專利名稱：大菱鲆紅體病虹彩病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于魚魏毒檢測(cè)技術(shù)，是涉及用環(huán)介導(dǎo)等尉廣增(loop-mediated isoth薩al amplification, LAMP)反應(yīng)檢測(cè)大菱鲆紅體病蟲!B病毒的一種^f生物學(xué)方^~~大菱鲆紅體病蟲I^病毒環(huán)介導(dǎo)等溫 擴(kuò)增檢測(cè)方法。 背景獄大穀平紅體病虹彩病毒(Turbot reddish body iridovirus， TRBIV)礦泛存在于魚苗、成魚以及 飼料和辭I7乂體中的一種新的魚^IJI^病毒，近年彩彌敲我國(guó)#81大穀平中 31流行，導(dǎo)致患病大 菱鲆大量死亡，給我國(guó)水產(chǎn)辭Mkit成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此開發(fā)新的技術(shù)十規(guī)、準(zhǔn)確、靈敏ife^測(cè) TRBIV，加強(qiáng)苗種和魚##疫以及# 1*體環(huán)境的監(jiān)測(cè)，對(duì)預(yù)防病毒感染，切斷病毒傳播，保障我國(guó)大 穀平水產(chǎn)銜鵬勺纖捲賣魏具有輕意義。目前，有關(guān)大^S平紅體病虹彩病毒檢測(cè)方法的ffiilX不多，史成銀等(2004) ffiil組織病理學(xué)方法 和電子顯微纟鼓現(xiàn)t腿了大穀平蟲I^病毒，陳松林等(2004)禾,接種培養(yǎng)牙鲆胚胎細(xì)胞的方法脅離和 鑒定到該病毒。在這些方法中，傳統(tǒng)的組織満理學(xué)方法只戯寸患病大穀種勺組織減理狀劍故出初步判斷，并不會(huì)^i:接檢測(cè)到大穀平紅體病蟲i^病毒的存在；電子顯微鏡技術(shù)雖然可以直接觀察至'J病毒粒子的存在，但其操作復(fù)雜、耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)；AI接種培養(yǎng)細(xì)胞的方法檢測(cè)精衝氏、檢測(cè)過(guò)，對(duì)毛費(fèi)時(shí)間更長(zhǎng)。±3^￡種 方法均不能鵬、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地檢測(cè)大穀聘工體病鮮彌毒。史成銀等(2007)開發(fā)出大穀轉(zhuǎn)工體病虹 彩病毒PCR檢測(cè)法，該方法克月艮了Jdi3中方法的缺點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)室劍牛下實(shí)現(xiàn)了)(狀穀平紅體病^^病 毒的相對(duì)十魏、7侮角檢測(cè)。由于常規(guī)的PCR檢測(cè)需要昂貴的PCR儀、？鋤交頓斜a成像系統(tǒng)，這大大限 制了 PCR檢測(cè)方法在7i/^中的推廣應(yīng)用。環(huán)介導(dǎo)等顯擴(kuò)增技術(shù)是2000年由Notomi等發(fā)明的。該技術(shù)針對(duì)目的基因的6個(gè)區(qū)段，設(shè)計(jì)4條特 異弓卿并利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合騰在一定^Jt下對(duì)核Mffl1f^顯擴(kuò)增。M幾年已開始 應(yīng)用于生物致病病原的檢測(cè)。此前，已有自LAMP技;^t測(cè)魚l^lB病毒附隨，Caipang等(2004) 開發(fā)了真鯛蟲10病毒(RSIV)的LAMP檢測(cè)技術(shù)。大^I平紅體病蟲IB病毒和真鯛蟲I^病毒雖同屬蟲I^ 病毒科，iiM于不同的病毒種，其基因組間存在駄的差異，所以已J隨的真鯛蟲If;病毒LAMP檢測(cè)技 術(shù)并不適用于大^t平紅體病虹彩病毒的檢測(cè)。目前，尚未見利用LAMP技術(shù)檢測(cè)大^I平紅體病蟲I^病毒 的鵬。