專利名稱：一種鰻弧菌快速檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)技術(shù)進行菌樣的快速檢 測的方法，具體是一種鰻弧菌快速檢測試劑盒的制備和檢測方法。
背景技術(shù)：
鰻弧菌(Vibrio cholerae)是一種廣泛分布于海洋和淡水環(huán)境中的革 蘭氏陰性短桿菌，生長溫度為10度-35度，最適生長溫度25度左右；適宜 生長的鹽濃度為1%左右。生長PH值為6-10，最適生長PH值為8左右。能 夠引起養(yǎng)殖魚類的皮膚潰爛、肌體出血和死亡，危害十分巨大。鰻鱺弧菌 病主要癥狀是各鰭條出血發(fā)紅，肛門紅腫，軀干部皮膚褪色、糜爛或隆起。 有的病魚體表出現(xiàn)出血性潰瘍。腸道通常有充血。肝臟腫大呈土黃色，有 出血斑。診斷鰻鱺弧菌病單獨依靠觀察癥狀還很難判斷，必須釆用血清學(xué) 方法或通過病原的分離鑒定。目前病原性鰻弧菌的檢測方法主要有、熒光 抗體技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗和16srRNA基因探針雜交技術(shù)，這些方法在 檢測時間、穩(wěn)定性、敏感性等方面存在著一些不足。
以往檢測鰻弧菌的主要方法有三種1.生理生化鑒定技術(shù)，該法費時， 操作繁瑣，不能滿足病害防治的需要；2.酶聯(lián)免疫吸附試驗，3.聚合酶鏈 式反應(yīng)法(PCR法)，該方法較前兩種方法快速、靈敏，但需要昂貴的PCR
儀。目前尚未見用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法檢測鰻弧菌的試劑盒及方法。 發(fā)明的內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鰻弧菌快速檢測試劑盒及其檢測方法。 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明釆用的技術(shù)方案為
試劑盒l(wèi)-2mL環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)液、AO. 5-1. 5U/ju L UNG酶、6-10 U/iaLBstDNA聚合酶B和l-3)iL顯色劑C;顯色劑C體積濃度為5%-20%;
其中，每升環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)液A含1-2 mL lOxThermopol反應(yīng)緩 沖液、300 - 500 jumoldNTP、 2-4 mmol硫酸鎂、0. 8 - 1. 2 ju mol上游內(nèi)引 物、0.8-1.2jumo1下游內(nèi)引物、0.2-0.3jumol上游外引物、0. 2 _ 0. 3 m mol下游外引物和1-1.5 mol甜菜堿；
上游內(nèi)引物5- GCATGATGGCGCAGCAAATTTAACCGCCTGCTTTTGTTC -3、下游 內(nèi)引物5- CGTAAACTTGGCCGATACCTTTCTTTACCGGTCTTTAATA CGTCAG —3、上游 外引物5- GGTAATGCGTAAGTGCAATA -3、下游外引物5- CCAGCAGATGTATCATGGT -3。
所述 dNTP 內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的質(zhì)量比為 dUTP: dATP: dGTP: dCTP-l: 1: 1: 1到2: 1: 1: 1。所述每升10 x Thermopol反應(yīng) 緩沖液含100-300mmo1 pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、80—120n腦l
4氯化鉀、80-120隱o1硫酸銨、10-30 mmol硫酸鎂和0. 8-1.5 %曲拉通X-100;所述顯色劑為熒光染料SYBR GREEN I或DNAGreen。 檢測方法
1) 待檢樣品或細菌DNA的提取取200 mg待檢樣品加入到500-800juL 蒸餾水中調(diào)制勻漿后，再加入加入l. 0-1.5 mL滅菌雙蒸水混勾，而后一 并加入到加入100 - 150juL滅菌雙蒸水中混勾，并于IO(TC沸水洛中加熱 10-15 min，待水浴后將其以10000-12000轉(zhuǎn)/分離心5 - 10 min，取上清 即為待檢樣品模板DNA,待用；
2) 鰻弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增
在21-23 u L環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入1-2 ju L待檢樣品 模板DNA和，0. 5-1. 5U/)iL的UNG酶，于恒溫95 。C放置3-5min,而后 置于冰上1-3min;待冷卻后加入6-10 U/n L Bst DNA聚合酶B，于恒溫 60 - 65 。C放置45 - 90 min,而后再將溫度調(diào)到80 _ 95 。C中止反應(yīng)，3-5 min后待用；
3) 顯色檢測在反應(yīng)液中加入l-3nL顯色劑C，觀察顏色變化；
