專利名稱：：淋巴囊腫病毒的實(shí)時定量pcr檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明是屬于淋巴囊腫病毒的檢測技術(shù)，是一種采用熒光探針或SYBRGREENI熒光染料的實(shí)時定量PCR技術(shù)的檢測方法——淋巴囊腫病毒的實(shí)時定量PCR檢測方法。技術(shù)背景淋巴囊腫病毒(Lymphocystisdiseasevirus,LCDV)屬于虹彩病毒科，淋巴囊腫病毒屬，可感染9目34科計140種以上魚類，對魚類危害嚴(yán)重，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的損失，同時嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)魚類的進(jìn)出口貿(mào)易。淋巴囊腫病毒被世界動物衛(wèi)生組織(O正)、世界糧農(nóng)組織亞太水產(chǎn)病害網(wǎng)絡(luò)(NACA)和各個國家列入水生動物病害檢疫名錄，因此，迫切需要建立快速、靈敏、準(zhǔn)確的淋巴囊腫病毒的檢測方法。目前檢測淋巴囊腫病毒的方法包括細(xì)胞學(xué)技術(shù)、免疫學(xué)診斷技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)三大類-1.細(xì)胞學(xué)診斷技術(shù)主要包括采用細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒、組織病理切片及電鏡觀察。這些方法操作繁瑣，檢測周期長，且靈敏度低。2.免疫學(xué)技術(shù)主要包括免疫熒光檢測、免疫點(diǎn)雜交。這些方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高的優(yōu)點(diǎn)，但操作步驟相當(dāng)繁瑣，不適宜對大量樣品進(jìn)行檢測。3.分子生物學(xué)診斷技術(shù)主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，該技術(shù)比較快速、靈敏，但是需要瓊脂糖凝膠電泳，EB染色觀察結(jié)果，EB是致癌物，對人體和環(huán)境有危害，并且交叉污染問題比較嚴(yán)重；另外PCR只能進(jìn)行定性檢測，不能對病毒進(jìn)行定量。實(shí)時定量PCR技術(shù)目前已被廣泛應(yīng)用于檢測水生生物細(xì)菌(如對蝦弧菌、貝副溶血弧菌)、病毒(對蟲下白斑綜合癥病毒、魚傳染性造血器官壞死病毒)等病原體，但是尚未用于淋巴囊腫病毒的檢測。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種利用熒光探針(Taqman探針)或SYBRGREENI熒光染料定量檢測淋巴囊腫病毒的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明的技術(shù)方案如下首先設(shè)計特異性引物序列和熒光探針序列，然后建立實(shí)時定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，制備含有目的擴(kuò)增片段的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后建立待測樣品的結(jié)果判定依據(jù)。上述的設(shè)計特異性引物序列和熒光探針序列選取淋巴囊腫病毒的主要衣殼蛋白(MCP)基因保守序列，利用巳有的PrimerExpress2.0軟件設(shè)計特異性引物序列和熒光探針序列，為正向引物L(fēng)CDV-F:5'-CAAGCTATACAATCCAATTACACCAGTT-3'反向引物L(fēng)CDV-R:5'-CAGCAGCAATACCCGGTAAATC-3'熒光探針LCDV-T:5'-FAM-TTCTCCTGTAATCTTTGACGGTGGAATTGCT-TAMRA-3'。熒光探針的5'端標(biāo)記熒光報告基團(tuán)FAM，3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，擴(kuò)增片斷長度為82bp。上述的建立實(shí)時定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序按照常規(guī)操作，首先要采用傳統(tǒng)的酚/氯仿法或者商業(yè)化的DNA提取試劑盒提取待測樣品的DNA，之后通過調(diào)整實(shí)時定量PCR各組分的用量，以定量PCR儀器檢測到高熒光信號和低Ct值為依據(jù)，建立定量PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序。