專利名稱：一種pcr引物的設計方法及其應用和試劑盒的制作方法
技術領域：
-
本發(fā)明屬于核酸診斷試劑領域，具體涉及一種全新的、高效易控的PCR引物設計 方法，以及利用該方法設計內對照參與的肝炎和艾滋病核酸多重PCR檢測試劑盒，利 用該方法生產(chǎn)的試劑盒靈敏度高，內對照非常穩(wěn)定可靠，適用于臨床核酸檢驗和血 液核酸篩查。
背景技術：
PCR技術(聚合酶鏈式反應技術)是一種特異擴增DNA的體外酶促反應，可以短 時間擴增出兩段己知序列之間的DNA，用于診斷、鑒定、制備探針及基因工程產(chǎn)品開 發(fā)等，是一項極其有效和實用的技術。由于PCR試驗存在一定的假陽性和假陰性問題， 導致PCR技術在我國臨床診斷中的應用曾一度被叫停，近年來由于改進的PCR技術如 巢式PCR (nested PCR)、多重PCR(multiplex PCR)、熒光PCR技術等在較大程度上 增加了該技術的敏感性和特異性，加上衛(wèi)生部于2002-01頒發(fā)了有關基因擴增檢驗 技術臨床應用的法規(guī)性文件《臨床基因擴增檢驗試驗室管理暫行辦法》(衛(wèi)醫(yī)發(fā) (2002) 10號)，要求從事臨床基因擴增檢驗的技術人員必須經(jīng)過衛(wèi)生部臨床檢驗 中心或授權的省級培訓機構的上崗培訓，持證上崗，使PCR技術在臨床檢驗診斷中重 新發(fā)揮其不可替代的作用，PCR已廣泛用于核酸的科學研究以及臨床疾病的診斷和治 療監(jiān)測，尤其在感染性疾病診斷方面更有應用價值。
定量PCR目前在臨床上已廣泛使用，特別是熒光定量PCR技術，其具有出結果快 且可靠等優(yōu)勢，在病原體基因擴增中常用于檢測及鑒定微生物，評價治療反應和檢 測耐藥性突變等。在許多情況下已證明PCR技術對感染性疾病的評價較傳統(tǒng)方法更為 優(yōu)越，尤其是在鑒定不易培養(yǎng)、生長緩慢或不能培養(yǎng)的病原體時，采用PCR技術可以 快速(1-2小時內)提供診斷結果，并能同時分析多種樣品；同時PCR不受藥物治療 的干擾，可在治療開始后確定感染原，為用藥提供可靠的參考。
PCR幾乎可以用于檢測任何組織或體液，包括新鮮的和存檔的手術標本來診斷疾
病。DNA是相對穩(wěn)定的分子，可從木乃伊或冷凍的組織中獲取標本。指數(shù)擴增使得PCR 具有極高的靈敏性，而獨特的引物使用使其具有高度的特異性，且引物的使用保障 了PCR技術不象其他傳統(tǒng)的檢測方法為提高特異性而犧牲靈敏性。
目前PCR在臨床方面的應用主要集中在從病原體和患者基因組中擴增和檢測具有 診斷參考價值的DNA片段。
盡管PCR技術已被廣泛地應用于核酸分析，但普通PCR技術(包括已通過國家注 冊的熒光PCR)診斷試劑還存在這樣一些不足
1. 根本不具有內對照系統(tǒng)，從而無法排除假陰性結果和受到抑制的反應結果， 且不能準確定量和指示PCR的擴增效率；或者
2. —些試劑國家FDA注冊時聲稱有內對照系統(tǒng)，但實際用于臨床核酸診斷時卻 沒有有效的內對照系統(tǒng)，因為申請國家FDA注冊的臨床核酸診斷試劑必須具有內對照 系統(tǒng)才可能通過，但是常規(guī)技術得到內對照系統(tǒng)會影響試劑的靈敏度，而一些靈敏 度符合要求的內對照系統(tǒng)制備成本相當昂貴，故一些公司在進行FDA申請時雖然具有 內對照系統(tǒng)，但一旦其通過審批，在醫(yī)院臨床使用時，就去掉了內對照系統(tǒng)，以保證 試劑的靈敏度；和/或
