專利名稱：：將分子遞送到細(xì)胞的方法和載體復(fù)合物的制作方法將分子遞送到細(xì)胞的方法和載體復(fù)合物本申請是2004年5月3日提交的名稱為"將分子遞送到細(xì)胞的方法和載體復(fù)合物"的第200480011701.X號發(fā)明專利申請的分案申請。本申請要求于2003年5月1日提交的序列號為60/467,516的美國臨時(shí)申請的優(yōu)先權(quán)。序列號為60/467,516的美國臨時(shí)申請的說明書的全部內(nèi)容以引用方式結(jié)合于本文。本發(fā)明系在批準(zhǔn)號為P01-DA-08924的來自國家藥物濫用研究所的政府支持下完成的。美國汪支府對本發(fā)明擁有一定權(quán)利。
背景技術(shù)：
：生物細(xì)胞對于被允許穿過細(xì)胞膜的分子通常是高選擇性的。因此，將例如小分子和生物分子這樣的化合物遞送(或運(yùn)送)進(jìn)入細(xì)胞，通常受限于該化合物的物理性質(zhì)。該小分子和生物分子可以是，例如，具有藥物活性的化合物。這樣的分子(包括大分子，如蛋白質(zhì)和核酸)在體內(nèi)一皮遞送至細(xì)胞內(nèi)的不足，已經(jīng)成為大量潛在有效的化合物在治療、預(yù)防和/或診斷中的應(yīng)用的障礙。此外，因?yàn)樵隗w內(nèi)缺乏將化合物有效地遞送到細(xì)胞內(nèi)的能力，許多在體外看來很有前途的化合物已經(jīng)作為潛在的藥物而祐j改棄了。許多報(bào)導(dǎo)都已提及通過共價(jià)地將化合物附著到"蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)閾，，(PTDs)而^l尋4b合物遞送至細(xì)月包的問題。Schwarze等(7>e"d尸/mv^7co/2000;21:45-8)禾口4受斗又纟會Dowdy的美國專矛J第6，221,355號披露了幾種能夠以濃度依賴性的方式穿過細(xì)胞的脂質(zhì)雙層的PTDs。所披露的PTDs包括來源于HIV-1tat蛋白、來源于由觸角足(簡寫為ANTP)基因編碼的果蠅同型轉(zhuǎn)錄因子、以及來源于單純皰滲病毒VP22轉(zhuǎn)錄因子的PTDs。HIV-1tatPTD的長度為十一個(gè)氨基酸，ANTPPTD的長度為十六個(gè)氨基酸，而VP22PTD的長度為34個(gè)氨基酸。然而，最近出版的資料顯示這些PTDs經(jīng)由能量依賴性的胞吞作用而進(jìn)入細(xì)胞。因此，"PTD-運(yùn)載物"復(fù)合物包括在細(xì)胞內(nèi)涵體的小泡內(nèi)，而不存在于例如細(xì)胞的胞質(zhì)。因此，該"PTD-運(yùn)載物"復(fù)合物必需/人內(nèi)涵體的小泡釋放，以^f更具有生物活性(Richardetal.,J腸/.C72亂2003;278:585-590;Drinetal.,J腸/.CTz簡.2003;278:31192-31201)。此外，最近的報(bào)導(dǎo)表明PTDs對細(xì)胞是有毒性的。因此，需要有能夠以不依賴能量的非胞吞方式穿過細(xì)胞的脂質(zhì)膜的肽。此外，為了避免通常周知的對較大的肽的免疫反應(yīng)，需要有專交小的、耐肽酶的肽。最后，所述肽載體對于細(xì)胞沒有毒性，這也是很重要的。
發(fā)明內(nèi)容通過本發(fā)明提供的一種用于將分子遞送到細(xì)胞的方法，從而滿足了這些要求。本方法包括將載體復(fù)合物與所述細(xì)胞接觸，其中該載體復(fù)合物包括所述分子和芳香族陽離子肽，并且其中該芳香族陽離子肽包括(a)至少一個(gè)凈正電荷；(b)最少三個(gè)氨基酸；(c)最多十個(gè)氨基酸；(d)凈正電荷的最小數(shù)目(Pm)與氨基酸殘基的總數(shù)(r)之間的關(guān)系為，其中3pm是小于或者等于r+l的最大數(shù)；以及(e)芳香基團(tuán)的最小數(shù)目(a)與凈正電荷的總數(shù)(pt)之間的關(guān)系為，其中3a是小于或者等于pt+l的最大數(shù)，除非當(dāng)a為l時(shí)，pt也可以為1。在另一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種載體復(fù)合物，該載體復(fù)合物包括分子和芳香族陽離子肽，其中芳香族陽離子肽包括(a)至少一個(gè)凈正電荷；(b)最少三個(gè)氨基酸；(c)最多十個(gè)氨基酸；(d)凈正電荷的最小數(shù)目(pm)與氨基酸殘基的總數(shù)(r)之間的關(guān)系為，其中301是小于或者等于『+1的最大數(shù)；以及(e)芳香基團(tuán)的最小數(shù)目(a)與凈正電荷的總數(shù)(pt)之間的關(guān)系為，其中3&是小于或者等于^+1的最大數(shù)，除非當(dāng)a為l時(shí)，pt也可以為1。在另一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明4是供了一種用于將分子遞送至細(xì)胞的方法。該方法包括將分子和芳香族陽離子肽與細(xì)胞接觸，其中該芳香族陽離子肽包括(a)至少一個(gè)凈正電荷；(b)最少三個(gè)氨基酸；(c)最多十個(gè)氨基酸；(d)凈正電荷的最小數(shù)目(pm)與氨基酸殘基的總數(shù)(r)之間的關(guān)系為，其中3pm是小于或者等于r+l的最大數(shù)；以及(e)芳香基團(tuán)的最小數(shù)目(a)與凈正電荷的總數(shù)(pt)之間的關(guān)系為，其中3a是小于或者等于pt+l的最大數(shù)，除非當(dāng)a為l時(shí)，pt也可以為1。圖1.Caco-2細(xì)胞內(nèi)肽的攝取。[3H]〖Dm。DALDA(A)和[14C]Gly-Sar(B)的才聶耳又的時(shí)間過程。在37。C或者4。C下，Caco-2細(xì)胞與[3H][Dm。DALDA(250nM,47Ci/mmo1)或者['4C]Gly-Sar(50juM,56.7mCi/mmol)孵育1小時(shí)。隨后在溶解后的細(xì)胞中測定放射性。(C)將[3H][Dmt"DALDA的積聚物進(jìn)行酸洗的結(jié)果。Caco-2細(xì)胞與[3H][Dm—]DALDA在37。C下孵育1小時(shí)。在細(xì)胞溶解前，對細(xì)胞進(jìn)行酸洗，以便去除與細(xì)胞表面結(jié)合的放射性(物質(zhì))。(D)[Dm]DALDA的濃度對[Dm。DALDA攝取的影響。細(xì)胞在37。C下與一定濃度范圍(1jaM-3mM)的[Dm—]DALDA孵育1小時(shí)。所有的數(shù)據(jù)用三個(gè)獨(dú)立單層的平均數(shù)±S.E.表示。其中誤差棒(errorbar)不明顯，它們比才示i己纟且更小。圖2.pH和DEPC對Caco-2細(xì)胞內(nèi)[3H][Dm。DALDA(A和C)和["C]Gly-Sar(B和D)的攝取的影響。在37。C和不同pH條件下將Caco-2細(xì)月包與[3H][Dm。DALDA(250nM,47Ci/mmol)或[14C〗Gly-Sar(50pM,56.7mCi/mmol)聘育1小時(shí)(A和B)。在37°C下將細(xì)胞與[3H][Dmt!]DALDA(250nM,47Ci/mmol)或[14C]Gly-Sar(50juM,56.7mCi/mmol)孵育1小時(shí)(C和D)之前，在25。C將細(xì)胞與0.2mMDEPC預(yù)先賻育10分鐘。所有的數(shù)據(jù)用三個(gè)獨(dú)立的單層的平均數(shù)土S.E.表示。圖3.(A)[3H][Dmt"DALDA在不同的細(xì)胞系中的攝取。在37。C將細(xì)胞與[3H][Dm。DALDA(250nM,47Ci/mmol)孵育1小時(shí)。在細(xì)胞溶解前，將細(xì)胞酸洗，以便除去細(xì)月包表面結(jié)合的放射性。數(shù)據(jù)顯示了代表耐酸的放射性，并且用三個(gè)獨(dú)立的單層的平均數(shù)±S.E.表示。(B)[3H][Dm。DALDA與細(xì)胞膜的特異性結(jié)合。在25。C將從SH-SY5Y纟田胞和Caco-2纟田胞制備的細(xì)胞膜與[3H][Dm一]DALDA(15-960pM)孵育1小時(shí)。通過l(iM未標(biāo)記的[Dmt"DALDA的包含物評估非特異性結(jié)合。通過快過濾將游離的放射性配體與結(jié)合的放射性配體分離。沒有看到與Caco-2細(xì)胞的特異性結(jié)合。對于SH-SY5Y纟田胞，《d值是118pM(范圍是87-149)，而5max值是96fmol/mg蛋白質(zhì)。圖4.(A)[3H][Dmt!]DALDA(填充柱)和["C]Gly-Sar(空心柱)的泄漏。在37。C或4。C用[3H][Dm。DALDA(250nM,47Ci/mmol)或["C]Gly-Sar(50jiM，56.7mCi/mmol)3夸Caco畫2細(xì)月包預(yù)先加載1小時(shí)。隨后用培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞，并在37。C或4。C與培養(yǎng)基孵育1小時(shí)。在培養(yǎng)基和細(xì)胞溶解產(chǎn)物中均測定放射性，而數(shù)據(jù)用泄漏入培養(yǎng)基中的肽的百分?jǐn)?shù)表示。(B)DEPC對[3H][Dmt"DALDA泄漏的影響。在用[3H][Dm。DALDA加載前，在25。C將細(xì)胞與0.2mMDEPC預(yù)先孵育10分鐘。(C)異搏定，一種/-糖蛋白抑制劑，對[3H][Dm—]DALDA的泄漏(C)和攝取(D)的影響。圖5.[3H][DmP]DALDA和["C]Gly-Sar穿過Caco-2單層的轉(zhuǎn)運(yùn)。將Caco-2細(xì)胞(2x105)接種在轉(zhuǎn)孔細(xì)胞培養(yǎng)容器內(nèi)的多微孔膜上。通過將[3H][Dm。DALDA或者["C]Gly-Sar加入到頂部隔間來測定肽從頂部到底側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)，并且在加入肽后的不同時(shí)間將20卞1等分試樣從頂部和底側(cè)隔間移出，以便測定》文射性。圖6.[Dmt、dnsDap4]DALDA和[Dmt、atnDap4]DALDA白勺纟田月包才聶取。在37。C將Caco-2細(xì)胞與0.1|iM[Dmt、dnsDap4]DALDA孵育15分鐘。隨后用PBS沖洗和覆蓋細(xì)胞。在室溫下10分鐘內(nèi)進(jìn)行顯微鏡觀察。在340nm進(jìn)行激發(fā)，在520nm測量發(fā)射。出現(xiàn)的熒光擴(kuò)散到整個(gè)細(xì)胞質(zhì)，但是完全排除在細(xì)胞核外。在37。C小泡濃度的缺乏表明非內(nèi)吞性攝取。圖7.三種肽與交聯(lián)劑SMCC結(jié)合的質(zhì)譜分析確認(rèn)。將SMCC(ljLig)和肽(5pg)—起溶解在2mlPBS中、在室溫下孵育30分鐘、然后在4t:貯存。將所述樣品的等分試樣與基質(zhì)(50%的乙腈中々包和的3-羥基吡咬羧酸(HPA)，10mg/ml的牙寧4蒙酸4妄)以1:10的比率混合，然后將其點(diǎn)樣在不銹鋼的靶向平板(targetplate)上。通過基質(zhì)輔助的激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜分析(MALDI-TOFMS)分析樣品。所述肽和它們各自的SMCC結(jié)合物的分子量顯示在質(zhì)i普圖上。圖8.肽增加j3-半乳糖苷酶(J3-Gal)被攝取入N2A神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的能力。將細(xì)胞(N2A神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞或Caco-2)平鋪在96孔板內(nèi)(2x104個(gè)細(xì)胞/孔)，隨后在37。C將細(xì)胞與(3-半乳糖苷酶或與肽結(jié)合(經(jīng)由SMCC)的(3-半乳糖苷酶孵育1小時(shí)。然后用磷酸鹽緩沖液將細(xì)胞洗4次。隨后在37。C用P-半乳糖苷酶染色系統(tǒng)(Roche)將細(xì)胞染色至少2小時(shí)，隨后在顯孩i鏡下才企查。(A)當(dāng)Caco-2細(xì)胞與P-半乳糖苷酶孵育時(shí)，沒有觀察到P-半乳糖苷酶的攝取。(B)藍(lán)色細(xì)胞的存在表明Caco-2細(xì)胞內(nèi)與[Dm。DALDA共軛結(jié)合的P-半乳糖苦酶的攝取。(C)Caco-2細(xì)胞內(nèi)與[右旋精氨酸-011^-賴氨酸-苯丙氨酸-^2]結(jié)合的(3-半乳糖苷酶的攝取增加。(D)Caco-2細(xì)胞內(nèi)與[Phe"DALDA結(jié)合的(3-半乳糖苷酶的攝取增力口。(3-半乳糖苷酶與單獨(dú)的SMCC的結(jié)合沒有增加攝取。圖9.與[Dm。DALDA-SMCC共輒結(jié)合物的共同孵育增加了綠色熒光蛋白(GFP)進(jìn)入Huh7細(xì)胞的攝取。用DMEM沖洗Huh7細(xì)胞(1x106個(gè)細(xì)萬包/孔)，隨后在37。C將細(xì)月包與0.5mlDMEM孵育60分鐘，該DMEM:僅包含3pgGFP(A);包含3pgGFP和40jul[Dm。DALDA(B);或者包含3pgGFP和與SMCC共4厄結(jié)合的[Dm。DALDA(C)。隨后將2ml細(xì)胞培養(yǎng)基加入到細(xì)胞中，并且將其在細(xì)胞孵育器中孵育額外的24小時(shí)。孵育后，在細(xì)胞培養(yǎng)基中將細(xì)胞沖洗四次，隨后通過激光共聚焦掃描顯微鏡觀察保留在活細(xì)月包中的GFP。在340nm處進(jìn)4亍激發(fā)，而在520nm處測量發(fā)射。頂部的板塊代表通過Huh7細(xì)胞的0.8nm厚的中部的水平光學(xué)部分的GFP的圖像。底部的板塊代表同一區(qū)域內(nèi)的不同界面的對比圖像。圖10.[Dmt"DALDA與RNAj氐聚物的共車厄結(jié)合。利用Y_32P_ATP和多聚核苷酸激酶在5'末端將合成的RNA低聚物(長度為40個(gè)核苷酸)磷酸化。通過凝膠電泳將產(chǎn)物純化。在lmgEDC(N-[3-二曱基氨基丙基-N，-乙基碳酰亞胺])存在時(shí)，500,000cpm凝膠-純化的RNA低聚物與[Dm。DALDA共扼結(jié)合。將共扼反應(yīng)的產(chǎn)物([Dm。DALDA-RNA低聚物)與單獨(dú)的RNA低聚物在15%的聚丙烯酰胺基脲凝月交上分析。圖11.[Dm—]DALDA-[32p]RNA低聚物的共軛結(jié)合物被攝取入Caco-2纟田胞。將Caco-2細(xì)胞(1xio6)在DMEM培養(yǎng)基中洗三次，并且在DMEM中預(yù)先孵育5分鐘。隨后，將細(xì)月包與[Dm。DALDA-["P]RNA低聚物的共軛結(jié)合物或?qū)φ誖NA(接近20,000cpm)在37。C孵育60分鐘。孵育后，沖洗、溶解細(xì)胞，并且測定細(xì)胞溶解產(chǎn)物中的放射性。[DmP]DALDA-["P]RNA共軛結(jié)合物的ii取與單獨(dú)的RNA的攝取相比高(〉)三倍多(圖11)。圖12.肽-SMCC共軛結(jié)合物對增加RNA低聚物被攝取入Huh7細(xì)胞的影響。(A)時(shí)間對細(xì)胞攝取RNA低聚物的影響。用DMEM沖洗Huh7細(xì)胞(1x106個(gè)細(xì)胞/孔)，隨后在37。C將該細(xì)胞與l.OmlDMEM將育15或60分鐘，該DMEM中包含單獨(dú)的[32p]RNA4氐聚物(單鏈，11個(gè)石咸基，~lOO,OOOcpm)，或者包含[3￥]脂八低聚物和40jul[Dmt']DALDA-SMCC共輒結(jié)合物。隨后將細(xì)胞在DMEM中洗四次，并且在醋酸鈉溶液中洗一次，以1更將其在溶解緩沖液中孵育30分鐘之前除去非特異性結(jié)合，隨后測定保留的放射性。RNA低聚物與[Dm。DALDA-SMCC在37。C共同孵育提高了RNA低聚物的攝耳又，在15分鐘的孵育后提高了10倍，在60分鐘的孵育后提高了20倍。(B)溫度對細(xì)胞才聶取脂A4氐聚物的影響。4。C時(shí)[Dm]DALDA-SMCC提高認(rèn)A攝取的能力更小，雖然它仍將4聶取增加了10倍。(C)借助不同的肽-SMCC共軛結(jié)合物增加細(xì)胞對RNA的才聶取。用DMEM沖洗Huh7細(xì)胞(1x106個(gè)細(xì)胞/孔)，隨后在37。C將該細(xì)胞與1.0mlDMEM孵育15分鐘，該DMEM中包含單獨(dú)的["P]RNA低聚物，或者包含["P]RNA低聚物和40ml肽-SMCC共輒結(jié)合物。全部三種肽-SMCC共專厄結(jié)合物均增加了RNA的攝取。