專利名稱：：一種粗毛栓菌及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種擔(dān)子菌，尤其涉及一種耐熱性漆酶產(chǎn)生真菌菌株粗毛栓菌，屬微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。(二)
背景技術(shù)：
：漆酶是一種含金屬離子的糖蛋白，屬于多銅氧化酶家族，它分布于動(dòng)物、植物、真菌、細(xì)菌當(dāng)中，特別是在真菌和細(xì)菌中廣泛存在。漆酶能夠利用氧氣作為電子供體直接氧化芳香族化合物底物或者介體，還可以在介體的介導(dǎo)作用下氧化大分子的木質(zhì)素或者氧化還原電勢(shì)較高的非酚型芳香族化合物。熱穩(wěn)定性是限制漆酶廣泛應(yīng)用的一個(gè)瓶頸，分離得到熱穩(wěn)定性好的菌株對(duì)于擴(kuò)大漆酶的應(yīng)用范圍、延長(zhǎng)漆酶的應(yīng)用時(shí)間、降低漆酶的應(yīng)用成本有著重要的意義。漆酶被首先發(fā)現(xiàn)于植物中，隨著人們的研究表明漆酶并非僅僅存在于植物中，而且漆酶也不僅僅是人們所認(rèn)為的四聚體，還存在著二聚體和單體的漆酶蛋白。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展特別是基因組測(cè)序物種的日益增多和Blast技術(shù)和同源模建技術(shù)的發(fā)展人們發(fā)現(xiàn)漆酶在細(xì)菌中也是廣泛存在的。不論是真菌中的漆酶還是植物、細(xì)菌以及動(dòng)物中的漆酶在其序列方面表現(xiàn)出了很大的差異，而且在酶學(xué)性質(zhì)上也表現(xiàn)出很大的差異。目前發(fā)現(xiàn)的耐熱性好的漆酶多集中在細(xì)菌中，但其存在著產(chǎn)量低、對(duì)金屬銅離子依賴等局限，而高產(chǎn)的真菌菌株并不多見。目前，耐熱性的漆酶在紙漿造紙、印染廢水處理、食品工程以及有機(jī)合成當(dāng)中已經(jīng)被使用，高產(chǎn)、耐熱的漆酶在工業(yè)生產(chǎn)中有著重要的應(yīng)用前景。(三)
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種具有高產(chǎn)耐熱性漆酶的菌株粗毛栓菌(rrs歷""lg-9及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用。一種粗毛栓菌(rra/etes"r卯te)lg-9，該菌種已經(jīng)于2008年03月26日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCNo.2422。本發(fā)明涉及的粗毛栓菌lg-9是從蒙山通過選擇性培養(yǎng)基分離得到的一株擔(dān)子菌。該菌株在采集子實(shí)體后，通過選擇性培養(yǎng)基分離得到，通過與本實(shí)驗(yàn)室收藏以及分離得到的產(chǎn)漆酶菌株進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)該菌株生長(zhǎng)迅速，具有較高的產(chǎn)漆酶能力且產(chǎn)生的漆酶具有很強(qiáng)的溫度耐受性。該粗毛栓菌lg-9具有如下生物學(xué)特征活化后的粗毛栓菌1g-9在麩皮浸出液培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，5天左右能長(zhǎng)滿10cm平板，初生菌絲白色，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)菌絲變黃。該菌能夠產(chǎn)生子實(shí)體，子實(shí)體無(wú)柄，側(cè)生，木栓質(zhì)。菌蓋1.55.0cmX28cm,厚525mra，有白色或黃白色的粗毛束，有同心環(huán)帶。菌肉白色到黃白色，擔(dān)孢子球棒狀，大約10mX3Wii不等。菌絲體能夠在頂端產(chǎn)生鎖狀聯(lián)合。在液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)條件下能夠產(chǎn)生白色的球狀菌絲體。