3. 在血液核酸篩查試劑中，因為陽性率只有百分之一乃至千分之一以下，所 以用于血液篩查的核酸診斷試劑必須具有內對照系統(tǒng)，以確保試驗的陰性結果確實 成立(非假陰性)，但目前除了一些利用高成本試驗篩選得到的內對照系統(tǒng)之外， 國內血液篩查試劑都無法做到在內對照參與的反應中使內對照系統(tǒng)不抑制靶核酸擴 增檢測，也就是說其以損失靈敏度的方式加入內對照系統(tǒng)。
產(chǎn)生上述問題的根本原因在于，常規(guī)方法制備的內對照系統(tǒng)在擴增反應中會競 爭靶序列擴增所需要的底物，從而抑制了低濃度靶序列的擴增，此外，加入的內對 照引物會與靶序列擴增引物交叉，形成PCR的副反應，從而降低了整個PCR反應的效 率。目前解決上述問題的方法只有進行大量試驗篩選合適的內對照系統(tǒng)，這需要高 昂的成本和很長的研發(fā)周期。
為了解決上述問題，本發(fā)明建立了一種全新的引物設計方法，利用該方法設計 的內對照系統(tǒng)的試劑盒在不影響靶核酸的檢測靈敏度且內對照穩(wěn)定可靠，具有以下 優(yōu)點
1) 內對照的加入量不會影響靶核酸的擴增；
2) 啟動內對照的擴增是可控的；
3)該方法設計的內對照系統(tǒng)適用于熒光PCR、 PCR-ELISA、 PCR-流體芯片分析、 PCR-液態(tài)芯片分析、PCR-DNA點陣芯片分析等核酸診斷領域；

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種全新的引物設計方法、利用該方法得到的內對照系通用于擴增檢測乙肝(HBV)、丙肝(HCV)和人免疫缺陷病毒(HIV)核酸，以克服 傳統(tǒng)蛋白檢測固有的缺陷和不足，同時彌補現(xiàn)有國內外同類產(chǎn)品的諸多不足乃至方 法學上無法解決的致命缺陷。
按照本發(fā)明所述的方法包括以下三項相對獨立又相互關聯(lián)的內容，并且提供了 可選組合以供完整實現(xiàn)本發(fā)明的試劑盒。l.提供了全新內對照引物的設計方法，其 特點是內對照的加入量不受限制，且內對照的擴增啟動可以人為控制而使其擴增不 干擾耙序列的擴增檢測。2.提供了一種不同于目前市場上其它試劑盒的PC財廣增參數(shù) 的PC財廣增參數(shù)設計方案，利用該參數(shù)，可以有效控制內對照擴增啟動的時間，有利 于控制內對照的擴增量。3.提供了一種全新的試劑盒設計理念，特別是在這種設計 理念下設計的HBV DNA、 HCV RNA、 HIV RNA熒光檢測試劑盒具有其它試劑盒無法比擬 的靈敏度和穩(wěn)定的內對照。本發(fā)明的最突出優(yōu)點是檢測試劑設計容易，組成簡單， 引物條數(shù)少、成本低，具有優(yōu)秀的靈敏度和特異性。
根據(jù)本發(fā)明的PCR引物的設計方法，其特征在于，使內對照引物的退火溫度低于 靶序列引物的退火溫度，先在高退火溫下擴增并富集靶序列，再在低退火溫度下擴 增內對照序列，從而通過控制內對照的啟動擴增時間來避免其對靶序列擴增的抑制。 常規(guī)的退火溫度范圍是45-72°C，在此溫度范圍內本領域技術人員根據(jù)引物序列和實 際需要可以對高低退火溫度進行自由選擇和優(yōu)化。優(yōu)選的是，高退火溫度為63-68'C， 低退火溫度為55-62'C。更優(yōu)選的是，高退火溫度為65'C，低退火溫度為60'C。
在本發(fā)明的PCR引物設計方法的一種優(yōu)選實施方式中，內對照序列和靶序列采用 不同的引物，使靶序列引物的退火溫度高于內對照引物的退火溫度，從而實現(xiàn)降低 退火溫度控制內對照的擴增而不影響靶序列的擴增。