圖13.與[Dm一]DALDA-SMCC共舉厄結(jié)合物的共同孵育增力口了兩種不同長度的RNA的攝取。將[Dm。DALDA與SMCC共軛結(jié)合，并通過質(zhì)i普分析確認(rèn)。在室溫下將11-merRNA〗氐聚物和1350-merRNA與[Dmt"DALDA-SMCC共扼結(jié)合物混合15分鐘。用DMEM沖洗Huh7細(xì)胞(1x106個(gè)細(xì)胞/孔)，隨后在37。C和5%C02下將該細(xì)胞與lmlDMEM孵育60分鐘，該DMEM中包含單獨(dú)的RNA(~100,000cpm),或者包含與[Dm一]DALDA-SMCC共軛結(jié)合物混合的RNA。隨后將細(xì)月包在DMEM中洗四次，并且在醋酸鈉溶液中洗一次，以〗更除去非特異性結(jié)合。將沖洗后的細(xì)胞在溶解緩沖液中孵育30分鐘，隨后對保留的放射性計(jì)數(shù)。相較于與單獨(dú)的RNA將育，與[Dm。DALDA-SMCC共軛結(jié)合物的共同孵育增加了11-merRNA的才聶取達(dá)22倍，而增加了1350-merRNA的4聶耳又達(dá)3倍。圖14.DNA^氐聚4勿與[Dm]DALDA的共扼結(jié)合。將SMCC(l|ig)和[Dm。DALDA(5pg)—起溶解在2mlPBS中、在室溫下孵育30分鐘、隨后在4。C與去保護(hù)的3'-碌u醇基DNA低聚物混合24小時(shí)。孵育后，將樣品的等分試樣與基質(zhì)(50%的乙腈中飽和的3-羥基吡咬羧酸(HPA)，10mg/ml的種檬酸銨)以1:10的比率混合，并且將其點(diǎn)樣在不銹鋼的耙向平板上。通過MALDI-TOFMS分析樣品(A)。已發(fā)現(xiàn)3，-碌l醇基DNA^f氐聚物和[Dmt']DALDA-DNA共價(jià)復(fù)合物的分子量分別為6392和7171。在與多聚核苷酸激酶的反應(yīng)中，利用y-32P-ATP將位于5，-末端的共軛結(jié)合和非共軛結(jié)合的低聚物磷酸化，而激酶反應(yīng)的產(chǎn)物在15%的聚丙烯酰胺脲凝膠上分析，并且#皮凝月交-純化，用于細(xì)胞4聶取研究(B)。圖15.與[Dm。DALDA共軛結(jié)合的DNA低聚物的細(xì)胞才聶耳又。利用SMCC將3，-石危醇4奮飾的20-基體DNA共扼結(jié)合到[Dm。DALDA上，并且通過質(zhì)譜分析確認(rèn)共軛結(jié)合物的形成。用32P將共軛結(jié)合和非共軛結(jié)合的DNA低聚物在其5，-末端用放射性同^f立素才示^己，并;疑月交一提純。用DMEM沖洗4申經(jīng)N2A(1x106個(gè)細(xì)胞/孔)細(xì)胞，然后在37。C和5%C02的條件下將該細(xì)胞與lmlDMEM聘育2小時(shí)或19小時(shí)，該DMEM中包含有或沒有與DNA低聚物(~100,000cpm)共軛結(jié)合的[Dm。DALDA。然后將細(xì)胞在DMEM中沖洗四次，在醋酸鈉卩容液中沖洗一次，以l更除去非特異性結(jié)合。隨后將所述細(xì)月包在溶解緩沖液中孵育30分鐘，隨后確定保留的放射性。Y-軸表示DNA的攝取，用總放射性的百分?jǐn)?shù)表示。圖16.[Dm。DALDA對培養(yǎng)的細(xì)胞是沒有毒性的。將神經(jīng)N2A細(xì)胞與[Dm一]DALDA(InM到lOpM)孵育，并且通過MTT實(shí)—驗(yàn)測定細(xì)胞的生存能力。圖17.[Dmt']DALDA-SMCC共輒結(jié)合物沒有在Huh7細(xì)胞中引起凋亡。將Huh7細(xì)胞(1x106個(gè)細(xì)胞/孔)在DMEM中沖洗三次，并且力口入lml新鮮的培養(yǎng)基。隨后，將50jilPBS中[Dm一]DALDA-SMCC共輒結(jié)合物(lmM)或<又PBS(對照)加入到所述細(xì)胞培養(yǎng)基中，并且在37。C和5%C02的條件下孵育24小時(shí)。孵育后，將1^1可以使凋亡的細(xì)胞核染色的Hoechst染料加入到細(xì)胞中，并且孵育額外的15分鐘。通過用細(xì)胞培養(yǎng)基(不含pH指示劑)沖洗細(xì)胞除去過多的Hoechst染料，然后利用熒光顯樣t鏡(在350nm處激發(fā)，而在461nm處測量發(fā)射)比壽交經(jīng)[Dm。DALDA-SMCC共扼結(jié)合物處理的細(xì)胞和對照細(xì)月包。具體實(shí)施方式本發(fā)明基于發(fā)明人的令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，該發(fā)現(xiàn)為包括至少一個(gè)分子和芳香族陽離子肽的一些載體復(fù)合物能夠以不依賴能量的斗幾制穿過細(xì)胞膜，并且將該分子遞送到細(xì)胞內(nèi)。芳香族陽離子肽本發(fā)明中所用的芳香族陽離子肽具有如下所述的凈正電荷，是水溶性和高極性的。該肽包括最少三個(gè)氨基酸，優(yōu)選包括最少四個(gè)氨基酸，通過肽4建共價(jià)連接。該芳香族陽離子肽中存在的氨基酸的最大數(shù)目是十個(gè)，優(yōu)選約八個(gè)，最優(yōu)選約六個(gè)。最佳地，該肽中存在的氨基酸的數(shù)目是約四個(gè)。用于限定氨基酸的最大數(shù)目的術(shù)語"約"是指增加或者減少一個(gè)氨基酸。本發(fā)明中所用的芳香族陽離子肽的氨基酸可以是任何氨基酸。正如本文中所使用的，術(shù)語"氨基酸"指的是包括至少一個(gè)氨基和至少一個(gè)羧基的任何有機(jī)分子。優(yōu)選地，至少一個(gè)氨基位于相對于羧基的a位。該氨基酸可以是天然存在的。天然存在的氨基酸包括，例如，通常存在于蛋白質(zhì)中的二十種最常見的氨基酸，即，丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷胺酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、異亮氨酸(Ileu)、亮氨酸(Leu)、賴氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、以及纈氨酸(Val)。其它天然存在的氨基酸包括，例如，在與蛋白質(zhì)合成無關(guān)的代謝過程中合成的氨基酸。例如，在產(chǎn)生尿的過程中哺乳動物代謝合成的氨基酸鳥氨酸。本發(fā)明所用的芳香族陽離子肽可選地包4舌一個(gè)或多個(gè)非天然存在的氨基酸。在一個(gè)具體實(shí)施例中，該肽沒有天然存在的氨基酸。非天然存在的氨基酸是這樣的氨基酸，其通常不在生物機(jī)體的正常代i射過程中合成，并且不天然存在于蛋白質(zhì)中。此外，本發(fā)明中所用的非天然存在的氨基酸優(yōu)選不被常見的蛋白酶所識別。因此，非天然存在的氨基酸優(yōu)選對常見的蛋白酶有抗性，并且更優(yōu)選對常見的蛋白酶不敏感。非天然存在的氨基酸可以存在于該肽的任何位置。例如，非天然存在的氨基酸可以在N-末端、C-末端、和/或N-末端和C-末端之間的4壬4可一個(gè)或多個(gè)4立置。舉例來說，非天然存在的氨基酸可以包括烷基、芳基、或者烷芳基。烷基氨基酸的一些實(shí)例包括oc-氨基丁酸、氨基丁酸、Y-氨基丁酸、5-氨基戊酸、以及s-氨基己酸。芳基氨基酸的一些實(shí)例包括鄰-、間-、以及對-氨基苯甲酸。烷芳基氨基酸的一些實(shí)例包括鄰-、間-、以及對-氨基苯乙酸，以及Y-苯基-P-氨基丁酸。非天然存在的氨基酸還包括天然存在的氨基酸的衍生物。天然存在的氨基酸的衍生物可以包括，例如，在天然存在的氨基酸上添加一個(gè)或多個(gè)化學(xué)基團(tuán)。例如，一個(gè)或多個(gè)^f匕學(xué)基團(tuán)可以^皮添加到苯丙氨酸或酪氨酸殘基的芳香環(huán)的2，、3，、4，、5，、或6'位置中的一個(gè)或多個(gè)，或者色氨酸殘基的苯并環(huán)的4'、5，、6，、或7，位置中的一個(gè)或多個(gè)。該基團(tuán)可以是能被添加到芳香環(huán)上的任何化學(xué)基團(tuán)。這樣的基團(tuán)的一些實(shí)例包括支鏈的或直鏈的C廣C4烷基，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、丁基、異丁基、或叔丁基、C廠C4烴氧基(即烷氧烷)、氨基、C廣C4烷基胺(例如，甲胺基)以及C廠Ct二烷基胺(例如，二甲胺基)、硝基、羥基、卣素(即，氟、氯、溴、或碘)。天然存在的氨基酸的非天然存在的衍生物的一些特殊實(shí)例包括正纈氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nk)、以及羥脯氨酸(Hyp)。本發(fā)明所用的肽中的氨基酸的<務(wù)飾的另一實(shí)例是該肽中的天冬氨酸或者谷氨酸殘基的羧基的衍生作用(衍生化)。衍生作用的一個(gè)實(shí)例是用氨或者用伯胺或仲胺，例如，曱胺、乙胺、二甲胺或二乙胺，進(jìn)行氨基化。衍生作用的另一實(shí)例包括利用，例如，曱醇或乙醇，進(jìn)4亍酯化作用。另一種這樣的修飾包括賴氨酸、精氨酸或組氨酸殘基的氨基的修飾。例如，這樣的氨基可以被?；Ｒ恍┖线m的?；ǎ?，包括任何上述d-C4烷基的苯曱?；蛲轷；?，如乙?；虮；?。非天然存在的氨基酸通常可以是左旋型(L-)、右旋型(D-)、或者其混合物。合適的非天然存在的氨基酸的實(shí)例還包括上述任何天然存在的L-氨基酸的右旋(D-)型，以及L-和/或D-非天然存在的氨基酸。在這點(diǎn)上，應(yīng)該注意雖然已發(fā)現(xiàn)D-氨基酸存在于某些肽類抗生素中(該肽類抗生素是利用除細(xì)胞的正常核4唐體蛋白合成器以外的方式合成的)，^旦是它們通常不存在于蛋白中。用于此處時(shí)，這樣的D-氨基酸指的是非天然存在的氨基酸。為了使對蛋白酶的敏感性最小，本發(fā)明中所用的肽應(yīng)該具有少于五個(gè)，〗尤選少于四個(gè)，更^尤選少于三個(gè)，以及最4尤選i也少于兩個(gè)相鄰的能被常見蛋白酶識別的L-氨基酸，而不管這些氨基酸是天然存在的或是非天然存在的。在一個(gè)具體實(shí)施例中，該肽〗義有D-氨基酸，而沒有L-氨基酸。如果該肽包含對蛋白酶敏感的氨基酸序列，那么氨基酸中至少有一個(gè)優(yōu)選為非天然存在的D-氨基酸，由此l吏其具有蛋白酶抗性。又于蛋白酶壽丈感的序列的實(shí)例包4舌能夠#皮常見的蛋白酶，如肽《連內(nèi)切酶和胰蛋白酶，切開的兩個(gè)或多個(gè)相鄰的石威性氨基酸。堿性氨基酸的實(shí)例包括精氨酸、賴氨酸及組氨酸。在生理pH下，相較于芳香族陽離子肽中氨基酸殘基的總數(shù)，該肽具有最小數(shù)目的凈正電荷，這是很重要的。生理pH下，凈正電荷的最小數(shù)目下文中表示為(Pm)。該肽中氨基酸殘基的總數(shù)表示為(r)。下述的凈正電荷的最小數(shù)目均是在生理pH下。這里所用的術(shù)語"生理pH，，指的是哺乳動物機(jī)體的組織和器官的細(xì)胞內(nèi)的正常pH。例如，人類的生理pH正常時(shí)4妾近7.4,〗旦哺乳動物的正常生理pH可以是/人約7.0到約7.8的4壬何pH。這里所用的"凈電荷"指的是存在于該肽中的氨基酸所攜帶的正電荷的^:目與負(fù)電荷的凄t目的差^f直。在本it明書中，可以理解為凈電荷是在生理pH下測定的。在生理pH下具有正電荷的天然存在的氨基酸包括L-賴氨酸、L-精氨酸、以及L-組氨酸。在生理pH下具有負(fù)電荷的天然存在的氨基酸包括L-天冬氨酸和L-谷氨酸。通常，肽具有帶正電荷的N-末端氨基和帶負(fù)電荷的C-末端羧基。在生理pH下該電荷互相4氏消。作為計(jì)算凈電荷的實(shí)例，肽-.酪氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-谷氨酸-組氨酸-色氨酸-精氨酸(Tyr-Arg-Phe-Lys-Glu-His-Trp-Arg)具有一個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸(即谷氨酸)和四個(gè)帶正電荷的氨基酸(即，兩個(gè)精氨酸殘基，一個(gè)賴氨酸，以及一個(gè)組氨酸)。因此，上述肽具有三個(gè)凈正電荷。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，該芳香族陽離子肽在生理pH下的凈正電荷的最小數(shù)目(pm)與氨基酸殘基的總數(shù)(r)之間的關(guān)系為其中3pm是小于或等于r+1的最大數(shù)。在這個(gè)具體實(shí)施例中，凈正電荷的最小數(shù)目(pm)與氨基酸殘基的總數(shù)(r)之間的關(guān)系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>在另一具體實(shí)施例中，該芳香族陽離子肽在凈正電荷的最小數(shù)目(pm)與氨基酸殘基的總數(shù)(r)之間的關(guān)系為其中2pm是小于或等于r+l的最大數(shù)。在這個(gè)具體實(shí)施例中，凈正電荷的最小數(shù)目(pm)與氨基酸殘基的總數(shù)(r)之間的關(guān)系如下(<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>在一個(gè)具體實(shí)施例中，凈正電荷的數(shù)目(pm)與氨基酸殘基的數(shù)目(r)相等。在另一優(yōu)選的具體實(shí)施例中，該肽具有三個(gè)或四個(gè)氨基酸殘基以及最少一個(gè)凈正電荷，優(yōu)選為最少兩個(gè)凈正電荷，以及更優(yōu)選地，最少三個(gè)凈正電荷。芳香族陽離子肽具有相較于凈正電荷總數(shù)(Pt)的最小數(shù)目的芳香基，這也是重要的。芳香基的最小數(shù)目在下文表示為(a)。具有芳香基的天然存在的氨基酸包括這些氨基酸組氨酸、色氨酸、酪氨酸、以及苯丙氨酸。例如，六肽賴氨酸-谷胺酰胺-酪氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-色氨酸具有兩個(gè)凈正電荷(由賴氨酸和精氨酸殘基提供)和三個(gè)芳香基(由酪氨酸、苯丙氨酸及色氨酸殘基提供)。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明的方法中所用的芳香族陽離子肽在芳香基的最小數(shù)目(a)與生理pH下凈正電荷的總數(shù)(pt)之間的關(guān)系為其中3a是小于或等于pt+l的最大數(shù)，除非當(dāng)pt為1時(shí)，a也可以為1。在這個(gè)具體實(shí)施例中，芳香基的最小數(shù)目(a)與凈正電荷的總數(shù)(pt)之間的關(guān)系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>在另一具體實(shí)施例中，該芳香族陽離子肽在芳香基的最小數(shù)目(a)與凈正電荷的總數(shù)(pt)之間的關(guān)系為其中2a是小于或等于pt+l的最大數(shù)。在這個(gè)具體實(shí)施例中，芳香族氨基酸殘基的最小數(shù)目(a)與凈正電荷的總數(shù)(pt)之間的關(guān)系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>在另一具體實(shí)施例中，芳香基的數(shù)目(a)與凈正電荷的總數(shù)(Pt)相等。歡基，尤其是C-末端氨基酸的末端羧基，優(yōu)選用，例如，氨來酰胺化以形成C-末端酰胺?？蛇x地，C-末端氨基酸的末端羧基可以被伯胺或仲胺酰胺化。該伯胺或仲胺可以是，例如，烷基，尤其是支鏈或直鏈的d-C4烷基，或芳基胺。相應(yīng)的，該肽的C-末端的氨基酸可以轉(zhuǎn)變?yōu)轷０坊?、N-甲基酰胺基、N-乙基酰胺基、N，N-二甲基酰胺基、N，N-二乙基酰胺基、N-甲基-N-乙基酰胺基、N-苯基酰胺基或者N-苯基-N-乙基酰胺基。另夕卜，具有多于一個(gè)羧基的氨基酸殘基(例如，天冬酰胺殘基、谷胺酰胺殘基、天冬氨酸殘基及谷氨酸殘基)的自由羧基基團(tuán)，無論其存在于任何位置，也可以被酰胺化。在這些部位的酰胺化作用可以利用氨或上述任^f伯胺或仲胺進(jìn)4亍。在一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明的方法中所用的芳香族陽離子肽是具有兩個(gè)凈正電荷和至少一個(gè)芳香族氨基酸的三肽。在一具體實(shí)施例中，本發(fā)明的方法中所用的芳香族陽離子肽是具有兩個(gè)凈正電荷和兩個(gè)芳香力矣氨基酸的三肽。