專利名稱：：利用微生物發(fā)酵生產Ectoine的方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵
技術領域：
，涉及利用微生物發(fā)酵生產Ectoine的方法。
背景技術：
：1985年Galinski在嗜鹽菌細胞中發(fā)現了補償性溶質Ectoine，即1，4,5,6-四氫-2國甲基國4-嘧啶羧酸(1，4，5,6-tetrahydro隱2-methyl曙4曙pyrimidinecarboxylicacid)。此后的研究發(fā)現，Ectoine作為主要的補償性溶質在中度嗜鹽菌中普遍存在。Ectoine能夠在高溫、冷凍和干燥等逆環(huán)境下，對酶、DNA、細胞膜和整個細胞提供保護作用。因此，Ectoine在化妝品、生物制劑、酶制劑和制藥等領域具有很大的應用價值和廣泛的應用前景。過去十幾年間，高效生產Ectoine的工藝研究，首先是解決細胞的高密度培養(yǎng)，第一個用于批量生產的技術是Ectoine的"細菌擠奶"工藝(BacterialMilking:Anovelbioprocessforproductionofcompatiblesolutes.Biotechnol.Bioeng.,57，306-313,1998)。//a/omo"ase/o"gatoDSM142丁在較高鹽濃度(1.5mol/L)誘導下細胞合成Ectoine，經過分批流加的高密度發(fā)酵后，收集細胞，通過低滲脅迫使細胞迅速釋放胞內Ectoine(約釋放總合成量的64%)，隨后，細胞再在含有較高鹽濃度的培養(yǎng)基中生長，重新誘導合成胞內Ectoine,再行低滲透壓釋放，這種滲透壓脅迫過程重復循環(huán)。一個完整的(含9個循環(huán)的)細菌擠奶工藝，Ectoine發(fā)酵產率約為3.3g/L/d。還有利用firev^acfen.wwep^ew^DSM20659菌株在較高鹽濃度(l.Omol/L)下通過分批流加進行高密度培養(yǎng)后，收集細胞，通過低滲脅迫釋放和酒精抽提胞內Ectoine相結合的方法收集Ectoine，收集胞內Ectoine后的細胞不能再重復用于發(fā)酵。Ectoine發(fā)酵產率為2g/L/d(Optimizationofectoinesynthesisthroughfed-batchfermentationof5rev/6""er/wwep/c/erw/s.Biotechnol.Prog"21，1206-1212,2005)。上述工藝的特點是，菌株合成的Ectoine均存在于細胞內，它們不分泌Ectoine，發(fā)酵培養(yǎng)基中不積累Ectoine。當細胞內Ectoine積累量達到一定濃度時，其合成便受到抑制，即Ectoine的合成量受胞內Ectoine濃度閥值的限制。因此人們試圖尋找使胞內Ectoine分泌至細胞外的方法。Grammann等在/fe/omo"ase/o"gatoDSM2581T(凡e/o"gatoDSM2581T)中首次發(fā)現了一種新型的Ectoine特異性吸收系統(tǒng)TeaABC，該系統(tǒng)能夠回收細胞輸出和/或泄露至細胞周質或培養(yǎng)基中的Ectoine，包括向培養(yǎng)基中添加的Ectoine。Ectoine通過這種輸出/吸收循環(huán)，調節(jié)細胞Ectoine的合成，達到并維持胞內的Ectoine濃度閾值，因此，在培養(yǎng)基中不積累Ectoine。而TeaABC缺陷的i/.e/o"取toDSM258lT菌株，則向培養(yǎng)基屮分泌Ectoine，從而達到Ectoine的超量(超過胞內的Ectoine濃度閾值)合成的目的(AnewtypeofosmoregulatedsolutetransporteridentifiedinhalophilicmembersoftheBacteriadomain:TRAP畫transporterTeaABCmediatestheuptakeofectoineandhydroxyectoineinTfa/omomwe/o"gafaDSM2581T,J.Bacteriol.,184,3078-3085,2002)。利用這種TeaABC缺陷菌株經高密度發(fā)酵制備Ectoine,培養(yǎng)基中積累的Ectoine發(fā)酵產率約為2.1g/L/d(德國，DE10114189,2002年9月26日)。