專利名稱：：與水稻紫葉鞘基因PSH1(t)連鎖的分子標(biāo)記及其獲得方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及與水稻紫葉鞘基因尸5^7"J連鎖的分子標(biāo)記及其獲得方法和應(yīng)用，屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：水稻是我國的重要糧食作物。形態(tài)1$狀在水稻的遺傳改良和圖譜構(gòu)建過程中起著重要的作用。在目前傳統(tǒng)的育種過程中，育種者仍把易于識(shí)別的形態(tài)性狀作為標(biāo)記來指導(dǎo)育種。近些年隨著雜交水稻在我國的發(fā)展，雜交稻種子的純度鑒定變的越來越重要。選擇既在苗期表現(xiàn)明顯不同于正常綠葉，而又植株健壯，對(duì)產(chǎn)量影響小的葉色標(biāo)記性狀如紫葉、紫葉鞘、淡綠葉，導(dǎo)入到不育系、恢復(fù)系，利用葉色標(biāo)記在苗期幫助檢出假雜交種，將是提高雜交稻種子純度的一種簡便有效的方法(曹立勇等，1999;沈圣泉等，2004)。研究表明，紫葉鞘作為水稻重要的農(nóng)藝性狀，在雜交種苗期鑒定中具有很重要的潛在優(yōu)勢。關(guān)于葉鞘基因的遺傳依據(jù)在不同的分離群體已經(jīng)被研究，結(jié)果顯示控制紫葉鞘性狀的基因有一個(gè)或兩個(gè)主效QTL控制(宋國清等，1994;黃碧光和盧泳全，2002;邱振國，2006)。Bing等(2006)利用重組自交系群體定位了3個(gè)與水稻紫葉鞘性狀相關(guān)的QTL，分別位于水稻第l、6、10染色體上，在第1染色體上位于SSR標(biāo)記RM129和RM5之間，但是RM129和RM5兩標(biāo)記與紫葉鞘基因所在的基因座的遺傳距離并沒有報(bào)道。目前還沒有建立水稻紫葉鞘/^;W(^)基因的分子遺傳圖譜。本發(fā)明人利用水稻品種圣稻301和IRBB60雜交，并連續(xù)自交，利用單粒傳法，發(fā)展了一個(gè)包含210家系的重組自交系群體，該群體中編號(hào)為RI51的株系帶有紫葉鞘性狀。利用無紫葉鞘水稻品種香粳9407與紫葉鞘品種RI51雜交產(chǎn)生的F2分離群體，對(duì)其帶有的紫葉鞘基因尸6^7G;進(jìn)行定位，建立尸5^fd基因的分子遺傳圖譜，找到與尸^7^^基因緊密連鎖的分子標(biāo)記基礎(chǔ)上，通過緊密連鎖的SSR標(biāo)記的擴(kuò)增確定紫葉鞘基因是以純合狀態(tài)還是以雜合狀態(tài)存在，才能方便的開展選育研究。借助分子標(biāo)記輔助選擇(Marker-assistedselection,MAS)技術(shù)有目的地進(jìn)行紫葉鞘基因的轉(zhuǎn)育，培育帶有紫葉鞘基因的不育系和恢復(fù)系，加快育種的進(jìn)程。并可用于紫葉鞘基因/^)77(^>的克隆。本發(fā)明可用來指導(dǎo)紫葉鞘水稻品種的選育研究，與之連鎖的分子標(biāo)記對(duì)攜有紫葉鞘基因是以純合或雜合狀態(tài)存在的單株進(jìn)行準(zhǔn)確選擇，大大提高育種效率。同時(shí)紫葉鞘基因/^A7(^;分子遺傳圖譜的構(gòu)建，對(duì)于圖位克隆該基因提供了很好的基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是篩選出幾個(gè)與水稻紫葉鞘基因尸5WG,緊密連鎖且不受環(huán)境影響的以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，在苗期就可鑒定出攜有紫葉鞘基因是以純合或雜合狀態(tài)存在的單株，加快紫葉鞘性狀分子標(biāo)記輔助育種，大大提高選擇的效率。同時(shí)紫葉鞘基因尸5^7(^分子遺傳圖譜的構(gòu)建可加快克隆紫葉鞘基因。