本發(fā)明的方法中所用的芳香族陽離子肽包括4旦不限于下述肽的實(shí)例賴氨酸-右"走4青氨酸-酪氨酸-NH2,苯丙氨酸-右旋精氨酸-組氨酸，右旋酪氨酸-色氨酸-賴氨酸-NH2，色氨酸-右旋賴氨酸-酪氨酸-精氨酸-NH2，酪氨酸-組氨酸-右^走甘氨酸-甲好u氨酸，苯丙氨酸-精氨酸-右旋組氨酸-天冬氨酸，酪氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-谷氨酸-NH2,曱硫氨酸-酪氨酸-右旋賴氨酸-苯丙氨酸-精氨酸，右旋組氨酸-谷氨酸-賴氨酸-酪氨酸-右旋苯丙氨酸-精氨酸，賴氨酸-右旋谷胺酰胺-酪氨酸-精氨酸-右旋苯丙氨酸-色氨酸-NH2,苯丙氨酸-右旋精氨酸-賴氨酸-色氨酸-酪氨酸-右旋精氨酸-組氨酸，甘氨酸-右旋苯丙氨酸-賴氨酸-酪氨酸-組氨酸-右旋精氨酸-酪氨酸-麗2，纈氨酸-右旋賴氨酸-組氨酸-酪氨酸-右旋苯丙氨酸-絲氨酸-酪氨酸4青氨酸-NH2，色氨酸-賴氨酸-苯丙氨酸-右旋天冬氨酸-精氨酸-酪氨酸-右旋組氨酸-賴氨酸，賴氨酸-色氨酸-右旋酪氨酸-精氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸-酪氨酸-右旋組氨酸-NH"蘇氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸-右旋組氨酸-苯丙氨酸-色氨酸-右^走組氨酸-賴氨酸，天冬氨酸-右旋色氨酸-賴氨酸-酪氨酸-右旋組氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-右旋甘氨酸-賴氨酸-NH2，右旋組氨酸-賴氨酸-酪氨酸-右旋苯丙氨酸-谷氨酸-右旋天冬氨酸-右旋組氨酸-右旋賴氨酸-精氨酸-色氨酸-NH2，以及丙氨酸-右旋苯丙氨酸-右旋精氨酸-酪氨酸-賴氨酸-右旋色氨酸-組氨酸-右旋酪氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸。在一個(gè)特別優(yōu)選的具體實(shí)施例中，芳香族陽離子肽具有的分子式為酪氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-NH2(為了方便用DALDA這個(gè)簡寫代表)。DALDA具有由氨基酸酪氨酸、精氨酸、和賴氨酸提供的三個(gè)凈正電荷，以及由氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸提供的兩個(gè)芳香基。DALDA中的酪氨酸可以是酪氨酸被修飾后的衍生物，如2',6，-二曱基酪氨酸，以便產(chǎn)生分子式為2，6，-Dmt-右旋精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-NH2(即，Dmt、DALDA)的化合物。其它經(jīng)修飾的酪氨酸衍生物包括2，-甲基酪氨酸(Mmt);N,2，,6，-三甲基酪氨酸(Tmt);以及2，-羥基-6，-甲基酪氨酸(Hmt)。在另一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施例中，位于DALDA的N-末端的氨基酸可以是苯丙氨酸或其衍生物。N-末端具有苯丙氨酸的芳香族陽離子肽的分子式苯丙氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-NH2(即，Phe^DALDA)。優(yōu)選的苯丙氨酸的衍生物包括2'-曱基苯丙氨酸(Mmp)、2'，6，-二甲基苯丙氨酸(Dmp)、N，2，,6，-三甲基苯丙氨酸(Tmp)、以及2，-羥基-6，-甲基苯丙氨酸(Hmp)。在另一個(gè)具體實(shí)施例中，Dm一-DALDA的氨基酸序列被重新排列，使Dmt不位于N-末端。這樣的芳香族陽離子肽的實(shí)例具有的分子式為右旋精氨酸-2，6，Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2。本文中提及的任何特定的肽，如那些上面提及的肽和下面提及的肽，例如，表1中4是及的肽，包括Dmt^DALDA、DALDA、Phe^DALDA、右旋精氨酸-2，6，Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2以及它們的衍生物可以進(jìn)一步包括功能類似物。如果該類似物與Dmt1-DALDA、DALDA、Phe^DALDA、或者右旋4青氨酸-2'6，Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2具有同樣的功能，那么這樣的肽被認(rèn)為是Dm一畫DALDA、DALDA、Phe丄-DALDA、或者右旋精氨酸-2，6，01111-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2的功能類々乂物。該類々乂物可以是，例如，Dm-DALDA、DALDA、Phe、DALDA、或者右^^青氨酸-2，6,Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2的取代變體，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被另外的氨基酸取代。Dmt-DALDA、DALDA、Phe、DALDA、或者右旋精氨酸-2，6，011^-賴氨酸-苯丙氨酸-^^的合適的取代變體包括保守的氨基酸^,代物。氨基酸可以才艮據(jù)其理化特性分組如下(a)非極性氨基酸丙氨酸(A)絲氨酸(S)蘇氨酸(T)脯氨酸(P)甘氨酸(G);(b)酸性氨基酸天冬酰胺(N)天冬氨酸(D)谷氨酸(E)谷胺酰胺(Q);(c)堿性氨基酸組氨酸(H)精氨酸(R)賴氨酸(K);(d)疏水氨基酸曱硫氨酸(M)亮氨酸(L)異亮氨酸(I)纈氨酸(V);以及(e)芳香族氨基酸苯丙氨酸(F)酪氨酸(Y)色氨酸(W)組氨酸(H)。肽中的氨基酸被同組的另外的氨基酸取代(替代)稱為保守取代。保守取代有助于保持原有肽的理化特性。相反，肽中的氨基酸被不同組的另外的氨基酸取代通常更有可能改變原有肽的理化特性。在本發(fā)明的實(shí)施中所用的類似物的實(shí)例包括，但不限于，表l和表2中所示的芳香族陽離子肽。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>2'6，Dmt右旋精氨酸苯丙氨酸賴氨酸半胱氨酸NH22'6，Dmt右旋精氨酸苯丙氨酸賴氨酸-NH(CH2)2.-NH-dnsNH22，6'Dmt右旋精氨酸笨丙氨酸賴氨酸-NH(CH2)2.-NH-atnNH22,6，Dmt右旋精氨酸苯丙氨酸dns賴氛酸NH22'6，Dmt右旋瓜氨酸苯丙氨酸賴氨酸NH22'6'Dmt右旋瓜氨酸苯丙氨酸AhpNH22'6'Dmt右旋精氨酸苯丙氨酸鳥氨酸NH22'6'Dmt右旋精氨酸苯丙氨酸DabNH22'6，Dmt苯丙氨酸DapNH22'6'Dmt右旋精氨酸苯丙氨酸Ahp(2-氨基庚酸)麗2Bio-2'6'Dmt右旋精氨酸苯丙氨酸賴氨酸NH23'5，Dmt右旋精氨酸苯丙氨酸賴氨酸NH23'5，Dmt右旋精氨酸苯丙氨酸鳥氨酸NH23'5'Dmt右旋精氨酸苯丙氨酸Dab3'5'Dmt右旋精氨酸苯丙氨酸Dap酪氨酸右旋精氨酸酪氨酸賴氨酸NH2酪氨酸右旋精氨酸酪氨酸烏氨酸酪氨酸右旋精氨酸酪氨酸Dab麗2酪氨酸右旋精氨酸酪氨酸DapNH22'6，Dmt右旋精氨酸酪氨酸賴氨酸NH22'6，Dmt右旋精氨酸酪氨酸鳥氨酸NHb2'6'Dmt右旋精氨酸酪氨酸DabNH22'6，Dmt右旋精氨酸酪氨酸DapNH22'6，Dmt右旋精氨酸2'6，Dmt賴氨酸NH22'6'Dmt右旋精氨酸2'6，Dmt鳥氨酸NH22'6'Dmt右旋精氨酸2'6，DmtDabNH22'6，Dmt右旋精氨酸2'6，DmtDapNH23'5'Dmt右^走^"氨酸3'5，Dmt精氨酸NH23'5，Dmt右旋精氨酸3'5，Dmt賴氨酸NH23,5,Dmt右旋精氨酸3'5'Dmt鳥氨酸NH23'5'Dmt右旋精氨酸3'5，DmtDabNH2酪氨酸右旋賴氨酸苯丙氨酸Dap麗2酪氨酸右旋賴氨酸苯丙氨酸精氨酸NH2酪氨酸右旋賴氨酸苯丙氨酸賴氨酸NH2酪氨酸右旋賴氨酸苯丙氨酸鳥氨酸麗22'6'Dmt右旋賴氨酸苯丙氨酸DabNH22'6，Dmt右旋賴氨酸苯丙氨酸DapNH22'6'Dmt右旋賴氨酸苯丙氨酸精氨酸瑪2'6，Dmt右旋賴氨酸苯丙氨酸賴氨酸NH23'5，Dmt右旋賴氨酸苯丙氨酸鳥氨酸麗23'5,Dmt右旋賴氨酸苯丙氨酸DabNH23,5，Dmt右旋賴氨酸苯丙氨酸Dap菌23'5，Dmt右旋賴氨酸苯丙氨酸精氨酸NH2酪氨酸右旋賴氨酸酪氨酸賴氨酸NH2酪氨酸右旋賴氨酸酪氨酸鳥氨酸簡2酪氨酸右3炎賴氨酸酪氨酸DabNH2酪氨酸右旋賴氨酸酪氨酸DapNH22，6'Dmt右旋賴氨酸酪氨酸賴氨酸NM22，6，Dmt右旋賴氨酸酪氨酸鳥氨酸NH22，6，Dmt右旋賴氨酸酪氨酸DabNH22'6，Dmt右旋賴氨酸酪氨酸DapNH22，6，Dmt右旋賴氨酸2'6，Dmt賴氨酸NH22'6，Dmt右3走賴氨酸2'6，Dmt鳥氨酸冊22，6'Dmt右旋賴氨酸2'6，DmtDabNH;22'6，Dmt右S走賴氨酸2'6，DmtDapNH22'6'Dmt右旋精氨酸苯丙氨酸dnsDapNH22'6'Dmt右旋精氨酸苯丙氨酸atnDapNH23'5，Dmt右旋賴氨酸3,5，Dmt賴氨酸NH23'5，Dmt右旋賴氨酸3'5'Dmt鳥氨酸麗23'5'Dmt右旋賴氨酸3,5'DmtDab麗23，5，Dmt右旋賴氨酸3'5'DmtDap麗2酪氨酸右旋賴氨酸苯丙氨酸精氨酸NH2酪氨酸右旋烏氨酸苯丙氨酸精氨酸NH2酪氨酸右旋Dab苯丙氨酸精氨酸NH2酪氨酸右旋Dap苯丙氨酸精氨酸NH22'6'Dmt右旋精氨酸苯丙氨酸精氨酸NH22，6，Dmt右旋賴氨酸苯丙氨酸精氨酸麗22'6，Dmt右旋烏氨酸苯丙氨酸精氨酸NH22,6，Dmt右旋Dab苯丙氨酸精氨酸NH23'5，Dmt右旋Dap苯丙氨酸精氨酸NH23'5，Dmt右旋精氨酸苯丙氨酸精氨酸NH23'5，Dmt右旋賴氨酸苯丙氨酸精氨酸NH23,5'Dmt右旋鳥氨酸苯丙氨酸精氨酸NH2酪氨酸右旋賴氨酸酪氨酸精氨酸NH2酪氨酸右旋鳥氨酸酪氨酸精氛酸NH2酪氨酸右旋Dab酪氨酸精氨酸NH2酪氨酸右旋Dap酪氨酸精氨酸NH22'6，Dmt右旋精氨酸2'6'Dmt精氨酸NH22,6，Dmt右旋賴氨酸2'6'Dmt精氨酸NH22'6'Dmt右旋鳥氨酸2'6'Dmt精氨酸NH22'6'Dmt右旋Dab2'6'Dmt精氨酸NH23'5，Dmt右旋Dap3'5'Dmt精氨酸雨23,5，Dmt右旋精氨酸3'5'Dmt精氨酸NH23'5，Dmt右旋賴氨酸3'5'Dmt精氨酸MH23'5，Dmt右旋鳥氨酸3'5'Dmt精氨酸NH2Mmt右旋精氨酸苯丙氨酸賴氨酸NH2Mmt右旋精氨酸苯丙氨酸鳥氨酸NH2Mmt右旋精氨酸苯丙氨酸Mmt右旋精氨酸苯丙氨酸Tmt右旋精氨酸苯丙氨酸Tmt右旋精氨酸苯丙氨酸Tmt右旋精氨酸苯丙氨酸Tmt右旋精氨酸苯丙氨酸Hmt右旋精氨酸苯丙氨酸Hmt右旋精氨酸苯丙氨酸Hmt右i是4fr氨酸苯丙氨酸Hmt右旋4青氨酸苯丙氨酸Mmt右旋賴氨酸苯丙氨酸Mmt右旋賴氨酸苯丙氨酸Mmt右旋賴氨酸苯丙氨酸Mmt右旋賴氨酸苯丙氨酸Mmt右旋賴氨酸苯丙氨酸Tmt右旋賴氨酸笨丙氨酸Tmt右旋賴氨酸苯丙氨酸Tmt右旋賴氨酸苯丙氨酸Tmt右旋賴氨酸苯丙氨酸Tmt右旋賴氨酸苯丙氨酸Hmt右旋賴氨酸苯丙氨酸Hmt右旋賴氨酸苯丙氨酸Hmt右旋賴氨酸苯丙氨酸Hmt右旋賴氨酸苯丙氨酸Hmt右旋賴氨酸苯丙氨酸Mmt右旋賴氨酸苯丙氨酸Mmt右旋鳥氨酸苯丙氨酸Mmt右旋Dab苯丙氨酸Mmt右旋Dap苯丙氨酸DabNH2Dap麗2賴氨酸NH2烏氨酸NH2DabNH2DapNH2賴氨酸NH2烏氨酸麗2DabNH2DapNH2賴氨酸NH2鳥氨酸NH2DabNH2DapNH2精氨酸NH2賴氨酸NH2鳥氨酸NH2DabNH2DapNH2精氨酸NH2賴氨酸NH2鳥氨酸NH2DabNH2DapNH2精氨酸NH2精氨酸NH2精氨酸NH2精氨酸NH2精氨酸NH2Mmt右旋精氨酸苯丙氨酸精氨酸NH2Tmt右旋賴氨酸苯丙氨酸精氨酸順2Tmt右旋鳥氨酸苯丙氨酸精氨酸NH2Tmt右旋Dab苯丙氨酸精氨酸NH2Tmt右旋Dap苯丙氨酸精氨酸NH2Tmt右旋精氨酸苯丙氨酸精氨酸NH2Hmt右旋賴氨酸苯丙氨酸精氨酸NH2Hmt右旋鳥氨酸苯丙氨酸精氨酸NH2Hmt右旋Dab苯丙氨酸精氨酸NH2Hmt右旋Dap苯丙氨酸精氨酸NH2Hmt右旋精氨酸苯丙氨酸精氨酸NH2Dab:二氨基丁酸Dap-二氨基丙酸Dmt二二曱基酪氨酸Mmt二2，-甲基酪氨酸Tmt-N，2，,6，-三甲基酪氨酸Hmt-2，-羥基，6，-甲基酪氨酸dnsDap-(3-丹石黃?；?L-a,p-二氨基丙酸atnDap二P-鄰氨基苯曱酰基-L-a,(3-二氨基丙酸Bk^生物素氨基酸位置i右旋精氨酸右旋精氨酸氨基酸位置2DmtDmt表2氨基酸位置3賴氨酸笨丙氨酸氨基酸位置4苯丙氨酸賴氨酸C-末端修飾NH2麗2右旋精氨酸苯丙氨酸賴氨酸DmtNH2右旋精氨酸苯丙氛酸Dmt賴氨酸NH2右旋精氨酸賴氨酸Dmt苯丙氨酸NH2右旋精氨酸賴氨酸苯丙氨酸DmtNH2苯丙氨酸賴氨酸Dmt右旋精氨酸NH2苯丙氨酸賴氨酸右旋精氨酸DmtNH2苯丙氨酸右旋精氨酸Dmt賴氨酸麗2苯丙氨酸右旋精氨酸賴氨酸DmtNH2苯丙氨酸右旋精氨酸苯丙氨酸賴氨酸NH2苯丙氨酸Dmt右旋精氨酸賴氨酸NH2苯丙氨酸Dmt賴氨酸右旋精氨酸NH2賴氨酸苯丙氨酸右旋精氨酸DmtNH2賴氨酸苯丙氨酸Dmt右旋精氨酸冊2賴氨酸Dmt右旋精氨酸苯丙氨酸NH2賴氨酸Dmt苯丙氨酸右旋精氨酸NH2賴氨酸右旋精氨酸苯丙氨酸DmtNH2賴氨酸右旋精氨酸Dmt苯丙氨酸NH2右旋精氨酸Dmt右^走^"氨酸苯丙氨酸NH2右旋精氨酸Dmt右旋精氨酸DmtNH2右旋精氨酸Dmt右旋精氨酸酪氨酸NH2右旋精氨酸Dmt右旋精氨酸色氨酸跳一色氨酸右旋精氨酸苯丙氨酸賴氨酸NH2色氨酸右旋精氨酸酪氨酸賴氨酸NH2色氨酸右旋精氨酸色氨酸賴氨酸NH2色氨酸右旋精氨酸Dmt賴氨酸NH2右旋精氨酸色氨酸賴氨酸苯丙氨酸NH2右旋精氨酸色氨酸苯丙氨酸賴氨酸NH2右旋精氨酸色氨酸賴氨酸DmtNH2右旋精氨酸色氨酸Dmt賴氨酸NH2右旋精氨酸賴氨酸色氨酸苯丙氨酸右3炎精氨酸賴氨酸色氨酸DmtNH2Cha右3走4青氨酸苯丙氨酸賴氨酸NH2丙氨酸右旋4fr氨酸苯丙氨酸賴氨酸NH2Cha=環(huán)己基表1和表2中所示的肽中的氨基酸可以是L-構(gòu)型或者D-構(gòu)型。更多的陽離子肽可以在2003年2月4日4是交的美國臨時(shí)申請第60/444,777號中4戈到，其以引用方式結(jié)合于本文。分子該分子可以是生物分子或者小分子。優(yōu)選i也，該生物分子或者d、分子是具有藥物活性的分子。這里所用的具有藥物活性的分子，是能夠在體內(nèi)施加有益的影響的任何分子。生物分子是包含核酸或者氨基酸序列的任何分子，并且分子量大于450。這樣的核酸和氨基酸序列在本文中分別指的是"多(聚)核苷酸"和"多(聚)氨基酸"。生物分子包括多聚核苷酸、肽核苷酸、以及多聚氨基酸，如肽、多肽，以及蛋白質(zhì)。具有藥物活性的生物分子的實(shí)例包^fe:內(nèi)源性肽(如，血管加壓素、谷胱甘肽)、蛋白質(zhì)(如，干擾素)、激素(如，人類生長激素)、酶(如，a-半乳糖苷酶)、抗體(如，抗|3-淀粉狀蛋白的抗體，其可以用于治療阿爾茨海默氏病)、神經(jīng)生長因子(如，神經(jīng)生長因子NGF，腦部起源的神經(jīng)因子BDNF)、纟田胞因子(如，血小板起源的生長因子PDGF,血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF)、以及低聚核苷酸。該<氐聚核苦酸可以包括任4可序列的多核普酸，如DNA或者RNA。該DNA和RNA序列可以是單鏈或者雙鏈的。例如，編碼有利于在應(yīng)激期間幫助細(xì)胞存活的蛋白的DNA可以與本發(fā)明的多肽結(jié)合。這樣的蛋白的實(shí)例包括熱休克蛋白(如，hsp60、hsp70等)。單鏈的RNA分子的實(shí)例包括核酶、RNA誘何(decoy)、核酶的外部指導(dǎo)序列、反義RNA和mRNA。對于這些單纟連RNA分子的評述，參見Sullenger等(淑,2002,418:252-247)。Sullenger才皮露的對這些單《連DNA分子的描述，以及對可以用核酶、RNA誘-餅、核酶的外部指導(dǎo)序列、反義RNA和mRNA分子治療的疾病和病變的描述以引用方式結(jié)合于本文。雙鏈RNA的實(shí)例是RNA千護(hù)0分子(即，RNAi，例長口，siRNA，(即，小干擾RNA))。該siRNA可以是任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。該siRNA可以，例如，與mRNA充分;也互#卜，以^更氺卩制與疾病、病癥或者病變相關(guān)的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄。這樣的蛋白質(zhì)的實(shí)例包括，例如，與阿爾茨海默氏病相關(guān)的P-淀粉狀蛋白和與癌相關(guān)的ras蛋白。可選;t也，該siRNA可以，例,與由病毒產(chǎn)生的RNA充分i也互補(bǔ)。該由病毒產(chǎn)生的RNA可以是病毒感染宿主細(xì)月包、病毒的存活、和/或病毒的繁殖通常需要的任何RNA。