這項研究雖然解決了Ectoine分泌的問題，但是因為細胞生長緩慢、培養(yǎng)時間較長，約90小時達到生長的最高OD值，而且Ectoine的總合成量低，所以Ectoine發(fā)酵產率與非分泌菌株的"細菌擠奶技術"相比并沒有得到明顯改善。另外Schubert等人構建的合成并分泌Ectoine的基因工程大腸桿菌，Ectoine發(fā)酵產率為0.8g/L/d(Continuoussynthesisandexcretionofcompatiblesoluteectoinebyatransgenic,nonhalophilicbacterium.,Appl.Environ.Microbiol"73,3343-3347,2007)，除Ectoine發(fā)酵產率較低外，基因工程大腸桿菌培養(yǎng)基中的啟動轉錄誘導物價格口蟲卬貝0現有技術中的Ectoine發(fā)酵方法的共同缺點是細胞生長緩慢，并且Ectoine合成量低。通過髙密度發(fā)酵，盡管可以達到較高的細胞密度，然而由于細胞生長緩慢和合成量低，發(fā)酵產率仍然無法顯著提高。本發(fā)明的發(fā)明人嘗試通過控制代謝流來提高細胞的生長速率和Ectoine合成量，并促進Ectoine分泌，以解決上述現有技術中存在的問題。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供一種微生物發(fā)酵生產Ectoine的方法，相比于現有技術，該方法能提高Ectoine的發(fā)酵產率，并提高Ectoine總合成量中分泌Ectoine所占比例。本發(fā)明的技術方案是將鹽單胞菌屬(Halomonas)細菌在以谷氨酸單鈉為唯一碳氮源，并且NaCl濃度15120g/L的液體培養(yǎng)基中發(fā)酵，誘導其合成并分泌Ectoine，然后從發(fā)酵體系中回收Ectoine;其中所述的鹽單胞菌屬(Halomonas)細菌是//a/o附o""sa//"aDSM5928(//^//"aDSM5928)，i/a/omowosve"組aDSM4743(i/.ve"wstoDSM4743)，T^/owowos/jfl/ocfemYr折ca朋DSM735(H/wr/o(iew",c<msDSM735)，i/a/omoMoyvewtoraeDSM15911DSM15911)，ifo/o附owospac折cflDSM4742pac訴caDSM4742)或W"/omowosa//we"/07^aDSM15356a/z.wewfaWaDSM15356)。此技術方案的提出基于發(fā)明人在對鹽單胞菌屬(Halomonas)細菌的研究過程中的發(fā)現，B卩在一定條件下，該屬的一些菌株將合成的Ectoine部分分泌至胞外培養(yǎng)基中，這是首次發(fā)現的野生型菌株分泌Ectoine的現象。其中尤以DSM5928能夠大量合成和分泌Ectoine。因此，本發(fā)明的技術方案優(yōu)選將//.^//""DSM5928在以谷氨酸單鈉為唯一碳氮源，并且NaCl濃度15120g/L的液體培養(yǎng)基中發(fā)酵，誘導其合成并分泌Ectoine，然后從發(fā)酵液中回收Ectoine。研究同時還發(fā)現培養(yǎng)基碳源種類對Esa//""DSM5928的生長和Ectoine的合成量有非常大的影響。使用現有技術中常用于Ectoine誘導合成的培養(yǎng)基，如葡萄糖為碳源、硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基(Osmoregulationinfocfer/c/z/flco//byaccumulationoforganicosmolytes:betaines,glutamicacid,andtrehalose.,Arch.Microbiol"147,1-7,1987;BacterialMilking:Anovelbioprocessforproductionofcompatiblesolutes,Biotechnol.Bioeng.，57，306-313,1998)，或者以蛋白胨和酵母臂為主要成分的培養(yǎng)基(SupplementationeffectsofhydroxyectoineonprolineuptakeofdownshockedBreW6acte/7'謂sp.JCM6894.,J.Biosci.Bioeng.，101,178-184,2006)，if.^//waDSM5928生長緩慢，Ectoine合成量也不高，發(fā)酵產率《2.0g/L/d(6L發(fā)酵罐數據)，而且合成的Ectoine僅在細胞內積累，培養(yǎng)基中沒有Ectoine。