專利名稱：：用于鑒定n-乙酰基轉(zhuǎn)移酶2(nat2)基因型的核苷酸引物組和探針的制作方法用于鑒定N-乙?；D(zhuǎn)移酶2(NAT2)基因型的核苷酸引物組和探針發(fā)明背景本發(fā)明涉及用于檢測N-乙?；D(zhuǎn)移酶2(NAT2)基因中單核苷酸多態(tài)性的基因型的核酸引物組和檢測探針。N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶2(NAT2)涉及臨床上重要的藥物如肺結(jié)核內(nèi)服藥異煙肼(INH)和水楊酸偶氮磺胺吡啶的代謝。水楊酸偶氮磺胺吡啶用于治療潰瘍性結(jié)腸炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病。已知在編碼NAT2的基因中存在遺傳多態(tài)性。NAT2活性較高的表現(xiàn)型稱為快型乙?；?RA)，而NAT2活性較低的表現(xiàn)型稱為慢型乙?；?SA)。據(jù)報(bào)道在日本人群中存在四種類型的多態(tài)型(NAT2A4，NAT2*5，NAT*6，NAT2*7)。NAT2A4是野生型。通過分析單核苷酸多態(tài)性T341C、G590A和G857A基因型可以分別鑒定出突變體等位基因NAT2*5、NAT*6和~入12*7。具有純合子突變體等位基因或混合雜合子突變體等位基因的人很可能是SA,并且具有更高的有害藥物作用發(fā)生率。為此，鑒定NAT2基因突變體有助于避免有害的藥物反應(yīng)。還有可能通過確定NAT2基因的基因型來選擇適用于個(gè)體病人的藥物施用和治療。通常通過借助于聚合Sm式反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增把核苷酸并用特異性探針檢測野生型和突變體擴(kuò)增產(chǎn)物來檢測單核苦酸多態(tài)性(見，參考文獻(xiàn)"JainK.K"ApplicationofAmplicip.CYP450,MolDiagn.9，119陽27[2005")。然而，PCR方法具有一些缺點(diǎn)，例如預(yù)處理過程(包括核苦酸提取)復(fù)雜，需要復(fù)雜的溫控設(shè)備，例如熱循環(huán)儀，以及需要2小時(shí)或更長的反應(yīng)時(shí)間。通過PCR方法擴(kuò)增的產(chǎn)物為雙鏈，這導(dǎo)致產(chǎn)生一個(gè)問題，即互##:降低了檢測靈敏度，在檢測過程中其又作為探針的竟?fàn)幷咂鹱饔?。已?jīng)研究了將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)變成單鏈的多種方法，例如通過使用酶或磁珠將互補(bǔ)鏈分解或分離。但是這些方法也存在操作復(fù)雜且昂貴的問題。發(fā)明簡述根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了用于檢測NAT2基因中單核苷酸多態(tài)性G590A的基因型的LAMP擴(kuò)增的核苷酸引物組，其中當(dāng)耙核苷酸從5，末端依次具有F3區(qū)、F2區(qū)和Fl區(qū)并且從3，末端依次具有B3c區(qū)、B2c區(qū)和Blc區(qū)時(shí)，并且當(dāng)引物組包括在3，末端側(cè)具有與F2區(qū)相同的序列并在5，末端側(cè)具有與Fl區(qū)互補(bǔ)的序列的FIP引物、具有與F3區(qū)相同的序列的F3引物、在3，末端側(cè)具有與B2c區(qū)互補(bǔ)的序列并在5，末端側(cè)具有與Blc區(qū)相同的序列的BIP引物、以及具有與B3c區(qū)互補(bǔ)的序列的B3引物時(shí)，引物組包括選自表2和3所示引物組1-16的FIP引物和BIP引物、結(jié)合至M苷酸上距F2區(qū)5，末端60個(gè)#內(nèi)區(qū)域的F3引物、以及結(jié)合至乾核苷酸上距B2c區(qū)3，末端60個(gè)堿基內(nèi)區(qū)域的B3引物。表2和3所示引物組1-16如下引物組1:SEQIDNo:l的FIP引物和SEQIDNo:7的BIP引物；引物組2:SEQIDNo:2的FIP引物和SEQIDNo:7的BIP引物；引物組3:SEQIDNo:5的FIP引物和SEQIDNo:7的BIP引物；引物組4:SEQIDNo:6的FIP引物和SEQIDNo:7的BIP引物；引物組5:SEQIDNo:10的FIP引物和SEQIDNo:13的BIP引物；引物組6:SEQIDNo:10的FIP引物和SEQIDNo:14的BIP引物；引物組7:SEQIDNo:15的FIP引物和SEQIDNo:ll的BIP引物；引物組8:SEQIDNo:15的FIP引物和SEQIDNo:12的BIP引物；引物組9:SEQIDNo:15的FIP引物和SEQIDNo:13的BIP引物；引物組10:SEQIDNo:15的FIP引物和SEQIDNo:14的BIP引物；引物組11:SEQIDNo:16的FIP引物和SEQIDNo:ll的BIP引物；引物組12:SEQIDNo:16的FIP引物和SEQIDNo:12的BIP引物；引物組13:SEQIDNo:16的FIP引物和SEQIDNo:13的BIP引物；引物組14:SEQIDNo:16的FIP引物和SEQIDNo:14的BIP引物；引物組15:SEQIDNo:17的FIP引物和SEQIDNo:13的BIP引物；引物組16:SEQIDNo:17的FIP引物和SEQIDNo:14的BIP引物。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用于檢測NAT2基因中單核苷酸多態(tài)性G857A的基因型的LAMP擴(kuò)增的核苷酸引物組，其中引物組包括選自表4所示引物組1-5的FIP引物和BIP引物、結(jié)合至靼核苷酸上距F2區(qū)5，末端60個(gè)#內(nèi)區(qū)域的F3引物、以及結(jié)合至M苷酸上距B2c區(qū)3，末端60個(gè)堿基內(nèi)區(qū)域的B3引物。表4所示引物組l-5如下引物組l:SEQIDNo:20的FIP引物和SEQIDNo:21的BIP引物;引物組2:SEQIDNo:20的FIP引物和SEQIDNo:22的BIP引物;引物組3:SEQIDNo:20的FIP引物和SEQIDNo:23的BIP引物;引物組4:SEQIDNo:20的FIP引物和SEQIDNo:25的BIP引物;引物組5:SEQIDNo:20的FIP引物和SEQIDNo:26的BIP引物。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用于檢測NAT2基因中單核苷酸多態(tài)性T341C的基因型的LAMP擴(kuò)增的核苷酸引物組，其中引物組包括選自表5所示引物組1-10的FIP引物和BIP引物、結(jié)合至M苷酸上距F2區(qū)5，末端60個(gè)g內(nèi)區(qū)域的F3引物、以及結(jié)合至M苷酸上距B2c區(qū)3，末端60個(gè)堿基內(nèi)區(qū)域的B3引物。表5所示引物組1-10如下引物組l:SEQIDNo:33的FIP引物和SEQIDNo:30的BIP引物引物組2:SEQIDNo:33的FIP引物和SEQIDNo:31的BIP引物引物組3:SEQIDNo:33的FIP引物和SEQIDNo:32的BIP引物引物組4:SEQIDNo:34的FIP引物和SEQIDNo:30的BIP引物引物組5:SEQIDNo:34的FIP引物和SEQIDNo:31的BIP引物引物組6:SEQIDNo:34的FIP引物和SEQIDNo:32的BIP引物引物組7:SEQIDNo:35的FIP引物和SEQIDNo:32的BIP引物引物組8:SEQIDNo:36的FIP引物和SEQIDNo:32的BIP引物引物組9:SEQIDNo:37的FIP《物和SEQIDNo:32的BIP引物引物組10:SEQIDNo:38的FIP引物和SEQIDNo:32的BIP引物。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用于檢測NAT2基因中單核苷酸多態(tài)性G590A和G857A的基因型的LAMP擴(kuò)增的核苷酸引物組，其中引物組包括選自表6所示引物組1-8的FIP引物和BIP引物、結(jié)合至M苷酸上距F2區(qū)5，末端60個(gè)#內(nèi)區(qū)域的F3引物、以及結(jié)合至靼核普酸上距B2c區(qū)3，末端60個(gè)堿基內(nèi)區(qū)域的B3引物。表6所示引物組l-8如下引物組l:SEQIDNo:42的FIP引物和SEQIDNo:43的BIP引物;引物組2:SEQIDNo:42的FIP引物和SEQIDNo:44的BIP引物;引物組3:SEQIDNo:45的FIP引物和SEQIDNo:43的BIP引物;引物組4:SEQIDNo:45的FIP引物和SEQIDNo:46的BIP引物;引物組5:SEQIDNo:47的FIP引物和SEQIDNo:43的BIP引物。引物組6:SEQIDNo:48的FIP引物和SEQIDNo:43的BIP引物;引物組7:SEQIDNo:48的FIP引物和SEQIDNo:46的BIP引物;引物組8:SEQIDNo:48的FIP引物和SEQIDNo:44的BIP引物。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了檢測NAT2基因中單核苷酸多態(tài)性G590A、G857A或T341C的基因型的方法，包括步驟通過使用核苷酸引物組擴(kuò)增耙核苷酸得到擴(kuò)增產(chǎn)物；和測定并比較擴(kuò)增產(chǎn)物中所包含的野生型擴(kuò)增產(chǎn)物和突變體擴(kuò)增產(chǎn)物的量。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了用于檢測通過使用核苷酸引物組擴(kuò)增M苷酸所得到擴(kuò)增產(chǎn)物的NAT2基因單核苷酸多態(tài)性G5卯A基因型的野生型和突變體核酸探針。在一個(gè)方面，野生型核苦酸探針與野生型擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)并具有62-70匸的Tm值，而突變體核苷酸探針與突變體擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)并具有61-69匸的Tm值，并且單核苷酸多態(tài)性G5卯A位點(diǎn)位于距各個(gè)核苷酸探針末端3個(gè)或更多個(gè)堿基的內(nèi)部。在另一個(gè)方面，野生型核苷酸探4十具有58-68*€的Tm值，而突變體核苷酸探針具有58-68"C的Tm值，并且單核香酸多態(tài)性G875A位點(diǎn)位于距各個(gè)核苷酸探針末端3個(gè)或更多個(gè)堿基的內(nèi)部。在另一個(gè)方面，野生型核苷酸探針具有61-69t:的Tm值，而突變體核苷酸探針具有58-70匸的Tm值，并且單核苷酸多態(tài)性T341C位點(diǎn)位于距各個(gè)核苷酸探針末端3個(gè)或更多個(gè)堿基的內(nèi)部。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了同時(shí)檢測NAT2基因的單核苷酸多態(tài)性G5卯A、G857A和T341C的基因型的方法。酸引物和檢測探針。因此，可以容易且成本低廉地檢測NAT2基因的T341C、G5卯A和G857A單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型。