與水稻紫葉鞘基因/^^7(^>連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于，用標(biāo)記引物RM7202左端引物序列為AACGTGGAGGCTCCTTTTTC右端引物序列為TTGCTATTAGTTGGTGGGGC標(biāo)記引物固7318左端引物序列為CCATAGCTGCGTGATTCTCC右端引物序列為AGATGAAACTGGCACGTGTG標(biāo)記引物賜3475左端引物序列為GTCGGTTTGCCTAGTTGAGC右端引物序列為TTCCTCGGTGTATGGGTCTC標(biāo)記弓物RM488左端弓物序列為CAGCTAGGGTTTTGAGGCTG右端弓物序列為TAGCAACAACCAGCGTATGC標(biāo)記弓物RM3143左端弓l物序列為AGCCTGGATAAGATGGTTCG右端弓物序列為CGAGAAGACCCAGTTTCTGC標(biāo)記弓物RM8260左端弓物序列為AATCTAACGTTTGACTATCCATC右端弓物序列為TCTACCAGTACTCCCTTCACC標(biāo)記弓物RM246左端弓物序列為GAGCTCCATCAGCCATTCAG右端弓物序列為CTGAGTGCTGCTGCGACT標(biāo)記弓物RM128左端弓物序列為AGCTTGGGTGATTTCTTGGAAGCG右端弓物序列為ACGACGAGGAGTCGCCGTGCAG擴(kuò)增水稻基因組DNA獲得的擴(kuò)增片段大小約為157bp、103bp、150bp、177bp、98bp、192bp、116bp和157bp，即為與水稻紫葉鞘基因/^肌(^>連鎖的分子標(biāo)記RM7202標(biāo)記、RM7318標(biāo)記、RM3475標(biāo)記、RM488標(biāo)記、RM3143標(biāo)記、RM8260標(biāo)記、RM246標(biāo)記和RM128標(biāo)記，其中標(biāo)記M488,RM8260,RM3475位于尸5附靠近短臂的一側(cè)，與尸>5^/(^>的遺傳距離分別為7.lcM、5.8cM和2.0cM;標(biāo)記RM7202,RM7318,RM3143,RM246和RM128位于Z^vWG,的另一側(cè)，與尸5附的遺傳距離分別為1.lcM、1.4cM，4.9cM、5.8cM和18.9cM，離尸淑W基因最近的兩側(cè)標(biāo)記分別為RM3475和RM7202。上述與水稻紫葉鞘基因/^)W(^)連鎖的分子標(biāo)記，是通過以下方法獲得的(1)利用水稻品種圣稻301(山東省水稻研究所育成品種，國家種子庫均有保存，可對(duì)外提供)和水稻品種IRBB60(公知公用材料，國家種子庫均有保存，可對(duì)外提供)雜交，并連續(xù)自交，利用單粒傳法，發(fā)展了一個(gè)包含210家系的重組自交系群體，該群體中編號(hào)為RI51的株系帶有紫葉鞘性狀；(2)利用無紫葉鞘品種香粳9407與紫葉鞘品種RI51(公知公用材料，國家種子庫均有保存，可對(duì)外提供)雜交，F(xiàn)i種子自交，產(chǎn)生F2，用CTAB法提取水稻香粳9407、RI51及其Ft、F2分離群體的單株DNA;(3)采用360對(duì)均勻覆蓋水-超基因組的SSR引物對(duì)親本RI51和香粳9407及其F,進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行引物的多態(tài)性篩選；篩選出的多態(tài)性引物然后依次對(duì)F2有紫葉鞘和無紫葉鞘DNA混合池，F(xiàn)2群體的各個(gè)體篩選紫葉鞘基因連鎖的分子標(biāo)記；(4)先在第1染色體上篩選出2對(duì)多態(tài)性引物RM7202，,18，在此區(qū)域進(jìn)行標(biāo)記加密，共篩選出8對(duì)多態(tài)性引物RM488，RM8260，RM3475，RM7202，RM7318,RM3143,RM246，RM128;對(duì)50個(gè)具有隱性性狀的無紫葉鞘的&分離群體單株進(jìn)行分析，確證這8對(duì)SSR引物與尸5^7(^>基因連鎖；(5)利用這8對(duì)引物對(duì)420個(gè)分離群體單株的F2進(jìn)行分析，獲取群體基因型資料；(6)根據(jù)連鎖交換規(guī)律，利用群體基因型資料構(gòu)建水稻尸5WG;基因的遺傳圖譜，采用軟件MAPMAKER/EXP3.0，用Kosambi函數(shù)將重組值轉(zhuǎn)換為遺傳圖距(cM);顯性紫葉鞘基因尸5iW(^)被定位在第l染色體上，SSR標(biāo)記M488，RM8260，RM3475位于,5F7(^,靠近短臂的一側(cè)，與",的遺傳距離分別為7.lcM、5.8cM和2.OcM;SSR標(biāo)記RM7202，RM7318,RM3143,RM246和RM128位于尸5W",的另一側(cè)，與W肌("d的遺傳距離分別為1.lcM、1.4cM，4.9cM、5.8cM和18.9cM;離尸6X7(^,基因最近的兩側(cè)標(biāo)記分別為RM3475和RM7202。