上述的制備含有目的擴(kuò)增片段的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線首先設(shè)計包含實(shí)時定量PCR擴(kuò)增區(qū)域的正鏈引物和負(fù)鏈引物，擴(kuò)增淋巴囊腫病毒得到401bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，按照己有的分子克隆操作方法，制備質(zhì)粒并提取質(zhì)粒DNA，命名為pLCDV-MCP，即為標(biāo)準(zhǔn)品。將標(biāo)準(zhǔn)品測定濃度后并梯度稀釋，之后進(jìn)行實(shí)時定量PCR反應(yīng)。定量PCR儀器計算Ct值(Thresholdcycle,循環(huán)閾值)，Ct值是指PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的拐點(diǎn)所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和Ct值，儀器軟件自動繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。上述的建立待測樣品的結(jié)果判定依據(jù)利用實(shí)時定量PCR儀器收集熒光信號，再利用分析軟件處理數(shù)據(jù)，得到擴(kuò)增曲線、熔解曲線、Ct值、Tm值。以最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的Ct值作為待測樣品的判定界限，以標(biāo)準(zhǔn)品對照的Tm值作為SYBRGREENI熒光染料的判定依據(jù)。本發(fā)明適用于對淋巴囊腫病毒進(jìn)行快速檢測，可廣泛應(yīng)用于魚類特別是牙鲆、鱸魚等養(yǎng)殖場的疫病監(jiān)控及進(jìn)出口貿(mào)易中淋巴囊腫病毒的檢測。本發(fā)明與已有技術(shù)對比其特點(diǎn)是1、檢測快速、高效該檢測方法在定量PCR反應(yīng)結(jié)束后，可立即通過儀器軟件進(jìn)行結(jié)果判定，不需要瓊脂糖凝膠電泳、EB染色觀察結(jié)果，減少了環(huán)境污染和樣品交叉污染，從核酸提取到結(jié)果判定僅需要4小時；一次可以進(jìn)行96個樣品的檢測，具有高效性。2、可實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量通過制備標(biāo)準(zhǔn)品及繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測樣品的Ct值，可以對待測樣品中的淋巴囊腫病毒進(jìn)行定量，準(zhǔn)確度高，做到了真正意義上的定量檢測。3、特異性強(qiáng)特異性引物和熒光探針只與淋巴囊腫病毒特異性地結(jié)合，與虹彩病毒科的其他病毒都沒有反應(yīng)。4、檢測范圍廣，靈敏度高，在標(biāo)準(zhǔn)品為3"07-30拷貝范圍內(nèi)都有極好的線性關(guān)系，檢測范圍可達(dá)7個數(shù)量級；檢測限達(dá)30個拷貝，是其他檢測方法無法比擬的。圖l.本發(fā)明的不同濃度的淋巴囊腫病毒標(biāo)準(zhǔn)品的實(shí)時定量PCR反應(yīng)的擴(kuò)增曲線圖譜橫坐標(biāo)代表PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)代表熒光信號強(qiáng)度。1-7:PCR反應(yīng)體系中標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為3xl07、3xl06、3xl05、3xl04、3xl03、3><102、3xl01拷貝圖2.本發(fā)明的淋巴囊腫病毒的實(shí)時定量PCR檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖譜橫坐標(biāo)代表樣品的拷貝數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值?？截悢?shù)X與Ct值的線性關(guān)系為Ct=-3.631gX+41.86，相關(guān)系數(shù)R2=0.9915。圖3.本發(fā)明的利用熒光探針實(shí)時定量PCR檢測牙鲆樣品的擴(kuò)增曲線圖譜P:淋巴囊腫病毒標(biāo)準(zhǔn)品；B:空白對照；1-5:為5份牙鲆樣品圖4.