附圖簡述圖1是LAMP方法的示意圖2是說明LAMP方法中中間產(chǎn)物以及內(nèi)引物(FIP和BIP)退火位點(diǎn)的示意圖3是"^兌明環(huán)引物位置的示意圖4是+兌明LAMP方法中中間產(chǎn)物以及環(huán)引物(LFc和LBc)退火位點(diǎn)的示意圖5是說明擴(kuò)增產(chǎn)物檢測位置的示意圖6是探針固定化支持物的一個(gè)實(shí)施方案的平面示意圖7是說明該探針固定化支持物的一個(gè)實(shí)施方案的平面示意圖8顯示FIP引物位置的示意圖9A顯示NAT1和NAT2基因的序列，O指出報(bào)道的突變位點(diǎn)；圖9B是圖9A的延續(xù)，顯示NAT1和NAT2基因序列，O指出報(bào)道的突變位點(diǎn)；圖10顯示通過^f吏用引物組得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖，左圖為1小時(shí)擴(kuò)增，右圖為l小時(shí)擴(kuò)增，符號M、1、2、3、4、5和6分別代表100bp梯、引物組l、引物組2、引物組18、引物組19、引物組3和引物組4;圖11顯示通過^f吏用引物組得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的另一張電泳圖，符號M、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和16分別代表100bp梯、引物組20、引物組21、引物組5、引物組6、引物組7、引物組8、引物組9、引物組IO、引物組ll、引物組12、引物組13、引物組14、引物組22、引物組23、引物組15和引物組16;圖12顯示擴(kuò)增產(chǎn)物(包括非特異擴(kuò)增產(chǎn)物)的電泳圖，符號M、l和2分別代表100bp梯、無非特異擴(kuò)增和有非特異擴(kuò)增；圖13顯示了通過使用檢測G590A的探針?biāo)@得的試驗(yàn)結(jié)果1的圖14顯示了通過4吏用檢測G590A的探針?biāo)@得的試驗(yàn)結(jié)果2的圖15A顯示了通過使用檢測G590A的探針?biāo)@得的試驗(yàn)結(jié)果3(野生型純合子)的圖，U)、(b)、(c)和(d)分別代表不洗滌、40匸洗滌、45t:洗滌和50X:洗滌的情況；圖15B顯示了通過使用檢測G590A的探針?biāo)@得的試驗(yàn)結(jié)果3(突變體純合子)的圖，(a)、(b)、(c)和(d)分別代表不洗滌、40t)洗滌、45t;洗滌和50X:洗滌的情況；圖15C顯示了通過使用檢測G590A的探針?biāo)@得的試驗(yàn)結(jié)果3(雜合子)的圖，(a)、(b)、(c)和(d)分別代表不洗滌、40C洗滌、45C洗滌和50t:洗滌的情況；圖16A顯示了通過使用檢測G857A的探針?biāo)@得的試驗(yàn)結(jié)果l(引物組l)的圖16B顯示了通過使用檢測G857A的探針?biāo)@得的試驗(yàn)結(jié)果l(引物組5)的圖17顯示了通過使用檢測G857A的探針?biāo)@得的試驗(yàn)結(jié)果2的圖，(a)、(b)和(c)分別代表野生型純合子、突變體純合子和雜合子的情況；圖18A顯示了通過使用檢測T341C的探針?biāo)@得的試驗(yàn)結(jié)果1(引物組6)的圖，U)、(b)和(c)分別代表野生型純合子、突變體純合子和雜合子的情況；的圖，(a)、(b)和(c)分別代表野生型純合子、突變體純合子和雜合子的情況；圖19顯示了同時(shí)擴(kuò)增G5卯A和G857A的結(jié)果的圖，(a)、(b)和(c)分別代表野生型純合子、突變體純合子和雜合子的情況；圖20A顯示了同時(shí)檢測G5卯A、G857A和T341A(用于T341C的引物組6)的結(jié)果的圖，(a)、(b)和(c)分別代表野生型純合子、突變體純合子和雜合子的情況，G590A代表引物組9，G857A代表引物組5，T341C代表引物組6;和圖20B顯示了同時(shí)檢測G590A、G857A和T341A(用于T341C的引物組IO)的結(jié)果的圖，(a)、(b)和(c)分別代表野生型純合子、突變體純合子和雜合子的情況，G590A代表引物組9，G857A代表引物組5，T341C代表引物組IO。發(fā)明詳述PCR方法經(jīng)常用于檢測單核苷酸多態(tài)性，但是PCR方法具有上述缺點(diǎn)。因此，在本發(fā)明中單核苷酸多態(tài)性通過替代PCR方法的環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)方法檢測。在LAMP方法中，核苷酸在60-65匸等溫條件下擴(kuò)增。LAMP方法具有優(yōu)點(diǎn)，即與PCR方法相比可以在更短的時(shí)間內(nèi)得到更大量的擴(kuò)增產(chǎn)物。還報(bào)道，反應(yīng)受樣品中雜質(zhì)的影響較小。因此通過LAMP方法可以容易地?cái)U(kuò)增靼核苷酸。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過LAMP方法擴(kuò)增了乾核苷酸，并且分別測定了擴(kuò)增產(chǎn)物中野生型擴(kuò)增產(chǎn)物和突變體擴(kuò)增產(chǎn)物的量。當(dāng)存在許多野生型擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可將所試驗(yàn)把核苷酸的基因型判定為野生型純合子。相反，當(dāng)存在許多突變體擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可將耙核苷酸的基因型判定為突變體純合子。備選地，當(dāng)野生型和突變體擴(kuò)增產(chǎn)物的量幾乎相等時(shí)，將耙核苷酸的基因型判定為雜合子。例如使用核普酸探針測定擴(kuò)增產(chǎn)物的量。核苷酸探針包括與野生型擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)的探4十和與突變體擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)的探針。允許擴(kuò)增產(chǎn)物與各個(gè)核苷酸探針彼此雜交，并且測定結(jié)合至各個(gè)核苷酸探針的擴(kuò)增產(chǎn)物的量。通過比較結(jié)合至野生型核苷酸探針的擴(kuò)增產(chǎn)物的量和結(jié)合至突變體核苷酸探針的擴(kuò)增產(chǎn)物的量可以確定乾核苷酸的基因型。LAMP方法概述在下文將簡要描述LAMP方法。在本說明書中，將進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性檢測的核苷酸(包括基因組DNA等)將稱作分析物核苷酸。通過LAMP方法擴(kuò)增的NAT2基因的區(qū)域被稱作乾核苷酸。通過LAMP方法得到的產(chǎn)物將稱作擴(kuò)增產(chǎn)物。包含人基因組DNA的溶液將稱作樣品溶液。在LAMP方法中，將耙核苷酸設(shè)計(jì)成從5，末端依次具有F3區(qū)、F2區(qū)和F1區(qū)并且從3，末端依次具有B3c區(qū)、B2c區(qū)和Blc區(qū)。使用圖1所示的4種引物擴(kuò)增乾核苷酸。Flc、F2c、F3c、Bl、B2和B3區(qū)是互補(bǔ)鏈上分別對應(yīng)于F1、F2、F3、Blc、B2c和B3c區(qū)的區(qū)域。在LAMP方法中用于擴(kuò)增核苷酸的4種引物是(l)在3，末端側(cè)具有與F2區(qū)相同的序列并在5，末端側(cè)具有與Fl區(qū)互補(bǔ)的序列的FIP引物；(2)具有與F3區(qū)相同的序列的F3引物；(3)在3，末端側(cè)具有與B2c區(qū)互補(bǔ)的序列并在5，末端側(cè)具有與Blc區(qū)相同的序列的BIP引物；和(4)具有與B3c區(qū)互補(bǔ)的序列的B3引物。通常，F(xiàn)IP和BIP引物稱作內(nèi)引物，而F3和B3引物稱作外引物。使用4種引物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增得到如圖2所示具有啞鈴結(jié)構(gòu)的中間產(chǎn)物。FIP和BIP引物結(jié)合至單鏈環(huán)的F2c區(qū)和B2c區(qū)，并且延伸反應(yīng)從每一引物的3，末端和中間產(chǎn)物自身的3，末端開始進(jìn)行。細(xì)節(jié)見日本專利號3313358。通過在LAMP方法中任選地使用稱作環(huán)引物的引物，可以縮短擴(kuò)增時(shí)間段。在此情況下，如圖3所示，在從F2區(qū)至F1區(qū)的區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)LF區(qū)并且在從B2c區(qū)至Blc區(qū)的區(qū)域內(nèi)i殳計(jì)LBc區(qū)。這些區(qū)域稱作環(huán)引物區(qū)。除了使用4種引物之外，還使用具有與LF區(qū)互補(bǔ)的序列的環(huán)引物L(fēng)Fc和具有與LBc區(qū)相同的序列的環(huán)引物L(fēng)Bc。細(xì)節(jié)見WO2002/024902。這些環(huán)引物L(fēng)Fc和LBc可同時(shí)使用，或者備選地，僅使用它們中的一個(gè)。如圖4所示，環(huán)引物與環(huán)退火，與其退火的環(huán)與FIP和BIP引物所退火的環(huán)是不同的環(huán)，從而給出另外的合成起點(diǎn)并因此加速擴(kuò)增。檢測LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物；核苷酸^1針為了檢測單核苷酸多態(tài)性，如圖5所示，待檢測的多態(tài)性位點(diǎn)位于FP區(qū)或BPc區(qū)。備選地，不同的多態(tài)性可以位于FP區(qū)或BPc區(qū)。如圖5所示，從F2區(qū)至F1區(qū)的區(qū)域是在擴(kuò)增產(chǎn)物中變成單鏈的部分。類似地，從B2c區(qū)至Blc區(qū)的區(qū)域也是在擴(kuò)增產(chǎn)物中變成單鏈的部分。通過將待檢測的多態(tài)性位點(diǎn)至于單鏈部分，使得通過核苷酸探針的檢測更容易。將核苷酸探針設(shè)計(jì)成結(jié)合至包含多態(tài)性位點(diǎn)的FP區(qū)或BPc區(qū)。因此，核苷酸探針具有與在FP區(qū)或BPc區(qū)包含多態(tài)性位點(diǎn)的區(qū)域互補(bǔ)的序列。在擴(kuò)增產(chǎn)物中還存在與FP區(qū)互補(bǔ)的FPc區(qū)以及與BPc區(qū)互補(bǔ)的BP區(qū)。因此，可以4吏用FPc區(qū)和BP區(qū)用于檢測。在本說明書中，包含與野生型擴(kuò)增產(chǎn)物序列互補(bǔ)的序列的核苷酸探針稱作野生型核苷酸探針，而包含與突變體擴(kuò)增產(chǎn)物序列互補(bǔ)的序列的核苷酸探針稱作突變體核苷酸探針。核苷酸探針可以包括，但不限于，DNA、RNA、PNA、LNA、具有曱基磷酸酯骨架的核苷酸或者合成的核苷酸鏈。為了將其固定化于支持物上，其末端可以用活性官能團(tuán)如氨基、羧基、羥基、巰基或磺?；揎??？稍诠倌軋F(tuán)和核苷酸之間導(dǎo)入間隔區(qū)。間隔區(qū)可以具有例如烷烴骨架、乙二醇骨架等。核苷酸探針固定化支持物核苷酸探針可以例如作為固定化于支持物上的探針使用。在已知的裝置，如所謂的DNA芯片和DNA微點(diǎn)陣中可以使用核苷酸探針固定化支持物。探針固定化支持物的一個(gè)實(shí)施方案如圖6所示。探針被固定化于支持物1的固定化區(qū)域2中。支持物l可以用硅基質(zhì)制備，但不限于硅基質(zhì)。探針可以通過任意已知方法固定化。可以將一種探針固定化于支持物上，或者將不同種類的探針固定化于支持物上，其位置和數(shù)量根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的需要而變化。如將在下文所述，根據(jù)本發(fā)明的探針固定化支持物可用于探針的熒光檢測。探針固定化支持物的另一個(gè)實(shí)施方案的示意圖如圖7所示。在本實(shí)施方案中，在支持物11上形成電極12。探針固定化在電極12上。每一電極12與提取電信息的墊(pad)13相連。支持物11可以從例如硅基質(zhì)制備，但不限于硅基質(zhì)。電極的產(chǎn)生和探針的固定化可通過任何已知方法開展。電極可由任何材料制成，包括但不限于單一金屬如金、金合金、銀、柏、汞、鎳、鈀、硅、鍺、鎵和鵠、其合金、碳如石墨和玻璃碳、以及它們的氧化物或4t合物。圖7中所示的固定化支持物具有IO個(gè)電極，但是在單一支持物上形成的電極的數(shù)量不限于此并且可以任選地改變。電極的位置模式也不限于圖中所示的才莫式，其可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的需要而改變。根據(jù)需要，可在支持物1上形成參比電極和反電極。如下文將描述，該實(shí)施方案的探針固定化支持物可用于電化學(xué)檢測。核苷酸探針與擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交在適宜條件下，擴(kuò)增產(chǎn)物雜交至核苷酸探針。適宜條件根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的種類和結(jié)構(gòu)、在待檢測序列中包含的核苷酸的種類、以及核苷酸探針的種類而改變。具體而言，雜交在離子強(qiáng)度范圍為0.01-5并且pH范圍在5-10的緩沖溶液中開展?？上蚍磻?yīng)溶液中加入硫酸葡聚糖(一種雜交促進(jìn)劑)、鮭精DNA、牛胸腺DNA、EDTA、表面活性劑等。反應(yīng)溫度例如在10-90。C范圍內(nèi)，反應(yīng)混合物可以攪拌或振蕩以改善反應(yīng)效率。反應(yīng)之后，例如離子強(qiáng)度范圍為0.01-5并且pH范圍為5-10的緩沖溶液用于洗滌。檢測方法固定化于支持物上的探針與擴(kuò)增產(chǎn)物之間的雜交產(chǎn)生雙鏈核苷酸。雙鏈核苷酸可用電化學(xué)方式檢測或熒光檢測。(a)電流檢測系統(tǒng)下面將描述雙鏈核苷酸的電化學(xué)檢測。方法使用識別雙鏈的化合物，該化合物特異識別雙鏈核苷酸。識別雙鏈的化合物的實(shí)例包括但不限于Hoeches33258、吖咬橙、米帕林、柔紅霉素、金屬嵌入劑、雙嵌入劑如雙吖啶、三嵌入劑和多嵌入劑。這些物質(zhì)可以用電化學(xué)活性金屬^^物，如二茂鐵或紫精修飾。識別雙鏈的化合物的濃度會根據(jù)其種類而改變，但通常使用的濃度范圍為1ng/mL至1mg/mL。在該情況下，優(yōu)選使用離子強(qiáng)度范圍為0.001-5并且pH范圍為5-10的緩沖溶液。在雜交過程中或雜交后向反應(yīng)溶液中加入識別雙鏈的化合物。如果通過雜交形成了雙鏈核苷酸，則識別雙鏈的化合物結(jié)合至雙鏈核苷酸。例如通過施加高于導(dǎo)致識別雙鏈的化合物發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)的電位的電位可以測量從識別雙鏈的化合物產(chǎn)生的反應(yīng)電流。