物的 核堿基和其反向互補序列之間的比較，在一個實施方案中指核堿基序列和同等的(相同 的)核堿基序列之間，或者它們的互補序列之間的比較，其中同等的(相同的)核堿基序列 可以包含，例如其他的核堿基，但保持相同的堿基序列。核苷酸類似物可以直接地與它們的 同等物或對應的自然核苷酸進行比較。與一條序列形成反向互補的序列被稱為該序列的互 補序列。當提到這里涉及的核苷酸分子的長度時，長度相當于單體單位，即核堿基的數(shù)目， 不考慮那些單體單位是核苷酸還是核苷酸類似物。就核堿基而言，術語單體和單位在此處 可交換使用。應理解，當在比值或數(shù)值范圍的上下文中使用術語"大約"時，讀出的公開內容 應包括提到的比值或范圍。此處在蛋白質或多肽(序列)的上下文中使用的術語"變體"指通過在原始(親 本)多肽中插入、缺失或替換一個或多個氨基酸，即至少一個氨基酸，但優(yōu)選少于50個氨基 酸，例如少于40，少于30，少于20或少于10個氨基酸，例如1個氨基酸，1-2個氨基酸，1-3 個氨基酸，1-4個氨基酸，1-5個氨基酸，從所述多肽制備的多肽，或者利用來自所述多肽的 序列信息制備的多肽。此處在蛋白質或多肽(序列)的上下文中使用的術語"同系物"指與所述多肽序 列至少70%同源，例如至少80%同源，例如至少85%同源或至少90%同源，例如至少95%， 96 %，97 %，98 %或99 %同源的多肽。可以利用Blosum62算法，用ClustalW比對算法確定兩 個多肽之間的同源性，其中缺口程度(Gap Extent) =0.5，缺口開放(Gap open) = 10(參 jAL,http://www. ebi. ac. uk/emboss/align/index. html)。比對在一個實施方案中可以是局 部比對(水)，或者在分開的另一個實施方案可以是整體比對(針))。因為此處提到的外 顯子缺失的TNFR蛋白質的同系物包括各自外顯子中的缺失，因此更優(yōu)選整體比對。此處在蛋白質或多肽(序列)的上下文中使用的術語"片段"指只由多肽序列的 一部分組成的多肽。因此片段可以包含所述多肽序列的至少5%，例如所述多肽序列的至少 10%，包括至少 20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90% 或 95%。上述變體、片段和同系物的定義也適合核酸序列，但同源性算法使用的是 DNAfull。顯而易見地是，當提到核酸變體、片段或同系物時，術語蛋白質、多肽和氨基酸應相應地替換為核酸、多核苷酸或核堿基/核苷酸。這里使用的術語"膜結合形式"或"整體膜形式"指具有跨越細胞膜的氨基酸 序列的蛋白質，氨基酸序列在膜的兩邊。這里使用的術語"穩(wěn)定分泌的配體結合形式"或有時所稱的"穩(wěn)定可溶的配體 結合形式"(此處術語"分泌"和"可溶的"是同義詞，而且可以交換使用)指通過被分 泌，保持穩(wěn)定以及仍然能結合對應的配體而與天然膜結合形式的受體相關的蛋白質。應注 意這些形式不是由這種分泌形式是否具有生理活性限定的，只要這種剪接變體產物在產生 時是被分泌的，穩(wěn)定的，而且仍能結合配體就可以。術語"分泌的"指可溶形式，也就是說，它不再與細胞膜結合。在上下文中，如果 利用本領域技術人員已知的常規(guī)試驗發(fā)現(xiàn)一種形式是可溶的，那么就可以在不與膜關聯(lián)的 部分，例如細胞上清液或血清中檢測到大部分這種形式。術語"穩(wěn)定的"指本領域技術人員利用常規(guī)試驗可檢測的分泌形式。例如，蛋白 質印跡、ELISA試驗可用于檢測收獲的細胞，細胞上清液或病人血清中的這種形式。術語"結合配體"指所述形式雖然未必保持了對應整體膜形式的全部特異性配 體結合活性，但至少保持了一些顯著水平的特異性配體結合活性。這里使用的術語"降低配體的活性"指導致由配體結合或與受體的相互作用產 生的胞內信號傳輸下降的任何作用。例如，配體與它的受體的可溶形式的結合或者降低有 效結合配體的膜形式的受體的數(shù)量可以降低活性。藥物組合物和制劑本發(fā)明其他的實施方案涉及包含本發(fā)明的寡聚物、蛋白質和核酸的藥物組合物。本發(fā)明的寡聚物、核酸和蛋白質可以通過摻合，包封，共軛結合或其他方式聯(lián)合到 其他分子，分子結構或化合物的混合物中，具體實例有有助于攝取，分布和/或吸收的脂質 體，受體靶分子，口服劑型，直腸給藥劑型，局部給藥劑型或其他劑型。本發(fā)明的劑型包含在生理上或藥學上可接受的載體，例如水性載體中的本發(fā)明的 寡聚物、核酸或蛋白質。因此本發(fā)明使用的劑型包括，但不局限于那些適合于腸胃外給藥的 劑型，包括關節(jié)內、腹膜內、靜脈內、動脈內、皮下，肌肉注射或輸注的劑型，以及那些適合于 局部給藥、眼用、經陰道，口服、經直腸或肺給藥的劑型，包括粉末或氣霧劑的吸入或吹入， 包括通過噴霧器、氣管內和鼻內遞送的劑型。所述制劑可以方便地以單位制劑形式存在，也 可以通過本領域公知的任何方法制備。在任何給定的情況下，最適當?shù)慕o藥途徑取決于受 試者待治療的狀態(tài)的性質和嚴重程度，以及使用的特殊活性化合物。本發(fā)明的藥物組合物包括，但不局限于其生理上和藥學上可接受的鹽，即保持母 體化合物想要的生物活性，此外還不產生不希望有的毒性作用的鹽。這種鹽的實例有(a) 用陽離子，例如鈉、鉀、銨、鎂、鈣、多胺，例如精胺和亞精胺等等形成的鹽；(b)用無機酸， 例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等等形成的酸加成鹽；(c)用有機酸，例如乙酸、草酸、 酒石酸、丁二酸、馬來酸、富馬酸、葡糖酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、安息香酸、丹寧酸、棕 櫚酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、P-甲苯磺酸、萘二磺酸(naphthalene disulfonic acid)、多聚半乳糖醛酸等等形成的鹽。本發(fā)明提供了利用上述的寡聚物、蛋白質和核酸制備用于治療患有下文討論的涉 及TNF活性過強的炎性病癥的病人的藥物制劑的用途。在制造依照本發(fā)明的藥物時，本發(fā)明的寡聚物、核酸和蛋白質典型地與其它的可接受的載體混合。當然，載體必須是可接受 的，也就是與劑型中的任何其他成分相容，而且必須對病人沒有害處。載體可以是固體或液 體。本發(fā)明的寡聚物、核酸和蛋白質被摻入到通過任何基本上由混合組分組成的公知制藥 技術制備的本發(fā)明的制劑中，其中所述制劑任意地包括一種或多種附加的治療成分。本發(fā)明的制劑包括活性化合物的無菌的水性和非水性注射溶液，這種制劑優(yōu)選與 預期的接受者的血液等滲，而且基本上無熱原。這些制劑可以包含抗氧化劑、緩沖液、抑菌 劑，以及使制劑與預期的接受者的血液等滲的溶質。水性和非水性的無菌的懸浮液可以包 括，但不局限于懸浮劑和增稠劑。制劑可以存在于單位劑量或多劑量容器中，例如密封的安 瓿和管形瓶中，而且可以保存在只需要使用之前立即添加無菌液體載體，例如鹽水或注射 用水的凍干條件下。在該制劑中，本發(fā)明的寡聚物、核酸和蛋白質可以包含在粒子或囊，例如適合于 腸胃外給藥的脂質體或微晶內。粒子可以是任何適當結構，例如單層或多層的粒子，只要 本發(fā)明的寡聚物、核酸和蛋白質包含在其中就可以。這種粒子和囊特別優(yōu)選帶正電荷的 脂質，例如 N-[l-(2，3-dioleoyloxy)丙基]-N，N，N_ 三甲基-ammoniummethy 1 sulfate 或"DOTAP"。這種脂質粒子的制備是公知的(參見參考文獻美國專利No. 5，976，879的第 6欄)。因此，本發(fā)明的一個實施方案涉及通過施用穩(wěn)定分泌的配體結合形式的TNF受體 降低該受體的TNF活性，從而治療炎性疾病或狀態(tài)的方法。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉 及通過施用編碼穩(wěn)定分泌的配體結合形式的TNF受體的寡核苷酸降低該受體的TNF活性， 從而治療炎性疾病或狀態(tài)的方法。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及生產穩(wěn)定分泌的配體 結合形式的TNF受體的方法。下文討論的本發(fā)明的以下方面可應用到上述的實施方案中。本發(fā)明的方法、核酸、蛋白質和劑型也是有用的體外或體內工具。本發(fā)明的實施方案可用于治療執(zhí)業(yè)醫(yī)生打算限制TNF作用或TNF活化的信號路徑 的任何狀態(tài)。特別是，本發(fā)明可用于治療炎性疾病。在一個實施方案中，所述狀態(tài)是炎性系 統(tǒng)性疾病，例如類風濕性關節(jié)炎或牛皮癬關節(jié)炎。在另一個實施方案中，所述疾病是炎性肝 病。炎性肝病的實例包括，但不局限于與甲型、乙型或丙型肝炎病毒有關的肝炎，酒精性肝 病和非酒精性脂肪變性。在另一個實施方案中，炎性疾病是皮膚疾病，例如牛皮癬。本發(fā)明的用途包括，但不局限于治療已知的TNF拮抗劑已經顯示有用的疾 病。三個具體的TNF拮抗劑目前已被FDA批準。這些藥物是etanerc印t(Enbrel )、 infliximab ( Remicade )和adalimumab ( Humira )。這些藥物中的一個或多個已被批 準用于治療類風濕性關節(jié)炎、幼年型類風濕性關節(jié)炎、牛皮癬、牛皮癬關節(jié)炎、強直性脊柱 炎和炎性腸病(Crohn氏病或潰瘍性結腸炎)。利用蛋白質治療炎性疾病本發(fā)明的一個實施方案涉及通過給病人施用SSOs治療炎性疾病或狀態(tài)的方法， 所施用的SSOs能改變前信使RNA的剪接以產生編碼穩(wěn)定分泌的配體結合形式的TNFR超家 族受體的剪接變體，因此能降低該配體對那種受體的活性。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉 及通過給細胞施用SSOs在細胞中生產穩(wěn)定分泌的配體結合形式的TNFR超家族受體的方 法。
在用于治療用途時，將本發(fā)明的純化的TNFR蛋白質施用給患者，優(yōu)選施用給人， 以治療依賴TNF的炎性疾病，例如關節(jié)炎。在對人進行治療時，優(yōu)選使用huTNFRs。可以通 過彈丸注射、啦連輸注、從植入物持續(xù)釋放或其他適當?shù)募夹g施用本發(fā)明的TNFR蛋白質。 典型地，以包含純化蛋白質和生理上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑的組合物的形式施用 TNFR治療蛋白質。所使用的這種載體的劑量和濃度對接受者無毒性。通常，這種組合物的 制備需要將TNFR與緩沖液，抗氧化劑，例如抗壞血酸，多肽，蛋白質，氨基酸，包括葡萄糖， 蔗糖或糊精的糖類，如EDTA的螯合劑，谷胱甘肽及其他穩(wěn)定劑和賦形劑組合。作為示例的 適當稀釋劑有與同種血清白蛋白混合的中性緩沖鹽水或鹽水。優(yōu)選利用適當?shù)馁x形劑溶 液，例如作為稀釋劑的蔗糖將產物配制成凍干劑。也可以添加防腐劑，例如苯甲醇。當然， 給藥的數(shù)量和頻率將取決于這種因子的性質，待治療適應癥的嚴重性，期望的反應，病人的 狀態(tài)等等。系統(tǒng)施用的本發(fā)明的TNFR蛋白質的治療有效量的優(yōu)選范圍為0. lmg/kg/周到大 約100mg/kg/周。在優(yōu)選的實施方案中，施用的TNFR的量為大約0. 5mg/kg/周到大約50mg/ kg/周。局部應用時，優(yōu)選劑量為每次注射大約0. 0lmg/kg到大約1. Omg/kg。利用表達載體升高哺乳動物中TNF拮抗劑的水平本發(fā)明提供了升高哺乳動物中TNF拮抗劑水平的方法。該方法包括用此處描述的 表達載體轉化哺乳動物細胞的步驟，其中表達載體驅動此處描述的TNFR的表達。該方法對 大型哺乳動物，例如家庭寵物，用于生產食物的哺乳動物和靈長類動物特別有用。大型哺乳 動物的實例有狗，貓、馬、奶牛、羊、鹿和豬。靈長類動物的實例有猴、猿和人?？梢栽隗w內或體外轉化哺乳動物細胞。當在體內轉化時，表達載體被直接施用，例 如通過注射施用給哺乳動物。在體內轉化細胞的方式在本領域是公知的。當在體外轉化時， 先從哺乳動物獲取細胞，在體外進行轉化，然后將轉化的細胞再移植到哺乳動物中。本發(fā)明的用途包括，但不局限于治療已知的TNF拮抗劑已經顯示有用的疾 病。三個具體的TNF拮抗劑目前已被FDA批準。這些藥物是etanerc印t(Enbrel )、 infliximab ( Remicade )和adalimumab ( Humira )。這些藥物中的一個或多個已被批 準用于治療類風濕性關節(jié)炎、幼年型類風濕性關節(jié)炎、牛皮癬、牛皮癬關節(jié)炎、強直性脊柱 炎和炎性腸病(Crohn氏病或潰瘍性結腸炎)。利用開發(fā)的適合AS0N的步驟可以完成給受試者施用SS0的過程。通過靜脈內施 用已經成功地將鹽水中的AS0N以高達6mg/kg的劑量施用給了實驗動物和受試驗的人，每 周施用三次(Yacysyhn，B. R.，et al, 2002,Gut 51 :30(治療 Crohn 氏病的抗 ICAM-1AS0N)； Stevenson, J.，et al.，1999，J. ClinicalOncology 17 :2227 (靴向 PBMC 的抗RAF-1AS0N))。 已經報告靶向于TNF- a的2'o-MOE硫代磷酸酯AS0N的藥物動力學(Geary, R. S.，et al.， 2003，DrugMetabolism and Disposition 31 :1419)。也已經報告了混合的 LNA/DNA 分子的 系統(tǒng)有效性(Fluiter, K.，et al.，2003，Nucleic Acids Res. 31 953)。利用2’ 0-M0E硫代磷酸酯和PNA化學作用調查了 SS0在小鼠模型系統(tǒng)中的全身 活性。在除腦、胃和真皮外的所有被研究的組織中觀察到了顯著活性(SaZani，P.，et al., 2002, Nature Biotechnology 20,1228)。通常，在傳統(tǒng)反義治療中有用的任何施藥方法都可以用來施用本發(fā)明的SS0。為了 在培養(yǎng)細胞中測試SS0，可以使用已經開發(fā)的測試AS0N或SS0的任何技術。
