專利名稱：：一種提取狂犬病病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及利用生物技術(shù)提取狂犬病病毒的方法。技術(shù)背景目前狂犬病病毒疫苗的提取一般采用分子篩凝膠層析單一手段，存在以下缺陷1)不同批次間質(zhì)量指標(biāo)差異較大，對生物制品的穩(wěn)定性影響較大。2)殘余DNA的去除成為難題。3)殘余宿主蛋白含量過高，臨床表現(xiàn)副作用較大。4)原液制備后抗原含量浮動范圍寬，后期成品配制造成一定障礙。5)影響了生物制品的產(chǎn)品質(zhì)量，制約了工業(yè)化生產(chǎn)提取的規(guī)模。為此許多人嘗試在分子篩層析中，對上樣液性質(zhì)，即病毒收獲液濃縮倍數(shù)，進(jìn)行調(diào)節(jié)；對上樣體積進(jìn)行調(diào)節(jié)；對平衡液進(jìn)行選擇，對平衡液鹽濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)，對平衡液PH值進(jìn)行控制；層析流速進(jìn)行控制等手段。僅能輕微的改善結(jié)果，技術(shù)上沒有突破。李福安等提到，狂犬病毒分子量大于病毒培養(yǎng)液中的雜蛋白分子量。病毒顆粒最先被洗脫下來，在樣品蛋白濃度較小時，病毒與雜蛋白可以被分開。但當(dāng)樣品蛋白濃度大于40mg/mL，由于濃度過大使液體粘度增高，擴(kuò)散速度降低，使正常的凝膠柱層析交換規(guī)律受阻，造成液流圖形不規(guī)則，形成了擴(kuò)散較大的區(qū)帶，病毒尚未完全流出凝膠柱，后面的雜蛋白分子已追上來，致使純化效果不佳。因此，單一用凝膠柱層析法純化Vero細(xì)胞狂犬病疫苗，樣品蛋白濃度應(yīng)在40mg/mL以下。并且上樣體積小于柱床體積的5%，由于蛋白濃度的限制產(chǎn)生了瓶頸，制約了生產(chǎn)規(guī)模。同時存在殘余DNA超標(biāo)的問題。張磊等提及，曾采用過硫酸魚精蛋白直接結(jié)合殘余細(xì)胞DNA的方法，將濃縮了30倍的疫苗原液經(jīng)硫酸魚精蛋白一瓊脂糖凝膠層析，收獲穿透峰后，再用pH3.5醋酸緩沖液洗脫，發(fā)現(xiàn)硫酸魚精蛋白在結(jié)合DNA的同時也結(jié)合了部分病毒糖蛋白，造成了較大的活性損失，合并穿透峰和洗脫峰，pH調(diào)至中性。但是層析填料價格較貴，不能用于工業(yè)化生產(chǎn)，并且抗原損失較大需要進(jìn)行回收處理，同時抗原的穩(wěn)定性需要進(jìn)行考察?？傊诩兓^程中盡可能提高收率是純化工藝需要解決的重要經(jīng)濟(jì)問題。
發(fā)明內(nèi)容為克服上述諸多不足，本發(fā)明的目的在于提供一種用中空纖維超濾柱、離子交換層析、分子篩凝膠層析相結(jié)合和組合的方法提取狂犬病病毒。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的1、利用截留分子量為750KD或500KD的中空纖維超濾柱或超濾膜將病毒收獲液進(jìn)行濃縮和部分雜質(zhì)去除；2、利用陰離子交換層析或分子篩凝膠層析對步驟1所得樣品進(jìn)行分離提純；3、利用分子篩凝膠層析或陰離子交換層析對步驟2所得樣品進(jìn)行分離提純。利用750KD或500KD中空纖維超濾柱對病毒收獲液進(jìn)行濃縮存在許多優(yōu)點(diǎn)。病毒濃縮速度比傳統(tǒng)的300KD或100KD膜包快，提高了處理效率。單位膜面積相對的處理量增加了許多，批處理量有所增加。從膜截留分子量的選擇看，750KD比300KD雜質(zhì)去除效果要好，并且抗原沒有泄漏。離子交換層析與分子篩凝膠層組合后，生產(chǎn)流程更加合理化，批次穩(wěn)定性好，HCP的去除效率更高，尤其對殘余DNA的去除效果更佳。并且原液制備后抗原含量波動更小，對后續(xù)的成品的配制更加方便。