其中，每升環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)液A含lOxThermopol反應(yīng)緩沖液、300 -500 jumoldNTP、 2-4 mmol硫酸鎂、0. 8-1.2 jumol上游內(nèi)引物、0.8-1. 2 iamol下游內(nèi)引物、0. 2 - 0. 3jumo1上游外引物、0. 2 - 0. 3jumo1下游夕卜 引物和1 - 1. 5 mol甜菜堿；
上游內(nèi)弓l物5- GCATGATGGCGCAGCAAATTTAACCGCCTGCTTTTGTTC -3、下游 內(nèi)引物5- CGTAAACTTGGCCGATACCTTTCTTTACCGGTCTTTAATA CGTCAG -3、上游 外引物5-GGTAATGCGTAAGTGCAATA-3、下游外引物5-CCAGCAGATGTATCATGGT -3。
所述 dNTP 內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的質(zhì)量比為 dUTP: dATP: dGTP: dCTP=l: 1: 1: 1到2: 1: 1: 1。所述每升10 x Thermopol反應(yīng) 緩沖液含100-300mmol pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、80-120mmol 氯化鉀、80-120mmo1硫酸銨、10-30 mmol硫酸鎂和0. 8-1. 5%曲拉通X-100;所述顯色劑為熒光染料SYBR GREEN I或DNAGreen。所述步驟3)顏 色變化，若顏色為黃色，說明待檢樣品不含或者不是鰻弧菌，若顏色變?yōu)?綠色，則說明待檢樣品含有或為鰻弧菌。
本發(fā)明的主要原理為(1)特殊設(shè)計一組可以識別靶DNA六個不同序 列的兩個內(nèi)引物(上游內(nèi)引物和下游內(nèi)引物)和兩個外引物(上游外引物 和下游外引物)，內(nèi)引物包含靶DNA的正義鏈和反義鏈；(2)其中一個內(nèi)引 物首先和靶DNA雜交，隨后的鏈置換DNA合成在具有高度鏈置換活性的DNA 聚合酶的參與下由一個外引物啟動，釋放出單鏈DNA,并作為由雜交到靶的 另一端的一個內(nèi)引物和一個外引物啟動的DNA合成模板，產(chǎn)生一個原始的 莖環(huán)DNA; (3)內(nèi)引物以原始莖環(huán)DNA做模板，啟動鏈置換DNA的合成，產(chǎn) 生一個原始的莖環(huán)DNA和一個新的由兩倍莖長度的莖環(huán)DNA; ( 4 )在等溫條件下，內(nèi)引物以莖環(huán)DNA為模板，通過鏈置換形成多個含有靶DNA重復(fù)序 列的莖環(huán)薩A，在一小時內(nèi)該循環(huán)反應(yīng)可使耙DNA累積到109拷貝，可通過 熒光染料來觀察擴增結(jié)果。 本發(fā)明所具有的優(yōu)點
本發(fā)明建立了鰻弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測試劑盒及檢測方法，所述 試劑盒根據(jù)鰻弧菌的empA基因的基本保守區(qū)的六個序列設(shè)計了兩個特異性 內(nèi)引物和兩個特異性外引物，該保守基因序列為鰻弧菌各不同血清型和菌 株型所共有，以保證從種的水平上檢測不同來源的鰻弧菌株的可靠性。本 發(fā)明采用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)技術(shù)，該技術(shù)特異性強，與PCR檢測方 法有相同的高靈敏度，但不需要昂貴的PCR儀，只需普通的水浴鍋即可， 且結(jié)果不必用凝膠電泳方法來觀察，使用熒光染料來觀察即可，簡單而快 速。可用于鰻弧菌的檢測，特別適用于基層醫(yī)療機構(gòu)以及養(yǎng)殖場現(xiàn)場應(yīng)用。 從而為水產(chǎn)養(yǎng)殖和食品安全提供科學(xué)的依據(jù)和指導(dǎo)作用。
具體實施例方式
下列實施例進 一 步說明本發(fā)明，但不應(yīng)當作對本發(fā)明的限制。 實施例1
試劑盒1)環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)液含有2. 5 iaL 10 x Thermopol反 應(yīng)緩沖液、1. OuL 10睡l/LdNTP、 1.0 ja L 20 |a mol/L上游內(nèi)引物(FIP )、 1. OjiL 20jumol/L下游內(nèi)引物(BIP)、 0. 25 n L 20 |umol/L上游外引物(F3)、 0. 25|aL 20|iimol/L下游外引物(B3)、 0, 5 ju L 100mmol/L MgS04、 12. 5juL 2 mol/L甜菜堿和4|iL ddH20 (滅菌雙蒸水)。