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是衝共一種大菱鲆紅體病蟲I^病毒環(huán)介導(dǎo)等顯擴(kuò)增檢測(cè)方法，以實(shí)現(xiàn)戯^C穀轉(zhuǎn)工體 病蟲I^病毒進(jìn)行十規(guī)、特異、靈敏、簡(jiǎn)便的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，劃艮已有技術(shù)的不足。本發(fā)明具體包括兩4^分1、掛共兩對(duì)用于檢則大菱S轉(zhuǎn)工體病虹彩病毒的LAMP引物序列，即長(zhǎng) 度分別為45bp、 46bp、 18bp和18bp的驟核苷鵬列，依次命名為F1P、 BIP、 F3和B3; 2、 Jif共一 種人徵轉(zhuǎn)工體病蟲II多病毒的LAMP檢測(cè)方法'即首先從待檢測(cè)樣品中制備反蹈對(duì)反，并配制LAMP反 應(yīng)體系，然后艦LAMP反應(yīng)禾Mm對(duì)反應(yīng)t對(duì)腿行擴(kuò)增，顧根據(jù)反應(yīng)混劊勿顯示的顏fe^1t測(cè)結(jié)魏 行判斷，如果顯恭絶則標(biāo)該樣品的大魏紅體病蟲IB病毒樹則結(jié)果為陽(yáng)性。Jl^兩對(duì)LAMP引物序列(FIP、 BIP、 F3和B3)分別與大^I平紅體病蟲I^病毒的主要衣殼蛋白基 因上相應(yīng)位置+雜^^列相同軀補(bǔ)，其驟核苷M^列如下 FIP: 5，-TGCGGTGGGTGACGTTCTTTACTTTTCTTGGTGCATCTGGACCTC-3,BIP: 5，-ACGTGCAAAGCAATTACACCGCTTTTGCAAAGGCAGATTGACCTTG-3，F(xiàn)3: 5'"GTCACACCCGCAGACAAT-3， B3: 5，-ACCTCGGACAGGGGATTG-3，。禾鵬戰(zhàn)的LAMP引物，根據(jù)以下步驟即可進(jìn)行TRBIV病毒的檢測(cè)，具體包括以下四個(gè)歩驟(1) 制備待檢樣品的LAMP反應(yīng)t對(duì)及取0.5克樣品，采用天根生化禾射i有限公司組織基因組DNA 提取試劑盒(TlANamp Genomic DNA Kit)進(jìn)^T^且織DAN的提取和純化，制備LAMP反應(yīng)的DNA模 板；(2) 酉己制LAMP反應(yīng)體系^mii制備的DNAt對(duì)及l(fā) ^L，加入到如下反應(yīng)體系中引物FIP和 BIP各1.6pM，引物F3禾口B3各0,2mM， dNTP1.4Mm， MgCl28mM， Betaine 1M， Tris-HC120mM， KC110mM， MgSO42mM,(NH4)2SO410mM， TritonX-100 0.1%， 聚合酶8U，加A^義蒸zK使 反應(yīng)體系的總體禾,吸剖25^L，上述的dNTP為dTTP、 dATP、 dGTP和dCTP的混合物，其質(zhì)量比 為l:l:l:l;(3) 按照如下反應(yīng)禾M 進(jìn)行LAMP反應(yīng)63。C保溫60併中，然后80。C保溫5併中； 〔4)判斷LAMP檢測(cè)結(jié)果:LAMP ffi結(jié)束后，在反應(yīng)體系中加入100倍稀釋的GeneFinder 2 pL，然后用目朗青觀察被測(cè)樣品的LAMP反應(yīng)產(chǎn)物，如果顯恭絶則*^該樣品的大^1平紅體病蟲10病毒檢測(cè) 結(jié)果為附性，如果顯示橙黃色則S^該樣品的大穀平紅體病蟲I^病毒檢測(cè)結(jié)果為附性。 本發(fā)明所麟的TOBIV檢測(cè)方法具有如下優(yōu)點(diǎn)(1) 靈每娘高。對(duì)TRBIV的檢測(cè)極限可低至101個(gè)拷貝，對(duì)TRBIV檢測(cè)的靈敏比普通PCR方法 高10倍以上。(2) 特異性強(qiáng)。所用的特異引物根據(jù)TRBIV主要衣殼蛋白基因中6個(gè)不同區(qū)i或設(shè)計(jì)，特異ttM 常規(guī)PCR。