專利名稱：：半滑舌鰨雌性特異分子標記及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物
技術領域：
中的魚類分子標記和遺傳性別鑒定技術，是一種能在魚類單性育種中應用的魚類遺傳性別鑒定的分子生物學方法。技術背景我國有著豐富的魚類資源，其中許多魚類在生長速率上存在著性別差異，例如，羅非魚雄性比雌性生長快約40%以上，而牙鲆和半滑舌鰨等海水魚類，雌性個體比雄性個體生長快40%-100%，因此，開展這些魚類遺傳性別檢測和性別控制的研究既有重要的科學意義，又有重大的應用潛力和推廣前景。半滑舌鰨(Qv朋g/oMw化m"/aev^)是我國特有的一種名貴經(jīng)濟海水魚類，屬于近海溫水性底層魚類，我國沿海均有分布，以黃海、渤海為多。半滑舌鰨由于其味道鮮美，肉質(zhì)細嫩，營養(yǎng)豐富，深受廣大消費者歡迎，其市場價值極高，養(yǎng)殖前景非常廣闊。盡管近2年來，半滑舌鰨人工育苗技術獲得突破，年產(chǎn)半滑舌鰨苗種近百萬尾，不過，研究表明半滑舌鰨雌性個體和雄性個體在生長速率上存在巨大差別，其雌性個體比雄性個體大2-3倍(黃海水產(chǎn)研究所，孟田湘等，1988)。由于雄性個體生長過慢，降低了半滑舌鰨的養(yǎng)殖產(chǎn)量，增加了養(yǎng)殖成本，因而嚴重影響了半滑舌鰨苗種的推廣及養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的形成，由于難以鑒定半滑舌鰨的遺傳性別，嚴重影響了半滑舌鰨雌核發(fā)育和性別控制研究的進行。有關魚類性別相關分子標記的研究，目前只是在少數(shù)幾種魚類上進行過。采用的主要方法包括RAPD、SSR和AFLP等。加拿大西溫哥華實驗室的Deviin(1994)找到了大鱗大馬哈魚Y染色體特異的DNA片段；匈牙利農(nóng)業(yè)生物技術中心的Kovacs等(2000)用RAPD掃描非洲給魚雌雄基因池，找到兩個雄性性別相關的RAPD標記，一個(CgaYl)大約2.6kb,另一個(CgaY2)458bp,這是首次從鯰魚中找到性別特異的DNA標記。美國新罕布什爾大學的Lee等(2004)用分離集團分析法尋找羅非魚表型性別相連鎖的DNA標記，找到IO個與羅非魚表型性別連鎖的微衛(wèi)星標記。這些標記可以直接用于不同Y染色體等位基因功能的研究和具有一個或者幾個Y染色體拷貝的親魚的鑒定。英國Stirling大學的Ezaz等(2004)用AFLP技術掃描尼羅羅非魚基因組，找到三個Y染色體連鎖(ftn'Y425、ftn'Y382、feiY227)和一個X染色體連鎖(ft]iX420)的AFLP標記。目前的研究還只是在某些魚類找到少數(shù)雄性性別相關的分子標記，但還沒有找到魚類雌性性別特異的分子標記。而有關半滑舌鰨性別特異分子標記以及遺傳性別鑒定的分子生物學技術，目前國內(nèi)外均未見報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的，是為了篩選出半滑舌鰨雌性特異分子標記，獲得性別特異分子標記的序列，并在半滑舌鰨遺傳性別鑒定中進行應用，為半滑舌鰨性別控制和全雌育種研究提供分子標記和技術方法。本發(fā)明的技術方案如下研究一種半滑舌鰨雌性特異分子標記的篩選方法，包括半滑舌鰨基因組DNA的提取，基因組DNA的AFLP分析，雌性特異分子標記的篩選，其特征是一、半滑舌鰨雌性特異分子標記的篩選，包括1、半滑舌鰨基因組DNA的提?。?、基因組DNA的AFLP分析；3、雌性特異分子標記的篩選；二、半滑舌鰨雌性特異分子標記的克隆與序列，包括1、半滑舌鰨雌性特異分子標記的回收；2、雌性特異分子標記的克?。?