上述粗毛栓菌(7ya歷etesh>s"a)lg-9CGMCCNo.2422的ITS核苷酸序列(包括18SDNA和28SDNA的一部分以及5.8SDNA和三者之間的兩段間隔序列)長(zhǎng)度為651個(gè)堿基，如序列表SEQIDNo.1所示。通過美國(guó)生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)序列同源性分析，將本發(fā)明的菌株粗毛栓菌(7>a/zetesMrs"ts)lg_9CGMCCNo.2422的ITS核苷酸通過Blast進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果表明該菌株屬于粗毛栓菌。結(jié)合該菌株的子實(shí)體形態(tài)分析以及菌絲體形態(tài)分析和孢子的形態(tài)分析根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》(魏景超著)表明該菌株屬于真菌擔(dān)子菌屬中的粗毛栓菌。一種粗毛栓菌lg-9的培養(yǎng)方法，具體步驟如下取菌種保藏編號(hào)為CGMCCNo.2422的粗毛栓菌lg-9菌株，將該菌株接種至麩皮浸出液斜面培養(yǎng)基或者PDA固體斜面培養(yǎng)基活化35天，溫度為2830'C，取活化后的粗毛栓菌lg-9接種于麩皮浸出液發(fā)酵培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為283(TC，震蕩型搖床的速度為70轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)68天。優(yōu)選的，所述麩皮浸出液斜面培養(yǎng)基通過如下方法制得麩皮195205g加到1L水中，沸煮30min，六層紗布過濾，添加19.520,5g瓊脂，自然pH,121°C滅菌20min。優(yōu)選的，所述PDA固體斜面培養(yǎng)基通過如下方法制得馬鈴薯195205g去皮片狀，沸煮30min過濾，葡萄糖1822g，蒸餾水1000mL，瓊脂20g，pH=5.56.5，115°C滅菌30min。優(yōu)選的，所述麩皮浸出液培養(yǎng)基通過如下方法制得麩皮195205g加到1L水中，沸煮30min，六層紗布過濾，自然pH,121°C滅菌20min。優(yōu)選的，所述擴(kuò)大培養(yǎng)溫度為30°C，培養(yǎng)時(shí)間為6天。一種粗毛栓菌lg-9在工業(yè)造紙、紙漿改性、造紙污水處理、印染污水處理、食品工業(yè)、飲料行業(yè)、服裝行業(yè)、有機(jī)合成行業(yè)中的應(yīng)用。所述粗毛栓菌lg-9的應(yīng)用，步驟如下將活化后的粗毛栓菌lg-9通過優(yōu)化的合成培養(yǎng)基培養(yǎng)1216天，離心除去菌絲體，提純漆酶，將該漆酶應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。所述優(yōu)化的合成培養(yǎng)基含有如下成分:葡萄糖9.510.5g，磷酸氫二銨9.510.5mM,土溫801.92.lgg,藜蘆醇2.853.15mM,硫酸鎂1.92.1mM%,磷酸氫二鉀13.9715.44raM,氯化鈣0.650.72mM，甘氨酸7.418.19幽，硫酸錳0.550.6線氯化鈉16.1517.85mM,硫酸亞鐵0.3400.377mM,氯化鈷0.7360.814mM，硫酸鋅0.3310.365mM，硫酸鋁鉀0.0200.022mM,硼酸0.1520.168mM,鉬酸鈉0.0390.043mM,維生素B0.002820.00312mM，硫酸銅0.190.21函。本發(fā)明中實(shí)驗(yàn)操作及試劑如無(wú)特別說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作及市售試劑。對(duì)本發(fā)明所述的粗毛栓菌lg-9菌株產(chǎn)生的漆酶進(jìn)行熱穩(wěn)定性試驗(yàn)和最適反應(yīng)溫度試驗(yàn)表明該漆酶的最適反應(yīng)溫度為85°C(如圖1所示)，該漆酶在小于75°C時(shí)具有很好的溫度穩(wěn)定性(如圖2所示)。并且該漆酶表現(xiàn)出很強(qiáng)的溫度依賴性，雖然在室溫下該漆酶具有較強(qiáng)的酶活性，但該漆酶的最適反應(yīng)溫度范圍在45X到75°C之間。