這樣的RNA的實(shí)例包括內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)、RNA依賴的聚合酶起始位點(diǎn)、以及編碼病毒包膜蛋白、病毒核酸酶、和病毒蛋白酶(的RNA)。病毒的實(shí)例包4舌，例如，肝炎病毒，如A(曱)、B(乙)、C(丙)型肝炎、人類免疫缺陷病毒、EB病毒、巨細(xì)胞病毒、以及人類乳頭瘤病毒。針對病毒RNA的siRNA對于本領(lǐng)域的4支術(shù)人員來說是已知的。例如，針對C型肝炎病毒的RNA的siRNA對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來i兌是已^口的，參見Randall等，尸A^S，2003，100:235-240。該分子可以是小分子。小分子包括有機(jī)化合物、有機(jī)金屬化合物、有機(jī)化合物和有機(jī)金屬化合物的鹽、單糖、氨基酸、以及核苷酸。小分子可以進(jìn)一步包括不^皮認(rèn)為是生物分子的分子，只要它們的分子量不大于450。因此，小分子可以是分子量為450或更小的脂質(zhì)、低聚糖、低聚肽、和低聚核苷酸、以及它們的衍生物。要強(qiáng)調(diào)的是小分子可以具有任何分子量。它們被稱作小分子僅^又因?yàn)樗鼈儾籢皮稱作生物分子，并且通常具有小于450的分子量。小分子包括自然界發(fā)現(xiàn)的化合物，也包括合成的化合物。具有藥物活性的小分子的實(shí)例包括抗生素(如，四環(huán)素、青霉素、紅霉素)、細(xì)胞毒性劑(如，鏈霉素、阿霉素)、以及抗氧化劑(如，維生素E、維生素C、p-胡蘿卜素)。栽體復(fù)合物至少一個(gè)上述分子，以及至少一個(gè)上述芳香族陽離子肽，結(jié)合(締合)形成載體復(fù)合物。該分子和芳香族陽離子肽可以通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何方法結(jié)合。合適的結(jié)合類型包括化學(xué)性結(jié)合和物理性結(jié)合。化學(xué)性結(jié)合包括，例如通過共價(jià)鍵結(jié)合和通過配位鍵結(jié)合。物理性結(jié)合包括，例如，通過氳4建、偶極相互作用、范瓦耳斯力、靜電相互作用、疏水性相互作用和芳香族的堆積作用(aromaticstacking)結(jié)合。該分子和芳香族陽離子肽之間的結(jié)合的類型通常依賴于，例如，該分子上可利用的官能團(tuán)和該芳香族陽離子肽上可利用的官能團(tuán)。對于物理性結(jié)合或者化學(xué)性結(jié)合，該分子上的官能團(tuán)通常與該芳香族陽離子肽上的官能團(tuán)結(jié)合。可選地，該芳香族陽離子肽上的官能團(tuán)與該分子上的官能團(tuán)締合。該分子和芳香力矣陽離子肽上的官能團(tuán)可以直4妻結(jié)合。例如，分子上的官能團(tuán)(如，巰基)與芳香族陽離子肽上的官能團(tuán)(如，巰基)結(jié)合，以便形成二硫化物?？蛇x地，該官能團(tuán)可以通過交聯(lián)劑(如，連接劑)結(jié)合。交聯(lián)劑的一些實(shí)例如下所述。交聯(lián)劑可以連接到該分子或者芳香族陽離子肽中的^壬意一個(gè)。該連接劑可以影響也可以不影響芳香族陽離子肽的凈電荷的數(shù)目。該連接劑通常不影響芳香族陽離子肽的凈電荷。存在于連接劑中的每個(gè)氨基，如果有的話，將影響芳香族陽離子肽的凈正電荷。存在于連接劑中的每個(gè)羧基，如果有的話，將影響芳香族陽離子肽的凈負(fù)電4肓。該載體復(fù)合物中分子或者芳香族陽離子肽的數(shù)目受限于該肽容納多個(gè)分子的能力或者該分子容納多個(gè)肽的能力。例如，空間位阻可以妨礙該肽容納尤其是大分子的能力?？蛇x地，空間位阻可以妨礙該分子容納相對4交大的(如，長度為七、八、九或十個(gè)氨基酸)芳香族陽離子肽的能力。該載體復(fù)合物中分子或者芳香族陽離子肽的數(shù)目還受限于存在于對方上的官能團(tuán)的數(shù)目。例如，與肽結(jié)合的分子的最大數(shù)目取決于存在于該肽上的官能團(tuán)的婆t目?？蛇x地，與分子結(jié)合的肽的最大數(shù)目取決于存在于該分子上的官能團(tuán)的數(shù)目。在一個(gè)具體實(shí)施例中，該載體復(fù)合物包4舌至少一個(gè)與芳香力臭陽離子肽結(jié)合的分子，并且優(yōu)選的情況是至少兩個(gè)分子。包含多個(gè)(如，3,4，5或者更多)官能團(tuán)的相對較大的肽(如，長度為八個(gè)、十個(gè)氨基酸)可以與多個(gè)(如，3，4，5或者更多)分子結(jié)合。在另一具體實(shí)施例中，該載體復(fù)合物包括至少一個(gè)與分子結(jié)合的芳香族-陽離子肽，并且優(yōu)選的情況是至少兩個(gè)芳香族陽離子肽。例如，包含多個(gè)(如，3,4，5或者更多)官能基團(tuán)的分子可以與多個(gè)(如，3，4,5或者更多)肽結(jié)合。在另一具體實(shí)施例中，該載體復(fù)合物包括一個(gè)與一個(gè)分子結(jié)合的芳香族-陽離子肽。在一個(gè)具體實(shí)施例中，載體復(fù)合物包括至少一個(gè)與至少一個(gè)芳香族陽離子肽化學(xué)結(jié)合(如，共軛結(jié)合)的分子。該分子可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法與芳香族陽離子肽化學(xué)性結(jié)合。例如，該分子上的官能團(tuán)可以直接連接到芳香族陽離子肽上的官能團(tuán)。合適的官能團(tuán)的一些實(shí)例包括，例如，氨基、羧基、巰基、馬來酰亞胺基、異氰酸基、異石危氰酸基以及羥基。該分子還可以借助交聯(lián)劑，如二醛、碳二亞胺、二馬來酰亞胺、以及類似物，與芳香族陽離子肽化學(xué)性結(jié)合。交聯(lián)劑可以，例如，/人<尹利i若斯州羅克福德市的Pierce生物技術(shù)7>司獲得。PierceBiotechnology司，網(wǎng)址為URLhttp:〃www.piercenet.com/products/browse.cfmfldID=26436A16-60A0-4A56-85F7-213A50830440，可以提供幫助。另外的交聯(lián)劑包括荷蘭阿姆斯特丹市KreatechBiotechnologyB.V.的美國專利第5,580,990號、5,985,566號和6,133,028號中4苗述的鉑交耳關(guān)劑。該分子的官能團(tuán)可以不同于肽的官能團(tuán)。例如，如果巰基存在于該分子上，如在(3-半乳糖苷酶內(nèi)或者在5，-和/或3，-末端硫醇基修飾的DNA和RNA4氐聚核苷酸內(nèi)，該分子可以借助來自PierceBiotechnology的交聯(lián)試劑SMCC(即，琥詢酰亞胺4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷基-l-羧酸酯(鹽))，通過賴氨酸的4-氨基交聯(lián)到肽上，如，[Dm。DALDA(參見下面的實(shí)施例10)。在另一實(shí)例中，DALDA的賴氨酸的4-氨基可以^昔助來自PierceBiotechnology的交聯(lián)劑EDC(即，(N-[3-二甲基氨基丙基-N，-乙基碳酰亞胺]),直接共輒結(jié)合到位于RNA或者DNA的5，-末端的a-磷酸基上(參見下面的實(shí)施例13)?？蛇x;t也，該分子和肽的官能團(tuán)可以相同。同型雙官能(homobifunctional)交聯(lián)劑通常可以用于交聯(lián)同樣的官能團(tuán)。同型雙官能交聯(lián)劑的實(shí)例包括EGS(即，乙二醇二[琥珀酰亞胺基琥珀酸酯])、DSS(即，二琥珀酰亞胺基辛二酸鹽)、DMA(即，二甲基己二酰亞胺鹽.2HC1)、DTSSP(即，3，3，-聯(lián)石克基[碌L代琥珀酰亞胺基丙酸鹽])、DPDBP(即，1，4-二-[3，-(2，畫吡啶基聯(lián)硫基)-丙酰胺基]丁烷、以及BMH(即，二-馬來酰亞胺己烷)。這樣的同型雙官能交聯(lián):劑也可以/人PierceBiotechnology乂>司4尋到。為了使該分子和肽化學(xué)性地結(jié)合，通常將該分子、肽、和交聯(lián)劑混合在一起。該分子、肽、和交聯(lián)劑的加入順序是不重要的。例如，可以先將該肽與交聯(lián)劑混合，隨后加入該分子?？蛇x地，可以先^1牟該分子與交耳關(guān)劑混合，隨后加入該肽。最〗圭i也，可以先將該分子與肽混合，隨后加入交4關(guān)劑。該化學(xué)性結(jié)合的載體復(fù)合物可以將分子遞送到細(xì)胞。在一些實(shí)例中，該分子在細(xì)胞內(nèi)起作用時(shí)沒有與芳香族陽離子肽分開。例如，如果該芳香族陽離子肽不妨礙分子的催化位點(diǎn)，那么將分子與芳香族陽離子肽分開不是必需的(參見下面的實(shí)施例11)。在另一些實(shí)施例中，將該分子與芳香族化合物分開可能是有利的。上述PierceBiotechnology公司的網(wǎng)址還在選4奪合適的能夠4皮，例如，細(xì)胞內(nèi)的酶，分開的交聯(lián)劑方面為本領(lǐng)域的技術(shù)人員提供幫助。因此，該分子可以與芳香族陽離子肽分開?？杀环珠_的連接劑的實(shí)例包括SMPT(即，4-琥珀酰亞胺基氧化羰基-曱基-a-[2-吡啶基聯(lián)石克基]甲苯、Sulfo-LC-SPDP(即，為乾代琥珀酰亞胺基6-(3-[2-吡啶基聯(lián)硫基]-丙酰胺基)己酸鹽)、LC-SPDP(即，琥珀酰亞胺基6-(3-[2-吡咬基聯(lián)石克基]畫丙酰胺基)己酸鹽)、Sulfo-LC-SPDP(即，硫代琥珀酰亞胺基6-(3-[2-吡"定基聯(lián)硫基]-丙酰胺基)己酸鹽)、SPDP(即，N-琥珀酰亞胺基3-[2-吡咬基聯(lián)石克基]-丙酰胺基己酸鹽)、以及AEDP(即，3-[(2-氨基乙基)聯(lián)石克基]-丙酸.HCl)。在另一具體實(shí)施例中，載體復(fù)合物包括至少一個(gè)與至少一個(gè)芳香族陽離子肽物理性結(jié)合的分子。該分子可以通過本領(lǐng)域才支術(shù)人員已知的任4可方法與芳香族陽離子肽物理性結(jié)合。例如，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的4壬4可方法將該芳香族陽離子肽與分子混合在一起。混合順序是不重要的。例如，分子可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法與4奮飾過或未修飾過的芳香族陽離子肽物理性混合?？蛇x地，該<奮飾過或未<奮飾過的芳香族陽離子肽可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法與分子物理性混合。例如，可以將該芳香族-卩日離子肽和分子置于容器中，并且通過，例如，搖動該容器來攪拌，以便混合該芳香族-陽離子肽和分子。該芳香族陽離子肽可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法被修飾。例如，該芳香族陽離子肽可以借助如上所述的交聯(lián)劑或者官能基團(tuán)而被修飾。該連接劑可以影響也可以不影響芳香族陽離子肽的凈電荷的數(shù)目。典型地，該連接劑不會影響芳香族陽離子肽的凈電荷。存在于連接劑中的每個(gè)氨基，如果有的話，將影響(增加)芳香族陽離子肽的凈正電荷。存在于連接劑中的每個(gè)羧基，如果有的話，將影響芳香族陽離子肽的凈負(fù)電荷。農(nóng)寸^口，[Dmti]DALDA可以通過來自PierceBiotechnology的交聯(lián)試劑SMCC(即，琥珀酰亞胺4-(N-馬來酰亞胺曱基)環(huán)己烷基-l-羧酸鹽)，通過賴氨酸的4-氨基而被修飾(參見下面的實(shí)施例10)。為了形成載體復(fù)合物，該修飾后的芳香族-陽離子肽通常首先形成，然后與該分子混合。物理性結(jié)合的栽體復(fù)合物的一個(gè)伊C點(diǎn)是該分子在細(xì)月包內(nèi)起作用時(shí)不需要除去芳香族陽離子肽，如那些其中分子與芳香族陽離子肽化學(xué)性結(jié)合的載體復(fù)合物。此外，如果該芳香族陽離子肽不妨礙分子的催化位點(diǎn)，那么該復(fù)合物的解離也不是必需的(參見下面的實(shí)施例12)。芳香族陽離子肽的合成本發(fā)明的方法中所用的肽可以通過本領(lǐng)域公知的任何方法化學(xué)合成。用于合成該蛋白的合適的方法包4舌，例4。，通過StuartandYoungin"SolidPhasePeptideSynthesis(固才目月太合成)，"secondEdition,PierceChemicalCompany(1984),andin"SolidPhasePeptideSynthesis(固才目月太合成)，，，MethodsEnzymol,289，AcademicPress，Inc,NewYork(1997)中4葛述的那些方法。施用方式在一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明涉及將分子遞送到細(xì)胞的方法。本方法包括將分子和芳香族陽離子肽與細(xì)胞4妻觸?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法將該分子和芳香族陽離子肽與細(xì)胞接觸。例如，細(xì)胞可以與分子和芳香族陽離子肽在體外孵育。一方面，該細(xì)月包和芳香族陽離子肽可以以載體復(fù)合物的形式存在，如上述那些載體復(fù)合物，包括化學(xué)性結(jié)合或者物理性結(jié)合的分子和芳香族陽離子肽。在另一具體實(shí)施例中，將分子遞送到細(xì)胞的方法包括將載體復(fù)合物與細(xì)胞接觸。通過將包括該分子和芳香族陽離子肽的載體復(fù)合物與細(xì)胞4妻觸，該分子^皮遞送到細(xì)月包?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域-技術(shù)人員已知的任何方法將載體復(fù)合物與細(xì)胞接觸。例如，可以在體外將細(xì)胞與該載體復(fù)合物孵育。該細(xì)胞可以是任何細(xì)胞。細(xì)胞可以來源于植物、動物、或者細(xì)菌。植物細(xì)胞的實(shí)例包4舌阿布屬細(xì)"包。細(xì)菌的細(xì)力包的實(shí)例包4舌酵母菌屬和乳g吏4干菌屬。動物細(xì)胞包括哺乳動物細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞、腎細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞。血管內(nèi)皮細(xì)胞的實(shí)例是血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞。可選的，該載體復(fù)合物可以在體內(nèi)#:施用于哺乳動物。有效劑量的載體復(fù)合物，優(yōu)選藥用組合物，可以在其需要時(shí)，通過多種用于施用藥用化合物的公知的方法中的任何一種來施用于哺乳動物。該載體復(fù)合物可以全身或局部施用。在一個(gè)具體實(shí)施例中，該載體復(fù)合物通過l爭"永施用。例如，該載體復(fù)合物可以經(jīng)由快速的l爭脈推注施用。然而，優(yōu)選地，該載體復(fù)合物以恒速l爭脈注射施用。該載體復(fù)合物可以一皮局部施用于哺乳動物的組織。例如，通過注射進(jìn)入注射器易于到達(dá)的組織。例如，如果該載體復(fù)合物包含將被遞送到哺乳動物的肺瘤處的細(xì)胞毒性劑，優(yōu)選地，該腫瘤易于局部施用。這樣的腫瘤包括，例如，皮膚癌和乳腺癌。該載體復(fù)合物還可以口月良施用、局部施用、鼻內(nèi)施用、月幾肉內(nèi)施用、皮下施用、或者透皮施用。在一優(yōu)選的具體實(shí)施例中，載體復(fù)合物的透皮施用是通過離子電滲療法，其中該載體復(fù)合物通過電流透皮遞送。其它的施用途徑包括腦室內(nèi)或者鞘內(nèi)施用。腦室內(nèi)施用涉及施用入腦的腦室系統(tǒng)。鞘內(nèi)施用涉及施用入腦或脊髓的蛛網(wǎng)膜下的空間。因而腦室內(nèi)或鞘內(nèi)施用可以優(yōu)選用于影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的器官或組織的那些疾病或病變。本發(fā)明的方法中所用的載體復(fù)合物可以通過持續(xù)釋放的方式給哺乳動物施用，這在本領(lǐng)域是已知的。持續(xù)釋》欠施用是藥物遞送的方法，其可以z使該藥物在特定時(shí)間-敬達(dá)到某個(gè)水平。該水平通常通過血清濃度測定。藥學(xué)領(lǐng)域已知的任何劑型均適用于該載體復(fù)合物的施用。對于口月良施用，可以使用液體或固體劑型。