本發(fā)明的利用SYBRGREENI實(shí)時定量PCR檢測牙鲆樣品的熔解曲線圖譜橫坐標(biāo)代表反應(yīng)溫度，縱坐標(biāo)代表熒光信號導(dǎo)數(shù)。A:淋巴囊腫病毒標(biāo)準(zhǔn)品及5份牙鲆樣品，熔解曲線的峰值對應(yīng)的溫度即為Tm值，待測樣品的Tm值介于74.4。C一74TC之間；B:空白對照(水)圖5.本發(fā)明的其他病毒的SYBRGREENI實(shí)時定量檢測結(jié)果的熔解曲線圖譜A:淋巴囊腫病毒標(biāo)準(zhǔn)品；B:流行性造血器官壞死病毒(EHNV)、蛙虹彩病毒(BIV)、新加坡石斑虹彩病毒(SGIV)、真鯛虹彩病毒(RSIV)具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例及附圖進(jìn)一步闡述本發(fā)明。實(shí)施例1、以牙鲆樣品為例，采用熒光探針實(shí)時定量PCR方法定量檢測淋巴囊腫病毒。牙鲆樣品采自山東萊州某養(yǎng)殖場，具有感染淋巴囊腫病毒的典型臨床癥狀，魚皮膚、鰭及眼球等處出現(xiàn)小泡狀的腫脹物，其病史患有纖毛蟲病、鼓眼病等。上述的設(shè)計特異性引物序列和熒光探針序列在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/中搜索淋巴囊腫病毒的序列，利用已有的DNALASERGENE7.1軟件分析比較各個基因序列的保守性，結(jié)果表明淋巴囊腫病毒的主衣殼蛋白(MCP)基因序列比較保守。因此，以MCP基因?yàn)槟繕?biāo)基因，利用已有的PrimerExpress2.0軟件設(shè)計特異性引物序列和熒光探針序列。設(shè)計的引物序列Tm值在58'C-6(TC之間，不具有二級結(jié)構(gòu)，兩條引物的Tm值相差2'C以內(nèi)，且不形成引物二聚體。熒光探針的Tm值比引物高8'C-1(TC。特異性引物包括正向引物和反向引物，熒光探針為Taqman探針，設(shè)計的實(shí)時定量PCR的特異性引物序列和熒光探針序列如下正向引物L(fēng)CDV腳F:5'-CAAGCTATACAATCCAATTACACCAGTT-3'反向引物L(fēng)CDV-R:5'-CAGCAGCAATACCCGGTAAATC-3'熒光探針LCDV-T:5'-FAM-TTCTCCTGTAATCTTTGACGGTGGAATTGCT—TAMARA-3'。擴(kuò)增片斷長度為82bp。設(shè)計好特異性引物序列和熒光探針序列后，通過TAKARA商業(yè)公司，采用J3-乙腈亞磷酸胺化學(xué)合成法，使用全自動DNA合成儀進(jìn)行特異性引物和熒光探針的合成與熒光標(biāo)記。熒光探針的5'端標(biāo)記熒光報告基團(tuán)FAM，3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。上述的建立PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序按照常規(guī)操作，首先要提取待測樣品的DNA。取牙鲆的腎、脾、腦等組織勻漿，采用TaKaRaMiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer3.0DNA提取試劑盒，按照說明書進(jìn)行DNA的提取，之后用核酸分析儀進(jìn)行定量，調(diào)整DNA濃度為100ng/nL。實(shí)時定量PCR反應(yīng)體系由以下組分構(gòu)成2pL待測樣品DNA，12.5piL2xPCRMasterMix(美國ABI公司)，l(Himol/L正向引物、反向引物各2pL，lpL10|xmol/L熒光探針，補(bǔ)充水至25^L。采用ABI7900HT型定量PCR儀器進(jìn)行反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序?yàn)?(TC2min;95°C10min;之后95。C15sec，60°Clmin進(jìn)行40個循環(huán)。上述的制備含有目的擴(kuò)增片段的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線利用PRIMEREXPRESS2.0軟件，設(shè)計包含定量PCR擴(kuò)增區(qū)域的PCR引物，用于制備陽性質(zhì)粒。PCR引物序列為LCDV-659F:ACGACTCTACCATCATGCCTTTG;LCDV-1059R:AAGACGAGCACTATTTTCATAAACCA。