本漆酶具有很好的熱穩(wěn)定性，適合應(yīng)用于環(huán)境溫度較高的工業(yè)生產(chǎn)中，如造紙及紙漿改性，以及一些需要溫度要求的化學(xué)合成工業(yè)中。同時(shí)該漆酶在常溫下的熱穩(wěn)定性良好，24小時(shí)活性幾乎沒有變化。實(shí)驗(yàn)表明該漆酶的最適反應(yīng)溫度比國(guó)外報(bào)道的從真菌尸/c"，or^sa/7^/i/7e^提取的漆酶的最適反應(yīng)溫度55T要高，比嗜熱古細(xì)菌777emws^ermcp/7/7wsHB27的最適反應(yīng)溫度95"C略低。并且粗毛栓菌lg-9生長(zhǎng)速度快，在麩皮浸出液培養(yǎng)基中產(chǎn)酶時(shí)間為68天，少于真菌Pycnoporussanguineus的培養(yǎng)時(shí)間10天。嗜熱古細(xì)菌T77em7us"ermoph/'/usHB27的漆酶并沒有在野生菌株中的報(bào)道，且該菌株所產(chǎn)漆酶催化需要銅離子的存在，使得其應(yīng)用具有很大的局限性。因此，粗毛栓菌lg-9具有很強(qiáng)的工業(yè)應(yīng)用開發(fā)價(jià)值和應(yīng)用前景，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)該項(xiàng)技術(shù)的空白。(四)附圖l:粗毛栓菌lg-9中漆酶最適反應(yīng)溫度測(cè)定圖。附圖2:粗毛栓菌lg-9中漆酶在75T時(shí)的熱穩(wěn)定性圖。(五)具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:高產(chǎn)耐熱性漆酶菌株的分離篩選1.培養(yǎng)基分離純化培養(yǎng)基將200g麩皮加入1L水中，煮沸30min，6層紗布過濾；稱取20g瓊脂條；將濾得的麩皮液與秤取的瓊脂條放入1000ml三角瓶中，加水定容至1000ml;將麩皮汁培養(yǎng)基和洗凈的培養(yǎng)皿121'C濕熱滅菌20min，添加200mg/L的青霉素和200mg/l的鏈霉素，倒平板備用。漆酶選擇性培養(yǎng)基將100g麩皮加入1L水中，煮沸30min，6層紗布過濾；稱取20g瓊脂條；將濾得的麩皮液與秤取的瓊脂條放入加入1000ml三角瓶中，加水定容至1000ml;將麩皮汁培養(yǎng)基和洗凈的培養(yǎng)皿12rC濕熱滅菌20min，添加200rag/L愈創(chuàng)木酚，倒平板備用。2.篩選步驟(1)取感染有真菌的木頭或者真菌子實(shí)體，用小刀撬取很少的一小塊接種到分離純化培養(yǎng)基平板上，置于283(TC培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。制備土壤稀釋液稱取土樣10克，放入盛90ml無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，振搖約20min,使土樣與水充分混勻，將細(xì)胞分散。用一支lml無(wú)菌吸管從中吸取lml土壤懸液加入9ml無(wú)菌水的大試管中充分混勻，然后用無(wú)菌吸管從此試管中吸取lml加入另一盛有9ml無(wú)菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成10"、10—2、l(T3、10—4、10'5、10—6不同稀釋度的土壤稀釋液。涂布平板將上述分離純化培養(yǎng)基的三個(gè)平板底面分別用記號(hào)筆寫上l(T2、l(T4、10—6三種稀釋度，然后用無(wú)菌吸管分別由10—2、10—4、1(^三管土壤稀釋液中各取0.1ml對(duì)號(hào)放入已寫好稀釋度的平板中，滴在平板培養(yǎng)基表面中央位置(O.lml的土壤稀釋液要全部滴在培養(yǎng)基上，若吸液管尖端有剩余的，須將吸液管在培養(yǎng)基表面輕輕地按一下便可)。右手拿無(wú)菌涂棒平放在平板培養(yǎng)基表面上，將菌懸液先沿一條直線輕輕地來回推動(dòng)，使之分布均勻，然后改變方向沿另一垂直線來回推動(dòng)，平板內(nèi)邊緣可改變方向再涂布幾次。涂布均勻后，室溫下靜置5-10min，使菌液吸附進(jìn)培養(yǎng)基。(2)隔天觀察平板上真菌的生長(zhǎng)情況。