專利名稱：結(jié)縷草中脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Rd29A的克隆和功能鑒定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬植物生物技術(shù)領(lǐng)域或作物育種領(lǐng)域。具體說，涉及結(jié)縷草DNA的提取、引物設(shè)計(jì)、基因克 隆和載體構(gòu)建、基因槍轉(zhuǎn)化的相關(guān)技術(shù)。從而從結(jié)縷草中獲得了脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Rd29A，并對(duì)其功能 進(jìn)行了鑒定。
背景技術(shù)：
干旱、高鹽及低溫脅迫都會(huì)使植物缺水受傷害，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致植物死亡。為了適應(yīng)或抵抗這些不利的 環(huán)境狀況，植物會(huì)做出各種反應(yīng)來維持本身的水分狀況，以避免或減輕缺水對(duì)細(xì)胞的危害，目前對(duì)這方 面的研究，重點(diǎn)集中在植物缺水引發(fā)的分子反應(yīng)和信號(hào)傳遞。根據(jù)近年來的報(bào)道，許多植物基因的表達(dá) 受上述干旱、高鹽及低溫脅迫的誘導(dǎo)。Rd29A基因編碼一種與LEA蛋白相似的親水性很強(qiáng)的蛋白，該 基因的表達(dá)受到干旱、低溫和高鹽的誘導(dǎo)。Rd29A基因啟動(dòng)子是一個(gè)受干旱、鹽堿的逆境誘導(dǎo)表達(dá)的特 異性啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子區(qū)域中，有兩個(gè)與上述環(huán)境脅迫應(yīng)答有關(guān)的DRE順式作用元件，DREB轉(zhuǎn)錄因子 和DRE元件在干旱、高鹽及低溫脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)遞中起重要作用。
結(jié)縷草CZo^iaJ卬o"/c"&eMc/.)是我國(guó)資源豐富的唯一不需要進(jìn)口的草坪草種，具有適應(yīng)性強(qiáng)，長(zhǎng)勢(shì) 旺盛，喜光、抗旱、抗熱和耐貧瘠，抗寒性在暖地型草坪草中表現(xiàn)得較突出，在微堿性土壤中亦能正常 生長(zhǎng)的特性。本發(fā)明從結(jié)縷草中克隆出脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Kd29A,并對(duì)其功能進(jìn)行了鑒定，為下一步用 此啟動(dòng)子調(diào)控逆境脅迫誘導(dǎo)基因的表達(dá)，提高轉(zhuǎn)基因草坪草抗逆性奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明以中國(guó)野生結(jié)縷草為材料，利用PCR方法獲得了脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Rd29A的序列，在GenBank 上的登錄號(hào)是EU346948。以表達(dá)載體pBI121為基礎(chǔ)，GFP (綠色熒光蛋白)為報(bào)告基因，構(gòu)建了用
于比較鑒定所克隆啟動(dòng)子活性的pBIG(35S-GFP)和pBIRG (Rd29A-GFP)兩個(gè)植物真核表達(dá)載體。采用基 因槍法對(duì)洋蔥表皮細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，檢測(cè)Rd29A啟動(dòng)子在受體細(xì)胞中調(diào)控GFP基因表達(dá)的活性，從而對(duì) 其功能進(jìn)行鑒定。
本發(fā)明的主要步驟包括以結(jié)縷草為植物材料，提取植物總DNA,利用生物軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異引 物，經(jīng)過PCR擴(kuò)增方法獲得了 Rd29A啟動(dòng)子序列，并以pBI121為基礎(chǔ)，分別構(gòu)建了 pBIG(35S-GFP)禾口 pBIRG
(Rd29A-GFP)兩個(gè)植物真核表達(dá)載體。采用基因槍法對(duì)洋蔥表皮細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，檢測(cè)Rd29A啟動(dòng)子在受
體細(xì)胞中調(diào)控GFP基因表達(dá)的活性。