在該情況下，可以恒定速度施加電位，或者以脈沖形式施加或者以恒定電壓施加。在測定過程中，通過使用裝置如恒電位儀、數(shù)字多用表或函數(shù)發(fā)生器控制電流和電壓。例如，優(yōu)選使用在JP-A10-146183(KOKAI)中公開的已知的電化學(xué)檢測方法。(b)熒光檢測方法下面將描述通過熒光檢測雙鏈核苷酸的方法。先前用熒光活性物質(zhì)標(biāo)記引物。備選地，使用用熒光活性物質(zhì)標(biāo)記的二級探針檢測?？墒褂脦в卸嘀貥?biāo)記的二級探針。熒光標(biāo)記物質(zhì)的實(shí)例包括但不限于焚光色料，例如FITC、Cy3、Cy5和羅丹明。熒光材料用例如熒光檢測器檢測。適宜標(biāo)記種類的檢測器用于檢測標(biāo)記的待檢測序列或二級探針。核苷酸引物的選擇圖8是顯示核苷酸引物的示意圖，其中單核苷酸多態(tài)性G590A位于F2和F1之間的區(qū)域，即FP區(qū)。FIP引物具有與F2區(qū)序列相同的序列和與Fl區(qū)序列互補(bǔ)的序列?？梢栽O(shè)計(jì)多種類型的引物，只要F2區(qū)和F1區(qū)的位置使得G590A位于它們之間即可。然而，本發(fā)明人的研究已經(jīng)顯示，通過LAMP方法的擴(kuò)增效率根據(jù)引物的種類而改變。例如，使用圖8內(nèi)所示4種引物中的一個(gè)引物和共同的3個(gè)引物(BIP、F3和B3引物)開展擴(kuò)增。結(jié)果，甚至在足夠的時(shí)間段之后，例如2小時(shí)之后具有引物1的樣品仍然沒有擴(kuò)增。具有引物2的樣品在大約1小時(shí)之后擴(kuò)增，但出現(xiàn)引物的非特異擴(kuò)增。具有引物3的樣品沒有導(dǎo)致引物的非特異擴(kuò)增，但是需要的擴(kuò)增時(shí)間段為1.5-2小時(shí)。具有引物4的樣品沒有導(dǎo)致引物的非特異擴(kuò)增并且在1小時(shí)內(nèi)完成擴(kuò)增。在該情況下，優(yōu)選用于擴(kuò)增的引物是引物3和引物4，并且最佳引物是引物4。因此它是優(yōu)越的引物，擴(kuò)增效率更高，允許在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增并且未導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。為了用核苷酸探針檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物優(yōu)選地用核苷酸探針以高效率雜交。因此，在評估引物時(shí)還可考慮擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交效率。人NAT2基因與人NAT1非常高度同源。NAT2和NAT1基因的序列顯示于圖9A和9B。由于NAT2和NAT1基因彼此高度同源，為了特異性括增NAT2必須在NAT2和NAT1之間序列不同的區(qū)域設(shè)置引物。因此，至少一條引物需要設(shè)置于在NAT2和NAT1之間序列不同的區(qū)域。優(yōu)選地，至少Fl、F2、Bl和B2區(qū)域之一需要設(shè)置于在NAT2和NAT1之間序列不同的區(qū)域。而且沒有引物設(shè)置于報(bào)道有如圖9中所示突變體的區(qū)域。如果一條引物不可避免地設(shè)置于此種突變體位點(diǎn)，則會導(dǎo)入通用堿基如混合堿基或脫氧肌苷(dl)。另一條內(nèi)部不含單核苷酸多態(tài)性的內(nèi)引物優(yōu)選地放置于長度為450bp或更短、更加優(yōu)選為350bp或更短的F2至B2的區(qū)域內(nèi)。此外，兩條內(nèi)引物優(yōu)選地設(shè)計(jì)成使得單鏈環(huán)長度為100bp或更短，更加優(yōu)選為70bp或更短。引物間的非特異性擴(kuò)增是LAMP反應(yīng)中常見的現(xiàn)象。包含F(xiàn)lc區(qū)和F2區(qū)的引物FIP常常是長鏈核苷酸。同樣，包含Blc區(qū)和B2區(qū)的BIP引物常常是長鏈核苷酸。因此，在FIP引物當(dāng)中、在BIP引物當(dāng)中或者FIP和BIP引物彼此糾纏在一起，常常允許以引物為模板進(jìn)行擴(kuò)增。與PCR反應(yīng)相比，LAMP反應(yīng)中的非特異性反應(yīng)的可能性較高，因?yàn)榉磻?yīng)溶液包含F(xiàn)3和B3引物，并且在一些情況下還額外包含LFc和LBc引物。此類非特異性反應(yīng)導(dǎo)致通過使用分析物核苷酸作為模板得到的目的LAMP產(chǎn)物的量降低。如果在未加入分析物核苷酸的陰性對照反應(yīng)溶液中出現(xiàn)非特異性反應(yīng)，則不能確定隨著擴(kuò)增的進(jìn)行釋放的焦磷酸和Mg的白色沉淀是由非特異擴(kuò)增導(dǎo)致的還是由污染導(dǎo)致的。因此，排除可能導(dǎo)致非特異擴(kuò)增的引物是重要的。因此，本發(fā)明人已經(jīng)開展試驗(yàn)，以選擇最適合擴(kuò)增NAT2基因的單核苷酸多態(tài)性G590A以及還用于擴(kuò)增單核苷酸多態(tài)性G857A和T341C的核苷酸引物。試驗(yàn)1-1:用于G590A的引物；FP區(qū)l通過使用在FP區(qū)包含NAT2G590A多態(tài)性位點(diǎn)的6種核苷酸引物組，于63匸開展擴(kuò)增1小時(shí)或2小時(shí)。反應(yīng)溶液成分如表1所示。使用的模板DNA是人基因組。為了檢查污染和非特異性擴(kuò)增存在與否，在所有組中準(zhǔn)備了用滅菌超純水代替人基因組的陰性對照。在擴(kuò)增反應(yīng)之后，擴(kuò)增產(chǎn)物通過3%瓊脂糖電泳鑒定。所使用的核苷酸引物組示于表2。表lLAMP反應(yīng)組成<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>表2在FP或FPc區(qū)具有G590A的引物組<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>F3引物含有SEQIDNo.8的序列，而B3引物含有SEQIDNo.9的序列，并且兩條引物共同用于全部組。[試驗(yàn)l-l:結(jié)果將通過使用表2中所示的6種引物組獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳。結(jié)果總結(jié)于圖10中。擴(kuò)增1小時(shí)后，使用引物組3和4獲得了足夠量的擴(kuò)增產(chǎn)物(泳道5和6)。擴(kuò)增2小時(shí)后，使用引物組l、2、3和4獲得了足夠量的擴(kuò)增產(chǎn)物(泳道l、2、5和6)。使用引物組18和19(泳道3和4)，僅獲得少量產(chǎn)物，或者沒有檢測到產(chǎn)物。在任意引物組中都沒有觀察到非特異性擴(kuò)增。上面的結(jié)果表明，引物組l、2、3和4是優(yōu)選的，并且引物組3和4是最優(yōu)選的。結(jié)果總結(jié)于表2。[試驗(yàn)l-2:用于G5卯A的引物；BP區(qū)J通過4吏用在BP區(qū)包含NAT2G590A多態(tài)性位點(diǎn)的16種核苷酸引物組，于63匸開展擴(kuò)增1小時(shí)或2小時(shí)。反應(yīng)溶液成分如表l所示。使用的模板DNA是人基因組，為了檢查污染和非特異性擴(kuò)增存在與否，在所有組中準(zhǔn)備了用滅菌超純水代替人基因組的陰性對照。在擴(kuò)增反應(yīng)之后，擴(kuò)增產(chǎn)物通過3%瓊脂糖電泳鑒定。所使用的核苷酸引物組示于表3。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>F3引物含有SEQIDNo.18的序列，而B3引物含有SEQIDNo.19的序列，并且兩條引物共同用于全部組。試驗(yàn)l-2:結(jié)果將通過使用表3中所示的16種引物組獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳。結(jié)果總結(jié)于圖11中。擴(kuò)增1小時(shí)后，使用引物組9產(chǎn)生了足夠量的擴(kuò)增產(chǎn)物(泳道7)。擴(kuò)增2小時(shí)后，使用引物組5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20和21產(chǎn)生了足夠量的擴(kuò)增產(chǎn)物。使用引物組22和23未獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。如圖12所示使用引物組20和21產(chǎn)生了非特異性擴(kuò)增。上面的結(jié)果表明，引物組5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和16是優(yōu)選的，并且引物組9是最優(yōu)選的。結(jié)果總結(jié)于表3。試驗(yàn)2:用于G857A的引物；BP區(qū)通過4吏用在BP區(qū)包含NAT2G857A多態(tài)性位點(diǎn)的6種核苷酸引物組，于63匸開展擴(kuò)增1小時(shí)或2小時(shí)。反應(yīng)溶液成分如表1所示。使用的模板DNA是人基因組。為了檢查污染和非特異性擴(kuò)增存在與否，在所有組中準(zhǔn)備了用滅菌超純水代替人基因組的陰性對照。在擴(kuò)增反應(yīng)之后，擴(kuò)增產(chǎn)物通過3%瓊脂糖電泳鑒定。所使用的核苷酸引物組示于表4。表4在BP或BPc區(qū)具有G857A的引物組<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>F3引物含有SEQIDNo.27的序列，而B3引物含有SEQIDNo.28的序列，并且兩條引物共同用于全部組。[試驗(yàn)2:結(jié)果將通過使用表4中所示的6種引物組獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳。擴(kuò)增l小時(shí)后，使用引物組l、2、3、4和5產(chǎn)生了足夠量的擴(kuò)增產(chǎn)物。同樣，擴(kuò)增2小時(shí)后，使用引物組l、2、3、4和5產(chǎn)生了足夠量的擴(kuò)增產(chǎn)物。使用引物組6甚至是在2小時(shí)后仍未觀察到擴(kuò)增。在任意組中未觀察到非特異性擴(kuò)增。結(jié)果表明引物組l、2、3、4和5是最優(yōu)選的。結(jié)果總結(jié)于表4。試驗(yàn)3:用于T341C的引物；BP區(qū)通過使用在BP區(qū)包含NAT2T341C多態(tài)性位點(diǎn)的13種核苷酸引物組，于63匸開展擴(kuò)增1小時(shí)或2小時(shí)。反應(yīng)溶液成分如表l所示。使用的模板DNA是人基因組。為了檢查污染和非特異性擴(kuò)增存在與否，在所有組中準(zhǔn)備了用滅菌超純水代替人基因組的陰性對照。在擴(kuò)增反應(yīng)之后，擴(kuò)增產(chǎn)物通過3%瓊脂糖電泳鑒定。所使用的核苷酸引物組示于表5<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage33</formula>引物組1、2、3、4、5、11、12、13和14中的F3引物含有SEQIDNo.39的序列。引物組6、7、8和9中的F3引物含有SEQIDNo.41的序列。B3引物含有SEQIDNo.40的序列，并共同用于全部組。[試驗(yàn)3:結(jié)果]將通過使用表5中所示的13種引物組獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳。擴(kuò)增l小時(shí)后，使用引物組3、6、9和10產(chǎn)生了足夠量的擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增2小時(shí)后，使用引物組l、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11產(chǎn)生了足夠量的擴(kuò)增產(chǎn)物。使用引物組12和13甚至是在2小時(shí)后仍未觀察到擴(kuò)增。使用引物組ll觀察到非特異性擴(kuò)增。使用引物組l、2、3、4、5、6、7、8、9和10未)f見察到非特異性擴(kuò)增。上面的結(jié)果表明，引物組l、2、3、4、5、6、7、8、9和10是優(yōu)選的，并且引物組3、6、9和10是最優(yōu)選的。結(jié)果總結(jié)于表5。選擇用于同時(shí)擴(kuò)增G590A和G857A多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸引物多態(tài)性位點(diǎn)可以放置于FP區(qū)和BP區(qū)兩區(qū)域內(nèi)。這樣，有可能僅使用一種擴(kuò)增產(chǎn)物測量兩個(gè)或多個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)。