、雌性特異分子標記的序列；三、半滑舌鰨雌性特異分子標記的應用；包括該標記應用于無損傷鑒別半滑舌鰨的遺傳性別，具體方法是采集待測半滑舌鰨魚基因組DNA,根據(jù)獲得的3個半滑舌鰨雌性特異分子標記的序列，分別設計3對特異引物，其引物序列分別為CseF136Nl(5，-AAGTAACGACACGAAGGG-3，)禾口CseF136Cl(5，隱AACCGAGTGAAATGTGATAG-3，)；CseF464Nl(5,-CACAGCCAGGATGAGGAT-3')和CseF464Cl(5'隱TCAGTTGGAAAACGGAGAA-3，)；CseF783Nl(5，-AGATTCAAGCATGACGGT-3，)禾口CseF783Cl(5'-GATTTTGGACAGAGGAGC-3，)；采用其中任意1對雌性特異引物進行PCR擴增，就可以對半滑舌鰨魚進行遺傳性別鑒定；當使用CseF136Nl和CseF136Cl引物時，從半滑舌鰨個體基因組DNA中擴增出一條84-94bp的特異DNA片^:的為遺傳上的雌性個體；當^吏用CseF464Nl和CseF464Cl引物時，/人半滑舌鰨個體基因組DNA中擴增出一條306-316bp的特異DNA片段的為遺傳上的雌性個體；當使用CseF783Nl和CseF83Cl引物時，從半滑舌鰨個體基因組MA中擴增出一條248-258bp的特異DNA片段的為遺傳上的雌性個體。以下對本發(fā)明的技術方案作更進一步闡述一、半滑舌鰨雌性特異分子標記的篩選，包括1、半滑舌鰨基因組DNA的提?。?、基因組DNA的AFLP分析；3、雌性特異分子標記的篩選其中，1、半滑舌鰨基因組DNA的提取血液基因組DNA的提取抽取半滑舌鰨魚血液，在冰上靜置后離心去除上層血漿，加4-6倍體積蒸餾水溶解血細胞沉淀，搖勾，靜置，再離心，去上清；加4-6倍體積STE緩沖液，清洗沉淀，用含蛋白酶-K的STE緩沖液，消化過夜，直至沉淀物溶解為組織液；添加等體積飽和酚，抽^是一次；用與上述STE緩沖液體積相同的飽和酚氯仿異戊醇(25:24:l)混合液抽提一次；然后用與上述STE緩沖液體積相同的氯仿異戊醇(24:l)抽提一次；最后用2-3倍體積的無水乙醇沉淀簡A。于-20。C;^置20-30分鐘后于12000rpm離心，去上清，收集DNA沉淀，經(jīng)70。/。乙醇洗:條和自然干火喿后，用TE(lOmMTris-HCl，pH8.0，10mMEDTA)緩沖液溶解，將DNA保存在-20。C備用。鰭條基因組DNA的提取采集半滑舌鰨鰭條，采取高鹽法提取基因組DNA。首先將固定于純酒精中的鰭條置于1.5ml離心管中，剪碎后加入400fi1TENS裂解液和IOpl蛋白酶K(10mg/ml)，然后于55。C消化。消化完全后，加入140)!l飽和氯化鈉，混勻，12000rpm/min4'C離心30min。耳又上清加入兩倍體積預冷的無水乙醇沉淀，然后將絮狀沉淀挑出后用70%的酒精洗滌兩次，待酒精揮發(fā)干后，用TE(10mMTris-HCl，pH8.G,10mMEDTA)溶解DNA為組織液；2、基因組DNA的AFLP分析基因組DNA的AFLP分析主要包括如下步驟第一步對DNA才莫板進行酶切，第二步是將特異接頭連接到酶切片段上，第三步是進行預擴增，第四步是進行選擇性擴增，第五步是電泳分析。所述的對DNA模板進行酶切，其方法是先用商業(yè)來源的EcoRI/Msel酶混合物(LifeTechnologies/>司)(1.2511/^1)消訐t80-llOng才莫+反DNA4-6小時，用1°/。瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切是否充分，將充分酶切的DNA溶液置于7(TC孵育15分鐘滅活限制性內(nèi)切酶。所述的特異接頭連接到酶切片段上，其方法是向上面的酶切反應混合液中加入12.(^l接頭混合物和0.5^1T4DNA連接酶，2(TC孵育12-20小時。所述的預擴增，其方法是將上述連接產(chǎn)物稀釋10倍，作為PCR預擴增的模板；PCR引物是3，末端帶有一個選擇性堿基(A或者C)的引物混合物，進行PCR預擴增。所述的選擇性擴增其方法是將預擴增產(chǎn)物稀釋30-50倍，作為選擇性擴增的模板。用熒光標記的MseI引物和5coRI引物進行選4奪性PCR擴增，這兩種引物3，末端帶有三個選擇性堿基。向PCR擴增產(chǎn)物中加入適量的上樣液，于94。C變性3分鐘后立即置于冰上待用。總共用了64個引物組合進行選擇性擴增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)94。