圖1結(jié)縷草總DNA的電泳圖；圖2擴(kuò)增到的Rd29A啟動(dòng)子片段電泳圖；圖3結(jié)縷草脅迫誘導(dǎo)型 啟動(dòng)子Rd29A的核苷酸序列；圖4pBIG和pBIRG兩個(gè)植物表達(dá)載體的構(gòu)建圖；圖5 pBIRG表達(dá)載體中 GFP酶切檢測(cè)電泳圖；圖6pBIRG表達(dá)載體中Rd29A酶切檢測(cè)電泳圖；圖7 pBIRG表達(dá)載體中GFP的 PCR檢測(cè)電泳圖；圖8 pBIRG表達(dá)載體中Rd29A的PCR檢測(cè)電泳圖；圖9 25'C下35S驅(qū)動(dòng)GFP基因在 洋蔥表皮中的表達(dá)；圖10 25'C下Rd29A驅(qū)動(dòng)GFP基因在洋蔥表皮中的表達(dá)；圖11 4'C下Rd29A驅(qū)動(dòng) GFP基因在洋蔥表皮中的表達(dá)；圖12 4'C下35S驅(qū)動(dòng)GFP基因在洋蔥表皮中的表達(dá)。
具體實(shí)施方式
1材料與方法 U植物材料
結(jié)縷草的標(biāo)本由北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所采集并保存，采集于遼寧省遼陽(yáng)縣鴨子溝。 1.2實(shí)驗(yàn)方法
.2.1結(jié)縷草基因組DNA與大腸桿菌質(zhì)粒DNA提取
結(jié)縷草基因組DNA的提取采用SDS法(附圖l),大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取和相關(guān)操作采用堿裂解法 (具體實(shí)驗(yàn)操作步驟參考分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè))。 1.2.2 Rd29A啟動(dòng)子目的基因克隆
根據(jù)已報(bào)道的Rd29A啟動(dòng)子基因序列，經(jīng)分子生物學(xué)軟件01igo分析，設(shè)計(jì)了以下兩對(duì)引物，同時(shí)引入 了便于載體構(gòu)建過程中進(jìn)行定向連接的相應(yīng)酶切位點(diǎn)BamHI和HindIII。
Pl :5'-CTGCAAGAATCTCAAACACG-3'， P2:5'-TCCAATAGAAGTAATCAAACC-3' 以結(jié)縷草基因組DNA為模板，用P1和PS為引物，褲行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增參數(shù)為95'C5min, 94。C Ms, 57°C 40s， 72°C卯s, 30個(gè)循環(huán)，72。C延伸10min，循環(huán)結(jié)束后在4'C保存，進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。 1.2.3基因序列分析
將PCR擴(kuò)增出的基因片段交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序；利用分子生物學(xué)分析軟件 DNAMAN對(duì)測(cè)序結(jié)果與已知序列進(jìn)行同源性分析。 1.2.4兩種啟動(dòng)子分別驅(qū)動(dòng)的GFP基因植物表達(dá)載體構(gòu)建
選用Smal+SacI分別雙酶切pBI121和pTG質(zhì)粒，將回收到的約750bp的GFP基因片段與載體片段用T4 DNALigase連接，構(gòu)建成35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP基因的表達(dá)載體pBIG;用BamHI十HindIII分別雙酶切pBIG 和pT29A,將回收到的約800bp的Rd29A啟動(dòng)子片段和載體連接，構(gòu)建成Rd29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP基因的表 達(dá)載體pBIRG。 1.2.5基因槍轉(zhuǎn)化
轟擊材料為洋蔥表皮。洋蔥表皮平鋪于高滲培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)4-6h后，轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基上，pBIG和 pBIRG質(zhì)粒DNA濃度為lug/u，基因槍采用PDS-1000/He,樣品室真空度為26inHg，可裂膜壓力為1100psi，
說明書第4/6頁(yè)
耙距9cm。
1.2.6 GFP活性分析
基因槍轟擊后的材料，25'C暗培養(yǎng)12h，在4'C和25'C光照培養(yǎng)24h，在熒光顯微鏡Olympus Bx51 / Bx52 下觀察，照相，分析啟動(dòng)子表達(dá)活性。 2結(jié)果與分析 2.1 Rd29A啟動(dòng)子的克隆
以結(jié)縷草基因組DNA為模板進(jìn)打PCR擴(kuò)增得到一個(gè)約800bp的Rd2yA啟動(dòng)子基因片段(附圖2),測(cè)序結(jié) 果表明，該片段長(zhǎng)度為814bp，其中DRE順式作用元件、TATAbox均有(附圖3)，在GenBank上的登錄號(hào) 是EU346948。 , 2.2兩種啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP植物表達(dá)載體的構(gòu)建