本發(fā)明的創(chuàng)新之處在于，病毒的濃縮采用750KD或500KD截留分子量的中空纖維超濾柱，后期的提取工藝增加了離子交換層析步驟，減輕原有單一層析工藝負(fù)擔(dān)，打破了生產(chǎn)的瓶頸，提高了產(chǎn)品質(zhì)量，在去除殘余DNA、HCP上尤其突出。下面結(jié)合實(shí)施例及附圖進(jìn)一步說明本發(fā)明。圖1是電泳檢測圖譜。圖2是離子交換層析圖譜。圖3是分子篩層析圖譜。圖4是殘余DNA含量檢測圖譜。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。本實(shí)施例僅采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，這些均是本
技術(shù)領(lǐng)域：
人員所熟悉的。或者按照試劑生產(chǎn)商所提供的說明書進(jìn)行。實(shí)施例一1用截留分子量為750KD或500KD的中空纖維超濾柱對病毒收獲液進(jìn)行濃縮和部分雜質(zhì)的去除首先用10mmol/LPBS-0.15MNaCl緩沖液(pH7.6)循環(huán)平衡中空纖維超濾柱IOL。將40L病毒收獲液上樣并濃縮處理，中空纖維超濾柱型號采用UFP-750-E6A，膜面積2800cm2，截留分子量為750000道爾頓。當(dāng)病毒收獲液濃縮至0.4L后，分別取樣病毒濃縮液和過濾液10mL。然后用10mmol/LPBS-0.15MNaCl緩沖液(pH7.6)平衡液流加洗脫8L。將濾過的膜下液每隔0.4L收集一個樣品，同時取病毒濃縮液樣品10mL。將收集組分進(jìn)行蛋白濃度檢測顯示，雜蛋白去除率達(dá)到了60%以上，如表一所示。對病毒濃縮液樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，如圖1所示。雜蛋白分子量主要分布在6.6、9.9、11.6、20.5萬道爾頓四條主帶，與理論存在一定矛盾。本發(fā)明包括的中空纖維超濾柱濃縮病毒和去除部分雜質(zhì)步驟，由于膜板式超濾裝置，截留面積有限，中空纖維超濾是在一支空心柱內(nèi)裝有許多的，中空纖維毛細(xì)管，兩端相通，管的內(nèi)徑一般在lmm左右，有效面積可以達(dá)到1平方厘米，每一根纖維毛細(xì)管像一個微型透析袋，極大地增大了滲透的表面積，提高了超濾的速度。中空纖維超濾步驟中洗脫量太少，則留在濃縮液中的雜蛋白成分會較多，效率損失較大；同時對洗脫量的多少進(jìn)行了優(yōu)化，影響濾液中雜蛋白成分的含量。但有可能需要工序時間延長，配合后續(xù)層析工序合理協(xié)調(diào)它們之間的關(guān)系。中空纖維超濾的壓力降，是指原液進(jìn)口處壓力與濃縮液出口處壓力之差。壓力降與樣品供應(yīng)量，流速及濃縮液排放量有密切關(guān)系。沿著水流方向膜表面的流速及壓力是逐漸變化的。樣品供應(yīng)量，流速及濃縮液排量越大，則壓力降越大，在實(shí)際應(yīng)用中，盡量控制壓力降值范圍，正確的掌握和執(zhí)行操作參數(shù)對超濾系統(tǒng)的長期和穩(wěn)定運(yùn)行是極為重要的，操作參數(shù)一般主要包括流速、壓力、壓力降、濃縮液排放量、回收比和溫度等參數(shù)控制，本方法步驟中均對其進(jìn)行了優(yōu)化選擇。例如步驟1所述經(jīng)過優(yōu)化后的條件，蛋白去除效果達(dá)到了60%以上。表一病毒濃縮過程中間樣品蛋白濃度檢測結(jié)果樣品名稱蛋白濃度病毒濃縮液(未洗脫前)723Pg/mL濃縮過程過濾液579Pg/mL洗脫過程過濾液1425Pg/mL洗脫過程過濾液2928Pg/mL洗脫過程過濾液31398Mg/mL洗脫過程過濾液4168卯g/mL洗脫過程過濾液52003Pg/mL洗脫過程過濾液61944Pg/mL洗脫過程過濾液71722Pg/mL洗脫過程過濾液81132Pg/mL洗脫過程過濾液9洗脫過程過濾液10896Pg/mL洗脫過程過濾液11746)^g/mL洗脫過程過濾液12685Pg/mL洗脫過程過濾液136024g/mL洗脫過程過濾液14532Pg/mL洗脫過程過濾液15489Pg/mL洗脫過程過濾液16402Pg/mL洗脫過程過濾液17320Mg/mL洗脫過程過濾液18304Pg/mL洗脫過程過濾液19295Hg/mL洗脫過程過濾液20280Pg/mL病毒濃縮液(洗脫后)28930Pg/mL還可以使用截留分子量為750KD或500KD的超濾膜對病毒收獲液進(jìn)行濃縮和部分雜質(zhì)的去除。