本發(fā)明的劑型包含在生理上或藥學上可接受的載體，例如水性載體中的SSOs。因 此本發(fā)明使用的劑型包括，但不局限于那些適合于腸胃外給藥的劑型，包括腹膜內、關節(jié) 內、靜脈內、動脈內、皮下，肌肉注射或輸注的劑型，以及那些適合于局部給藥、眼用、經陰 道，口服、經直腸或肺(包括粉末或氣霧劑的吸入或吹入，包括通過噴霧器、氣管內和鼻內 遞送)施用的劑型。所述制劑可以方便地以單位制劑形式存在，也可以通過本領域公知的 任何方法制備。在任何給定的情況下，最適當?shù)慕o藥途徑取決于受試者待治療的狀態(tài)的性 質和嚴重程度，以及使用的特殊活性化合物。本發(fā)明的藥物組合物包括，但不局限于其生理上和藥學上可接受的鹽，即保持母 體化合物想要的生物活性，此外還不產生不希望有的毒性作用的鹽。這種鹽的實例有(a) 用陽離子，例如鈉、鉀、銨、鎂、鈣、多胺，例如精胺和亞精胺等等形成的鹽；(b)用無機酸，例 如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等等形成的酸加成鹽(acid addition salts) ； (c)用有機 酸，例如乙酸、草酸、酒石酸、丁二酸、馬來酸、富馬酸、葡糖酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、安 息香酸、丹寧酸、棕櫚酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、P-甲苯磺酸、萘二磺酸、多聚半乳 糖醛酸等等形成的鹽。本發(fā)明提供了利用具有上述特征的SSOs制備用于在受炎性紊亂折磨的病人體內 增加缺乏外顯子7的哺乳動物TNFR2蛋白質/它對應的膜結合形式的比率的藥物的用途， 其中炎性紊亂涉及上文討論的TNF-alpha。在制造依照本發(fā)明的藥物時，SSOs典型地與可 接受的載體混合。當然，載體必須是可接受的，也就是與劑型中的任何其他成分相容，而且 必須對病人沒有害處。載體可以是固體或液體。SSOs被摻入到通過任何基本上由混合組分 組成的公知制藥技術制備的本發(fā)明的制劑中，其中所述制劑任意地包括一種或多種附加的 治療成分。本發(fā)明的制劑包括活性化合物的無菌的水性和非水性注射溶液，這種制劑優(yōu)選與 預期的接受者的血液等滲，而且基本上無熱原。這些制劑可以包含抗氧化劑、緩沖液、抑菌 劑，以及使制劑與預期的接受者的血液等滲的溶質。水性和非水性的無菌的懸浮液可以包 括，但不局限于懸浮劑和增稠劑。制劑可以存在于單位劑量或多劑量容器中，例如密封的安 瓿和管形瓶中，而且可以保存在只需要使用之前立即添加無菌液體載體，例如鹽水或注射 用水的凍干條件下。在該制劑中，SSOs可以包含在粒子或囊，例如適合于腸胃外給藥的脂質體或微晶 內。粒子可以是任何適當結構，例如單層或多層的粒子，只要SSOs包含在其中就可以。這 種粒子和囊特別優(yōu)選帶正電荷的脂質，例如N-[l-(2，3-di0le0yl0Xy)丙基]_N，N，N_三甲 基-ammoniummethylsulfate或〃 D0TAP"。這種脂質粒子的制備是公知的(參見參考文獻 美國專利No. 5，976，879的第6欄)。SS0可以靶向調節(jié)剪接的任何元件或元件組合，包括3’剪接位點，5’剪接位點，分 支點，多聚嘧啶區(qū)域，外顯子剪接增強子，外顯子剪接沉默子，內含子剪接增強子，內含子剪 接沉默子。本領域熟練技術人員可以理解，可以利用具有與包含外顯子7和它的鄰近內含子 的TNFR1或TNFR2基因部分的至少8個核苷酸，至少9個，至少10個，至少11個，至少12 個，至少13個，至少14個，至少15個，優(yōu)選10-16個核苷酸互補的序列的SS0實施靶向人 TNF TNFR2的本發(fā)明。
SEQ ID NO 3包含TNFR2的外顯子7的序列和側接內含子的50個相鄰核苷酸。例 如，靶向人TNFR2的SS0可以具有選自表4列出的序列的核堿基序列。當使用增強親合力 的修飾，包括但不局限于LNA或g-clamp核苷酸時，本領域技術人員將會認識到SS0的長度 可以相應地降低。本領域熟練技術人員也承認SS0序列的選擇必須要考慮避免自身互補的SS0，其 中自身互補可能導致部分"發(fā)夾"雙鏈結構的形成。另外，應避免高GC含量以將非特異性 堿基配對的可能性降到最低程度。此外，也應該避免使用通過BLAST顯示的與off-target 基因配對的SSOs。在一些情況下，選擇靶向人和至少一個其他物種的SS0序列是優(yōu)選的。開始在人 類中使用之前，可在所述的其他物種中用這些SSOs測試和優(yōu)化本發(fā)明，因此有助于調整 報批和藥物開發(fā)目的。例如，靶向人TNFR2的SEQ IDNos 14，30，46，70和71也與對應的 Mullata獼猴序列100%互補。因此，在用于人類以前，可以先在猴子體內用這些序列進行 實驗治療。下文討論的本發(fā)明的以下方面可應用到上述的實施方案中。SS0的長度與反義寡核苷酸(AS0N)相似，典型地在大約10_24個核苷酸之間?？?以利用SSOs具有的與RNA雜交，但不象常規(guī)的反義2匸脫氧寡核苷酸那樣活化RNAse H引 起的RNA破壞作用的幾種化學性質來實施本發(fā)明?？梢岳?’ 0修飾的核酸寡聚物，例如 2’氧-甲基或2’氧-甲氧乙基硫代磷酸酯實施本發(fā)明。核堿基不必連接到糖上；可以使 用被稱為肽核酸寡聚物或基于嗎啉的寡聚物。在Sazani，p. et al.，2001，nucleic acids res. 29 3695中發(fā)現(xiàn)了對這些不同的化學連接過程的比較。術語剪接轉換寡核苷酸預計包 括上述形式。本領域技術人員能夠理解反義寡核苷酸gapmers和SSOs之間的關系。Gapmers 是包含RNAse H活化區(qū)域(典型地為2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯)的AS0N，其中活化區(qū) 域與不活化的核酸酶抵抗寡聚物側接。通常，在SS0中可以使用適合于gapmerASON中的側 接序列的任何化學過程。通過公知的固相合成技術可以制備本發(fā)明的SSOs?？梢粤硗馐褂没蛱鎿Q使用其他 的任何適合這種合成的工具。已經公知可利用類似的方法制備寡核苷酸，例如硫代磷酸酯 和烷基衍生物。鎖定的核酸(LNA)提供了特別優(yōu)選的化學過程(Koshkin, A. A.，et al.，1998， Tetrahedron 54 3607 ；Obika, S.，et al.，1998，Tetrahedron Lett. 39 5401)。LNA 是常 規(guī)的磷酸二酯連接的核糖核苷酸，除了呋核亞硝脲部分是2’ 0和4’ C之間的橋接形成二環(huán) 外。這種橋接強制呋核亞硝脲環(huán)構象變成寡核苷酸與互補RNA雜交時所采用的V-橋(endo) 構象。W003/095467種描述了合成LNA的最新進展。大多數(shù)典型的橋是亞甲基或乙烯基。 Morita, et al.，2003，Bioorg. and Med. Chem. 11 -.2211 中描述了 2，0，4，C_ 乙烯-橋接核 酸(ENA)和其他LNA的合成。然而，可以使用可替換的化學過程，用2’ N取代2’ 0。LNA和 常規(guī)的核苷酸可以混合形成嵌合的SS0。例如，可以使用交替的LNA和2’脫氧核苷酸或交 替的LNA和2’0-Me或2’0_M0E形成的嵌合的SS0。這些化學過程的任何替換方式，不僅僅 是2’ -脫氧核苷酸，都可以是替換磷酸二酯的phosphorothioatediester連接。在體內使 用時，優(yōu)選硫代磷酸酯連接。當在SS0中使用LNA核苷酸時，也存在非LNA核苷酸的情形是優(yōu)選的。LNA核苷酸在有非常明顯的非特異性結合的雜交中具有如此高的親合力，以至于可以降低游離SS0 的有效濃度。當使用LNA核苷酸時，也可以用2'脫氧核苷酸方便地替換它們?？梢允褂?交替的核苷酸，交替的二核苷酸或混合型，例如LDLDLD或或LDDLDD。當2’-脫氧核苷酸或 2’-脫氧核苷硫代磷酸酯與LNA核苷酸混合時，避免RNase H活化很重要。預計SS0的LNA 核苷酸在大約三分之一和三分之二之間比較合適。例如，如果SS0是12聚體，那么將存在 至少四個LNA核苷酸和四個常規(guī)核苷酸。SS0的堿基可以是傳統(tǒng)的胞嘧啶、鳥嘌呤、腺嘌呤和尿嘧啶或胸腺嘧啶脫氧核苷。 或者，也可以使用修飾的堿基。特別有價值的是結合親合力增加的修飾堿基。優(yōu)選的修飾 堿基的一個非限制性例子是被稱為G-clamp或9-(氨基乙氧基)吩惡嗪的核苷酸、與鳥嘌 呤核苷形成4個氫鍵的胞嘧啶類似物(Flanagan, ff. M.，et al.，1999，Proc. Natl. Acad. Sci. 96 3513 ；Holmes, S.C，2003，Nucleic Acids Res. 31 2759)?？梢岳貌换罨疪Nase H的多種可選擇的化學過程。例如適當?shù)腟SOs可能 是其中至少一個或全部核苷酸間橋接磷酸鹽殘基是經過修飾的磷酸鹽，例如膦酸甲酯、 甲基硫代月粦酸酉旨、phosphoromorpholidates、phosphoropiperazidates禾口氛基憐酸酉旨 (phosphoroamidates)的寡核苷酸。例如依照所描述的內容可以每隔一個地修飾核苷酸 間橋接的磷酸鹽殘基。在另一個非限制性例子中，這種SS0是其中至少一個或全部核苷酸 包含2’位置的低級烷基部分(例如，C1-C4，線性的或分支的，飽和或不飽合的低級烷基，例 如甲基、乙基、乙烯基、丙基、1-丙烯基、2-丙烯基核異丙基)的寡核苷酸。例如，依照所描 述的內容可以每隔一個地修飾核苷酸。[參見美國專利5，976，879的第4欄]。SS0的長度(即寡聚物中單體的數(shù)目)為大約10-大約30個堿基。在一個實施 方案中，20個堿基的2’0-Me-核糖核苷硫代磷酸酯是有效的。本領域熟練技術人員應理解 當使用增加親合力的化學修飾時，SS0可以短些，但仍然保持特異性。本領域熟練技術人員 應該能更進一步地理解SS0長度的上限是通過保持特異性識別靶序列，避免二級結構形成 SS0的自身雜交，以及獲取進入細胞的限制來限定的。這些限制意味著長度增加(超過依賴 于SS0親合力的一定長度)的SS0經常被發(fā)現(xiàn)是特異性較低、沒有活性或活性很差的SS0。本發(fā)明的SSOs包括，但不局限于涉及通過化學連接將增強SS0活性、細胞分布或 細胞吸收的一個或多個部分或偶聯(lián)物連接到SS0上的SS0修飾。這種部分包括，但不局限 于脂質部分，例如膽固醇部分、膽酸、硫醚，例如己基-硫-三苯甲基硫醇(tritylthiol)、硫 膽固醇、脂肪鏈，例如、十二烷基或十一烷基殘基、磷脂，例如、二-十六基-rac-甘油或三乙 銨-1，2- 二-氧-十六烷基-rac-甘油基-3-氫-磷酸鹽化合物、多胺或聚乙二醇鏈、金剛 烷乙酸、棕櫚基部分、十八胺或己氨_羰基-羥膽固醇部分。不必均勻地改變給定SS0中的所有位置，實際上可以在單個化合物，乃至SSOs內 部的單個核苷中引入一種以上的上述修飾。SSOs可以與其他分子、分子結構或化合物的混 合物混合、包封、偶聯(lián)在一起，或者與它們有關聯(lián)，例如，形成有助于吸收、分布和/或吸收 的脂質體、受體靶向的分子，口服劑型、直腸給藥劑型、局部給藥劑型或其他劑型。本領域熟練技術人員應理解細胞分化包括，但不局限于剪接體的分化。因此，本發(fā) 明的任何特殊SS0的活性取決于將其引入其中的細胞類型。例如，在一種細胞類型中有效 的SSOs在另一種細胞類型中可能是無效的。本發(fā)明的方法、寡核苷酸和劑型也是有用的調查人或動物基因剪接的體外或體內工具。通過此處描述的步驟或本領域技術人員熟知的所述步驟的修飾可以實施這種方法。本發(fā)明可用于治療執(zhí)業(yè)醫(yī)生打算限制TNF超家族配體作用或這種配體活化的信 號路徑的任何狀態(tài)。特別是，本發(fā)明可用于治療炎性疾病。在一個實施方案中，所述狀態(tài)是 炎性系統(tǒng)性疾病，例如類風濕性關節(jié)炎或牛皮癬關節(jié)炎。在另一個實施方案中，所述疾病是 炎性肝病。炎性肝病的實例包括，但不局限于與甲型、乙型或丙型肝炎病毒有關的肝炎，酒 精性肝病和非酒精性脂肪變性。在另一個實施方案中，炎性疾病是皮膚疾病，例如牛皮癬。本發(fā)明的用途包括，但不局限于治療已知的TNF拮抗劑已經顯示有用的疾 病。三個具體的TNF拮抗劑目前已被FDA批準。這些藥物是etanerc印t(Enbrel )、 infliximab ( P\emicade )和 adalimumab ( Humira )。這些藥物中的一個或多個已被批 準用于治療類風濕性關節(jié)炎、幼年型類風濕性關節(jié)炎、牛皮癬、牛皮癬關節(jié)炎、強直性脊柱 炎和炎性腸病(Crohn氏病或潰瘍性結腸炎)。在優(yōu)選的實施方案中，受體是TNFR1或TNFR2受體。在其他的實施方案中，受體 是與TNFR1和TNFR2充分同源的TNFR超家族的成員，例如TNFRSF3、TNFRSF5或TNFRSFI IA，這樣與外顯子7和8同源的兩個外顯子中的一個或兩個缺失都會產生分泌形式的受體。 本領域熟練技術人員應理解，本發(fā)明的可操作性不取決于這種分泌形式是否是有生理活性 的，只要這種剪接變體的產物是分泌的、穩(wěn)定的，且能結合配體就可以。利用開發(fā)的適合AS0N的步驟可以完成給受試者施用SS0的過程。通過靜脈內施 用已經成功地將鹽水中的AS0N以高達6mg/kg的劑量施用給了實驗動物和受試驗的人，每 周施用三次(Yacysyhn，B. R.，et al, 2002, Gut 51 :30(治療 Crohn 氏病的抗 ICAM-1AS0N)； Stevenson, J.，et al.，1999，J. ClinicalOncology 17 :2227 (靴向 PBMC 的抗RAF-1AS0N))。 已經報告靶向于TNF- a的2'o-MOE硫代磷酸酯AS0N的藥物動力學(Geary, R. S.，et al.， 2003，DrugMetabolism and Disposition 31 :1419)。也已經報告了混合的 LNA/DNA 分子的 系統(tǒng)有效性(Fluiter, K.，et al.