(3) 檢測(cè)時(shí)間短。2-3個(gè)小時(shí)便可獲得檢測(cè)結(jié)果，比現(xiàn)有最賊走的PCR檢測(cè)法節(jié)省3-5個(gè)小時(shí)。(4) 儀驟求寬松。不需要普通PCR所用的PCR儀、湊超交電泳和成像系統(tǒng)，只要一個(gè)7K浴鍋或金 屬浴就能完鵬測(cè)反應(yīng)。(5) 操作簡(jiǎn)單、結(jié)果明顯。fi^檢測(cè)過(guò)程H鄰及復(fù)雜儀器或設(shè)備，稍具針生物學(xué)基礎(chǔ)的人員即可 完 作；檢測(cè)結(jié)果清晰明顯，直接用鵬青觀察就可以判斷。(6) 對(duì)人和環(huán)境安全。檢測(cè)過(guò)程中不4頓有毒試劑，對(duì)人和環(huán)境都非常安全。(7) 低 。
LAMP檢測(cè)總鵬大大低于現(xiàn)有SJt1介的PCR檢測(cè)方法?？傊?，該方法具有比普通PCR衞則方法更高的特異性、靈敏性和便捷性，可以割飲菱鲆紅體病 蟲I^病毒的電子顯微鏡、細(xì)胞培養(yǎng)和PCR檢測(cè)法。下面M實(shí)施例詳細(xì)U^本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容。為了teTRBIV的LAMP檢測(cè)方法，首先要選擇TOB1V所具有的特異核昔lgff列，然后進(jìn)行LAMP 弓嫩的設(shè)計(jì)和合成。史成銀等(2007)研究表明TRBIV的主要衣殼蛋白基因(GenBank注冊(cè)號(hào)為 AY590687)與其ft^I^病毒不同，可以作為TOBIV的特征核苷 列，用于TRBIV的鑒定和檢測(cè)。在 確定主要衣殼蛋白基因作為TRBIV檢測(cè)的特異核苷 列之后，就可以根據(jù)該基因的核苷S^列設(shè)計(jì) LAMP擴(kuò)增的引物。LAMP引物的設(shè)計(jì)首選軟件PrimerExplore 4.0 (http:〃primerexplorer加 /elamp4.0.0/index.html)，也可以j頓常用的弓l物設(shè)計(jì)軟件(如Primer Primier 5.0或Omiga2.0)按照LAMP 引物的設(shè)計(jì)要 行弓嫩設(shè)計(jì)。禾傭軟件PrimerExplore 4.0在線設(shè)計(jì)的TRBIV主要衣殼蛋白基因的 LAMP引物如下FIP: 5，-TGCGGTGGGTGACGTTCTTTACTnTCTTGGTGCATCTGGACCTC-3， BIP: 5'-ACGTGCAAAGCAATTACACCGCTTTTGCAAAGGCAGATTGACCTTG-3， F3: 5'-GTCACACCCGCAGACAAT陽(yáng)3， B3: 5'-ACCTCGGACAGGGGATTG-3'。按照，弓胸序列進(jìn)行LAMP弓l物的合成(可由商業(yè)的DNA合成公司合成，如上海生物工程公司)。合成制備TRBIV主要衣殼蛋白基因的LAMP擴(kuò)增弓卿之后，就可以進(jìn)行TRBIV的LAMP檢測(cè)了。 其LAMP檢測(cè)方、 跑括反應(yīng)豐對(duì)反的制備、LAMP反應(yīng)體系、LAMP反應(yīng)禾im和擴(kuò)增結(jié)果的判斷。LAMP檢測(cè)反iS^用的DAN t對(duì)反可以用常規(guī)的組織核,取方法制備，也可用商品化的組織DAN 提取試劑盒制備。本發(fā)明中采用天根生化科技有限公司(TIANGEN)組織基因組DNA提取試劑盒 (TIANamp Genomic DNA Kit)進(jìn)行樣品DAN的提取和純化，制備LAMP反應(yīng)DNA模板的詳細(xì)操作 歩S聚參見該試劑盒的J頓說(shuō)明書。制備LAMP反應(yīng)DNA豐對(duì)及后，即可進(jìn)行頂BIV的LAMP反應(yīng)檢測(cè)，為此，首先要配制出具有最 佳擴(kuò)增效率和檢測(cè)特異性的反應(yīng)體系，本發(fā)明中的LAMP反應(yīng)中的引物、dNTTP和Betaine (甜菊減)的 濃度均做了優(yōu)化，它們的最佳濃度分別是弓嫩FIP和B1P各1.6 pM，弓胸F3和B3各0.2 一，四禾中dNTP 各1.4mM， BetainelM。