2、用陰離子交換凝膠高載量四價氨基瓊脂糖(QSepHaroseXL)對步驟1所得樣品進(jìn)行提取準(zhǔn)備50X130mmQSepHaroseXL層析柱，柱體積255mL。手動層析系統(tǒng)8823A設(shè)定0.5A，3057設(shè)定2cm/h，200mV。QSepHaroseXL離子交換層析在室溫環(huán)境操作，層析膠第19次使用。用2MNaCl-0.5mol/LNaOH再生30min。用10mmol/LPBS-0.15MNaCl緩沖液(pH7.6)平衡層析柱至pH7.6。層析樣品按照步驟1所述方法制備所得，樣品編號為UF08。樣品上樣60mL，流速20mL/min。上樣結(jié)束后，用1Ommol/LPBS-0.15MNaCl緩沖液(pH7.6)平衡層析柱，收集吸收峰。用10mmol/LPBS-0.25MNaCl緩沖液(pH7.6)洗脫收集吸收峰。用10mmol/LPBS-1.0MNaCl緩沖液(pH7.6)洗脫收集吸收峰。用2MNaCl-0.5mol/LNaOH再生30min。用10mmol/LPBS-0,15MNaCl緩沖液(pH7.6)平衡層析柱至pH7.6。將收集組分按照步驟4、6、8所述方法，分別進(jìn)行蛋白濃度、殘余DNA含量和抗原含量檢測。結(jié)果如表二所示，層析圖譜見圖2，Vero細(xì)胞DNA殘留量檢測圖譜見圖4。離子交換層析(IonExchangeChromatograpHy簡稱為IEC)是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。陰離子交換劑的電荷基團(tuán)帶正電，洗脫液中的離子可以逐步與結(jié)合在離子交換劑上的各種負(fù)電基團(tuán)進(jìn)行交換，而將各種負(fù)電基團(tuán)置換出來，隨洗脫液流出。從而達(dá)到分離目的。本發(fā)明包括的離子交換層析步驟，對離子交換層析進(jìn)行了以下的優(yōu)化選擇，包括離子交換劑的選擇、離子本身的性質(zhì)、緩沖液離子強(qiáng)度的選擇、PH、溫度、溶劑組成，上樣體積等等參數(shù)。并通過通過優(yōu)化選擇后的條件，改變離子強(qiáng)度、pH等改變病毒顆粒與離子交換劑的結(jié)合力而達(dá)到分離的效果。例如步驟2所述經(jīng)過優(yōu)化后的條件之一，HCP去除率達(dá)到了95%以上，抗原回收率達(dá)到了80%以上，殘余DNA去除了99.7%效果十分顯著。表二QSepHaroseXL層析樣品檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>在本步驟中，陰離子交換凝膠還可以選擇高流速四價氨基瓊脂糖(QSepHaroseFF)或高流速二乙基氨基乙基瓊脂糖(DEAESepHaroseFF)對樣品進(jìn)行提取，操作方法與參數(shù)與以上相同。3、用分子篩凝膠4%交聯(lián)度高流速瓊脂糖凝膠過濾(SepHarose4FF)對步驟2所得樣品進(jìn)行提取準(zhǔn)備一根26X700mm層析柱，柱體積130mL。手動層析系統(tǒng)8823A設(shè)定0.5A，3057設(shè)定2cm/h，200mV。層析在室溫環(huán)境操作。按照步驟2所述方法制備樣品Q25-2，用10mmol/LPBS-0.15MNaCl緩沖液(pH7.6)平衡層析柱至pH7.6。將Q25-2樣品上樣60mL，流速8mL/min。上樣結(jié)束后，用10mmol/LPBS-0.15MNaCl緩沖液(pH7.6)平衡層析柱，收集抗原吸收峰。