，2003，Nucleic Acids Res. 31 953)。利用2’ 0-M0E硫代磷酸酯和PNA化學作用調查了 SS0在小鼠模型系統(tǒng)中的全身 活性。在除腦、胃和真皮外的所有被研究的組織中觀察到了顯著活性(SaZani，P.，et al., 2002, Nature Biotechnology 20,1228)。通常，在傳統(tǒng)反義治療中有用的任何施藥方法都可以用來施用本發(fā)明的SS0。為了 在培養(yǎng)細胞中測試SS0，可以使用已經開發(fā)的測試AS0N或SS0的任何技術。本發(fā)明的劑型包含在生理上或藥學上可接受的載體，例如水性載體中的SSOs。因 此本發(fā)明使用的劑型包括，但不局限于那些適合腸胃外給藥的劑型，包括腹腔內、靜脈內、 動脈內、皮下，肌肉注射或輸注的劑型，以及那些適合局部給藥(包括眼用的和用于黏膜 的，包括陰道遞送)，口服、經直腸或肺(包包括粉末或氣霧劑的吸入或吹入，包括通過噴霧 器、氣管內、鼻內遞送)給藥的劑型。所述制劑可以方便地以單位制劑形式存在，也可以通 過本領域公知的任何方法制備。在任何給定的情況下，最適當?shù)慕o藥途徑取決于受試者待 治療的狀態(tài)的性質和嚴重程度，以及使用的特殊活性化合物。本發(fā)明的藥物組合物包括，但不局限于其生理上和藥學上可接受的鹽，即保持母 體化合物想要的生物活性，此外還不產生不希望有的毒性作用的鹽。這種鹽的實例有(a) 用陽離子，例如鈉、鉀、銨、鎂、鈣、多胺，例如精胺和亞精胺等等形成的鹽；(b)用無機酸，例 如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等等形成的酸加成鹽；(c)用有機酸，例如乙酸、草酸、酒石酸、丁二酸、馬來酸、富馬酸、葡糖酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、安息香酸、丹寧酸、棕櫚 酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、P"甲苯磺酸、萘二磺酸、多聚半乳糖醛酸等等形成的 鹽；以及(d)由基本陰離子，例如氯、溴和碘形成的鹽。本發(fā)明提供了利用具有上述特征的SSOs制備用于在受炎性紊亂折磨的病人體內 增加TNFR超家族成員的可溶形式/它對應的膜結合形式的比率的藥物的用途，其中炎性紊 亂涉及細胞因子，例如，上文討論的TNF-alpha的活性過強。在制造依照本發(fā)明的藥物時， SSOs典型地與可接受的載體混合。當然，載體必須是可接受的，也就是與劑型中的任何其他 成分相容，而且必須對病人沒有害處。載體可以是固體或液體。SSOs被摻入到通過任何基 本上由混合組分組成的公知制藥技術制備的本發(fā)明的制劑中，其中所述制劑任意地包括一 種或多種附加的治療成分。本發(fā)明的制劑包括活性化合物的無菌的水性和非水性注射溶液，這種制劑優(yōu)選與 預期的接受者的血液等滲，而且基本上無熱原。這些制劑可以包含抗氧化劑、緩沖液、抑菌 劑，以及使制劑與預期的接受者的血液等滲的溶質(solutes)。水性和非水性的無菌的懸浮 液可以包括，但不局限于懸浮劑和增稠劑。制劑可以存在于單劑量或多劑量容器，例如密封 的安瓿和管形瓶中，可以保存在凍干(凍干)狀態(tài)，在使用之前，只需要立刻添加無菌液體 載體，例如鹽水或注射用水就可以。在該制劑中，SSOs可以包含在脂質粒子或囊，例如適合于腸胃外給藥的脂質體或 微晶內。粒子可以是任何適當結構，例如單層或多層的粒子，只要SSOs包含在其中就可以。 這種粒子和囊特別優(yōu)選帶正電荷的脂質，例如N-[l-(2，3-di0le0yl0Xi)丙基]-N，N, N-三 甲基-ammoniummethylsulfate或〃 D0TAP"。這種脂質粒子的制備是公知的。[參見參考 文獻美國專利5，976，879的第6欄]SS0可以靶向調節(jié)剪接的任何元件或元件組合，包括3’剪接位點，5’剪接位點， 分支點，多聚嘧啶區(qū)域，外顯子剪接增強子，外顯子剪接沉默子，內含子剪接增強子，內含子 剪接沉默子。在顯示SSOs活性的下列表格的引導下可以確定SS0的序列，其中SSOs的序 列和位置被發(fā)現(xiàn)描述在圖20中。所屬技術領域的技術人員將注意到1)與外顯子互補的 SSOs不必與剪接受體位置或剪接供體位置互補，注意表1的SSOs A7-10、B7-7和B7-9 ；2) 與內含子序列互補的SSOs和少至外顯子一個核苷酸的SSOs是可操作性的，注意的A8-5和 B7-6(表 1)；3)與緊鄰外顯子的內含子互補的SSOs也是有效的，注意表2的3312 ；和4)單獨 的寡核苷酸的效力通?？梢灶A示與其他SSOs組合的SS0的效力。本領域熟練技術人員可以理解，可以利用具有與包含外顯子7或8和它們的鄰近 內含子的TNFR1或TNFR2基因部分的至少10個核苷酸，優(yōu)選15-20個核苷酸互補的序列的 SS0實施靶向人TNF-a受體的本發(fā)明。更優(yōu)選外顯子本身的至少一個核苷酸被包含在互 補序列內部。SEQ ID Nos :1-4 包含 TNFR1(SEQ ID Nos :1 和 2)和 TNFR2 (SEQ ID Nos :3 禾口 4)的外顯子7和8，以及側接的內含子的50個相鄰核苷酸的序列。當使用增強親合力的修 飾，包括，但不限于LNA或G-clamp核苷酸時，熟練技術人員應認識到SS0的長度可以相應 地降低。當使用交替的常規(guī)核苷酸和LNA核苷酸時，16個核苷酸的長度是有效的。本領域熟練技術人員也承認SS0序列的選擇必須要考慮避免自身互補的SS0，其 中自身互補可能導致部分"發(fā)夾"雙鏈結構的形成。另外，應避免高GC含量以將非特異性堿基配對的可能性降到最低程度。此外，也應該避免使用通過BLAST顯示的與off-target 基因配對的SSOs。在一些情況下，選擇靶向人和至少一個其他物種的SS0序列是優(yōu)選的。使用在人 類中開始之前，可在所述的其他物種中用這些SSOs測試和優(yōu)化本發(fā)明，因此有助于調整報 批和藥物開發(fā)目的。例如，靶向人TNFR2的SEQ IDNos 74，75，77，78，80和89也與對應的 Macaca Mullata獼猴序列100%互補。因此，在用于人類以前，可以先在猴子體內用這些序 列進行實驗治療。本領域熟練技術人員應理解對如上所述的本發(fā)明所進行的多種省略、添加和修飾 沒有偏離本發(fā)明的范圍，所有這種修飾和變化都在附加的權利要求書所限定的本發(fā)明的范 圍內。所有引用的參考文獻、專利、專利申請或其他文件在此處都合并作為參考。在下文的序列表中，W02007/058894中公開了 SEQ ID NOs 1-116。SEQIDs NOs 117-242 為 PCT/US2007/10557 中公開的 SEQ ID NOs 1-126。SEQ IDsNOs 243-246 是本申 請中的新序列，而且是本發(fā)明的優(yōu)選寡聚物。表4 靶向人TNFR2的剪接轉換寡聚物大寫字母=LNA,小寫字母=DNA)-注意 SEQ ID No 243 靶向小鼠 TNFR2。3378 3379 3384 在治療炎性疾病或狀態(tài)的一個具體實施方法中，施用了兩種或多種SSOs。在一個實施方案中受體是TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF3、TNFRSF5 或 TNFRSFI1A， 所述的改變所述前信使RNA的剪接包括切除來自所述前信使RNA的外顯子7或外顯子8，或 者兩者都切除。在一個實施方案中，所述的改變所述前信使RNA的剪接包括切除外顯子7。在一個實施方案中，所述受體是人TNFRSF1A或人TNFRSF1B，所述的SSO包括與來 自SEQ ID Nos :1，2，3或4的毗連序列互補的至少10到至少20個核苷酸。在一個實施方案中，所述SSO序列包括選自由SEQ ID Nos :74，75，77，78，80，82， 84和86-89組成的組的序列。在一個實施方案中，所述SSOs包含獨立地選自由如下選擇組成的組的一個或多 個核苷酸或核苷2’ -脫氧核糖核苷酸，2’ O-Me核糖核苷酸，2’ O-MOE核糖核苷酸，己糖醇 (HNA)核苷酸或核苷，2’ 0-4’ C-連接的二環(huán)呋核亞硝脲(LNA)核苷酸或核苷，上述的任何 硫代磷酸酯類似物，上述的任何肽核酸(PNA)類似物；上述的任何methylphosponate類似 物，上述的任何肽核酸類似物；上述的任何N3’ 一 P5’(N3’ fwdarw P5’ )氨基磷酸酯類似 物，上述的任何phosphorodiamidate嗎啉代核苷酸類似物，以及它們的組合。在一個實施方案中，所述SSOs包含獨立地選自由2’ O-Me核糖核苷酸和 2’ 0-4’ C-連接的二環(huán)呋核亞硝脲(LNA)核苷酸或核苷組成的組的一個或多個核苷酸或核 苷。在一個實施方案中，所述給藥是腸胃外、局部、口服、經直腸或肺給藥。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了增加細胞中來自TNFR超家族的穩(wěn)定分泌的配 體結合形式的受體生產的方法，包括給所述細胞施用一種或多種剪接轉換寡聚物(SSOs)， 其中所述的一種或多種SSOs能夠改變編碼所述受體的前信使RNA的剪接，因此能夠增加穩(wěn) 定分泌的配體結合形式的所述受體的生產。在一個實施方案中，該方法是在體內實施的。在一個實施方案中，所述受體是選自由TNFRSF1A，TNFRSF1B, TNFRSF3, TNFRSF5, TNFRSF8和TNFRSF1A組成的組的哺乳動物受體。在一個實施方案中，所述受體是人TNFRSF1A或人TNFRSF1B。在一個實施方案中，所述受體是人TNFRSF1B。在一個實施方案中，所述的SSO包含與來自SEQ ID Nos :1，2，3或4的毗連序列互 補的至少10到至少20個核苷酸。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了至少10到至少20個核苷酸的SS0，所述SSOs能 夠改變編碼來自TNFR超家族的受體的前信使RNA的剪接，因此能夠增加穩(wěn)定分泌的配體結 合形式的所述受體的生產。在一個實施方案中，所述受體是選自由TNFRSF1A，TNFRSF1B, TNFRSF3, TNFRSF5, TNFRSF8和TNFRSFIIA組成的組的哺乳動物受體。在一個實施方案中，所述受體是人TNFSF1A或人TNFRSF1B。在一個實施方案中，所 述受體是人TNFRSF1B。在一個實施方案中，SSO包含與來自SEQ ID Nos :1，2，3或4的毗連序列互補的至 少10到至少20個核苷酸。在一個實施方案中，SSOs包含獨立地選自由如下選擇組成的組的在一個或多個核苷酸或核苷2’ -脫氧核糖核苷酸，2’ O-Me核糖核苷酸，2’ O-MOE核糖核苷酸，己糖醇 (HNA)核苷酸或核苷，2’ 0-4’ C-連接的二環(huán)呋核亞硝脲(LNA)核苷酸或核苷，上述的任何 硫代磷酸酯類似物，上述的任何肽核酸(PNA)類似物；上述的任何methylphosponate類 似物，上述的任何肽核酸類似物；上述的任何N3’ 一 P5’氨基磷酸酯類似物，上述的任何 phosphorodiamidate嗎啉代核苷酸類似物，以及它們的組合。在一個實施方案中，所述2’ 0-4’ C-連接的二環(huán)呋核亞硝脲(LNA)核苷酸或核苷 分別是2’ 0-4’ C-(亞甲基)-呋核亞硝脲核苷酸或核苷，或者是2’ 0-4’ C-(乙烯)呋核亞 硝脲核苷酸或核苷。在一個實施方案中，所述SSOs包含獨立地選自由2’ O-Me核糖核苷酸 和2’ 0-4’ C-連接的二環(huán)呋核亞硝脲(LNA)核苷酸或核苷組成的組的一個或多個核苷酸或 核苷。在一個實施方案中，所述SSO序列包括選自由SEQ ID Nos :8，9，14，17-21，24-29， 32，33，38-42，44-46，50-52，55-57，60，68-71，74，75，77，78，80，82，84 和 86-89 組成的組的 序列。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含SSO和藥學上可接受的載體的藥物組合 物。在一個實施方案中，所述的SSO包含與來自SEQ ID Nos :1，2，3或4的毗連序列互 補的至少10到至少20個核苷酸。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了能夠結合腫瘤壞死因子(TNF)的分離蛋白質， 所述蛋白質具有包含來源于哺乳動物腫瘤壞死因子受體(TNFR)基因的cDNA編碼的氨基酸 的序列，其中cDNA包含從5’到3’的毗連排列的在所述基因的信號序列的切割位點后的編 碼第一個氨基酸的密碼子，其穿過(through)所述基因的外顯子6，所述基因的外顯子8和 所述基因的外顯子10 ；或者包含編碼所述基因的開放閱讀框的第一個氨基酸的密碼子，其 穿過所述基因的外顯子6，所述基因的外顯子8和所述基因的外顯子10。在一個實施方案中，所述TNF是TNF-alpha。在一個實施方案中，所述蛋白質包含至少至少一種化學加工或翻譯后修飾，其中 所述修飾選自由乙?；Ⅴ；?、酰胺化，ADP-核糖基化、糖基化、甲基化、聚乙二醇化、異戊烯 化、磷酸化或膽固醇結合組成的組。在一個實施方案中，所述受體是TNFRl，例如人TNFRl，在一個實施方案中，所述受 體是TNFR2，例如人TNFR2。在一個實施方案中，所述蛋白質包含選自由SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 6 的氨基酸 30-417、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 8 的氨基酸 30-416、SEQ ID NO :10、 SEQ ID NO 10 的氨基酸 23-435、SEQ ID NO 12 和 SEQ ID NO 12 的氨基酸 23-448 所組成 的組的序列。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含與藥學上可接受的載體混合的本發(fā)明的蛋 白質的藥物組合物。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的純化蛋白質的組合物。