在本發(fā)明的PCR內對照引物設計方法的另一種優(yōu)選實施方式中，內對照序列和靶 序列采用相同的引物，并且該引物與靶序列對應的互補區(qū)完全匹配，而與內對照對 應的互補區(qū)3'端完全匹配、但5'端有1-5個堿基不同，這樣設計的靶序列引物在溫度 改變時選擇性擴增內對照分子，使得內對照引物因為互補配對少于靶序列的數(shù)目，而實現(xiàn)利用退火溫度控制內對照的擴增而不影響靶序列的擴增。
在本發(fā)明的PCR內對照引物設計方法的另一種優(yōu)選實施方式中，內對照序列和靶 序列采用相同的引物，并且該引物與靶序列對應的互補區(qū)完全匹配，而與內對照對 應的互補區(qū)5'端完全匹配、但3'端有l(wèi)-3個堿基不同，這樣設計的靶序列引物在溫度 改變時選擇性擴增內對照分子，使得內對照引物因為互補配對少于靶序列的數(shù)目， 而實現(xiàn)利用退火溫度控制內對照的擴增而不影響靶序列的擴增。
根據(jù)上述方法在PCR擴增中應用，其中PCR的循環(huán)參數(shù)設為兩個部分，第一部分 是變性、高溫退火和延伸，第二部分為變性、低溫退火和延伸。常規(guī)的退火溫度范 圍是45-72'C，在此溫度范圍內本領域技術人員根據(jù)引物序列和實際需要可以對高低 退火溫度進行自由選擇和優(yōu)化。優(yōu)選的是，高退火溫度為63-68'C ，低退火溫度為55-62 °C。更優(yōu)選的是，高退火溫度為65t:，低退火溫度為6(TC。
上述方法或應用，優(yōu)選應用于乙肝DNA、丙肝RNA、人免疫缺陷病毒RNA的檢測。
根據(jù)上述方法可以制備各種PCR擴增試劑盒，其中包括dNTP、 Mg2+、 Taq DNA聚合 酶、Tris-KCl體系、引物、內對照分子等常規(guī)試劑，其特征在于其中所述引物通 用于內對照和靶序列的擴增，并且該引物與靶序列對應的互補區(qū)完全匹配，而與內 對照對應的互補區(qū)5'端完全匹配、但3'端有l(wèi)-3個堿基不同；或者所述引物通用于內 對照和靶序列的擴增，并且該引物與靶序列對應的互補區(qū)完全匹配，而與內對照對 應的互補區(qū)3'端完全匹配、但5'端有l(wèi)-5個堿基不同。
使用上述方法設計的內對照引物具有以下優(yōu)點內對照引物退火溫度低于靶序 列引物的退火溫度，這樣的設計可以控制內對照的啟動擴增時間，從而在預先設計 5-30個循環(huán)只擴增靶序列，在富集靶序列后，再啟動內對照分子的擴增，此時靶序 列濃度要高于內對照1000倍以上，內對照的擴增不再影響到靶序列的擴增。特別是 在后兩種引物設計方案中，內對照引物與靶序列相同，這樣的反應體系因為簡單， 優(yōu)化系統(tǒng)變得更容易且穩(wěn)定，原料少、成本低且合成簡單。
本發(fā)明公開的PCR擴增參數(shù)設計方案不同于目前市場上其它試劑盒的PCR擴增參 數(shù)，在本發(fā)明中，PCR反應參數(shù)分成兩個部分第一部分使用高溫退火溫度進行擴增， 在這一部分由于內對照的低退火溫度，故只擴增耙序列部分而不擴增內對照；第二 部分降低高溫退火溫度3-IO度進行擴增，在這一部分內對照和靶序列同時擴增。傳 統(tǒng)的PCR擴增參數(shù)設計成內對照分子與靶序列同時擴增，這樣內對照的擴增通常會抑 制耙序列的擴增，而本文提供的PCR兩部分擴增參數(shù)會先富集靶序列，故能夠大大提
高試劑盒的靈敏度和穩(wěn)定性。
利用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的試劑盒可廣泛用于臨床檢驗和血液篩査等領域，尤其 是在HBV DNA、 HCV RNA、 HIV RNA熒光檢測試劑盒中因其獨特的引物設計理念和PCR
擴增參數(shù)，而大大提高了試劑盒的靈敏度和穩(wěn)定性，而且因為合成引物數(shù)量少具有 生產(chǎn)容易、操作簡單、低成本的優(yōu)勢。