挑取分離純化培養(yǎng)基平板上長(zhǎng)出的真菌菌落，轉(zhuǎn)接到另外的分離純化培養(yǎng)基平板上，直到分離的真菌只長(zhǎng)出一種純化的菌落為止，共取得真菌近百株。(3)高產(chǎn)漆酶菌株的篩選將純化的菌落接種于漆酶選擇性培養(yǎng)基，能產(chǎn)生變色圈的菌落具有降解木素的能力，變色圈的形成有兩種一種是變色圈在菌落的外圍形成(dl/d2〈l);另一種是變色圈在菌落的內(nèi)圈形成(dl/d2〉1)Ander禾口Eriksson實(shí)驗(yàn)表明dl/d2的比值可作為判斷該菌是否能降解木素的依據(jù)。如dl/d2〈1，則該菌能選擇性降解木素，如dl/d2〉1，則該菌首先降解纖維素。漆酶選擇性培養(yǎng)基中的木粉愈創(chuàng)木酚在漆酶(多酚氧化酶)和過氧化物酶的作用下，平板會(huì)產(chǎn)生紅褐色的顯色圈。漆酶選擇性培養(yǎng)基中平板變色反應(yīng)用以定性測(cè)定菌株是否能產(chǎn)漆酶，降解木素。將篩選所得菌種同時(shí)接種于漆酶選擇性培養(yǎng)基中上，接種后放于28'C恒溫保濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)天，觀察，記錄菌落的生長(zhǎng)速度和變色區(qū)域的大小，取出測(cè)量dl/d2的比值，從中挑選出四株菌。3.熱穩(wěn)定性漆酶的篩選取上述菌株中生長(zhǎng)迅速，變色能力強(qiáng)的菌株進(jìn)行液體發(fā)酵驗(yàn)證，并初步的進(jìn)行熱穩(wěn)定性保溫試驗(yàn)測(cè)定。發(fā)現(xiàn)菌株粗毛栓菌lg-9具有生長(zhǎng)迅速且熱穩(wěn)定性能好的特點(diǎn)，值得進(jìn)一步進(jìn)行研究。液體發(fā)酵酶活性測(cè)定方法為ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonicacid)，2，2'-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)]法或者DMP(2,6-Dimethoxypheno1，2，6-二甲氧基苯酚)法其具體操作是ABTS[2,2'-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)]法的底物為ABTS[2，2'-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)],其濃度為lmM，反應(yīng)體積是2ml，緩沖體系是20mM的醋酸醋酸鈉緩沖液，測(cè)定波長(zhǎng)為420nm,消光系數(shù)為s二36,000M'1cm";DMP(2,6-二甲氧基苯酚)法的底物為DMP(2，6-二甲氧基苯酚),底物濃度為10mM,反應(yīng)體積是2ml，緩沖體系是20mM的醋酸醋酸鈉緩沖液，測(cè)定波長(zhǎng)為470nm，消光系數(shù)為s=49，600M"cm"。酶活性測(cè)定中用到的大型儀器是Shimadzu的UV-3100型紫外可見全波段分光光度計(jì)。實(shí)施例2:高產(chǎn)熱穩(wěn)定性漆酶菌株的鑒定1.形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定首先將采集到的子實(shí)體或者經(jīng)培養(yǎng)產(chǎn)生的子實(shí)體以及孢子形態(tài)與真菌分類學(xué)手冊(cè)《真菌鑒定手冊(cè)》(魏景超著)進(jìn)行對(duì)照初步鑒定該菌株子實(shí)體無(wú)柄，側(cè)生，木栓質(zhì)。菌蓋1.5-5.0cmX2-8cm,厚5-25mra，有白色或黃白色的粗毛束，有同心環(huán)帶。菌肉白色到黃白色，擔(dān)孢子球棒狀，大約10WnX3Wn不等，與栓菌屬的特征非常相似，應(yīng)屬于栓菌屬，具體種名還需要分子生物學(xué)的方法進(jìn)行鑒定。2.ITS的序列分析(1)序列分析用培養(yǎng)基菌絲培養(yǎng)培養(yǎng)基取重量比為10%的麩皮與重量比為90%的去離子水混合，沸煮10min，6層紗布進(jìn)行過濾，添加去離子水到原來的體積，自然pH值121'C滅菌20min。