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療炎性疾病或狀態(tài)的方法，包括給受試者施 用本發(fā)明的藥物組合物一段時間，其用量能有效降低TNF的活性。在一個實施方案中，所述疾病或狀態(tài)選自由類風濕性關節(jié)炎、幼年型類風濕性關 節(jié)炎、牛皮癬、牛皮癬關節(jié)炎、強直性脊柱炎、炎性腸病(包括Crohn氏病和潰瘍性結腸炎)、 與甲型肝炎病毒有關的肝炎、與乙型肝炎病毒有關的肝炎、與丙型肝炎病毒有關的肝炎、與缺血/再灌注有關的肝炎、敗血癥、酒精性肝病和非酒精性脂肪變性組成的組。在一個實施 方案中，本發(fā)明提供了來源于哺乳動物腫瘤壞死因子受體(TNFR)基因并編碼能夠結合腫 瘤壞死因子(TNF)的蛋白質的分離核酸，其中所述蛋白質的cDNA包含從5’到3’的毗連排 列的在所述基因的信號序列的切割位點后的編碼第一個氨基酸的密碼子，其穿過所述基因 的外顯子6，所述基因的外顯子8和所述基因的外顯子10 ；或者包含編碼所述基因的開放閱 讀框的第一個氨基酸的密碼子，其穿過所述基因的外顯子6，所述基因的外顯子8和所述基 因的外顯子10。在該實施方案中，所述蛋白質的序列包含選自由SEQ ID N0:6、SEQ ID NO 6 的氨基酸 30-417、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 8 的氨基酸 30-416、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO 10的氨基酸23-435、SEQ ID N0:12和SEQ ID NO 12的氨基酸23-448所組成的組的序 列。在一個實施方案中，所述核酸序列包含選自由SEQ ID NO :5的核苷酸1-1251，SEQ ID NO 5 的核苷酸 88-1251，SEQ ID NO 7 的核苷酸 1-1248，SEQ ID NO 7 的核苷酸 88-1248， SEQ ID NO 9 的核苷酸 1-1305，SEQ ID NO 9 的核苷酸 67-1305，SEQ ID NO 11 的核苷酸 1-1344，SEQ ID NO :11的核苷酸67-1344組成的組的序列。在一個實施方案中，本發(fā)明提 供了包含與調節(jié)序列操作性地連接的本發(fā)明的核酸的表達載體。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了增強哺乳動物體內TNF拮抗劑水平的方法，包 括用本發(fā)明的表達載體轉化所述哺乳動物的細胞使其表達所述TNF拮抗劑，其中所述載體 驅動所述TNFR表達。在一個實施方案中，哺乳動物是人，例如所述人是患有炎性疾病或狀 態(tài)的個體。在一個實施方案中，所述表達載體是質?；虿《尽Ｔ谝粋€實施方案中，細胞在體內被轉化。在一個實施方案中，細胞在體外被轉化。在一個實施方案中，所述表達載體包含組織特異性啟動子，所述組織特異性啟動 子例如，可以源自肝細胞或巨噬細胞。在一個實施方案中，細胞選自由肝細胞、造血細胞、脾細胞和肌細胞組成的組。本發(fā)明提供了用本發(fā)明的表達載體轉化的細胞，例如哺乳動物細胞、昆蟲細胞或 微生物細胞。本發(fā)明提供了產生能結合腫瘤壞死因子(TNF)的蛋白質的方法，包括在適合于表 達所述蛋白質的情況下培養(yǎng)本發(fā)明的細胞，并收獲所述蛋白質。本發(fā)明提供了包含與藥學上可接受的載體混合的本發(fā)明的核酸或載體的藥物組 合物。本發(fā)明提供了治療炎性疾病或狀態(tài)的方法，包括給受試者施用本發(fā)明的表達載體一 段時間，其用量足以降低TNF的活性，例如TNF-alpha的活性。在一個實施方案中，疾病或狀態(tài)選自由類風濕性關節(jié)炎、幼年型類風濕性關節(jié)炎、 牛皮癬、牛皮癬關節(jié)炎、強直性脊柱炎、炎性腸病(包括Crohn氏病和潰瘍性結腸炎)、與甲 型肝炎病毒有關的肝炎、與乙型肝炎病毒有關的肝炎、與丙型肝炎病毒有關的肝炎、與缺血 /再灌注有關的肝炎、敗血癥、酒精性肝病和非酒精性脂肪變性組成的組。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療炎性疾病或狀態(tài)的方法，包括給受試者施 用本發(fā)明的一種或多種剪接轉換寡聚物(SSOs) —段時間，其用量能有效降低TNF的活性， 其中，所述的一種或多種SSOs能夠改變編碼哺乳動物腫瘤壞死因子受體2(TNFR2)(或 TNFR1)的前信使RNA的剪接，因此能夠增加能結合腫瘤壞死因子(TNF)的蛋白質的生產，所 述蛋白質具有包含來源于所述受體基因的cDNA編碼的氨基酸的序列，其中cDNA包含從5’到3’的毗連排列的在所述基因的信號序列的切割位點后的編碼第一個氨基酸的密碼子，其 穿過所述基因的外顯子6，所述基因的外顯子8和所述基因的外顯子10 ；或者包含編碼所述 基因的開放閱讀框的第一個氨基酸的密碼子，其穿過所述基因的外顯子6，所述基因的外顯 子8和所述基因的外顯子10。在一個實施方案中，所述疾病或狀態(tài)選自由類風濕性關節(jié)炎、幼年型類風濕性關 節(jié)炎、牛皮癬、牛皮癬關節(jié)炎、強直性脊柱炎、炎性腸病(包括Crohn氏病和潰瘍性結腸炎)、 與甲型肝炎病毒有關的肝炎、與乙型肝炎病毒有關的肝炎、與丙型肝炎病毒有關的肝炎、與 缺血/再灌注有關的肝炎、敗血癥、酒精性肝病和非酒精性脂肪變性組成的組。在一個實施 方案中，所述給藥是腸胃外、局部、口服、經直腸或肺給藥。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含至少8個核苷酸的剪接轉換寡聚物(SSO)， 其中，所述SSOs能夠改變編碼哺乳動物腫瘤壞死因子受體2 (TNFR2)(或TNFR1)的前信使 RNA的剪接，以增加能結合腫瘤壞死因子(TNF)的蛋白質的產生，所述蛋白質具有包含來源 于所述受體基因的cDNA編碼的氨基酸的序列，其中cDNA包含從5’到3’的毗連排列的在 所述基因的信號序列的切割位點后的編碼第一個氨基酸的密碼子，其穿過所述基因的外顯 子6，所述基因的外顯子8和所述基因的外顯子10 ；或者包含編碼所述基因的開放閱讀框的 第一個氨基酸的密碼子，其穿過所述基因的外顯子6，所述基因的外顯子8和所述基因的外 顯子10。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含與來自SEQ ID NO :13的毗連序列互補的至 少8個核苷酸的SSO。在一個實施方案中，所述SSO序列包括選自由SEQ ID Nos :14，30，46，70，71，72和 73,以及它們的至少8個核苷酸的子序列組成的組的序列。在一個實施方案中，所述SSO序列包含選自由SEQ ID Nos :14_61組成的組的序 列。本發(fā)明提供了增加細胞中能結合腫瘤壞死因子(TNF)的蛋白質生產的方法，包括 給所述細胞施用一種或多種剪接轉換寡聚物(SSOs)，其中，所述蛋白質具有包含來源于哺 乳動物腫瘤壞死因子受體2(TNFR2)(或TNFR1)基因的cDNA編碼的氨基酸的序列，其中 cDNA包含從5’到3’的毗連排列的在所述基因的信號序列的切割位點后的編碼第一個氨基 酸的密碼子，其穿過所述基因的外顯子6，所述基因的外顯子8和所述基因的外顯子10 ；或 者包含編碼所述基因的開放閱讀框的第一個氨基酸的密碼子，其穿過所述基因的外顯子6， 所述基因的外顯子8和所述基因的外顯子10，其中，所述一種或多種SSOs能夠改變編碼所 述受體的前信使RNA的剪接，使所述蛋白質的生產增加。在一個實施方案中，該方法是在體 內實施的。本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的SSO和藥學上可接受的載體的藥物組合物。 實施例下列實施例與PCT/US2007/10557中描述的那些實施例等同。實施例1寡核苷酸。表6列出了具有交替的2’脫氧-和2’ 0-4’ _(亞甲基)_ 二環(huán)-核糖 核苷硫代磷酸酯和具有如上所述的序列的嵌合的鎖定核酸(LNA) SSOs。這些序列是由丹麥的Santaris Pharma合成的。對于每個SS0，5’ -末端的核苷是2’氧-4’ -亞甲基-核糖 核苷，3’ -末端核苷是2’脫氧核糖核苷。表7顯示了具有交替的2’ -氧-甲基-核糖核 苷-硫代磷酸酯(2’ -OMe)和2’ 0-4’ _(亞甲基)_ 二環(huán)-核糖核苷硫代磷酸酯的嵌合的 LNA SSOs的序列。這些序列是由丹麥的Santaris Pharma合成的。LNA用大寫字母顯示， 2’ -OME用小寫字母顯示。細胞培養(yǎng)和轉染。L929細胞維持在補充有10%胎牛血清和抗生素的最低必需培 養(yǎng)基中(37°C，5%C02)。為了轉染，將L929細胞接種到24孔板中，每孔IO5個細胞，24小時 以后進行轉染。按照廠家說明，讓所標示濃度的寡核苷酸與2μ1的Lipofectamine 2000 轉染試劑(Irwitrogen)形成復合物。然后將核苷酸/脂質復合物施加給細胞并溫育24小 時。吸出培養(yǎng)基，并用TRI-試劑 (MRC，Cincinnati，0H)收獲細胞。RT-PCR。用TRI試劑(MRC，Cincinnati，0H)分離總RNA，并按照供應商的說明，利 用 rTth 聚合酶(Applied Biosystems)通過GeneAmp RT-PCR 擴增 TNFRl 或 TNFR2 的 mRNA。每個反應使用大約200ng RNA。此處描述的實施例中使用的引物包括在表2中。進 行PCR循環(huán)95°C，60秒；56°C，30秒；72°C，60秒，總共進行22-30個循環(huán)。在有些情況下，Cy5標記的dCTP(GE Healthcare)被包含在PCR步驟中用于顯 象(每50 μ 1 PCR反應0.1 μ 1)。在10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上分離PCR產物， 用 Typhoon 9400 掃描器(GE Healthcare)顯現(xiàn) Cy5 標記的條帶。用 ImageQuant (GE Healthcare)軟件對掃描進行量化?；蛘撸话珻y5標記的dCTP時，在包含用于顯象的痕 量溴化乙錠的1. 5%的瓊脂糖凝膠上分離PCR產物。PCR依照廠家的說明用Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen)實施PCR。50 μ 1反 應，使用大約30pmol的正反向引物。被用于此處描述的實施例中的引物包括在表5中。除 非另作說明，否則按照如下條件進行熱循環(huán)反應94°C，3分鐘；然后94°C，30秒，55°C，30 秒，以及72°C，105秒，共30-40個循環(huán)；接下來72°C，3分鐘。在1. 5%的瓊脂糖凝膠上分 析產物，用溴化乙錠顯象。表5 RT-PCR 和 PCR 弓 | 物 人肝細胞的培養(yǎng)。從ADMET技術或者UNC-Chapel Hill的UNC細胞代謝和運輸中 心(UNC Cellular Metabolism and Transport Core)獲取懸浮液中的人肝細胞。在補充 有10% FBS, lmg/mL人胰島素和13nM DexamethASONe的RPMI 1640中洗滌并懸浮細胞。肝 細胞平鋪在6孔板中，每板3ml培養(yǎng)基，IO5個細胞。1-1. 5小時后，去除非粘附細胞，將培 養(yǎng)基替換為沒有FBS的補充有l(wèi)mg/mL人胰島素和130nM DexamethASONe的RPMI 1640。為了將SSOs遞送到6孔板的肝細胞中，IOml的5mM的SSO原液被稀釋成IOOml 0PTI-MEM ,4ml Lipofectamine 2000 被稀釋成 100ml0PTI-MEM 。然后將 200ml 復合物溶 液施加給包含2800ml培養(yǎng)基的6孔板中的細胞，液體總共為3000ml。最后的SSO濃度是 17nM。24小時后，在TRI-Reagent 中收獲細胞。按照廠家的說明分離總RNA。大約200ng 的總RNA進行反轉錄-PCR(RT-PCR)。ELISA。為了確定細胞培養(yǎng)基或血清中的可溶性TNFR2的水平，利用從R&D系 統(tǒng)(Minneapolis, MN)獲得的Quantikine 小鼠 sTNF RII ELISA 試劑盒或從 R&D 系統(tǒng) (Minneapolis, MN)獲得的Quantikine 人STNF RIIELISA試劑盒。檢測使用的抗體也可 以檢測蛋白酶切割形式的受體。利用設定在450nm的全自動定量繪圖酶標儀對ELISA孔板 進行讀數(shù)，波長校正設定在570nm。為了進行小鼠體內試驗，將來自動物的血在37 °C下凝結1小時，并在4 °C以 14，OOOrpm的轉數(shù)(Jouan BRA4i離心機)離心10分鐘。收集血清，依照廠家的說明，利用 1 10稀釋的50ml小鼠血清進行測試。L929細胞毒性試驗。在存在10%來自小鼠血清的情況下，用0. Ing/mLTNF- α和 lmg/mL放線菌素D處理平鋪在96孔板上，每孔IO4個細胞的L929細胞，讓細胞在37°C生 長 24小時，其中所述小鼠用總數(shù)為IOOmL的完全MEM培養(yǎng)基(包含10%合格的FBS)中 的標示寡核苷酸處理過。對照組平鋪在來自未處理小鼠的10%的血清中。24小時后，通過 添加 20mL Cel ITiter 96 AQue。us0ne Solution Reagent (Promega)和用全自動定量繪圖酶 標儀測量490nm的吸光度來測量細胞的生存能力。參照未處理細胞，將細胞生存能力標準 化。蛋白質斑跡法(Western blots)。將二十毫升培養(yǎng)基或20mg裂解物上樣到4-12% 的NuPAGE 聚丙烯酰胺凝膠(Invitrogen)的每個孔中。在200V的條件下運行凝膠40 分鐘。30V轉移1小時，將蛋白質轉移到Invitrolon PVDF膜(Invitrogen)上，然后用 StartingBlock 封閉緩沖液(Blocking Buffer) (Pierce)封閉膜1小時。室溫下，用識 別人和小鼠TNFR2的C-末端的兔多克隆抗體(Abeam)溫育膜3小時，在用PBS-T緩沖液 (lxPBS,0. 1% Tween-20)沖洗三次后，用二抗羊抗兔抗體(Abeam)在室溫下溫育膜1小時， 然后又用PBS-T緩沖液沖洗三次。最后依照廠家的介紹用ECL Plus (GEHealthcare)檢測 蛋白質并對蛋白質進行拍照。實施例2-SS0對TNFR mRNA的剪接轉換活性表6顯示了具有如美國申請No. 11/595,485中描述的序列且靶向小鼠和人TNFRs 的SSOs的剪接轉換活性。靶向小鼠TNFR2外顯子7的SSOs中，至少有8個產生了一些 muTNFR2 Δ 7mRNA。特別是，SSO 3312和3305誘導了至少50%的外顯子7缺失；SSO 3305 處理導致幾乎完全的缺失。轉染到原代人肝細胞中，而且靶向人TNFR2外顯子7的SSOs中的至少 7 個 SSOs 產生了一些 huTNFR2A7mRNA。特別是，SSOs 3378、3379、3384 和洶59 誘 導了至少75%的外顯子7缺失(圖2B)，huTNFR2A7被顯著誘導到了細胞外培養(yǎng)基中(圖 2A)。 表6 :SS0的剪接轉換活性 表7包含具有交替的2’ -氧-甲基-核糖核苷-硫代磷酸酯(2’ -OMe)和2’ 氧-4，-(亞甲基)_ 二環(huán)-核糖核苷硫代磷酸酯的10個核苷酸嵌合的SSOs的序列。這些 SSOs靶向小鼠TNFR2的外顯子7。表7 :LNA/2' -OMe-核糖核苷-硫代磷酸酯嵌合的靶向小鼠的SSO *大寫字母是2’ 0-4’ _(亞甲基)_ 二環(huán)-核糖核苷；小寫字母是2’ -OMe為了分析表7中列出的SSOs的體外剪接轉換活性，可以按照實施例1的描述培 養(yǎng)并接種L929細胞。為了將表7中的每一個SSOs遞送給L929細胞，將SSOs稀釋到50ml OPT I-MEM 中，然后添加 50ml Lipofectamine 2000 混合物(1 份 Lipofectamine 2000 與 25份0ΡΤΙ-ΜΕΜ )并溫育20分鐘。接下來，將400ml無血清培養(yǎng)基添加到SSOs中，并將其 施用給24孔板中的細胞。SSO的終濃度是50或ΙΟΟηΜ。24小時后，將細胞收獲到800ml TRI-Reagent 中。依照廠家的說明分離總RNA，并利用正向引物TR045 (SEQ ID NO 228)和 反向引物TR046 (SEQ ID NO 229)通過RT-PCR進行分析(圖3)。為了分析表7中列出的SSOs在體內的剪接轉換活性，以25mg/kg/天的劑量給小 鼠腹腔內注射表4中列出的SSOs，共注射5天。在注射之前對小鼠進行放血處理，在最后一 次注射后的1、5、10天又再次放血。通過ELISA測量第一次注射前和最后一次注射后10天 的血清中的可溶性TNFR2 Δ 7的濃度(圖4Β)。在第10天處死小鼠，利用正向引物TR045 (SEQ ID NO 228)和反向引物TR046(SEQ ID NO 229)通過RT-PCR分析從5_10mg肝臟中獲取的 總 RNA。所有體外測試的SSO 3274的10核苷酸的SSOs子序列都產生了至少一些 muTNFR2 Δ 7mRNA(圖3)。特別是，SSO 3839,3840和3841顯示出比衍生它們的更長的16核 苷酸的SSO 3274更大的剪接轉換活性。體外顯示出最大活性的三個10核苷酸SSOs 3839、 3840,3841也能在小鼠體內產生大量的muTNFR2 Δ 7mRNA(圖4A)和可溶性muTNFR2 Δ 7蛋白 質(圖4Β)。為了評價SSO長度對人TNFR2的剪接轉換活性的影響，用不同長度的SSOs處理細 胞。用選自表4的標示的SSOs轉染原發(fā)的人肝細胞。通過丹麥的Santaris Pharma，用交替 的2’脫氧和2’ 0-4’ _(亞甲基)_ 二環(huán)-核糖核苷硫代磷酸酯合成這些SSOs。每一個SSO 的5’ -末端核苷是2’ 0-4’ -亞甲基-核糖核苷，3’ -末端核苷是2’脫氧核糖核苷。這些SSOs長度為10-、12-、14-或16-個核苷酸。通過ELISA測定可溶性TNFR2 Δ 7的濃度(圖 5，上部的網格)。通過RT-PCR分析總RNA的剪接轉換活性(圖5，底部的網格)。實施例3-分析SSO誘導的TNFR2剪接變體的剪接接合為了在小鼠和人細胞中證實SSO的剪接轉換產生了預期的TNFR2A7mRNA，通過 RT-PCR分析SSO誘導的TNFR2 Δ 7mRNA并進行測序。小鼠。以25mg/kg/天的劑量給小鼠腹腔內注射SSO 3274，共注射10天。然后處 死小鼠，并利用正向引物TR045(SEQ ID NO 228)和反向引物TR046 (SEQ ID NO 229)通過 RT-PCR分析來自肝臟的總RNA。在1. 5%瓊脂糖凝膠上分析產物，并利用標準分子生物學技 術分離編碼TNFR2 Δ 7的產物。利用相同的引物通過PCR擴增分離的TNFR2 Δ 7產物并進行 測序(圖 6Β)。序列資料包含序列 CTCTCTTCCAATTGAGAAGCCCTCCTGC(SEQ ID NO 127 的核 苷酸777-804)，這也證實SSO誘導的TNFR2 Δ 7mRNA缺乏外顯子7，外顯子6直接連接到外 顯子8上。人肝細胞。按照實施例1的描述用SSO 3379轉染原代人肝細胞。轉染后48小 時分離總RNA。依照廠家的說明，利用隨機的六聚體引物，用Superscript 〗〗逆轉錄酶 (Invitrogen)將RNA轉變?yōu)閏DNA。利用正向引物TR049 (SEQ ID NO 202)和反向引物 TR050 (SEQ ID NO 203)對cDNA進行PCR。在1. 5%的瓊脂糖凝膠上分析產物(圖7A)。利 用標準分子生物學技術分離相當于TNFR2 Δ 7的條帶并進行測序(圖7Β)。序列資料包含序 列 CGCTCTTCCAGTTGAGAAGCCCTTGTGC(SEQ ID NO 125 的核苷酸 774-801)，這也證實 SSO 誘 導的TNFR2 Δ 7mRNA缺乏外顯子7，外顯子6直接連接到外顯子8上。實施例4-SS0誘導在原代人肝細胞中生產TNFR2 Δ 7蛋白質的劑量依賴性在原代人肝細胞中測試了 SSOs的剪接轉換活性的劑量反應。獲取來自ADMET技 術的處于懸浮液中的人肝細胞。將細胞洗滌三次并懸浮在接種培養(yǎng)基中(補充有L-谷氨 酸，10% FBS，青霉素，鏈霉素和UnMDexamethASONe)。評估肝細胞的生存能力，并將肝細胞 平鋪在涂有膠原的24孔板上，每孔l.OxlO5個細胞。典型的細胞生存能力是85-93%。大 約24小時后，將培養(yǎng)基替換為維持培養(yǎng)基(沒有ras的接種培養(yǎng)基)。為了將每一個SSOs遞送給肝細胞，將SSOs稀釋到50ml 0ΡΤΙ-ΜΕΜ 中，然后添加 50ml Lipofectamine 2000 混合物(1 份 Lipofectamine 2000 與 25 份 OPT I-MEM )并溫 育20分鐘。然后將SSOs施用給24孔板中的細胞。最后的SSO濃度是1-150ηΜ。48小時 后，將細胞收獲到800ml TRI-Reagent 中。利用正向引物TR047(SEQ ID NO :200)和反向引物 TR048 (SEQ ID NO :201)通過 RT-PCR分析來自細胞的總RNA(圖8A)。通過ELISA測定血清中可溶性TNFR2 Δ 7的濃度 (圖8Β)。huTNFR2 Δ 7mRNA(圖8A)和分泌的huTNFR2 Δ 7蛋白質(圖8Β)都顯示出劑量依 賴性的升高。實施例5-來自鼠科動物細胞的TNFR2剪接變體的分泌測試SSOs誘導可溶性TNFR2蛋白質生產并分泌到細胞外培養(yǎng)基的能力。按照實 施例1的描述用SSOs處理L929細胞，轉染后48小時收集細胞外培養(yǎng)基樣品。通過ELISA 測量樣品中可溶性TNFR2的濃度(圖9)。誘導RNA剪接轉移最好的SSOs也能將最多的蛋 白質分泌到細胞外培養(yǎng)基中。特別是，SSOs 3305，3312和3274可以相對于背景增加可溶 性TNFR2至少3. 5倍。因此，剪接變體mRNA的誘導與可溶性TNFR2的生產和分泌有相互關系。實施例6-體內注射SSOs在小鼠體內產生muTNFR2 Δ 7mRNA將鹽水中的SSO 3305通過腹膜內注射(i. p.)到小鼠體內，注射劑量為3mg/ kg-25mg/kg,每天注射，持續(xù)4天。在第5天處死小鼠，通過RT-PCR分析來自肝臟的總RNA。 數(shù)據(jù)顯示與細胞培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)的剪接轉換效力相似的剪接轉換效力。劑量為25mg/kg的最 大劑量時，SSO 3305處理幾乎誘導完全轉變成A7mRNA(圖10，底部網格)。對SSO 3274進行的類似實驗誘導大約20%轉換成Δ 7mRNA。為了優(yōu)化SSO 3274 誘導Δ 7mRNA的過程，改變了給藥方法和從最后一次注射到處死動物的時間。每天將SSO 3274注射(i.p)到小鼠體內，持續(xù)4天。SSO處理在第15天分析的小鼠體內誘導大約30% 轉換成A7mRNA，而在第5天分析的小鼠體內觀察到20%的轉變(圖10，上部網格)。此外， 注射Δ710天，在第11天處死的小鼠顯示出誘導50%的mRNA(圖10，上部)。這些體內數(shù) 據(jù)表明TNFR2SS0s可以在給藥后至少10天產生muTNFR2 Δ 7mRNA。實施例7-循環(huán)的TNFR2 Δ 7以25mg/kg/天的劑量給小鼠腹腔內注射(i. p) SSO 3274,3305或對照3083，共注 射10天。在注射之前對小鼠進行放血處理，在最后一次注射后的1、5、10天又再次放血。測 定血清中可溶性TNFR2 Δ 7的濃度。SSO處理可以誘導可溶性TNFR2 Δ 7蛋白水平超過背景 至少10天(圖11)。為了測試更長時間點的效果，可以重復實驗，除了直到最后一次注射后的第27天 收集血清樣品外。結果顯示可溶性TNFR2 Δ 7的水平在最后一次注射后的第27天只有輕微 下降(圖12)。實施例8-小鼠血清中的抗TNF-alpha活性在L929細胞毒性試驗中測試來自SSO 3274處理小鼠的血清的抗TNF-α活性。在 該試驗中，按照實施例1的描述測定血清保護培養(yǎng)的L929細胞不受固定濃度的TNF-α的 細胞毒性影響的能力。來自SSO 3274，而不是對照SSOs (3083或3272)處理小鼠的血清增 強了暴露于0. Ing/mL TNF-α的L929細胞的生存能力。因此，SSO 3274血清包含足以結 合并活化TNF-α的TNF-α拮抗劑，因此可以保護細胞不受TNF-α的細胞毒性影響。這種 抗TNF- α活性存在于最后一次注射SSO 3274后5天和27天的動物血清中。實施例9-SS0產生的TNFR2 Δ 7與其他抗TNF- α拮抗劑的比較依照如上所述的方法接種L929細胞。制備包含90 μ 1無血清的ΜΕΜ，0. lng/ml TNF-α和lug/ml的放線菌素D，以及(i)來自Sigma 的具有小鼠TNFR2的236個氨基酸 殘基的細胞外域的重組的可溶性蛋白質(0.01-3mg/mL)，(ii)來自SSO 3274或SSO 3305 處理小鼠的血清(1.25-10%，稀釋在未處理小鼠的血清中；通過ELISA確定TNFR2A7的 濃度)或者(iii) Enbrel (0. 45-150pg/ml)，至最終體積為100 μ 1，最終小鼠血清濃度 為10%。在室溫下溫育樣品30分鐘。隨后，將樣品施用給平鋪的細胞，37°C，在包含5% C02的濕潤空氣中溫育24小時。通過添加20μ1 CellTiter 96 AQueous One Solution Reagent (Promega)并用全自動定量繪圖酶標儀測量490nm的吸收度來測量細胞生存能力。 參照未處理細胞將細胞生存能力標準化，并以TNF拮抗劑濃度為函數(shù)繪圖(圖14)。實施例10-TNFR2 Δ 7mRNA和蛋白質的穩(wěn)定性以25mg/kg/天的劑量，每天給小鼠腹腔注射SSO 3274或3272 (對照)(η = 5)，共注射5天。在注射開始前和最后一次注射后5、15、22、27和35天對小鼠進行放血處理。 測量血清中可溶性TNFR2 Δ 7的濃度(圖15Α)。在處死小鼠時，也通過對來自肝臟的總RNA 進行RT-PCR確定了肝臟中TNFR2的剪接轉換。結合實施例7的數(shù)據(jù)就會發(fā)現(xiàn)，SSO處理 后TNFR2mRNA水平的時程與血清中TNFR2 Δ 7蛋白質的時程一起被構建，而且兩者是被比 較(圖16)。數(shù)據(jù)顯示體內TNFR2 Δ 7mRNA衰退的速率比血清中TNFR2 Δ 7蛋白質大約快4 倍。在第35天，只能檢測到痕量TNFR2 Δ 7mRNA,但TNFR2 Δ 7蛋白質卻只從最高濃度下降了 20%。實施例11-產生人TNFR2 Δ 7通過購買從OriGene (產品目錄No :TC119459，ΝΜ_001066. 2)獲取包含全長人 TNFR2cDNA的cDNA質粒。通過利用反向引物TR001(SEQ ID NO 116)和正向引物TR002 (SEQ ID NO 117)在質粒上實施PCR來獲取cDNA。利用標準分子生物學技術分離和純化PCR產 物，所述PCR產物包含沒有終止密碼子的1383bp的TNFR2開放閱讀框?；蛘?，通過利用 TR001反向引物和TR002正向引物對來自人單核細胞的總RNA實施RT-PCR，來獲取全長人 TNFR2cDNA。利用標準分子生物學技術分離和純化PCR產物。為了產生人TNFR2A7cDNA，在全長人TNFR2cDNA上進行兩個分離的PCR反應，以產 生TNFR2A7cDNA的重疊片段。在一個反應中，利用正向引物TR003 (SEQ ID NO 190)和反 向引物TR004(SEQ ID NO 191)對全長TNFR2cDNA進行PCR。在一個反應中，利用反向引物 TR005 (SEQ IDNO 192)和正向引物TR002對全長TNFR2cDNA進行PCR。最后，合并2個重疊 片段，并利用正向引物TR002和反向引物TR004進行PCR。利用標準分子生物學技術分離和 純化PCR產物，所述PCR產物預計包含具有終止密碼子的1308bp的TNFR2 Δ 7開放閱讀框 (SEQ ID NO 125)。類似地，在這些PCR反應中，利用反向引物TROO1代替反向引物TR004產生具有終 止密碼子的1305bp的人TNFR2 Δ 7的開放閱讀框。當最終的PCR產物被插入適當?shù)妮d體中 時，這也允許添加框內的C末端親合力純化標記，例如His標記。實施例12-產生人TNFRl Δ 7通過購買從OriGene (產品目錄No :TC127913，ΝΜ_001065. 2)獲取包含全長人 TNFR2cDNA的cDNA質粒。通過利用反向引物TR006 (SEQ IDNO 204)和正向引物TR007 (SEQ ID NO 205)在質粒上實施PCR來獲取cDNA。利用標準分子生物學技術分離和純化全長人 TNFRlcDNA 的 PCR 產物。或者，通過利用反向引物TR006和正向引物TR007對來自人單核細胞的總RNA 實施RT-PCR，來獲取全長人TNFRlcDNA。利用標準分子生物學技術分離和純化全長人 TNFRlcDNA 的 PCR 產物。為了產生人TNFRl Δ 7cDNA,在全長人TNFRlcDNA上進行兩個分離的PCR反應，以 產生TNFRlA7cDNA的重疊片段。在一個反應中，利用正向引物TR008 (SEQ ID NO 206)和 反向引物TR006對全長TNFRlcDNA進行PCR。在一個反應中，利用反向引物TR009 (SEQ ID NO 207)和正向引物TR010(SEQ ID NO 208)對全長TNFRlcDNA進行PCR。最后，合并2個 重疊片段，并利用正向引物TR010和反向引物TR006進行PCR。利用標準分子生物學技術分 離和純化PCR產物，所述PCR產物包含具有終止密碼子的1254bp的人TNFRl Δ 7開放閱讀 框(SEQ ID NO 121)。