目前，HBV DNA、 HCV RNA、 HIV RNA熒光檢測試劑盒的內對照系統(tǒng)是與靶序列同 時擴增，且不具有控制性，在臨床的使用情況看來，這樣的試劑最終只能放棄內對 照以保證試劑檢測的靈敏度。具有內對照的試劑有以下優(yōu)點
a) 發(fā)現(xiàn)假陰性造成假陰性的原因包括(1) DNA抽提過程不當。(2) DNA樣 品中含有Taq聚合酶抑制劑，如尿素、DMS0、 SDS等物質，可抑制Taq酶活性，DNA 樣品中的蛋白質和重金屬離子等亦影響Taq酶活性，尤其是含有較多膿液或分泌物 的標本，其中雖有待査菌，但卻因標本處理不當而出現(xiàn)假陰性。設置內對照是判斷 假陰性較好的指示系統(tǒng)，在每一反應管中加入內對照，若內對照未能擴增出來，說 明該反應管的結果可能有問題。
b) 指示PCR的擴增效率內對照的加入量每次是一定的，所以其檢測結果可以顯 示出每個PCR反應的擴增效率。在被抑制的樣品中，內對照是一個很好的判斷標準。
c) 內對照參與耙序列的定量不同儀器和同一儀器的不同的反應位是有很大差 異的，加入的內對照分子可以消除這種差異，使定量結果更準確。
利用本文提供的引物設計方案設計的HBV DNA、 HCV RNA、 HIV RNA熒光檢測試劑
盒很好的解決了內對照的加入擴增問題，并且試驗表明具有很好的臨床效果。
具體實施例方式
實施例1.HBV引物和探針、內對照探針的設計
1.1. HBV引物LBL-HBV01: 5'-aggaa cctct atgtt tccct -3'
U3L-HBV02: 5'-ccact cccat aggaa tcttg-3' LBL-HBV probe01: 5'FAM-tgttg ctgta caaaa ccttc gga-NFQ3' 可供參考的HBV序列(斜體加粗部分為引物結合序列) 解卵scctct s^tttccct cttgttgctg tacaaaacct tcggacggaa actgcacttg tattcccatc ccatcatcct gggctttcgc朋卵"ccts t^ggagt^
1.2. 內對照探針和序列LBL-HBV ic probe01: 5，腿-tgttg ctgAT cTGaa ccttc
gga-NFQ3'
合成內對照序列，可供參考的內對照序列為(斜體部分為引物結合序列)
財gaacctct atgt"cc力t cttgttgctg ATcTGaacct tcggacggaa actgcacttg tattcccatc ccatcatcct gggctttcg71朋卵ttccta t敘卵g^ g
注大寫加粗堿基字母為設計的突變點
1. 3.將合成的內對照序列稀釋到1000c叩ies/ul，用衛(wèi)生部臨檢中心的國家乙肝DNA 標準品(lxlOE+06IU/ml)做樣品，梯度稀釋后，加入內對照分子進行提取，提取的 DNA用于熒光PCR檢測，檢測結果10000IU/ml、 1000IU/ml、 100IU/ml、 10IU/ml的樣 品均為陽性，內對照正常；水對照組提取的樣品只有內對照信號被檢出，該結果為 陰性，符合預期結果。
1.4.使用的循環(huán)參數(shù)94攝氏度3分鐘
(94攝氏度IO秒 65攝氏度30秒)25個循環(huán) (94攝氏度IO秒 60攝氏度35秒)30個循環(huán)
熒光定量PCR儀儀器ABI7500
實施例2.HCV引物和探針、內對照探針的設計
2. l.HCV引物LBL-HCV01:5'-cgtacagcct ccaggcc-3'
U3L-HCV02:5'-gccgg gcata gagtg ggt-3'