將收集組分按照步驟4、5、6、8所述方法，分別進(jìn)行蛋白濃度、殘余DNA含量、抗原含量(ELISA)和效價檢測(NIH)。結(jié)果如表三所示，層析圖譜見圖3,Vero細(xì)胞DNA殘留量檢測圖譜見圖4。本發(fā)明包括的分子篩凝膠層析步驟中，病毒顆粒最先被洗脫下來，離子交換后樣品蛋白濃度較小時，病毒與雜蛋白可以被分開.但當(dāng)樣品病毒濃縮液蛋白濃度較大時。由于濃度過大使液體粘度增高.擴(kuò)散速度降低，使正常的凝膠柱層析交換規(guī)律受阻，造成液流圖形不規(guī)則，形成了擴(kuò)散較大的區(qū)帶，病毒尚未完全流出凝膠柱。后面的雜蛋白分子已追上來，致使純化效果不佳。本發(fā)明包括采用四柱聯(lián)用方式可以解決此類問題，并且可以實(shí)現(xiàn)分別清洗，提高生產(chǎn)效率，節(jié)約成本。例如步驟3所述經(jīng)過優(yōu)化的條件之一，HCP去除率達(dá)到了35%以上，抗原回收率達(dá)到了94%以上，殘余DNA去除了90X，效果十分顯著。表三SepHarose4FF層析樣品檢測結(jié)果樣品編號體積(mL)蛋白濃度雜蛋白去除率抗原含量抗原回收率殘余DNA含量Q25-260mL466Pg/mL-32.6IU/mL-小于lng/mLGF-4382mL219Mg/mL35.8%22.6IU/mL94.7%小于100pg/mL在本步驟中，分子篩凝膠還可以選擇6%交聯(lián)度高流速瓊脂糖凝膠過濾(SepHarose6FF)對樣品進(jìn)行提取，操作方法與參數(shù)與以上相同。4、效力檢定(ELISA法)利用武漢生物制品研究所的狂犬病效力檢測試劑盒對樣品抗原含量進(jìn)行檢測。將樣品稀釋液用蒸餾水2倍稀釋成工作濃度(并將牛白按0.5—1%加入)。首先將板條各孔加樣品稀釋液(若需要檢測原倍樣品，可不加第一列)，100ul/孔，設(shè)D12為空白對照，將自8備的標(biāo)準(zhǔn)品加入A1孔，100lil/孔，再倍比稀釋(稀釋每孔時應(yīng)換槍頭)，稀釋最后一孔時棄多余的100ul液體。樣品按同意稀釋度稀釋(如一律稀釋2倍)，并做復(fù)孔。將酶標(biāo)板置濕盒內(nèi)，37'C溫育1小時。剩余的板條及試劑請保存于-2(TC備用。將濃縮的洗滌液用蒸餾水30倍稀釋成工作濃度，取出酶標(biāo)板甩干，將洗滌液加滿各孔，傾出，甩干，洗板6次。取酶結(jié)合物加入各孔(空白對照孔不加酶結(jié)合物)，100ul/孔或2滴，置濕盒內(nèi)，37'C溫育0.5小時。取出酶標(biāo)板，傾出液體，甩干，同上法洗板10次。將底物A、B各一滴加入各孔中，置濕盒內(nèi)IO分鐘。將終止液加入各孔，50ul/孔或l滴，終止反應(yīng)?？瞻卓谉o色，而標(biāo)準(zhǔn)品孔顯藍(lán)色，并呈梯度遞減則結(jié)果成立。加終止液后，以空白孔調(diào)零，在酶標(biāo)儀上測定450nm處各孔A值。通過計(jì)算對結(jié)果進(jìn)行分析。將自備標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度相對應(yīng)的國際單位及對應(yīng)A值分別取對數(shù)值，以稀釋度對數(shù)為橫坐標(biāo)，以A值對數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，在圖中找出樣品對應(yīng)的A值對數(shù),其對應(yīng)的橫坐標(biāo)值的反對數(shù)即為該稀釋度樣品的對應(yīng)國際單位值。打開計(jì)算機(jī)，進(jìn)入Microsoft選擇Excel表，輸入數(shù)據(jù)，插入稀釋度，選定A、B兩條，按E鍵頭選其他函數(shù)(F),選L0G10,確定，圈定數(shù)據(jù)，拉相應(yīng)的表格數(shù)，算出L0G10。再選定A、B制圖表選散點(diǎn)圖/完成，點(diǎn)圖上三角點(diǎn)按右鍵，添加趨勢圖/選項(xiàng)/顯示公式(E)，顯示R平均值/確定。