或者，在這些PCR反應中，可以利用反向引物TRO11代替反向引物TR006產生沒有 終止密碼子的1251bp的人TNFRl Δ 7的開放閱讀框。當最終的PCR產物被插入適當?shù)妮d體 中時，這也允許添加框內的C末端親合力純化標記，例如His標記。實施例13-產生鼠科動物TNFR2 Δ 7cDNA為了產生全長鼠科動物TNFR2cDNA，利用反向引物TR012(SEQ IDNO 214)和正 向引物TR013(SEQ ID NO 215)對商業(yè)上獲得的FirstChoice 的為PCR準備的小鼠肝 cDNA (PCR-Ready Mouse Liver cDNA) (Ambion，產品目錄No :AM3300)進行 PCR。利用標準分 子生物學技術分離和純化全長鼠科動物TNFR2cDNA的PCR產物。然后，通過利用TRO14正 向引物(SEQ IDNO 216)和反向引物TR012對所產生的產物進行PCR，將合適的Kozak序列 引入其中?；蛘撸ㄟ^利用反向引物TR015(SEQ ID NO :217)和正向引物TR016 (SEQ ID NO: 218)對來自人單核細胞或小鼠肝細胞的總RNA實施RT-PCR，來獲取全長的鼠TNFR2cDNA。 利用標準分子生物學技術分離和純化全長鼠科動物TNFR2cDNA的PCR產物。為了產生鼠的TNFR2 Δ 7cDNA,在全長鼠的TNFR2cDNA上進行兩個分離的PCR反應， 以產生TNFR2A7cDNA的重疊片段。在一個反應中，利用正向引物TR017 (SEQ ID NO 219) 和反向引物TRO15對全長TNFR2cDNA進行PCR。在一個反應中，利用反向引物TRO18 (SEQ ID NO 220)和正向引物TR016對全長TNFR2cDNA進行PCR。最后，合并2個重疊片段，并利用 正向引物TR016和反向引物TR015進行PCR。利用標準分子生物學技術分離和純化PCR產 物，所述PCR產物預計包含具有終止密碼子的1348bp的鼠TNFR2 Δ 7開放閱讀框(SEQ ID NO 127)。或者，在這些PCR反應中，可以利用反向引物TR019(SEQ ID NO :221)代替反向引 物TR015產生沒有終止密碼子的1345bp的鼠TNFR2 Δ 7的開放閱讀框。當最終的PCR產物 被插入適當?shù)妮d體中時，這也允許添加框內的C末端親合力純化標記，例如His標記。實施例14-產生鼠科動物TNFRl Δ 7cDNA為了產生全長鼠科動物TNFRlcDNA，利用反向引物TR020(SEQ IDNO 230)和正 向引物TR021(SEQ ID NO 231)對商業(yè)上獲得的FirstChoice 的為PCR準備的小鼠肝 cDNA (PCR-Ready Mouse Liver cDNA) (Ambion，產品目錄 No :AM3300)進行 PCR。利用標準 分子生物學技術分離和純化全長鼠科動物TNFRlcDNA的PCR產物?；蛘?，通過利用反向引物TR020和正向引物TR021對來自小鼠單核細胞的總RNA 實施RT-PCR，來獲取全長鼠TNFRlcDNA。利用標準分子生物學技術分離和純化全長鼠科 動物TNFRlcDNA的PCR產物。為了產生鼠的TNFRl Δ 7cDNA,在全長人TNFRlcDNA上進行 兩個分離的PCR反應，以產生TNFRlA7cDNA的重疊片段。在一個反應中，利用正向引物 TR022 (SEQID NO 232)和反向引物TR020對全長TNFRlcDNA進行PCR。在另一個反應中，利 用反向引物 TR023(SEQ ID NO 233)和正向引物 TR024(SEQ IDNO 234)對全長 TNFRlcDNA 進行PCR。最后，合并2個重疊片段，并利用正向引物TR024和反向引物TR020進行PCR。利 用標準分子生物學技術分離和純化1259bp的PCR產物，所述PCR產物包含具有終止密碼子 的 125 Ibp 的鼠 TNFRl Δ 7 開放閱讀框(SEQ ID NO :123)?；蛘撸谶@些PCR反應中，可以利用反向引物TR025(SEQ ID NO :235)代替反向引 物TR020產生沒有終止密碼子的1248bp的鼠TNFRl Δ 7的開放閱讀框。當最終的PCR產物被插入適當?shù)妮d體中時，這也允許添加框內的C未端親合力純化標記，例如His標記。實施例15-構建在哺乳動物細胞中表達人TNFR2 Δ 7的載體為了在哺乳動物細胞中表達人TNFR2 Δ 7蛋白質，將來自實施例12的人 TNFR2A7cDNA PCR產物整合到適當?shù)牟溉閯游锉磉_載體中。依照廠家的說明，將來 自實施例12的具有和不具有終止密碼子的TNFR2 Δ 7cDNA PCR產物與pcDNA 3. ID V5-HisTOP〇 表達載體(Invitrogen)進行平末端連接和分離。依照供應商的說明，用包 含編碼人TNFR2 Δ 7的插入物的質粒轉化()neShot ToplO感受態(tài)細胞(Invitrogen)。將 五十毫升轉化混合物平鋪在具有l(wèi)OOmg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，37°C溫育過夜。將 單個集落接種到具有l(wèi)OOmg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，37°C溫育過夜。然后將培養(yǎng)物 接種到具有l(wèi)OOmg/mL氨芐青霉素的200mL LB培養(yǎng)基上，37°C生長過夜。依照廠家的說明， 利用 GenElute 質粒 Maxipr印試劑盒(Plasmid Maxiprep kit) (Sigma)分離質粒。純化 效率為每次制備0. 5-1. 5mg質粒。產生三個人TNFR2 Δ 7克隆(1319-1，1138-5與1230-1)，并對它們進行測序?？?隆1319-1包含后面直接連接有來自質粒的框內His標記的沒有終止密碼子的人TNFR2A7 開放閱讀框；而克隆1138-5和1230-1包含后面立刻連接有終止密碼子的TNFR2 Δ 7開放 閱讀框。SEQ ID NO 242中給出了來自質粒的His標記的序列?？寺?230-1和1319-1的 TNFR2 Δ 7開放閱讀框的序列分別與具有和沒有終止密碼子的SEQ ID Ν0:125相同。然而， 相對于SEQ IDNO :125，克隆1138-5的TNFR2 Δ 7開放閱讀框的序列(SEQ ID NO 231)在外 顯子10的位置1055處有一個核苷酸不同，前者是Α，而后者是G。該單核苷酸變化導致氨 基酸352由谷氨酰胺變成精氨酸。實施例16-在大腸桿菌中表達人TNFR2 Δ 7為了在細菌中表達人TNFR2 Δ 7蛋白質，將來自實施例12的人TNFR2 Δ 7cDNA整合 到適當?shù)谋磉_載體，例如pETDirectionalTOPO 表達載體(Invitrogen)中。利用正向引 物(TR002) (SEQ ID NO 191)和反向引物(TR026) SEQ ID NO 195 對來自實施例 12 的 PCR 片段進行PCR，以引入適合載體的同源重組位點。依照廠家的說明，用ρΕΤΙΟΙ/D-TOPO 載體(Invitrogen)溫育產生的PCR片段以產生人TNFR2 Δ 7細菌表達載體。產生的載體被 轉化到大腸桿菌菌株BL21(DE3)中。然后依照廠家的說明從細菌細胞表達人TNFR2 Δ 7。實施例17-在昆蟲細胞中表達人TNFR2 Δ 7為了在昆蟲細胞中表達人TNFR2 Δ 7蛋白質，將來自實施例12的人TNFR2 Δ 7cDNA 整合到桿狀病毒載體中。利用正向引物(TR027) (SEQ IDNO :196和反向引物(TR028) (SEQ ID NO 197)對來自實施例12的人TNFR2 Δ 7cDNA進行PCR。用限制性內切酶EcoRI和Xhol消 化產生的PCR產物。將消化的PCR產物與EcoRI和Xhol消化的pENTR 載體(Invitrogen)， 例如 pENTR (TM) 1A, pENTR (TM) 2B, pENTR (TM) 3C, pENTR (TM) 4 或 pENTR (TM) 11 載體中的任何 一個連接以產生輸入載體。然后，利用標準分子生物學技術分離，擴增和純化產物。依照廠家的說明，禾Ij用LRClonase (Invitrogen)，通過輸入載體與 BaculoDirect 線性DNA(Invitrogen)的同源重組產生包含人TNFR2 Δ 7cDNA的桿狀病毒 載體。然后用反應混合物感染Sf9細胞以產生重組的桿狀病毒。收獲重組桿狀病毒以后， 證實人TNFR2A7被表達。重組桿狀病毒的擴增產生了高滴度的病毒庫存。用高滴度的病 毒庫存感染Sf9細胞，從而表達人TNFR2 Δ 7蛋白質。
實施例18-表達人TNFR2 Δ 7的腺相關病毒載體的產生為了在體外或體內將人TNFR2 Δ 7基因遞送給哺乳動物細胞以在所述哺乳動物細 胞中進行表達，按照 Grieger，J.，et al.，2006，Nature Protocols 1 1412 的描述利用三 質粒轉染系統(tǒng)產生重組的腺病毒相關病毒(rAAV)載體。利用正向引物(TR029)(SEQ ID NO 198)和反向引物(TR030) (SEQ IDNO 199)對實施例12的純化的人TNFR2D7PCR產物進 行PCR，以引入側接的唯一的NotI限制性位點。用Notl限制性內切酶消化產生的PCR產 物，并通過標準分子生物學技術進行分離。然后，將Notl消化的片段連接到Notl消化的 pTR-UF2(美國北卡羅來納州大學(UNC)的載體中心實驗室)上，以產生包含人TNFR2D7開 放閱讀框的質粒，所述開放閱讀框與CMVie啟動子操作性連接，還側接了末端反向重復。然 后，按照Grieger，J.等的描述，用質粒pXX680和pHelper (UNC載體中心試驗室)將產生的 質粒轉染到HEK-293細胞中，以產生包含人TNFR2 Δ 7基因的rAAV粒子，其中人TNFR2 Δ 7 基因的表達由較強的組成型CMVie啟動子驅動。按照Grieger，J.等的描述收獲并純化病 毒粒子以提供適合轉導哺乳動物細胞的rAAV原料。實施例19-在大腸桿菌中表達人TNFRl Δ 7為了在細菌中表達人TNFRl Δ 7蛋白質，將cDNA整合到適當?shù)谋磉_載體，例如 pETDirectional TOPO 表達載體(Invitrogen)中。利用正向引物(TROlO) (SEQ ID NO: 208和反向引物(TR006) (SEQ ID NO 204)對cDNA進行PCR，以引入適合載體的同源重組位 點。依照廠家的說明，用ρΕΤΙΟΙ/D-TOPO 載體(Invitrogen)溫育產生的PCR片段以產 生人TNFRl Δ 7細菌表達載體。產生的載體被轉化到大腸桿菌菌株BL21(DE3)中。然后依 照廠家的說明從細菌細胞表達人TNFRl Δ 7。實施例20-在哺乳動物細胞中表達人TNFRl Δ 7為了在哺乳動物細胞中表達人TNFRl Δ 7蛋白質，將人TNFRl Δ 7cDNAPCR產物 整合到適當?shù)牟溉閯游锉磉_載體中，依照廠家的說明，將人TNFRl Δ 7cDNA PCR產物與 pcDNA 3. ID V5-HisTOPO 表達載體(Invitrogen)進行平末端連接。然后，利用標準分 子生物學技術分離，擴增和純化產物以產生哺乳動物表達載體。然后，載體被轉染到哺乳動 物細胞中，其中人TNFRl Δ 7蛋白質的表達由較強的組成型CMVie啟動子驅動。實施例21-在昆蟲細胞中表達人TNFRl Δ 7為了在昆蟲細胞中表達人TNFRl Δ 7蛋白質，將來自實施例12的cDNA整合到桿 狀病毒載體中。利用正向引物(TR031) (SEQ ID NO 210)和反向引物(TR032) (SEQ ID NO 211)對來自實施例12的cDNA進行PCR。用限制性內切酶EcoRI和Xhol消化產生的PCR產 物。將消化的PCR產物與EcoRI和Xhol消化的pENTR 載體(Invitrogen)，例如pENTR lA， pENTR 2B, pENTR 3C, pENTR 4或pENTR l 1載體中的任何一個的連接以產生輸入載體。然 后，利用標準分子生物學技術分離，擴增和純化產物。依照廠家的說明，利用LR Clonase (Invitrogen)，通過輸入載體與 BaculoDirect 線性DNA(Invitrogen)的同源重組產生包含人TNFRl Δ 7cDNA的桿狀病毒 載體。然后用反應混合物感染Sf9細胞以產生重組的桿狀病毒。收獲重組桿狀病毒以后， 證實人TNFRl Δ 7被表達。重組桿狀病毒的擴增產生了高滴度的病毒庫存。用高滴度的病 毒庫存感染Sf9細胞，從而表達人TNFRl Δ 7蛋白質。實施例22-表達人TNFRl Δ 7的腺相關病毒載體的產生
為了在體外或體內將人TNFRl Δ 7基因遞送給哺乳動物細胞以在所述哺乳動物細 胞中進行表達，按照Grieger，J.，et al. ,2006,Nature Protocols 1 1412的描述利用三質 粒轉染系統(tǒng)產生重組的腺病毒相關病毒(rAAV)載體。利用正向引物(TR033) (SEQ ID NO 212)和反向引物(TR034) (SEQ ID NO 213)對純化的人TNFR1D7PCR產物進行PCR，以引入 側接的Notl限制性位點。用Notl限制性內切酶消化產生的PCR產物，并通過標準分子生 物學技術進行分離。然后，將Notl消化的片段連接到Notl消化的pTR-UF2(美國北卡羅來 納州大學(UNC)的載體中心實驗室)上，以產生包含人TNFR1D7開放閱讀框的質粒，所述開 放閱讀框與CMVie啟動子操作性連接，還側接了末端反向重復。然后，按照Grieger，J.等 的描述，用質粒PXX680和pHelper (UNC載體中心試驗室)將產生的質粒轉染到HEK-293細 胞中，以產生包含人TNFRl Δ 7基因的rAAV粒子，其中人TNFRl Δ 7基因的表達由較強的組 成型CMVie啟動子驅動。按照Grieger，J.等的描述收獲并純化病毒粒子以提供適合轉導 哺乳動物細胞的rAAV原料。實施例23-構建在哺乳動物細胞中表達小鼠TNFR2 Δ 7的載體為了在哺乳動物細胞中表達鼠的TNFR2 Δ 7蛋白質，將來自實施例14的鼠的 TNFR2A7cDNA PCR產物整合到適當?shù)牟溉閯游锉磉_載體中。依照廠家的說明，將來自實施 例14的具有和不具有終止密碼子的TNFR2 Δ 7cDNAPCR產物與pcDNA 3. ID V5_HisTOPO 表達載體(Irwitrogen)進行平末端連接和分離。依照供應商的說明，用包含編碼鼠的 A7TNFR2的插入物的質粒轉化〇neShot ToplO感受態(tài)細胞(Invitrogen)。將五十毫升 轉化混合物平鋪在具有l(wèi)OOmg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，37°C溫育過夜。將單個集落 接種到具有l(wèi)OOmg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，37°C溫育過夜。然后將培養(yǎng)物接種到 具有l(wèi)OOmg/mL氨芐青霉素的200mL LB培養(yǎng)基上，37°C生長過夜。依照廠家的說明，利用 GenElute 質粒Maxipr印試劑盒(Plasmid Maxiprepkit) (Sigma)分離質粒。純化效率為 每次制備0. 5-1. 5mg質粒。產生兩個鼠TNFR2 Δ 7克隆(1144-4和1145-3)，并對它們進行測序?？寺?144-4 包含后面直接連接有來自質粒的框內His標記的沒有終止密碼子的鼠的TNFR2 Δ 7開放閱 讀框；而克隆1145-3包含后面立刻連接有終止密碼子的TNFR2 Δ 7開放閱讀框。SEQ ID NO :242中給出了來自質粒的His標記的序列。相對于SEQ ID NO 127，兩個克隆1144-4和 1145-3的TNFR2 Δ 7開放閱讀框的序列在位置11處有一個核苷酸不同。這些單個核苷酸的 變化導致相對于SEQ ID NO 128出現(xiàn)了四個氨基酸不同。實施例24-在大腸桿菌中表達鼠TNFR2 Δ 7為了在細菌中表達小鼠TNFR2 Δ 7蛋白質，將來自實施例14的小鼠TNFR2 Δ 7cDNA 整合到適當?shù)谋磉_載體，例如pET Directional TOPO 表達載體(Invitrogen)中。利 用正向引物(TR035) (SEQ ID NO 222)和反向引物(TR036) (SEQ ID NO 223)對來自實施 例14的PCR片段進行PCR，以引入適合載體的同源重組位點。依照廠家的說明，用pETlOl/ D- TOPO 載體(Invitrogen)溫育產生的PCR片段以產生鼠的TNFR2 Δ 7細菌表達載體。 產生的載體被轉化到大腸桿菌菌株BL21(DE3)中。然后依照廠家的說明從細菌細胞表達鼠 的 TNFR2A7。實施例25-在昆蟲細胞中表達小鼠TNFR2 Δ 7為了在昆蟲細胞中表達鼠的TNFR2 Δ 7蛋白質，將來自實施例14的cDNA整合到桿狀病毒載體中。利用正向引物(TR037) (SEQ ID NO :224)和反向引物(TR038) (SEQ ID NO 225)對來自實施例14的cDNA進行PCR。用限制性內切酶EcoRI和Xhol消化產生的 PCR產物。將消化的PCR產物與EcoRI和Xhol消化的pENTR 載體(Invitrogen)，例如 pENTR lA, pENTR 2B, pENTR 3C, pENTR 4或pENTR ll載體中的任何一個的連接以產生輸 入載體。然后，利用標準分子生物學技術分離，擴增和純化產物。依照廠家的說明，利用LR Clonase (Invitrogen)，通過輸入載體與 BaculoDirect 線性 DNA (Invitrogen)的同源重 組產生包含鼠的TNFR2A7cDNA的桿狀病毒載體。然后用反應混合物感染Sf9細胞以產生 重組的桿狀病毒。收獲重組桿狀病毒以后，證實鼠的TNFR2 Δ 7被表達。重組桿狀病毒的擴 增產生了高滴度的病毒庫存。用高滴度的病毒庫存感染Sf9細胞，從而表達鼠的TNFR2A7 蛋白質。實施例26-表達鼠的TNFR2 Δ 7的腺相關病毒載體的產生為了在體外或體內將鼠的TNFR2 Δ 7基因遞送給哺乳動物細胞以在所述哺乳動物 細胞中進行表達，按照 Grieger，J.，et al.，2006，Nature Protocols 1 1412 的描述利用 三質粒轉染系統(tǒng)產生重組的腺病毒相關病毒(rAAV)載體。利用正向引物(TR039) (SEQ ID NO 226)和反向引物(TR040) (SEQ IDNO 227)對實施例14的純化的鼠TNFR2D7PCR產物進 行PCR，以引入側接的唯一的Notl限制性位點。用Notl限制性內切酶消化產生的PCR產 物，并通過標準分子生物學技術進行分離。然后，將Notl消化的片段連接到Notl消化的 pTR-UF2(美國北卡羅來納州大學(UNC)的載體中心實驗室)上，以產生包含鼠的TNFR2D7 開放閱讀框的質粒，所述開放閱讀框與CMVie啟動子操作性連接，還側接了末端反向重復。 然后，按照Grieger，J.等的描述，用質粒pXX680和pHelper (UNC載體中心試驗室)將產 生的質粒轉染到HEK-293細胞中，以產生包含鼠的TNFR2A7基因的rAAV粒子，其中鼠的 TNFR2 Δ 7基因的表達由較強的組成型CMVie啟動子驅動。按照GriegerJ.等的描述收獲 并純化病毒粒子以提供適合轉導哺乳動物細胞的rAAV原料。實施例27-在大腸桿菌中表達鼠的TNFRl Δ 7為了在細菌中表達小鼠TNFR1A7蛋白質，將來自實施例15的cDNA整合到適當 的表達載體，例如PET Directional TOPO 表達載體(Invitrogen)中。利用正向引物 (TR024) (SEQ ID NO 234)和反向引物(TR020) (SEQ IDNO 235)對來自實施例 15 的互補DNA 進行PCR，以引入適合載體的同源重組位點。依照廠家的說明，用ρΕΤΙΟΙ/D-TOPO 載體 (Invitrogen)溫育產生的PCR片段以產生鼠的TNFRl Δ 7細菌表達載體。產生的載體被轉 化到大腸桿菌菌株BL21(DE3)中。然后依照廠家的說明從細菌細胞表達鼠的TNFRl Δ 7。實施例28-在哺乳動物細胞中表達小鼠TNFRl Δ 7為了在哺乳動物細胞中表達鼠的TNFRl Δ 7蛋白質，將來自實施例15的鼠 的TNFRlA7cDNA PCR產物整合到適當?shù)牟溉閯游锉磉_載體中。依照廠家的說明，將來 自實施例15的鼠的TNFRl Δ 7cDNA PCR產物與pcDNA 3. 1DV5-His TOPO 表達載體 (Invitrogen)進行平末端連接。然后，利用標準分子生物學技術分離，擴增和純化產物以產 生哺乳動物表達載體。然后，載體被轉染到哺乳動物細胞中，其中鼠的TNFRlA 7蛋白質的 表達由較強的組成型CMVie啟動子驅動。實施例29-在昆蟲細胞中表達小鼠TNFRl Δ 7為了在昆蟲細胞中表達鼠的TNFRl Δ 7蛋白質，將來自實施例15的cDNA整合到桿狀病毒載體中。利用正向引物(TR041) (SEQ ID NO :236)和反向引物(TR042) (SEQ ID NO 237)對來自實施例15的cDNA進行PCR。用限制性內切酶EcoRI和Xhol消化產生的 PCR產物。將消化的PCR產物與EcoRI和Xhol消化的pENTR 載體(Invitrogen)，例如 pENTR lA, pENTR 2B, pENTR 3C, pENTR 4 或 pENTR ll 載體中的任何一個的連接以產生 輸入載體。然后，利用標準分子生物學技術分離，擴增和純化產物。依照廠家的說明，利用 LRClonase (Invitrogen)，通過輸入載體與 BaculoDirect 線性 DNA(Invitrogen)的同源 重組產生包含鼠的TNFRl Δ 7cDNA的桿狀病毒載體。然后用反應混合物感染Sf9細胞以產生 重組的桿狀病毒。收獲重組桿狀病毒以后，證實鼠的TNFRl Δ 7被表達。重組桿狀病毒的擴 增產生了高滴度的病毒庫存。用高滴度的病毒庫存感染Sf9細胞，從而表達鼠的TNFRl Δ 7 蛋白質。實施例30-表達鼠的TNFRl Δ 7的腺相關病毒載體的產生為了在體外或體內將鼠的TNFRl Δ 7基因遞送給哺乳動物細胞以在所述哺乳動物 細胞中進行表達，按照 Grieger，J.，et al.，2006，Nature Protocolsl 1412 的描述利用 三質粒轉染系統(tǒng)產生重組的腺病毒相關病毒(rAAV)載體。利用正向引物(TR043) (SEQ ID NO 238)和反向引物(TR044) (SEQIDN0 239)對實施例14的純化的鼠TNFR1D7PCR產物進 行PCR，以引入側接的唯一的Notl限制性位點。用Notl限制性內切酶消化產生的PCR產 物，并通過標準分子生物學技術進行分離。然后，將Notl消化的片段連接到Notl消化的 pTR-UF2(美國北卡羅來納州大學(UNC)的載體中心實驗室)上，以產生包含鼠的TNFR1D7 開放閱讀框的質粒，所述開放閱讀框與CMVie啟動子操作性連接，還側接了末端反向重復。 然后，按照Grieger，J.等的描述，用質粒pXX680和pHelper (UNC載體中心試驗室)將產 生的質粒轉染到HEK-293細胞中，以產生包含鼠的TNFR2 Δ 7基因的rAAV粒子，其中鼠的 TNFRl Δ 7基因的表達由較強的組成型CMVie啟動子驅動。按照GriegerJ.等的描述收獲 并純化病毒粒子以提供適合轉導哺乳動物細胞的rAAV原料。實施例31-表達TNFR Δ 7的慢病毒載體的產生為了在體外或體內將TNFR Δ 7基因遞送給哺乳動物細胞以在所述哺乳動物細胞 中進行表達，要產生不能復制的慢病毒載體。依照廠家的說明，將來自實施例27、30、35和 38的PCR產物與pLenti6/V5-D-TOPO 載體(Invitrogen)進行平末端連接。利用標準 分子生物學技術將所產生的質粒轉化到大腸桿菌中，并對其進行擴增和純化。依照廠家的 說明將該質粒轉染到293FT細胞(Invitrogen)中以產生包含TNFRA 7基因的慢病毒粒子， 其中TNFRA 7基因的表達由較強的組成型CMVie啟動子驅動。按照Tiscornia，G. , et al.， 2006,Nature Protocols 1 :241的描述收獲并純化病毒粒子以提供適合轉導哺乳動物細胞 的慢病毒原料。實施例32-在哺乳動物細胞中表達TNFR2 Δ 7用實施例26和34產生的質粒在哺乳動物HeLa細胞中表達活性蛋白質，并測試 所產生的蛋白質的抗TNF-alpha活性。HeLa細胞接種在裝有包含L-谷氨酰胺、慶大霉素、 卡那霉素、5% FBS和5% HS的SMEM培養(yǎng)基的24孔板中，每孔1. OxlO5個細胞。37°C在包 含5% C02的濕潤空氣中讓細胞生長過夜。將大約250ng質粒DNA添加到50ml OPT I-MEM 中，然后添加 50mlLipofectamine 2000 混合物(1 份 Lipofectamine 2000 與 25 份 0PTI-MEM )并溫育20分鐘。接下來，添加400ml無血清培養(yǎng)基，并將其施用給24孔板中的細胞。37°C在包含5% C02的濕潤空氣中溫育48小時后，收集培養(yǎng)基并將細胞收獲在SOOmL TRI-Reagent 中。依照廠家的說明從細胞分離總RNA，并利用適合于人TNFR2 Δ 7的正向引 物 TR047(SEQ ID NO 200)和反向引物 TR048 (SEQ ID NO 201)或適合于小鼠 TNFR2 Δ 7 的 正向引物 TR045(SEQ ID NO 228)和反向引物 TR046 (SEQ ID NO 229)進行 RT-PCR 分析。 通過ELISA測定培養(yǎng)基中可溶性TNFR2的濃度。在L929細胞毒性試驗中測試上述培養(yǎng)基的抗TNF-alpha活性。L929細胞接種在 裝有包含10%常規(guī)FBS、青霉素和鏈霉素的MEM培養(yǎng)基的96孔板中，每孔2xl04個細胞， 37°C在包含5% C02的濕潤空氣中讓細胞生長過夜。用來自未轉染Hela細胞的培養(yǎng)基將培 養(yǎng)基樣品稀釋1、2、4、8和16倍。將這些樣品中的每種樣品取90 μ 1添加到10 μ 1的包含 1. Ong/ml TNF-alpha和lug/ml的放線菌素D的無血清培養(yǎng)基中。去除細胞的培養(yǎng)基并用 所述的100 μ 1的樣品替換培養(yǎng)基。然后，37°C在包含5% C02的濕潤空氣中讓細胞生長過 夜。然后將 20mLCelITiter 96 AQue。usOne Solution Reagent (Promega)添加到每個孔中。 4小時以后，通過用全自動定量繪圖酶標儀測量490nm的吸光度來測量細胞的生存能力。參 照未處理細胞，將細胞生存能力標準化，并以TNF拮抗劑的濃度為函數(shù)繪圖(圖17)。利用GraphPad Prism 軟件分析來自該實施例和實施例9的數(shù)據(jù)以確定3拮抗劑 的EC5tl值。對 于這些實施例的每一種拮抗劑，通過用分別被固定在100%和0%的最大和 最小反應進行非線性回歸擬合S形劑量反應曲線。表8顯示的EC5tl值相當于95%的置信 水平，每個曲線具有從0. 7到0. 9的r2值。表8 TNF-alpha拮抗劑的活性 實施例33-哺乳動物細胞中TNFR2 Δ 7的表達和純化