例如，關(guān)于G590A和G857A,G590A可以放置于FP區(qū)，且G857A放置于FP區(qū)。盡管由于G590A和G857A在一定程度上彼此分離且靶長度(從F2到B2的長度)變?yōu)榇蠹s350bp，從而使擴(kuò)增效率低到一定程度，但是仍然有可能例如通過導(dǎo)入環(huán)引物在1個(gè)小時(shí)的短周期內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增。為了同時(shí)擴(kuò)增G590A和G857A，有可能使用在單一反應(yīng)管中擴(kuò)增各自產(chǎn)物的方法(多重?cái)U(kuò)增)，但是多重?cái)U(kuò)增需要嚴(yán)格的條件設(shè)置。而且，即便嚴(yán)格的控制可能導(dǎo)致僅一種產(chǎn)物的優(yōu)先擴(kuò)增而不擴(kuò)增其他產(chǎn)物。因此，通過上述方法用一種擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)測量2個(gè)或多個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)是特別有利的。[試驗(yàn)4:用于G590A(FP區(qū))的引物和用于G857A(BP區(qū))的引物；I通過使用在FP區(qū)包含NAT2G5卯A多態(tài)性位點(diǎn)和在BPc區(qū)包含NAT2G857A多態(tài)性位點(diǎn)的11種核苷酸引物組，于63C開展擴(kuò)增1小時(shí)或2小時(shí)。反應(yīng)溶液成分如表1所示。使用的模板DNA是人基因組。為了檢查污染和非特異性擴(kuò)增存在與否，在所有組中準(zhǔn)備了用滅菌超純水代替人基因組的陰性對照。在擴(kuò)增反應(yīng)之后，擴(kuò)增產(chǎn)物通過3%瓊脂糖電泳鑒定。所使用的核苷酸引物組示于表6。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>F3引物含有SEQIDNo.49的序列，而B3引物含有SEQIDNo.50的序列，并且兩條引物共同用于全部組。[試驗(yàn)4:結(jié)果l將通過使用表6中所示的11種引物組獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳。擴(kuò)增l小時(shí)后，使用任意引物組均未觀察到擴(kuò)增。擴(kuò)增1,5小時(shí)后，使用引物組1、6、7和8產(chǎn)生了足夠量的擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增2小時(shí)后，使用引物組l、2、3、4、5、6、7、8和10產(chǎn)生了足夠量的擴(kuò)增產(chǎn)物。使用引物組9和11甚至是在2小時(shí)后仍未觀察到擴(kuò)增。使用引物組10觀察到非特異性擴(kuò)增。使用引物組l、2、3、4、5、6、7和8未觀察到非特異性擴(kuò)增。上面的結(jié)果表明，引物組l、2、3、4、5、6、7和8是優(yōu)選的，并且引物組l、6、7和8是最優(yōu)選的。結(jié)果總結(jié)于表6。通過上面的試驗(yàn)確定了本發(fā)明所提供的優(yōu)選的內(nèi)引物。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言顯而易見地是，LAMP反應(yīng)中最重要的引物是內(nèi)引物。雖然內(nèi)引物是擴(kuò)增反應(yīng)所必需的，但是外引物和環(huán)引物不是必需的。向擴(kuò)增反應(yīng)溶液中添加外引物和環(huán)引物會導(dǎo)致擴(kuò)增效率提高，但是與內(nèi)引物相比其位置的改變對擴(kuò)增效率的影響較小。因此，外引物(F3和B3引物)可以任選"i殳計(jì)。例如，其優(yōu)選位于距F2區(qū)5，末端60個(gè)堿基范圍內(nèi)的區(qū)域內(nèi)或者距B2c區(qū)的3，末端60個(gè)堿基內(nèi)的區(qū)域內(nèi)。因此，具有與F3引物相同的序列的F3區(qū)優(yōu)選位于距F2區(qū)5，末端60個(gè)#范圍內(nèi)的區(qū)域內(nèi)，并且具有與B3引物互補(bǔ)的序列的B3c區(qū)優(yōu)選位于距B2c區(qū)3，末端60個(gè)堿基范圍內(nèi)的區(qū)域內(nèi)。優(yōu)選將環(huán)引物設(shè)計(jì)成結(jié)合至不同于內(nèi)引物所結(jié)合環(huán)的環(huán)，并且環(huán)引物不位于內(nèi)引物區(qū)。核苷酸探針的選擇核苷酸探針鏈既不能太長也不能太短。通常，鏈長度增加導(dǎo)致結(jié)合力增加，但根據(jù)堿基種類會存在一些差異。核苷酸探針的鏈長度過短導(dǎo)致降低核苷酸探針與擴(kuò)增產(chǎn)物之間的雜交效率。另一方面，核苷酸探針的鏈長因此，野生型擴(kuò)增產(chǎn)物與突變體核苷酸探針之間以及突變體擴(kuò)增產(chǎn)物與野生型核苷酸探針之間的非特異性結(jié)合增加。因此，優(yōu)選使用具有適當(dāng)鏈長度，如10-35個(gè)堿基的核苷酸探針來檢測單核苷酸多態(tài)性。結(jié)合力可通過雙鏈核苷酸的解離溫度Tm來表示。Tm值可通過例如近鄰法、Wallance法或GC。/。法計(jì)算。在本發(fā)明中，使用的是近鄰法(Breslauer等，1986;Freier等，1986;ScWldkraut等，1965),在本發(fā)明中，于50mM的Na+濃度和0.5jiM的核苷酸探針(寡核苷酸)濃度條件下計(jì)算Tm值。在下文，將描述用于選擇適用于檢測根據(jù)本發(fā)明所得到擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸探針的試驗(yàn)。通過使用經(jīng)PCR-RFLP分析確定為雜合子的人基因組作為模板，并且使用用于檢測G857A的引物組1和5，于63C開展LAMP擴(kuò)增1小時(shí)。用于檢測G857A的引物組1和5是經(jīng)上述試驗(yàn)2確定為最佳的引物組。所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物在電流檢測DNA芯片上檢測。核苷酸探針?biāo)囼?yàn)的核苷酸探針的核苷酸序列示于表8。所使用的核苷酸探針是正鏈。核普酸探針的3，末端經(jīng)巰基修飾，以便固定化在電極上。陰性對照探針是其序列與NAT2基因序列完全無關(guān)的核苷酸。SEQIDNo.絲數(shù)Tm值F/R序列6120mer59.3FTGGTGATGGATCCCTTACTA6223mer63.8FCCTGGTGATGGATCCCTTACTAT野生型6324mer64.8FCCTGGTGATGGATCCCTTACTATT6425mer65.3FACCTGGTGATGGATCCCTTACTATTG857A6530mer68.4FAACCTGGTGATGGATCCCTTACTATTTAGA6622mer58.4FCTGGTGATGAATCCCTTACTAT6726mer64.4FACCTGGTGATGAATCCCTTACTATTT突變體6828mer65.1FAACCTGGTGATGAATCCCTTACTATTTA6929mer65.6FAACCTGGTGATGAATCCCTTACTATTTAG7031mer67.5FAACCTGGTGATGAATCCCTTACTATTTAGAA10003438.X勢溢也被33/68:a;用于核苷酸探針固定化的支持物以與試驗(yàn)5-1相似的方式制備核苷酸探針固定化支持物。分別在下列電極上固定核苷酸探針電極1-2:陰性探針(SEQIDNo.51)電極3-4:野生型核苷酸探針20mer(SEQIDNo.61)電極5-6:野生型核苷酸探針23mer(SEQIDNo.62)電極7-8:野生型核苷酸探針24mer(SEQIDNo.63)電極9-10:野生型核苷酸探針25mer(SEQIDNo.64)電極11-12:野生型核苷酸探針30mer(SEQIDNo.65)電極13-14:突變體核苷酸探針24mer(SEQIDNo.66)電極15-16:突變體核苷酸探針26mer(SEQIDNo.67)電極17-18:突變體核苷酸探針28mer(SEQIDNo.68)電極19-20:突變體核苷酸探針29mer(SEQIDNo.69)電極21-22:突變體核苷酸探針31mer(SEQIDNo.70)。擴(kuò)增產(chǎn)物與核苷酸探針間的雜交及其檢測向通過擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物中加入終濃度為2xSSC的鹽，然后允許混合物與電極上固定的核苷酸探針雜交。反應(yīng)溫度為35、45、50、55和60匸并且反應(yīng)時(shí)間段為20分鐘。然后，用超純水溫和洗滌DNA芯片。將DNA芯片浸入含50jiM嵌入劑Hoechst33258的磷酸緩沖溶液中10分鐘并洗滌，然后測定Hoechst33258分子的氧化電流反應(yīng)。[試驗(yàn)6-l:結(jié)果結(jié)果總結(jié)于圖16。圖16A顯示使用引物組1獲得的結(jié)果，而圖16B顯示使用引物組S獲得的結(jié)果。隨著反應(yīng)溫度的提高，信號增加了，這表明反應(yīng)溫度的提高導(dǎo)致雜交效率的提高。于55和60"C反應(yīng)溫度的試驗(yàn)得到幾乎相同的結(jié)果。通過對使用用于檢測G857A的引物組1和5擴(kuò)增的LAMP產(chǎn)物進(jìn)行檢測表明，使用引物組5的雜交信號的增加比引物組1更高。引物組l和5之間信號增強(qiáng)的差異原因仍然不清楚。有可能是雜交效率可能隨著擴(kuò)增產(chǎn)物中單鏈區(qū)的長度或結(jié)合核苷酸探針的區(qū)域的位置而改變。備選地，有可能是添加到擴(kuò)增產(chǎn)物中的Hoechst33258的數(shù)量可能有微小的不同。[試驗(yàn)6-2:用于檢測G857A的探針然后，通過^(吏用用引物組5擴(kuò)增得到的產(chǎn)物，以與試驗(yàn)5-3相似的方式在反應(yīng)溫度為55t:進(jìn)行雜交反應(yīng)20分鐘。隨后，將核苷酸探針固定化支持物浸入45"C的0.2xSSC洗滌緩沖液中20分鐘。在本試驗(yàn)中用于擴(kuò)增的分析物核苷M經(jīng)PCR-RFLP分析分別確定為野生型純合子、突變體純合子和雜合子的3種人基因組。[試驗(yàn)6-2:結(jié)果l結(jié)果總結(jié)于圖17。通過野生型核苷酸探針(23G、24G和25G)可以高信號強(qiáng)度檢測到野生型擴(kuò)增產(chǎn)物，但是通過突變體核苷酸探針(26A、28A和29A)幾乎檢測不到信號。同樣，通過突變體核苷酸探針(26A、28A和29A)可以高信號強(qiáng)度檢測到突變體擴(kuò)增產(chǎn)物，但是通過野生型核苷酸探針(23G、24G和25G)幾乎檢測不到信號。此外，雜合子擴(kuò)增產(chǎn)物可被野生型核苷酸探針(23G、24G和25G)和突變體核苷酸探針(26A、28A和29A)以較高的信號強(qiáng)度檢測到。結(jié)果表明，野生型核苷酸探針(23G、24G和25G)和突變體核苷酸探針(26A、28A和29A)給出了理想的檢測模式。因此，根據(jù)本發(fā)明最優(yōu)選使用的核苷酸探針是野生型核苷酸探針(23G:SEQIDNo.62，24G:SEQIDNo.63和25G:SEQIDNo.64)和突變體核苷酸探針(26A:SEQIDNo.67,28A:SEQIDNo.68和29A:SEQIDNo.69)。在試驗(yàn)中使用的核苷酸探針的Tm值也總結(jié)于表8。從表8中顯而易見，在本發(fā)明中優(yōu)選使用的核苷酸探針是Tm值為59-68t;、優(yōu)選64-65匸的野生型核苷酸探針和Tm值為58-68X:、優(yōu)選64-66C的突變體核苷酸探針。[試驗(yàn)7-1:用于檢測T341C的探針I(yè)通過使用經(jīng)序列分析確定為野生型雜合子、突變體純合子和雜合子的人基因組作為模板，并JU吏用用于檢測T341C的引物組6和10，于63"C開展LAMP擴(kuò)增1小時(shí)。用于檢測T341C的引物組6和10是經(jīng)上述試驗(yàn)3確定為最佳的引物組。所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物在電流檢測DNA芯片上檢測。核苷酸探針?biāo)囼?yàn)的核苷酸探針的核苷酸序列示于表9。所使用的核苷酸探針是正鏈。核苷酸探針的3，末端經(jīng)巰基修飾，以便固定化在電極上。陰性對照探針是其序列與NAT2基因序列完全無關(guān)的核苷酸。表9在檢測使用檢測T341C的引物組6和10所擴(kuò)增產(chǎn)物中使用的核苷酸探針<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>核苷酸探針固定化支持物以與試驗(yàn)5-1相似的方式制備核苷酸探針固定化支持物。