C變性后用6.5%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離。所述的電泳分析，其方法是將變性好的擴增產(chǎn)物用5.5-6.5%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。電泳條件電壓1500V,功率40W，電流40mA,溫度45。C,時間3.5小時。然后對電泳后產(chǎn)生的DNA條帶進行觀察，照相和分析。3、雌性特異分子標記的篩選采用商業(yè)來源的64個引物組合(即8個M序列引物分別與8個E序列引物進行組合，這些引物購自美國LifeTechnologies公司)對15個半滑舌鰨雌性個體和13個半滑舌鰨雄性個體的基因組DNA進行了AFLP-PCR擴增，通過SAGA軟件分析篩選出2個引物組合產(chǎn)生了3條雌性特異的DNA標記，這些片段在雄性個體基因組掘A中不存在。其中商品名為M-CAA和E-ACT的引物組合擴增出一條雌性特異的DNA片段，長度為781-791bp,將此片段命名為CseF783;商品名為M-CTG和E-AGC的引物組合擴增出2條雌性特異DNA片段，一條為460-468bp，將此片段命名為CseF464;另一條為130-136bp的雌性特異DNA片段，將此片段命名為CseF136。將只在雌性個體中出現(xiàn)，而在雄性個體中不出現(xiàn)的片段作為雌性特異顧A分子標記。二、半滑舌鰨雌性特異分子標記的克隆與序列分析主要包括如下步驟1)半滑舌鰨雌性特異分子標記的回收；2)雌性特異分子標記的克??；3)雌性特異分子標記的序列分析其中，1)、雌性特異AFLP片段的回收選取能擴增出130-136bp、460-468bp和781-791bp雌性特異AFLP標記的2個引物組合M-CTG和E-AGC以及M-CAA和E-ACT，進行AFLP擴增，擴增產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，用刀片分別切下含有130-136bp、460-468bp和781-791bp雌性特異DNA條帶的聚丙烯酰胺凝膠，溶解后回收目的片段備用。2)、AFLP片段的克隆將回收的上述3個雌性特異AFLP標記，克隆到商業(yè)上獲得的pMD18-T載體中，采用標準方法進行連接和轉化，采用常規(guī)PCR法篩選含有目的片段的克隆，用瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物的長度，符合預期長度的樣品可以視為陽性克隆。3)、序列分析選取陽性克隆，采用ABI3730序列分析儀進行雌性特異DNA片段的序列分析，獲得半滑舌鰨3個雌性特異分子標記的序列分別為CseF783ATTTb-ASAMTb丁GAG0AAcTA^cAAAGcTcAGG丁KAccJAGGTccTTAAccATGcGTcAGATGccAGGTcGTGAGATGAcGTcGGAAGTGGcGAAAcTTTcTGAccGAAAATGGAccTTcGGAGTAAGAGAcGATGATAAAAGcTGTcGAAGAGTATAcAGTTGGAAAcAGccTTGcAGTGGAGGAGAGGGGGAGAccAGTGGcAGAcGAAcTAGGccAGcTATcTGAAGAcccGGcTTGGcGTGTTTTAcAGAAccAcGcccAAGTTcGGTcccccTTcTGTTcTGTcGAAGGAAcAAGTccATcTTGTTGcTAGTAccGAGcGTGAcGAccAAAccAAccccGccccGTTTcGTAAcccGTGcGTTGTccTGcTAccAATAAcAATAAATAAAcAATGGTAcccTcTGGGcTTGGAGGAcGAcGTTGGTATTAcAATAcAAcAATcAAATAAGAGAcAGTGGGGAGccAccTAcATccGAGGAcGATAAAGGcTAccAcGcccAGGAGTGAAAAAGcccAGccAAcATAcccTTGTGAAAccTTATccGAccGGAccccAcTcCT)G€rcATccTTTTAcccccATGTTcAcc、hAGSGTA爪GwGGATMcTATAAGGGAATcATc^GcbAAVGcKAII-CseF464<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>結果表明這3個雌性特異標記的長度分別為134bp、468bp及791bp。