LB液體培養(yǎng)基(Luria-Bertani):稱取蛋白胨(Tryptone)lOg，酵母提取物(Yeastextract)5g，NaCl10g，溶于800ml去離子水中，用NaOH調(diào)pH至7.5,加去離子水至總體積1升,高壓下蒸氣12rC滅菌20分鐘。LB固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基中每升加1014g瓊脂粉，高壓滅菌。LA固體培養(yǎng)基氨芐青霉素(Ampicillin,Amp)與水配成50mg/ml母液，-20°0保存?zhèn)溆茫逼S青霉素的LB固體培養(yǎng)基將配好的LB固體培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻至6(TC左右,加入氨芐青霉素儲(chǔ)存液，使終濃度為50ug/ml，搖勻后鋪板。(2)基因組DNA的提取麩皮液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌體(約5-7天)用兩層紗布過濾，把菌體放在液氮預(yù)冷的研缽中進(jìn)行研磨。約研磨4次左右然后稱取約100mg研磨產(chǎn)物用DNA提取試劑盒進(jìn)行基因組的DNA提取。所用的DNA提取試劑盒為UNIQ-10柱式植物基因組DNA抽提試劑盒(購(gòu)于上海生工生物工程有限公司)。(3)基因組DNA的檢測(cè)基因組DNA的電泳檢測(cè)是通過濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行的，制膠方法為取10mlTEB緩沖液用量筒定溶到100ml;稱取0.2g瓊脂糖凝膠溶到20ml(取25ml)電泳緩沖液中用微波爐加熱至融化；將膠板洗干凈封好，插好梳子；取15ulEB加到緩沖液中混勻倒入玻璃板中冷凝后加入電泳緩沖液，拔出梳子；將膠放入電泳槽中，加TEB電泳緩沖液至過膠1mm，點(diǎn)樣品2ul和8ulMarker開通電源進(jìn)行電泳，所加電壓不得超過5v/cm。(4)PCR基因擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)是采用的通用引物ITS5:位于18sRNA序列5，一GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG—3，，ITS4:位于28sRNA序列為5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，PCR反應(yīng)體系(Total:50u1):IOX反應(yīng)緩沖液5.0iilMgCl2:(濃度為25mM)3.0u1模板DNA:0.5引物1:1.0ii1(10yM)引物2:1.0u1(10uM)dNTPs(各為lOmM):1.0n1DNA聚合酶0.5y1(5U/u1擴(kuò)增速度為lkb/0.5min)ddH20:36y1添加順序ddH20—10X反應(yīng)緩沖液一dNTP—MgCl2—引物1和引物2—模板DNA—DNA聚合酶；添加后低速離心混勻。PCR反應(yīng)程序94'C變性5min后開始以下循環(huán):94'C變性反應(yīng)O.5min，54'C退火反應(yīng)0.5min,72'C延伸反應(yīng)0.5min;進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72'C反應(yīng)10min，4'C冷卻恒定。PCR產(chǎn)物純化用的試劑盒為U-geneH.Q.&.Q.PCR及酶反應(yīng)產(chǎn)物純化試劑盒PCR-PureKit，其具體純化步驟參考該試劑盒使用說明書。(5)連接轉(zhuǎn)化連接體系如表1所示表l:連接反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>添加順序ddH20—PMD20-Tvector—DNA—solutionl全部加后低速離心混勻。放于16度水浴中連接過夜，約10小時(shí)。