卜.述本發(fā)明的生產方法中，促進H^/f"flDSM5928旺盛生長、大量合成并分泌Ectoine的重要條件是所使用的培養(yǎng)基，其基本特征之一是以谷氨酸單鈉為唯一的碳氮源。谷氨酸促進細胞生長和Ectoine合成并分泌的原因，可能與谷氨酸強化Ectoine的合成流和三羧酸循環(huán)、促進了/f.sa//""DSM5928在鹽脅迫下的生長代謝有關。Ectoine的合成途徑是草酰乙酸經過天冬氨酸、天冬氨酸-P-磷酸、天冬氨酸-(3-半醛、L-2，4-二氨基丁酸、Ny-乙酰二氨基丁酸，最后轉變?yōu)镋ctoine。Ectoine的合成由來自三羧酸循環(huán)的草酰乙酸起始，而谷氨酸通過脫氨基生成(x-酮戊二酸后直接進入三羧酸循環(huán)，然后經過若干步驟轉化為草酰乙酸，谷氨酸為合成天冬氨酸提供了底物草酰乙酸。草酰乙酸轉變?yōu)樘於彼嵋约皬奶於彼?卩-半醛轉變?yōu)長-2，4-二氨基丁酸的反應，均是需要谷氨酸脫氨提供氨基的反應。可見，谷氨酸對Ectoine的合成流中的原料天冬氨酸的供應具有推動作用，另外在Ectoine合成流中的分支點處(天冬氨酸-p-半醛是進一步合成Ectoine、賴氨酸、通過高絲氨酸進一步合成蘇氨酸和蛋氨酸等的共同底物)，谷氨酸對天冬氨酸-P-半醛向Ectoine支路合成具有拉動作用。結果，谷氨酸通過對三羧酸循環(huán)和Ectoine合成流的強化，促進Ectoine的合成，導致細胞在鹽的誘導下生長速度快、代謝旺盛，Ectoine合成量顯著超過其胞內濃度閾值，而超過其濃度閾值的部分，被分泌至細胞外，解除了胞內Ectoine濃度閾值對Ectoine合成的限制作用。經過優(yōu)化，本發(fā)明屮所述的生產方法屮述及的培養(yǎng)基屮谷氨酸單鈉濃度優(yōu)選3080g/L，更優(yōu)選6080g/L。本發(fā)明的技術方案中，培養(yǎng)基屮不使用酵母膏等含有滲透壓補償性溶質組分，而現有技術屮，鹽單胞菌屬(Halomonas)細菌在高鹽度環(huán)境下誘導Ectoine合成時，為了使菌體較好生長，通常采取外源性補給滲透壓補償溶質的做法。發(fā)明人為此特別考察了酵母膏對Ectoine分泌的影響，但發(fā)現添加酵母膏等不利于Ectoine的合成和分泌，Ectoine的總合成量和分泌量均隨酵母膏的濃度增加而減少(實施例3)。因此，本發(fā)明培養(yǎng)基屮不添加外源性滲透壓補償溶質。另一方面，發(fā)明人還考察了NaCl濃度對Ectoine分泌量的影響，發(fā)現菌株HDSM5928的胞內Ectoine濃度閾值隨鹽濃度的升高而升高，而Ectoine的分泌量則隨NaCl濃度的降低而增加，較低的鹽濃度有利于Ectoine的分泌(實施例4)。然而當NaCl濃度低于15g/L時菌體生長不良?；诖?，上述本發(fā)明的微生物發(fā)酵生產Ectoine的方法中，所述培養(yǎng)基中NaCl濃度優(yōu)選2060g/L，最優(yōu)選2030g/L。盡管對培養(yǎng)基中的其他小量/微量組分的選定可以參考現有技術中的技術方案，如參考文獻"Optimizationofectoinesynthesisthroughfed-batchfermentationof5rev/^ctenwwe/^ew^.Biotechnol.Prog.,21,1206-1212,2005"中所描述的內容，本發(fā)明還是對培養(yǎng)基中小量及微量組分進行了優(yōu)化，除了上文所述的培養(yǎng)基中提及組分L-谷氨酸單鈉和NaCl，其他加入的組分優(yōu)選是KH2P042.53.5g/L，K2HP04810g/L,MgS04.7H200.30.5g/L及MnS044H200.01g/L;培養(yǎng)基優(yōu)選去離子水配制，pH7.2。上述培養(yǎng)基中添加組分的更優(yōu)選的添加量分別是KH2P043g/L，K2HP049g/L，MgS04'7H200.4g/L，MnS044H200.01g/L，NaCl2030g/L。對上文所述各種培養(yǎng)基,最為優(yōu)選的是:L-谷氨酸單鈉6080g/L，KH2P043g/L，K2HP049g/L，MgS04.7H200.4g/L，MnS04.4H200.01g/L，NaCl2030g/L，pH7.2。