將樣品的A值取對數(shù)后帶入標(biāo)準(zhǔn)品的直線方程中進(jìn)行計(jì)算，所得X值即為該稀釋度樣品相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)樣品的稀釋度的對數(shù)值。將該值乘以樣品的稀釋倍數(shù)(若為負(fù)值則先反對數(shù),乘以稀釋倍數(shù)后再取log值)后代入公式計(jì)算出Y值，樣品的國際單位(E-NIH)-(所得Y值X標(biāo)準(zhǔn)品國際單位+從直線方程得出的標(biāo)準(zhǔn)品原倍的A值)X0.9272+0.6105。5、效力測定法(NIH法)首先進(jìn)行攻擊毒株的制備。攻擊毒株(CVS)由國家藥品檢定機(jī)構(gòu)提供。啟開凍干毒種，稀釋成1(T懸液，用體重ll13g小鼠，腦內(nèi)接種0.03mL，連續(xù)傳23代。收腦時應(yīng)選擇45日有典型狂犬病癥狀小鼠。將鼠腦研磨并加入適量含正常馬血清或小牛血清蒸餾水，制成20%懸液，經(jīng)1000r/min沉淀IO分鐘，經(jīng)用體重1820g小鼠10只做病毒滴定及無菌試驗(yàn)，符合要求后，方可做攻擊毒用。分裝小管，-6(TC保存。參考疫苗由國家藥品檢定機(jī)構(gòu)制備、分發(fā)。用待檢疫苗對小鼠進(jìn)行免疫處理。取同批異常毒性試驗(yàn)合格疫苗，用PH7.6、0.07mol/L的PBS做5倍系列稀釋，一般采用三個稀釋度以上進(jìn)行免疫，1:5、1:25、1:125等的稀釋度。同時，參考疫苗作l:25、1:125、1:625等稀釋度，選用體重1214g小鼠，每個稀釋度至少免疫16只，每只腹腔接種0.5mL，間隔l周后再免疫一次，免疫時將疫苗保存于冰浴中，各組小鼠應(yīng)在同樣條件下飼養(yǎng)，并預(yù)留40只同批小鼠作待測攻擊病毒用。用攻擊毒株(CVS)對小鼠進(jìn)行攻擊。在小鼠第1次免疫后14天，用預(yù)先測定每0.03mL含5100LD5(,的病毒量腦內(nèi)攻擊0.03mL/只。病毒測定用1、10—1、10—2、10—3，每稀釋度不少于8只，疫苗免疫組小鼠，每個稀釋度為16只，所有小鼠自攻擊之日起觀察14天。攻擊后最初4日內(nèi)死亡的小鼠不作統(tǒng)計(jì)，第5日后死亡和呈現(xiàn)典型狂犬病癥狀的小鼠進(jìn)行計(jì)算統(tǒng)計(jì)。對結(jié)果進(jìn)行計(jì)算。先測定各免疫組的ED5。值。疫苗效力的計(jì)算按照公式計(jì)算。疫苗效力=(待測疫苗的ED5fl)/(參考疫苗的EDS)X(待測疫苗niL/劑)/(參考疫苗mL/劑)X國家參考疫苗效價(IU)6、樣品蛋白質(zhì)含量測定(Lowery法)采用經(jīng)典的蛋白質(zhì)的含量測定方法Lowery法。蛋白質(zhì)在堿性溶液中可形成銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物，此復(fù)合物加入酚試劑后，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，該藍(lán)色化合物在650nm處的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，根據(jù)供試品的吸光度，計(jì)算供試品的蛋白質(zhì)含量。首先配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的，取蛋白國家標(biāo)準(zhǔn)品一支，用水定量稀釋至每lmL含lmg，作為IC備液。量取貯備液2.5mL置25mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即為每lmL含100Ug的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。然后量取一定體積供試品(含蛋白質(zhì)50Pg左右)置試管內(nèi)。