HCV probe01:5'FAM-cccct cccgg gagag ccata g-NFQ3' 可供參考的HCV序列(斜體部分為引物結合序列)
cgi"sc解cct ccsggccccc ccctcccggg agagccatag tggtctgcgg aaccggtgag tacaccggaa ttgccgggaa gactgggtcc tttcttggat aascccs"c tstgcccggc
2.2.內對照探針和序列內對照的探針用與HBV相同的內對照探針，序列如下
LBL-HCV ic probe01: 5'ROX-tgttg ctgat ctgaa ccttc gga-NFQ3' 合成內對照序列，可供參考的內對照序列為
cgtac解c" ccaggc71 cc tgttg ctgat ctgaa ccttc gga aaacccactc a7bcaci"C
注大寫加粗堿基字母為設計的突變點
2. 3.將合成的內對照序列稀釋到1000c叩ies/ul，用衛(wèi)生部臨檢中心的國家丙肝RNA 標準品(5xlOE+06IU/ml)做樣品，梯度稀釋后，加入內對照分子進行提取，提取的
RNA用于RT-PCR熒光檢測，檢測結果10000IU/ml、 1000IU/ml、 100IU/ml的樣品均為 陽性，內對照正常；10IU/ml和水對照組提取的樣品只有內對照信號被檢出，該結果 為陰性。
2.4.使用的循環(huán)參數(shù)37攝氏度30分鐘 94攝氏度3分鐘
(94攝氏度IO秒 65攝氏度30秒)25個循環(huán) (94攝氏度IO秒 60攝氏度35秒)30個循環(huán)
熒光定量PCR儀儀器ABI7500
實施例3.HIV引物和探針、內對照探針的設計 3. l.HIV引物LBL-HIV01:5'-aggatgtata gccctattag-3' LBL-HIV02:5'-gaagc ttgct cggct ct-3'
LBL-HIV probe01:5'FAM-ttctg gacst aaaac肌ggg cc犯a aga -NFQ3' 可供參考的HIV序列(斜體部分為引物結合序列)
3ggatgtsts gcccts"sg cattctggac ataaaacaag ggccaaaaga atcctttaga gactatgtag atcggttcta taaaactcta s卵gcc卵gc ss《c"c
3.2.內對照探針和序列內對照的探針用與HBV相同的內對照探針，序列如下 LBL-HIV ic probe01: 5'R0X-tgttg ctgat ctgaa ccttc gga-NFQ3' 合成內對照序列，可供參考的內對照序列為
s^gatgtste gcccts"s71 cc tgttg ctgat ctgaa ccttc gga aaacccactc Ggagccgagc
注大寫加粗堿基字母為設計的突變點
3. 3.將合成的內對照序列稀釋到1000c叩ies/ul，用衛(wèi)生部臨檢中心的國家人免疫缺 陷病毒樣顆粒標準品(HIV VLP lxlOE+09IU/ml)做樣品，梯度稀釋后，加入內對照 分子進行提取，提取的RNA用于RT-PCR熒光檢測，檢測結果10000IU/ml、 1000IU/ml、 100IU/ml、 50IU/ml的樣品均為陽性，內對照正常；10IU/ml和水對照組提取的樣品 只有內對照信號被檢出，該結果為陰性。 3.4.使用的循環(huán)參數(shù)37攝氏度30分鐘94攝氏度3分鐘
(94攝氏度10秒 65攝氏度30秒)25個循環(huán) (94攝氏度10秒 60攝氏度35秒)30個循環(huán) 熒光定量PCR儀儀器ABI7500
