專利名稱：：D4去飽和酶和d5延伸酶的制作方法D4去飽和酶和D5延伸酶I.背景有壓倒性的科學(xué)證據(jù)表明，(n-3)高級(jí)不飽和脂肪酸諸如二十二碳六烯酸(DHA)對心血管循環(huán)疾病、慢性炎癥和腦功能障礙有積極作用。另一方面，已經(jīng)注意到(n-6)脂肪酸諸如二十碳五烯酸(EPA)在類花生酸類固醇諸如前列腺素、白細(xì)胞三烯或類似的類花生酸類固醇中作為中間代謝產(chǎn)物。目前，這些高級(jí)不飽和脂肪酸的主要來源是魚，注意到EPA和DHA在各種海洋魚類(bluefish)(諸如沙丁魚和金槍魚)中分別以大約20%和10%的量存在。認(rèn)為這樣一種脂肪酸譜是通過在每種魚類中自然選擇最佳表現(xiàn)的最佳比例而發(fā)生的。然而，如果人們想要使用魚油作為這些脂質(zhì)的唯一來源，還存在許多缺陷，諸如味道污染的問題，可獲得性的不可控的波動(dòng)，和天然魚油成分的變化性。此外，如果人們想要從這些來源獲得高度純化的(n-3)或(n-6)油，很難優(yōu)先分離并純化它們。此前公開了能夠產(chǎn)生高量DHA和EPA以及其它首選脂肪酸的破囊壺菌目(Thraustochytriales)真核生物0NC-T18和相關(guān)有機(jī)體。0NC-T18公開在國際申請PCT/IB2006/003977和美國臨時(shí)申請60/751401和60/821084，這些都通過參考至少涉及0NC-T18和其中產(chǎn)生的脂肪酸的信息的方式并入本文。期望操縱DHA和EPA途徑。本文公開了來自0NC-T18、牽涉在這些途徑中的兩種酶D4去飽和酶和D5延伸酶的分離和表征。II.概述公開了涉及0NC-T18、D4-去飽和酶、D5延伸酶和分離、表征、產(chǎn)生、鑒定它們的方法和組合物，和它們用于脂肪酸產(chǎn)生的應(yīng)用，以及包含這些組合物的有機(jī)體和表達(dá)這些組合物的有機(jī)體。III.附圖簡述并入本文并構(gòu)成說明書一部分的附圖，闡釋了多種實(shí)施方式，并連同描述闡釋了公開的組合物和方法。圖1顯示EPA和DHA產(chǎn)生的途徑。圖2A顯示分離的D4去飽和酶的系統(tǒng)進(jìn)化(phylogentic)樹，圖2B顯示分離的D5-延伸酶的系統(tǒng)進(jìn)化(phlogenetic)樹。圖3顯示分離的D4去飽和酶的圖示遺傳概述。圖4顯示分離的D5延伸酶的圖示遺傳概述。IV.詳述公開和描述本發(fā)明的化合物、組合物、物品、裝置和/或方法之前，應(yīng)理解的是，除非另外指明，否則它們不限于具體合成方法或具體重組生物技術(shù)方法，或除非另外指明，否則不限于具體試劑，因?yàn)楸景l(fā)明的這些化合物、組合物、物品、裝置和/或方法當(dāng)然都可以變化。還應(yīng)理解的是，本文所用的術(shù)語僅是為了描述具體實(shí)施方案的目的，不意為限制。A.定義在說明書和所附的權(quán)利要求書中所用的，除非上下文另外清楚地指明，否則單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“該”包括多數(shù)指示物。因此，例如，提到“一種藥物運(yùn)載體”包括兩種或多種所述運(yùn)載體(carrier)的混合物，等等。本文中范圍可表示為從“約”一個(gè)具體值和/或到“約”另一個(gè)具體值。當(dāng)表示這種范圍時(shí)，另一實(shí)施方案包括從一個(gè)具體值和/或到另一個(gè)具體值。類似地，當(dāng)數(shù)值通過使用先行詞“約”表示為近似值時(shí)，應(yīng)理解的是，該具體值形成另一實(shí)施方案。進(jìn)一步應(yīng)理解的是，每個(gè)范圍的端點(diǎn)在相對于另一端點(diǎn)和獨(dú)立于另一端點(diǎn)兩種情況下都是有意義的。還應(yīng)理解的是，本文公開了許多數(shù)值，每個(gè)數(shù)值除了該數(shù)值本身，還在本文公開為“約”該具體值。例如，如果公開數(shù)值“10”，那么還公開了“約10”。還應(yīng)理解的是，當(dāng)公開數(shù)值時(shí)，還公開了“小于或等于”該數(shù)值、“大于或等于該數(shù)值”和數(shù)值之間的可能范圍，如本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)?shù)乩斫獾?。例如，如果公開“10”，則還公開了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。還應(yīng)理解的是，在本申請中，數(shù)據(jù)以多種不同形式提供，且該數(shù)據(jù)代表端點(diǎn)和起點(diǎn)，以及數(shù)據(jù)點(diǎn)的任何組合的范圍。例如，如果公開具體數(shù)據(jù)點(diǎn)“10”和具體數(shù)據(jù)點(diǎn)15，則應(yīng)理解的是，認(rèn)為公開了大于、大于或等于、小于、小于或等于、等于10和15以及10與15之間。還應(yīng)理解的是，還公開了兩個(gè)具體單位之間的每個(gè)單位。例如，如果公開10和15，那么還公開711、12、13和14。在說明書和所附的權(quán)利要求書中，將提及許多術(shù)語，這些術(shù)語應(yīng)被界定為具有以下含義“任選”或“任選地”是指其后描述的事件或情況可能發(fā)生或可能不發(fā)生，該描述包括其中所述事件或情況發(fā)生的情形和所述事件或情況不發(fā)生的情形?！耙铩笔悄軌蛑С忠恍╊愋偷拿复俨倏v并能與靶核酸雜交以使酶促操縱可發(fā)生的探針亞組。引物可從本領(lǐng)域可獲得而不干擾酶促操縱的核苷酸或核苷酸衍生物或類似物的任何組合制備?！疤结槨笔悄軌蚺c靶核酸相互作用的分子，所述相互作用典型地是以序列特異性方式例如經(jīng)由雜交。核酸的雜交是本領(lǐng)域熟知的，并在本文討論。典型地探針可從本領(lǐng)域可獲得的核苷酸或核苷酸衍生物或類似物的任何組合制備。在本申請中，參照了多種出版物。這些出版物的公開完整地通過參考并入本申請，以更完全地描述本申請所屬領(lǐng)域的技術(shù)狀態(tài)。公開的參考文獻(xiàn)還單獨(dú)和具體地通過參考包含在其中的材料而并入本文，所述材料在參考文獻(xiàn)所依賴的語句中討論。公開了將用于制備公開的組合物的組分以及將用于本文公開的方法的組合物本身。本文公開這些和其它材料，應(yīng)理解的是，當(dāng)公開這些材料的組合、亞組、相互作用、組等等時(shí)，盡管可能沒有明確地公開具體地提及這些化合物的每種不同的單獨(dú)和共同的組合和排列，但本文具體地預(yù)期并描述每一種。例如，如果公開和討論具體的D4去飽和酶和D5延伸酶，并討論可對包括D4去飽和酶和D5延伸酶的大量分子進(jìn)行的大量修飾，則具體地預(yù)期D4去飽和酶和D5延伸酶的每一種和每種組合和排列以及可能的修飾，除非具體地指明相反。因此，如果公開一類分子A、B和C以及一類分子D、E和F并公開組合分子A-D的一個(gè)實(shí)例，那么即使沒有單獨(dú)地提及每一種，也單獨(dú)和共同地預(yù)期每一種，即認(rèn)為公開了組合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、CUPC-F。類似地，還公開了這些的任何亞組或組合。因此，例如，將認(rèn)為公開了A-E、B-FjPC-E的亞組。這一概念應(yīng)用到本申請的所有方面，包括但不限于制備和使用公開的組合物的方法的步驟。因此，如果有可進(jìn)行的多個(gè)另外步驟，應(yīng)理解的是，這些另外步驟的每一個(gè)可與公開的方法的任何具體的實(shí)施方案或?qū)嵤┓桨傅慕M合一起進(jìn)行。B.組合物在強(qiáng)化某些食品以促進(jìn)健康飲食方面，ω-3濃縮物(二十碳五烯酸ΕΡΑ，即20:5ri-3，和二十二碳六烯酸DHA，即22:6η-3)的使用已經(jīng)變得重要。破囊壺菌Thraustochytrid是天然地產(chǎn)生DHA的海洋原生生物，產(chǎn)生的DHA達(dá)其生物量的20%。發(fā)酵這些有機(jī)體的能力提供了這些ω-3油的可再生的、長期來源。脂肪酸代謝途徑的表征(圖1)揭示了負(fù)責(zé)延伸EPA為二十二碳五烯酸(DPA、22:5n-3)的D5-延伸酶、以及牽涉在去飽和DPA為DHA的D4-去飽和酶的重要性。操縱特定酶活性可以影響由我們的0NC-T18菌株產(chǎn)生EPA和DHA的產(chǎn)率，如由市場和我們的顧客的需要所要求的。使用從不同破囊壺菌Thraustochytrid菌株(用于D4-去飽和酶的破囊壺菌Thraustochytriumsp.(CS020087)、金黃色破囊壺菌Thraustochytriumaureum(AF391546)、破囊壺菌Thraustochytriumsp.ATCC34304(AF391543)、破囊壺菌Thraustochytriumsp.ATCC21685(AF489589)和破囊壺菌Thraustochytriumsp.FJN-10(DQ133575)；用于D5-延伸酶的破囊壺菌Thraustochytriumsp.(CS160897)和金黃色破囊壺菌Thraustochytriumaureum(CS160879))的酶的基因序列中的保守區(qū)域構(gòu)建的簡并引物，從ONCT-18分離了D4-去飽和酶和D5延伸酶。進(jìn)一步PCR擴(kuò)增來自基因組DNA的基因的一部分(分別是967bp和593bp)?；蚪M步移(APAgeneGOLD試劑盒，BIOS&T,Montreal,Quebec)用于延伸已知序列以摻入完整的開放閱讀框，并進(jìn)一步延伸以鑒定任一側(cè)上的相鄰基因以及啟動(dòng)子區(qū)域。隨后對完整序列構(gòu)建引物以產(chǎn)生摻入完整的開放閱讀框的全基因PCR產(chǎn)物(分別是1758bp和1099bp)。將PCR產(chǎn)物克隆到pT7_Blue3載體(Novagen,SanDiego,California)并轉(zhuǎn)化至丨J大腸桿菌NovaBlue(DE3)(Novagen,SanDiego,California),隨后測序。使用UltraClean6MinuteMini質(zhì)粒制備試劑盒(MOBIOLaboratories,Inc.，SolanaBeach,California)純化獲得的基因質(zhì)粒。隨后使用限制酶BamHI和NotI切下基因插入片段并克隆到PYES2酵母表達(dá)載體(Invitrogen，Carlsbad，California)。隨后使用S.c.EasyComp轉(zhuǎn)化試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,California)，在半乳糖啟動(dòng)子Gall控制下，轉(zhuǎn)化鑒定為pYDes(D4-去飽和酶)和pYElo(D5-延伸酶)的新載體構(gòu)建體到釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeINVScl陰性對照菌株是包含未改變的pYES2載體的INVScl，使這些菌株同時(shí)生長。使用酵母菌株的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型進(jìn)行載體篩選，并使用無尿嘧啶的SC培養(yǎng)基。使用酵母表達(dá)體系確定D4-去飽和酶和D5延伸酶的活性和特異性。轉(zhuǎn)化的酵母在包含2%葡萄糖、TergitolNP-40的SC-U培養(yǎng)基中在30°C150RPM下生長48hr。制備包含SC-U、2%半乳糖、棉子糖、TergitolNP-40和500μM特定自由脂肪酸的底物培養(yǎng)基。將轉(zhuǎn)化的酵母培養(yǎng)物以0.5的0D600接種到IOOml底物培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)物在20°C培養(yǎng)5天。以2000RPM離心5min，IOOmM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)洗滌一次，隨后冷凍干燥來回收生物量。其后進(jìn)行脂肪酸甲基酯氣相色譜以確定脂肪酸去飽和與延伸的效率。通過計(jì)算(產(chǎn)物)/(底物+產(chǎn)物)女100而確定底物的轉(zhuǎn)化百分比。BLASTx結(jié)果顯示，ONCT-18D4去飽和酶與破囊壺菌Thraustochytriumsp.ATCC21685D4-去飽和酶96%相似。圖2A顯示當(dāng)與0NC-T18D4-去飽和酶序列相比時(shí)的置根鄰接系統(tǒng)進(jìn)化樹(rootedneighbour-joiningphylogenetictree),該系統(tǒng)進(jìn)化樹使用ClustalX，使用BLASTx搜尋結(jié)果的自展分析(IOOOx)確定。D4-去飽和酶基因具有1560bp的開放閱讀框，轉(zhuǎn)錄519氨基酸的蛋白。該蛋白的分析顯示細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域、三個(gè)組氨酸盒基序和四個(gè)跨膜區(qū)，所有元件都是前端去飽和酶的特征。與該基因相鄰的是五個(gè)推定的TATA盒、多個(gè)重復(fù)區(qū)、兩個(gè)啟動(dòng)子和上游鑒定的蛋白激酶以及下游的AP2結(jié)合蛋白(圖3)。相反，BLASTx搜尋鑒定D5-延伸酶蛋白為與破囊壺菌Thraustochytriumsp.FJN-10多不飽和的脂肪酸延伸酶具有89%的同一性。圖2B顯示當(dāng)與0NC-T18D5-延伸酶序列相比時(shí)的置根鄰接系統(tǒng)進(jìn)化樹，該系統(tǒng)進(jìn)化樹使用ClustalX，使用BLASTx搜尋結(jié)果的自展分析(IOOOx)確定。進(jìn)一步分析確定該831bp長的延伸酶編碼276氨基酸的蛋白，包含對線粒體特異性的四個(gè)跨膜區(qū)、和一個(gè)組氨酸盒基序。該D5-延伸酶區(qū)的上游組分包含線粒體輸入受體之前的單個(gè)TATA盒、多個(gè)重復(fù)區(qū)和啟動(dòng)子，而在下游鑒定了膜占據(jù)和識(shí)別連結(jié)(recognitionnexus)基序的開始(圖4)。n-3和n-6途徑的pYDes的表征(表1)顯示14%的DPAn_3或二十二碳四烯酸(DTA22:4n-6)分別轉(zhuǎn)化為DHA或DPAn_6。:D4-去飽和酶的酶活性和表征<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>DPADHA14.044.01438.702.75倍DTADPAn-63.761.31333.432.43倍DGLAARA0.870.273___當(dāng)飼喂相應(yīng)的D4-去飽和酶底物二高-g-亞麻酸(DGLA，20:3n-6)時(shí)，未檢測到轉(zhuǎn)化。為了增加PYDes活性，向培養(yǎng)基加入痕量金屬諸如檸檬酸鐵，導(dǎo)致DPA向DHA的轉(zhuǎn)化增加(表1)。相反，當(dāng)飼喂EPA或花生四烯酸(ARA20:4n-6)時(shí)，目前pYElo顯示最少的轉(zhuǎn)化。已經(jīng)成功分離并克隆來自高脂肪酸產(chǎn)生菌株破囊壺菌Thraustochytriumsp.0NC-T18的D4-去飽和酶和D5-延伸酶基因，隨后在釀酒酵母中表達(dá)。而且，顯示D4-去飽和酶以其天然形式和經(jīng)由補(bǔ)充痕量金屬轉(zhuǎn)化DPA或DTA兩者為其各自的終產(chǎn)物。用其它脂肪酸的飼喂研究證實(shí)該去飽和酶的D4特異性活性。經(jīng)由使用基因操縱技術(shù)諸如易錯(cuò)PCR，將進(jìn)一步增強(qiáng)該活性以實(shí)現(xiàn)我們的菌株中DHA產(chǎn)生的增加。公開了包含D4去飽和酶的組合物，其中該D4去飽和酶與SEQIDNO26具有至少或大于70%、80%、89%、90%、95%、96%、97%的同一性。還公開了組合物，其中不同于SEQIDNO26的任何變化是保守性變化。還公開了包含核酸的組合物，其中該核酸編碼任何D4去飽和酶。還公開了組合物，其還包含載體。還公開了包含細(xì)胞的組合物，其中該細(xì)胞包含任何的該組合物。還公開了組合物，其中該細(xì)胞是真核生物、原核生物、破囊壺菌Thraustochytrid、酵母或大腸桿菌的細(xì)胞。還公開了包含非人類動(dòng)物的組合物，其中該非人類動(dòng)物包含任何的該組合物。還公開了組合物，其中該組合物比不存在D4去飽和酶的組合物產(chǎn)生更多的多不飽和的脂肪酸。還公開了組合物，其中該脂肪酸是EPA或DHA。還公開了組合物，其中該去飽和酶包含至少一個(gè)組氨酸盒。還公開了組合物，其中該去飽和酶包含至少2個(gè)組氨酸盒。還公開了組合物，其中該去飽和酶包含至少三個(gè)組氨酸盒。還公開了組合物，其中該組氨酸盒包含序列HXXHH，其中X是任何氨基酸。還公開了組合物，其中該組氨酸盒包含序列QXXHH。還公開了組合物，其中該去飽和酶還包含細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域。還公開了組合物，其中該細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域位于5’_端。還公開了組合物，其中該去飽和酶是在去飽和酶底物存在下。還公開了組合物，其中該底物具有至少100μΜ、200μΜ、300μΜ、400μΜ、500μΜ、600μΜ、700μΜ、800μΜ、900μM或1000μM的濃度。還公開了組合物，其中該底物是二十二碳五烯酸(22:5ri-3)、二十二碳四烯酸(224η-6)或二高-Y-亞麻酸(203η_6)。還公開了組合物，其中該去飽和酶轉(zhuǎn)化至少0.1%、0.5%、1%、5%、10%、30%、50%、70%、90%、95%的可獲得的底物。還公開了組合物，其中該去飽和酶轉(zhuǎn)化表1所示的量的底物。還公開了組合物，其中該組合物是分離的。還公開了包含D5延伸酶的組合物，其中該D5延伸酶與SEQIDNO:15具有至少或大于70%、80%、89%、90%、95%、96%、97%的同一性。還公開了組合物，其中不同于SEQIDNO15的任何變化是保守性變化。還公開了包含核酸的組合物，其中該核酸編碼任何D5延伸酶。還公開了編碼延伸酶或去飽和酶的組合物，其還包含載體。還公開了組合物，其中該組合物比不存在D5延伸酶的組合物產(chǎn)生更多的多不飽和的脂肪酸，諸如DHA或EPA。還公開了組合物，其中該延伸酶是在延伸酶底物存在下。還公開了組合物，其中該底物是二十碳五烯酸(20:5n-3)或花生四烯酸(20:4n-6)。還公開了組合物，其中該延伸酶轉(zhuǎn)化至少0.1%、0.5%、1%、5%、10%、30%、50%、70%、90%、95%的可獲得的底物。還公開了組合物，其中該組合物是分離的。還公開了組合物，其包含公開的任何去飽和酶組合物和公開的任何延伸酶組合物。還公開了產(chǎn)生多不飽和的脂肪酸的方法，其包括使用一種或多種任何這種組合物。還公開了方法，其中產(chǎn)生的脂肪酸是EPA或DHA。還公開了產(chǎn)生權(quán)利要求1-37所述的組合物的方法，其包括分離任何這種組合物。