擴(kuò)增片斷長度為401bp。按照常規(guī)PCR擴(kuò)增淋巴囊腫病毒，得到401bp的擴(kuò)增片段。再按照黃培堂等譯《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)，中國科學(xué)出版社，2003年1月，第1217-1259頁，構(gòu)建含有目的擴(kuò)增片段的質(zhì)粒，命名為pLCDV-MCP。用BECKMAN核酸分析儀測定質(zhì)粒濃度為50ng4tL。pMD19-T載體長度為2692bp，插入的MCP基因片段長度為401bp，每對堿基的平均分子量為660g/mo1，再根據(jù)阿佛加德羅常數(shù)(6.02x1023)，計算出標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為1.5x107拷貝爾L。為了繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行IO倍系列稀釋，分別得到濃度為1.5xl07、1.5xl06、1.5xl05、1.5x104、1.5x103、1.5x102、1.5x101拷貝/ixL的標(biāo)準(zhǔn)品。以各個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行實(shí)時定量PCR反應(yīng)，每個濃度做2個平行樣，通過定量PCR儀器的分析軟件繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。ABI7900HT型定量PCR儀器在反應(yīng)過程中自動收集熒光信號，反應(yīng)結(jié)束后，利用儀器自帶的SDS2.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，包括査看擴(kuò)增曲線、Ct值。淋巴囊中病毒各個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線圖譜見圖1。結(jié)果表明，反應(yīng)體系中標(biāo)準(zhǔn)品為3"07-30個拷貝，7個數(shù)量級的范圍內(nèi)都有"S"型擴(kuò)增曲線，表明該實(shí)時定量PCR檢測方法檢測范圍廣。標(biāo)準(zhǔn)品濃度最低為30個拷貝，對應(yīng)的Ct值為35.85，因此以Ct值36作為判定待測樣品結(jié)果的界限，判定該方法的檢測限為30個拷貝。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)與Ct值的關(guān)系，SDS2.1軟件自動繪制出的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。其中，模板濃度X與Ct值的線性關(guān)系為Ct=-3.631gX+41.86，相關(guān)系數(shù)R2=0.9915。上述建立待測樣品的結(jié)果判定依據(jù)待測樣品的結(jié)果判定是通過其擴(kuò)增曲線及Ct值進(jìn)行的。若待測樣品的Ct值536.0，同時有"S"型擴(kuò)增曲線的待測樣品，判定為含有淋巴囊腫病毒。經(jīng)檢測，發(fā)現(xiàn)5份牙鲆待測樣品都含有淋巴囊腫病毒，其擴(kuò)增曲線見圖3。根據(jù)待測樣品的Ct值，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線，儀器計算出5份牙鲆樣品的淋巴囊腫病毒拷貝數(shù)，見表2。在本檢測過程中，以淋巴囊腫病毒標(biāo)準(zhǔn)品、水為模板，分別作為陽性對照、空白對照，以排除試劑污染或試劑失效造成的假陽性或者假陰性結(jié)果。表25份牙鲆樣品淋巴囊腫病毒的定量PCR檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例2、以牙鲆樣品為例，利用SYBRGREENI熒光染料檢測牙鲆樣品是否含有淋巴囊腫病毒。牙鲆樣品的來源同實(shí)施例1，設(shè)計的特異性引物序列實(shí)施例1，在利用SYBRGREENI熒光染料的情況下不需要設(shè)計熒光探針。SYBRGREENI實(shí)時定量PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序同實(shí)施例1，只是將反應(yīng)體系中的luL10pmol/L熒光探針換成l^L25xSYBRGREENI熒光染料。而且要在PCR反應(yīng)程序結(jié)束后，利用ABI7卯0HT定量PCR儀器進(jìn)行熔解曲線分析，其程序?yàn)?5°C15min，60'C15min,95°C15min,升降溫速率為每25秒溫度變化rC。