同樣稱取標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、l.OmL分別置于試管中，并包括空白對照。分別加水至lmL,加堿性銅溶液5mL，搖勻，室溫放置10分鐘，快速加入酚試劑0.5mL，搖勻，室溫放置30分鐘，顯色后，波長在650nm處測定吸光度。。以標(biāo)準(zhǔn)曲線的蛋白質(zhì)濃度對應(yīng)其吸光度，求直線回歸方程；將測得供試品的吸光度代入直線回歸方程，即得供試品蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)含量"g/ml)=_測宗結(jié)糶X稀釋倍教取樣量7、非還原性10%SDS-PAGE電泳對雜蛋白分析由于病毒顆粒性質(zhì)關(guān)系，僅能對樣品中雜蛋白分子量進(jìn)行分析。首先制備10%SDS-PAGE分離膠，然后將樣品15000r/min離心10min,取上清液.然后取40"上清液，加入10ul五倍上樣緩沖液后混勻，上樣15ug樣品，當(dāng)樣品在濃縮膠中時，調(diào)節(jié)電壓使電流為10-12mA。當(dāng)溴酚蘭前沿進(jìn)入分離膠后，調(diào)節(jié)電壓使電流20-30mA。繼續(xù)電泳至溴酚蘭前沿接近分離膠底部3-5mm時，將膠放入考馬斯亮蘭染色液中染色30min,經(jīng)過脫色處理后，利用分析軟件進(jìn)行分析處理。8、殘余DNA含量的檢測首先進(jìn)行樣品的DNA提純。將待檢樣品用0.5mL注射用水復(fù)溶。取2^蛋白酶K溶液4.5jli1于每個樣品對應(yīng)的離心管內(nèi)。取10mg/mLRNase酶2pl于每個樣品對應(yīng)的離心管內(nèi)。取Tris-HclEDTA(pH8.0)緩沖液lOpl于每個樣品對應(yīng)的離心管內(nèi)。取12.5%SDS10W于每個樣品對應(yīng)的離心管內(nèi)。取500pl樣品于每個樣品對應(yīng)的離心管內(nèi)，用封口膜封口后將樣品混勻，放在泡沫板上。將樣品放在37'C恒溫水浴鍋水浴1小時。取出樣品將樣品放在5CTC恒溫水浴鍋水浴3小時。取出后加Tris飽和酚500nl，用旋渦混合器混合lmin左右，混勻，放入離心機(jī)中以12500r/min，離心15min。離心后取其上清置入相對應(yīng)的2mL離心管內(nèi)，注意吸取時不要吸取到雜蛋白。取4MLiC150nl于每個樣品對應(yīng)的離心管內(nèi)。取冷無水乙醇lmL于每個樣品對應(yīng)的離心管內(nèi)，用封口膜將管口封好，用手混勻，放在-2(TC冰箱內(nèi)過夜。然后進(jìn)行標(biāo)記探針。取DNA標(biāo)準(zhǔn)品9pl置入0.5mL離心管中，取滅菌注射用水15pl于每個樣品對應(yīng)的離心管內(nèi)，用封口膜封好管口，煮沸10分鐘。取出立即冰浴5分鐘后，從冰浴中取出，放入離心機(jī)中離心。從-2(TC冰箱中取出地高辛引物(DIG匿HighPrime)1#瓶，取地高辛引物(DIG-HighPrime)6^1(使地高辛引物與標(biāo)記探針液混合液比為1:4)置入冰浴后的離心管中，混勻，用封口膜封好口，放在泡沫板上在37'C水浴中過夜。然后探針終止取0.5M(pH8.0)EDTA3ulpl、4MLiC13^1、冷無水乙醇150pl加入標(biāo)準(zhǔn)DNA管中，混勻，用封口膜封好管口，放入-2(TC冰箱中，過夜。將樣品管和探針管放入離心機(jī)中，以12500r/min，離心15min，離心后將樣品和探針上清液小心傾于一廢液缸內(nèi)。在每個離心管中加70%冷乙醇15(^1復(fù)洗，將樣品管和探針管放入離心機(jī)中，12500r/min,離心5min。吸出乙醇，注意留管底白色物質(zhì)，離心帽打開，室溫風(fēng)干一段時間。將DNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋處理。