劑型的一些實(shí)例包括片劑、膠嚢、丸劑、錠劑、酏劑、混懸劑、糖漿劑、糯米紙囊劑(wafer)、口嚼劑(chewinggum)及類似的劑型。該肽可以與合適的藥物載體(纟某介物)或賦形劑混合，這一點(diǎn)為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所了解。載體和賦形劑的實(shí)例包括淀粉、乳劑、糖、某些種類的粘土、膠、乳酸、硬脂酸或其鹽，包括硬脂酸鎂或石更脂酸鈣、滑石、植物油脂或植物油、樹膠及乙二醇。對于全身施用、腦室內(nèi)施用、鞘內(nèi)施用、局部施用、鼻內(nèi)施用、皮下施用、或者透皮施用，該載體復(fù)合物的劑型可以利用傳統(tǒng)的稀釋劑、載體、或賦形劑等，這在本領(lǐng)域是已知的，其可以用來遞送該載體復(fù)合物。例如，該劑型可以包括下面的一種或多種穩(wěn)定劑、表面活性劑，優(yōu)選非離子性的表面活性劑、以及可選的鹽和/或緩沖劑。該載體復(fù)合物可以以7j^容液的形式、或以凍干的形式一皮遞送。該穩(wěn)定劑可以是，例如，氨基酸，如舉例來說，甘氨酸；或者低聚糖，如舉例來說，蔗糖、四糖、乳糖或葡聚糖?？蛇x地，穩(wěn)定劑還可以是糖醇，如舉例來說，甘露醇；或其組合物。優(yōu)選地，該穩(wěn)定劑或穩(wěn)定劑的組合物的構(gòu)成占該載體復(fù)合物的重量的約0.1%到約10%。該表面活性劑優(yōu)選非離子性的表面活性劑，例如聚山梨醇酯。合適的表面活性劑的一些實(shí)例包4舌吐溫20、吐溫80;聚乙二醇或聚氧乙烯聚氧丙烯二醇，如^v約0.001%(w/v)到約10%(w/v)的Plu畫icF-68。該鹽或緩沖劑可以是任何鹽或緩沖劑，如舉例來說，分別為，氯化鈉、或者磷酸鈉/磷酸鉀。優(yōu)選地，該緩沖劑將藥物組合物的pH維持在約5.5到約7.5的范圍內(nèi)。該鹽和/或緩沖劑也用于將摩爾滲透壓濃度維持在適合于給人或動物施用的水平。優(yōu)選地，該鹽或緩沖劑以約150mM到約300mM的粗略的等滲濃度存在。本發(fā)明的方法中所用的載體復(fù)合物的組分還可以包含一種或多種傳統(tǒng)的添加劑。這樣的添加劑的一些實(shí)例包括增溶劑，如，舉例來說，甘油；抗氧化劑，如舉例來說，苯扎氯銨(季銨化合物的混合物，稱為"季銨化合物組(quats)"),苯曱醇、氯惹酮或氯丁醇；麻醉劑，如舉例來i兌，嗎啡書于生物；或者等〉參劑等，如上述的等滲劑。作為進(jìn)一步防止氧化或其它腐敗的預(yù)防4普施，該藥物組合物可以用不滲透的塞子封裝在小瓶中在氮?dú)庀沦A存。該哺乳動物可以是〗壬〗可哺乳動物，包4舌，例如，家畜，如羊、豬、牛、及馬；^L賞動物，如狗和貓；實(shí)-瞼動物，如大鼠、小鼠和兔。在優(yōu)選的具體實(shí)施例中，該哺乳動物是人。應(yīng)用由于該載體復(fù)合物能夠以不依賴能量的機(jī)制穿過細(xì)胞膜，因此在體內(nèi)和體外可以有4艮多應(yīng)用。該載體復(fù)合物能夠，例如，在體外用作研究工具。例如，該載體復(fù)合物可以將分子，如蛋白質(zhì)，遞送至細(xì)月包內(nèi)，以^更研究該分子的功能角色。這樣的分子包括，例如，細(xì)胞信號蛋白(如，細(xì)胞核因子NF-kB、激酶，如JAK)。體外的另一應(yīng)用包括，例如，將標(biāo)記物，如p-半乳并唐苦酶，遞送至細(xì)月包內(nèi)，如干纟田月包、造血細(xì)月包、或者胚細(xì)月包，以^更確定細(xì)胞的后代(鐠系)。體外的其它應(yīng)用包括，例如，將片企測性抗體遞送至細(xì)胞內(nèi)，以便確定該細(xì)"包內(nèi)特定蛋白的存在。該載體復(fù)合物還在體內(nèi)具有治療性用途。例如，該芳香族陽離子肽可以用于將反義多聚核苷酸遞送至哺乳動物的細(xì)胞內(nèi)，以便下調(diào)蛋白質(zhì)的過度表達(dá)。此外，該芳香族陽離子肽可以用于遞送低聚核苷酸，該低聚核香酸可以用于RNA干擾(RNAi)。這里所用的RNAi涉及細(xì)胞才幾制，該細(xì)胞4幾制用于調(diào)節(jié)基因的表達(dá)或者病毒或細(xì)菌的復(fù)制。該機(jī)制包括導(dǎo)入雙鏈RNA(如，siRNA)至目標(biāo)基因的產(chǎn)物(通常為RNA)。血腦屏障具有特歹朱的選4奪性。因此，體內(nèi)的另一應(yīng)用包括遞送分子穿過血腦屏障。這樣的分子可以包4舌，例如，在阿爾茨海默氏病患者的治療中針對(3-淀粉狀蛋白的抗體。與化學(xué)治療劑相關(guān)的典型的問題是在細(xì)月包內(nèi)達(dá)到足夠的水平。例如，該化學(xué)治療劑可能太大或者不是芳香族化合物，不足以穿過纟田胞膜。因此，體內(nèi)的又一應(yīng)用包括將化學(xué)治療劑，如上述細(xì)胞毒寸生劑，遞送至細(xì)J包內(nèi)。實(shí)施例實(shí)施例1:材料和方法藥物和4匕學(xué)制品。[Dm]DALDA和[3H][Dm一]DALDA(47Ci/mmol)4姿照先前描述的方法合成(Schiller等，Ewr.J.C72綴2000，35:895-901;Zhao等，J！尸/z簡,/.￡平2002,302:188-196)。["C]Gly隱Sar(56.7mCi/mmol)和[3H][D-Ala2，iV-Me-Phe4，Gly5-ol]-腦啡肽(50Ci/mmol)購自AmershamBiosciences(皮斯卡塔韋市，新澤西州)。所有的其它藥品和化學(xué)制品來自Sigma-Aldrich(圣路易斯市，密蘇里州)。細(xì)胞培養(yǎng)。所有的細(xì)胞系來自美國典型培養(yǎng)物收集中心(AmericanTypeCultureCollection)(馬納薩其斤鎮(zhèn)，弗吉尼亞州)，而細(xì)月包培養(yǎng)所需的供給物品來自Invitrogen(卡爾斯巴德市，力口利福尼亞州)。Caco-2細(xì)月包在MEM中生長，而SH-SY5Y、HEK293、和Huh7細(xì)胞在Dulbecco的改良的Eagle培養(yǎng)基中生長。生長培養(yǎng)基中添加了10%胎牛血清、200ng/ml青霉素、以及100|Ag/ml石克酸鏈霉素。0^1^細(xì)胞在]^1￡]^+10%馬血清、非必需氨基酸、以及青霉素/鏈霉素中生長。所有的細(xì)胞系維持在37°C、含95%空氣和5°/0CO2的濕潤氣體中。肽才聶取實(shí)驗(yàn)。首先利用Caco-2細(xì)胞研究肽的內(nèi)在化，隨后利用SH-SY5Y、HEK293、和CRFK細(xì)胞確認(rèn)。細(xì)月包的單層在覆蓋有膠原蛋白的12孔板上(5x105個(gè)細(xì)胞/孔)生長3天。第4天，用預(yù)熱的HBSS將細(xì)胞洗兩次，隨后在37。C將細(xì)胞與包含250nM[3H][Dm—]DALDA或者50pM["C]Gly-Sar的0.2mlHBSS孵育不同的時(shí)間至1小時(shí)。在一分開的實(shí)-驗(yàn)中，在未標(biāo)記的[Dm。DALDA(lpM-3mM)存在的情況下，將細(xì)月包與同樣濃度的[3H][Dmt']DALDA在37。C孵育1小時(shí)。為了研究在4°C時(shí)的攝取，在細(xì)胞與[3H][Dm。DALDA或者["C]Gly-Sar孵育前，將細(xì)胞放在水上20分鐘。該孵育期結(jié)束后，用HBSS將細(xì)胞洗四次，并且將具有1%SDS的0.2ml0.1NNaOH加到每個(gè)孔中。隨后將細(xì)月包內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到閃爍管中，并且計(jì)算放射性。細(xì)胞溶解產(chǎn)物的等分試樣用于4昔助Bradford(Bio-Rad,Hercules,力口利3畐尼亞州)的方法測定蛋白質(zhì)含量。為了區(qū)分內(nèi)在的放射性和表面結(jié)合的放射性，包括了酸洗步冬聚。細(xì)胞溶解前，將細(xì)胞與0.2ml0.2M乙酸/0.05MNaCl在冰上孵育5分鐘。源自CaCo-2細(xì)胞的肽的泄漏實(shí)驗(yàn)。單層Caco-2細(xì)胞在12孔板上(5xio5個(gè)細(xì)胞/孔)生長3天。第4天，在37。C利用[3H][Dmt]DALDA或者["C]Gly-Sar將細(xì)胞預(yù)載(preload)1小時(shí)。然后用lml冰冷的孵育液將細(xì)胞洗四次，以^"更終止^&取，隨后在37。C或4。C將細(xì)胞與0.5mlMEM將育1小時(shí)，以1更測定肽從細(xì)胞到該孵育培養(yǎng)基的泄漏量。在細(xì)胞溶解產(chǎn)物和孵育培養(yǎng)基中測定放射性的數(shù)量。為了檢測P-糖蛋白在肽攝取和從細(xì)胞中泄漏出時(shí)所起的作用，還在100pM異搏定存在時(shí)測定了[Dm。DALDA的攝取和泄漏量。肽穿過Caco-2單層的易位實(shí)驗(yàn)。如前所述制備Caco-2細(xì)胞的單層(Irie等，J!P/wrw"co/.2001,298:711-717)。將Caco-2細(xì)月包(2x105)4妄種在轉(zhuǎn)孔細(xì)月包培養(yǎng)容器(CorningGlassworks,科寧市，紐約州)內(nèi)的多孩i孑L膜過濾器上(24mm,0.4pm)。每個(gè)專爭孑L容器在其頂部隔間充有1.5ml培養(yǎng)基，在其底側(cè)隔間充有2.5ml培養(yǎng)基。每1到2天給予該細(xì)胞單層新鮮的培養(yǎng)基，在第28天將細(xì)月包單層用于轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。通過將0.2pM[3H][Dm。DALDA或者lOOjiM["C]Gly-Sar力。入到頂部隔間來測定肽/人頂部隔間到底側(cè)隔間的轉(zhuǎn)運(yùn)，并且在加入肽后的不同時(shí)間將50卞1等分試樣/人頂部和底側(cè)隔間除去，以便測定放射性計(jì)數(shù)。按照下面的公式計(jì)算表觀滲透系數(shù)=X/"".Co),其中Z々是接收隔間內(nèi)的攝取率，」是擴(kuò)散面積(4.72cm2)，而Co是供體隔間內(nèi)的初始濃度。、激光共聚焦掃描顯孩史鏡。芳香族-陽離子肽^皮攝取入細(xì)胞通過激光共聚焦掃描顯孩H竟(CLSM)利用兩種熒光肽來確認(rèn)，該焚光肽為[Dmt、dnsDap4]DALDA(Dmt陽右旋妹奇氨酸-苯丙氨酸-dnsDap-NH2，其中dnsDap是(3-丹酰-l-oc,p-二氨基-丙酸)和[Dm,atnDap4]DALDA(Dmt-右旋精氨酸-苯丙氨酸-atnDap-NH2,其中atnDap是(3-鄰氨基苯甲酰基-L-oc，p-二氨基丙酸)。Caco-2細(xì)胞或SH-SY5Y細(xì)胞如上所述的那樣生長，然后^皮平鋪在(35-mm)玻璃底盤上(MatTek，阿什蘭市，馬薩諸塞州)持續(xù)兩天。隨后此培養(yǎng)基^皮移除，并且細(xì)胞與包含O.ljaM熒光肽的lmlHBSS在4。C或37。C孵育15分鐘。然后用冰冷的HBSS將細(xì)胞洗三次，接著用200ju1PBS覆蓋細(xì)胞，隨后在室溫下用具有C-復(fù)消色差透鏡63x/1.2W校正物鏡的激光共聚焦掃描顯微鏡(Nikon,東京，日本)在10分鐘內(nèi)進(jìn)行顯樣i4竟沖全查。[Dmti,dnsDap4]DALDA和[Dm,atnDap4]DALDA的激發(fā)/發(fā)射波長分別"i殳定在340/520nm和320/420nm。對于z軸的光學(xué)切片，每2.0jum切5-10幀。利用細(xì)胞膜的》文射性配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)。fH][Dm—]DALDA與細(xì)胞表面受體的特異性結(jié)合是利用制備自Caco-2和SH-SY5Y細(xì)胞的膜測定的。培養(yǎng)4天后，用PBS緩沖液將細(xì)胞洗2次，隨后刮下細(xì)胞。在500g將細(xì)胞離心5分鐘，隨后將沉淀貯存在-8(TC。在冰冷的50mMTris-HCl緩沖液中(5jug/ml亮肽素、2pg/ml胰凝乳蛋白酶抑制劑、10pg/ml苯丁抑制素、以及l(fā)mMEGTA,pH7.4)勻化細(xì)胞。在36,000g將勻漿離心20分鐘。將沉淀重新懸浮在50mMTris-HC1中。在25。C將膜勻漿的等分試樣(~140pg蛋白質(zhì))與[3H][Dm]DALDA(15-960pM)孵育60分4中。非特異性結(jié)合通過混入lpM未標(biāo)記的[Dm。DALDA來評估。借助具有細(xì)胞收集器(Brandel公司，蓋瑟斯堡市，馬里蘭州)的GF/B過濾器(Whatman,梅德斯通市，英國)，通過快速的過濾將游離的放射性配體與結(jié)合的放射性配體分離開。用10mlTris緩沖液將過濾器洗三次，隨后通過液體閃爍計(jì)凄t測定力丈射性。利用非線性回歸(GraphPadSoftware，圣i也亞哥市，力口利福尼亞州)測定結(jié)合親和性(ATd)和受體豸史目(^m肌)。蛋白質(zhì)共輒結(jié)合到[Dm—DALDA上。利用交聯(lián)劑SMCC(琥珀酰亞胺4-(N-馬來酰亞胺曱基)環(huán)己基-l-羧酸鹽)(Pierce)將[Dmt"DALDA交耳關(guān)到(3-半乳#唐苷酶(recombinantE.coli,Sigma-Aldrich)。SMCC與含胺的分子([Dm]DALDA的Lys4)反應(yīng)，以便形成穩(wěn)定的酰胺鍵。隨后它的馬來酰亞胺基末端可以被共輒結(jié)合到含巰基的化合物上，以^更形成好u醚4建合(BioconjugateTechniquesbyGregT.Hermanson,AcademicPress,Page234-237)。(3-半乳糖苷酶在其天然狀態(tài)時(shí)包含大量自由巰基。p-半乳糖苷酶的攝取提供了利用X-gal的便利的讀取。簡單地說，在室溫下將1ml5x1(T3M[Dmt]DALDA與lmgSMCC在石粦酸鹽1￡沖液中混合1小時(shí)。這將形成"活化的肽"。用磷酸鹽緩沖液將"活化的肽"按1:10稀釋。將lmgp-半乳糖苦酶加入到lml該1:10的"活化的肽，，中，并且在4'C混合2小時(shí)或一整夜。將[Dm一DALDA連接到交聯(lián)劑SMCC上，并且通過質(zhì)譜分析確i人。將SMCC(lpg)和[Dm—]DALDA(5jug)—起溶解在2mlPBS中、在室溫下聘育30分鐘、然后在4。C貯存。一奪該樣品的等分試樣與基質(zhì)(50%的乙腈中飽和的3-羥基吡啶羧酸(HPA),10mg/ml的檸檬酸銨)以r.io的比率混合，然后將其點(diǎn)樣在不銹鋼的靶平板(targetplate)上。通過基質(zhì)輔助的激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)語分對斤(MALDI-TOFMS)(AppliedBiosystems(VoyagerDEPro))以正向反射模式分析。將RNA結(jié)合到[Dm。DALDA上，并且通過凝皎電泳確i人。利用y-32P-ATP和多聚核苷酸激酶在5'末端將合成的RNA低聚物(長度為40個(gè)核苷酸)磷酸化。通過凝膠將產(chǎn)物純化。在1mgEDC(N-[3-二曱氨基丙基-N，-乙基碳酰亞胺])存在時(shí)，將500,000cpm的凝膠-純化的RNA低聚物與[Dm—]DALDA結(jié)合。將結(jié)合的產(chǎn)物([Dmtl]DALDA-RNA低聚物)在15%的聚丙埽酰胺基脲凝膠上單獨(dú)分析。將DNA結(jié)合到Dm一]DALDA上，并且通ii^^普分才斤確^人。將SMCC(lpg)和[Dmt']DALDA(5pg)—起〉容解在2mlPBS中、在室溫下孵育30分鐘、并且在4。C與去保護(hù)的3，-.硫醇基DNA低聚物混合24小時(shí)。孵育后，將該樣品的等分試樣與基質(zhì)(50%的乙腈中飽i和的3-羥基吡"定羧酸(HPA)，10mg/ml的4寧一蒙酸4妄)以1:10的比率混合，并且將其點(diǎn)樣在不銹鋼的靶平板上。通過MALDI-TOFMS分析樣品。通過物理性混合RNA和lDm。DALDA-SMCC結(jié)合物形成載體復(fù)合物。如上該制備[Dm。DALDA-SMCC結(jié)合物。在用于細(xì)胞攝取研究前，在室溫下將該RNA分子與[Dmt']DALDA-SMCC結(jié)合物在PBS中混合15分鐘。通過物理性混合蛋白質(zhì)和DmPDALDA-SMCC結(jié)合物形成載體復(fù)合物。如上所述制備[Dm。DALDA-SMCC結(jié)合物。在用于細(xì)胞攝取研究前，在室溫下將該蛋白質(zhì)分子(即，綠色熒光蛋白，GFP)與[Dm。DALDA-SMCC結(jié)合物混合15分鐘。Dm。DALDA-RNA結(jié)合物初U聶取進(jìn)入細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)。