本發(fā)明與水稻紫葉鞘基因/^氾(^>連鎖的分子標(biāo)記專用于水稻紫葉鞘品種的選育與種質(zhì)資源的利用，并可用于克隆紫葉鞘基因。本發(fā)明所提供的帶有紫葉鞘性狀水稻品種RI51的紫葉鞘基因/^A7(^)的分子標(biāo)記方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)標(biāo)記穩(wěn)定，不受環(huán)境影響。通過本發(fā)明在國際上首次利用SSR標(biāo)記定位了水稻RI51的紫葉鞘基因Z^vW"人構(gòu)建了紫葉鞘基因的分子遺傳圖譜。無紫葉鞘品種香粳9407X紫葉鞘品種RI51組合的親本，&和F2分離群體部分單株，于2007年在不同生育期取樣，用這些標(biāo)記進(jìn)行檢測，標(biāo)記表現(xiàn)穩(wěn)定，不受環(huán)境影響。(2)通過本發(fā)明分子標(biāo)記定位的主基因座位位置明確，鑒定方便。通過檢測與該基因座連鎖的分子標(biāo)記，可以預(yù)測紫葉鞘基因是以純合或雜合狀態(tài)基因型存在的單株，加快紫葉鞘性狀分子標(biāo)記輔助育種，大大提高選擇的效率。其檢測方便快速，不受環(huán)境影響。(3)輔助育種選擇目標(biāo)明確，節(jié)約成本。在雜交稻生產(chǎn)中，由于不育系或恢復(fù)系不穩(wěn)定，造成種子混雜，一直是影響雜種純度的主要因素之一。把紫葉鞘基因轉(zhuǎn)育到不育系或恢復(fù)系中，培育帶有紫葉鞘性狀的不育系或恢復(fù)系，在苗期既可進(jìn)行人工去雜。因此利用與紫葉鞘基因緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助育種，判斷紫葉鞘基因是以雜合和純合存在，準(zhǔn)確地選擇在紫葉鞘基因座上純合的具有優(yōu)異性狀單株，而且能夠有目標(biāo)地將紫葉鞘基因在實(shí)驗(yàn)室選擇得到，大大提高選擇的效率。(4)用于克隆紫葉鞘基因尸6^(^的研究。圖位克隆紫葉鞘基因尸5F7&,的前提在于獲得尸5^/(^"基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。分子標(biāo)記RM3475和RM7202是目前與尸5)776^基因最緊密連鎖的分子標(biāo)記。圖1為水稻品種RI51紫葉鞘基因尸6^7(^,在第1染色體上的位置。圖2為標(biāo)記RM7318對(duì)無紫葉鞘品種香粳9407XRI51F2代分子標(biāo)記輔助選擇電泳圖譜Pl，香粳9407;P2，RI51;1-20，卩2分離單株。圖3為標(biāo)記RM7202對(duì)無紫葉鞘品種香粳9407XRI51&代分子標(biāo)記輔助選擇電泳圖譜Pl，香粳9407;P2，RI51;1-20，&分離單株。具體實(shí)施例方式(一)無紫葉鞘品種香粳9407與紫葉鞘品種RI51雜交F2群體的創(chuàng)建和表型鑒定(1)2000年至2005年利用圣稻301和水稻品種IRBB60雜交，并連續(xù)自交，利用單粒傳法，發(fā)展了一個(gè)包含210家系的重組自交系群體，該群體中編號(hào)為RI51的株系帶有紫葉鞘性狀。(2)2006年無紫葉鞘品種香粳9407XRI51雜交，2006年年底R(shí)種子送海南島三亞加代，自交產(chǎn)生F2種子。2007年將F2分離群體播種于山東省水稻研究所實(shí)驗(yàn)農(nóng)場，5月1號(hào)播種，6月20號(hào)插秧，單株插植。插秧20天抽提F2分離群體的單株DNA,并調(diào)査單株的葉鞘性狀，分紫葉鞘和綠葉鞘兩種表型。(二)RI51/香粳9407F2群體的分子標(biāo)記分析(1)用CTAB法提取香粳9407/RI51&各單株DNA。(2)SSR分析參照Panaudetal.(1996)的方法。20plPCR反應(yīng)體系為:模板DNA10ng/nl，0.15|al10mMdNTPs，1.5個(gè)單位的r^酶，2|iillOXPCRbuffer(含MgCl》，1.5pl的2uM正向和反向引物，反應(yīng)體積20pl。PCR反應(yīng)程序?yàn)镈NA94。C預(yù)變性5min，然后94°C變性1min，55°C退火lmin，72。C延伸lmin，最后72。C延伸5min。