1.序列相似性應(yīng)理解的是，如本文討論的，使用術(shù)語同源性和同一性表示與相似性相同的含義。因此，例如，如果在兩條非天然序列之間使用詞語同源性，應(yīng)理解的是，這不必表示這兩條序列之間的進(jìn)化關(guān)系，而是關(guān)注其核酸序列之間的相似性或關(guān)聯(lián)性。確定兩種進(jìn)化上相關(guān)分子之間同源性的許多方法為了測量序列相似性的目的常規(guī)地適用于任何兩種或多種核酸或蛋白，而不論它們是否進(jìn)化上相關(guān)。大體上，應(yīng)理解的是，界定本文公開的基因和蛋白的任何已知的變體和衍生物或可能產(chǎn)生的變體和衍生物的一種方式是經(jīng)由在對特定已知序列的同源性方面界定變體和衍生物。本文公開的具體序列的該同一性也在本文別處討論。大體上，本文公開的基因和蛋白的變體通常與所指的序列或天然序列具有至少約70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99的同源性百分比。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解如何確定兩種蛋白或核酸諸如基因的同源性。例如，可經(jīng)過比對兩條序列以使同源性處在最高水平之后，計(jì)算同源性。計(jì)算同源性的另一方式可通過公開的算法進(jìn)行。用于比較的序列的最佳比對可通過Smith和WatermanAdv.App1.Math.2=482(1981)的局部同源性算法進(jìn)行，通過Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48443(1970)的同源性比對算法進(jìn)行，通過Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.85=2444(1988)的搜尋相似性方法進(jìn)行，通過這些算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)現(xiàn)(Wisconsin遺傳學(xué)軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WI)進(jìn)行，或通過目測進(jìn)行。對核酸可獲得相同類型的同源性，通過例如公開在Zuker，Μ.Science244=48-52,1989，Jaeger等人.Proc.Natl.Acad.SciUSA86:7706_7710，1989，Jaeger等人.MethodsEnzymo1.183=281-306,1989的算法，這些參考文獻(xiàn)通過參考至少涉及核酸比對的材料并入本文。應(yīng)理解的是，通常可使用任何的這些方法，并且在某些情形下，這些不同方法的結(jié)果可以不同，但本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，如果以至少一個(gè)這些方法發(fā)現(xiàn)同一性，那么將認(rèn)為序列具有所指的同一性，并公開在本文。例如，如本文所用的，列為對另一序列具有特定同源性百分比的序列是指序列具有所指的如由上述任何一種或多種計(jì)算方法計(jì)算的同源性。例如，如果使用Zuker計(jì)算方法計(jì)算第一序列為與第二序列具有80%的同源性，則即使由任何其它計(jì)算方法計(jì)算第一序列與第二序列不具有80%同源性，仍認(rèn)為第一序列與第二序列具有80%的如本文界定的同源性。作為另一實(shí)例，如果使用Zuker計(jì)算方法以及Pearson和Lipman計(jì)算方法兩種方法計(jì)算第一序列為與第二序列具有80%的同源性，則即使由Smith和Waterman計(jì)算方法、Needleman和Wunsch計(jì)算方法、Jaeger計(jì)算方法或任何其它計(jì)算方法計(jì)算第一序列與第二序列不具有80%同源性，仍認(rèn)為第一序列與第二序列具有80%的如本文界定的同源性。作為又另一實(shí)例，如果使用每一種計(jì)算方法計(jì)算第一序列為與第二序列具有80%的同源性(盡管實(shí)際上，不同計(jì)算方法通常將導(dǎo)致不同的計(jì)算的同源性百分比)，認(rèn)為第一序列與第二序列具有80%的如本文界定的同源性。2.雜交/選擇性雜交術(shù)語雜交通常是指至少兩個(gè)核酸分子諸如引物或探針與基因之間的序列驅(qū)動(dòng)的相互作用。序列驅(qū)動(dòng)的相互作用是指以核苷酸特異性方式發(fā)生在兩個(gè)核苷酸或核苷酸類似物或核苷酸衍生物之間的相互作用。例如，G與C相互作用或A與T相互作用是序列驅(qū)動(dòng)的相互作用。通常序列驅(qū)動(dòng)的相互作用發(fā)生在核苷酸的Watson-Crick面或Hoogsteen面。兩個(gè)核酸的雜交受本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的大量條件和參數(shù)影響。例如，反應(yīng)的鹽濃度、PH和溫度都影響兩個(gè)核酸分子是否將雜交。兩個(gè)核酸分子之間選擇性雜交的參數(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如，在一些實(shí)施方案，選擇性雜交條件可界定為嚴(yán)緊性雜交條件。例如，雜交的嚴(yán)緊性由雜交和洗滌步驟之一或兩者的溫度和鹽濃度兩者控制。例如，實(shí)現(xiàn)選擇性雜交的雜交條件可包括在高離子強(qiáng)度溶液(6XSSC或6XSSPE)中在比Tm(—半的分子從其雜交伴侶解離的解鏈溫度)低約12-25°C的溫度下雜交，隨后是在選擇以使洗滌溫度約比Tm低5°C至20°C的溫度和鹽濃度的組合下洗滌。易于在預(yù)備試驗(yàn)中按照經(jīng)驗(yàn)確定溫度和鹽條件，其中固定在濾膜上的參照DNA樣品與標(biāo)記的目標(biāo)核酸雜交，隨后在不同嚴(yán)緊性條件下洗滌。對于DNA-RNA和RNA-RNA雜交，雜交溫度通常較高?？扇缟鲜龅鼗蛉绫绢I(lǐng)域已知地使用條件以實(shí)現(xiàn)嚴(yán)緊性。(Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南)，第2版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,1989；Kunkel等人.MethodsEnzymo1.1987154:367，1987，其通過參考至少設(shè)計(jì)核酸雜交的材料并入本文)。對DNA:DNA雜交優(yōu)選的嚴(yán)緊性雜交條件可為在約68°C(水溶液中)在6XSSC或6XSSPE，隨后是在68°C洗滌。如果期望，雜交和洗滌嚴(yán)緊性可隨著期望的互補(bǔ)性程度的減少而相應(yīng)地減少，并進(jìn)一步依賴于在其中搜尋變異性的任何區(qū)域的G-C或A-T豐富度。類似地，如果期望，雜交和洗滌嚴(yán)緊性可隨著期望的同源性增加而相應(yīng)地增加，并進(jìn)一步依賴于在其中期望高同源性的任何區(qū)域的G-C或A-T豐富度，都如本領(lǐng)域已知的。界定選擇性雜交的另一方式是通過觀察與另一核酸結(jié)合的核酸的量(百分比)。例如，在一些實(shí)施方案，當(dāng)至少約60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%的限制性核酸(limitingnucleicacid)結(jié)合于非限制性核酸時(shí)，將是選擇性雜交條件。通常，非限制性引物是例如10或100或1000倍過量的。這種類型的檢測可在其中限制性與非限制性引物兩者例如10倍或100倍或1000倍地低于它們的kd、或其中僅核酸分子之一是10倍或100倍或1000倍、或其中核酸分子之一或兩者高于它們的kd的條件下進(jìn)行。界定選擇性雜交的另一方式是通過觀察在需要雜交來促進(jìn)期望的酶促操縱的條件下被酶促操縱的引物百分比。例如，在一些實(shí)施方案，在促進(jìn)酶促操縱的條件下當(dāng)至少約60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%的引物被酶促操縱時(shí)，將是選擇性雜交條件，例如如果該酶促操縱是DNA延伸，那么當(dāng)至少約60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%的引物分子被延伸時(shí)將是選擇性雜交條件。優(yōu)選的條件還包括制造商建議的條件或本領(lǐng)域中指出適合酶進(jìn)行操縱的條件。正如對于同源性一樣，應(yīng)理解的是，本文公開的有多種方法用于確定兩個(gè)核酸分子之間的雜交水平。應(yīng)理解的是，這些方法和條件可能提供兩個(gè)核酸分子之間不同百分比的雜交，但除非另外指明，否則滿足這些方法中的任一種方法的參數(shù)就足夠。例如如果需要80%雜交，則只要在這些方法中的任一種方法的所需參數(shù)中發(fā)生雜交，就認(rèn)為是本文公開的。應(yīng)理解的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解如果組合物或方法共同地或單獨(dú)地滿足用于確定雜交的這些標(biāo)準(zhǔn)的任一個(gè)，則認(rèn)為該組合物或方法是本文公開的組合物或方法。3.核酸本文公開的有多種分子是基于核酸的，包括例如編碼例如本文公開的分離的D4去飽和酶和D5延伸酶以及任何其它蛋白的核酸、以及各種功能性核酸。公開的核酸由例如核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸取代物組成。這些和其它分子的非限制性實(shí)例在本文討論。應(yīng)理解的是，例如當(dāng)載體在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，表達(dá)的mRNA將通常由A、C、G和U組成。類似地，應(yīng)理解的是，如果例如反義分子經(jīng)由例如外源遞送被引入細(xì)胞或細(xì)胞環(huán)境，反義分子由減少反義分子在細(xì)胞環(huán)境中降解的核苷酸類似物組成是有利的。a)核苷酸和相關(guān)分子核苷酸是包含堿基部分、糖部分和磷酸酯部分的分子。核苷酸可經(jīng)由其磷酸酯部分和糖部分連接到一起，產(chǎn)生核苷間的鍵。核苷酸的堿基部分可為腺嘌呤-9-基(A)、胞嘧啶-1-基(C)、鳥嘌呤-9-基(G)、尿嘧啶-1-基(U)、和胸腺嘧啶-1-基(T)。核苷酸的糖部分是核糖或脫氧核糖。核苷酸的磷酸酯部分是五價(jià)的磷酸酯。核苷酸的非限制性實(shí)例將是3‘-AMP(3‘-腺苷單磷酸酯)或5‘-GMP(5‘-鳥苷單磷酸酯)。核苷酸類似物是包含對堿基、糖或磷酸酯部分的一些類型修飾的核苷酸。對核苷酸的修飾是本領(lǐng)域公知的，并包括例如，5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5_羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤和2-氨基腺嘌呤以及在糖或磷酸酯部分的修飾。核苷酸取代物是具有與核苷酸類似的功能特性但不包含磷酸酯部分的分子，諸如肽核酸(PNA)。核苷酸取代物是將以Watson-Crick或Hoogsteen方式識(shí)別核酸，但經(jīng)由磷酸酯部分以外的部分連接在一起的分子。當(dāng)與適合的靶核酸相互作用時(shí)，核苷酸取代物能夠符合雙螺旋型結(jié)構(gòu)。還可能連接其它類型的分子(共軛物)到核苷酸或核苷酸類似物以增強(qiáng)例如細(xì)胞攝取。共軛物可化學(xué)地連接到核苷酸或核苷酸類似物。這種共軛物包括但不限于脂質(zhì)部分諸如膽固醇部分。(Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989，86，6553-6556)。Watson-Crick相互作用是與核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸取代物的Watson-Crick面的至少一種相互作用。核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸取代物的Watson-Crick面包括基于嘌呤的核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸取代物的C2、Nl和C6位置，和基于嘧啶的核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸取代物的C2、N3、C4位置。Hoogsteen相互作用是發(fā)生在核苷酸或核苷酸類似物的Hoogsteen面的相互作用，該Hoogsteen面暴露在雙螺旋DNA的大溝中。Hoogsteen面包括N7位置和在嘌呤核苷酸C6位置的反應(yīng)性基團(tuán)(NH2或0)。b)序列有關(guān)于例如分離的D4去飽和酶和D5延伸酶以及本文公開的任何其它蛋白的多種序列公開在Genbank，這些序列和其它序列通過參考完整地以及對于其中包含的單獨(dú)子序列并入本文。多種序列提供在本文，并且這些序列和其它序列可見于Genbank，在驟w.pubmed.EOv0本領(lǐng)域技術(shù)人員理解如何分辨序列差別和差異，以及如何將關(guān)于具體序列的組合物和方法調(diào)整為其它相關(guān)序列。有了本文公開的和本領(lǐng)域已知的信息，可對任何序列設(shè)計(jì)引物和/或探針。c)引物和探針公開了包括能夠與本文公開的基因相互作用的引物和探針的組合物。在某些實(shí)施方案，引物用于支持DNA擴(kuò)增反應(yīng)。通常引物將能夠以序列特異性方式延伸。引物以序列特異性方式延伸包括其中引物與之雜交或以其它方式締合的核酸分子的序列和/或組成指引或影響通過延伸引物產(chǎn)生的產(chǎn)物的組成或序列的任何方法。因此以序列特異性方式延伸引物包括但不限于，PCR、DNA測序、DNA延伸、DNA聚合、RNA轉(zhuǎn)錄或逆轉(zhuǎn)錄。以序列特異性方式擴(kuò)增引物的技術(shù)和條件是優(yōu)選的。在某些實(shí)施方案，引物用于DNA擴(kuò)增反應(yīng)，諸如PCR或直接測序。應(yīng)理解的是，在某些實(shí)施方案，還可使用非-酶促技術(shù)延伸引物，其中例如用于延伸引物的核苷酸或寡核苷酸被修飾以使其將發(fā)生化學(xué)反應(yīng)來通過序列特異性方式延伸引物。通常，公開的引物與核酸或核酸的區(qū)域雜交，或與核酸的互補(bǔ)序列或核酸區(qū)域的互補(bǔ)序列雜交。d)功能性核酸功能性核酸是具有特定功能諸如結(jié)合靶分子或催化特定反應(yīng)的核酸分子。功能性核酸分子可分為以下種類，這不意為限制。例如，功能性核酸包括反義分子、適體、核酶、形成三螺旋的分子、和外部引導(dǎo)序列。功能性核酸分子可作用為靶分子具備的特定活性的影響劑(affector)、抑制劑、調(diào)節(jié)劑和刺激劑，或功能性核酸分子可具備獨(dú)立于任何其它分子的全新活性。功能性核酸分子可與任何大分子諸如DNA、RNA、多肽或糖鏈相互作用。因此，功能性核酸可與分離的D4去飽和酶和D5延伸酶的mRNA、或分離的D4去飽和酶和D5延伸酶的基因組DNA相互作用，或可與分離的D4去飽和酶和D5延伸酶的多肽或片段相互作用。通常功能性核酸設(shè)計(jì)為基于靶分子與功能性核酸分子之間的序列同源性與其它核酸相互作用。在其它情況，功能性核酸分子與靶分子之間的特異性識(shí)別不是基于功能性核酸分子與靶分子之間的序列同源性，而是基于形成允許發(fā)生特異性識(shí)別的三級(jí)結(jié)構(gòu)。反義分子設(shè)計(jì)為經(jīng)由規(guī)范或非-規(guī)范的堿基配對與靶核酸分子相互作用。反義分子與靶分子的相互作用設(shè)計(jì)為經(jīng)由例如RNA酶H介導(dǎo)的RNA-DNA雜合體降解而促進(jìn)破壞靶分子。作為選擇，反義分子設(shè)計(jì)為阻礙通常將在靶分子發(fā)生的加工功能，諸如轉(zhuǎn)錄或復(fù)制。反義分子可基于靶分子的序列設(shè)計(jì)。存在通過尋找靶分子的最可及區(qū)域用于優(yōu)化反義效率的許多方法。示例性方法將是體外篩選試驗(yàn)和使用DMS和DEPC的DNA修飾研究。優(yōu)選地，反義分子以小于或等于10_6、10_8、10_1(1或10_12的解離常數(shù)(kd)結(jié)合靶分子。目的是設(shè)計(jì)和使用反義分子的方法和技術(shù)的代表性實(shí)例可見于以下美國專利的非限制性列表5，135，917,5,294，533,5,627，158,5,641，754,5,691，317,5,780，607,5,786，138、5，849，903,5，856，103,5，919，772,5，955，590,5，990，088,5，994，320,5，998，602,6，005，095,6，007，995,6，013，522,6，017，898,6，018，042,6，025，198,6，033，910,6，040，296,6,046，004,6,046，319和6，057，437。適體是與靶分子相互作用優(yōu)選地以特異性方式相互作用的分子。通常適體是折疊為確定的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)諸如莖環(huán)或G-四聯(lián)體的長度從15-50堿基的小核酸。適體可結(jié)合小分子諸如ATP(美國專利5，631，146)和茶堿(theophiline)(美國專利5，580，737)，以及大分子諸如逆轉(zhuǎn)錄酶(美國專利5，786，462)和凝血酶(美國專利5，543，293)。適體可以小于10_12M的kd非常緊密地結(jié)合靶分子。優(yōu)選地，適體以小于10_6、10_8、10,或10_12的kd結(jié)合靶分子。適體可以非常高程度的特異性結(jié)合靶分子。例如，已經(jīng)分離了適體，其對靶分子與僅在分子上的一個(gè)位置不同的另一分子的結(jié)合親和性具有大于10000倍的差異(美國專利5，543，293)。優(yōu)選地，適體與靶分子的kd比與背景結(jié)合分子的kd低至少10、100、1000、10，000或100，000倍。優(yōu)選例如當(dāng)對多肽進(jìn)行比較時(shí)，背景分子為不同的多肽。例如，當(dāng)確定分離的D4去飽和酶和D5延伸酶適體的特異性時(shí)，背景蛋白可為血清白蛋白。如何制備和使用適體來結(jié)合多種不同靶分子的代表性實(shí)例可見于以下美國專利的非限制性列表5,476，766,5,503，978,5,631，146,5,731，424,5,780，228,5,792，613,5,795，721、5，846，713,5，858，660,5，861，254,5，864，026,5，869，641,5，958，691,6，001，988,6，011，020,6,013，443,6,020，130,6,028，186,6,030，776和6，051，698。