利用DNAMANVersion4.0軟件對5個不同個體的同一個標記的多個克隆子的序列進行比對，結果表明它們均為同一個序列。另外，對這3個標記的序列進行兩兩比對，發(fā)現(xiàn)并無同源性，表明它們?yōu)?個不同的序列。最后，利用BLASTn軟件在GenBank數(shù)據(jù)庫中對這3個標記進行同源性搜索，結果表明并無同源序列存在，說明這3個序列為半滑舌鰨的新序列。三、半滑舌鰨雌性特異分子標記的應用即該標記應用于無損傷鑒別半滑舌鰨的遺傳性別，具體方法是采集待測半滑舌鰨魚基因組顧A,根據(jù)獲得的3個半滑舌鰨雌性特異分子標記的序列，分別設計3對特異引物，其引物序列分別為CseF136Nl(5'-AAGTAACGACACGAAGGG-3，)和CseF136Cl(5'-AACCGAGTGAAATGTGATAG-3，)；CseF464Nl(5，-CACAGCCAGGATGAGGAT陽3，)禾BCseF464Cl(5，-TCAGTTGGAAAACGGAGAA-3,);CseF783Nl(5'-AGATTCAAGCATGACGGT-3，)和CseF783Cl(5，-GATTTTGGACAGAGGAGC國3，)；采用其中任意1對雌性特異引物進行PCR擴增，就可以對半滑舌鰨魚進行遺傳性別鑒定；當使用CseF136Nl和CseF136Cl引物時，從半滑舌鰨個體基因組DNA中擴增出一條84-94bp的特異顧A片段的為遺傳上的雌性個體；當使用CseF464N1和CseF464C1引物時，從半滑舌鰨個體基因組DNA中擴增出一條306-316bp的特異謹A片段的為遺傳上的雌性個體；當使用CseF783Nl和CseF783Cl引物時，,人半滑舌鰨個體基因組DNA中擴增出一條248-258bp的特異DNA片段的為遺傳上的雌性個體。具體步驟是1、基因組DNA的提??；2、遺傳性別鑒定PCR方法的建立(1).基因組DNA的提取釆集半滑舌鰨魚苗或鰭條，采取高鹽法提取基因組DNA。首先將固定于純酒精中的魚苗或魚鰭條置于l.5ml離心管中，剪碎后加入400ju1TENS裂解液(lOmMTris-HC1，pH7.5，400nMNaCl，lOOmMEDTA,0.6%SDS10mMTris-HC1，PH7.5,400juMNaCl，100mMEDTA，0.6%SDS)和10lil蛋白酶K(10mg/ml)，然后至于55。C消化。消化完全后，加入140pl飽和氯化鈉，混勻，12000rpm/min4。C離心30min。耳又上清加入兩倍體積預冷的無7JC乙醇沉淀，然后將絮狀沉淀挑出后用7oy。的酒精洗滌兩次，待酒精揮發(fā)干后，用TE(10mMTris—HCl，pH8.0，lOmMEDTA)〉容解DNA。(2)遺傳性別鑒定PCR方法的建立根據(jù)獲得的3個半滑舌鰨雌性特異DNA標記的序列，分別設計3對特異引物，其引物序列分別為CseF136Nl(5'誦AAGTAACGACACGAAGGG-3，)和CseF136Cl(5，-AACCGAGTGAAATGTGATAG-3，)；CseF464Nl(5，-CACAGCCAGGATGAGGAT-3，)和CseF464Cl(5，-TCAGTTGGAAAACGGAGAA-3，)；CseF783Nl(5，隱AGATTCAAGCATGACGGT-3，)和CseF783Cl(5，-GATTTTGGACAGAGGAGC隱3，)；PCR反應體系為DNA模板100ng;上下游引物濃度均為0.4^M;dNTP濃度為0.2mM;lxPCRbuffer;MgCb濃度為1.5mM;7b《DNA聚合酶0.75unit;補充滅菌雙蒸水至終體積為25^1。PCR反應程序為94。C預變性4min，之后94。C50s，退火(溫度分別為57，56和52。