在PTO200PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺膠上進(jìn)行分離電泳，銀染參照李文濤等(2002)的方法進(jìn)行顯色觀察，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(3)選擇具有紫葉鞘性狀30株的DNA等量混合，構(gòu)成紫葉鞘混合池，選擇無紫葉鞘性狀30株的DNA等量混合，構(gòu)成無紫葉鞘混合池。選擇兩混合池中表現(xiàn)有多態(tài)性的引物，對(duì)無紫葉鞘性狀的50個(gè)隱性單株進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)表型和基因型進(jìn)行分析，進(jìn)一步證明在兩混合池中表現(xiàn)多態(tài)性的引物與紫葉鞘基因P5^7(^連鎖。然后利用鑒定出的與紫葉鞘基因尸5W(^)連鎖的SSR標(biāo)記對(duì)F2分離群體的420個(gè)單株進(jìn)行擴(kuò)增，獲取F2群體各單株的基因型資料。(4)根據(jù)水稻基因組遺傳圖譜的遺傳圖距，選擇360對(duì)SSR分子標(biāo)記，保證每隔5cM之內(nèi)選擇一個(gè)標(biāo)記，所選標(biāo)記均勻覆蓋整個(gè)水稻基因組。利用這些標(biāo)記首先對(duì)上述親本及其Fi進(jìn)行多態(tài)性篩選，然后依次對(duì)F2有紫葉鞘和無紫葉鞘DNA混合池，并對(duì)無紫葉鞘性狀的50個(gè)隱性單株進(jìn)行擴(kuò)增，判斷標(biāo)記與目標(biāo)基因連鎖，然后利用篩選出的陽性標(biāo)記，對(duì)F2群體的各個(gè)體進(jìn)行基因型標(biāo)記。SSR引物序列來源于http:〃www.gramene.org/網(wǎng)站。由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。(5)按照Mapmaker的要求將與RI51相同帶型的個(gè)體賦為1，與香粳9407相同帶型賦為3，具有雜合帶型的個(gè)體賦為2，數(shù)據(jù)缺失的記為0，利用MAPMAKER/EXP3.0軟件對(duì)420單株進(jìn)行分析，構(gòu)建SSR標(biāo)記遺傳圖譜。并利用Kosambi函數(shù)轉(zhuǎn)換為遺傳距離(cM)。(三)結(jié)果與分析(1)在F2分離群體中，調(diào)查了760個(gè)單株的表型，其中紫葉鞘性狀的單株574株，具有無紫葉鞘性狀的單株186株(帶有綠葉鞘)，具有紫葉鞘性狀和無紫葉鞘性狀的單株分離比例很好的符合3:1(x^l.38〈x2。.。5,3.84)，證明紫葉鞘性狀為顯性，并由一對(duì)主基因控制。(2)利用360對(duì)引物對(duì)親本香粳9407與RI51之間多態(tài)性篩選中，有156對(duì)SSR引物在9407與RI51之間存在多態(tài)性。利用這156對(duì)多態(tài)性引物對(duì)DNA混合池進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)在第1染色體上，有兩個(gè)標(biāo)記RM7202和RM7318在有紫葉鞘性狀和無紫葉鞘性狀的DNA混合池中表現(xiàn)差異，進(jìn)一步對(duì)此區(qū)域的引物進(jìn)行篩選，又篩選到6對(duì)引物RM488,RM8260,RM3143,RM3475，RM246，RM128在紫葉鞘和無紫葉鞘性狀混合池中表現(xiàn)差異。這8對(duì)SSR引物的序列和擴(kuò)增片段大小見表1。為了進(jìn)一步證明這8對(duì)標(biāo)記與紫葉鞘基因尸5iW(^)連鎖，利用這8對(duì)SSR引物對(duì)F2分離群體中的50個(gè)具有綠葉鞘隱性性狀的單株進(jìn)行擴(kuò)增，基因型分離比例明顯偏離1:2:1分離比例，并且絕大部分基因型與表型共分離，證明這8對(duì)SSR標(biāo)記與紫葉鞘基因PSH1(t)連鎖。然后利用這8對(duì)引物對(duì)F2分離群體隨機(jī)選取的420個(gè)單株進(jìn)行擴(kuò)增。把基因型和表型數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)，利用MAPMAKER/EXP3.0程序進(jìn)行連鎖分析，建立了紫葉鞘基因尸6^("d的分子遺傳圖譜，離兩個(gè)最近的分子標(biāo)記RM3475和RM7202距離分別為2.0cM和1.lcM。