專利名稱：人卵母細(xì)胞序列玻璃化冷凍液和融解液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物學(xué)中的細(xì)胞保存領(lǐng)域，具體地說是一種人卵母細(xì)胞序列玻 璃化冷凍液和融解液。
背景技術(shù)：
玻璃化冷凍技術(shù)是生物學(xué)領(lǐng)域中針對(duì)各種卵細(xì)胞及胚胎的保藏技術(shù)。人卵 母細(xì)胞的玻璃化冷凍保存是建立人類卵子庫，為廣大不孕患者解決生育力保存 的重要技術(shù)手段?，F(xiàn)有技術(shù)中應(yīng)用于人卵細(xì)胞的玻璃化冷凍液和融解液雖然有 許多種，但是還沒有一種獲得大家的公認(rèn)，可以得到穩(wěn)定的很好的復(fù)蘇效果。如，在冷凍液中常用到1.2-丙二醇(PROH)和乙烯乙二醇(EG)為保護(hù)劑，而 其濃度高達(dá)15%。這類冷凍液主要存在以下不足 一、高濃度導(dǎo)致了較高的毒 性，對(duì)卵母細(xì)胞冷凍復(fù)蘇后應(yīng)用于人類生殖目的的安全性造成了威脅；二、卵 母細(xì)胞冷凍復(fù)蘇后獲得的胚胎的質(zhì)量下降，不能獲得令人滿意的臨床妊娠率。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種毒性低、保藏效 果好的人卵母細(xì)胞序列玻璃化冷凍液和融解液。本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)是按以下方式實(shí)現(xiàn)的人卵母細(xì)胞序列玻璃化冷凍液和 融解液，其特點(diǎn)是，基礎(chǔ)液在含有HEPES的人輸卵管液(mHTF)中添加10%人血蛋白； 冷凍液一基礎(chǔ)液中添加10%Ficoll 70和6.5mol/L蔗糖； 冷凍液二基礎(chǔ)液中添加10%Ficoll 70、 6.5mol/L蔗糖、10%乙二醇和 7.5mol/L二甲亞砜；融解液一基礎(chǔ)液中添加1.0mol/L蔗糖； 融解液二基礎(chǔ)液中添加0.6mol/L蔗糖； 融解液三基礎(chǔ)液中添加0.3mol/L蔗糖；融解液四基礎(chǔ)液中添加0.15mol/L蔗糖。本發(fā)明的人卵母細(xì)胞序列玻璃化冷凍液和融解液與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下突出的有益效果(1) 通過添加Ficoll 70，降低了乙二醇和二甲亞砜的濃度，也就是大 大減少了冷凍液的毒性；(2) 能夠保證冷凍復(fù)蘇效果，即獲得良好的復(fù)蘇成活率，獲得具有良 好發(fā)育潛能的胚胎，更適用于建立人卵子庫，并將復(fù)蘇后卵母細(xì) 胞應(yīng)用于患者妊娠之用；(3) 融解液采取低濃度、多次替換，可以逐漸將高濃度的冷凍保護(hù)劑 逐級(jí)替換出來，避免卵母細(xì)胞在較大濃度梯度的液體轉(zhuǎn)換中，細(xì) 胞質(zhì)水份的過度變化造成細(xì)胞的死亡，從而提高復(fù)蘇后細(xì)胞的成 活率和發(fā)育潛能。
具體實(shí)施方式
參照以下具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的人卵母細(xì)胞序列玻璃化冷凍液和融解液作 詳細(xì)地說明，但不以任何形式限制本發(fā)明。 實(shí)施例(一)冷凍液和融解液的配制 基礎(chǔ)液在100ml含有HEPES的人輸卵管液中添加10 ml人血蛋白；冷凍液一在9 ml基礎(chǔ)液中添加1 ml Ficoll 70和0.065mol蔗糖冷凍液二在8 ml基礎(chǔ)液中添加1 ml Ficoll 70、0.065mol蔗糖、1 ml乙二醇和0.075mol 二甲亞砜；融解液一在10 ml基礎(chǔ)液中添加0.01 mol蔗糖； 融解液二在10 ml基礎(chǔ)液中添加0.006 mol蔗糖； 融解液三在10 ml基礎(chǔ)液中添加0.003 mol蔗糖；融解液四在10 ml基礎(chǔ)液中添加0.0015 mol蔗糖。 (二)冷凍液和融解液的使用方法冷凍時(shí)，將待冷凍保存的卵母細(xì)胞首先放入基礎(chǔ)液中平衡5min，再入冷凍 液一3min;再入冷凍液二，馬上用Cryoloop (市售的用于玻璃化冷凍的承載器 具，開放式)沾取體積不超過luL的冷凍液二，在Cryoloop的環(huán)上形成一個(gè)薄 膜，后將卵母細(xì)胞點(diǎn)在薄膜上，時(shí)間約20 30s，卵母細(xì)胞不超過3個(gè)，隨后投 入液氮中保存。融解時(shí)，將Cryoloop拿出液氮后，直接將其放入融解液一，其上所帶的卵 母細(xì)胞馬上會(huì)沉入融解液中，再逐次轉(zhuǎn)入融解液二、三、四，時(shí)間各30 60S。 最后轉(zhuǎn)入普通卵母細(xì)胞培養(yǎng)液備用進(jìn)行體外受精。融解過程完成。發(fā)明人利用上述冷凍液及融解液將197個(gè)人卵母細(xì)胞玻璃化冷凍保藏1 6 個(gè)月后融解，共存活169個(gè)(85.8%)，受精122個(gè)(72.2%)，卵裂72個(gè)(59.0 %)，獲得優(yōu)質(zhì)胚胎41個(gè)(33.6%)，移植6例，其中4例為自身卵母細(xì)胞移植， 2例為卵巢早衰患者接受供卵移植。平均移植胚胎數(shù)2.5士0.6個(gè)，共獲得臨床妊 娠2例(33.3%)。各項(xiàng)指標(biāo)均令人滿意，證明本發(fā)明的冷凍液和融解液具有良 好的冷凍復(fù)蘇效果。
權(quán)利要求
1、人卵母細(xì)胞序列玻璃化冷凍液和融解液，其特征在于，基礎(chǔ)液在含有HEPES的人輸卵管液中添加10％人血蛋白；冷凍液一基礎(chǔ)液中添加10％Ficoll 70和6.5mol/L蔗糖；冷凍液二基礎(chǔ)液中添加10％Ficoll 70、6.5mol/L蔗糖、10％乙二醇和7.5mol/L二甲亞砜；融解液一基礎(chǔ)液中添加1.0mol/L蔗糖；融解液二基礎(chǔ)液中添加0.6mol/L蔗糖；融解液三基礎(chǔ)液中添加0.3mol/L蔗糖；融解液四基礎(chǔ)液中添加0.15mol/L蔗糖。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人卵母細(xì)胞序列玻璃化冷凍液和融解液，屬于生物學(xué)中的細(xì)胞保存領(lǐng)域。以含有HEPES及人血蛋白的人輸卵管液為基礎(chǔ)液，以低濃度的Ficoll 70、蔗糖、乙二醇和二甲亞砜為保護(hù)劑。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的人卵母細(xì)胞序列玻璃化冷凍液和融解液具有毒性低、保藏效果好等特點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于人類卵母細(xì)胞的玻璃化保藏之中。
文檔編號(hào)C12N5/08GK101215548SQ20081001378
公開日2008年7月9日 申請(qǐng)日期2008年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月15日
發(fā)明者媛 李, 趙躍然, 陳子江 申請(qǐng)人:山東省立醫(yī)院