對于發(fā)酵培養(yǎng)的其他條件，比如接種量、培養(yǎng)溫度、壓力等，本領域的技術人員可以參考現有技術中對鹽單胞菌屬(Halomonas)細菌的培養(yǎng)方法選擇，較為優(yōu)選的此類培養(yǎng)條件也可以通過有限次數的實驗考察得之，此非本發(fā)明的主要發(fā)明點所在，本說明書不再贅述。上述本發(fā)明的利用微生物發(fā)酵生產Ectoine的方法選用具有Ectoine分泌特性的H^"""DSM5"S菌株，采用以谷氨酸單鈉為唯一碳氮源的培養(yǎng)基，并選用較低的NaCl濃度進行發(fā)酵，使Ectoine發(fā)酵產率達到了6.47.9g/L/d，是現有技術的2.12.4倍；所產生的Ectoine大部分分泌到培養(yǎng)基中，生產者既可以選擇從培養(yǎng)體系高效率地回收Ectoine，也可以選擇從培養(yǎng)基中回收Ectoine,當然后者更為推薦，因其不僅簡化了產物回收工序，還可以實現菌體的連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)；此外，培養(yǎng)基中NaCl濃度比現有技術降低了l/22/3，大大降低了培養(yǎng)基鹽濃度，能夠減輕設備腐蝕，并有利于降低下游加工成本。本發(fā)明附圖3幅，圖1是不同添加量的酵母膏對Esa//""DSM5928合成及分泌Ectoine的影響(實施例3);圖2是不同濃度的NaCl對//.sa/z'"aDSM5928合成及分泌Ectoine的影響(實施例4);圖3是實施例5發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中，/f.^//w"DSM5928合成及分泌Ectoine的情況。具體實施例方式以下通過實施例的方式對木發(fā)明的內容做進一步的說明。如無特殊說明，采用下述產物測定的方法(1)細胞內Ectoine濃度測定取發(fā)酵液1mL，4°C，12000rpm離心15分鐘，NaCl-KpiBuffer(100mmol/L，pH7.2，NaC160g/L)洗滌(4°C，12000rpm離心15分鐘)，棄上清液，離心沉淀中加入lmL80。/。乙醇，懸浮，室溫靜置過夜4。C，12000rpm離心15分鐘，取上清液用于高效液相色譜(HPLC)領!j定。HPLC觀!j定參照文獻(AccumulationofectoineinthehalotolerantBreW^cfeWwwsp.JCM6894.，J.Biosci.Bioeng"91，288-293,2001)進行。(2)發(fā)酵液中Ectoine濃度測定取發(fā)酵液1mL，4°C，12000rpm離心15分鐘，取上清液，去離子水稀釋10倍后用于HPLC測定。HPLC測定同(1)。由于本發(fā)明中第一次發(fā)現野生型菌株分泌Ectoine的現象，因此還使用色質譜聯(lián)用(LC-MS及核磁共振(NMR)對分泌產物進行了分子量和結構鑒定，具體方法為(3)分泌Ectoine的)LC-MS鑒定取對數生長期的發(fā)酵液4。C下，12000rpm離心15分鐘，取上清液，加入99.5%乙醇(發(fā)酵液乙醇=1:9)，4°C下靜置30分鐘，使發(fā)酵液中殘留的谷氨酸單鈉結晶析出，取其上清液用于LC-MS測定。LC-MS分析使用HPLC(Waters2695separationmodule)和質譜儀(QuattroMicroWaters公司，美國)。HPLC條件色譜柱XterraMSC18，5pm(2.1xlSomm)，流動相為甲醇水溶液(甲醇水=4:1)，柱溫35。C，流速0.2mL/min，紫外檢測器，檢測波長210nm。質譜條件電噴霧電離，電離方式ES+，源溫度120。C，檢測器Waters2996photodiodearraydetector。單級質譜和串聯(lián)質譜電離電壓分別為25V和20V。(4)分泌Ectoine的NMR鑒定取對數生長期的發(fā)酵液20mL，4°C，12000rpm離心15分鐘，取上清液，加入99.5%乙醇(發(fā)酵液乙醇=1:9)，4。C下靜置30分鐘，使發(fā)酵液中殘留的谷氨酸單鈉結晶析出，取其上清液3(TC減壓蒸發(fā)至結晶，加入0.5mLD2O溶解，供NMR分析使用。NMR測定在核磁共振儀(VarianINOVA400MNMR,Varian公司，美國)上進行，四甲基硅烷(TMS)為內標物，400MHz下記錄&-核磁共振。H-NMR)波譜。測定樣品與Ectoine標準品同時進行^-NMR的測定。