實施例15和實施例中產生的質粒用來從哺乳動物HeLa細胞中表達和純化 TNFR2 Δ 7。HeLa細胞接種在6孔板中，每孔5x10s個細胞，37°C在包含5% C02的濕潤空氣中 讓細胞生長過夜。然后，利用1144-4 (具有His標記的小鼠TNFR2 Δ 7)，1145-1 (沒有His標 記的小鼠TNFR2 Δ 7)，1230-1 (沒有His標記的人TNFR2 Δ 7)或1319-1 (具有His標記的人 TNFR2 Δ 7)質粒，用1. 5mg質粒DNA轉染每個孔。轉染后 48小時收集培養(yǎng)基并利用Amicon MWCO 30，000過濾器濃縮大約40倍。讓細胞溶解在具有蛋白酶抑制劑(Sigma-aldrich)的 120mL RIPA溶解緩沖液(Invitrogen)，在冰上保持5分鐘。通過Bradford試驗確定蛋白 質濃度。從部分細胞裂解物分離蛋白質，并通過實施例1描述的適合于TNFR2的蛋白質印 跡分析細胞外培養(yǎng)基(圖18)。通過親和層析法從上述培養(yǎng)基純化具有His標記的人和小鼠TNFR2D7(分別為克 隆1319-1和1144-4)。HisPur 鈷離心柱(Pierce)被用來從上述培養(yǎng)基中純化包含His 標記的小鼠和人TNFR2A7。廠家推薦用50mM磷酸鈉、300mM氯化鈉、IOmM咪唑緩沖液(pH 7. 4)平衡的Iml HisPur 柱可以純化大約32ml培養(yǎng)基。然后，用兩倍柱體積的相同緩沖液 沖洗柱子，用Iml 50mM的磷酸鈉、300mM氯化鈉、150mM咪唑緩沖液(pH 7.4)洗脫蛋白質。 通過如上所述的蛋白質印跡分析每種洗脫液5ml。TNFR2 Δ 7出現(xiàn)在洗脫液中，多個條帶代 表TNFR2D7可變的糖基化形式。經過上述純化步驟的由不包含His標記的質粒1230-1或 1145-1表達的TNFR2D7蛋白質作為陰性對照。這些蛋白質不結合親和層析柱且不出現(xiàn)在洗 脫液中(圖19)。
權利要求
長度在8和16個核堿基之間的寡聚物，包含由長度為8-16個核堿基組成的毗連核堿基序列，其中所述的毗連核堿基序列與SEQ ID NO 1，SEQID NO 2，SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4中存在的毗連核苷酸的對應區(qū)域互補，而且所述的毗連核堿基序列不包含5個或5個以上毗連的DNA(2’-脫氧核糖核苷)單體單位，其中所述毗連核堿基序列包含選自由beta-D-氧LNA、硫代-LNA、氨基-LNA和ena-LNA組成的組的至少一個核苷酸類似物。
2.根據(jù)權利要求1的寡聚物，其中所述寡聚物在具有互補mRNA分子的復合物的雙鏈體 中形成時，基本上不能補充RNAseH。
3.根據(jù)權利要求1或2的寡聚物，其中毗連核堿基序列由與SEQID NOl或SEQ ID NO 3的對應區(qū)域互補的核堿基序列組成。
4.根據(jù)權利要求1-3任一項的寡聚物，其中所述寡聚物由毗連核堿基序列組成，并且 其中所述毗連核堿基序列長度為8、9、10、11、12、13、14或15個核堿基。
5.根據(jù)權利要求1-4任一項的寡聚物，其中毗連核堿基序列的核堿基之間的連接基團 選自由磷酸二酯、硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯(boranophosphate)組成的組。
6.根據(jù)權利要求1-5任一項的寡聚物，其中所述的毗連核堿基序列包含或由至少一個 另外的的核苷酸類似物(X)組成。
7.根據(jù)權利要求6的寡聚物，其中核苷酸類似物(X)獨立地選自由2’-0-烷基-RNA 單位、2 ‘ -OMe-RNA 單位、2 ‘ -MOE RNA 單位、2，-氨基-DNA 單位、2 ‘-氟-DNA 單位，LNA 單位、PNA單位、HNA單位和INA單位組成的組。
8 根據(jù)權利要求1-7任一項的寡聚物，其中毗連核堿基序列不包含2’0Me核糖核苷酸 類似物或2’ -MOE核糖核苷酸類似物。
9.根據(jù)權利要求1-8任一項的寡聚物，其中毗連核堿基序列包含核苷酸類似物⑴和 核苷酸(χ)。
10.根據(jù)權利要求1-9任一項的寡聚物，其中毗連核堿基序列包含含有至少一個核苷 酸和至少一個核苷酸類似物的子序列。
11.根據(jù)權利要求10的寡聚物，其中子序列選自由Xx，XX，Xxx,xXx, xxX, XXx, XxX, χΧΧ, XXXx，XXxX，XxXX，χΧΧΧ, χχχΧ, χχΧχ, χΧχχ, Xxxx，XXXXx，XXXxX，XXxXX，XxXXX，χΧΧΧΧ, χχχχΧ, χχχΧχ, χχΧχχ, χΧχχχ, Χχχχχ組成的組，其中所述的交替序列可任意重復。
12.根據(jù)權利要求11的寡聚物，其中重復序列在毗連核堿基序列的全長范圍內重復， 其中任選地5’和或3’端的重復可以截短。
13.根據(jù)權利要求1-12任一項的寡聚物，其中毗連核堿基序列包含所述的至少一個 LNA類似物單位和至少一個另外的不同于LNA的核苷酸類似物單位。
14.根據(jù)權利要求13的寡聚物，其中毗連核堿基由至少一個X1X2X1或X2X1X2序列組成， 其中X1是LNA，X2是不同于LNA的核苷酸類似物。
15.根據(jù)權利要求14的寡聚物，其中毗連核堿基由交替的X1和X2單位組成。
16.根據(jù)權利要求7-15任一項的寡聚物，其中另外的核苷酸類似物單位獨立地選自由 2’ -OMe RNA單位、2’ -氟-DNA單位、2’ -MOE RNA單位和LNA單位組成的組。
17.根據(jù)權利要求7-16任一項的寡聚物，其中核苷酸類似物單位(X)是LNA單位。
18.根據(jù)權利要求7-17任一項的寡聚物，其中LNA單位選自由alpha-L-氧、 beta-D-氧-LNA、氨基-LNA、硫代-LNA和ena-LNA組成的組。
19.根據(jù)權利要求7-18任一項的寡聚物，其中毗連核堿基序列不包含由5個或5個以 上獨立地選自DNA和alpha-L LNA單位的毗連核堿基組成的毗連子序列。
20.根據(jù)權利要求7-18任一項的寡聚物，其中毗連核堿基序列不包含由5個或5個以 上獨立地選自DNA和alpha-L-氧LNA單位的毗連核堿基組成的毗連子序列。
21.根據(jù)權利要求7-20任一項的寡聚物，其中所有的LNA單位都是beta_D構型。
22.根據(jù)權利要求1-21任一項的寡聚物，其中所述毗連核堿基序列與選自由SEQID NO 1 的 51-164、SEQ ID NO 2 的 51-79、SEQ ID NO 3 的 51-127 和 SEQ ID NO 4 的 51-85 ； 或者SEQ ID NO 247-SEQ ID NO 250的等價位置所組成的組之序列中存在的毗連核苷酸的 對應區(qū)域互補。
23.根據(jù)權利要求1-21任一項的寡聚物，其中所述的毗連核堿基序列與選自由SEQID NO 1 的 1-50、SEQ ID NO 1 的 165-215、SEQ ID NO 2 的 1-50、SEQ ID NO 2 的 80-130、SEQ ID NO 3 的 1-50、SEQ ID NO 3 的 128_178、SEQ ID NO 4 的 1-50 和 SEQ ID NO 4 的 86-136; 或者SEQ ID NO 247-SEQ IDNO 250中的等價位置所組成的組之序列中存在的毗連核苷酸 的對應區(qū)域互補。
24.根據(jù)權利要求1-21任一項的寡聚物，其中所述的毗連核堿基序列包含與5’外顯 子/內含子3，或3，內含子/外顯子5，邊界；或者SEQ ID N0247-SEQ ID NO 250中的等 價位置互補的核堿基序列。
25.根據(jù)權利要求24的寡聚物，其中所述的5’外顯子/內含子3’或3’內含子/外 顯子 5，邊界選自由 SEQ ID NO 1 的核堿基 50-51、SEQ ID NO 1 的 164-165、SEQ ID NO 2 的 50-51、SEQ ID NO 2 的 79-80、SEQ ID NO 3 的 51-52、SEQ ID NO 3 的 129-139、SEQ ID NO 4 的 50-51、SEQ ID No 4 的 81-82 ；或者 SEQ ID NO 247-SEQ ID NO 250 中的等價位置 所組成的組。
26.根據(jù)權利要求1-25任一項的寡聚物，其中所述的毗連核堿基序列與選自由SEQID NO 74到SEQ ID NO 105組成的組的序列中存在的核堿基序列相同，或者存在于該序列中。
27.根據(jù)權利要求26的寡聚物，其中所述的毗連核堿基序列與選自由SEQID NO 74、 SEQ ID NO 75、SEQ ID NO 77、SEQ ID NO 78、SEQ IDNO 80、SEQ ID NO 82 和SEQ ID NO 84 組成的組的核堿基序列相同，或者存在于該序列中。
28.根據(jù)權利要求26的寡聚物，其中所述的毗連核堿基序列與選自由SEQID NO 85、 SEQ ID NO 86,SEQ ID NO 87,SEQ ID NO 88和SEQ IDNO 89組成的組的核堿基序列相同， 或者存在于該序列中。
29.根據(jù)權利要求1-28任一項的寡聚物，其中所述的毗連核堿基序列包含與選自SEQ ID No 3的核苷酸區(qū)域47-49、54-56和122-124互補的核堿基序列。
30.根據(jù)權利要求1-29任一項的寡聚物，其中所述的毗連核堿基序列與選自由SEQID NO 131-SEQ ID No 145、SEQ ID NO 147-SEQ ID NO 161 和 SEQ ID NO 163-177 組成的組 的核堿基序列或核堿基基序相同，或者存在于該序列中。
31.根據(jù)權利要求32的寡聚物，其中所述寡聚物選自由SEQID N0245-SEQ ID NO 246,SEQ ID NO 251-263、SEQ ID NO 264-SEQ ID NO 279、SEQ ID NO 280-SEQ ID NO 295 組成的組。
32.根據(jù)權利要求1-29任一項的寡聚物，其中所述的毗連核堿基序列與選自由SEQIDNO 130,SEQ ID NO 146和SEQ ID NO 162組成的組的核堿基序列或核堿基基序相同，或者 存在于該序列或基序中。
33.根據(jù)權利要求1的寡聚物，其中寡聚物選自由SEQID NO 244、SEQ ID NO 264或 SEQ ID NO 280組成的組。
34.包含根據(jù)權利要求1-33任一項的寡聚物和共價附著于所述寡聚物上的至少一個 非核苷酸部分的偶聯(lián)物。
35.包含權利要求1-33任一項的寡聚物，或權利要求34的偶聯(lián)物和藥學上可接受的載 體的藥物組合物。
36.改變TNFalpha受體前-mRNA mRNA剪接的方法，其中前-mRNAmRNA選自表達 TNFRSFIATNF alpha受體或TNFRSF1B TNF alpha受體的哺乳動物細胞中的TNFRSF1A或 TNFRSFIA(B)，所述方法包括給細胞施用權利要求1_33任一項的寡聚物、權利要求34的偶 聯(lián)物或權利要求35的藥物組合物。
37.在表達TNFRSF1ATNF alpha受體或TNFRSF1B TNF alpha受體的哺乳動物細胞中 制備可溶形式的所述TNF alpha受體的方法，所述方法包括給所述細胞施用權利要求1_33 任一項的寡聚物、權利要求34的偶聯(lián)物或權利要求35的藥物組合物。
38.根據(jù)權利要求37的方法，更進一步地包括從所述哺乳動物細胞分離或純化可溶形 式的 TNF alpha 受體 TNFRSF1A 或 TNFRSF1B 的步驟。
39.增加表達TNFRSFIA TNF alpha受體或TNFRSF IB TNF alpha受體的哺乳動物細 胞中可溶形式的所述TNF alpha受體的表達的方法，所述方法包括給所述細胞施用權利要 求1-33任一項的寡聚物、權利要求34的偶聯(lián)物或權利要求35的藥物組合物。
40.根據(jù)權利要求36-39任一項的方法，其中所述方法在體外或體內實施。
41.權利要求1-33任一項的寡聚物或權利要求34的偶聯(lián)物，在制備用于治療炎性疾病 或狀態(tài)的藥物中的用途。
42.權利要求1-33任一項的寡聚物或權利要求34的偶聯(lián)物，用于治療炎性疾病或狀態(tài)。
43.治療或預防炎性疾病或狀態(tài)的方法，包括給患有或很可能患有所述炎性疾病的病 人施用權利要求35的藥物組合物的步驟。
44.根據(jù)權利要求44-49任一項的分離或純化的可溶形式的TNFalpha受體，或根據(jù)權 利要求57制備的TNF alpha受體，用于治療炎性疾病或狀態(tài)。
45.治療或預防炎性疾病或狀態(tài)的方法，包括給患有或很可能患有所述炎性疾病的病 人施用權利要求56的藥物組合物的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及剪接轉換寡核苷酸或剪接轉換寡聚物(SSOs)。依照本發(fā)明的優(yōu)選的SSOs靶向TNFR1(TNFRSFlA)或TNFR2(TNFRSFlA)前信使RNA的外顯子7，典型地會導致產生分別包含部分或全部外顯子7缺失的TNFR變體。發(fā)現(xiàn)靶向外顯子7的SSOs會產生治療炎性疾病的具有治療用途的可溶形式的TNFR。SSO的特征在于它們基本上不能或不能補充RNaseH。
文檔編號C12N15/113GK101889086SQ200780053595
公開日2010年11月17日 申請日期2007年10月19日 優(yōu)先權日2007年5月1日
發(fā)明者亨里克·奧魯姆, 彼得·L·薩扎尼 申請人:桑塔用斯制藥公司;厄克爾生物技術股份有限公司