分別在下列電極上固定核苷酸探針電極1-2:陰性探針(SEQIDNo.51)電極3-4:野生型核苷酸探針16mer(SEQIDNo.71)電極5-6:野生型核苷酸探針18mer(SEQIDNo.72)電極7-8:野生型核苷酸探針19mer(SEQIDNo.73)電極9-10:野生型核苷酸探針20mer(SEQIDNo.74)電極11-12:突變體核苷酸探4十16mer(SEQIDNo.75)電極13-14:突變體核苷酸探針17mer(SEQIDNo.76)電極15-16:突變體核苷酸探針18mer(SEQIDNo.77)電極17-18:突變體核苷酸探針19mer(SEQIDNo.78)電極19-20:突變體核苷酸探針20mer(SEQIDNo.79)。擴(kuò)增產(chǎn)物與核苷酸探針間的雜交及其檢測向通過擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物中加入終濃度為2xSSC的鹽，并允許混合物與電極上固定的核苷酸探針雜交。反應(yīng)溫度為55t:，并且反應(yīng)時(shí)間段為20分鐘。然后，將芯片在45C洗滌20分鐘。將電極浸入含50pM嵌入劑Hoechst33258的磷酸緩沖溶液中10分鐘并洗滌，然后測定Hoechst33258分子的氧化電流反應(yīng)。[試驗(yàn)7-l:結(jié)果l結(jié)果總結(jié)于圖18。圖18A顯示使用引物組6獲得的結(jié)果，而圖18B顯示使用引物組10獲得的結(jié)果。用于檢測野生型突變體的核苷酸探針(18T和19T)和用于檢測突變體的核苷酸探針(17C、18C和19C)給出了理想的檢測模式。野生型核苷酸探針(18T和19T)以高信號強(qiáng)度檢測到野生型擴(kuò)增產(chǎn)物，而突變體核苷酸探針(17C、18C和19C)幾乎沒有檢測到信號增加，其中非特異性雜交被阻斷。同樣，突變體核苷酸探針(17C、18C和19C)以高信號強(qiáng)度檢測到突變體擴(kuò)增產(chǎn)物，而野生型核苷酸探針(18T和19T)幾乎沒有檢測到信號增加，其中非特異性雜交被阻斷。此外，野生型核普酸探針(18T和19T)和突變體核苷酸探針(17C、18C和19C)都以高信號強(qiáng)度檢測到雜合子擴(kuò)增產(chǎn)物。通過使用檢測T341C的引物組6和10分別獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物顯示了幾乎相同的檢測才莫式。結(jié)果表明，根據(jù)本發(fā)明最優(yōu)選使用的核苷酸探針是野生型核苷酸探針(18T:SEQIDNo.72和19T:SEQIDNo.73)和突變體核苷酸探針(17C:SEQIDNo.76,18C:SEQIDNo.77和19C:SEQIDNo.78)。在試驗(yàn)中使用的核苷酸探針的Tm值也總結(jié)于表9。M9中顯而易見，在本發(fā)明中優(yōu)選使用的核苷酸探針是Tm值為61-69t:，優(yōu)選66-68匸的野生型核苷酸探針和Tm值為58-70n,優(yōu)選63-69C的突變體核苷酸探針。試驗(yàn)8-1:用于檢測G590A和G857A的探針通過分別使用經(jīng)PCR-RFLP分析確定為野生型純合子、突變體純合子和雜合子的人基因組作為模板，并且使用用于檢測G590A和G857A的引物組6，于63X:開展LAMP擴(kuò)增。用于檢測G590A和G857A的引物組6經(jīng)上述試驗(yàn)4確定為最佳的引物組。所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物在電流檢測DNA芯片上檢測。使用環(huán)引物縮短擴(kuò)增時(shí)間段使用用于檢測G590A和G857A的引物組進(jìn)行1.5小時(shí)的擴(kuò)增。因此，通過引入環(huán)引物檢查擴(kuò)增時(shí)間段的縮短。環(huán)引物是顯示于表6中的LB引物(SEQIDNo.80)。將環(huán)引物以40pmol的量加入到25pl反應(yīng)溶液中。擴(kuò)增結(jié)果顯示引入環(huán)引物導(dǎo)致在1個(gè)小時(shí)內(nèi)完成擴(kuò)增。DNA芯片檢測結(jié)果檢測到使用引入環(huán)引物對用于檢測G590A和G857A的引物組的擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增。核苷酸探針表7中所示的用于檢測野生型的探針(SEQIDNo.54)和用于檢測突變體的探針(SEQIDNo.59)用于檢測G590A多態(tài)性，而表8中所示的用于檢測野生型的探針(SEQIDNo.62)和用于檢測突變體的探針(SEQIDNo.67)用于檢測G857A多態(tài)性。用于檢測G590A多態(tài)性的探針為負(fù)鏈，而用于檢測G857A多態(tài)性的探針為正鏈。核苷酸探針的3，末端經(jīng)巰基修飾，以便固定化在電極上。核苷酸探針固定化支持物以與試驗(yàn)5-1相似的方式制備核苷酸探針固定化支持物。分別在下列電極上固定核苷酸探針電極1-2:陰性探針(SEQIDNo.51)電極3-4:野生型核苷酸探針26mer(SEQIDNo.54)電極5-6:突變體核苷酸探針27mer(SEQIDNo.59)電極7-8:野生型核苷酸探針23mer(SEQIDNo.62)電極9-10:突變體核苷酸探針26mer(SEQIDNo.67)。擴(kuò)增產(chǎn)物與核苷酸探針間的雜交及其檢測以與試驗(yàn)7相似的方式進(jìn)行試驗(yàn)。[試驗(yàn)8-l:結(jié)果結(jié)果總結(jié)于圖19。用于檢測G5卯A野生型的^4f(SEQIDNo.54)、用于檢測G590A突變體的探針(SEQIDNo.59)、用于檢測G857A野生型的探針(SEQIDNo.62)、用于檢測G857A突變體的探針(SEQIDNo.67)顯示出理想的檢測結(jié)果。分析物樣品在本發(fā)明中使用的分析物樣品并無特別限制，例如可使用人血液、血清、白細(xì)胞、毛根或口腔粘膜。從分析物樣品中提取核苷酸成分，制備樣品溶液用于試驗(yàn)以便檢測乾核苷酸。提取方法并無特別限制，例如可使用商業(yè)上可獲得的核苷酸提取工具，例如QIAamp(QIAGEN制造)或Sumaitest(SumitomoMetalIndustriesLtd.制造)。試劑盒本發(fā)明的另一方面提供試劑盒，其包含用于根據(jù)本發(fā)明檢測方法中LAMP法的上述引物組。試劑盒還任選包含例如鏈替換性DNA聚合酶、合成底物和緩沖溶液。在另一方面，本發(fā)明提供用于檢測根據(jù)本發(fā)明引物組所擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸探針。本發(fā)明還提供在其上固定有本發(fā)明核苷酸探針的核苷酸探針固定化支持物。探針固定化支持物優(yōu)選作為DNA芯片或DNA微點(diǎn)陣提供。物。在另一方面，本發(fā)明提供同時(shí)檢測NAT2的單核苷酸多態(tài)性G590A、G857A和T341C的方法。在該方面，如上所述分別擴(kuò)增G590A、G857A和T341C,然后將擴(kuò)增產(chǎn)物混合制備成液體混合物。如上所述對液體混合物進(jìn)行檢測。在該方面，可以同時(shí)檢測基因型G590A、G857A和T341C。實(shí)施例同時(shí)檢測G590A、G857A和T341C開展了同時(shí)檢測G590A、G857A和T341C的試驗(yàn)。分別使用用于檢測G5卯A的核苷酸引物組9(試驗(yàn)1-2)、用于檢測G857A的核苷酸引物組5(試驗(yàn)2)或者用于檢測T341C的核苷酸引物組6和IO(試驗(yàn)3)，于63"C擴(kuò)增人基因組樣品1小時(shí)。人基因組是經(jīng)PCR-RFLP分析或序列分析分別確定為野生型純合子、突變體純合子和雜合子的3種人基因組。擴(kuò)增反應(yīng)后，將3種擴(kuò)增產(chǎn)物混合，制備混合的反應(yīng)溶液。核苷酸探針使用用于G590A的核苷酸探針、用于G857A的核苷酸探針和用于T341C的核苷酸探針檢測混合的反應(yīng)溶液。核普酸探針如下G590A:野生型核苷酸探針(SEQIDNo.54)，突變體核苷酸探針(SEQIDNo.59)，G857A:野生型核苷酸探針(SEQIDNo.62),突變體核苷酸探針(SEQIDNo.67),T341C:野生型核苷酸探針(SEQIDNo.72)，突變體核苷酸探針(SEQIDNo.76)。所有的核苷酸探針均為正鏈，并且核苷酸探針的3，末端被巰基修飾。核苷酸探針固定化的電極的制備以與上面試驗(yàn)5-1中描述方法相似的方式制備核苷酸探針固定化的電極。分別在下列電極上固定核苷酸探針電極l-2:陰性探針(SEQIDNo.51)電極3-4:G590A野生型核苷酸探針26mer(SEQIDNo.54)電極5-6:G590A突變體核苷酸探針27mer(SEQIDNo.59)電極7-8:G857A野生型核苷酸探針23mer(SEQIDNo.62)電極9-10:G857A突變體核苷酸探針26mer(SEQIDNo.67)。電極11-12:T341C野生型核苷酸探針18mer(SEQIDNo.72)電極13-14:T341C突變體核苷酸探針17mer(SEQIDNo.76)。擴(kuò)增產(chǎn)物與核苷酸探針之間的雜交及其檢測以與試驗(yàn)7相似的方式開展試驗(yàn)。[結(jié)果結(jié)果總結(jié)于圖20。圖20A顯示了使用引物組9、5和6獲得的結(jié)果，而圖20B顯示了使用引物組9、5和10獲得的結(jié)果。對于G5卯A、G857A和T341C每一個(gè)都觀察到了理想的檢測模式。結(jié)果表明，使用根據(jù)本發(fā)明的DNA芯片可以同時(shí)檢測G590A、G857A和T341C。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，可以容易想到額外的優(yōu)點(diǎn)和修改。因此，較寬方面的本發(fā)明并不限于本文所示和所述的特定細(xì)節(jié)和代表性實(shí)施方案。因此，在不脫離如后附權(quán)利要求及其等效物所定義的總體發(fā)明概念的精神和范圍的情況下，可以進(jìn)行多種修改。序列表<110>株式會社東芝(KabushikiKaishaToshiba)<120>用于鑒定N-乙?；D(zhuǎn)移酶2基因型的核苷酸引物組和探針<130〉07S0651<140><141><150>JP2007-084289<151>2007-03-28<160>82<170〉Patentln版本3.1<210〉1<211>55<212>DNA<213〉人工的<220><223>G590A引物FIP-1<400>1cgtctgcaggtatgtattcatagactcaaaaaatatacttatttacgcUgaacc55<210〉2<211>54<212>DNA<213>人工的<220〉<223>G591A引物FIP-2<400>2cgtctgcaggtatgtattcatagactcaacaccaaaaaatatacttatttacgc54<210>3<211>55<212>DNA〈213>人工的<220>〈223〉G592A引物FIP-3<400>3cgtctgc鄉(xiāng)tatgtattcatagactcaacaaagaagaaac3cc3a幼aatatac55<210>4<211>53<212>DNA<213〉人工的〈220〉<223>G593A引物FIP-4<400〉4cgtctgcaggtatgtattcatagactcaactcctgccaaag卿aaacaccaa53<210>5<211>54<212>腿〈213〉人工的<220>〈223〉G594A引物FIP-5<400〉5gcaggtatgtattcatagactcaaaatctcaccaaatatacttattteicgc54<210>6<211>49<212〉DNA<213〉人工的〈220><223>G595A引物FIP-6<400>6ggagacgtctgcaggtatgtattccaccaaaaaatatacttatttacgc49<210>7<211>50<212>DNA<213>人工的<220><223>G596A引物BIP-1<400>7ataaccacatcattttgttccttgcatgaamtctataggtgaggatga50<210>8<211>27〈212〉DNA<213〉人工的<220><223>G597A引物F3〈400〉8caaacaaagaatttcttaattctcatc27〈210〉9<211>21<212>腿<213>人工的<220〉<223>G598A弓<400>9cgaccagatctgtattgtctt21〈210>10<211>48<212〉腿<213>人工的<220〉<223>G590A引物FIP-1<400〉10gtttgtaatatactgctctctcctggcttgacagaagagagaggaatc48<210>11<211〉54<212>腿<213>人工的<220〉<223>G590A引物BIP-1<400〉11gaaacaccaaaaaatatacttatttacgcctgcaggtatgtattcatagactca54<210>12<211〉57<212>DNA<213>人工的<220>〈223>G590A引物BIP—2〈400>12gaaacaccaaaaaatatacttatttacgccaggtatgtattcatagactcaaaatct57<210>13<211>49<212>腿<213>人工的<220><223>G590A引物BIP-3<400>13caccaaaaaatatacttatttacgcctgcaggtatgtattcatagactc49<210>14<211>52<212>DNA<213>人工的<220><223>G590A引物BIP-4〈400>14caccaaaaaatatacttatttacgccaggtatgtattcatagactcaaaatc52<210>15<211>45〈212>腿<213>人工的<220><223>G590A引物FIP-2<400>15gtttgtaatatactgctctctcctgccttgcattttctgcttgac45<210>16<211>49<212>DNA<213〉人工的<220><223>G590A引物FIP-3<400>16gaaattctttgtttgtaatatactgcgcttgac柳agag卿ggaatc49<210>17<211〉46<212>DNA〈213〉人工的<220><223>G590A引物FIP-4<400>17gaaattctttgtttgtaatatactgcccttgcattttctgcttgac46<210>18〈211〉18〈212〉腿<213>人工的<220〉<223>G590A引物F3<400〉18ctgggaaggatcagcctc18<210>19<211>20<212〉腿<213>人工的<220><223>G590A引物B3<400〉19aaatgaagatgttggagacg20<210〉20<211>46<212>DNA〈213〉人工的<220><223>G857A引物FIP-1<400〉20agcacttcttcaacctcttcctctaaagacaatacagatctggtcg46<210>21<211>47<212>DNA<213>人工的<220>〈223>G857A引物BIP-1<400>21ccttggggagaaatctcgtgcgttcctta/ttctaaatagtaagggat47〈210〉22<211>47<212〉DNA<213>人工的<220><223>G857A引物BIP-2<400>22gaga犯tctcgtgcccaaaccgttccttattctaaatagt卿ggat47<210〉23<211〉44<212>DNA<213>人工的<220><223>G857A引物BIP-3<400>23gaaatctcgtgcccaaacccaagggtttattttgttccttattc44<210>24<211>44<212〉DNA〈213〉人工的<220><223>G857A引物BIP-4<400>24gagaaatctcgtgcccaaacgttccttattctaaatagtaaggg44<210>25<211>43<212>DNA<213>人工的<220>〈223〉G857A引物BIP-5〈400>25ccttggggagaaatctcgtg鄉(xiāng)gtttattttgttccttattc43<210>26<211>43<212>DNA〈213>人工的<220><223>G857A引物BIP-6<400>26ggggag纖tctcgtgcccaagggtttattttgttccttattc43<210>27<211〉17<212>DNA<213>人工的<220><223>G857A引物F3<400>27gtgggcttcatcctcac17<210〉28〈211〉23<212>DNA<213>人工的<220>〈223〉G857A引物B3〈400>28<formula>formulaseeoriginaldocumentpage62</formula><220><223〉T341C引物BIP-3<400>32catggttcaccttctcctgagcttccagacccagcat37<210>33<211>40<212>DNA<213>人工的<220><223>T341C引物FIP-2〈400>33tgtggtctgaaaaccgattgggtgtctccaggtcaatcaa40<210>34<211>41<212>DNA<213>人工的<220><223>T341C引物FIP-3<400>34gaaaaccgattgtggtcagagggtgtctcc鄉(xiāng)tc犯tcaa41<210>35<211>42<212>DNA〈213>人工的〈220〉<223〉T341C引物FIP-4<400>35ttgattgacctggagacacggcttagaggctatttttgatca42<210>36<211>41<212>DNA<213>人工的<220><223>T341C引物FIP-5<400>36ttgattgacctggagacaggcttagaggctatttttgatca41<210〉37<211>44<212>DNA〈213〉人工的<220>〈223〉T341C引物FIP-6<400>37ttgattgacctggagacacggcttagaggctatttttgatcaca44<210>38<211〉43<212>DNA<213>人工的<220><223>T341C引物FIP-7<400>38ttgattgacctggagacacgcttagaggctatttttgatcaca43<210>39<211>24<212>DNA〈213>人工的〈220><223>T341C引物F3-1<400>39gaggctatttttgatcacattgta24<210>40<211>18<212>DNA<213>人工的〈220><223>T341C引物B3-1〈400>40ggctgccacatctgggag18<210>41〈211>18<212>DNA〈213〉人工的<220><223>T341C引物F3-2<400>41tgtgggcaagccatggag18<210>42<211〉43<212>DNA<213>人工的<220><223>G590A引物FIP-1<400>42gg柳cgtctgcaggtatgtattcacttatttacgcttgaacc43<210>43<211>47<212>DNA<213〉人工的<220〉<223>G590A引物BIP-1<400>43gatttccttggggagaaatctcgtgacacaagggtttattttgttcc47<210>44<211>43<212>DNA<213>人工的<220><223>G590A引物BIP-3<400>44gggg柳aatctcgtgcccaagggtttattttgttccttattc43<210>45<211>48<212>廳<213>人工的<220><223>G590A引物FIP-2〈400〉45gagacgtctgcaggtatgtattcatccaaaaaatatacttatttacgc48〈210>46<211>47〈212>腿<213>人工的<220><223>G590A引物BIP-2<46cttggggagaaatctcgtgccccatacacaagggtttattttgttcc47<210>47<211>48<212>DNA<213>人工的<220>〈223〉G590A引物FIP-3〈400>47cgtctgcaggtatgtattcat柳cccaaaaaatatacttatttacgc48<210>48<211〉49<212>DNA<213〉人工的<220>〈223〉G590A引物FIP-4<400>48ctgcaggtatgtattcatagactccaccaaaaaatatacttatttacgc49<210>49<211>21<212〉DNA<213>人工的<220〉<223〉G590A引物F3<400>49tctcatctcctgccaaagaag21<210>50<211>24<212>廳<213>人工的〈220><223>G590A引物B3<400>50agttgataattagtgagttgggtg24<210>51<211>14<212>薩<213>人工的〈220〉<223>陰性對照探針<400>51gtgctgcaggtgcg14<210〉52<211>17<212>腿〈213〉人工的<220><223〉G590A野生型探針<400>52gaacctcgaacaattga17<210>53<211〉21<212〉腿<213>人工的<220〉<223>G590A野生型探針〈400〉53ttgaacctcgaacaattgaag21<210>54<211>26<212>DNA〈213〉人工的<220><223>G590A野生型探針<400>54ttgaacctcgaacaattgaagatttt26<210>55<211>29<212>腿〈213>人工的<220><223>G590A野生型探針<400>55ttgaacctcgaacaattgaagattttgag29<210>56<211>19<212>DNA<213〉人工的<220〉<223>G590A突變型探針<400>56gaacctcaaac犯ttg犯g19<210>57<211>21<212>腿<213>人工的<220>〈223>G590A突變型探針<400>57gaacctcaaacaattgaagat21<210>58<211>23<212〉腿<213>人工的<220〉<223>G590A突變型探針<400>58ttgaacctcaaacaattgaagat23<210>59<211〉27<212>DNA<213>人工的<220>〈223〉G590A突變型探針<400>59ttgaacctcaaacaattgaagattttg27<210〉60<211>30〈212>腿<213>人工的<220><223>G590A突變型探針〈400〉60ttgaacctcaaacaattgaagattttgagt30<210>61<211>20<212>DNA〈213〉人工的<220><223〉G857A野生型探針<400>61tggtgatggatcccttacta20<210>62<211>23<212>靈<213〉人工的<220><223>G857A野生型探針<400>62cctggtgatggatcccttactat23<210>63<211>24<212>DNA<213>人工的<220><223>G857A野生型探針<400>63cctggtgatggatcccttactatt24<210〉64<211>25〈212>DNA<213>人工的<220><223>G857A野生型探針<400>64acctggtgatggatcccttactatt25〈210>65<211>30〈212>腿<213>人工的<220><223>G857A野生型探針〈400〉65aacctggtgatggatcccttactatttaga30<210〉66<211>22〈212〉DNA<213>人工的<220〉〈223〉G857A突變型探針〈400〉66ctggtgatgaatcccttactat22<210>67<211>26<212〉DNA<213>人工的<220>〈223〉G857A突變型探針<■67acctggtgatgaatcccttactattt26<210>68<211>28<212>DNA<213>人工的<220><223>G857A突變型探針<400>68aacctggtgatgaatcccttactattta28<210>69<211>29<212>腿<213>人工的<220>〈223〉G857A突變型探針<400〉69aacctggtgatgaatcccttactatttag29〈210>70<211>31<212>DNA<213>人工的<220>〈223>G857A突變型探針<400>70aacctggtgatgaatcccttactattt柳a31<210>71<211>16<212>DNA<213>人工的<220><223>T341C野生型探針<400>71ggtgaccattgacggc16<210>72<211>18<212>DNA<213>人工的〈220〉<223>T341C野生型探針<400>72aggtgaccattgacggca18<210>73<211>19<212>腿<213>人工的<220><223>T341C野生型探針<400>73caggtgaccattgacggca19〈210>74<211>20<212>DNA<213〉人工的〈220〉<223>T341C野生型探針<400>74caggtgaccattgacggcag20<210>75<211〉16<212〉■<213〉人工的<220><223〉T341C突變型探針<400〉75aggtgaccactgacgg16<210>76<211>17<212〉DNA<213>人工的<220〉<223〉T341C突變型探針〈400〉76aggtgaccactgacggc17<210>77〈211>18<212>DNA〈213〉人工的〈220〉<223>T341C突變型探針<400>77aggtgaccactgacggca18<210>78<211〉19<212〉DNA<213〉人工的<220〉<223>T341C突變型探針<400>78caggtgaccactgacggca19<210>79〈211>20〈212>DNA<213>人工的<220>〈223>T341C突變型探針<400〉79caggtgaccactgacggcag20<210>80<211>16<212>DNA<213>人工的<220><223>G590A引物L(fēng)B<400>80<210>81<211〉898<212>腿<213>人<220><223>NAT1<400>81tcttcaacaccagatccgagctgttccctttg柳accttaacatccattgtggggatgc60catggacttaggcttagaggccatttttgatcaagttgtg卿agaaatcggggtggatg120gtgtctccaggtcaatcatcttctgtactgggctctgaccactattggttttgagaccac180gatgttgggagggtatgtttacagcactccagccaaaaaatacagcactggcatgattca240ccttctcctgcaggtgaccattgatggcaggaactacattgtcgatgctgggtttggacg300ctcataccagatgtggcagcctctggagttaatttctgggaaggatcagcctcaggtgcc360ttgtgtcttccgtttgacggaag柳atggattctggtatctagaccaaatcag卿gga420acagtacattccaaatgaagaatttcttcattctgatctcctagaagacagcaaataccg480aaaaatctactcctttactcttaagcctcgaacaattgaagattttgagtctatgaatac540atacctgcagacatctccatcatctgtgtttactagtaaatcattttgttccttgcagac600cccaga/tggggttcactgtttggtgggcttcaccctcacccataggagattcaattataa660ggacaatacagatctaatagagttca柳ctctgagtgaggaagaaatagaaaaagtgct720gaaaeiEitEitattt犯tatttccttgcagagaaagcttgtgccc犯acatggtgatagatt780ttttactatttagaataaggagtaaaacaatcttgtctatttgtcatccagctcaccagt840tatcaactgacgacctatcatgtatcttctgtacccttaccttattttgaagaei犯tc898<210〉82〈211>900〈212〉DNA<213〉人<220>〈223〉NAT2<400〉82tcttgagcaccagatccgggctgttccctttgagaaccttaacatgcattgtgggcaagc60catggagttgggcttagaggctatttttgatcacattgta卿卿aaccggggtgggtg120gtgtctccaggtcaatcaacttctgtactgggctctgaccacaatcggttttcagaccac180aatgttaggagggtatttttacatccctccagttaacaaatacagcactggcatggttca240ccttctcctgcaggtgaccattgacggcaggaattacattgtcgatgctgggtctggaag300ctcctcccagatgtggcagcctctagaattaatttctgggaaggatcagcctcaggtgcc360ttgcattttctgcttgacagaagag卿ggaatctggtacctggaccaaatcaggagaga420gcagtatattacaaacaaagaatttcttaattctcatctcctgccaaagaagaaacacca480aaaaatatacttatttacgcttgaacctcgaacaattgaagattttgagtctatgaatac540atacctgcagacgtctccaacatcttcatttataaccacatcattttgttccttgcagac600cccagaaggggtttactgtttggtgggcttcatcctcacctatagaaaattcaattataa660agacaatacagatctggtcgagttt犯aactctcactgaggaagaggttgaagaagtgct720gaa犯atataUtaagatttccttggggagaaatctcgtgcccaaacctggtgatggatc780ccttactatttagaataaggaacaaaataaacccttgtgtatgtatcacccaactcacta840attatcaacttatgtgctatcagatatcctctctaccctcacgttattttgaagaaaatc900權(quán)利要求1.用于檢測NAT2基因單核苷酸多態(tài)性G590A的基因型的LAMP擴(kuò)增的核苷酸引物組，其特征在于當(dāng)靶核苷酸從5’末端依次具有F3區(qū)、F2區(qū)和F1區(qū)并且從3’末端依次具有B3c區(qū)、B2c區(qū)和B1c區(qū)時(shí)，并且當(dāng)引物組包括在3’末端側(cè)具有與F2區(qū)相同的序列并在5’末端側(cè)具有與F1區(qū)互補(bǔ)的序列的FIP引物、具有與F3區(qū)相同的序列的F3引物、在3’末端側(cè)具有與B2c區(qū)互補(bǔ)的序列并在5’末端側(cè)具有與B1c區(qū)相同的序列的BIP引物、以及具有與B3c區(qū)互補(bǔ)的序列的B3引物時(shí)，引物組包括選自表2和3所示引物組1-16的FIP引物和BIP引物、結(jié)合至靶核苷酸上距F2區(qū)5’末端60個(gè)堿基內(nèi)區(qū)域的F3引物、以及結(jié)合至靶核苷酸上距B2c區(qū)3’末端60個(gè)堿基內(nèi)區(qū)域的B3引物。2.根據(jù)權(quán)利要求1的核苷酸引物組，其特征在于FIP引物和BIP引物選自表2和3所示的引物組3、4和9。3.根據(jù)權(quán)利要求1的核苷酸引物組，其特征在于FIP引物和BIP引物是表3所示引物組9的引物。4.檢測NAT2基因中單核苷酸多態(tài)性G590A的基因型的方法，其特征在于包括步驟通過使用根據(jù)權(quán)利要求1的核苷酸引物組擴(kuò)增靶核苷酸得到擴(kuò)增產(chǎn)物^和5.權(quán)利要求4的方法，其特征在于通過固定化于支持物上的核苷酸探針與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，然后確定結(jié)合至核苷酸探針上的擴(kuò)增產(chǎn)物的量，來實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物的測定；以及體擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)的突變體核苷酸引物，6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于野生型核苷酸探針具有62-70'C的Tm值，突變體核苷酸探針具有61-69n的Tm值，并且單核苷酸多態(tài)性G5卯A位點(diǎn)位于距各個(gè)核苷酸探針末端3個(gè)或更多個(gè)堿基的內(nèi)部。7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其特征在于野生型核苷酸探針具有62-66匸的Tm值，并且突變體核苷酸探針具有66-67*C的Tm值。8.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于野生型核苷酸探針具有SEQIDNo.53或54的序列或者其互補(bǔ)序列，并且突變體核苷酸探針具有SEQIDNo.59的序列或者其互補(bǔ)序列。9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其特征在于野生型核苷酸探針具有SEQIDNo.54的序列或者其互補(bǔ)序列，并且突變體核苷酸探針具有SEQIDNo.59的序列或者其互補(bǔ)序列。10.用于從通過使用核苷酸引物組擴(kuò)增耙核苷酸所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測NAT2基因中單核苷酸多態(tài)性G590A的基因型的野生型和突變體核苷酸探針，其特征在于野生型核苷酸探針與野生型擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)并具有62-70"的Tm值，并且單核苷酸多態(tài)性G590A位點(diǎn)位于距末端3個(gè)或更多個(gè)堿基的內(nèi)部，并且突變體核苷酸探針與突變體擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)并具有61-69n的Tm值，并且單核苷酸多態(tài)性G5卯A位點(diǎn)位于距末端3個(gè)或更多個(gè)堿基的內(nèi)部；當(dāng)M普酸從5，末端依次具有TF3區(qū)、F2區(qū)和F1區(qū)并且從3，末端依次具有B3c區(qū)、B2c區(qū)和Blc區(qū)時(shí)，并且當(dāng)核苷酸引物組包括在3，末端側(cè)具有與F2區(qū)相同的序列并在5，末端側(cè)具有與Fl區(qū)互補(bǔ)的序列的FIP引物、具有與F3區(qū)相同的序列的F3引物、在3，末端側(cè)具有與B2c區(qū)互補(bǔ)的序列并在5，末端側(cè)具有與Blc區(qū)相同的序列的BIP引物、以及具有與B3c區(qū)互補(bǔ)的序列的B3引物時(shí)，F(xiàn)IP引物和BIP引物選自表2和3所示引物組1-16;F3引物結(jié)合至乾核苷酸上距F2區(qū)5，末端60個(gè)堿基內(nèi)區(qū)域；和B3引物結(jié)合至乾核苷酸上距B2c區(qū)3，末端60個(gè)堿基內(nèi)區(qū)域。11.根據(jù)權(quán)利要求10的野生型和突變體核苷酸探針，其特征在于野生型核苷酸探針具有SEQIDNo.53或54的序列或者其互補(bǔ)序列，并且突變體核苷酸探針具有SEQIDNo.59的序列或者其互補(bǔ)序列。12.根據(jù)權(quán)利要求10的野生型和突變體核苷酸探針，其特征在于探針固定化于支持物上。13.用于檢測NAT2基因單核苷酸多態(tài)性G857A的基因型的LAMP擴(kuò)增的核苷酸引物組，其特征在于當(dāng)耙核苷酸從5，末端依次具有F3區(qū)、F2區(qū)和Fl區(qū)并且從3，末端依次具有B3c區(qū)、B2c區(qū)和Blc區(qū)時(shí)，并且當(dāng)核苷酸引物組包括在3'末端側(cè)具有與F2區(qū)相同的序列并在5'末端側(cè)具有與Fl區(qū)互補(bǔ)的序列的FIP引物、具有與F3區(qū)相同的序列的F3引物、在3，末端側(cè)具有與B2c區(qū)互補(bǔ)的序列并在5，末端側(cè)具有與Blc區(qū)相同的序列的BIP引物、以及具有與B3c區(qū)互補(bǔ)的序列的B3引物時(shí)，引物組包括選自表4所示引物組1-5的FIP引物和BIP引物；結(jié)合至把核香酸上距F2區(qū)5，末端60個(gè)堿基內(nèi)區(qū)域的F3引物；以及結(jié)合至靶核苦酸上距B2c區(qū)3，末端60個(gè)堿基內(nèi)區(qū)域的B3引物。14.根據(jù)權(quán)利要求13的核苷酸引物組，其特征在于FIP引物和BIP引物是表4所示引物組5的引物。15.檢測NAT2基因中單核苦酸多態(tài)性G857A的基因型的方法，其特征在于包括步驟通過使用根據(jù)權(quán)利要求13的核苷酸引物組擴(kuò)增耙核苷酸得到擴(kuò)增產(chǎn)物；和測定并比較擴(kuò)增產(chǎn)物中所包含的野生型擴(kuò)增產(chǎn)物和突變體擴(kuò)增產(chǎn)物的16.權(quán)利要求15的方法，其特征在于通過固定化于支持物上的核苷酸探針與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，然后確定結(jié)合至核苷酸探針上的擴(kuò)增產(chǎn)物的量，來實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物的測定；以及體擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)的突變體核苷酸引物。17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其特征在于野生型核苷酸探針具有59-68X:的Tm值，突變體核苷酸^:針具有58-68tl的Tm值，并且單核苷酸多態(tài)性G857A位點(diǎn)位于距各個(gè)核苷酸探針末端3個(gè)或更多個(gè)堿基的內(nèi)部。18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其特征在于野生型核苷酸探針具有64-65X:的Tm值，并且突變體核苷酸探針具有64-66*C的Tm值。19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其特征在于野生型核普酸探針具有SEQIDNo.62、63或64的序列或者其互補(bǔ)序列，并且突變體核苷酸探針具有SEQIDNo.67、68或69的序列或者其互補(bǔ)序列。20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其特征在于野生型核苷酸探針具有SEQIDNo.62的序列或者其互補(bǔ)序列，并且突變體核苦酸探針具有SEQIDNo.67的序列或者其互補(bǔ)序列。21.