取標(biāo)準(zhǔn)DNA做7個稀釋度，依次由100ng，10ng，lng,100pg，10pg，lpg和O.lpg共7管。根據(jù)DNA標(biāo)準(zhǔn)品的DNA含量在標(biāo)100ng管中加入適量TE稀釋DNA標(biāo)準(zhǔn)品含量至100ng。從100ng管中取5^1液體加入10ng管中，在以下每個稀釋度管中均加45plTE緩沖依次倍比稀釋至0.1pg。將DNA標(biāo)準(zhǔn)品管、探針及樣品管上各扎一孔，放入沸水中煮沸10min。取出，立即冰浴，放入冰箱中。進(jìn)行抽濾、點(diǎn)膜及DNA固定。取出真空泵、點(diǎn)樣板，用螺絲擰緊點(diǎn)樣板，將點(diǎn)樣板左側(cè)用管子連接到真空泵的進(jìn)氣口中，管道中連接一個三角瓶。取一培養(yǎng)皿，放入適量水，將剪好的尼龍膜放入平皿中用水潤濕后，用平頭鑷子夾取尼龍膜放在點(diǎn)樣板上。剪取適當(dāng)大小的封口膜蓋在點(diǎn)樣板上暴露部位，防止漏氣。打開真空泵，將膜吸在點(diǎn)樣板上。取樣品適量點(diǎn)于尼龍膜上，第二排起點(diǎn)樣品，注意要一滴一滴點(diǎn)在尼龍膜上，槍頭接近尼龍膜，但不要接觸尼龍膜。取等體積DNA標(biāo)準(zhǔn)品按濃度從高到低的順序點(diǎn)在尼龍膜上，第一排和最后一排點(diǎn)陽性。用剪刀將尼龍膜左上角剪掉一角，用鉛筆在尼龍膜上標(biāo)記好樣品范圍。用平頭鑷子將尼龍膜夾起放在濾紙中。將尼龍膜放在紫外燈下固定15min。然后進(jìn)行雜交處理。從-2(TC試劑盒中取雜交液7#瓶，(雜交液需在37t:水浴鍋中預(yù)熱5分鐘)倒入燒杯中，向燒杯中加64mL無菌水及一磁力攪拌棒，將燒杯放在磁力攪拌器上攪拌，待溶解后，即為預(yù)雜交液。用吸管取10mL預(yù)雜交液于平皿中，將剪好的尼龍膜放入平皿中，將平皿放入混旋儀中，設(shè)定58'C放置30min。用鑷子取出尼龍膜，將平皿中的預(yù)雜交液倒掉，在平皿中用吸管加入lOmL預(yù)雜交液，將探針液全部加入平皿中，混勻，用鑷子將尼龍膜放入平皿中，將平皿放入旋混儀中，58t:過夜。洗膜處理。另取一新的平皿，加入稀釋好的2XSSC液體適量，將尼龍膜從旋混儀中取出放入盛有2XSSC液體的平皿中，放在脫色搖床上，室溫洗滌5min，將液體倒掉，另加入2XSSC液體于平皿中，再洗5min。將尼龍膜取出放在平皿上，將2XSSC液倒掉，加入配好的0.5XSSC液體將膜放在平皿中，放入旋混儀中，58。C洗滌10min10r/pm，洗滌2次，中間換一次液體。平衡處理。將膜取出，液體倒掉，用已配制好的BufferI潤洗平皿，將BufferI倒入平皿，將膜放入平皿中，放在脫色搖床上，室溫平衡5min。封閉處理。取封閉液6#瓶4000|^1，倒入一容器內(nèi)，加Bufferl至40mL，即二者體積比為1:9。也就是將封閉液作IOX稀釋。將膜取出，液體倒掉，在平皿上加入已稀釋好的封閉液，將膜浸入平皿中，將平皿放在搖床上，用報(bào)紙蓋好，封閉30min。抗體結(jié)合，將膜取出，液體倒掉，取12mL已稀釋好的封閉液加入平皿中，取抗體5pl(抗體應(yīng)為3pl，樣品多可多取些)加入平皿中，混勻，將膜浸入，放在脫色搖床上，蓋張報(bào)紙，室溫一小時。注意V抗體V已稀釋封閉液=1:4。洗膜，另取一平皿，倒入40mLBufferl，取40^1吐溫20加入平皿中，混勻，適量放入平皿中，洗滌兩次，每次15分鐘(V吐溫20:VBufferI=1:1000)。將BufferIII倒入平皿中，將膜浸入，放在搖床上，室溫平衡5min。取出顯色劑5#瓶，取顯色劑45(^1放入平皿內(nèi)，再加12mLBuffer111，混勻，將膜放入平皿中，要輕拿輕放，盡量不要搖動，避光，靜置放12小時。終止顯色。加TE緩沖液終止顯色5分鐘。用鑷子將膜取出，液體倒掉，用滅菌水潤洗平皿，在平皿中倒入適量水，將膜放入平皿中，輕輕洗滌后將水倒掉，將尼龍膜放在濾紙上盡量把水吸干。取出尼龍膜，放入塑料袋中，用封口機(jī)將尼龍膜封在塑料袋內(nèi)，保存。