其中，所述的上游內(nèi)引物5-GCATGATGGCGCAGCAAATTTAACCGCCTGCTTTTGTTC -3、下游內(nèi)引物5- CGTAAACTTGGCCGATACCTTTCTTTACCGGTCTTTAATA CGTCAG -3 、上游外引物5- GGTAATGCGTAAGTGCAATA -3 、下游外引物5-CCAGCAGATGTATCATGGT -3其中dNTP內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的混合物的質(zhì) 量比為dUTP: dATP: dGTP: dCTP=2: 1: 1: 1，所述每升10 x Thermopol反應(yīng)緩 沖液含200ramo1 pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、lOO隱ol氯化鉀、 lOOmmol硫酸銨、20mmo1硫酸鎂和1 %曲拉通X - 100。
2) 1 U/mL UNG酶(購自New England Biolabs )、 8U / |i L Bst DNA聚合 酶B (購自于New England Biolabs )和1 |a L體積濃度為10 %的熒光染料SYBR GREEN I (購自天根生物有限公司)。
檢測方法
1)待檢樣品或細菌DNA的提取取200 mg待檢樣品加入到500juL蒸 餾水中調(diào)制勻漿后，再加入加入1.0-1.5 mL滅菌雙蒸水混勻，而后一并 加入到加入IOOiliL滅菌雙蒸水中混勻，并于10(TC沸水洛中加熱lOmin, 待水浴后將其以10000轉(zhuǎn)/分離心10 min，取上清即為待檢樣品模板DNA, 待用；
2 )鰻弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增在23 ju L環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入1iliL待檢樣品模板DNA和，1 U/juL的UNG酶，于恒溫95 。C放 置5min，而后置于冰上lniin;待冷卻后加入8 U/ji L Bst DNA聚合酶B, 于恒溫65 。C放置60 min,而后再將溫度調(diào)到8(TC中止反應(yīng)，3 min后待
用；
3)顯色檢測在待檢的每個反應(yīng)管中加入l juL體積濃度為10%的熒 光染料SYBR GREEN I，直接用肉眼觀察顏色變化，如果顏色為黃色，說明 待檢樣品不含或者不是鰻弧菌，如果顏色變?yōu)榫G色，則說明待檢樣品含有 或者為鰻弧菌。
其中，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)液含有2.5 mL lOxThermopol反應(yīng)緩沖 液、1. 0 juL 10 mmol/L dNTP、 1.0 ju L 20 p mol/L上游內(nèi)引物(FIP )、 1.0 liL 20jumol/L下游內(nèi)引物(BIP )、 0.25|iL 20 p mol/L上游外引物(F3)、 0. 25 iaL 20jumol/L下游外引物(B3)、 0. 5 |i L 100mmol/L MgS04、 12. 5juL 2 mol/L甜i堿和4|uL ddH20 (滅菌雙蒸水)。
上游內(nèi)引物5- GCATGATGGCGCAGCAAATTTAACCGCCTGCTTTTGTTC —3、下游 內(nèi)引物5- CGTAAACTTGGCCGATACCTTTCTTTACCGGTCTTTAATA CGTCAG —3、上游 外引物5-GGTAATGCGTAAGTGCAATA-3、下游外引物5-CCAGCAGATGTATCATGGT -3 (參見序列表)。所述dNTP內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的質(zhì)量比dUTP: dATP: dGTP: dCTP=2: 1: 1: 1。所述每升10 x The簡pol反應(yīng)緩沖液含 200mmol pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、100隱o1氯化鉀、100隱o1 硫酸銨、20mmol硫酸鎂和1%曲拉通X-100。 實施例2
與實施例1不同之處在于 試劑盒l(wèi)mL環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)液A、 0. 5U/ |a L UNG酶、6U/ n L Bst DNA 聚合酶B和3jaL體積濃度為5%的熒光染料DNAGreen (購自天根生物有限 公司)。
其中，每升環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)液A含lniL 10 x Thermopol反應(yīng)緩沖液、 300jLimoldNTP、 2mmo1硫酸鎂、0. 8 ju mol上游內(nèi)引物、0.8|amol下游內(nèi)引 物、0. 2jumo1上游外引物、0.2|amol下游外引物和lmol甜菜堿。每升10 x Thermopol反應(yīng)緩沖液含lOOmmol pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、 80-120mmo1氯化鉀、80隱o1硫酸銨、10mmo1硫酸鎂和0. 8 %曲拉通X - 100; 所述dNTP內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的混合物的質(zhì)量比為 dUTP: dATP: dGTP: dCTP=2: 1: 1: 1。 檢測方法