核酶是能夠催化分子內(nèi)或分子間化學(xué)反應(yīng)的核酸分子。因此核酶是催化性核酸。優(yōu)選地，核酶催化分子間反應(yīng)。有大量不同類型的核酶催化核酸酶或核酸聚合酶類型反應(yīng)，這是基于在天然體系中發(fā)現(xiàn)的核酶，諸如錘頭狀核酶(例如但不限于如下美國專利5，334，711,5,436，330,5,616，466,5,633，133,5,646，020,5,652，094,5,712，384、5，770，715,5，856，463,5，861，288,5，891，683,5，891，684,5，985，621,5，989，908,5，998，193、5，998，203、Ludwig禾口Sproat的WO9858058、Ludwig禾口Sproat的WO9858057、以及Ludwig和Sproat的WO9718312)、發(fā)夾核酶(例如但不限于如下美國專利5，631，115,5,646，031,5,683，902,5,712，384,5,856，188,5,866，701,5,869，339和6，022，962)、和四膜蟲核酶(例如但不限于如下美國專利5，595，873和5，652，107)。還有大量核酶未見于天然體系，但已被工程化以催化全新的特異性反應(yīng)(例如但不限于如下美國專禾Ij:5，580，967、5，688，670、5，807，718和5，910，408)。優(yōu)選的核酶裂解RNA或DNA底物，更優(yōu)選地裂解RNA底物。核酶通常經(jīng)由識(shí)別并結(jié)合靶底物，隨后裂解而裂解核酸底物。該識(shí)別通常主要基于規(guī)范或非-規(guī)范堿基對相互作用。這一特性使得核酶成為靶特異性裂解核酸的特別好的候選物，由于識(shí)別靶底物是基于靶底物序列。如何制備和使用核酶來催化多種不同反應(yīng)的代表性實(shí)例可見于以下美國專利的非限制性列表5，646，042、5，693，535,5，731，295,5，811，300,5，837，855,5，869，253,5，877，021,5，877，022,5，972，699,5,972，704,5,989，906和6，017，756。形成三螺旋的功能性核酸分子是可與雙鏈或單鏈核酸相互作用的分子。當(dāng)三螺旋分子與靶區(qū)域相互作用時(shí)，形成稱為三螺旋的結(jié)構(gòu)，其中DNA的三條鏈形成依賴于Watson-Crick和Hoogsteen堿基-配對的復(fù)合體。三螺旋分子是優(yōu)選的，由于其可以以高的親和性和特異性結(jié)合靶區(qū)域。優(yōu)選地，形成三螺旋的分子以小于ΙΟΛΟΛΟ,或10_12的kd結(jié)合靶分子。如何制備和使用形成三螺旋的分子來結(jié)合多種不同靶分子的代表性實(shí)例可見于以下美國專利的非限制性列表5，176，996,5,645，985,5,650，316,5,683，874、5，693，773,5,834，185,5,869，246,5,874，566和5，962，426。外部引導(dǎo)序列(EGS)是結(jié)合靶核酸分子并形成復(fù)合體的分子，該復(fù)合體被裂解靶分子的RNA酶P識(shí)別。EGS可設(shè)計(jì)為特異性靶向所選的RNA分子。RNA酶P幫助加工細(xì)胞中的轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)。通過使用致使靶RNA:EGS復(fù)合體模擬天然tRNA底物的EGS，可募集細(xì)菌RNA酶P以裂解基本上任何RNA序列(Yale的WO92/03566，F(xiàn)orster和Altman，Science238407-409(1990))o類似地，真核EGS/RNA酶P指引的RNA裂解可用于裂解真核細(xì)胞中期望的靶。(Yuan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:8006-8010(1992)；Yale的WO93/22434；Yale的WO95/24489；Yuan禾口Altaian,EMBOJ14:159-168(1995)，禾口Carrara等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)92=2627-2631(1995))。如何制備和使用EGS分子來促進(jìn)裂解多種不同靶分子的代表性實(shí)例可見于以下美國專利的非限制性列表5，168，053、5，624，824、5，683，873,5,728，521,5,869，248和5，877，162。4.核酸遞送在上述包括施用并攝取外源DNA到受試者的細(xì)胞的方法中(即，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染)，公開的核酸可為裸DNA或RNA的形式，或核酸可在用于向細(xì)胞遞送核酸的載體中，藉以使編碼抗體的DNA片段處在啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)下，如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的。載體可為可購買獲得的制品，諸如腺病毒載體(QuantumBiotechnologies,Inc.(Laval,Quebec，Canada)。可經(jīng)由多種機(jī)制遞送核酸或載體到細(xì)胞。作為一個(gè)實(shí)例，遞送可經(jīng)由脂質(zhì)體，使用可購買獲得的脂質(zhì)體制品諸如LIP0FECTIN、LIPOFECTAMINE(GIBC0-BRL,Inc.，Gaithersburg,MD)、SUPERFECT(Qiagen,Inc.Hilden,Germany)和TRANSFECTAM(PromegaBiotec,Inc.，Madison，WI)、以及根據(jù)本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)方案開發(fā)的其它脂質(zhì)體。此外，公開的核酸或載體可通過電穿孔體內(nèi)遞送，該技術(shù)可從Genetronics，Inc.(SanDiego,CA)獲得，以及依靠S0N0P0RATI0N機(jī)器(ImaRxPharmaceuticalCorp.，Tucson,AZ)。作為一個(gè)實(shí)例，載體遞送可經(jīng)由病毒體系，諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體體系，該體系可包裝重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組(參見，例如Pastan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.854486，1988；Miller等人，Mol.Cell.Biol.6=2895,1986)。隨后重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒可用于感染并從而將編碼廣泛地中和的抗體(或其活性片段)的核酸遞送到受感染的細(xì)胞。將改變的核酸引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的確切方法當(dāng)然不限于使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。對該方案其它技術(shù)是廣泛可獲得的，包括使用腺病毒載體(Mitani等人，Hum.GeneTher.5=941-948,1994)、腺相關(guān)病毒(AAV)載體(Goodman等人，Blood84:1492_1500，1994)、慢病毒載體(Naidini等人，Science272:263_267，1996)、假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(Agrawal等人，Exper.Hematol.24=738-747,1996)。還可使用物理轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，諸如脂質(zhì)體遞送和受體介導(dǎo)的遞送以及其它胞吞機(jī)制(參見，例如Schwartzenberger等人，Blood87=472-478,1996)。這些公開的組合物和方法可聯(lián)合任何這些或其它常用的基因轉(zhuǎn)移方法使用。作為一個(gè)實(shí)例，如果編碼抗體的核酸在腺病毒載體中遞送到受試者的細(xì)胞，施用腺病毒于人類的劑量可從每次注射約107變化到109個(gè)空斑形成單位(pfu)，但也可高達(dá)每次注射1012pfu(Crystal,Hum.GeneTher.8:985_1001，1997；Alvarez禾口Curiel，Hum.GeneTher.8:597-613，1997)。受試者可接受單次注射，或如果需要另外的注射，可以六個(gè)月的間隔重復(fù)(或其它合適的時(shí)間間隔，如熟練的操作者確定的)無限的時(shí)間段和/或直到確立治療的效力。如果使用，腸胃外施用核酸或載體通常以注射為特征。注射液可制備為常規(guī)形式，作為液態(tài)溶液或懸浮液、適于在注射前溶解或懸浮于液體的固體形式或作為乳劑。對于腸胃外施用，最近修正的方法包括使用慢釋放或緩釋體系以使保持恒定劑量。治療化合物的適合的制劑和各種施用途徑的另外討論參見，例如Remington:TheScience14andPracticeofPharmacy(雷氏藥學(xué)理論和實(shí)踐)(第I9版)A.R.Gennaro編輯，MackPub1ishingCompany,Easton,PA1995。5.表達(dá)體系遞送到細(xì)胞的核酸通常包含表達(dá)控制體系。例如，病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒體系中插入的基因通常包含啟動(dòng)子、和/或增強(qiáng)子來幫助控制期望基因產(chǎn)物的表達(dá)。啟動(dòng)子通常是當(dāng)相對于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)處于相對固定的位置時(shí)起作用的一個(gè)或多個(gè)DNA序列。啟動(dòng)子包含RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄因子的基本相互作用所需的核心元件，并可能包含上游元件和響應(yīng)元件。a)病毒啟動(dòng)子和增強(qiáng)子在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中控制從載體轉(zhuǎn)錄的優(yōu)選啟動(dòng)子可從多種來源獲得，例如病毒基因組，諸如多瘤病毒、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙肝病毒和最優(yōu)選地巨細(xì)胞病毒，或來自異源哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子，如0肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。SV40病毒的早期和晚期啟動(dòng)子方便地獲得為SV40限制性片段，其還包含SV40病毒的復(fù)制起點(diǎn)(Fiers等人，Nature,273113(1978))0人類巨細(xì)胞病毒的最早期啟動(dòng)子方便地獲得為HindlllE限制性片段(GreenWay，P.J.等人，Gene18:355-360(1982))。當(dāng)然，來自宿主細(xì)胞或相關(guān)物種的啟動(dòng)子也可用在本文。增強(qiáng)子通常是指在離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)不固定的距離起作用的DNA序列，并可在轉(zhuǎn)錄單元的5，(Laimins,L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.78993(1981))或3，(Lusky,M.L.，等人，Mol.CellBio.3=1108(1983))0而且，增強(qiáng)子可位于內(nèi)含子中(Banerji,J.L.等人，Cell33729(1983))以及位于編碼序列本身中(Osborne，T.F.，等人，Mol.CellBio.41293(1984))。它們通常長度是10至300bp，并順式作用。增強(qiáng)子作用以增加從附近啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子通常還包含介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的響應(yīng)元件。啟動(dòng)子也可包含介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的響應(yīng)元件。增強(qiáng)子通常決定基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。盡管現(xiàn)在已知有來自哺乳動(dòng)物基因(珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、a-胎蛋白和胰島素)的許多增強(qiáng)子序列，人們通常使用來自真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子用于總的表達(dá)。優(yōu)選的實(shí)例是復(fù)制起點(diǎn)后側(cè)的SV40增強(qiáng)子(bp100-270)、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、復(fù)制起點(diǎn)后側(cè)的多瘤病毒增強(qiáng)子和腺病毒增強(qiáng)子。啟動(dòng)子(promotor)和/或增強(qiáng)子可被光或觸發(fā)其功能的特定化學(xué)事件特異性地活化。體系可被試劑諸如四環(huán)素和地塞米松調(diào)節(jié)。還有通過接觸輻射諸如Y輻射或烷化化療藥物來增強(qiáng)病毒載體基因表達(dá)的方法。在某些實(shí)施方案，啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子區(qū)域可作為組成型啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子以使待轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄單元的區(qū)域表達(dá)最大化。在某些構(gòu)建體中，啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子區(qū)域在所有真核細(xì)胞類型中是活性的，即使在特定時(shí)間它僅在特定細(xì)胞類型表達(dá)。這一類型的優(yōu)選啟動(dòng)子是CMV啟動(dòng)子(650堿基)。其它優(yōu)選的啟動(dòng)子是SV40啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒(全長啟動(dòng)子)、和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LTR。已經(jīng)顯示，可克隆所有特異性調(diào)節(jié)元件并用于構(gòu)建在特定細(xì)胞類型諸如黑素瘤細(xì)胞中選擇性地表達(dá)的表達(dá)載體。膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(glialfibrillaryaceticprotein)(GFAP)啟動(dòng)子已經(jīng)用于在膠質(zhì)來源的細(xì)胞中選擇性地表達(dá)基因。用于真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動(dòng)物、人類或有核的細(xì)胞)的表達(dá)載體還可包含終止轉(zhuǎn)錄需要的序列，其可影響mRNA表達(dá)。這些區(qū)域轉(zhuǎn)錄為編碼組織因子蛋白的mRNA的非翻譯部分中的多腺苷酸化的區(qū)段。3’非翻譯區(qū)域還包括轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)錄單元還包含多腺苷酸化區(qū)域。該區(qū)域的一個(gè)益處是，其增加轉(zhuǎn)錄的單元將像mRNA一樣被加工和運(yùn)輸?shù)目赡苄?。已?jīng)確立表達(dá)構(gòu)建體中多腺苷酸化信號(hào)的鑒定和使用。優(yōu)選地，同源多腺苷酸化信號(hào)用于轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體。在某些轉(zhuǎn)錄單元，多腺苷酸化區(qū)域起源于SV40早期多腺苷酸化信號(hào)并由約400個(gè)堿基組成。轉(zhuǎn)錄的單元包含單獨(dú)的或聯(lián)合上述序列的其它標(biāo)準(zhǔn)序列以改進(jìn)從構(gòu)建體的表達(dá)或構(gòu)建體的穩(wěn)定性也是優(yōu)選的。b)標(biāo)記病毒載體可包括編碼標(biāo)記產(chǎn)物的核酸序列。該標(biāo)記產(chǎn)物用于確定基因是否已經(jīng)被遞送到細(xì)胞，且遞送之后是否被表達(dá)。優(yōu)選的標(biāo)記基因是大腸桿菌的lacZ基因，其編碼3-半乳糖苷酶，和綠色熒光蛋白。在一些實(shí)施方案，該標(biāo)記可以是選擇性標(biāo)記。對哺乳動(dòng)物細(xì)胞合適的選擇性標(biāo)記的實(shí)例是二氫葉酸還原酶(DHFR)、胸苷激酶、新霉素、新霉素類似物G418、潮霉素(hydromycin)和嘌呤霉素。當(dāng)這種選擇性標(biāo)記被成功地轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞時(shí)，轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞在被置于選擇壓下時(shí)可存活。有兩種廣泛使用的不同類的選擇方案。第一類是基于細(xì)胞的代謝和使用突變細(xì)胞系，該突變細(xì)胞系缺乏獨(dú)立于補(bǔ)充的培養(yǎng)基生長的能力。兩個(gè)實(shí)例是CHODHFR-細(xì)胞和小鼠LTK-細(xì)胞。這些細(xì)胞缺乏在不加入營養(yǎng)物諸如胸苷或次黃嘌呤時(shí)生長的能力。由于這些細(xì)胞缺乏完整核苷酸合成途徑必需的某些基因，除非缺少的核苷酸提供在補(bǔ)充的培養(yǎng)基，否則其不能存活。補(bǔ)充培養(yǎng)基的替代方案是向缺乏DHFR或TK基因的細(xì)胞引入完整的相應(yīng)的基因，從而改變其生長需求。未轉(zhuǎn)化DHFR或TK基因的單獨(dú)細(xì)胞在非補(bǔ)充的培養(yǎng)基將不能存活。第二類是顯性選擇，這是指用于任何細(xì)胞類型，不要求使用突變細(xì)胞系的選擇方案。