根據(jù)本發(fā)明公開的內容，本領域的熟練技術人員無需試驗即可對本發(fā)明所要求保 護的引物設計方法進行領會，從而設計出同樣原理的試劑盒并達到相同結果；特別是 要求保護的用于臨床檢驗和血液篩查的HBV DNA、 HCV RNA、 HIV RNA熒光檢測試劑盒， 本領域的技術人員只需要改動一下引物序列，就可利用本發(fā)明所要求保護的引物設計 方法設計出一套能夠達到預期效果的試劑。本發(fā)明的實施例只是對本發(fā)明進行描述， 但不構成本發(fā)明的限制。
權利要求
1.一種PCR引物的設計方法，其特征在于，在設計引物時，使內對照引物的退火溫度低于靶序列引物的退火溫度，先在高退火溫下擴增并富集靶序列，再在低退火溫度下擴增內對照序列，從而通過控制內對照序列的啟動擴增時間來避免其對靶序列擴增的抑制。
2. 根據(jù)權利要求1的PCR引物的設計方法，其中內對照序列和靶序列采用不同的 引物，并使靶序列引物的退火溫度高于內對照引物的退火溫度。
3. 根據(jù)權利要求1的PCR引物的設計方法，其中內對照序列和靶序列采用相同的 引物，并且該引物與靶序列對應的互補區(qū)完全匹配，而與內對照對應的互補區(qū)3'端 完全匹配、但5'端有l(wèi)-5個堿基不同。
4. 根據(jù)權利要求1的PCR引物的設計方法，其中內對照序列和靶序列采用相同的 引物，并且該引物與靶序列對應的互補區(qū)完全匹配，而與內對照對應的互補區(qū)5'端 完全匹配、但3'端有1-3個堿基不同。
5. 根據(jù)權利要求l-4中任何一項的PCR引物的設計方法，其中高退火溫度為63-68 。C，低退火溫度為55-62°C。
6. 根據(jù)權利要求5的PCR引物的設計方法，其中高退火溫度為65'C，低退火溫度 為60。C。
7. 權利要求1-6的方法在PCR擴增中應用，其中將PCR的循環(huán)參數(shù)設為先后兩個 部分，第一部分是變性、高溫退火和延伸，第二部分為變性、低溫退火和延伸。
8. 根據(jù)權利要求1-7的方法或應用在乙肝DNA、丙肝RNA或人免疫缺陷病毒RNA檢測中的應用。
9. 一種PCR擴增試劑盒，其中包括dNTP、 Mg2+、 Taq DNA聚合酶、Tris-KCl體系、 引物、內對照分子，其特征在于其中所述引物通用于內對照和靶序列的擴增，并 且該引物與靶序列對應的互補區(qū)完全匹配，而與內對照對應的互補區(qū)5'端完全匹配、 但3'端有l(wèi)-3個堿基不同。
10. —種PCR擴增試劑盒，其中包括dNTP、 Mg2+、 Taq DNA聚合酶、Tris-KC1體系、 引物、內對照分子，其特征在于其中所述引物通用于內對照和靶序列的擴增，并 且該引物與靶序列對應的互補區(qū)完全匹配，而與內對照對應的互補區(qū)3'端完全匹配、 但5'端有l(wèi)-5個堿基不同。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種全新的引物設計方法及其在PCR檢測中的應用，以克服傳統(tǒng)PCR檢測固有的缺陷和不足，同時彌補現(xiàn)有國內外同類產(chǎn)品的諸多不足乃至方法學上無法解決的致命缺陷。根據(jù)本發(fā)明的PCR引物的設計方法，使內對照引物的退火溫度低于靶序列引物的退火溫度，先在高退火溫下擴增并富集靶序列，再在低退火溫度下擴增內對照序列，從而通過控制內對照的啟動擴增時間來避免其對靶序列擴增的抑制。
文檔編號C12Q1/68GK101343659SQ20081000695
公開日2009年1月14日 申請日期2008年1月28日 優(yōu)先權日2008年1月28日
發(fā)明者剛 李 申請人:剛 李