用GFP替換pBI121中的GUS基因，命名為pBIG。用Rd29A啟動(dòng)子替換pBIG中的35S啟動(dòng)子，命名為 pBIRG (附圖4)。對(duì)pBIRG分別進(jìn)行酶切(附圖5、 6)和PCR (附圖7、 8)鑒定后，用金粉對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行包 被。
2.3啟動(dòng)子活性的鑒定分析
我們將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體通過基因槍法導(dǎo)入洋蔥表皮細(xì)胞，進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，通過觀察GFP的表達(dá)， 以確定該基因是否具有啟動(dòng)子的功能，為隨后利用Rd29A啟動(dòng)子提高轉(zhuǎn)基因植物抗逆性做好前期準(zhǔn)備。
將轉(zhuǎn)化后的洋蔥表皮分別于25'C和4'C條件下培養(yǎng)，在OLYPUSBX5 1 / BX52型熒光顯微鏡下用藍(lán)光 激發(fā)綠色熒光，在顯微鏡下觀察到洋蔥表皮呈現(xiàn)綠色熒光。在不同的培養(yǎng)條件下，4'C低溫誘導(dǎo)24h后Rd29A 啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)的GFP基因在洋蔥表皮細(xì)胞得到了高水平的表達(dá)，說明該啟動(dòng)子在低溫條件下能使所驅(qū)動(dòng)的 基因表達(dá)，而35S啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)的GFP基因在洋蔥表皮細(xì)胞中表達(dá)較弱(圖9、圖IO)。 25'C條件下,Rd29A啟
動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)的GFP基因在洋蔥表皮細(xì)胞中表達(dá)的強(qiáng)度較4。C的弱，而35S啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)的GFP基因在洋蔥表 皮細(xì)胞中表達(dá)較強(qiáng)(圖ll、圖12);進(jìn)一步說明該基因具有啟動(dòng)子功能，并在低溫條件下具有較強(qiáng)的調(diào)控能 力。
3討論
瞬時(shí)表達(dá)是用來檢測(cè)外源基因能否正常表達(dá)的一種方式，通過檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)情況，可用來研究 基因的表達(dá)調(diào)控。本研究選用的報(bào)告基因一綠色熒光蛋基因(GFP)是來源于動(dòng)物的一種報(bào)告基因，與其它 報(bào)告基因相比，由于植物本身不含綠色熒光蛋白基因，這就可以避免以往報(bào)告基因可能產(chǎn)生的底色對(duì)檢測(cè) 的干擾，可信度較高。此外，傳統(tǒng)檢測(cè)報(bào)告基因的方法需將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物或以原生質(zhì)體為受體材料， 過程非常繁瑣。而本實(shí)驗(yàn)選用洋蔥表皮細(xì)胞作為受體材料，并運(yùn)用基因槍轉(zhuǎn)化法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，省去了以往制 備生質(zhì)體或轉(zhuǎn)化植物所帶來的不便，簡(jiǎn)單易行，是研究基因表達(dá)調(diào)控一種有效的方法。
選擇合適的啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)目的靶基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)已成為植物基因工程研究的熱點(diǎn)問題之 一。針對(duì)不同的目的基因，人們選用不同的啟動(dòng)子，從而使靶基因在特定組織或條件下表達(dá)，以利轉(zhuǎn)基 因植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育。Rd29A基因的啟動(dòng)子被認(rèn)為是干旱、低溫和高鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，具有低溫、高 鹽和脫水響應(yīng)元件(CCGACAT)及TATA框(保守序列為TATAAA)。在逆境環(huán)境下可促進(jìn)靶基因大 量表達(dá)，從而提高轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性，但在結(jié)縷草中克隆出Rd29A啟動(dòng)子還尚沒有報(bào)道，因此，為隨 后構(gòu)建植物抗逆性表達(dá)載體進(jìn)行草坪草轉(zhuǎn)基因抗逆性研究奠定了基礎(chǔ)。