利用y_32P_ATP和多聚核苷酸激酶在5，末端將合成的RNA低聚物-疇酸化，并且通過凝膠電泳將產(chǎn)物純化。在1mgN-(3-二甲氨基丙基-N，-乙基碳酰亞胺)(EDC)存在時(shí)，將500,000cpm的凝膠-純化的RNA低聚物與[Dmt!]DALDA結(jié)合(偶合)。將Caco-2細(xì)胞(1xio6)在DMEMi吝養(yǎng)基中洗三次，并且在DMEM中預(yù)先孵育5分鐘。隨后在37。C將細(xì)胞與[Dm—]DALDA-pP]RNA低聚物結(jié)合物或非結(jié)合的RNA(4妄近20,000cpm)孵育60分鐘。孵育后，^!奪該細(xì)胞在DMEM中洗三次，與溶解緩沖液共同稀釋，隨后在細(xì)胞溶解產(chǎn)物中測定i文射性。RNA在與IDm。DALDA畫交聯(lián)劑結(jié)合物';昆合后浮皮才聶取入細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。用DMEM沖洗Huh7細(xì)胞(1x106個(gè)細(xì)月包/孔)，隨后在37。C或4。C將細(xì)胞與1.0mlDMEM孵育60分鐘，該DMEM中僅包含[32P]RNA低聚物，或者包含[32P]RNA低聚物和40)Li1[Dmt!]DALDA-SMCC結(jié)合物。隨后將細(xì)胞在DMEM中洗四次，并且在醋酸鈉溶液中洗一次，以便在溶解緩沖液中孵育30分鐘之前減少非特異性結(jié)合，隨后在細(xì)胞溶解產(chǎn)物中測定方文射性。[Dm。DALDA-蛋白質(zhì)結(jié)合物凈皮攝取入細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞(N2A神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞或Caco-2)平鋪在96孔板內(nèi)(2x104個(gè)細(xì)胞/孔)，隨后在37。C將細(xì)胞與交聯(lián)有P-半乳糖苷酶的[Dm]DALDA或僅與j3-半乳糖苷酶孵育1小時(shí)。然后用PBS將細(xì)月包洗4次。隨后在37。C用(3-半乳4唐苷酶染色系統(tǒng)(Roche)^奪纟田月包染色至少2小時(shí)，隨后在顯微鏡下檢查。蛋白質(zhì)與[DmP]DALDA-SMCC結(jié)合物孵育后祐^聶取入細(xì)胞*的實(shí)驗(yàn)。用DMEM沖洗Huh7細(xì)月包(1x106個(gè)細(xì)月包/3匕)，隨后在37。C將細(xì)胞與0.5mlDMEM孵育60分鐘，該DMEM:<又包含3pg綠色熒光蛋白(GFP)(A);包含3jagGFP和40pl[Dmt']DALDA(B);或者包含3pgGFP和40jil與SMCC結(jié)合的[Dm]DALDA(C)。隨后將2ml的細(xì)胞培養(yǎng)基加入到細(xì)胞中，在細(xì)胞培養(yǎng)孵育器中孵育了額外的24小時(shí)。孵育后，在細(xì)胞培養(yǎng)基中將細(xì)胞沖洗四次，隨后通過激光共聚焦掃描顯微鏡觀察保留在活細(xì)胞中的GFP。在340nm處進(jìn)行激發(fā)，而在520nm處測量發(fā)射。凋亡實(shí)驗(yàn)。利用Hoechst染料(MolecularProbes,尤金市，勒岡州)將凋亡的細(xì)i包核染色來確定凋亡。將Hoechst染料加載到細(xì)胞培養(yǎng)物中并且孵育15分鐘。通過用細(xì)胞培養(yǎng)基(不含pH指示劑)沖洗細(xì)胞除去過多的Hoechst染料，然后利用熒光顯微鏡檢查細(xì)月包(在350nm處激發(fā)，而在461nm處(測量)發(fā)射)。實(shí)施例2:Dmt^DALDA和Gly腳Sar,皮才聶^C入Caco-2細(xì)月包的時(shí)間it考呈。當(dāng)[3H][Dm。DALDA與Caco-2細(xì)胞在37。C孵育時(shí)，早在5分鐘時(shí)就觀察到了細(xì)胞溶解產(chǎn)物中的pH][Dmt"DALDA，而到30分鐘時(shí)達(dá)到穩(wěn)態(tài)水平(圖1A)。1小時(shí)的孵育后，細(xì)胞溶解產(chǎn)物中回收的[3H][Dmt1]DALDA的總量占全部藥物的約1%。與之相比，在同樣的實(shí)驗(yàn)條件下，["C]Gly-Sar在5到45分鐘時(shí)持續(xù)增加(圖1B)。可以相信測定的》文射性可以反映[Dmt']DALDA的水平，因?yàn)橄惹耙呀?jīng)證實(shí)[Dm。DALDA可以防止肽酶的下降(Szeto等，J.P/z"m/"co/.Ex/.7T^r,2001,298:57-61)。為了確定測定的放射性是否與細(xì)胞膜相關(guān)，將細(xì)胞酸洗，以便除去表面結(jié)合。圖1C顯示80.8%的pH][Dm。DALDA可以耐受酸洗，因此判定其存在于細(xì)胞內(nèi)部。已發(fā)現(xiàn)[Dm]DALDA的攝取在較廣的濃度范圍內(nèi)是濃度依賴性的(圖1D)。實(shí)施例3:pH對于DmtMDALDA和Glv-Sar的才聶取的溫度依賴性和影響。當(dāng)在4。C進(jìn)行孵育時(shí)，[3H][Dm一]DALDA的攝取與在37。C時(shí)相比專交慢，^f旦是在45分鐘時(shí)達(dá)到76.5%(圖1A),并且在1小時(shí)時(shí)達(dá)到86.3o/o(圖lA)。與之相比，[14C]Gly-Sar的才聶取在4。C時(shí)完全消除了(圖1B)。已知PEPT1對Gly-Sar的攝取是pH依賴性的，在pH6.0時(shí)進(jìn)行的才聶取最佳(Terada等，1999,/尸/2",》/.276:G1435-G1441)。這在我們的研究中得到了證實(shí)(圖2B)。與之相比，當(dāng)pH從4.0到7.4變化時(shí)，[3H][Dm。DALDA的攝取沒有變化(圖2A)。這種溫度和pH依賴性缺乏表明Caco-2細(xì)胞內(nèi)的[Dm—]DALDA的:t聶取不是經(jīng)由PEPT1(肽的4爭運(yùn)體1)介導(dǎo)的。實(shí)施例4:DEPC對于『DmtMDALDA和Gly-Sar4聶取的影響。為了進(jìn)一步表明PEPT1沒有涉及[Dm一]DALDA的4爭運(yùn)，我們研究了DEPC(焦碳酸二乙酯；0.2mM)對于[3H][Dmt']DALDA和["C]Gly-Sar攝取的影響。DEPC是一種組氨酸殘基的修飾試劑，已顯示其可以抑制Caco-2細(xì)胞內(nèi)的PEPT1(Terada等，F(xiàn)五^S丄e".，1996,394:196-200)。將DEPC添加到孵育培養(yǎng)基中顯著抑制了卩4C]Gly-Sar攝取(圖2D)。令人驚奇的是，DEPC不僅沒有抑制[3H][Dm]DALDA攝取，而且它居然將[3H][Dm一]DALDA攝取提高了34倍(圖2C)。實(shí)施例5:[Dm一lDALDA在不同的細(xì)胞類型中的內(nèi)在化。為了證明[Dm—]DALDA的內(nèi)在4匕不P艮于Caco-2纟田月包，我們在許多不同的細(xì)月包系中比4交了[Dm。DALDA的內(nèi)在化。加入了酸洗步驟以便將內(nèi)在的放射性(耐酸的)與表面結(jié)合的放射性(對酸敏感的)區(qū)分開來。圖3A比較了Caco-2細(xì)胞、SH-SY5Y纟田月包、HEK293細(xì)胞、及CRFK細(xì)胞中的耐酸的放射性的水平。結(jié)果顯示fH][Dm—]DALDA在所有的細(xì)胞類型中都被大量地?cái)z取。實(shí)施例6:與『3Hl〖DmthDALDA的it射性配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)。為了確定[Dm]DALDA的內(nèi)在化是否經(jīng)由受體介導(dǎo)的機(jī)制，我們進(jìn)行了放射性配體([3H][Dm]DALDA)與制備自Caco-2細(xì)月包和SH-SY5Y細(xì)胞的膜的結(jié)合實(shí)驗(yàn)。圖3B顯示了[3H][Dmt"DALDA與SH-SY5Y細(xì)胞膜的特異性結(jié)合。計(jì)算出的ATo值是118pM(范圍是87-149),而計(jì)算出的^nax值是96fmol/mg蛋白質(zhì)(范圍是88-104)。這相當(dāng)于利用中國倉鼠卵巢細(xì)胞上表達(dá)的重組的人類p-阿片樣受體得到的值(G.-M.Zhao和H.H.Szeto，未公開的數(shù)據(jù))。沒有觀察到與Caco-2細(xì)胞膜的高度親和性的特異性結(jié)合(圖3B)。已知HEK293細(xì)月包；殳有阿片才羊受體(Blake等"S/o/.C/^w.，1997，272:782-790)。實(shí)施例7:DmtMDALDA和Glv-Sar從Caco-2細(xì)月包中的泄漏。Caco-2細(xì)胞中的[3H][Dm。DALDA在<30分鐘的孵育后達(dá)到穩(wěn)態(tài)水平，這表明此時(shí)該肽從細(xì)胞中泄漏的速率與攝取的速率相等。為了測定Gly-Sar和[Dmt']DALDA乂人細(xì)月包中的泄漏量，用[14C]Gly-Sar或[3H][Dm。DALDA將Caco-2細(xì)月包預(yù)載，然后纟會該細(xì)胞換上不包含肽的新鮮培養(yǎng)基。圖4A顯示37。C時(shí)1小時(shí)后在培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)了390/。的["C]GIy-Sar。[14C]Giy-Sar的泄漏量在4。C時(shí)顯著減少了。源自Caco-2細(xì)胞的[3H][Dm—]DALDA的泄漏要快得多，在1小時(shí)時(shí)該肽的80%泄漏到培養(yǎng)基中(圖4A)。與[3H][Dm。DALDA的內(nèi)在化相反(圖1A)，溫度對于[SH][Dm。DALDA從細(xì)胞中的泄漏具有重大的影響(圖4A)。在用DEPC處理過的細(xì)胞中，[Dm]DALDA的泄漏減少了(圖4B)。由DEPC所致的[3H][Dm]DALDA泄漏量的減少與DEPC存在時(shí)[3H][Dm。DALDA才聶取的顯著增加(圖2C)相一致。另一方面，["H][Dm一]DALDA的泄漏不受異搏定(一種P-糖蛋白的抑制劑)的影響(圖4C)。異搏定對于pH][Dmt"DALDA的細(xì)胞攝取也沒有影響(圖4D)。如果在[Dm。DALDA-蛋白質(zhì)結(jié)合物被細(xì)l包攝取后，其被酶切開，[Dm。DALDA泄漏出細(xì)胞，而蛋白質(zhì)裝載物仍在細(xì)胞內(nèi)，那么這種[Dmt']DALDA泄漏出細(xì)胞就是有利的。實(shí)例8:『DmtMDALDA和Glv-Sar的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。在轉(zhuǎn)孔(transwell)中生長的Caco-2單層被用于研究[3H][Dm]DALDA和["C]Gly-Sar的乂人頂部到底側(cè)部的轉(zhuǎn)運(yùn)。圖5顯示在轉(zhuǎn)孔的頂部面加載了該肽后，在不同的時(shí)間時(shí)底側(cè)面中的[14C]Gly-Sar和[3;H][Dmt"DALDA的轉(zhuǎn)運(yùn)。在60分鐘內(nèi)[3H][Dmt"DALDA從頂部面轉(zhuǎn)移到底側(cè)面的百分?jǐn)?shù)(10.4%)與轉(zhuǎn)移的["C]Gly-Sar的百分?jǐn)?shù)(11.9%)相當(dāng)。據(jù)推算，[Dmt']DALDA的表觀滲透系數(shù)是1.24xl(r5cm/s,而Gly-Sar的表觀滲透系數(shù)是1.26xl(T5cm/s.實(shí)施例9:利用CLSM觀察芳香族-陽離子肽的細(xì)月&聶取。為了觀察芳香族-卩日離子肽的細(xì)胞內(nèi)在化的攝取和模式，借助CLSM研究了兩種熒光肽([Dmt1,dnsDap"DALDA和[Dmt1,atnDap4]DALDA)。圖6顯示了在Caco-2細(xì)胞與O.ljuM[Dmt1,dnsDap勺DALDA在37。C孵育15分鐘后，該熒光肽的內(nèi)在化進(jìn)入Caco-2細(xì)胞。出現(xiàn)的熒光彌散于整個(gè)細(xì)胞質(zhì)，而沒有明顯的泡狀分布，表明該肽的才聶取沒有涉及內(nèi)吞作用，并且該肽沒有一皮去于閉在內(nèi)涵體內(nèi)。還注意到，該肽^皮完全排除于細(xì)月包核外。在SH-SY5Y纟田月包與0.1|iM[Dmt、atnDap4]DALDA在4。C孵育30分鐘后，[Dmt1,atnDap勺DALDA內(nèi)在化進(jìn)入SH-SY5Y細(xì)胞，這清楚地支持非能量依賴性的非內(nèi)吞的攝取機(jī)制，原因是內(nèi)吞是一種依賴能量的過程。實(shí)施例10:肽連接到交聯(lián)劑SMCC上，并且通ij^鐠分析確認(rèn)。將SMCC(lpg)和5pg的[Dmt"DALDA，[Phe"DALDA、或者[右旋精氨酸-Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2]—起溶解在2mlPBS中、在室溫下孵育30分鐘、然后在4。C貯存。將該才羊品的等分試樣與基質(zhì)(50%的乙腈中飽和的3-幾基吡咬羧酸(HPA),10mg/ml的檸檬酸銨)以1:10的比率混合，然后將其點(diǎn)樣在不《秀鋼的耙平板上。通過基質(zhì)輔助的激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)鐠分析(MALDI-TOFMS)(AppliedBiosystems(VoyagerDEPro))以正向反射才莫式分4斤沖羊品。該肽的分子量和它們各自的肽-SMCC共輒結(jié)合物顯示在質(zhì)譜上(圖7)。實(shí)施例11:與蛋白質(zhì)裝載物結(jié)合的肽將蛋白質(zhì)裝載物帶入細(xì)胞。利用交if關(guān)劑SMCC(Pierce)將各種肽交耳關(guān)到p-半乳糖苷酶上(recombinantE.coli，Sigma-Aldrich)。SMCC與含胺的分子([Dm。DALDA的Lys4)反應(yīng)，以便形成穩(wěn)定的酰胺4建。通過質(zhì)譜分析確i人肽-SMCC共扼結(jié)合物的形成(圖7)。隨后它的馬來酰亞胺基末端可以被共扼結(jié)合到含巰基的化合物上，以便形成硫醚鍵:(GregT.Hermanson的BioconjugateTechniques,Academic出片反牙土，234-237頁)。(3-半乳糖苷酶在其天然狀態(tài)時(shí)包含大量自由巰基。(3-半乳糖普酶的攝取提供了利用X-gal的便利的讀取。簡單；也it,室溫下a尋1ml5x10-3M[Dmt]DALDA、[Phe^DALDA、或者[右旋精氨酸-Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NHz]與lmgSMCC在磷酸鹽緩沖液中混合1小時(shí)。這形成"活化的肽"。用磷酸鹽緩沖液將"活化的肽"按1:10稀釋。將lmg(3-半乳糖苷酶力口入到lml該1:10的"活化的肽，，中，并且在4。C混合2小時(shí)或一整夜。將細(xì)胞(N2A神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞或Caco-2)平鋪在96孔板內(nèi)(2x104個(gè)細(xì)胞/孔)，隨后在37。C將細(xì)胞與J3-半乳糖苷酶或與[Dm—]DALDA交聯(lián)的p-半乳糖普酶、[Phe^DALDA或者[右旋精氨酸-Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2]孵育1小時(shí)。然后用磷酸鹽緩沖液將細(xì)胞洗4次。隨后在37。C用P-半乳一唐苦酶染色系統(tǒng)(Roche)將細(xì)胞染色至少2小時(shí)，隨后在顯^t鏡下;^查。當(dāng)Caco-2細(xì)胞與P-半乳糖苷酶孵育時(shí)，沒有觀察到p-半乳糖苷酶的攝取(圖8A)。藍(lán)色細(xì)胞的存在表明Caco-2細(xì)胞內(nèi)與[Dm。DALDA共扼結(jié)合的(3-半乳糖香酶的攝取(圖8B)。在p-半乳糖苷酶與[右旋精氨酸-Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2](圖8C)或[Phe^DALDA(圖8D)共輒結(jié)合時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了|3-半乳糖香酶的攝取增加。p-半乳糖苷酶僅與SMCC的共輒結(jié)合沒有增加攝取。在利用神經(jīng)N2A細(xì)胞或CHO細(xì)胞(中國倉鼠卵巢細(xì)胞)時(shí)，也得到了同樣的結(jié)果。