本發(fā)明實施例所使用的菌種均購自德國DSMZ公司(GermanCollectionofMicroorganismsandCellCultures)。Ectoine標準品購自德國Biomol公司。菌種保存方法菌株在裝有5mL本發(fā)明所述培養(yǎng)基的試管中3(TC、搖床(120rpm)培養(yǎng)24小時后，取菌液0.5mL與0.5mL60%滅菌甘油混合，裝入菌種凍存管中，-S(TC低溫冷凍保存。實施例l菌株Hra/z'朋DSM5928;培養(yǎng)基L-谷氨酸單鈉30g/L，KH2P043g/L，K2HP049g/L,MgS04'7H200.4g/L，MnS04'4H200.01g/L，NaCl60g/L，pH7.2,0.2過濾滅菌；培養(yǎng)方法菌株在裝有5mL上述培養(yǎng)基的試管中30°C、搖床(120rpm)培養(yǎng)24小時后，按1%(體積)接菌量轉接至中30mL的上述培養(yǎng)基中(300mL三角瓶)，30°C、搖床120rpm培養(yǎng)，36小時取樣測定胞內外Ectoine濃度；結果經分子量和結構鑒定及分析，培養(yǎng)基中有分泌的Ectoine;細胞內Ectoine濃度為0.56g/L，培養(yǎng)基中Ectoine濃度為0.68g/L，分泌率55%。實施例2菌株鹽單胞菌屬(Halomonas)其他幾種微生物，見表1;培養(yǎng)基條件及培養(yǎng)方法如實施例l;實驗結果如表l示表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(續(xù)表l)菌株Ectoine濃度(mg/L)Ectoine分泌率胞外胞內(%)^pac訴cflDSM4742115.6±4.6126.6±5.851.6±2.2//^//附e咖n'"DSM1535695.1±1.4103.4±3.147.9±0.4//:e/o，,aDSM2581T0601.2±9.30F-附a"力aDSM47410283.6±6.10由表1結果可見，在同樣的培養(yǎng)條件下，并非所有的Ectoine合成菌株都能分泌Ectoine。實施例3本實施例考察添加酵母膏對H>$"http://aDSM5928合成及分泌Ectoine的影響。本實施例在實施例1基礎上，向培養(yǎng)基中添加010g/L的酵母膏，并按照實施例1的培養(yǎng)條件進行Ectoine誘導合成，并測定Ectoine總合成量(胞內Ectoine量與分泌Ectoine量之和)和分泌量，結果見附圖1所示?？梢奅ctoine的總合成量和分泌量均隨酵母膏的濃度增加而減少，特別是當酵母膏濃度達到10g/L時，i/.DSM5928僅分泌微量的Ectoine。實施例4菌株//.ra/z'""DSM5928;培養(yǎng)基除NaCl濃度分別設定為30、60、90及120g/L外，其余與實施例1相同；培養(yǎng)方法同實施例1;結果如附圖2所示，其中，Ectoine分泌量和細胞內Ectoine量以每克干細胞的Ectoine的毫克數計算；由附圖2可見，細胞內Ectoine量隨NaCl濃度的增加而增加，而Ectoine分泌量卻隨NaCl濃度的降低而增加。30g/LNaCl濃度下Ectoine分泌量最高為196.4mg/g，分泌率為80.1%;當NaCl濃度升高至120g/L時，Ectoine分泌量降低為31.6mg/g，分泌率降低為13.2%;需要注意的是，本發(fā)酵條件下，NaCl濃度《15g/L時，細胞生長不良，Ectoine合成量顯著降低。實施例5菌株if.sa/Z""DSM5928;培養(yǎng)基L-谷氨酸單鈉60g/L，KH2P043g/L，K2HP049g/L,MgS04'7H200.4g/L，MnS04-4H200.01g/L，NaCl30g/L，pH7.2，121°C、15分鐘滅菌；培養(yǎng)方法發(fā)酵罐培養(yǎng)，反應器10L，裝6L的培養(yǎng)基；最大通風量為10L/min，最大轉速1000rpm，保持溶解氧水平在30%以上，用極性氧分壓電極檢測。玻璃pH電極檢測并控制添加6MHC1，維持pH7.2;添加消泡劑(泡敵，中國旅順化工廠)0.015%避免起泡；發(fā)酵罐中接種300mL//.sa/z'"aDSM5928培養(yǎng)液(500mL三角瓶，30°C、搖床120rpm.培養(yǎng)24小時的培養(yǎng)液)；培養(yǎng)過程定時取發(fā)酵液，按實施例1的方法測定分泌Ectoine濃度和細胞內Ectoine濃度，結果見附圖3。