本發(fā)明利用基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)，并對(duì)發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行研究， 這一方法快速，方便，省去了用其他方法檢測(cè)而花費(fèi)的大量時(shí)間，以便快速地進(jìn)入到下一步的工作中。
降列表
〈110>北京林業(yè)大學(xué) 王瑩，韓烈保
<120>結(jié)縷草中脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Rd29A的克隆和功能鑒定<formula>formula see original document page 8</formula>
<213> 人工序列
<400> 3
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權(quán)利要求
1、結(jié)縷草脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Rd29A的克隆及功能鑒定，其技術(shù)體系包括(1)提取結(jié)縷草的總DNA。(2)根據(jù)已經(jīng)在GenBank上發(fā)布的Rd29A啟動(dòng)子的序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，引入合適的酶切位點(diǎn)，通過PCR擴(kuò)增出Rd29A啟動(dòng)子基因片斷，并進(jìn)行測(cè)序分析。(3)以pBI121表達(dá)載體為基礎(chǔ)，構(gòu)建由結(jié)縷草Rd29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP基因(綠色熒光蛋白)的植物表達(dá)載體。(4)鑒定結(jié)縷草Rd29A啟動(dòng)子的功能
2、 按照權(quán)利耍求1所述的方法，其特征在于，設(shè)計(jì)了一劉特異引物，在兩引物i)'端分別引入丁 HincUi丄和 BamH I 的酶切位點(diǎn)，Pl :5'-AAGCTTCTGCAAGAATCTCAAACACG-3' 和 P2 : 5'-GGATCCTCCAATAGAAGTAATCAAACC-3'。通過PCR獲得了 814bp片段，其核苷酸序列在GenBank 上的登錄號(hào)為EU346948。
3、 按照權(quán)利要求1所述的方法，以本實(shí)驗(yàn)保存的pBI121為基礎(chǔ)，利用GFP(綠色熒光蛋白)為報(bào)告基因， 構(gòu)建了用于比較鑒定所克隆啟動(dòng)子活性的pBIG(35S-GFP)、 pBIRG (Rd29A-GFP)兩個(gè)植物真核表達(dá)載 體。為下一步鑒定所克隆啟動(dòng)子的功能奠定了基礎(chǔ)。
4、 按照權(quán)利要求1所述的方法，采用基因槍法對(duì)洋蔥表皮細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，檢測(cè)Rd29A啟動(dòng)子在受體細(xì)胞 中調(diào)控GFP基因表達(dá)的活性。
全文摘要
本發(fā)明涉及結(jié)縷草中脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Rd29A的克隆和功能鑒定，其主要步驟包括以結(jié)縷草為植物材料，提取植物總DNA，利用生物軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，經(jīng)過PCR擴(kuò)增方法獲得了Rd29A啟動(dòng)子序列，并以pBI121為基礎(chǔ)，分別構(gòu)建了pBIG(35S-GFP)和pBIRG(Rd29A-GFP)兩個(gè)植物真核表達(dá)載體，采用基因槍法對(duì)洋蔥表皮細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，檢測(cè)Rd29A啟動(dòng)子在受體細(xì)胞中調(diào)控GFP基因表達(dá)的活性。本發(fā)明能篩選出適用于草坪草轉(zhuǎn)基因的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Rd29A，Rd29A啟動(dòng)子是一個(gè)受干旱、鹽堿和低溫等逆境誘導(dǎo)表達(dá)的特異性啟動(dòng)子，也是植物抗逆性基因工程中理想的逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，對(duì)于逆境條件下草坪草的生長(zhǎng)發(fā)育有重要意義。
文檔編號(hào)C12N15/29GK101381723SQ20081000077
公開日2009年3月11日 申請(qǐng)日期2008年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月16日
發(fā)明者君 劉, 曾會(huì)明, 瑩 王, 韓烈保 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué);韓烈保;王 瑩