實(shí)施例12:與『DmtMDALDA-SMCC結(jié)合物的孵育增加了綠色熒光蛋白(GFP)迭入Huh7細(xì)胞的才聶取。用DMEM沖洗Huh7細(xì)胞(1xio6個(gè)細(xì)胞/孔)，隨后在37。C將細(xì)胞與0.5mlDMEM孵育60分鐘，該DMEM:^f又包含3pgGFP;包含3嗎GFP和40jLil[Dmt!]DALDA;或者包含3jigGFP和40|al與SMCC結(jié)合的[Dm—]DALDA。隨后將2ml細(xì)胞培養(yǎng)基加入到細(xì)胞中，并在細(xì)胞培養(yǎng)孵育器中孵育額外的24小時(shí)。孵育后，在細(xì)胞培養(yǎng)基中將細(xì)胞沖洗四次，隨后通過激光共聚焦掃描顯微鏡觀察保留在活細(xì)胞中的GFP。在340nm處進(jìn)行激發(fā)，而在520nm處測量發(fā)射。圖9(頂部的板塊)代表通過Huh7細(xì)胞的0.8jum厚的中部的水平光學(xué)部分的GFP的圖像。圖9(底部的板塊)代表同一區(qū)域內(nèi)的不同界面的對比圖像。GFP與[Dm一]DALDA的聘育顯示與^又與GFP孵育相比，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的綠色熒光適中地增加(圖9B)。在細(xì)胞核內(nèi)沒有觀察到纟錄色熒光。GFP與[Dm。DALDA-SMCC結(jié)合物的孵育甚至顯示了更多的GFP的攝取(圖9C)。這些數(shù)據(jù)表明[Dm。DALDA可以僅通過修飾的肽與蛋白質(zhì)的物理性混合增加蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的攝取，而該肽與蛋白質(zhì)之間的化學(xué)性結(jié)合不是必需的。實(shí)施例13:fDmt"DALDA與RNA裝載物的結(jié)合。在與多聚核苷酸激酶的反應(yīng)中，利用y-32P_ATP在5'末端將合成的RNA低聚物(長度為40個(gè)核苷酸)磷酸化。通過凝膠將產(chǎn)物純化。在lmgEDC(N-[3-二甲氨基丙基-N，-乙基碳酰亞胺])存在時(shí)，500,000計(jì)數(shù)/分鐘的凝膠-純化的RNA低聚物在與10mM[Dm。DALDA的反應(yīng)中與其共軛連接。將結(jié)合反應(yīng)的產(chǎn)物([Dm。DALDA-脂A低聚物)與單獨(dú)的對照RNA低聚物在15%的聚丙烯酰胺基脲凝膠上分析。在該凝膠上的兩條獨(dú)立的帶表示單獨(dú)的RNA低聚物和[Dm—]DALDA-RNA低聚物的結(jié)合物(圖10)。實(shí)施例14:『DmPlDALDA-RNA〗氐聚物的結(jié)合物祐j聶取入C3co-2細(xì)胞。將Caco-2細(xì)月包(1xio6)在DMEM培養(yǎng)基中洗三次，并且在加入低聚物之前在DMEM中預(yù)先孵育5分鐘。隨后，將[Dmt^DALDA-RNA〗氐聚物的結(jié)合物或非結(jié)合的RNA(每個(gè)4妾近20,000計(jì)^:/每分鐘)加入到該細(xì)胞培養(yǎng)基中，并且在37。C孵育60分鐘。孵育后，除去反應(yīng)培養(yǎng)基，用DMEM將細(xì)胞洗四次，并且在醋酸鈉溶液中洗一次，以{更減少非特異性結(jié)合。最后，將細(xì)l包在;容解纟爰沖液中孵育30分4f,隨后在細(xì)月包溶解產(chǎn)物中測定放射性。Caco-2細(xì)胞顯示對[Dmti]DALDA-RNA低聚物的結(jié)合物的攝取比對單獨(dú)的非共扼結(jié)合的RNA^氐聚物的才聶取多了三倍多(圖11)。因此，[Dmt']DALDA可以促進(jìn)RNA低聚物穿過細(xì)胞膜。實(shí)施例15:RNA與『DmlDALDA-SMCC連接劑的混合增強(qiáng)了RNA被攝取入細(xì)胞。通過將RNA和[Dm—]DALDA-SMCC結(jié)合物物理性混合形成該載體復(fù)合物。如下所述，通過將[Dm]DALDA與交3f關(guān)劑SMCC混合來制備[DmP]DALDA-SMCC結(jié)合物。在用于細(xì)胞攝取研究前，將單鏈的ll-merpP]RNA低聚物與[Dm。DALDA-SMCC結(jié)合物在室溫下混合15分鐘。用DMEM沖洗Huh7細(xì)胞(1x106個(gè)細(xì)胞/孔)，隨后在37。C或4。C將該細(xì)胞與1.0mlDMEM將育，該DMEM中^又包含[32p]認(rèn)A低聚物(~100,000cpm)，或者包含[32p]RNA低聚物和40)^1[Dm—]DALDA-SMCC結(jié)合物。隨后將細(xì)月包在DMEM中洗四次，并且在醋酸鈉溶液中洗一次，以便將其在溶解緩沖液中孵育30分鐘之前除去非特異性結(jié)合，隨后測定保留的放射性。RNA低聚物與[Dm]DALDA-SMCC在37。C孵育提高了作為時(shí)間函數(shù)的RNA低聚物的攝取(圖12A)。在一'J、時(shí)時(shí)，RNA低聚物的才聶取在[Dm。DALDA-SMCC結(jié)合物存在時(shí)與單獨(dú)的RNA孵育相比才是高了~20倍。RNA的攝取一皮[Dm。DALDA-SMCC顯著地提高了(圖12B)。這些數(shù)據(jù)表明可以不經(jīng)過與[Dm。DALDA的化學(xué)結(jié)合物提高RNA的攝取。4C時(shí)的攝取提高了非能量依賴性的非胞吞過程，與[Dm—]DALDA通過被動擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞膜的能力一致。除了[Dm。DALDA-SMCC,與[Phe"DALDA-SMCC結(jié)合物的孵育也可以提高ll-merRNA低聚物的攝取。圖12C顯示RNA攝耳又的增加，在37。C與三種不同的肽-SMCC結(jié)合物孵育15分鐘。如圖13所示，與[Dm。DALDA-SMCC結(jié)合物的孵育也可以4足進(jìn)大的多的RNA分子(1350-mer)的細(xì)胞攝取，雖然沒有對較小的低聚物那么多。實(shí)施例16:fDm—lDALDA與DNA寸氐聚物的結(jié)合。將SMCC(l|ig)和[Dm一]DALDA(SS002;5jug)—起〉容解在2mlPBS中、在室溫下孵育30分鐘、隨后在4。C與去保護(hù)的3，-硫醇基DNA低聚物混合24小時(shí)。孵育后，將樣品的等分試樣與基質(zhì)(50%的乙腈中々包和的3-羥基吡口定羧酸(HPA),10mg/ml的4寧訐蒙酸銨)以1:10的比率混合，并且將其點(diǎn)樣在不銹鋼的耙向平板上。通過MALDI-TOFMS確認(rèn)DNA-[Dmt^DALDA結(jié)合物的形成。已發(fā)現(xiàn)3，-硫醇基DNA低聚物和[Dm。DALDA-DNA共價(jià)復(fù)合物的分子量分別為6392和7171(圖14A)。實(shí)施例17:『Dmt"DALDA-DNA寸氐聚物的結(jié)合物凈皮才聶取入細(xì)胞。利用SMCC將3，-石克醇》務(wù)飾的20-merDNA共專厄結(jié)合到[Dm。DALDA上，并且通過質(zhì)i普分析確認(rèn)結(jié)合物的形成。用32P將結(jié)合和非結(jié)合的DNA低聚物在其5，-末端用放射性同位素標(biāo)記(圖14B)。用DMEM沖洗神經(jīng)N2A(1x106個(gè)細(xì)月包/孔)細(xì)月包，然后在37。C和5。/。C02的條件下將該細(xì)胞與lmlDMEM孵育2小時(shí)或19小時(shí)，該DMEM中包含有或沒有與DNA低聚物(~100,000cpm)結(jié)合的[Dmt]]DALDA。然后將細(xì)月包在DMEM中沖洗四次，在醋酸鈉;容液中沖洗一次，以1更減少非特異性結(jié)合。隨后將該細(xì)胞在溶解緩沖液中孵育30分鐘，隨后確定保留的放射性。19小時(shí)的孵育后，與[Dm]DALDA結(jié)合的DNA的才聶耳又多于沒有結(jié)合的DNA(圖15),表明與[Dm。DALDA的結(jié)合可以增加DNA的攝取。實(shí)施例18:肽和肽-SMCC結(jié)合物對細(xì)胞沒有毒性。不管是該肽還是肽-SMCC結(jié)合物對培養(yǎng)的細(xì)胞是沒有毒性的。用[Dm—〗DALDA(lnM到lO)iiM)處理24小時(shí)對細(xì)胞的生存能力沒有影響，這一點(diǎn)通過對N2A細(xì)月包、SH-SY5Y細(xì)胞或Caco-2細(xì)胞的MTT實(shí)-驗(yàn)測定(MTSassay,Promega,麥迪遜市，威斯康星州)(圖16)。對[右旋精氨酸-Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2]的同樣的研究也表明對細(xì)胞生存能力沒有影響。將培養(yǎng)的細(xì)胞與肽-SMCC結(jié)合物孵育對細(xì)胞的生存能力也沒有影響，這一點(diǎn)通過臺盼藍(lán)的攝取測定。臺盼藍(lán)僅被細(xì)胞膜通透性增力口的纟田胞才聶取。在DMEM、和lml新鮮的培養(yǎng)基、或包含50)^1的lmM[Dm一]DALDA-SMCC結(jié)合物、[右禱j青氨酸-Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2]-SMCC結(jié)合物、或[Phe^DALDA—SMCC結(jié)合物中將Huh7細(xì)胞(1x106)沖洗三次，并且在37。C和5°/。C02的條件下孵育24小時(shí)。隨后用DMEM將細(xì)胞沖洗三次，然后將lml0.4。/。臺盼藍(lán)加入到該細(xì)月包中達(dá)2分鐘。通過在細(xì)月包培養(yǎng)基中沖洗細(xì)胞除去過多的染料，通過光學(xué)顯微鏡檢查該細(xì)胞。通過光學(xué)顯微鏡對細(xì)胞的檢查表明僅與介質(zhì)孵育的細(xì)胞顯示了最小的臺盼藍(lán)攝取。在與[Dm]DALDA-SMCC、[右旋精氨酸~01111-賴氨酸-苯丙氨酸-1^12]-8]^(3<^、或[Phe^DALDA醉育的細(xì)胞中沒有觀察到臺盼藍(lán)的攝取增加。與之相比，與DEPC(焦碳酸二乙酯)孵育的細(xì)胞產(chǎn)生臺盼藍(lán)攝取的顯著增加。培養(yǎng)的細(xì)胞與[Dm〗DALDA-SMCC結(jié)合物的孵育也沒有？1起培養(yǎng)的Huh7細(xì)月包的凋亡。將Huh7細(xì)胞(1xlo6個(gè)纟田月包/孔)在DMEM中沖洗三次，并且加入lml新鮮的培養(yǎng)基。隨后，將50jalPBS中經(jīng)^務(wù)飾的[Dm。DALDA(lmM)或^f義PBS(對照)加入到該細(xì)胞培養(yǎng)基中，并且在37。C和5。/QC02的條件下孵育24小時(shí)。孵育后，^!奪1ml可以將凋亡的細(xì)月包核染色的Hoechst染泮牛(MolecularProbes,尤金，俄勒閃州)力口入到纟田月包中，并且再孵育15分鐘。通過用細(xì)胞培養(yǎng)基(不含pH指示劑)沖洗細(xì)胞除去過多的Hoechst染料，然后利用熒光顯樣"竟(在350nm處激發(fā)，而在461nm處測量發(fā)射)比較經(jīng)[Dm。DALDA-SMCC結(jié)合物處理的細(xì)胞和對照細(xì)胞。通過細(xì)胞核中的熒光濃度顯示凋亡。圖17表明經(jīng)[Dmt"DALDA-SMCC處理的Huh7細(xì)胞中凋亡的水平與對照細(xì)胞中的凋亡水平相同。權(quán)利要求1.一種將分子遞送到細(xì)胞的方法，所述方法包括將載體復(fù)合物與所述細(xì)胞接觸，其中所述載體復(fù)合物包括所述分子和芳香族陽離子肽，其中所述芳香族陽離子肽包括(a)至少一個(gè)凈正電荷；(b)最少三個(gè)氨基酸；(c)最多十個(gè)氨基酸；(d)凈正電荷的最小數(shù)目(pm)與氨基酸殘基的總數(shù)(r)之間的關(guān)系為其中3pm是小于或者等于r+1的最大數(shù)；以及(e)芳香基團(tuán)的最小數(shù)目(a)與凈正電荷的總數(shù)(pt)之間的關(guān)系為其中3a是小于或者等于pt+1的最大數(shù)，除非當(dāng)a為1時(shí)，pt也可以為1。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中2a是小于或者等于pt+1的最大數(shù)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中a等于pt。4.才艮據(jù)—又利要求1所述的方法，其中所述肽具有最少兩個(gè)正電訶。5.纟艮據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽具有最少三個(gè)正電^r。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽是包括兩個(gè)帶正電荷的氨基酸和一個(gè)芳香族氨基酸的三肽。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,氨基酸。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,的C-末端羧基一皮酰胺化。權(quán)利要求書第2/12頁其中所述肽是水溶性的。其中所述肽包括一個(gè)或多個(gè)D-其中所述氨基酸的位于C-末端10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽包括一個(gè)或多個(gè)非天然存在的氨基酸。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽具有最少四個(gè)氨基酸。12.才艮據(jù)4又利要求1所述的方法，其中所述肽具有最多約八個(gè)氨基酸。13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽具有最多約六個(gè)氨基酸。14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽具有四個(gè)氨基酸。15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽的分子式是酪氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-NH2(DALDA)。16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽的分子式是2，,6，-Dmt-右旋精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-NH2(Dmt、DALDA)。17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽的分子式是苯丙氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-NH2(Phe^DALDA)。18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽的分子式是右旋精氨酸-2，，6，Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2。19.才艮據(jù);K利要求1所述的方法，其中所述肽的分子式是2，,6，-Dmp-右旋精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-NH2(Dmp'-DALDA)。20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述分子是小分子。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述小分子是具有藥物活性的分子。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述具有藥物活性的分子是抗生素。23.沖艮據(jù)^又利要求21所述的方法，其中所述具有藥物活性的分子是細(xì)胞毒性劑。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述細(xì)胞毒性劑是鏈霉素。25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述細(xì)胞毒性劑是阿霉素。26.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述具有藥物活性的分子是抗氧化劑。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述抗氧化劑是維生素E。28.才艮據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述抗氧化劑是維生素C。