結(jié)束后，由SDS2.1軟件給出待測樣品的Tm值。定量PCR儀器收集熒光信號、分析數(shù)據(jù)同實(shí)施例1。5份牙鲆待測樣品的熔解曲線見圖4。在本檢測過程中，以淋巴囊腫病毒標(biāo)準(zhǔn)品、水為模板，分別作為陽性對照、空白對照，以排除試劑污染或試劑失效造成的假陽性或者假陰性結(jié)果。結(jié)果表明，淋巴囊腫病毒標(biāo)準(zhǔn)品的熔解曲線的峰值與橫坐標(biāo)的交點(diǎn)，即Tm值，為74.5'C。由于定量PCR儀器有系統(tǒng)誤差，因此若待測樣品的Tm值介于74.0°C—75.(TC之間則判定感染了淋巴囊腫病毒。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明牙鲆待測樣品的Tm值為74.4'C—74.7'C之間，熒光信號導(dǎo)數(shù)強(qiáng)度與質(zhì)粒相當(dāng)，因此判定5尾牙鲆都感染了淋巴囊腫病毒。實(shí)施例3、分析淋巴囊腫病毒的SYBRGREENI實(shí)時定量PCR檢測方法的特異性。作為對照，采用與淋巴囊腫病毒親緣關(guān)系較近的其他病毒，利用SYBRGREENI實(shí)時定量PCR方法進(jìn)行檢測。這些病毒都屬于虹彩病毒科，它們是流行性造血器官壞死病毒(EHNV)、蛙虹彩病毒(BIV)、新加坡石斑虹彩病毒(SGIV)、真鯛虹彩病毒(RSIV)，。檢測步驟同實(shí)施例2，只是將待測樣品的DNA換成流行性造血器官壞死病毒(EHNV)、蛙虹彩病毒(BIV)、新加坡石斑虹彩病毒(SGIV)、真鯛虹彩病毒(RSIV)的DNA。SYBRGREENI實(shí)時定量PCR的熔解曲線見圖5，其中淋巴囊腫病毒擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值為74.5'C，其它4種病毒的Tm值約為77'C，超出了74.(TC—75.0范圍，且熔解曲線的熒光信號值遠(yuǎn)低于陽性質(zhì)粒，因此判定流行性造血器官壞死病毒(EHNV)、蛙虹彩病毒(BIV)、新加坡石斑虹彩病毒(SGIV)、真鯛虹彩病毒(RSIV)沒有發(fā)生實(shí)時定量PCR反應(yīng)，表明SYBRGREENI實(shí)時定量PCR檢測淋巴囊腫病毒的方法特異性好，與其它相近病毒沒有交叉反應(yīng)。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>caagctatacaatccaattacaccagtt28〈210>3〈211>22〈212〉麗<213〉人工序列〈220〉<221〉primer—bind<222〉(1)…22)〈223〉根據(jù)實(shí)時定量PCR反應(yīng)要求設(shè)計，用于擴(kuò)增淋巴囊腫病毒的負(fù)鏈引物。<400〉3cagcagcaatacccggtaaatc22〈210>4〈211〉31〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<221〉primer一bind<222〉(l)...(31)<223>根據(jù)實(shí)時定量PCR反應(yīng)要求設(shè)計，用于擴(kuò)增淋巴囊腫病毒的Taqman探針。〈400〉4TTCTCCTGTAATCTTTGACGGTGGAATTGCT31〈210>5〈211>23<212〉■〈213>人工序列〈220〉<221〉primer—bind〈222>(1)…22)<223〉根據(jù)PCR反應(yīng)要求設(shè)計，用于制備陽性質(zhì)粒的正鏈引物。<400>5acgactctaccatcatgcctttg22<210〉6〈211>26〈212〉DNA〈213〉人工序列<220〉<221>primer一bind〈222〉(1)…26)〈223〉根據(jù)PCR反應(yīng)要求設(shè)計，用于制備陽性質(zhì)粒的負(fù)鏈引物?！?00〉6aagacgagcactattttcataaacca26〈210〉7<211〉82〈212〉DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉定量PCR反應(yīng)的目的擴(kuò)增片段序列<400>7caagctatacaatccaattacaccagttcttctcctgtaatctttgacggtggaattgct60agcgatttaccgggtattgctg8權(quán)利要求1、一種淋巴囊腫病毒的實(shí)時定量PCR檢測方法，其特征在于首先設(shè)計特異性引物序列和熒光探針序列，然后建立實(shí)時定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，制備含有目的擴(kuò)增片段的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后建立待測樣品的結(jié)果判定依據(jù)。