1)待檢樣品或細菌DNA的提取取200 mg待檢樣品加入到600 pL蒸 餾水中調(diào)制勻漿后，再加入加入1. 0-1. 5 mL滅菌雙蒸水混勻，而后一并 加入到加入150|aL滅菌雙蒸水中混勻，并于100。C沸水浴中加熱15min， 待水浴后將其以12000轉(zhuǎn)/分離心5min，取上清即為待檢樣品模板DNA，待
用；2 )鰻弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增在23 m L環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)液A的反應(yīng) 管中加入2jaL待檢樣品模板DNA和，0. 5U/|i L UNG酶，于恒溫95 。C放置 3 min，而后置于冰上3min;待冷卻后加入6U/jhL Bst DNA聚合酶B,于 恒溫65 'C放置90min，而后再將溫度調(diào)到95'C中止反應(yīng)，5min后待用；
3)顯色檢測在待檢的每個反應(yīng)管中加入3yL體積濃度為5%的熒光 染料DNAGreen,直接用肉眼觀察顏色變化，如果顏色為黃色，說明待檢樣 品不含或者不是鰻弧菌，如果顏色變?yōu)榫G色，則說明待檢樣品含有或者為 鰻弧菌。
實施例3
與實施例l不同之處在于
試劑盒2mL環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)液A、 1. 5U/n L UNG酶、10U/yLBst DNA聚合酶B和2nL體積濃度為20。/。的熒光染料SYBR GREEN I。
其中，每升環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)液A含2 mL lOxThermopol反應(yīng)緩沖 液、500 |imoldNTP、 4mmol硫酸鎂、1. 2 jumol上游內(nèi)引物、1.2jamol下游 內(nèi)引物、0. 3jumo1上游外引物、0. 3jumo1下游外引物和1. 5 mol甜菜堿。 所述dNTP內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的混合物的質(zhì)量比為 dUTP: dATP: dGTP: dCTP=l. 5: 1: 1: 1;所述每升10 x Thermopol反應(yīng)緩沖液含 300腿o1 pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、120隱o1氯化鉀、120mmo1 硫酸銨、30 mm。1硫酸鎂和1. 5%曲拉通X-100。 檢測方法
1 )待檢樣品或細菌DNA的提取取200 mg待檢樣品加入到800 pL蒸 餾水中調(diào)制勻漿后，再加入加入1.2 mL滅菌雙蒸水混勻，而后一并加入到 加入140jaL滅菌雙蒸水中混句，并于IO(TC沸水浴中加熱10min,待水洛 后將其以11000轉(zhuǎn)/分離心8min，取上清即為待檢樣品模板DNA，待用；
2 )鰻弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增在22 n L環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)液A的反應(yīng) 管中加入1.5juL待檢樣品模板DNA和1.5U/juL UNG酶，于恒溫95 。C放 置3min，而后置于冰上3min;待冷卻后加入10 U/ja L Bst DNA聚合酶B, 于恒溫65匸放置90 min，而后再將溫度調(diào)到95。C中止反應(yīng)，5 min后待 用；
3)顯色檢測在待檢的每個反應(yīng)管中加入2pL體積濃度為20%的熒光 染料SYBR GREEN I,直接用肉眼觀察顏色變化，如果顏色為黃色，說明待 檢樣品不含或者不是鰻弧菌，如果顏色變?yōu)榫G色，則說明待檢樣品含有或 者為鰻弧菌。
實施例4
與實施例1不同之處在于
試劑盒1.5mL環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)液A、 1U/nLUNG酶、7U/MLBst DNA聚合酶B和linL體積濃度為15。/。的熒光染料DNAGreen。
其中，每升環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)液A含1.5mL 10 x Thermopol反應(yīng)緩沖液、400jumoldNTP、 3mmo1硫酸鎂、1 ili mol上游內(nèi)引物、ljamol下游內(nèi) 引物、0. 25 jumol上游外引物、0. 25jamo1下游外引物和1.25 mol甜菜堿； 每升lOxThermopol反應(yīng)緩沖液含200mmo1 pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷 -鹽酸、lOOmmol氯化鉀、lOOmmol硫酸銨、20mmo1硫酸鎂和1 %曲拉通X -100。
檢測方法-.