這些方案通常使用藥物來阻礙宿主細(xì)胞生長。具有新基因的細(xì)胞將表達(dá)傳遞藥物抗性的蛋白并在選擇中存活。這種顯性選擇的實(shí)例使用藥物新霉素(SouthernP.和Berg，P.，I^Molec.Appl.Genet.1:327(1982))、霉酚酸(Mulligan，R.C.和Berg，P.Science2091422(1980))或潮霉素(Sugden,B.等人，Mol.Cell.Biol.5:410_413(1985))。這三種實(shí)例采用處于真核控制下的細(xì)菌基因以分別傳遞對適當(dāng)藥物G418或新霉素(遺傳霉素)、xgpt(霉酚酸)或潮霉素的抗性。其它藥物包括新霉素類似物G418和嘌呤霉素(puramycin)。6.肽a)蛋白變體如本文討論的，分離的D4去飽和酶和D5延伸酶蛋白的許多變體是已知和本文預(yù)期的。此外，對于已知的功能性的分離的D4去飽和酶和D5延伸酶菌株變體，有也在公開的方法和組合物中起作用的分離的D4去飽和酶和D5延伸酶蛋白的衍生物。蛋白變體和衍生物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并可包括氨基酸序列修飾。例如，氨基酸序列修飾通常屬于三類中的一類或多類取代、插入或缺失變體。插入包括氨基和/或羧基末端融合以及序列內(nèi)插入單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。插入通常是比氨基或羧基末端融合小的插入，例如，以一個(gè)到四個(gè)殘基的級(jí)別。免疫原性融合蛋白衍生物，諸如實(shí)施例中描述的免疫原性融合蛋白衍生物，是通過經(jīng)由體外交聯(lián)來融合足夠大以對靶序列賦予免疫原性的多肽而制備，或通過以編碼融合蛋白的DNA轉(zhuǎn)化的重組細(xì)胞培養(yǎng)物而制備。缺失的特征是從蛋白序列除去一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。通常，不超過約2至6個(gè)殘基在蛋白分子中任何一個(gè)位點(diǎn)缺失。這些變體通常是在編碼蛋白的DNA中位點(diǎn)特異性誘變核苷酸，從而產(chǎn)生編碼變體的DNA，之后在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)DNA而制備。在具有已知序列的DNA中的預(yù)定位點(diǎn)制造取代突變的技術(shù)是公知的，例如M13引物誘變和PCR誘變。氨基酸取代通常是單個(gè)殘基的取代，但也可一次發(fā)生在大量不同位置；插入通常將以約從1到10個(gè)氨基酸殘基的級(jí)別；缺失將從約1到30個(gè)殘基。缺失或插入優(yōu)選地在相鄰的對進(jìn)行，即缺失2個(gè)殘基或插入2個(gè)殘基。取代、缺失、插入或其任何組合可能聯(lián)合以獲得最終的構(gòu)建體。突變必須不將序列放置在閱讀框外且優(yōu)選地不產(chǎn)生可能產(chǎn)生二級(jí)mRNA結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)域。取代變體是其中至少一個(gè)殘基已被除去且不同的殘基插入此位的變體。這種取代通常根據(jù)下表2和3進(jìn)行，并稱為保守性取代。功能或免疫同一性的顯著改變是通過選擇比表3中的取代保守性更小的取代而進(jìn)行的，即，選擇在保持以下方面的效力更顯著不同的殘基(a)取代區(qū)域多肽骨架的結(jié)構(gòu)，例如作為折疊或螺旋構(gòu)象，(b)分子在靶位點(diǎn)的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的堆積(bulk)。預(yù)計(jì)大體上產(chǎn)生蛋白特性最大變化的取代將是如下取代(a)親水殘基如絲氨?；蛱K氨酰取代(或被取代為)疏水殘基如亮氨酰、異亮氨酰、苯丙氨酰、纈氨?；虮滨?(b)半胱氨酸或脯氨酸取代(或被取代為)任何其它殘基；(c)具有帶正電的側(cè)鏈的殘基如賴氨酰、精氨酰、或組氨酰取代(或被取代為)帶負(fù)電的殘基如谷氨?；蛱於滨?；或(d)具有堆積側(cè)鏈的殘基如苯丙氨酸在此情形取代(或被取代為)不具有側(cè)鏈的殘基如甘氨酸；(e)通過增加硫酸化和/或糖基化位點(diǎn)的數(shù)目。氨基酸縮寫<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用一個(gè)氨基酸殘基代替生物和/或化學(xué)上類似的另一氨基酸殘基是保守性取代。例如，保守性取代將是用一個(gè)疏水殘基代替另一疏水殘基，或一個(gè)極性殘基代替另一極性殘基。取代包括組合諸如，例如Gly，Ala；Val,Ile,Leu；Asp,Glu；Asn,Gln；Ser,Thr；Lys，Arg和Phe，Tyr。每種明確地公開的序列的這種保守性地代替的變化包括在本文提供的嵌合多肽中?？刹捎萌〈T變或缺失誘變以插入用于N-糖基化(Asn-X-Thr/Ser)或0_糖基化(Ser或Thr)的位點(diǎn)。缺失半胱氨酸或其它不穩(wěn)定殘基也是期望的。缺失或取代可能的蛋白水解位點(diǎn)如Arg，通過例如缺失堿性殘基之一或用谷氨酰胺?；蚪M氨酰殘基取代來實(shí)現(xiàn)。氨基酸面兩原始?xì)埢纠员Ｊ厝〈?，其它取代是本領(lǐng)域已知的。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>某些翻譯后衍生化是重組宿主細(xì)胞對表達(dá)的多肽作用的結(jié)果。谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰殘基通常翻譯后脫酰胺為相應(yīng)的谷氨酰和天冬氨酰(asparyl)殘基。作為選擇，這些殘基在弱酸性條件下脫酰胺。其它翻譯后修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化，絲氨?；蛱K氨酰殘基的羥基的磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈的ο-氨基的甲基化(Τ.E.Creighton,ProteinsStructureandMolecularProperties(蛋白結(jié)構(gòu)和分子特性)，W.H.Freeman&Co.，SanFrancisco第79-86頁[1983])，N-末端胺的乙?；?，和在一些情形C-末端羧基的酰胺化。應(yīng)理解的是，界定本文公開的蛋白的變體和衍生物的一種方式是經(jīng)由在對特定已知序列的同源性/同一性方面界定變體和衍生物。例如，SEQIDNO15列出D5延伸酶的特定序列，SEQIDNO:26列出D4去飽和酶蛋白的特定序列。具體公開的是與所指的序列具有至少70%或75%或80%或85%或90%或95%同源性的本文公開的這些蛋白和其它蛋白的變體。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解如何確定兩種蛋白的同源性。例如，可經(jīng)過比對兩條序列以使同源性處在最高水平之后，計(jì)算同源性。具體公開的序列具有與SEQIDN0:15和26的大于96%的同一性和89%的同一性。計(jì)算同源性的另一方式可通過公開的算法進(jìn)行。用于比較的序列的最佳比對可通過Smith和WatermanAdv.App1.Math.2=482(1981)的局部同源性算法進(jìn)行，通過Needleman和Wunsch，J.MoLBiol.48443(1970)的同源性比對算法進(jìn)行，通過Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.85=2444(1988)的搜尋相似性方法進(jìn)行，通過這些算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)現(xiàn)(Wisconsin遺傳學(xué)軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WI)進(jìn)行，或通過目測進(jìn)行。對核酸可獲得相同類型的同源性，通過例如公開在Zuker，Μ.Science244=48-52,1989，Jaeger等人.Proc.Natl.Acad.SciUSA86:7706_7710，1989，Jaeger等人.MethodsEnzymo1.183=281-306,1989的算法，這些參考文獻(xiàn)通過參考至少涉及核酸比對的材料并入本文。應(yīng)理解的是，保守性突變和同源性的描述可以任何組合聯(lián)合在一起，諸如與特定序列具有至少70%同源性的實(shí)施方案，其中變體是保守性突變。雖然說明書討論了各種蛋白和蛋白序列，應(yīng)理解的是，還公開了可編碼這些蛋白序列的核酸。這將包括關(guān)于特定蛋白序列的所有簡并序列，即具有編碼一種特定蛋白序列的序列的所有核酸以及編碼蛋白序列的公開的變體和衍生物的所有核酸，包括簡并核酸。因此，雖然本文未寫出每種具體的核酸序列，應(yīng)理解的是，經(jīng)由公開的蛋白序列本文事實(shí)上公開和描述了每一種和每一序列。例如，可編碼列在SEQIDNO:15的蛋白序列的許多核酸序列之一列在SEQIDN0:14。還應(yīng)理解，盡管沒有氨基酸序列表示哪種具體的DNA序列在有機(jī)體中編碼該蛋白，但是當(dāng)本文公開了公開的蛋白的特定變體時(shí)，在產(chǎn)生該蛋白的特定菌株中編碼該蛋白的已知核酸序列也是已知的，并在本文公開和描述。應(yīng)理解的是，有許多氨基酸和肽類似物可摻入公開的組合物。例如，有許多D氨基酸或具有不同于表2和表3中顯示的氨基酸的功能性取代基的氨基酸。公開了天然產(chǎn)生肽的相對立體異構(gòu)體、以及肽類似物的立體異構(gòu)體。這些氨基酸可容易地?fù)饺攵嚯逆湥ㄟ^使tRNA分子負(fù)荷上所選氨基酸和加工利用例如琥珀密碼子的遺傳構(gòu)建體以將類似物氨基酸以位點(diǎn)特異性方式插入肽鏈(Thorson等人，MethodsinMolec.Biol.7743-73(1991),Zoller,CurrentOpinioninBiotechnology,3348-354(1992)；Ibba,Biotechnology&GeneticEngineeringReviews13:197_216(1995),Cahill等人，TIBS,14(10)400-403(1989)；Benner,TIBTech,12158-163(1994)；Ibba和Hennecke,Bio/technology,12:678_682(1994)，所有文獻(xiàn)都通過參考至少涉及氨基酸類似物的材料并入本文)?？僧a(chǎn)生類似肽的分子，但其不經(jīng)由天然肽鍵連接。例如，氨基酸或氨基酸類似物的鍵可包括CH2NH—、-CH2S-,-CH2-CH2-,-CH=CH-(順式和反式)、--COCH2--、一CH(OH)CH2-和一CHH2SO-(這些和其它可見于Spatola，A.F.ChemistryandBiochemistryofAminoAcids,Peptides,andProteins(氨基酸、肽禾口蛋白的化學(xué)和生物化學(xué))，B.Weinstein編輯，MarcelDekker,NewYork,第267頁(1983)；Spatola,A.F.,VegaData(1983年3月)，第1卷，第3期，P印tideBackboneModifications(肽骨架修飾)(總的綜述)；Morley,TrendsPharmSci(1980)第463_468頁；Hudson，D.等人，IntJPeptProtRes14177-185(1979)(-CH2NH-,CH2CH2-)；Spatola等人·LifeSci381243-1249(1986)(--CHH2-S)；HamJ.Chem.SocPerkinTrans.I307-314(1982)(―CH-CH-,順式和反式)；Almquist等人.J.Med.Chem.231392-1398(1980)(-COCH2-)Jennings-White等人.TetrahedronLett23:2533(1982)(--COCH2--)；Szelke等人.EuropeanAppln，EP45665CA(1982)9739405(1982)(-CH(OH)CH2-)；HolIaday等人.Tetrahedron.Lett244401-4404(1983)(—C(OH)CH2-)；以及HrubyLifeSci31=189-199(1982)(-CH2-S-)；每篇文獻(xiàn)都通過參考并入本文。特別優(yōu)選的非肽鍵是一CH2NH--。應(yīng)理解的是，肽類似物在成鍵原子之間可具有多于一個(gè)原子，諸如b-丙氨酸、g-氨基丁酸和類似物。氨基酸類似物和類似物以及肽類似物通常具有增強(qiáng)的或期望的特性，諸如，生產(chǎn)更經(jīng)濟(jì)、更大的化學(xué)穩(wěn)定性、增強(qiáng)的藥理學(xué)特性(半衰期、吸收、效能、效力等等)、改變的特異性(如，廣譜的生物活性)、減少的抗原性、及其它。D-氨基酸可用于產(chǎn)生更穩(wěn)定的肽，因?yàn)镈氨基酸不被肽酶等等識(shí)別。以相同類型的D-氨基酸系統(tǒng)取代共有序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(如，D-賴氨酸代替L-賴氨酸)可用于產(chǎn)生更穩(wěn)定的肽。半胱氨酸殘基可用于環(huán)化或?qū)蓷l或多條肽連接到一起。這可有利于將肽限制于特定構(gòu)象。(Rizo和GieraschAnn.Rev.Biochem.61:387(1992)，通過參考并入本文)。7.抗體(1)抗體總述術(shù)語“抗體”在本文以廣泛含義使用，包括多克隆和單克隆抗體兩者。除了完整免疫球蛋白分子，術(shù)語“抗體”還包括這些免疫球蛋白分子的片段或聚合物、和免疫球蛋白分子或其片段的人類或人源化形式，只要根據(jù)它們與分離的D4去飽和酶和D5延伸酶相互作用的能力選擇以使它們可被鑒定、結(jié)合、純化或具有改變的活性。還公開了結(jié)合D4去飽和酶和D5延伸酶的公開的區(qū)域的抗體?？墒褂帽疚拿枋龅捏w外檢測或通過類似方法測試抗體的期望活性，此后根據(jù)已知的臨床測試方法測試其體內(nèi)治療和/或預(yù)防活性。如本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”是指從大致均一的抗體群體獲得的抗體，S卩，該群體中的單獨(dú)抗體相同，除了抗體分子小亞組中可能存在的可能的天然產(chǎn)生的突變。本文的單克隆抗體具體地包括“嵌合”抗體，其中重和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而該鏈的其余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及嵌合抗體的片段，只要其表現(xiàn)期望的拮抗活性(參見，美國專利4，816，567和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851_6855(1984))。公開的單克隆抗體可使用產(chǎn)生單克隆抗體的任何方案制備。例如，公開的單克隆抗體可使用雜交瘤方法制備，諸如描述在Kohler和Milstein，Nature，256=495(1975)的雜交瘤方法。雜交瘤方法中，通常以免疫劑免疫小鼠或其它合適的宿主動(dòng)物以引發(fā)產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生將特異性結(jié)合免疫劑的抗體的淋巴細(xì)胞。作為選擇，也可體外免疫淋巴細(xì)胞，如，使用本文描述的HIVEnv-⑶4-共受體復(fù)合體。單克隆抗體還可通過重組DNA方法制備，諸如描述在美國專利4，816，567(Cabilly等人)的方法。使用常規(guī)方案(如，通過使用能夠特異性地結(jié)合編碼鼠抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)，編碼公開的單克隆抗體的DNA可容易地分離并測序。還可使用噬菌體展示技術(shù)產(chǎn)生和篩選抗體或活性抗體片段的文庫，如，在授予Burton等人的美國專利5，804，440和授予Barbas等人的美國專利6，096，441中描述的技術(shù)。體外方法也適于制備單價(jià)抗體。消化抗體來產(chǎn)生其片段尤其是Fab片段，這可使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)實(shí)現(xiàn)。例如，消化可使用木瓜蛋白酶進(jìn)行。木瓜蛋白酶消化的實(shí)例描述在1994年11月22日公開的W094/29348和美國專利4，342，566。木瓜蛋白酶消化抗體通常產(chǎn)生稱為Fab片段的兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，其各帶有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，以及殘余的Fc片段。胃蛋白酶處理產(chǎn)生具有兩個(gè)抗原組合位點(diǎn)并仍能夠交聯(lián)抗原的片段。無論是否與其它序列連接，片段還可包括特定區(qū)域或具體氨基酸殘基的插入、缺失、取代或其它選擇的修飾，只要與未修飾的抗體或抗體片段相比抗體或抗體片段的活性未顯著改變或損害。這些修飾可提供一些另外的特性，諸如除去/增加能夠形成二硫鍵的氨基酸、增加其生物壽命、改變其分泌特征等等。在任何情況下，該抗體或抗體片段必須具備生物活性特性，諸如對其同類抗原特異性結(jié)合?？贵w或抗體片段的功能性或活性區(qū)域可通過誘變蛋白特定區(qū)域，隨后表達(dá)并測試表達(dá)的多肽來鑒定。這種方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的，并可包括位點(diǎn)特異性誘變編碼抗體或抗體片段的核酸。(Zoller，MJ.Curr.Opin.Biotechnol.3:348_354，1992)。如本文所用的，術(shù)語“抗體”還可指人類抗體和/或人源化抗體。許多非人類抗體(如，衍生自小鼠、大鼠或兔的抗體)在人類是天然抗原性的，因此當(dāng)施用于人類時(shí)可產(chǎn)生不期望的免疫響應(yīng)。因此，在方法中使用人類或人源化抗體用于減小施用于人類的抗體將引起不期望的免疫響應(yīng)的可能性。(2)人類抗體公開的人類抗體可使用任何技術(shù)制備。產(chǎn)生人類單克隆抗體的技術(shù)的實(shí)例包括Cole等人(MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy(單克隆抗體和癌癥治療)，AlanR.Liss，第77頁，1985)和Boerner等人.(JImmunol,147(1):86_95，1991)描述的技術(shù)。人類抗體(和其片段)還可使用噬菌體展示文庫產(chǎn)生(Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.，227381，1991；Marks等人，J.Mol.Biol.，222:581，1991)。