轉(zhuǎn)化反應(yīng)的步驟如下從-70'C冰箱中取100yl感受態(tài)的粗毛栓菌lg-9菌液，室溫下使其解凍，解凍后立即置冰上；加入質(zhì)粒DNA溶液(含量不超過50ng，體積不超過10ul)，輕輕搖勻，冰上放置30分鐘后；42'C水浴中熱擊卯秒或37匸水浴5分鐘，熱擊后迅速置于冰上冷卻1分鐘；向管中加入lmlLB液體培養(yǎng)基(不含氨芐青霉素)，混勻后37'C振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr);將上述菌液3000r/min，10min離心打散后取200n1涂布于含氨芐青霉素的LA固體培養(yǎng)基平板上，涂布待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37'C培養(yǎng)16-24小時(shí)。同時(shí)做兩個(gè)對(duì)照挑取轉(zhuǎn)化子接種于5ml的含有氨芐青霉素的濃度為10ug/ml，培養(yǎng)8小時(shí)后提取質(zhì)粒，酶切后進(jìn)行電泳驗(yàn)證，后送上海英駿公司測(cè)序。(6)序列分析結(jié)果如下序列表SEQIDNo.1所示。gga^gta已^gtcgtaacaaggtttccgtaggtg雄ctgcgg鄉(xiāng)gatc60tttgstatgggttgttgctggccttccgaggC3tgtgC3Cgccctgctcatccactctac120acctgtgcacttactgtaggttggcgtgggtttctagcctccgggctgggagcattctgc180cggcctatgtacactacaaactctaaagtatC3g犯tgt3aacgcgtctaacgcatctta240atacaactttcsgcaacggatctcttggctctcgcatcgatgaagaacgc3gcgaaatgc300gtg33ttgC3gaattcagtgtctttg^cgcaccttgcgc360tccttggtattccgaggagcatgcctgtttgagtgtcatgaaattctcaacccataagtc420cttgtgatctatgggcttgg3tttgg鄉(xiāng)Cttgctggccctagcggtcggctcctcttga480atgcattagcttgattccgtgcggatcggctctcagtgtg3t33ttgtCtacgctgtgsc540cgtgaagcgttttggcaagcttctaaccgtccattaggac犯lxtttcaacatctgacct600caaatcaggtaggactacccgctgaacttaagcatatcaaa651實(shí)施例3:耐熱性漆酶的制備和耐熱性的測(cè)定首先將保藏于4'C冰箱的麩皮浸出液斜面的菌種進(jìn)行轉(zhuǎn)接活化，轉(zhuǎn)接到新鮮的PDA固體斜面培養(yǎng)基或者麩皮浸出液培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)5天，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)接擴(kuò)大培養(yǎng)。接種量視擴(kuò)大培養(yǎng)的體積來決定。產(chǎn)酶培養(yǎng)基為麩皮200土5g加到1L水中，沸煮30min，六層紗布過濾，自然pH，121'C滅菌20min。培養(yǎng)時(shí)間是68天，培養(yǎng)溫度為2830°C，震蕩條件為70轉(zhuǎn)/分的震蕩型搖床或是與之條件相近的其他搖床。將培養(yǎng)物用G4砂芯漏斗抽濾或者離心除去菌絲體即可得到粗酶液，通過常規(guī)純化方法，可得到純化的漆酶。溫度穩(wěn)定性和最適反應(yīng)溫度的測(cè)定通過對(duì)純化的漆酶進(jìn)行DMP(2，6-二甲氧基苯酚)法測(cè)定，底物為lOmM的DMP(2，6-二甲氧基苯酚)，反應(yīng)體積是2ml，緩沖體系是20mM的醋酸鈉緩沖液，測(cè)定波長(zhǎng)為470nm，消光系數(shù)為s=49,600M—1cm"。最適反應(yīng)溫度測(cè)定范圍從2(TC到9(TC間隔溫度為5。C，其結(jié)果如圖1所示。溫度穩(wěn)定性從45'C到85r每隔l(TC進(jìn)行保溫測(cè)定殘留的漆酶活性，測(cè)定結(jié)果如圖2所示。權(quán)利要求1.一種粗毛栓菌(Trameteshirsuta)lg-9，該菌種已經(jīng)于2008年03月26日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCNo.2422。