由附圖3可見，在細胞生長的對數生長期和平衡期中，Ectoine的合成量和分泌量均隨發(fā)酵時間的延長而增加，其最大值呈現在平衡期的末期(21小時)，最大分泌量為4.3g/L，最大總合成量為6.9g/L，Ectoine合成體積效率為7.9g/L/d。實施例6菌株Hra/z'"aDSM5928;培養(yǎng)基L-谷氨酸單鈉80g/L，KH2P043g/L，K2HP049g/L，MgS04'7H200.4g/L，MnS04'4H200.01g/L，NaCl30g/L，pH7.2，121°C、15分鐘滅菌；培養(yǎng)方法同實施例5;結果平衡期末期(27小時)時測定，最大分泌量為5.4g/L，最大總合成量為7.2g/L，Ectoine合成體積效率為6.4g/L/d。權利要求1、一種利用微生物發(fā)酵生產Ectoine的方法，是將鹽單胞菌屬(Halomonas)細菌在以谷氨酸單鈉為唯一碳氮源，并且NaCl濃度15～120g/L的液體培養(yǎng)基中發(fā)酵，誘導其合成并分泌Ectoine，然后從發(fā)酵體系中回收Ectoine；其中所述的鹽單胞菌屬(Halomonas)細菌是HalomonassalinaDSM5928，HalomonasvenustaDSM4743，HalomonashalodenitrificansDSM735，HalomonasventosaeDSM15911，HalomonaspacififcaDSM4742或HalomonasalimentariaDSM15356。2、根據權利要求1所述的利用微生物發(fā)酵生產Ectoine的方法，其特征在于所述的鹽單胞菌屬(Halomonas)細菌是DSM5928。3、根據權利要求1或2所述的利用微生物發(fā)酵生產Ectoine的方法，其特征在于所述的谷氨酸單鈉濃度為3080g/L。4、根據權利要求3所述的利用微生物發(fā)酵生產Ectoine的方法，其特征在于所述的谷氨酸單鈉濃度為6080g/L。5、根據權利要求1、2或4中任一權利要求所述的利用微生物發(fā)酵生產Ectoine的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基中NaCl濃度為2060g/L。6、根據權利要求5所述的利用微生物發(fā)酵生產Ectoine的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基中NaCl濃度為2030g/L。7、根據權利要求1或2所述的利用微生物發(fā)酵生產Ectoine的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基為L-谷氨酸單鈉3080g/L，KH2P042.53.5g/L，K2HP04810g/L，MgS07H200.30.5g/L，MnS04.4H200.01g/L，NaCl20120g/L，去離子水配制，pH7.2。8、根據權利要求7所述的利用微生物發(fā)酵生產Ectoine的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基為L-谷氨酸單鈉6080g/L，KH2P043g/L，K2HP049g/L，MgS04'7H200.4g/L，MnS04'4H200.01g/L，NaCl2030g/L，去離子水配制，pH7.2。全文摘要一種利用微生物發(fā)酵生產Ectoine的方法，屬于微生物發(fā)酵工程領域。該方法是將鹽單胞菌屬(Halomonas)一些具有Ectoine分泌特性的菌株在以谷氨酸單鈉為唯一碳氮源，并且NaCl濃度15～120g/L的液體培養(yǎng)基中發(fā)酵，誘導其合成并分泌Ectoine，然后從發(fā)酵體系中回收Ectoine。上述方法使Ectoine發(fā)酵產率達到了6.4～7.9g/L/d，是現有技術的2.1～2.4倍，并且產物大部分分泌至培養(yǎng)基中，簡化了產物回收工序，有利于實現連續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)基NaCl濃度比現有技術降低了1/2～2/3，有利于減輕設備腐蝕，并降低下游加工成本。文檔編號C12P17/12GK101314785SQ20081001246公開日2008年12月3日申請日期2008年7月22日優(yōu)先權日2008年7月22日發(fā)明者張苓花,郎亞軍申請人:大連海事大學