公開的人類抗體還可從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物獲得。例如，已經(jīng)描述了能夠響應(yīng)于免疫產(chǎn)生人類抗體的全部清單(repertoire)的轉(zhuǎn)基因、突變小鼠(參見，例如Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9O:2551_255(1"3)Jakobovits等人，Nature，362255-258(1993)；Bruggermann等人，Yearinlmmunol，7:33(1993))。具體地，這些嵌合和種系突變小鼠抗體重鏈接合區(qū)(J(H))基因的純合缺失導(dǎo)致完全抑制內(nèi)源抗體產(chǎn)生，成功地轉(zhuǎn)移人類種系抗體基因陣列到這種種系突變小鼠導(dǎo)致在抗原攻擊時(shí)產(chǎn)生人類抗體。使用Env-CD4-共受體復(fù)合體選擇具有期望活性的抗體，如本文描述的。(3)人源化抗體抗體人源化技術(shù)通常包括使用重組DNA技術(shù)來操縱編碼抗體分子的一個(gè)或多個(gè)多肽鏈的DNA序列。因此，非人類抗體(或其片段)的人源化形式是嵌合抗體或抗體鏈(或其片段，諸如Fv、Fab、Fab’或抗體的其它抗原結(jié)合部分)，其包含整合到人類(受者)抗體的構(gòu)架中的來自非人類(供者)抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的一部分。為了產(chǎn)生人源化抗體，來自受者(人類)抗體分子一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基被來自供者(非人類)抗體分子一個(gè)或多個(gè)CDR的殘基代替，已知供者(非人類)抗體分子具有期望的抗原結(jié)合性(如，對靶抗原某水平的特異性和親和性)。在一些情況，人類抗體的Fv構(gòu)架(FR)殘基被相應(yīng)的非人類殘基代替。人源化抗體還可包含既不在受者抗體中也不在輸入的CDR或構(gòu)架序列中的殘基。通常，人源化抗體具有從非人類來源引入的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。實(shí)際上，人源化抗體通常是其中一些⑶R殘基和可能一些FR殘基被來自嚙齒動(dòng)物抗體中類似位點(diǎn)的殘基代替的人類抗體。人源化抗體通常包含抗體恒定區(qū)(Fe)的至少一部分，其通常是人類抗體的(Jones等人，Nature，321:522-525(1986)，Reichmann等人，Nature，332:323_327(1988)，禾口Presta，Curr.Opin.Struct.Biol.，2593-596(1992))。用于人源化非人類抗體的方法是本領(lǐng)域公知的。例如，人源化抗體可根據(jù)Winter和合作者的方法產(chǎn)生(Jones等人，Nature,321:522_525(1986)，Riechmann等人，Nature,332:323_327(1988)，Verhoeyen等人，Science,2391534-1536(1988))，該方法是通過用嚙齒動(dòng)物CDR或CDR序列取代人類抗體的相應(yīng)序列。可用于產(chǎn)生人源化抗體的方法還描述在美國專利4，816，567(Cabilly等人)、美國專利5，565，332(Hoogenboom等人)、美國專利5，721，367(Kay等人)、美國專利5，837，243(Deo等人)、美國專利5，939，598(Kucherlapati等人)、美國專利6，130，364(Jakobovits等人)和美國專利6，180,377(Morgan等人)。(4)抗體的施用抗體的施用可如本文公開的進(jìn)行。還存在用于抗體遞送的核酸方法。抗體和抗體片段還可作為編碼抗體或抗體片段的核酸制品(如，DNA或RNA)施用于患者或受試者或細(xì)胞，以使患者或受試者自身的細(xì)胞獲取核酸并產(chǎn)生和分泌編碼的抗體或抗體片段。核酸的遞送可通過任何手段，例如如本文公開的手段。8.藥物運(yùn)載體/藥物產(chǎn)品的遞送如上述的，組合物還可在藥學(xué)可接受的運(yùn)載體中體內(nèi)施用。“藥學(xué)可接受的”是指不是生物學(xué)上或以其它方式不期望的材料，即，該材料可與核酸或載體一起施用于受試者，而不導(dǎo)致任何不期望的生物效應(yīng)或與包含其的藥物組合物的任何其它組分以有害的方式相互作用。運(yùn)載體將天然地被選擇以使活性成分的任何降解最少并使受試者中的任何不良副作用最少，如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。組合物還可經(jīng)口、腸胃外(如，靜脈內(nèi))、通過肌內(nèi)注射、通過腹膜內(nèi)注射、經(jīng)皮、身體外、局部或類似方式施用，包括局部鼻內(nèi)施用或通過吸入器施用。如本文所用的，“局部鼻內(nèi)施用”是指經(jīng)由鼻孔之一或兩者將組合物遞送到鼻和鼻道，并可包括通過噴霧機(jī)器或液滴機(jī)器遞送，或經(jīng)由核酸或載體煙霧化遞送。通過吸入器施用組合物可通過噴霧機(jī)器或液滴機(jī)器經(jīng)過鼻或口遞送。還可通過插管直接遞送到呼吸系統(tǒng)的任何部位(如，肺)。需要的組合物的確切量將在受試者之間變化，取決于受試者的物種、體重和大致情況、被治療的過敏性紊亂的嚴(yán)重度、使用的具體核酸或載體、施用方式等等。因此，不可能對每種組合物指定確切的量。然而，由本文獲得的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員僅使用常規(guī)試驗(yàn)就可確定合適的量。如果使用腸胃外施用組合物，通常以注射為特征。注射液可制備為常規(guī)形式，作為液態(tài)溶液或懸浮液、適于在注射前溶解或懸浮于液體的固體形式或作為乳劑。對于腸胃外施用，最近修正的方法包括使用慢釋放或緩釋體系以使保持恒定劑量。參見，例如美國專利3，610,795，其通過參考并入本文。材料可以在溶液、懸浮液中(例如，摻入微粒、脂質(zhì)體、或細(xì)胞)。這些可能經(jīng)由抗體、受體或受體配體靶向特定細(xì)胞類型。以下參考文獻(xiàn)是使用該技術(shù)以將特異性蛋白靶向腫瘤組織的實(shí)例(Senter等人，BioconjugateChem.，2447-451,(1991)；Bagshawe,K.D.，Br.J.Cancer,60275-281,(1989)；Bagshawe,等人，Br.J.Cancer,58700-703,(1988)；Senter,等人’BioconjugateChem.,43~9,(1993)；Battelli等人’CancerImmunol.Immunother.,35:421_425,(1992)；Pietersz和McKenzie,Immunolog.Reviews,12957-80，(1992)；和Roffler等人，Biochem.Pharmacol，42:2062-2065，(1991))。載運(yùn)體(vehicle)諸如“stealth”和其它共軛到抗體的脂質(zhì)體(包括脂質(zhì)介導(dǎo)的藥物至結(jié)腸癌的靶向)、經(jīng)由細(xì)胞特異性配體的受體介導(dǎo)的DNA的靶向、淋巴細(xì)胞指引的腫瘤靶向、和鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體內(nèi)高特異性的治療性逆轉(zhuǎn)錄病毒靶向。以下參考文獻(xiàn)是使用這種技術(shù)將特異性蛋白靶向腫瘤組織的實(shí)例(Hughes等人，CancerResearch,49=6214-6220,(1989)；和Litzinger和Huang,BiochimicaetBiophysicaActa,1104:179_187，(1992))。大體上，受體牽涉在組成型或配體誘導(dǎo)的胞吞作用途徑中。這些受體聚集在網(wǎng)格蛋白包被的凹陷中，經(jīng)由網(wǎng)格蛋白包被的囊泡進(jìn)入細(xì)胞，經(jīng)過在其中分選受體的酸化的內(nèi)涵體，隨后再循環(huán)到細(xì)胞表面、變成細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存或在溶酶體中降解。內(nèi)在化途徑用于多種功能，諸如營養(yǎng)攝取、除去活化的蛋白、清除大分子、病毒和毒素的條件性進(jìn)入、解離和降解配體、以及受體水平的調(diào)節(jié)。許多受體參與多于一種細(xì)胞內(nèi)途徑，取決于細(xì)胞類型、受體濃度、配體類型、配體價(jià)位和配體濃度。已經(jīng)綜述了受體介導(dǎo)的胞吞作用的分子和細(xì)胞機(jī)制(Brown和Greene，DNAandCellBiology10:6，399-409(1991))。a)藥學(xué)可接受的運(yùn)載體包括抗體的組合物可用于治療性地與藥學(xué)可接受的運(yùn)載體組合。合適的運(yùn)載體和其制劑描述在Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(雷氏藥學(xué)理論和實(shí)踐)(第19版)A.R.Gennaro編輯，MackPublishingCompany,Easton,PA1995。通常，合適的量的藥學(xué)上可接受的鹽用于制劑中以使得制劑等滲。藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體的實(shí)例包括但不限于，鹽水、林格氏溶液和右旋糖溶液。溶液的PH優(yōu)選地從約5到約8，更優(yōu)選地從約7到約7.5。進(jìn)一步的運(yùn)載體包括緩釋制品，諸如包含抗體的固態(tài)疏水聚合物的半透基質(zhì)，該基質(zhì)以有形物品的形式，如，膜、脂質(zhì)體或微粒。對本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，取決于例如施用途徑和被施用的組合物濃度，某些運(yùn)載體可能是更優(yōu)選的。藥物運(yùn)載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這些最通常地將是用于施用藥物于人類的標(biāo)準(zhǔn)運(yùn)載體，包括溶液諸如無菌水、鹽水和生理PH的緩沖溶液。組合物可肌內(nèi)或皮下施用。其它化合物將根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員使用的標(biāo)準(zhǔn)方案施用。除了所選分子以外，藥物組合物可包括運(yùn)載體、增稠劑、稀釋劑、緩沖劑、防腐劑、表面活性劑和類似物。藥物組合物還可包括一種或多種活性成分，諸如抗微生物劑、抗炎劑、麻醉劑和類似活性成分。取決于是否期望局部或全身治療和待治療的部位，藥物組合物可以許多方式施用。施用可為局部(包括眼部、陰道、直腸、鼻內(nèi))、經(jīng)口、通過吸入、或腸胃外，例如通過靜脈內(nèi)滴注、皮下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)注射。公開的抗體可靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腔內(nèi)或經(jīng)皮施用。用于腸胃外施用的制品包括無菌水溶液或非水溶液、懸浮液和乳劑。非水性溶劑的實(shí)例是丙二醇、聚乙二醇、植物油諸如橄欖油、和注射用有機(jī)酯諸如油酸乙酯。水性運(yùn)載體包括水、醇/水溶液、乳劑或懸浮液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。腸胃外載運(yùn)體包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、乳酸化林格氏、或不揮發(fā)油。靜脈內(nèi)載運(yùn)體包括流體和營養(yǎng)補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑(諸如基于林格氏右旋糖的補(bǔ)充劑)、和類似載運(yùn)體。也可存在防腐劑和其它添加劑，諸如例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體和類似添加劑。用于局部施用的制劑可包括軟膏、洗劑、乳膏、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧、液體劑和粉末劑。水性、粉末或油性基質(zhì)的常規(guī)藥物運(yùn)載體、增稠劑和類似物可為需要的或期望的。用于經(jīng)口施用的組合物包括粉末或顆粒、水或非水介質(zhì)中的懸浮液或溶液、膠囊、囊劑或片劑。增稠劑、調(diào)味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑可為期望的。一些組合物可能地作為藥學(xué)可接受的酸或堿加成鹽施用，所述鹽通過與無機(jī)酸諸如鹽酸、氫溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸、和磷酸、和有機(jī)酸諸如甲酸、乙酸、丙酸、羥基乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸和反丁烯二酸反應(yīng)而形成，或通過與無機(jī)堿諸如氫氧化鈉、氫氧化銨、氫氧化鉀、和有機(jī)堿諸如單烷基胺、二烷基胺、三烷基胺和芳基胺以及取代的乙醇胺反應(yīng)而形成。b)治療應(yīng)用用于施用組合物的有效劑量和時(shí)間表可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定，進(jìn)行這種決定在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)。用于施用組合物的劑量范圍是足夠大以產(chǎn)生其中疾患的癥狀受影響的期望的效應(yīng)的那些范圍。劑量不應(yīng)太大而導(dǎo)致不良副作用，諸如不希望的交叉反應(yīng)、過敏反應(yīng)和類似的不良副作用。通常，劑量將隨著患者的年齡、條件、性別和疾病程度、施用途徑、或其它藥物是否包含在治療方案中而變化，并可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。在任何禁忌癥的事件時(shí)，劑量可由具體的醫(yī)師調(diào)整。劑量可變化，并可每天施用一個(gè)或多個(gè)劑量，持續(xù)一天或數(shù)天。對指定類型的藥物產(chǎn)品的合適劑量，指導(dǎo)可見于文獻(xiàn)。例如，對抗體選擇合適的劑量的指導(dǎo)可見于關(guān)于抗體治療應(yīng)用的文獻(xiàn)，如，HandbookofMonoclonalAntibodies(單克隆抗體手冊),Ferrone等人編輯，NogesPublications,ParkRidge,NJ.，(1985)第22章和第303-357頁；Smith等人，AntibodiesinHumanDiagnosisandTherapy(人類診斷和治療中的抗體)，Haber等人編輯，RavenPress,NewYork(1977)第365-389頁。取決于上述因素，單獨(dú)使用的抗體的典型每日劑量可能從每天約1Pg/kg體重到高達(dá)100mg/kg體重或更多。與分離的D4去飽和酶和D5延伸酶相互作用、不具有具體藥學(xué)(pharmacuetical)功能，但例如可用于追蹤細(xì)胞染色體變化或用于遞送診斷工具的其它分子可以對藥物產(chǎn)品描述的方式類似的方式遞送。259.芯片和微陣列公開了芯片，其中至少一個(gè)地址是列在本文公開的任何核酸序列中的序列或序列的部分。還公開了芯片，其中至少一個(gè)地址是列在本文公開的任何肽序列中的序列或序列的部分。還公開了芯片，其中至少一個(gè)地址是列在本文公開的任何核酸序列中的序列或序列的部分的變體。還公開了芯片，其中至少一個(gè)地址是列在本文公開的任何肽序列中的序列或序列的部分的變體。10.計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)應(yīng)理解的是，公開的核酸和蛋白可表示為由氨基酸的核苷酸組成的序列。有多種方式來展示這些序列，例如核苷酸鳥苷可被G或g代表。類似地氨基酸纈氨酸可被Val或V代表。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解如何用存在的多種方式的任一種展示和表達(dá)任何核酸或蛋白序列，認(rèn)為這些方式的每一種公開在本文。本文具體地預(yù)期在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上展示這些序列，所述計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)諸如，可購買獲得的軟盤、磁帶、芯片、硬盤驅(qū)動(dòng)器、光盤、視盤、或其它計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。還公開了公開的序列的二進(jìn)碼形式。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解什么計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。因此，在其上記錄、儲(chǔ)存或保存核酸或蛋白序列的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。公開了計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其包含序列和關(guān)于本文列出的序列的信息。11.通過以公開的組合物/組合化學(xué)篩選而鑒定的組合物a)組合化學(xué)公開的組合物可用作任何組合技術(shù)的靶以鑒定以期望的方式與公開的組合物相互作用的分子或大分子分子。本文公開的核酸、肽和相關(guān)分子可用作組合方法的靶。還公開了經(jīng)由組合技術(shù)或篩選技術(shù)鑒定的組合物，其中在例如SEQIDN0:14、15、25或26公開的組合物或其部分用作組合或篩選方案中的靶。應(yīng)理解的是，當(dāng)在組合技術(shù)或篩選方法中使用公開的組合物時(shí)，將鑒定具有特定的期望特性諸如抑制或刺激靶分子的功能的分子，諸如大分子的分子。還公開了當(dāng)使用公開的組合物時(shí)鑒定和分離的分子，諸如脂肪酸。因此，使用涉及公開的組合物的組合或篩選方法產(chǎn)生的產(chǎn)物，諸如脂肪酸，也認(rèn)為在本文公開。應(yīng)理解的是，用于鑒定抑制例如，分離的D4去飽和酶與D5延伸酶之間的相互作用的分子的公開的方法可使用高通量手段進(jìn)行。例如，可使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)鑒定推定的抑制劑以快速鑒定相互作用。該技術(shù)的基本理論是當(dāng)兩個(gè)分子在空間中接近時(shí)，即以超過背景的水平相互作用，則產(chǎn)生信號(hào)或信號(hào)可被猝滅。