因此利用這些與紫葉鞘基因"y"連鎖的分子標(biāo)記可以有效地開展紫葉鞘基因的分子標(biāo)記輔助選擇和紫葉鞘性狀的分子育種，同時(shí)利用大的分離群體，對(duì)紫葉鞘基因座進(jìn)行物理作圖，把尸5F/^;基因界定在一個(gè)更小的區(qū)間，加快紫葉鞘基因的克隆。'表l.標(biāo)記引物的序列及擴(kuò)增片段大小<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>核苷酸序列表〈110〉山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高新技術(shù)研究中心〈120〉與水稻紫葉鞘基因PSHl(t)連鎖的分子標(biāo)記及其獲得方法和應(yīng)用〈140〉200810014910x〈141〉2008—03—31〈160〉16〈210〉1〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根據(jù)PCR反應(yīng)要求設(shè)計(jì)，用于擴(kuò)增水稻(0ryzasativa)基因組DNARM7202左端引物〈400〉1aacgtggaggctcctttttc20〈210〉2〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根據(jù)PCR反應(yīng)要求設(shè)計(jì)，用于擴(kuò)增水稻(Oryzasativa)基因組DNARM7202右端引物〈400〉2ttgctattagttggtggggc20〈210〉3〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根據(jù)PCR反應(yīng)要求設(shè)計(jì)，用于擴(kuò)增水稻(Oryzasativa)基因組DNARM7318左端引物〈400〉3ccatagctgcgtgattctcc20〈210〉4〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根據(jù)PCR反應(yīng)要求設(shè)計(jì)，用于擴(kuò)增水稻(Oryzasativa)基因組DNARM7318右端引物〈400〉4agatgaaactggcacgtgtg20〈210〉5〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根據(jù)PCR反應(yīng)要求設(shè)計(jì)，用于擴(kuò)增水稻(Oryzasativa)基因組DNARM3475左端引物〈400〉5gtcggtttgcctagttgagc20〈210〉6〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根據(jù)PCR反應(yīng)要求設(shè)計(jì)，用于擴(kuò)增水稻(Oryzasativa)基因組DNARM3475右端引物〈400〉6ttcctcggtgtatgggtctc20<210〉7〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根據(jù)PCR反應(yīng)要求設(shè)計(jì)，用于擴(kuò)增水稻(Oryzasativa)基因組DNARM488左端引物〈400〉7cagctagggttttgaggctg20〈210〉8〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根據(jù)PCR反應(yīng)要求設(shè)計(jì)，用于擴(kuò)增水稻(0ryzasativa)基因組DNA賜488右端引物〈400〉8tagcaacaaccagcgtatgc20〈210〉9〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根據(jù)PCR反應(yīng)要求設(shè)計(jì)，用于擴(kuò)增水稻(0ryzasativa)基因組DNARM3143左端引物〈400〉9agcctggataagatggttcg20〈210〉10〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根據(jù)PCR反應(yīng)要求設(shè)計(jì)，用于擴(kuò)增水稻(Oryzasativa)基因組DNARM3143右端引物〈400〉10cgagaagacccagtttctgc20〈210〉11〈211〉23〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