C)50s，72。C延伸50s，30個循環(huán)；再于72。C延伸7min。擴增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用D2000marker作參照。CseF136Nl和CseF136Cl引物可以從雌性個體基因組中擴增出一條84-94bp的特異DNA片段，CseF464Nl禾HCseF464Cl引物可以從雌性個體基因組中擴增出一條306-316bp的特異DNA片段，而CseF783Nl和CseF783Cl引物可以從雌性個體基因組中擴增出248-258bp的特異DNA片段，而這些引物從雄性個體基因組中則不能擴增出這樣的特異DNA片段。提取30個雌性個體和30個雄性個體的基因組DNA,用上述特異引物進行PCR擴增。如果某個個體產(chǎn)生了這樣的特異DNA片段，即可認為這些魚為遺傳上的雌性個體，而沒有這些片段的個體則被認為是遺傳上的雄性個體。本發(fā)明與已有技術對比其特點是本發(fā)明采用分子標記技術，以半滑舌鰨為材料首次篩選到雌性特異DNA分子標記，首次建立了我國養(yǎng)殖魚類遺傳性別鑒定的分子生物學技術。該技術具有準確、靈敏、可靠等優(yōu)點，為魚類性別控制和單性育種開辟了新的技術途徑，適宜在所有養(yǎng)殖魚類上推廣應用，對養(yǎng)殖魚類單性育種具有重要意義和應用價值。圖1、半滑舌鰨3個雌性特異顧A標記的核苦酸序列；圖2、半滑舌鰨雌性個體和雄性個體遺傳性別鑒定結果。具體實施方式圖1中，下劃線"="表示AFLP引物序列；下劃線"一"表示遺傳性別鑒定PCR中所用的雌性特異弓I物的序列。圖2中，A-1和A-2為采用CseF783Nl和CseF783Cl擴增的結果B-l和B-2為采用CseF464Nl和CseF464Cl擴增的結果；C-l和C-2為采用CseF136Nl和CseF136Cl擴增的結果。$表示雌性個體；(^表示雄性個體。本發(fā)明采用現(xiàn)代分子生物學技術，篩選出性別特異的分子標記，建立半滑舌鰨遺傳性別鑒定的分子技術，這對于培育半滑舌鰨全雌苗種，進行全雌苗種養(yǎng)殖，提高半滑舌鰨的養(yǎng)殖產(chǎn)量，提高養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益，真正將半滑舌鰨開發(fā)為一個被廣大養(yǎng)殖戶接受的優(yōu)良養(yǎng)殖品種，推動半滑舌鰨養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及海水魚類養(yǎng)殖品種的更新?lián)Q代，具有重要的現(xiàn)實意義和巨大的經(jīng)濟效益。對本發(fā)明的技術內(nèi)容進行詳細闡述實施方式舉例一、半滑舌鰨雌性特異分子標記，包括1、半滑舌鰨基因組DNA的提取，2、基因組DNA的AFLP分析，3、雌性特異分子標記的篩選。其中，1、半滑舌鰨基因組DNA的提取血液基因組DNA的提取抽取半滑舌鰨魚血液200-400|J,取100-150|il血液于3500rpm離心15分鐘，去除上層血漿后，加5倍體積蒸餾水(滅菌)溶解血細胞沉淀，搖勻，靜置5-10分鐘，再以3500rpm離心15分鐘，去上清；力口5倍體積STE(O.lmol/LNaCl,1Ommol/LTris.Cl(pH8.0)，lmmol/LEDTA(pH8.0)),清洗沉淀2次；每次在U000rpm離心78分鐘；去上清后加0.5mlSTE,10%SDS25-30^1，蛋白酶-K至終濃度100嗎/ml，37。C消化過夜，直至沉淀物溶解為止；添加等體積飽和酚，倒轉搖勻IO分鐘，12000rpm離心5分鐘，吸上層清液入另一1.5ml離心管；加等體積飽和酚氯仿異戊醇(25:24:1),倒轉混勻IO分鐘后于12000rpm離心5分鐘，吸上層清液入另一1.5ml離心管，向上清液中加等體積氯仿異戊醇(24:1),倒轉混勻IO分鐘，于12000rpm離心5分鐘，取上清入另一管；加1/12體積3M醋酸鈉，混勻后再加3倍體積的4。C無水乙醇，輕柔振搖；可觀察到白色絮狀物出現(xiàn)(DNA),于-20。