隨后可進(jìn)行多種試驗(yàn)，包括例如，加入推定的抑制劑。如果該抑制劑與兩種信號(hào)分子之間的相互作用競爭，信號(hào)將在空間中彼此除去，取決于所用的信號(hào)類型，這將導(dǎo)致信號(hào)減少或增加。這種減少或增加的信號(hào)可與推定的抑制劑的存在或不存在相關(guān)。可使用任何信號(hào)傳導(dǎo)手段。例如，公開了鑒定任何兩種公開的分子之間相互作用的抑制劑的方法，該方法包括使第一分子與第二分子在推定的抑制劑存在下接觸，其中第一分子或第二分子包括熒光供體，其中第一或第二分子，通常是不包括供體的分子，包括熒光受體；并在推定的抑制劑存在和推定的抑制劑不存在下測量熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，其中推定的抑制劑存在下FRET與推定的抑制劑不存在下FRET測量值相比減少表示推定的抑制劑抑制這兩種分子之間的結(jié)合。這種類型的方法還可以細(xì)胞體系進(jìn)行。組合化學(xué)包括但不限于用于分離小分子或能夠結(jié)合小分子或另一大分子的大分子的所有方法，通常是以迭代的方法。蛋白、寡核苷酸和糖類是大分子的實(shí)例。例如，具有催化性或配體結(jié)合的指定功能的寡核苷酸分子可從隨機(jī)寡核苷酸的復(fù)雜混合物中分離，這已被稱為“體外遺傳學(xué)”(SzostakJIBS19:89，1992)。人們合成帶有隨機(jī)和界定的序列的分子的大池，并對該復(fù)雜混合物，例如大約lOOyg的100核苷酸RNA中1015種單獨(dú)序列進(jìn)行一些選擇和富集處理。經(jīng)由親和性色譜和PCR擴(kuò)增結(jié)合于柱上配體的分子的重復(fù)循環(huán)，Ellington和SzOStak(1990)估計(jì)101QRNA分子中的1個(gè)以結(jié)合小分子染料的方式折疊。還已分離了具有這種配體結(jié)合行為的DNA分子(Ellington和Szostak，1992；Bock等人，1992)。對小的有機(jī)分子、蛋白、抗體和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它大分子存在針對類似目標(biāo)的技術(shù)。篩選分子組的期望活性，無論是否基于小有機(jī)文庫、寡核苷酸或抗體，都寬泛地稱為組合化學(xué)。組合技術(shù)特別適合于界定分子之間的結(jié)合相互作用并適于分離具有特異性結(jié)合活性的分子，當(dāng)大分子是核酸時(shí)該分子通常稱為適體。已有大量方法用于分離具有全新活性或修飾的活性的蛋白。例如，噬菌體展示文庫已被用于分離許多與特定靶相互作用的肽。(參見，例如美國專利6，031，071；5，824，520；5,596，079和5，565，332，其通過參考至少涉及噬菌體展示的材料和涉及組合化學(xué)的方法并入本文)。用于分離具有指定功能的蛋白的優(yōu)選方法描述在Roberts和Szostak(RobertsR.ff.和SzostakJ.ff.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94(23)12997-302(1997)。該組合化學(xué)方法聯(lián)合了蛋白的功能性能力和核酸的遺傳能力。產(chǎn)生RNA分子，其中嘌呤霉素分子共價(jià)連接于RNA分子的3’-端。這一修飾的RNA分子的體外翻譯導(dǎo)致翻譯該RNA編碼的正確蛋白。此外，由于連接有嘌呤霉素，不能延伸肽基(P印tdyl)受體，生長中的肽鏈連接于連接到RNA的嘌呤霉素。因此，蛋白分子連接于編碼其的遺傳材料?，F(xiàn)在可進(jìn)行普通的體外選擇步驟以分離功能性肽。完成對肽功能的選擇步驟后，進(jìn)行常規(guī)核酸操縱步驟以擴(kuò)增編碼所選的功能性肽的核酸。擴(kuò)增遺傳材料后，轉(zhuǎn)錄在3’-端帶有嘌呤霉素的新RNA，翻譯新肽并進(jìn)行又一功能性選擇循環(huán)。因此，可如同核酸選擇技術(shù)一樣以迭代方式進(jìn)行蛋白選擇。翻譯的肽由與嘌呤霉素連接的RNA的序列控制。該序列可為來自為了最佳翻譯而加工的隨機(jī)序列的任何序列(即無終止密碼子等等)，或可為已知RNA分子的簡并序列以搜尋已知肽的改進(jìn)或改變的功能。核酸擴(kuò)增和體外翻譯的條件對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的，優(yōu)選地如Roberts禾口Szostak(RobertsR.ff.禾口SzostakJ.ff.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94(23)12997-302(1997))進(jìn)行。設(shè)計(jì)為分離肽的組合方法的另一優(yōu)選的方法描述在Cohen等人(CohenB.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95(24):14272-7(1998))。該方法利用并修改了雙雜交技術(shù)。酵母雙雜交體系可用于檢測和分析蛋白蛋白相互作用。雙雜交體系最初描述在釀酒酵母Saccharomycescerevisiae，是一種用于鑒定新的對目標(biāo)蛋白特異性的調(diào)節(jié)性分子的強(qiáng)有力的分子遺傳技術(shù)(Fields和Song,Nature340:245_6(1989))。Cohen等人修改該技術(shù)以使可鑒定結(jié)合所選分子的合成或工程化的肽序列之間的新型相互作用。這類技術(shù)的益處是，選擇是在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境進(jìn)行。該方法利用連接于酸性活化結(jié)構(gòu)域的肽分子文庫。所選的肽，例如分離的D4去飽和酶或D5延伸酶的部分連接于轉(zhuǎn)錄活化蛋白諸如Gal4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。通過對這類體系進(jìn)行雙雜交技術(shù)，可鑒定結(jié)合分離的D4去飽和酶或D5延伸酶27的該部分的分子。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法聯(lián)同各種組合文庫，人們可分離并表征與期望的靶結(jié)合或相互作用的小分子或大分子。使用競爭結(jié)合研究可比較這些化合物的相對結(jié)合親和性并鑒定最佳化合物，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。用于制備組合文庫并篩選組合文庫以分離結(jié)合期望的靶的分子的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。代表性的技術(shù)和方法可見于但不限于美國專利5，084，824,5,288，514、5，449，754,5，506，337,5，539，083,5，545，568,5，556，762,5，565，324,5，565，332,5，573，905,5，618，825,5，619，680,5，627，5，677，195,5，683，899,5，688，696,5，688，5，723，598,5,741，5，834，195,5，834，318,5，834，588,5，840，5，859，190,5，864，010,5，874，443,5，877，5，891，737,5，916，899,5，919，955,5，925，210,5，646，285,5，663，046,5，670，326,997,5，698，685,5，712，146,5，721，099,130,5,831，014、500,5，847，150,5，856，107,5，856，496,214,5，880，972,5，886，126,5，886，127,527,5，939，268,5，942，387,5，945，070,713,5，792，431,5，807，683,5，807，754,5，821，5，948，696,5，958，702,5，958，792,5，962，337,5，965，719,5，972，719,5，976，894,5，980，704,5，985，356,5，999，086,6，001，579,6，004，617,6，008，321,6，017，768,6，025，371,6,030，917,6,040，193,6,045，671,6,045，755,6,060，596和6，061，636。使用大量的不同合成技術(shù)，組合文庫可從廣泛陣列的分子制備。例如，包含融合的2，4_嘧啶二酮類(美國專利6，025，371)、二氫苯并吡喃(美國專利6，017，768和5，821，130)、醇酰胺類(美國專利5，976，894)、羥基-氨基酸酰胺類(美國專利5，972，719)、糖類(美國專利5，965，719)、1，4-苯二氮-2，5-二酮(美國專利5，962，337)、環(huán)狀化合物(美國專利5，958，792)、聯(lián)芳氨基酸酰胺類(美國專利5，948，696)、噻吩類(美國專利5，942，387)、三環(huán)四氫喹啉類(美國專利5，925，527)、苯并呋喃類(美國專利5，919，955)、異喹啉類(美國專利5，916，899)、乙內(nèi)酰脲和乙內(nèi)酰硫脲(美國專利5，859，190)、吲哚類(美國專利5，856，496)、咪唑-吡啶并_吲哚和咪唑-吡啶并-苯并噻吩類(美國專利5，856，107)、取代的2-亞甲基-2，3-二氫噻唑類(美國專利5，847，150)、喹啉類(美國專利5，840，500)、PNA(美國專利5，831，014)、包含標(biāo)簽(美國專利5，721，099)、聚酮類(美國專利5，712，146)、嗎啉代-亞基(美國專利5，698，685和5，506，337)、磺酰胺類(美國專利5，618，825)、和苯二氮卓類(美國專利5，288，514)的文庫。如本文所用的，組合方法和文庫包括常規(guī)篩選方法和文庫以及用于迭代方法中的方法和文庫。b)計(jì)算機(jī)輔助的藥物設(shè)計(jì)公開的組合物可用作任何分子建模技術(shù)的靶以鑒定公開的組合物的結(jié)構(gòu)或鑒定以期望的方式與公開的組合物相互作用的可能的或?qū)嶋H的分子諸如小分子。本文公開的核酸、肽和相關(guān)分子可用作任何分子建模程序或方法中的靶。應(yīng)理解的是，當(dāng)在建模技術(shù)中使用公開的組合物時(shí)，將鑒定具有特定期望的特性諸如抑制或刺激靶分子功能的分子諸如大分子的分子。還公開了當(dāng)使用公開的組合物諸如分離的D4去飽和酶或D5延伸酶時(shí)鑒定和分離的分子。因此，使用涉及公開的組合物諸如分離的D4去飽和酶或D5延伸酶的分子建模方法產(chǎn)生的產(chǎn)物也認(rèn)為在本文公開。28因此，分離結(jié)合所選分子的分子的一種方式是經(jīng)由合理設(shè)計(jì)。這經(jīng)由結(jié)構(gòu)信息和計(jì)算機(jī)建模實(shí)現(xiàn)。計(jì)算機(jī)建模技術(shù)允許所選分子的三維原子結(jié)構(gòu)可視化和合理設(shè)計(jì)將與分子相互作用的新化合物。三維構(gòu)建通常取決于對所選分子的x-射線結(jié)晶學(xué)分析或NMR成像的數(shù)據(jù)。分子動(dòng)力學(xué)需要力場數(shù)據(jù)。計(jì)算機(jī)制圖系統(tǒng)能夠預(yù)測新化合物將如何連接靶分子并允許試驗(yàn)性操縱化合物和靶分子的結(jié)構(gòu)以使結(jié)合特異性最佳。預(yù)測當(dāng)在分子或化合物之一或兩者進(jìn)行小的變化時(shí)分子_化合物相互作用將是什么樣子需要分子力學(xué)軟件和密集計(jì)算的計(jì)算機(jī)，該軟件和計(jì)算機(jī)通常伴有分子設(shè)計(jì)程序與用戶之間用戶友好的、菜單驅(qū)動(dòng)的界面。分子建模體系的實(shí)例是CHARMm和QUANTA程序，PolygenCorporation，ffaltham,MA。CHARMm進(jìn)行能量最小化和分子動(dòng)力學(xué)功能。QUANTA進(jìn)行構(gòu)建、圖示建模和分析分子結(jié)構(gòu)。QUANTA允許互動(dòng)式構(gòu)建、修飾、可視化、和分析分子彼此的行為。大量文章綜述了與特定蛋白相互作用的藥物的計(jì)算機(jī)建模，諸如Rotivinen等A,1988ActaPharmaceuticaFennica97,159-166；Ripka,NewScientist54-57(1988年6月16日)；McKinaly禾口Rossmann，1989Annu.Rev.Pharmacol.Toxiciol.29，111—122；Perry禾口Davies,QSARQuantitativeStructure-ActivityRelationshipsinDrugDesign(QSAR藥物設(shè)計(jì)中的定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系)第189-193頁(AlanR.Liss,Inc.1989)；Lewis和Dean,1989Proc.R.Soc.Lond.236，125-140和141-162；以及，關(guān)于核酸組分的模型酶，Askew等人，1989J.Am.Chem.Soc.111，1082-1090。篩選和圖解地表示化學(xué)物的其它計(jì)算機(jī)程序可從以下公司獲得，諸如BioDesigmlnc.,Pasadena,CA.、Allelix，Inc,Mississauga,Ontario,Canada禾口Hypercube,Inc.,Cambridge,Ontario。盡管這些主要為應(yīng)用于對特定蛋白特異性的藥物而設(shè)計(jì)，它們也可適用于在鑒定該區(qū)域之后設(shè)計(jì)與DNA或RNA的具體區(qū)域特異性相互作用的分子。盡管上述提及設(shè)計(jì)和產(chǎn)生可以改變結(jié)合的化合物，人們也可以從已知化合物的文庫，包括天然產(chǎn)物或合成化學(xué)品和包括蛋白的生物活性材料篩選改變底物結(jié)合或酶促活性的化合物。12.試劑盒本文公開了關(guān)于可用于實(shí)踐本文公開的方法的試劑的試劑盒。試劑盒可包括本文討論的任何試劑或試劑組合或?qū)⒗斫鉃閷?shí)踐公開的方法所需或有益于實(shí)踐公開的方法的任何試劑或試劑組合。例如，試劑盒可包括引物以進(jìn)行在方法的某些實(shí)施方案討論的擴(kuò)增反應(yīng)，以及如計(jì)劃地使用引物所需的緩沖液和酶。13.具有類似功能的組合物應(yīng)理解的是，本文公開的組合物具有某些功能，諸如公開的酶促功能。本文公開了用于實(shí)現(xiàn)公開的功能的某些結(jié)構(gòu)要求，應(yīng)理解的是，有關(guān)于公開的結(jié)構(gòu)的多種結(jié)構(gòu)可實(shí)現(xiàn)相同功能，這些結(jié)構(gòu)最終將實(shí)現(xiàn)相同結(jié)果，例如刺激或抑制酶促功能。C.制備組合物的方法除非另外具體地指明，否則本文公開的組合物和進(jìn)行公開的方法必需的組合物可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員對該特定試劑或化合物已知的任何方法制備。1.核酸合成例如，核酸諸如將用作引物的寡核苷酸可使用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)合成方法制備或可使用酶促方法或任何其它已知方法產(chǎn)生。這種方法可從標(biāo)準(zhǔn)酶促消化隨后是核苷酸片段分離(參見，例如Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南)，第2版(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989)第5、6章)到單純的合成方法，例如通過使用Milligen或Beckman系統(tǒng)lPlusDNA合成儀(例如，Milligen-Biosearch,Burlington,MA的8700型自動(dòng)合成儀或ABI380B型)的氰乙基亞磷酰胺方法?？捎糜谥苽涔押塑账岬暮铣煞椒ㄟ€描述在Ikuta等人，Ann.Rev.Biochem.53:323_356(1984)(磷酸三酯和亞磷酸三酯方法)，和Narang等人，MethodsEnzymol.,65=610-620(1980)(磷酸三酯方法)。蛋白核酸分子可使用已知方法制備，諸如Nielsen等人，Bioconjug.Chem.5:3_7(1994)描述的方法。2.肽合成產(chǎn)生公開的蛋白諸如SEQIDNO23的一種方法是通過蛋白化學(xué)技術(shù)將兩個(gè)或多個(gè)肽或多肽連接在一起。例如，肽或多肽可使用目前可獲得的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備使用Fmoc(9-芴基甲氧基羰基)或Boc(叔丁氧基羰基)化學(xué)合成(AppliedBiosystems,Inc.，F(xiàn)osterCity,CA)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地明白，例如對應(yīng)于公開的蛋白的肽或多肽，可通過標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)反應(yīng)合成。例如，肽或多肽可被合成并不從其合成樹脂上切下，而肽或蛋白的其它片段可被合成且其后從樹脂上切下，從而將功能性地封閉的末端基團(tuán)暴露于該其它片段。通過肽縮合反應(yīng)，這兩種片段可經(jīng)由肽鍵分別在其羧基末端和氨基末端共價(jià)連接，以形成抗體或其片段。(GrantGA(1992)SyntheticPeptides:AUserGuide(合成肽的使用者指南).W.H.FreemanandCo.，N.Y.(1992)；BodanskyM和TrostB.編輯.(1993)PrinciplesofPeptideSynthesis(肽合成原理).Springer-VerlagInc.，NY(其通過參考至少關(guān)于涉及肽合成的材料并入本文)。作為選擇，肽或多肽如本文描述的獨(dú)立地體內(nèi)合成。在分離后，這些獨(dú)立的肽或多肽可經(jīng)由類似肽縮合反應(yīng)被連接以形成肽或其片段。例如，酶促連接克隆的或合成的肽區(qū)段允許連接相對小的肽片段以產(chǎn)生較大的肽片段、多肽或完整蛋白結(jié)構(gòu)域(AbrahmsenL等人，Biochemistry，30:4151(1991))。作為選擇，天然化學(xué)連接合成肽可用于從較小肽片段合成地構(gòu)建大的肽或多肽。該方法由兩步化學(xué)反應(yīng)組成(Dawson^ASynthesisofProteinsbyNativeChemicalLigation(iEii天然化學(xué)連接合成蛋白).Science，266:776-779(1994))。