1 )待檢樣品或細菌DNA的提取取200 mg待檢樣品加入到700 ML蒸 餾水中調(diào)制勻漿后，再加入加入l. 0-1.5 mL滅菌雙蒸水混勻，而后一并 加入到加入120juL滅菌雙蒸水中混勾，并于IO(TC沸水浴中加熱13 min, 待水洛后將其以10000轉(zhuǎn)/分離心8 min，取上清即為待檢樣品模板DNA， 待用；
2) 鰻弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增
在21 n L環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入1 n L待檢樣品模板 DNA和，lU/juLUNG酶iiL的UNG酶，于恒溫95 。C放置4min,而后置于冰 上2min;待冷卻后加入7 U/ju L Bst DNA聚合酶B,于恒溫63。C放置80min， 而后再將溫度調(diào)到85'C中止反應(yīng)，4min后待用；
3) 顯色檢測在反應(yīng)液中加入lpL體積濃度為15%的熒光染料 DNAGreen，觀察顏色變化。SEQUENCE LISTING U10>中閨科學(xué)院海洋研究所
〈120> —種鰻弧菌快速檢測試劑盒及;it檢測方法
<130>
<160〉 4
〈170> Patentln version 3. 1
<210> 1
<211> 39
<212> 腿
<213〉 人丁序列
、220〉
〈221> prim—bind
〈222〉 (1)..(39) <223>
<400〉 1
gcatgatggc gcagcaaat.t taaccgcctg cttttgttc 39
〈210〉 2
〈211〉 46
<212〉 DNA <213〉人工序列
<220>
<221> prim—bind
〈222〉 (1)..(46) <223〉
〈400〉 2
cgt,aaacttg gccgatacct t,tctttaccg gtctttaata cgtcag 46
〈210〉 3
<211> 20
<212> 脆<213> 人丁序列 〈220〉
<221〉 pi'im_bind
<222> (1)..(20) 〈223〉
<400〉 3
ggtaatgcgt aagtgcaat,a 20
<210> 4
<211> 19
<212> 隱 <213>人工序列
<220〉
<221〉 prim—bind
<222> (1)..(19) <223〉
<柳〉4
ccagcagatg tatcatggt 19
權(quán)利要求
1.一種鰻弧菌快速檢測試劑盒，其特征在于1-2mL環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)液A、0.5-1.5U/μL UNG酶、6-10U/μL BstDNA聚合酶B和1-3μL顯色劑C；其中，每升環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)液A含1-2mL 10×Thermopol反應(yīng)緩沖液、300-500μmoldNTP、2-4mmol硫酸鎂、0.8-1.2μmol上游內(nèi)引物、0.8-1.2μmol下游內(nèi)引物、0.2-0.3μmol上游外引物、0.2-0.3μmol下游外引物和1-1.5mol甜菜堿；上游內(nèi)引物5-GCATGATGGCGCAGCAAATTTAACCGCCTGCTTTTGTTC-3、下游內(nèi)引物5-CGTAAACTTGGCCGATACCTTTCTTTACCGGTCTTTAATA CGTCAG-3、上游外引物5-GGTAATGCGTAAGTGCAATA-3、下游外引物5-CCAGCAGATGTATCATGGT-3。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鰻弧菌快速檢測試劑盒，其特征在于所述 dNTP內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的質(zhì)量比為dUTP: dATP: dGTP: dCTP=l: 1: 1: 1到 2: 1: 1: 1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鰻弧菌快速檢測試劑盒，其特征在于所述 每升10xThermopo1反應(yīng)緩沖液含100-300mmol pH8. 8的三羥基甲基氨基 甲烷-鹽酸、80-120隱o1氯化鉀、80-120mmol硫酸銨、10-30 mmol硫酸鎂 和0. 8-1.5 %曲拉通X-100;所述顯色劑為熒光染料SYBR GREEN I或 DNAGreen。