根據(jù)PCR反應(yīng)要求設(shè)計(jì)，用于擴(kuò)增水稻(0ryzasativa)基因組DNARM8260左端引物〈橋11aatctaacgtttgactatccate23〈210〉12〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根據(jù)PCR反應(yīng)要求設(shè)計(jì)，用于擴(kuò)增水稻(Oryzasativa)基因組DNARM8260右端引物〈400〉12tctaccagtactcccttcacc21〈210〉13〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根據(jù)PCR反應(yīng)要求設(shè)計(jì)，用于擴(kuò)增水稻(0ryzasativa)基因組DNARM246左端引物〈400〉13gagctccatcagccattcag20〈210〉14〈211〉18〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根據(jù)PCR反應(yīng)要求設(shè)計(jì)，用于擴(kuò)增水稻(Oryzasativa)基因組DNARM246右端引物〈400〉14ctgagtgctgctgcgact18〈210〉15<211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根據(jù)PCR反應(yīng)要求設(shè)計(jì)，用于擴(kuò)增水稻(Oryzasativa)基因組DNARM128左端引物〈400〉15agcttgggtgatttcttggaagcg24〈210〉16<211〉22<212〉瞧〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根據(jù)PCR反應(yīng)要求設(shè)計(jì)，用于擴(kuò)增水稻(0ryzasativa)基因組DNARM128右端引物〈400〉16acgacgaggagtcgccgtgcag2權(quán)利要求1.與水稻紫葉鞘基因PSH1(t)連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于，用標(biāo)記引物RM7202左端引物序列為AACGTGGAGGCTCCTTTTTC右端引物序列為TTGCTATTAGTTGGTGGGGC標(biāo)記引物RM7318左端引物序列為CCATAGCTGCGTGATTCTCC右端引物序列為AGATGAAACTGGCACGTGTG標(biāo)記引物RM3475左端引物序列為GTCGGTTTGCCTAGTTGAGC右端引物序列為TTCCTCGGTGTATGGGTCTC標(biāo)記引物RM488左端引物序列為CAGCTAGGGTTTTGAGGCTG右端引物序列為TAGCAACAACCAGCGTATGC標(biāo)記引物RM3143左端引物序列為AGCCTGGATAAGATGGTTCG右端引物序列為CGAGAAGACCCAGTTTCTGC標(biāo)記引物RM8260左端引物序列為AATCTAACGTTTGACTATCCATC右端引物序列為TCTACCAGTACTCCCTTCACC標(biāo)記引物RM246左端引物序列為GAGCTCCATCAGCCATTCAG右端引物序列為CTGAGTGCTGCTGCGACT標(biāo)記引物RM128左端引物序列為AGCTTGGGTGATTTCTTGGAAGCG右端引物序列為ACGACGAGGAGTCGCCGTGCAG擴(kuò)增水稻基因組DNA獲得的多態(tài)性片段大小約為157bp、103bp、150bp、177bp、98bp、192bp、116bp和157bp，即為水稻紫葉鞘基因PSH1(t)連鎖的分子標(biāo)記RM7202標(biāo)記、RM7318標(biāo)記、RM3475標(biāo)記、RM488標(biāo)記、RM3143標(biāo)記、RM8260標(biāo)記、RM246標(biāo)記和RM128標(biāo)記，其中標(biāo)記M488，RM8260，RM3475位于PSH1(t)靠近短臂的一側(cè)，與PSH1(t)的遺傳距離分別為7.1cM、5.ScM和2.0cM；標(biāo)記RM7202，RM7318，RM3143，RM246和RM128位于PSH1(t)的另一側(cè)，與PSH1(t)的遺傳距離分別為1.1cM、1.4cM，4.9cM、5.8cM和18.9cM，離PSH1(t)基因最近的兩側(cè)標(biāo)記分別為RM3475和RM7202。