第一步是未保護(hù)的合成肽-硫酯與包含氨基_末端Cys殘基的另一未保護(hù)的肽區(qū)段化學(xué)選擇性反應(yīng)以產(chǎn)生硫酯_連接的中間產(chǎn)物作為最初的共價(jià)產(chǎn)物。不需改變反應(yīng)條件，該中間產(chǎn)物將經(jīng)歷自發(fā)、快速的分子內(nèi)反應(yīng)以形成在連接位點(diǎn)的天然肽鍵(BaggioliniM等人.(1992)FEBSLett.30797-101；Clark-LewisI等人，J.Biol.Chem.，26916075(1994)；Clark-LewisI等人，Biochemistry，30:3128(1991)；RajarathnamK等人，Biochemistry33:6623_30(1994))。作為選擇，未保護(hù)的肽區(qū)段被化學(xué)連接，其中作為化學(xué)連接的結(jié)果，肽區(qū)段之間形成的鍵是非天然(非肽)鍵(Schnolzer，M等人.Science，256:221(1992))。這一技術(shù)已經(jīng)用于合成蛋白結(jié)構(gòu)域的類似物以及大量具有完全生物活性的相對純的蛋白(deLisleMiltonRC等人，TechniquesinProteinChemistryIV(蛋白化學(xué)中的技術(shù)IV).AcademicPress,NewYork,pp.257-267(1992))。3.關(guān)于制備組合物的方法權(quán)利主張公開了用于制備組合物以及制備將產(chǎn)生該組合物的中間產(chǎn)物的方法。例如，公開了SEQIDNO:14和25的核酸。有多種方法可用于制備這些組合物，諸如合成化學(xué)方法和標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法。應(yīng)理解的是，具體地公開了用于制備這些和其它公開的組合物的方法。公開了包括以可操作方式連接例如包含列在SEQIDNO:14和25的序列的核酸與控制該核酸表達(dá)的序列的方法而產(chǎn)生的核酸分子。還公開了包括以可操作方式連接例如包含與列在SEQIDNO:14和25的序列具有80%同一性的序列的核酸分子與控制該核酸表達(dá)的序列的方法而產(chǎn)生的核酸分子。公開了包括以可操作方式連接例如包含在嚴(yán)緊性雜交條件下與列在SEQIDNO14和25的序列雜交的序列的核酸分子與控制該核酸表達(dá)的序列的方法而產(chǎn)生的核酸分子。公開了包括以可操作方式連接例如包含編碼列在SEQIDNO15和26的肽的序列的核酸分子與控制該核酸分子表達(dá)的序列的方法而產(chǎn)生的核酸分子。公開了包括以可操作方式連接例如包含編碼與列在SEQIDN0:15和26的肽具有80%同一性的肽的序列的核酸分子與控制該核酸分子表達(dá)的序列的方法而產(chǎn)生的核酸分子。公開了包括以可操作方式連接例如包含編碼與列在SEQIDNO:15和26的肽具有80%同一性、且例如其中不同于SEQIDNO15和26的任何變化是保守性變化的肽的序列的核酸分子與控制該核酸分子表達(dá)的序列的方法而產(chǎn)生的核酸。公開了以公開的任何核酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法產(chǎn)生的細(xì)胞。公開了以非天然產(chǎn)生的公開的任何核酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法產(chǎn)生的細(xì)胞。公開了由表達(dá)任何公開的核酸的方法產(chǎn)生的任何公開的肽。公開了由表達(dá)任何公開的核酸的方法產(chǎn)生的任何非天然產(chǎn)生的公開的肽。公開了由表達(dá)任何非天然公開的核酸的方法產(chǎn)生的任何公開的肽。公開了由以本文公開的任何核酸分子轉(zhuǎn)染動(dòng)物中細(xì)胞的方法產(chǎn)生的動(dòng)物。公開了以本文公開的任何核酸分子轉(zhuǎn)染動(dòng)物中的細(xì)胞的方法產(chǎn)生的動(dòng)物，其中該動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。還公開了以本文公開的任何核酸分子轉(zhuǎn)染動(dòng)物中的細(xì)胞的方法產(chǎn)生的動(dòng)物，其中該哺乳動(dòng)物是小鼠、大鼠、兔、牛、綿羊、豬或靈長類。還公開了通過向動(dòng)物加入本文公開的任何細(xì)胞的方法而產(chǎn)生的動(dòng)物。D.實(shí)施例提出以下實(shí)施例以對本領(lǐng)域技術(shù)人員提供如何制備和評價(jià)本文公開的化合物、組合物、物品、裝置和/或方法的完整公開和說明，并且僅意為示例性而不意為限制本公開。已經(jīng)努力確保關(guān)于數(shù)字(如，量、溫度等等)的準(zhǔn)確性，但應(yīng)當(dāng)說明有一些誤差和偏差。除非另外指明，否則部分是按重量計(jì)的部分，溫度以。c表示或在室溫，壓力是在大氣壓或接近大氣壓。1.實(shí)施例1為了從破囊壺菌Thraustochytrid0NC-T18分離去飽和酶和延伸酶而設(shè)計(jì)簡并寡核苷酸分析破囊壺菌Thraustochytrid0NC-T18的脂肪酸組成揭示，存在可觀量的較長鏈PUFA諸如花生四烯酸(ARA，20:4ri-6)、二十碳五烯酸(EPA，205n_3)、腎上腺酸(ADA,22:4n-6)、(&6_二十二碳五烯酸(66-DPA，22:5n-6)、(&3_二十二碳五烯酸(t&;j-DPAn-3)和二十二碳六烯酸(DHA，22:6ri-3)。因此認(rèn)為該有機(jī)體包含能夠轉(zhuǎn)化ARA為ADA或轉(zhuǎn)化EPA為d)3"DPA的活性A5-延伸酶和去飽和ADA為66"DPA或去飽和d>3"DPA為DHA的活性A4-去飽和酶(圖1)。因此目標(biāo)是試圖從破囊壺菌Thraustochytrid0NC-T18分離這些去飽和酶和延伸酶基因，并最終通過在另一宿主表達(dá)而證實(shí)功能性。為了分離編碼功能性去飽和酶的基因，從有機(jī)體提取基因組DNA。將破囊壺菌Thraustochytrid0NC-T18培養(yǎng)物在生長培養(yǎng)基(5g/l酵母提取物、5g/l蛋白胨、40g/lD(+)_葡萄糖、1.25ml/l痕量元素、1.25ml/l維生素、40g/l海鹽；(痕量元素:5g/1NaH2P04.H20、3.15g/lFeCl3.6H20、4.36g/lNa2EDTA.2H20、0.6125mg/lCuS04.5H20、0.0597g/lNa2Mo04.2H20、0.022g/lZnS04.7H20、0.01g/lCoCl2.6H20、0.18g/lMnCl2.4H20、13iig/lH2Se03、2.7mg/lNiS04.6H20、1.84mg/lNa3V04、1.94mg/lK2Cr04)、(維生素lmg/1維生素B12、lmg/1生物素、0.20g/l硫胺素HC1))在26°C生長16-20小時(shí)，伴隨不斷攪動(dòng)。將細(xì)胞在室溫在SorvallSuperT21離心機(jī)中用轉(zhuǎn)子ST-H750、使用適配器(adapter)Sorvall#00436以500rpm離心5min，除去80%上清液，在剩余培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞，并繼續(xù)提取。使用UltracleanMicrobialDNA分離試劑盒(MOBIOLaboratories,Inc,SolanaBeach,California)按照制造商的實(shí)驗(yàn)方案，從細(xì)胞分離基因組DNA。采用的方法是設(shè)計(jì)在已知的去飽和酶中保守的簡并寡核苷酸(即，引物)。這些引物可用在PCR反應(yīng)中以鑒定包含來自破囊壺菌Thraustochytrium的預(yù)測的去飽和酶基因中保守區(qū)域的片段。五條序列可從破囊壺菌Thraustochytriumsp.、金黃色破囊壺菌Thraustochytriumaureum>破囊壺菌Thraustochytriumsp.ATCC34304、破囊壺菌Thraustochytriumsp.ATCC21685禾口破囊壺菌Thraustochytriumsp.FJN—10獲得(分別具有EMB0登錄號(hào)CS020087、Genbank登錄號(hào)AF391546、AF391543、AF489589、DQ133575)。使用Kodon引物設(shè)計(jì)軟件，使用的簡并引物如下引物4deSat308(正向)(SEQIDNO:1)5，-GGRACAGCGASTTTTACAGGG-3，、弓丨物4desatl369(反向)(SEQIDN02)5，-GTGCTCAATCTGGTGGTTKAG-3，。采用相同方法來設(shè)計(jì)在已知的延伸酶中保守的簡并寡核苷酸(即，引物)。這些引物可用在PCR反應(yīng)中以鑒定包含來自破囊壺菌Thraustochytriumsp.的預(yù)測的延伸酶基因的保守區(qū)域的片段。兩條序列可從破囊壺菌Thraustochytriumsp.和金黃色破囊壺菌Thraustochytriumaureum獲得(分別具有EMB0登錄號(hào)CS160897和CS160879)。使用Kodon引物設(shè)計(jì)軟件，使用的簡并引物如下引物5elo202F(正向)(SEQIDN0:3)5，-AAGCCYTTCGAGCTCAAGTYC-3，、弓丨物5elo768R(反向)(SEQIDNO:4)5，-GCACGAARAAGTTGCCGAAG-3‘。寡核苷酸序列的簡并性密碼子是K=G、T，R=A、G，S——G、C，Y=C、T〇2.實(shí)施例2從破囊壺菌Thraustochytriumsp.0NC-T18分離A5_延伸酶的核苷酸序列為了分離A5-延伸酶基因，在包含以下的50ill體積中進(jìn)行PCR擴(kuò)增200ng破囊壺菌Thraustochytriumsp.0NC-T18的基因組DNA、10ii1甜菜堿、10mMTris_HCl，pH8.3、50mMKCl、1.5mMMgCl2、0.001%明膠、200yM每種脫氧核糖核苷酸三磷酸酯、1yM各種引物和0.2單位TaqDNA聚合酶(Sigma，Oakvilie,Ontario)。在55.7°C的退火溫度進(jìn)行熱循環(huán)，在0.8%低熔點(diǎn)的瓊脂糖凝膠上分辨PCR反應(yīng)物，凝膠純化600bp的條帶。用水從瓊脂糖上洗脫P(yáng)CR產(chǎn)物，隨后用QIAquickPCR純化試劑盒(Qiagen，Valencia,California)純化。按照制造商的說明書將這些DNA片段克隆到pT7BlUe-3Perfectly鈍端克隆試劑盒(Novagen,SanDiego,California)。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到NovaBlue感受態(tài)細(xì)胞(Novagen,SanDiego,California)，并對克隆測序。這樣分離了對此前鑒定的A5_延伸酶顯示序列同源性的一個(gè)克隆。該克隆如下描述對克隆#600-16(SEQIDN0:5)測序，從593bp推斷的氨基酸序列與破囊壺菌Thraustochytriumsp.FJN-10的多不飽和的脂肪酸延伸酶1顯示95%同一性作為BLASTx搜尋中的最高得分匹配。為了分離3’-端，按照制造商的實(shí)驗(yàn)方案使用APAgeneGOLD基因組步移試劑盒(BIOS&T，Montreal,Quebec)進(jìn)行基因組步移，并使用從破囊壺菌Thraustochytriumsp.0NC-T18純化的基因組DNA以及寡核苷酸3，GSPa(SEQIDNO6)(5，-CGCTGCGCCCGTACATTACTACCATCCA-3，)和3，GSPb(SEQIDN0:7)(5，-GTCGTCCAGTCCGTCTATGAC-3，)。這兩種寡核苷酸是基于推定的A5-延伸酶的#600-16片段設(shè)計(jì)的。在0.8%低熔點(diǎn)的瓊脂糖凝膠上分辨PCR片段，凝膠純化500至2000bp的條帶。用水從瓊脂糖上洗脫P(yáng)CR產(chǎn)物，隨后用QIAquickPCR純化試劑盒(Qiagen,Valencia,California)純化。按照制造商的說明書將這些DNA片段克隆到pT7Blue-3PerfeCtly鈍端克隆試劑盒(Novagen，SanDiego,California)。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到NovaBlue感受態(tài)細(xì)胞(Novagen,SanDiego,California)，并對克隆測序?？寺?，C2_1(SEQIDNO8)包含358bp的插入片段，基于與已知的A5-延伸酶的序列同源性和存在‘TGA’終止密碼子，鑒定該插入片段包含推定的A5-延伸酶基因的3’-端。為了分離5’-端，按照制造商的實(shí)驗(yàn)方案使用APAgeneGOLD基因組步移試劑盒(BIOS&T，Montreal,Quebec)進(jìn)行基因組步移，并使用從破囊壺菌Thraustochytriumsp.0NC-T18純化的基因組DNA，以及寡核苷酸5，GSPa(SEQIDNO9)(5，-CTCGGCACCCTTCTCCATCGGGTTGCCA-3，)和5，GSPb(SEQIDN010)(5，-GTTGCCAAAGAGCTTGTAGCCGCCGA-3，)。這兩種寡核苷酸是基于推定的A5-延伸酶的#600-16片段設(shè)計(jì)的。在0.8%低熔點(diǎn)的瓊脂糖凝膠上分辨PCR片段，凝膠純化500至2000bp的條帶。用水從瓊脂糖上洗脫P(yáng)CR產(chǎn)物，隨后用QIAquickPCR純化試劑盒(Qiagen,Valencia,California)純化。按照制造商的說明書將這些DNA片段克隆到pT7Blue-3Perfec11y鈍端克隆試劑盒(Novagen，SanDiego，California)。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到NovaBlue感受態(tài)細(xì)胞(Novagen,SanDiego,California)，并對克隆測序。如此獲得克隆5，D2-11(SEQIDNO:11)，其包含含有新八5-延伸酶的推定的116’起始位點(diǎn)的51%插入片段。當(dāng)與已知的A5-延伸酶比對時(shí)，該片段的推定的氨基酸序列顯示89%同一性。通過PCR擴(kuò)增完整地分離該A5-延伸酶基因，使用破囊壺菌Thraustochytrium0NC-T18基因組DNA作為模板和以下寡核苷酸0NC_T18elol(正向)(SEQIDNO:12)5'-GCTGATGATGGCCGGGACC-3'、0NC-T18elol099(反向)(SEQIDN013)5’-GGTCCACTCGAATTCGTAGCG-3，。使用50ill體積中的以下進(jìn)行PCR擴(kuò)增100ng破囊壺菌Thraustochytrium0NC-T18基因組DNA、25mMTAPS-HC1，pH9.3、50mMKCl、2mMMgCl2、lmM巰基乙醇、1.5illDMS0、200uM每種脫氧核糖核苷酸三磷酸酯、0.5uM各種引物和1單位的Phusion高保真DNA聚合酶(Firmzymes，Espoo,Finland)。熱循環(huán)條件如下最初在98°C將模板變性30sec，隨后是[98°C持續(xù)10sec、62°C持續(xù)30see、72°C持續(xù)30sec]的30個(gè)循環(huán)，最終在72°C延伸循環(huán)5分鐘。按照制造商的說明書將如此獲得的PCR產(chǎn)物克隆到pT7Blue-3Perfectly鈍端克隆試劑盒(Novagen,SanDiego,California)。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到NovaBlue感受態(tài)細(xì)胞(Novagen,SanDiego,California)，并對克隆測序。使用UltraClean6MinuteMiniMfifUli式齊Ui(MOBIOLaboratories,Inc,SolanaBeach,California)純化質(zhì)粒。以BamHI/NotI消化如此獲得的質(zhì)粒并克隆到酵母表達(dá)載體pYES2(Invitrogen,Carlsbad,California)以產(chǎn)生克隆pYElo，其隨后用于表達(dá)研究。八5_延伸酶全長基因插入片段的長度是109%(5￡0IDNO14)，從第一ATG開始，包含編碼276個(gè)氨基酸的831bp開放閱讀框。全長基因的氨基酸序列(SEQIDNO15)包含與來自破囊壺菌Thraustochytriumsp.FJN—10、地錢Marchantiapolymorpha、小立碗蘇Physcomitrellapatens禾口高山被抱霄Mortierellaalpina的A5_延伸醇同源的區(qū)域。3.實(shí)施例3從破囊壺菌Thraustochytrium0NC-T18分離A4-去飽和酶核苷酸序列為了分離A4-去飽和酶基因，在包含以下的50iU體積中進(jìn)行PCR擴(kuò)增100ng破囊壺菌Thraustochytrium0NC-T18的基因組DNA、20mMTris_HCl，pH8.4、50mMKC1、2mMMgCl2、400uM每種脫氧核糖核苷酸三磷酸酯、2yM各種引物和0.1單位TaqDNA聚合酶(Invitrogen，Carlsbad,California)。在59.5°C的退火溫度進(jìn)行熱循環(huán)，在0.8%瓊脂糖凝膠上分辨PCR反應(yīng)物的一部分，用QIAquickPCR純化試劑盒(Qiagen，Valencia,California)從剩余的PCR反應(yīng)物純化1100bp的條帶。按照制造商的說明書將這一DNA片段克隆到T0P0TA克隆試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，California)以測序。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到T0P10感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen,Carlsbad,California)，并對克隆測序。這樣分離了對此前鑒定的A4-去飽和酶顯示序列同源性的一個(gè)克隆。該克隆如下描述對克隆#10-3(SEQIDNO16)測序，從967bp推斷的氨基酸序列與破囊壺菌Thraustochytriumsp.ATCC21685的A-4脂肪酸去飽和酶顯示96%同一性作為BLASTx搜尋中的最高得分匹配。為了分離3’-端，按照制造商的實(shí)驗(yàn)方案使用APAgeneGOLD基因組步移試劑盒(BIOS&T，Montreal,Quebec)進(jìn)行基因組步移，并使用從破囊壺菌Thraustochytrium0NC-T18純化的基因組DNA以及寡核苷酸4desat3‘a(chǎn)(SEQIDNO:17)(5，-TTACGCTTCCAAGGACGCGGTC-3，)禾口4desat3‘b(SEQIDNO18)(5'-ATGAACAACACGCGCAAGGAGG-3')。