最終確定的反應(yīng)體系為引物FIP和BIP各1.6^M，弓|物F3禾Q B3各0.2 ^M， dNTP 1.4mM， MgCI2 8 mM， Betaine (甜熟減)1 M， Tris-HCl 20 mM， KCI 10mM， MgS04 2 mM, 4 10mM， TritonX-1000.1%，待檢樣品DNA模板1 )iL， &f DNA聚合酶8U。按照i:^體系要求配制反 應(yīng)混合物，混勻后，到無(wú)菌Eppendorf管中(規(guī)格為200pL)，然后加入雙蒸7W吏各Eppendorf管中反 應(yīng)體系的總^iRiifi」25 ^L。在反應(yīng)禾辨中，擴(kuò)徵鵬過(guò)高(如65。C) ^il低(如60。C)均不利于LAMP反應(yīng)獲得衝封戈果， 本發(fā)明J^共的弓鵬和細(xì)本發(fā)明確定的反應(yīng)體系時(shí)，其擴(kuò)i獸鵬為62 °d 。C，最佳的鵬ag為63°C。 另夕卜，反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物量也繊大影響，在反應(yīng)時(shí)間少于45併中時(shí)，無(wú)7敘見測(cè)到反應(yīng)產(chǎn)物，為保證 LAMP反應(yīng)產(chǎn)^S夠的產(chǎn)物便于觀測(cè)，本發(fā)明中反應(yīng)時(shí)間確定為1個(gè)小時(shí)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束時(shí)應(yīng)在80 。C 保溫5 6H中以滅活DNA聚合酶。所以，謝亍LAMP檢測(cè)時(shí)，需將iiS含有反應(yīng)體系的Eppendorf管放 A7K浴鍋或金屬浴中，63 。C保溫1個(gè)小時(shí)，然后80 。C保溫5 ^H中。LAMP反應(yīng)結(jié)束后，即可在反應(yīng)產(chǎn)物中加入核麟料謝亍檢測(cè)結(jié)果的判斷，本發(fā)明中〗頓的核麟 料為廈門百維信生物科技有限公司商品化生產(chǎn)的GeneFinder，。在反應(yīng)產(chǎn)物中加入100倍稀釋的 GeneFinder 2-，用卿青觀察所測(cè)i對(duì)羊品的LAMP反應(yīng)產(chǎn)物，如果顯/i^絶貝'J悉亍該樣品的大穀平紅體病蟲i^病毒檢測(cè)結(jié)果為附性，如果顯示橙黃色則標(biāo)該樣品的大穀移工體病蟲:iB病毒檢測(cè)結(jié)果為陰性。實(shí)施例1用LAMP方法檢測(cè)魚體內(nèi)的TRBIV首先按照本發(fā)明^f共的LAMP弓嫩序列合鵬于TRBIV檢測(cè)的LAMP弓,FIP、 BIP、 F3和B3 。 然后根據(jù)以下步3，行TTRBIV病毒的檢測(cè)。(1) 制^t寺1t樣品的LAMP反j3Ztlfc取待檢魚的脾臟組織0.5克，翻天根生化禾^1有限公司組織基因組DNA提取試劑盒(TTANamp Genomic DNAKit)進(jìn)《3且織DNA的提取和純化，制備LAMP反應(yīng)的DNA豐鎌，具4權(quán)取和純化步驟參見該試劑盒的操作說(shuō)明書。(2) 配制LAMP反應(yīng)體系!UO^制備的DNAt對(duì)及l(fā)(iL，加入到如下反應(yīng)體系中-弓胸FIP和BIP各1.6pM，引物F3和B3 各0.2,， dNTP1.4mM， MgCl28mM， Betaine (甜熟咸)1 M， Tris-HCl 20 mM， KC110mM， MgS04 2mH(NH02SO410mM， TritonX-100 0.1%， 聚合酶8U;加入雙蒸TK使反應(yīng)體系的總體積龍到25)iL。(3) 按照如下反i^Mff進(jìn)行LAMP反應(yīng) 63 。