實(shí)施例二1、利用截留分子量為750KD或500KD的超濾膜對病毒收獲液進(jìn)行濃縮和部分雜質(zhì)的去除操作過程與參數(shù)與實(shí)施例一步驟l相同，故略。2、用分子篩凝膠6%交聯(lián)度高流速瓊脂糖凝膠過濾(SepHarose6FF)對步驟1所得樣品進(jìn)行提取準(zhǔn)備實(shí)施例一所說的一根層析柱或?qū)⒃搶游鲋贸伤母?lián)成四聯(lián)柱,則每根層析柱為26X175mm，每根柱體積32.5mL。最好是采用成四根串聯(lián)成四聯(lián)柱。余下操作過程與實(shí)施例一步驟3相同，故略。3、用陰離子交換凝膠高流速四價氨基瓊脂糖(QSepHaroseFF)對步驟2所得樣品進(jìn)行提取操作過程與實(shí)施例一步驟2相同，故略。圖1的附圖標(biāo)記說明M:Marker1:病毒濃縮液(未洗脫前)，2:病毒濃縮液樣品(第1次洗脫)，3:病毒濃縮液樣品(第2次洗脫)，4:病毒濃縮液樣品(第3次洗脫)，5:病毒濃縮液樣品(第5次洗脫)，6:病毒濃縮液樣品(第7次洗脫)，7:病毒濃縮液樣品(第9次洗脫)，8:病毒濃縮液樣品(第10次洗脫)，9:病毒濃縮液樣品(第12次洗脫)，10:病毒濃縮液樣品(第14次洗脫)，11:病毒濃縮液樣品(第16次洗脫)，12:病毒濃縮液樣品(第18次洗脫)，13:病毒濃縮液樣品(第20次洗脫)，14:病毒濃縮液(洗脫后)。權(quán)利要求1.一種提取狂犬病病毒的方法，其特征是(1)、利用截留分子量為750KD或500KD的中空纖維超濾柱或超濾膜將病毒收獲液進(jìn)行濃縮和部分雜質(zhì)去除；(2)、利用陰離子交換層析或分子篩凝膠層析對步驟(1)所得樣品進(jìn)行分離提純；(3)、利用分子篩凝膠層析或陰離子交換層析對步驟(2)所得樣品進(jìn)行分離提純。2、按照權(quán)利要求1所述的提取狂犬病病毒的方法，其特征是在利用陰離子交換層析進(jìn)行分離提純時，離子交換凝膠類型選擇高載量四價氨基瓊脂糖陰離子凝膠、高流速四價氮基瓊脂糖陰離子凝膠或高流速二乙基氨基乙基瓊脂糖陰離子凝膠中的一個。3、按照權(quán)利要求1或2所述的提取狂犬病病毒的方法，其特征是利用分子篩凝膠層析進(jìn)行分離提純時，凝膠類型選擇用分子篩凝膠4%交聯(lián)度高流速瓊脂糖凝膠過濾或6%交聯(lián)度高流速瓊脂糖凝膠過濾。4、按照權(quán)利要求1或2所述的提取狂犬病病毒的方法，其特征是當(dāng)利用分子篩凝膠層析對步驟(l)所得樣品進(jìn)行分離提純時，準(zhǔn)備一根層析柱或?qū)⒃搶游鲋贸伤母?lián)成四聯(lián)柱。5、按照權(quán)利要求3所述的提取狂犬病病毒的方法，其特征是當(dāng)利用分子篩凝膠層析對步驟(l)所得樣品進(jìn)行分離提純時，準(zhǔn)備一根層析柱或?qū)⒃搶游鲋贸伤母?lián)成四聯(lián)柱。全文摘要本發(fā)明提供了一種提取狂犬病病毒的方法，所要解決的問題是狂犬病病毒疫苗的提取采用分子篩凝膠層析單一手段，存在以下缺陷不同批次間質(zhì)量指標(biāo)差異較大；殘余DNA的去除成為難題；殘余宿主蛋白含量過高，臨床表現(xiàn)副作用較大。本發(fā)明的要點(diǎn)是利用截留分子量為750KD或500KD的中空纖維超濾柱或超濾膜將病毒收獲液進(jìn)行濃縮和部分雜質(zhì)去除；利用陰離子交換層析或分子篩凝膠層析對樣品進(jìn)行分離提純；利用分子篩凝膠層析或陰離子交換層析對步驟(2)所得樣品進(jìn)行分離提純。本發(fā)明的特點(diǎn)是具有生產(chǎn)能力大，產(chǎn)品質(zhì)量高，批次穩(wěn)定性好，對殘余DNA、HCP去除表現(xiàn)尤為突出，減少了疫苗的安全隱患。文檔編號C12R1/93GK101270350SQ20081001053公開日2008年9月24日申請日期2008年3月5日優(yōu)先權(quán)日2008年3月5日發(fā)明者偉劉,譯張,靜徐,偉李,艷李,胡金東申請人:遼寧依生生物制藥有限公司