這兩種寡核苷酸是基于推定的A4-去飽和酶的#10-3片段設(shè)計(jì)的。在0.8%低熔點(diǎn)的瓊脂糖凝膠上分辨PCR片段，凝膠純化500至2000bp的條帶。用水從瓊脂糖上洗脫P(yáng)CR產(chǎn)物，隨后用QIAquickPCR純化試劑盒(Qiagen，Valencia，California)純化。按照制造商的說明書將這些DNA片段克隆到pT7Blue-3Perfectly鈍端克隆試劑盒(Novagen，SanDiego，California)。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到NovaBlue感受態(tài)細(xì)胞(Novagen,SanDiego，California)，并對克隆測序?？寺?，D2_92(SEQIDNO:19)包含782bp的插入片段，基于與已知的A4-去飽和酶的序列同源性和存在‘TGA’終止密碼子，鑒定該插入片段包含推定的A4-去飽和酶基因的3’-端。34為了分離5’-端，按照制造商的實(shí)驗(yàn)方案使用APAgeneGOLD基因組步移試劑盒(BIOS&T，Montreal,Quebec)進(jìn)行基因組步移，并使用從破囊壺菌Thraustochytriumsp.0NC-T18純化的基因組DNA，以及寡核苷酸4desat5，a(SEQIDNO20)(5，-CTGGATACACGTGCCCACGAAG-3，)和4desat5，b(SEQIDNO21)(5，-CACATCCAGTACAACGAGCTCCAGAA-3’)。這兩種寡核苷酸是基于推定的A4-去飽和酶的#10-3片段設(shè)計(jì)的。在0.8%低熔點(diǎn)的瓊脂糖凝膠上分辨PCR片段，凝膠純化500至2000bp的條帶。用水從瓊脂糖上洗脫P(yáng)CR產(chǎn)物，隨后用QIAquickPCR純化試劑盒(Qiagen，Valencia,California)純化。按照制造商的說明書將這些DNA片段克隆到pT7BlUe-3Perfectly鈍端克隆試劑盒(Novagen,SanDiego,California)。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到NovaBlue感受態(tài)細(xì)胞(Novagen,SanDiego，California)，并對克隆測序。如此獲得克隆5，_217(SEQIDN0:22)，其包含含有新A4-去飽和酶的推定的‘ATG’起始位點(diǎn)的946bp插入片段。當(dāng)與已知的A4-去飽和酶(desaaturase)比對時(shí)，該片段的推斷的氨基酸序列顯示96%同一性。通過PCR擴(kuò)增完整地分離該A4-去飽和酶基因，使用破囊壺菌Thraustochytriumsp.0NC-T18基因組DNA作為模板和以下寡核苷酸0NC_T184des380F(正向)(SEQIDNO:23)5，-CGATTGAGAACCGCAAGCTTT-3，、0NC-T184DES1687R(反向)(SEQIDNO:24)5，-GCAGCACTGCTGTGCTCTGGT-3，使用50ill體積中的以下進(jìn)行PCR擴(kuò)增300ng破囊壺菌Thraustochytrium0NC-T18基因組DNA、25mMTAPS-HC1，pH9.3、50mMKCl、2mMMgCl2、lmM巰基乙醇、1.5illDMS0、200uM每種脫氧核糖核苷酸三磷酸酯、0.5uM各種引物和1單位的Phusion高保真DNA聚合酶(Firmzymes，Espoo,Finland)。熱循環(huán)條件如下最初在98°C將模板變性30sec，隨后是[98°C持續(xù)10sec、61°C持續(xù)30sec、72°C持續(xù)30sec]的30個(gè)循環(huán)，最終在72°C延伸循環(huán)5分鐘。按照制造商的說明書將如此獲得的PCR產(chǎn)物克隆到pT7Blue_3Perfectly鈍端克隆試劑盒(Novagen,SanDiego,California)。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到NovaBlue感受態(tài)細(xì)胞(Novagen,SanDiego,California)，并對克隆測序。使用UltraClean6MinuteMiniMfifUli式齊Ui(M0BIOLaboratories,Inc,SolanaBeach,California)純化質(zhì)粒。以BamHI/NotI消化如此獲得的質(zhì)粒并克隆到酵母表達(dá)載體pYES2(Invitrogen,Carlsbad,California)以產(chǎn)生克隆pYDes，pYDes隨后用于表達(dá)研究。八4_去飽和酶全長基因插入片段的長度是1757&(5￡0IDNO:25)，從第一ATG開始，包含編碼519個(gè)氨基酸的1509bp開放閱讀框。全長基因的氨基酸序列(SEQIDNO26)包含與來自破囊壺菌Thraustochytriumsp.ATCC21685、破囊壺菌Thraustochytriumsp.FJN-10和金黃色破囊壺菌Thraustochytriumaureum的A4-去飽和酶同源的區(qū)域。其還包含三個(gè)見于所有已知的膜結(jié)合的去飽和酶中的保守的‘組氨酸盒’。(Okuley等人.(1994)ThePlantCell6:147-158)。這些組氨酸盒存在于氨基酸181-185、217-222和454-458。如同其它膜結(jié)合的A4-去飽和酶，發(fā)現(xiàn)破囊壺菌Thraustochytrium0NC-T18A4-去飽和酶中的第三個(gè)組氨酸-盒基序(HXXHH)是QXXHH。該序列還包含在5’-端的細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域。認(rèn)為該細(xì)胞色素充當(dāng)這些酶中的電子供體。4.實(shí)施例4在酵母中表達(dá)破囊壺菌Thraustochytrium0NC-T18A4_去飽和酶和A5_延伸酶基因?qū)⒂煽寺〉絧YES2(Invitrogen，Carlsbad，California)中的全長A4-去飽和酶組成的克隆pYDes和由pYES2中的全長A5-延伸酶基因組成的克隆pYElo轉(zhuǎn)化到感受態(tài)釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeINVScl。酵母轉(zhuǎn)化使用S.c.EasyComp轉(zhuǎn)化試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,California)根據(jù)制造商指明的條件進(jìn)行。在缺乏尿嘧啶的培養(yǎng)基(SC-Ura)上篩選轉(zhuǎn)化子的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型。為了檢測這些克隆的特異性去飽和酶活性，使轉(zhuǎn)化子在下列500yM特異性脂肪酸底物存在下生長:A)二十二碳五烯酸(22:5n-3)(轉(zhuǎn)化為二十二碳六烯酸將表示A4-去飽和酶活性)、B)二十二碳四烯酸(22:4n-6)(轉(zhuǎn)化為二十二碳五烯酸(22:5n-6)將表示八4-去飽和酶活性)、0二高亞麻酸(20:3n-6)(轉(zhuǎn)化為花生四烯酸(20:4n-6)將表示A5-去飽和酶活性)、D)二十碳五烯酸(20:5n-3)(轉(zhuǎn)化為二十二碳五烯酸(22:5n-3)將表示A5-延伸酶活性)、E)花生四烯酸(20:4n-6)(轉(zhuǎn)化為二十二碳四烯酸(22:4n-6)將表示A5-延伸酶活性)。陰性對照菌株是包含未改變的pYES2載體的INVScl，使這些菌株同時(shí)生長。劇烈攪動(dòng)(150rpm)培養(yǎng)物并使其在20°C在500i!M(終濃度)各種底物存在下生長96小時(shí)。將細(xì)胞成團(tuán)并在100mM磷酸鹽緩沖液，pH7.0中洗滌，冷凍干燥細(xì)胞小團(tuán)。隨后萃取脂質(zhì)并衍生為脂肪酸甲酯(FAME)用于氣相色譜分析(GC)。使用100mg冷凍干燥的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)酯和萃取，以C19:0作為內(nèi)標(biāo)，加入轉(zhuǎn)酯反應(yīng)混合物(甲醇鹽酸氯仿，1011)，混合并在90°C加熱2小時(shí)，隨后允許冷卻到室溫。通過加入1ml水和2ml己烷氯仿(41)來萃取FAME，并允許有機(jī)相與水相分離。萃取有機(jī)層并用0.5g無水硫酸鈉處理以除去顆粒和殘余水。在氬氣流下蒸發(fā)有機(jī)溶劑。將FAME重懸在異辛烷中并通過GC-FID分析。轉(zhuǎn)化百分比通過將產(chǎn)生的產(chǎn)物除以(產(chǎn)生的產(chǎn)物+加入的底物)的總和隨后乘以100來計(jì)算。表4表示分離的基因的酶活性，該酶活性是基于加入的底物的轉(zhuǎn)化百分比。MA-A4-去飽和酶的酶活性和表征。載體底物產(chǎn)物%轉(zhuǎn)化平均值標(biāo)準(zhǔn)差pYES2C22:5n-3C22:6n-30.070.14x=4pYDes14.044.01pYES2C22:4n-6C22:5n-60.530.92x=3pYDes13.761.31pYES2C20:3n-6C20:4n-60.420.37x=3pYDes0.870.27包含來自破囊壺菌Thraustochytrium0NC-T18的A4-去飽和酶基因的pYDes克隆轉(zhuǎn)化14%的22:5n-3底物為22:6n_3，以及轉(zhuǎn)化14%的22:4n_6底物為22:5n_6。這證實(shí)該基因編碼△4-去飽和酶。這種情況下沒有背景(底物的非特異性轉(zhuǎn)化)。5.實(shí)施例5以檸檬酸鐵操縱0NC-T18A4_去飽和酶活性將由克隆到pYES2(Invitrogen，Carlsbad，California)中的全長A4-去飽和酶36組成的克隆pYDes轉(zhuǎn)化到感受態(tài)釀酒酵母SaccharomycescerevisiaelNVScl。陰性對照菌株是包含未改變的PYES2載體的INVScl，使這些菌株同時(shí)生長。劇烈攪動(dòng)培養(yǎng)物(150RPM)并使其在20°C在500iiM(終濃度)DPA和0.01%檸檬酸鐵存在下生長96小時(shí)。隨后如上述地處理細(xì)胞以確定DPA向DHA的轉(zhuǎn)化百分比。在檸檬酸鐵存在下轉(zhuǎn)化百分比是38.70%,這種情況下A4-去飽和酶活性增加2.75倍。權(quán)利要求一種組合物，其包含D4去飽和酶，其中所述D4去飽和酶與SEQIDNO26具有至少或大于70％、80％、89％、90％、95％、96％、97％的同一性。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中不同于SEQIDNO:26的任何變化是保守性變化。3.一種包含核酸的組合物，其中所述核酸編碼權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的D4去飽和酶。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其還包含載體。5.一種包含細(xì)胞的組合物，其中所述細(xì)胞包含權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的組合物。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述細(xì)胞是真核生物、原核生物、破囊壺菌Thraustochytrid、酵母或大腸桿菌的細(xì)胞。7.一種包含非人類動(dòng)物的組合物，其中所述非人類動(dòng)物包含權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的組合物。8.根據(jù)權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物比不存在D4去飽和酶的組合物產(chǎn)生更多的多不飽和的脂肪酸。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述脂肪酸是EPA或DHA。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述去飽和酶包含至少一個(gè)組氨酸ιπτ.·11.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述去飽和酶包含至少2個(gè)組氨酸品.ο12.根據(jù)權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述去飽和酶包含至少三個(gè)組氨酸品.ο13.根據(jù)權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組氨酸盒包括序列ΗΧΧΗΗ，其中X是任何氨基酸。14.根據(jù)權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組氨酸盒包括序列QXXHH。15.根據(jù)權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述去飽和酶還包括細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域。16.根據(jù)權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域位于5，-端。17.根據(jù)權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述去飽和酶是在去飽和酶底物存在下。18.根據(jù)權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述底物具有至少100μΜ、200μΜ、300μΜ、400μΜ、500μΜ、600μΜ、700μΜ、800μΜ、900μM或1000μM的濃度。19.根據(jù)權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述底物是二十二碳五烯酸(22:5η-3)、二十二碳四烯酸(22:4η-6)或二高-Y-亞麻酸(20:3η_6)。20.根據(jù)權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述去飽和酶轉(zhuǎn)化至少0.1%、0.5%、1%、5%、10%、30%、50%、70%、90%、95%的可獲得的底物。21.根據(jù)權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述去飽和酶轉(zhuǎn)化表1所示的量的底物。22.根據(jù)權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物是分離的。23.一種組合物，其包含D5延伸酶，其中所述D5延伸酶與SEQIDNO15具有至少或大于70%、80%、89%、90%、95%、96%、97%的同一性。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的組合物，其中不同于SEQIDNO15的任何變化是保守性變化。25.一種包含核酸的組合物，其中所述核酸編碼權(quán)利要求23-24任一項(xiàng)所述的D5延伸酶。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物，其還包含載體。27.一種包含細(xì)胞的組合物，其中所述細(xì)胞包含權(quán)利要求23-26任一項(xiàng)所述的組合物。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的組合物，其中所述細(xì)胞是真核生物、原核生物、破囊壺菌Thraustochytrid、酵母或大腸桿菌的細(xì)胞。29.一種包含非人類動(dòng)物的組合物，其中所述非人類動(dòng)物包含權(quán)利要求23-28任一項(xiàng)所述的組合物。30.根據(jù)權(quán)利要求27-29任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物比不存在D5延伸酶的組合物產(chǎn)生更多的多不飽和的脂肪酸。31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的組合物，其中所述脂肪酸是EPA或DHA。32.根據(jù)權(quán)利要求23-31任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述延伸酶是在延伸酶底物存在下。33.根據(jù)權(quán)利要求23-32任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述底物具有至少ΙΟΟμΜ、200μΜ、300μΜ、400μΜ、500μΜ、600μΜ、700μΜ、800μΜ、900μM或1000μM的濃度。34.根據(jù)權(quán)利要求23-33任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述底物是二十碳五烯酸(20:5η-3)或花生四烯酸(20:4η-6)。35.根據(jù)權(quán)利要求23-34任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述延伸酶轉(zhuǎn)化至少0.1%、0.5%、1%、5%、10%、30%、50%、70%、90%、95%的可獲得的底物。36.根據(jù)權(quán)利要求23-35任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物是分離的。37.一種組合物，其包含權(quán)利要求1-22任一項(xiàng)所述的組合物并包含權(quán)利要求24-36任一項(xiàng)所述的組合物。38.一種產(chǎn)生多不飽和的脂肪酸的方法，包括使用權(quán)利要求1-37任一項(xiàng)所述的組合物中的一種或多種。39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中產(chǎn)生的所述脂肪酸是EPA或DHA。40.一種產(chǎn)生權(quán)利要求1-37任一項(xiàng)所述的組合物的方法，其包括分離權(quán)利要求1-37任一項(xiàng)所述的組合物。全文摘要公開了涉及ONC-T18、D4-去飽和酶、D5延伸酶和分離、表征、產(chǎn)生、鑒定它們的方法和組合物，和它們用于脂肪酸產(chǎn)生的應(yīng)用，以及包含這些組合物的有機(jī)體和表達(dá)這些組合物的有機(jī)體。文檔編號(hào)C12N15/53GK101827934SQ200780100540公開日2010年9月8日申請日期2007年10月31日優(yōu)先權(quán)日2007年7月13日發(fā)明者A·M·伯杰,G·S·吉魯阿德,H·瑞迪亞寧塔斯申請人:加拿大海洋營養(yǎng)食品有限公司