29.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述抗氧化劑是P-胡蘿卜素。30.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述分子是生物分子。31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述生物分子是聚氨基酸。32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述生物分子是具有藥物活性的分子。33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的辦法，其中所述具有藥物活性的分子是內(nèi)源性的胎或蛋白質(zhì)。34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的辦法，其中所述具有藥物活性的分子是酶。35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法,是抗體。36.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法,是神經(jīng)生長因子。37.4艮據(jù)一又利要求32所述的方法,是細(xì)胞因子。38.4艮據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，是多聚核苷酸。39.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，是低聚核苦酸。40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法,41.才艮據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述具有藥物活性的分子其中所述具有藥物活性的分子其中所述具有藥物活性的分子其中所述具有藥物活性的分子其中所述具有藥物活性的分子其中所述具有藥物活性的分子其中所述具有藥物活性的分子其中所述低聚核苷酸是RNA。其中所述RNA是雙4連RNA。才艮據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，是內(nèi)源性的肽或蛋白質(zhì)。根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，是酶。42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述雙鏈RNA是siRNA。43.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述低聚核香酸是DNA。44.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述低聚核苦酸是單鏈脂A。45.才艮據(jù)—又利要求44所述的方法，其中所述單《連RNA是信使RNA(m脂A)。46.4艮據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述^氐聚核苷酸是核酶。47.才艮據(jù)一又利要求39所述的方法，其中所述低聚核苷酸是反義脂A。48.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述低聚核苷酸是核酶的外部指導(dǎo)序列。49.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述低聚核苷酸是RNA誘斜。50.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述生物分子是多聚氨基酸。51.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞是細(xì)菌的細(xì)胞。52.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞是植物細(xì)胞。53.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞是動物細(xì)胞。54.沖艮據(jù)4又利要求53所述的方法，其中所述動物細(xì)月包是哺乳動物的細(xì)月包。55.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞。56.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述細(xì)胞是腎上皮細(xì)胞。57.才艮據(jù)4又利要求53所述的方法，其中所述細(xì)胞是腸上皮細(xì)胞。58.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述細(xì)胞是血管內(nèi)皮細(xì)胞。59.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述血管內(nèi)皮細(xì)胞是血腦屏障內(nèi)皮細(xì)月包。60.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述細(xì)胞是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。61.才艮據(jù)片又利要求53所述的方法，其中所述細(xì)胞是肝細(xì)胞。62.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述芳香族-陽離子肽包括連接劑。63.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述分子包括連接劑。64.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述分子和芳香族陽離子肽是化學(xué)性結(jié)合。65.一艮據(jù)4又利要求1所述的方法，其中所述分子和芳香族陽離子肽是物理性結(jié)合。66.—種包括分子和芳香族陽離子肽的載體復(fù)合物，其中所述芳香族陽離子肽包括U)至少一個(gè)凈正電4肓；(b)最少三個(gè)氨基酸；(c)最多十個(gè)氨基酸；(d)凈正電荷的最小數(shù)目(pm)與氨基酸殘基的總數(shù)(r)之間的關(guān)系為其中3pm是小于或者等于r+1的最大數(shù)；以及(e)芳香基團(tuán)的最小數(shù)目(a)與凈正電荷的總數(shù)(pt)之間的關(guān)系為其中3a是小于或者等于pt+1的最大數(shù)，除非當(dāng)a為1時(shí)，pt也可以為1。67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中2a是小于或者等于pt+1的最大數(shù)。68.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中a等于pt。69.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述肽具有最少兩個(gè)正電荷。70.4艮據(jù)一又利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述肽具有最少三個(gè)正電荷。71.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述肽是包括兩個(gè)帶正電荷的氨基酸和一個(gè)芳香族氨基酸的三肽。72.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述肽是水溶性的。73.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述肽包括一個(gè)或多個(gè)D-氨基酸。74.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述氨基酸的位于C-末端的C-末端羧基一皮酰胺4b。75.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述肽包括一個(gè)或多個(gè)非天然存在的氨基酸。76.根據(jù)片又利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述肽具有最少四個(gè)氨基酸。77.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述肽具有最多約/\個(gè)氨基酸。78.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述肽具有最多約六個(gè)氨基酸。79.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述肽具有四個(gè)氨基酸。80.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述肽的分子式是酪氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-NH2(DALDA)。81.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述肽的分子式是2，,6，-Dmt-右旋精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-NH2(Dmt1-DALDA)。82.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述肽的分子式是苯丙氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-NH2(Phe1-DALDA)。83.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述肽的分子式是右旋精氨酸-2，,6，Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2。84.根據(jù)權(quán)利要求66所迷的載體復(fù)合物，其中所述肽的分子式是2，，6，-Dmp-右旋精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-NH2(Dmp'-DALDA)。85.根據(jù)權(quán)利要求66所迷的載體復(fù)合物，其中所迷分子是小分子。86.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述小分子是生物分子。87.根據(jù)權(quán)利要求86所述的載體復(fù)合物，其中所述生物分子是聚氨基酸。88.根據(jù)權(quán)利要求85所述的載體復(fù)合物，其中所述小分子是具有藥物活性的分子。89.根據(jù)權(quán)利要求88所述的載體復(fù)合物，其中所述具有藥物活性的分子是抗生素。90.根據(jù)權(quán)利要求88所述的載體復(fù)合物，其中所述具有藥物活性的分子是細(xì)胞毒性劑。91.根據(jù)權(quán)利要求90所述的載體復(fù)合物，其中所述細(xì)胞毒性劑是鏈霉素。92.根據(jù)權(quán)利要求90所述的載體復(fù)合物，其中所述細(xì)胞毒性劑是阿霉素。93.根據(jù)權(quán)利要求88所述的載體復(fù)合物，其中所述具有藥物活性的分子是抗氧化劑。94.根據(jù)權(quán)利要求93所述的載體復(fù)合物，其中所述抗氧化劑是維生素E。95.根據(jù)權(quán)利要求93所述的載體復(fù)合物，其中所述抗氧化劑是維生素C。96.根據(jù)權(quán)利要求93所述的載體復(fù)合物，其中所述抗氧化劑是P-胡蘿卜素。97.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述分子是生物分子。98.根據(jù)權(quán)利要求97所述的載體復(fù)合物，其中所述生物分子是具有藥物活性的分子。99.才艮據(jù)4又利要求98所述的載體復(fù)合物，其中所述具有藥物活性的分子是內(nèi)源性的肽或蛋白質(zhì)。100.根據(jù)權(quán)利要求98所述的載體復(fù)合物，其中所述具有藥物活性的分子是酶。101.根據(jù)權(quán)利要求98所述的載體復(fù)合物，其中所述具有藥物活性的分子是抗體。102.根據(jù)權(quán)利要求98所述的載體復(fù)合物，其中所述具有藥物活性的分子是神經(jīng)生長因子。103.根據(jù)權(quán)利要求98所述的載體復(fù)合物，其中所述具有藥物活性的分子是細(xì)胞因子。104.才艮據(jù)^又利要求98所述的載體復(fù)合物，其中所述具有藥物活性的分子是多聚核苷酸。105.根據(jù)權(quán)利要求98所述的載體復(fù)合物，其中所述具有藥物活性的分子是低聚核苷酸。106.根據(jù)權(quán)利要求105所述的載體復(fù)合物，其中所述低聚核苷酸是腦A。107.根據(jù)權(quán)利要求106所述的載體復(fù)合物，其中所述RNA是雙鏈RNA。108.根據(jù)權(quán)利要求107所述的載體復(fù)合物，其中所述雙鏈RNA是si脂A。109.根據(jù)權(quán)利要求106所述的載體復(fù)合物，其中所述低聚核苷酸是DNA。110.根據(jù)權(quán)利要求105所述的載體復(fù)合物，其中所述低聚核香酸是單鏈RNA。111.才艮據(jù)權(quán)利要求IIO所述的載體復(fù)合物，其中所述單鏈RNA是信使RNA(m脂A)。112.根據(jù)權(quán)利要求105所述的載體復(fù)合物，其中所述低聚核苷酸是核酶。113.根據(jù)權(quán)利要求105所述的載體復(fù)合物，其中所述低聚核苷酸是反義RNA。114.根據(jù)權(quán)利要求105所述的載體復(fù)合物，其中所述低聚核苷酸是核酶的外部指導(dǎo)序列。115.根據(jù)權(quán)利要求105所述的載體復(fù)合物，其中所述低聚核苷酸是RNA誘餅。116.根據(jù)權(quán)利要求97所述的載體復(fù)合物，其中所述生物分子是聚氨基酸。117.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述芳香族陽離子月大包纟舌連4妄劑。118.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述分子包括連接刑d119.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述分子和芳香族陽離子肽是化學(xué)性結(jié)合。120.根據(jù)權(quán)利要求66所述的載體復(fù)合物，其中所述分子和芳香族陽離子肽是物理性結(jié)合。121.—種將分子遞送到細(xì)胞的方法，所述方法包括將分子和芳香族陽離子肽與所述細(xì)胞接觸，其中所述芳香族陽離子肽包括(a)至少一個(gè)凈正電荷；(b)最少三個(gè)氨基酸；(c)最多十個(gè)氨基酸；(d)凈正電荷的最小數(shù)目(pm)與氨基酸殘基的總數(shù)(r)之間的關(guān)系為，其中31是小于或者等于『+1的最大數(shù)；以及(e)芳香基團(tuán)的最小數(shù)目(a)與凈正電荷的總數(shù)(pt)之間的關(guān)系為，其中3&是小于或者等于^+1的最大數(shù)，除非當(dāng)a為1時(shí)，pt也可以為1。122.根據(jù)權(quán)利要求121所述的方法，其中所述分子和芳香族陽離子肽是化學(xué)性結(jié)合。123.4艮據(jù)4又利要求121所述的方法，其中所述分子和芳香族陽離子肽是物理性結(jié)合。全文摘要本發(fā)明涉及用于遞送分子到細(xì)胞的載體復(fù)合物和方法。根據(jù)本發(fā)明該載體復(fù)合物包括分子和芳香族陽離子肽。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，用于遞送分子到細(xì)胞的方法包括使載體復(fù)合物與細(xì)胞接觸。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，該用于遞送分子到細(xì)胞的方法包括將分子和芳香族陽離子肽與細(xì)胞接觸。文檔編號C12N15/85GK101214380SQ20081000018公開日2008年7月9日申請日期2004年5月3日優(yōu)先權(quán)日2003年5月1日發(fā)明者亞歷克斯·V·比爾克,休·D·羅伯遜,趙克勝,黑茲爾·塞托申請人:科內(nèi)爾研究基金會