用于從通過使用核苷酸引物組擴(kuò)增靶核苷酸所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測NAT2基因中單核苷酸多態(tài)性G857A的基因型的野生型和突變體核苷酸探針，其特征在于野生型核苷酸探針與野生型擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)并具有59-68匸的Tm值，并且單核苷酸多態(tài)性G857A位點(diǎn)位于距末端3個(gè)或更多個(gè)堿基的內(nèi)部，并且突變體核苷酸探針與突變體擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)并具有58-68X:的Tm值，并且單核苷酸多態(tài)性G857A位點(diǎn)位于距末端3個(gè)或更多個(gè)堿基的內(nèi)部；當(dāng)靼核苷酸從5，末端依次具有F3區(qū)、F2區(qū)和F1區(qū)并JU^3，末端依次具有B3c區(qū)、B2c區(qū)和Blc區(qū)時(shí)，并且當(dāng)核苷酸引物組包括在3，末端側(cè)具有與F2區(qū)相同的序列并在5，末端側(cè)具有與Fl區(qū)互補(bǔ)的序列的FIP引物、具有與F3區(qū)相同的序列的F3引物、在3，末端側(cè)具有與B2c區(qū)互補(bǔ)的序列并在5'末端側(cè)具有與Blc區(qū)相同的序列的BIP引物、以及具有與B3c區(qū)互補(bǔ)的序列的B3引物時(shí)，F(xiàn)IP引物和BIP引物選自表4所示引物組1-5;F3引物結(jié)合至耙核苷酸上距F2區(qū)5，末端60個(gè)堿基內(nèi)區(qū)域；和B3引物結(jié)合至靼核苷酸上距B2c區(qū)3，末端60個(gè)堿基內(nèi)區(qū)域。22.根據(jù)權(quán)利要求21的野生型和突變體核苷酸探針，其特征在于野生型核苷酸^針具有SEQIDNo.62、63或64的序列或者其互補(bǔ)序列，并且突變體核苷酸探針具有SEQIDNo.67、68或69的序列或者其互補(bǔ)序列。23.根據(jù)權(quán)利要求21的野生型和突變體核苷酸探針，其特征在于探針固定化于支持物上。24.用于檢測NAT2基因單核苷酸多態(tài)性T341C的基因型的LAMP擴(kuò)增的核苷酸引物組，其特征在于當(dāng)乾核苷酸從5，末端依次具有F3區(qū)、F2區(qū)和F1區(qū)并且從3，末端依次具有B3c區(qū)、B2c區(qū)和Blc區(qū)時(shí)，并且當(dāng)核苷酸引物組包括在3，末端側(cè)具有與F2區(qū)相同的序列并在5，末端側(cè)具有與Fl區(qū)互補(bǔ)的序列的FIP引物、具有與F3區(qū)相同的序列的F3引物、在3，末端側(cè)具有與B2c區(qū)互補(bǔ)的序列并在5，末端側(cè)具有與Blc區(qū)相同的序列的BIP引物、以及具有與B3c區(qū)互補(bǔ)的序列的B3引物時(shí)，引物組包括選自表5所示引物組1-10的FIP引物和BIP引物；結(jié)合至耙核苷酸上距F2區(qū)5，末端60個(gè)堿基內(nèi)區(qū)域的F3引物；以及結(jié)合至把核苷酸上距B2c區(qū)3，末端60個(gè)堿基內(nèi)區(qū)域的B3引物。25.根據(jù)權(quán)利要求24的核苷酸引物組，其特征在于FIP引物和BIP引物選自表5所示引物組3、6、9和10。26.根據(jù)權(quán)利要求24的核普酸引物組，其特征在于FIP引物和BIP引物是表5所示引物組6和10的引物。27.檢測NAT2基因中單核普酸多態(tài)性T341C的基因型的方法，其特征在于包括步驟通過使用根據(jù)權(quán)利要求24的核苷酸引物組擴(kuò)增耙核苷酸得到擴(kuò)增產(chǎn)物j和測定并比較擴(kuò)增產(chǎn)物中所包含的野生型擴(kuò)增產(chǎn)物和突變體擴(kuò)增產(chǎn)物的量。28.權(quán)利要求27的方法，其特征在于通過固定化于支持物上的核苷酸探針與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，然后確定結(jié)合至核苷酸探針上的擴(kuò)增產(chǎn)物的量，來實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物的測定；以及體擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)的突變體核苷酸引物。29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其特征在于野生型核苷酸探針具有61-69匸的Tm值，突變體核苦酸探針具有58-70'C的Tm值，并且單核苷酸多態(tài)性T341C位點(diǎn)位于距各個(gè)核苷酸探針末端3個(gè)或更多個(gè)堿基的內(nèi)部。30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其特征在于野生型核苷酸探針具有66-68r的Tm值，并且突變體核苷酸探針具有63-69X:的Tm值。31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其特征在于野生型核苷酸探針具有SEQIDNo.72或73的序列或者其互補(bǔ)序列，并且突變體核苷酸探針具有SEQIDNo.76、77或78的序列或者其互補(bǔ)序列。32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其特征在于野生型核苷酸探針具有SEQIDNo.72的序列或者其互補(bǔ)序列，并且突變體核苷酸探針具有SEQIDNo.76的序列或者其互補(bǔ)序列。33.用于從通過使用核苷酸引物組擴(kuò)增耙核苷酸所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測NAT2基因中單核普酸多態(tài)性T341C的基因型的野生型和突變體核苷酸探針，其特征在于野生型核苷酸探針與野生型擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)并具有61-69匸的Tm值，并且單核苷酸多態(tài)性T341C位點(diǎn)位于距末端3個(gè)或更多個(gè)堿基的內(nèi)部，并且突變體核苷酸探針與突變體擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)并具有58-70X:的Tm值，并且單核苷酸多態(tài)性T341C位點(diǎn)位于距末端3個(gè)或更多個(gè)堿基的內(nèi)部；當(dāng)耙核苷酸從5，末端依次具有F3區(qū)、F2區(qū)和Fl區(qū)并且從3，末端依次具有B3c區(qū)、B2c區(qū)和Blc區(qū)時(shí)，當(dāng)核苷酸引物組包括在3，末端側(cè)具有與F2區(qū)相同的序列并在5，末端側(cè)具有與Fl區(qū)互補(bǔ)的序列的FIP引物、具有與F3區(qū)相同的序列的F3引物、在3，末端側(cè)具有與B2c區(qū)互補(bǔ)的序列并在5，末端側(cè)具有與Blc區(qū)相同的序列的BIP引物、以及具有與B3c區(qū)互補(bǔ)的序列的B3引物時(shí)，F(xiàn)IP引物和BIP引物選自表5所示引物組1-10;F3引物結(jié)合至耙核苷酸上距F2區(qū)5，末端60個(gè)堿基內(nèi)區(qū)域；和B3引物結(jié)合至乾核苷酸上距B2c區(qū)3，末端60個(gè)堿基內(nèi)區(qū)域。34.根據(jù)權(quán)利要求33的野生型和突變體核苷酸探針，其特征在于野生型核苷酸探針具有SEQIDNo.72或73的序列或者其互補(bǔ)序列，并且突變體核苷酸探針具有SEQIDNo.76、77或78的序列或者其互補(bǔ)序列。35.根據(jù)權(quán)利要求33的野生型和突變體核苷酸探針，其特征在于探針固定化于支持物上。36.用于檢測NAT2基因單核苷酸多態(tài)性G590A和G857A的基因型的LAMP擴(kuò)增的核苦酸引物組，其特征在于當(dāng)耙核苷酸從5，末端依次具有F3區(qū)、F2區(qū)和F1區(qū)并且從3，末端依次具有B3c區(qū)、B2c區(qū)和Blc區(qū)時(shí)，并且當(dāng)核苷酸引物組包括在3，末端側(cè)具有與F2區(qū)相同的序列并在5'末端側(cè)具有與Fl區(qū)互補(bǔ)的序列的FIP引物、具有與F3區(qū)相同的序列的F3引物、在3，末端側(cè)具有與B2c區(qū)互補(bǔ)的序列并在5，末端側(cè)具有與Blc區(qū)相同的序列的BIP引物、以及具有與B3c區(qū)互補(bǔ)的序列的B3引物時(shí)，引物組包括選自表6所示引物組1-8的FIP引物和BIP引物；結(jié)合至乾核苷酸上距F2區(qū)5，末端60個(gè)堿基內(nèi)區(qū)域的F3引物；以及結(jié)合至耙核苷酸上距B2c區(qū)3，末端60個(gè)堿基內(nèi)區(qū)域的B3引物。37.根據(jù)權(quán)利要求36的核苷酸引物組，其特征在于FIP引物和BIP引物選自表6所示引物組1、6、7和8。38.根據(jù)權(quán)利要求36的核苷酸引物組，其特征在于FIP引物和BIP引物是表6所示引物組6的引物。39.檢測NAT2基因中單核苷酸多態(tài)性G590A和G857A的基因型的方法，其特征在于包括步驟通過使用根據(jù)權(quán)利要求36的核苷酸引物組擴(kuò)增耙核苷酸得到擴(kuò)增產(chǎn)物^和量<40.權(quán)利要求39的方法，其特征在于通過固定化于支持物上的核苷酸探針與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，然后確定結(jié)合至核苷酸探針上的擴(kuò)增產(chǎn)物的量，來實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物的測定；以及體擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)的突變體核苷酸引物。41.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其特征在于野生型核苷酸探針對于G5卯A的野生型核苷酸探針具有SEQIDNo.54的序列或者其互補(bǔ)序列且對于G857A的野生型核苷酸探針具有SEQIDNo.62的序列或者其互補(bǔ)序，并且突變體核苷酸探針對于G590A的突變體核苷酸探針具有SEQIDNo.59的序列或者其互補(bǔ)序列且對于G857A的突變體核苷酸探針具有SEQIDNo.67的序列或者其互補(bǔ)序列。42.同時(shí)檢測NAT2基因單核苷酸多態(tài)性G5卯A、G857A和T341C的基因型的方法，其特征在于包括步驟通過使用表3中所示引物組9擴(kuò)增耙核苷酸獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；通過使用表4中所示引物組5擴(kuò)增乾核苷酸獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；通過使用表5中所示引物組6和10擴(kuò)增把核苷酸獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；混合擴(kuò)增產(chǎn)物以制備液體混合物；通過將液體混合物與核苷酸探針固定化支持物接觸使擴(kuò)增產(chǎn)物與核苷酸探針雜交，其中支持物上攜帶有固定于其上的用于G590A的具有序列SEQIDNo.54或其互補(bǔ)序列的野生型核苦酸探針、用于G590A的具有序列SEQIDNo.59或其互補(bǔ)序列的突變體核苷酸探針、用于G857A的具有序列SEQIDNo.62或其互補(bǔ)序列的野生型核苷酸^^針、用于G857A的具有序列SEQIDNo.67或其互補(bǔ)序列的突變體核苷酸探針、用于T341C的具有序列SEQIDNo.72或其互補(bǔ)序列的野生型核苷酸探針、和用于T341C的具有序列SEQIDNo.76或其互補(bǔ)序列的突變體核苷酸探針；測量結(jié)合至各個(gè)核苷酸探針的擴(kuò)增產(chǎn)物的量；比較分別結(jié)合至用于G590A的野生型核苷酸探針和用于G5卯A的突變體核苷酸探針的擴(kuò)增產(chǎn)物的量；比較分別結(jié)合至用于G857A的野生型核苷酸探針和用于G857A的突變體核苷酸探針的擴(kuò)增產(chǎn)物的量；和比較分別結(jié)合至用于T341C的野生型核苷酸探針和用于T341C的突變體核香酸探針的擴(kuò)增產(chǎn)物的量。全文摘要本發(fā)明提供了用于鑒定N-乙?；D(zhuǎn)移酶2(NAT2)基因型的核苷酸引物組和探針，具體地，提供了用于檢測NAT2基因中單核苷酸多態(tài)性G590A、G857A和T341C的基因型的LAMP擴(kuò)增的核苷酸引物組。本發(fā)明還提供了用于檢測通過本發(fā)明引物組所擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸探針。本發(fā)明還提供了通過使用本發(fā)明的引物組檢測NAT2基因中單核苷酸多肽性G590A、G857A和T341C的基因型的方法。文檔編號C12N15/11GK101275166SQ200810003438公開日2008年10月1日申請日期2008年1月15日優(yōu)先權(quán)日2007年3月28日發(fā)明者中村奈緒子,伊藤桂子,橋本幸二,源間信弘申請人:株式會社東芝