C保溫60併中，然后80 。C保溫5併中。(4) 判斷LAMP檢測(cè)結(jié)果反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)體系中加入100倍稀釋的GeneFinder 2 ^，然后用目郞青觀察被測(cè)樣品的LAMP 反i^物，如果顯示纟絶則恭示該樣品的大菱鲆紅體病虹彩病毒檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，如果顯示橙黃色則表 示該樣品的大穀轉(zhuǎn)工體病蟲I^病毒樹則結(jié)果為陰性。禾,J^方法已經(jīng)完成了取自山東、遼寧、河北的36份大穀平樣品的樹則，檢測(cè)結(jié)果顯示，凡^^2TRBIV的PCR檢測(cè)方法確定為陽(yáng)性的樣品，LAMP檢測(cè)方法均能檢測(cè)到TRBIV的被；而其中兩傷資 TRBIV的PCR檢測(cè)方法確定為陰性的樣品，用LAMP檢測(cè)方法卻檢測(cè)出TRBIV的存在，后艦PCR 檢測(cè)方法的循環(huán)數(shù)增加到40，從這兩份樣品中又檢測(cè)到了 TTRBIV，這說(shuō)明PCR檢測(cè)方法可能會(huì)出現(xiàn)漏 檢的情況，這也反映出該LAMP檢測(cè)方法比PCR檢測(cè)方法具有更高的靈每娘和可靠性。實(shí)施例2用于TRBIV檢測(cè)的LAMP方法禾口 PCR方法的靈每娘測(cè)定及比較用TRBIV主要衣殼蛋白基因(MCP)特異的PCR弓l物(MCP-sense:5'-CACCATGTCTGCAATCTTA-GGT-3'和MCP-anti-sense primer: 5'-TTACAGGATAGGGAAGCCTGC-3')擴(kuò)增TRBIV主要衣殼蛋白基因 的錄序列，并構(gòu)建到載體pDEST32中，獲得含有TRBIV MCP基因錄的質(zhì)粒pDEST32-MCP，然后 測(cè)定質(zhì)粒濃度并作10倍的梯度稀釋。將±^稀釋后的質(zhì)粒用作LAMP反應(yīng)的徵及分別謝亍擴(kuò)增，用繊交電泳分析LAMP的反應(yīng)產(chǎn)物， 結(jié)果顯示本發(fā)明^f共的LAMP檢測(cè)方法對(duì)TRBIV的檢測(cè)極限為101個(gè)拷貝的病毒粒子。同時(shí)，將Jt^梯度稀釋的質(zhì)粒用作PCR反應(yīng)的樹及，禾,大穀平TRBIV主要衣殼蛋白基因特異的 PCR弓l物(MCP-F: 5，-CGTGTTAAGATCCCCTCC-3，和MCP-R: 5，-TCTCGTAAATGAGTGACACC -3，)，按照如下反應(yīng)，1^>別進(jìn)行擴(kuò)增94。C變性4min， 1個(gè)循環(huán)；94。C變性50s， 58。C退火50s， 72。C延伸lmin， 35個(gè)循環(huán)； 72。C延伸10min， 1個(gè)循環(huán)；然后在2X的瓊臘糖綱交電泳上分析PCR產(chǎn)物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCR方法對(duì)TRBIV的檢測(cè)柳艮僅僅為 lf個(gè)拷貝病毒粒子。可見，本發(fā)明所掛共的大穀平紅體病虹籠病毒LAMP檢測(cè)方法比目前用于該病毒檢測(cè)的PCR方法 靈敏度高10倍。
權(quán)利要求
1.一種大菱鲆紅體病虹彩病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，其特征在于它的方法包括以下兩部分1).提供兩對(duì)用于檢測(cè)大菱鲆紅體病虹彩病毒的LAMP引物序列，即長(zhǎng)度分別為45bp、46bp、18bp和18bp的寡聚核苷酸序列，依次命名為FIP、BIP、F3和B3；上述兩對(duì)LAMP引物的寡聚核苷酸序列如下FIP5’-TGCGGTGGGTGACGTTCTTTACTTTTCTTGGTGCATCTGGACCTC-3’BIP5’-ACGTGCAAAGCAATTACACCGCTTTTGCAAAGGCAGATTGACCTTG-3’F35’-GTCACACCCGCAGACAAT-3’B35’-ACCTCGGACAGGGGATTG-3’2).