4. 一種鰻弧菌快速檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于1) 待檢樣品或細菌DNA的提取取200 mg待檢樣品加入到500-800|aL 蒸餾水中調(diào)制句漿后，再加入加入1.0-1.5 mL滅菌雙蒸水混勻，而后一 并加入到加入100 - 150jiL滅菌雙蒸水中混勻，并于IOO'C沸水洛中加熱 10-15min，待水浴后將其以10000-12000轉(zhuǎn)/分離心5 - 10 min，取上清 即為待檢樣品模板DNA，待用；2) 鰻弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增在21-23 ni L環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入1_2 ja L待檢樣品 模板DNA和，0. 5-1.5U/iiL的UNG酶，于恒溫95 。C放置3-5min，而后 置于冰上1-3min;待冷卻后加入6-10 U/ju L Bst DNA聚合酶B，于恒溫 60 - 65 。C放置45 - 90 min,而后再將溫度調(diào)到80 - 95 。C中止反應(yīng)，3-5 min后待用；3) 顯色檢測在反應(yīng)液中加入1-3pL顯色劑C,觀察顏色變化；其中，每升環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)液A含10xThermopo1反應(yīng)緩沖液、300 _ 500 jumoldNTP、 2-4 mmol硫酸鎂、0. 8-1.2 iamol上游內(nèi)引物、0.8-1. 2 jumol下游內(nèi)引物、0. 2 - 0. 3|amol上游外引物、0. 2 - 0. 3|amol下游外 引物和1-1.5 mol甜菜堿；上游內(nèi)引物5- GCATGATGGCGCAGCAAATTTAACCGCCTGCTTTTGTTC -3、下游 內(nèi)引物5_ CGTAAACTTGGCCGATACCTTTCTTTACCGGTCTTTAATA CGTCAG -3、上游 外引物5-GGTAATGCGTAAGTGCAATA-3、下游外引物5-CCAGCAGATGTATCATGGT-3。
5.按權(quán)利要求4所述的鰻弧菌快速檢測試劑盒的檢測方法，其特征在 于所述dNTP內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的質(zhì)量比為 dUTP: dATP: dGTP: dCTP=l: 1: 1: 1到2: 1: 1: 1。
6.按權(quán)利要求4所述的鰻弧菌快速檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于 所述每升lOxThermopol反應(yīng)緩沖液含100-300mmol pH8. 8的三羥基甲基 氨基甲烷-鹽酸、80-120隱o1氯化鉀、80-120mmol硫酸銨、10-30 mmol硫 酸鎂和0. 8-1.5M曲拉通X-100;所述顯色劑為熒光染料SYBR GREEN I或 DNAGreen。
7.按權(quán)利要求4所述的鰻弧菌快速檢測試劑盒的檢測方法，其特征在 于所述步驟3)顏色變化，若顏色為黃色，說明待檢樣品不含或者不是鰻 弧菌，若顏色變?yōu)榫G色，則說明待檢樣品含有或為鰻弧菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)進行菌樣的快速檢測的方法，具體是一種鰻弧菌快速檢測試劑盒的制備和檢測方法。試劑盒包括1-2mL環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)液A、0.5-1.5U/μL UNG酶、6-10U/μL Bst DNA聚合酶B和1-3μL顯色劑C；；上游內(nèi)引物5-GCATGATGGCGCAGCAAATTTAACCGCCTGCTTTTGTTC-3、下游內(nèi)引物5-CGTAAACTTGGCCGATACCTTTCTTTACCGGTCTTTAATA CGTCAG-3、上游外引物5-GGTAATGCGTAAGTGCAATA-3、下游外引物5-CCAGCAGATGTATCATGGT-3。本發(fā)明的試劑盒快速、特異性強、靈敏度高而且成本低，可用于鰻弧菌的檢測，特別適用于基層醫(yī)療機構(gòu)以及養(yǎng)殖場現(xiàn)場應(yīng)用。從而為水產(chǎn)養(yǎng)殖和食品安全提供科學(xué)的依據(jù)和指導(dǎo)作用。
文檔編號C12Q1/04GK101307350SQ200810015289
公開日2008年11月19日 申請日期2008年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月18日
發(fā)明者李富花, 相建海, 莫照蘭, 高宏偉 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所