2、權(quán)利要求1所述的與水稻紫葉鞘基因尸5^7fd連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于，是通過以下方法獲得的(1)利用水稻品種圣稻301和IRBB60雜交，并連續(xù)自交，利用單粒傳法，發(fā)展了一個(gè)包含210家系的重組自交系群體，該群體中編號(hào)為RI51的株系帶有紫葉鞘性狀；(2)利用無紫葉鞘品種香粳9407與紫葉鞘品種RI51雜交，R種子自交，產(chǎn)生F2，用CTAB法提取水稻香粳9407、RI51及其Ft、F2分離群體的單株DNA;(3)采用360對(duì)均勻覆蓋水稻基因組的SSR引物對(duì)香粳9407和親本RI51及其F,進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行引物的多態(tài)性篩選；篩選出的多態(tài)性引物然后依次對(duì)F2有紫葉鞘和無紫葉鞘DNA混合池，F(xiàn)2群體的各個(gè)體篩選紫葉鞘基因連鎖的分子標(biāo)記；(4)先在第1染色體上篩選出2對(duì)多態(tài)性引物RM7202，RM7318，在此區(qū)域進(jìn)行標(biāo)記加密，共篩選出8對(duì)多態(tài)性引物RM488，RM8260，RM3475，RM7202，RM7318,RM3143,RM246,RM128;對(duì)50個(gè)具有隱性性狀的無紫葉鞘的Fz分離群體單株進(jìn)行分析，確證這8對(duì)SSR引物與尸5iW(^>基因連鎖；(5)利用這8對(duì)引物對(duì)420個(gè)F2分離群體單株進(jìn)行分析，獲取群體基因型資料；(6)根據(jù)連鎖交換規(guī)律，利用群體基因型資料構(gòu)建水稻尸5)WG;基因的遺傳圖譜，采用軟件MAPMAKER/EXP3.0，用Kosambi函數(shù)將重組值轉(zhuǎn)換為遺傳圖距(cM);顯性紫葉鞘基因尸6^(^)被定位在第1染色體上，SSR標(biāo)記M488，RM8260,RM3475位于尸5^/(^靠近短臂的一側(cè)，與<^>的遺傳距離分別為7.lcM、5.8cM和2.0cM;SSR標(biāo)記RM7202,RM7318,RM3143,RM246和RM128位于尸5W("d的另一側(cè)，與尸5W(^>的遺傳距離分別為1.lcM、1.4cM，4.9cM、5.8cM和18.9cM;離"y)基因最近的兩側(cè)標(biāo)記分別為RM3475和RM7202。3、權(quán)利要求i所述的與水稻紫葉鞘基因/^A7r^連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于，專用于水稻紫葉鞘品種的選育與種質(zhì)資源的利用，并可用于克隆紫葉鞘/^v7/(^基因。全文摘要本發(fā)明公開了與水稻紫葉鞘基因PSH1(t)連鎖的分子標(biāo)記及其獲得方法和應(yīng)用，屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域。提取水稻無紫葉鞘品種香粳9407、紫葉鞘品種RI51及其雜交獲得的F<sub>2</sub>分離群體單株DNA。利用360對(duì)SSR分子標(biāo)記對(duì)上述兩個(gè)親本進(jìn)行PCR產(chǎn)物多態(tài)性篩選，然后依次對(duì)F<sub>2</sub>有紫葉鞘和無紫葉鞘DNA混合池，F(xiàn)<sub>2</sub>群體的各個(gè)體篩選紫葉鞘基因連鎖的分子標(biāo)記。在第1染色體上構(gòu)建了紫葉鞘基因PSH1(t)的分子遺傳圖譜。通過紫葉鞘主基因的分子標(biāo)記來檢測紫葉鞘品種RI51及其衍生品種(系)中是否含有該基因，大大提高紫葉鞘水稻的選擇效率。本發(fā)明專用于水稻紫葉鞘基因的篩選，并用于克隆紫葉鞘基因PSH1(t)的研究。文檔編號(hào)C12N15/29GK101368181SQ200810014910公開日2009年2月18日申請(qǐng)日期2008年3月31日優(yōu)先權(quán)日2008年3月31日發(fā)明者丁漢風(fēng),姚方印,姜明松,張曉東,李廣賢,李潤芳,王文英申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高新技術(shù)研究中心