提供一種大菱鲆紅體病虹彩病毒的LAMP檢測(cè)方法，即首先從待檢測(cè)樣品中制備反應(yīng)模板，并配制LAMP反應(yīng)體系，然后通過(guò)LAMP反應(yīng)程序?qū)Ψ磻?yīng)模板進(jìn)行擴(kuò)增，最后根據(jù)反應(yīng)混合物的顏色顯示對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判斷。
2. 如權(quán)利要求書1所述的大菱鲆紅體病虹彩病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè) 方法，其特征在于所述的LAMP反應(yīng)體系引物FIP和BIP各1.6 pM， 弓i物F3和B3各0.21pM，dNTP1.4mM， MgCl2 8 mM, Betaine 1 M，Tris-HCl 20 mM, KC1 lOmM, MgS04 2 mM, (NH4)2S04 10 mM, Triton X-100 0.1% ， 待檢樣品DNA 1 |iL， 5WDNA聚合酶8U，該反應(yīng)體系的總體積為25 pL。
3. 如權(quán)利要求書1所述的大菱鲆紅體病虹彩病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè) 方法，其特征在于所述的LAMP反應(yīng)程序63 。C保溫60分鐘，然后80 °C 保溫5分鐘。
4. 如權(quán)利要求書1所述的大菱鲆紅體病虹彩病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè) 方法，其特征在于所述的LAMP檢測(cè)結(jié)果判斷方法LAMP反應(yīng)結(jié)束后， 在反應(yīng)體系中加入100倍稀釋的GeneFinderTM 2 |iL，然后在陽(yáng)光下觀察 被測(cè)樣品LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的顏色，如果是綠色則表示該樣品的大菱鲆紅體 病虹彩病毒檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，如果是橙黃色則表示該樣品的大菱鲆紅體病 虹彩病毒檢測(cè)結(jié)果為陰性。
全文摘要
本發(fā)明公開一種大菱鲆紅體病虹彩病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測(cè)方法。該方法包括兩對(duì)用于檢測(cè)大菱鲆紅體病虹彩病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物FIP、BIP、F3與B3，和一種利用上述兩對(duì)引物檢測(cè)大菱鲆紅體病病毒虹彩病毒的LAMP方法，其中包括反應(yīng)模板的制備、LAMP反應(yīng)體系、LAMP反應(yīng)程序和檢測(cè)結(jié)果判斷。本發(fā)明具有簡(jiǎn)便、快速、高特異性和靈敏性的特點(diǎn)，僅需一個(gè)水浴鍋或金屬浴即可在2小時(shí)內(nèi)準(zhǔn)確檢測(cè)出魚苗、成魚及飼料中的大菱鲆紅體病虹彩病毒，非常適用于大菱鲆紅體病虹彩病毒的流行情況調(diào)查。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK101245395SQ20081001515
公開日2008年8月20日 申請(qǐng)日期2008年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月13日
發(fā)明者史成銀, 宋曉玲, 張慶利, 冰 楊, 倢 黃 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所