2.—種如權(quán)利要求l所述的粗毛栓菌lg-9的培養(yǎng)方法，其特征是，具體步驟如下取菌種保藏編號(hào)為CGMCCNo.2422的粗毛栓菌lg-9菌株，將該菌株接種至麩皮浸出液斜面培養(yǎng)基或者PDA固體斜面培養(yǎng)基活化35天，溫度為283(TC，取活化后的粗毛栓菌lg-9接種于麩皮浸出液發(fā)酵培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為2830°C，震蕩型搖床的速度為70轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)68天。3.如權(quán)利要求2所述的粗毛栓菌lg-9的培養(yǎng)方法，其特征是，所述麩皮浸出液斜面培養(yǎng)基通過如下方法制得麩皮195205g加到1L水中，沸煮30min，六層紗布過濾，添加19.520.5g瓊脂，自然pH，121°C滅菌20min。4.如權(quán)利要求2所述的粗毛栓菌lg-9的培養(yǎng)方法，其特征是，所述PDA固體斜面培養(yǎng)基通過如下方法制得馬鈴薯195205g去皮片狀，沸煮30min過濾，葡萄糖1822g，蒸熘水1000mL，瓊脂20g，pH=5.56.5，115。C滅菌30min。5.如權(quán)利要求2所述的粗毛栓菌lg-9的培養(yǎng)方法，其特征是，所述麩皮浸出液培養(yǎng)基通過如下方法制得麩皮195205g加到1L水中，沸煮30min，六層紗布過濾，自然pH，121°C滅菌20min。6.如權(quán)利要求2所述的粗毛栓菌lg-9的培養(yǎng)方法，其特征是，所述擴(kuò)大培養(yǎng)溫度為30°C,培養(yǎng)時(shí)間為6天。7.—種如權(quán)利要求l所述的粗毛栓菌lg-9在工業(yè)造紙、紙漿改性、造紙污水處理、印染污水處理、食品工業(yè)、飲料行業(yè)、服裝行業(yè)、有機(jī)合成行業(yè)中的應(yīng)用。8.如權(quán)利要求7所述的粗毛栓菌lg-9的應(yīng)用，其特征是，步驟如下將活化后的粗毛栓菌lg-9通過優(yōu)化的合成培養(yǎng)基培養(yǎng)1216天，離心除去菌絲體，提純漆酶，將該漆酶應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。9.如權(quán)利要求8所述的粗毛栓菌lg-9的應(yīng)用，其特征是，所述優(yōu)化的合成培養(yǎng)基含有如下成分葡萄糖9.510.5g，磷酸氫二銨9.510.5mM，土溫801.92.lgg,藜蘆醇2.853.15mM，硫酸鎂1.92.1慮％，磷酸氫二鉀13.9715.44慮，氯化鈣0.650.72mM,甘氨酸7.418.19函,硫酸錳0.55~0.6線氯化鈉16.1517.85mM，硫酸亞鐵0.3400.377mM，氯化鈷0.7360.814mM，硫酸鋅0.3310.365mM，硫酸鋁鉀0.0200.022mM，硼酸0.1520.168mM，鉬酸鈉0.0390.043mM，維生素002820細(xì)12mM，硫酸銅0.190.21mM。全文摘要本發(fā)明公開了一種耐熱性漆酶產(chǎn)生菌株粗毛栓菌(Trameteshirsuta)1g-9及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用，屬于微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。該菌株保藏編號(hào)為CGMCCNo.2422；本菌株可通過麩皮浸出液斜面培養(yǎng)基或者PDA固體斜面培養(yǎng)基活化，通過麩皮浸出液發(fā)酵培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)；本菌株可應(yīng)用于工業(yè)造紙、紙漿改性、造紙污水處理、印染污水處理、食品工業(yè)、飲料行業(yè)、服裝行業(yè)、有機(jī)合成行業(yè)中。文檔編號(hào)A23L3/3571GK101280277SQ20081001568公開日2008年10月8日申請(qǐng)日期2008年4月14日優(yōu)先權(quán)日2008年4月14日發(fā)明者張應(yīng)龍,張海波,峰黃申請(qǐng)人:山東大學(xué)