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的淋巴囊腫病毒的實(shí)時定量PCR檢測方法，其特征在于特異性引物序列、熒光探針序列為-正向引物L(fēng)CDV-F:5'-CAAGCTATACAATCCAATTACACCAGTT-3';反向引物L(fēng)CDV-R:5'-CAGCAGCAATACCCGGTAAATC-3';熒光探針LCDV-T:5'-FAM-TTCTCCTGTAATCTTTGACGGTGGAATTGCT-TAMRA-3';3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種淋巴囊腫病毒的實(shí)時定量PCR檢測方法，其特征在于上述PCR反應(yīng)體系由以下組分組成12.5nL2xPCRMasterMix，10nmol/L正向引物、反向引物各l-2pL，0.5-lpL10pmol/L熒光探針，lOOng/pL待測樣品的DNAl-2pL，補(bǔ)充雙蒸水至25^L。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種淋巴囊腫病毒的實(shí)時定量PCR檢測方法，其特征在于上述PCR反應(yīng)體系由以下組分組成12.5^L2xPCRMasterMix，10nmol/L正向引物、反向引物各l-2^L;0.5-lpL25倍SYBRGREENI熒光染料，lOOng/^L待測樣品的DNAl-2^L，補(bǔ)充雙蒸水至25pL。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種淋巴囊腫病毒的實(shí)時定量PCR檢測方法，其特征在于PCR反應(yīng)程序?yàn)?0°C2min;95°C10min;95°C15sec，57。C-63。C間的某一溫度lmin，進(jìn)行40個循環(huán)。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種淋巴囊腫病毒的實(shí)時定量PCR檢測方法，其特征在于結(jié)果判定依據(jù)為若采用熒光探針，當(dāng)待測樣品有"S"型擴(kuò)增曲線，且Ct值《6.0時，則待測樣品中含有淋巴囊腫病毒，通過待測樣品的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線，由定量PCR儀器自動計算出淋巴囊腫病毒含量值；若采用SYBRGREENI熒光染料，當(dāng)待測樣品的Tm值介于74.(TC—75.(TC之間時，判定待測樣品中含有淋巴囊腫病毒。全文摘要一種淋巴囊腫病毒的實(shí)時定量PCR檢測方法，屬于病毒檢驗(yàn)技術(shù)。其技術(shù)方案是首先設(shè)計特異性引物序列和熒光探針序列，然后建立PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，制備含有目的擴(kuò)增片段的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后建立檢測樣品的結(jié)果判定依據(jù)。本發(fā)明包括設(shè)計的特異性引物序列和熒光探針序列，以及與之配套的定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，記憶檢測樣品的結(jié)果判定方法。本發(fā)明解決了從魚樣本中檢測淋巴囊腫病毒的方法，具有快速，準(zhǔn)確、特異性好、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，可以進(jìn)行定性、定量檢測，適合魚病毒的快速檢驗(yàn)檢疫，具有很強(qiáng)的推廣性和實(shí)用性。文檔編號C12Q1/70GK101240351SQ20081001482公開日2008年8月13日申請日期2008年3月20日優(yōu)先權(quán)日2008年3月20日發(fā)明者岳志芹,駿應(yīng),彪徐,朱來華,梁成珠,肖西志,辛學(xué)謙,鄧明俊,鄭小龍,曉陳申請人:山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心