C放置20-30分鐘后于12000rpm低溫(4°C)離心10分鐘，去上清，收集DNA沉淀，加lml70。/。乙醇洗滌，12000ipm低溫(4°C)離心10分鐘，去上清，重復l次；自然干燥后，用pH8.0TE溶解，保存在-2(TC備用?；蚪MDNA的濃度應不低于20ng/fxl,基因組DNA的純度要求0026()/0028()值為1.8左右。鰭條基因組DNA的提取釆集半滑舌鰨鰭條，釆取高鹽法提取基因組DNA。首先將固定于純酒精中的鰭條置于1.5ml離心管中，剪碎后加入400jilTENS裂解液(lOmMTris-HCl,pH7.5,400^iMNaCU00mMEDTA,0.6%SDS10mMTris陽HCl,PH7.5,400fiMNaCl,100mMEDTA,0.6%SDS)和10(il蛋白酶K(10mg/ml)，然后至于55。C消化。消化完全后，加入140(al飽和氯化鈉，混勻，12000rpm/min4°C離心30min。取上清加入兩倍體積預冷的無水乙醇沉淀，然后將絮狀沉淀挑出后用70。/。的酒精洗滌兩次，待酒精揮發(fā)干后，用TE(10mMTris-HCl,pH8.0,10mMEDTA)溶解DNA。2、基因組DNA的AFLP分析主要分為如下5步(1)、酶切用l.O(il5caRI/^feel酶混合物(1.25U/^)消化80-110ng模板DNA4-6小時，再用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切是否充分，然后將充分酶切的DNA溶液于70。C孵育15分鐘滅活限制性內(nèi)切酶。(2)、連接向上面的酶切反應混合液中加入12.0jal接頭混合物和0.5(^1T4DNA連接酶，2(TC孵育12-20小時，保證接頭充分連接。(3)、預擴增將連接產(chǎn)物稀釋10倍，作為預擴增的模板；預擴增引物是3，末端帶有一個選擇性堿基(A或者C)的引物混合物。PCR反應條件為92-94。C，30秒；54-56°C，1分鐘；70-72°C,1分鐘。20個循環(huán)后，4。C待用。(4)、選擇性擴增將預擴增產(chǎn)物稀釋30-50倍，作為選擇性擴增的模板。用含酶切位點MseI的引物和含酶切位點EcoRI的引物進行擴增，這兩種引物3，末端帶有三個選擇性堿基。PCR反應分為三步第一步進行l(wèi)個循環(huán)92-94°C,30秒；63-65°C,30秒；70-72°C,1分鐘；第二步進行12個循環(huán)92-94°C,30秒；65-54°C,30秒；70-72°C,1分鐘；第三步進行23個循環(huán)——92-94°C,30秒；54-56°C,30秒；70-72°C,1分鐘。擴增產(chǎn)物加入適量的上樣液，94。C變性3分鐘，立即置于冰上。(5)、電泳分析將變性好的擴增產(chǎn)物用5.5-6.5%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。電泳條件電壓1500V,功率40W，電流40mA,溫度45。C,時間3.5小時?？偣灿昧?4個引物組合對15個半滑舌鰨雌性個體和13個半滑舌鰨雄性個體的基因組DNA進行了AFLP分析，用SAGA軟件分析電泳圖譜后，篩選出產(chǎn)生特異片段的引物組合2個，這2個引物組合共產(chǎn)生了3條雌性特異的DNA片段。3、雌性特異分子標記的篩選總共用64個引物組合(即8個M序列引物分別與8個E序列引物進行組合，這些引物購自美國LifeTechnologies公司)對15個半滑舌鰨雌性個體和13個半滑舌鰨雄性個體的基因組DNA進行了AFLP-PCR擴增，這64個引物組合的核苷酸序列見表1。表1:64個AFLP引物組合的核苷酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>通過SAGA軟件分析篩選出2個引物組合產(chǎn)生了3條雌性特異的DNA片段，這些片段在雄性個體基因組DNA中不存在其中商品名為M-CAA和E-ACT的引物組合Ml-El擴增出長度為781-791bp的雌性特異DNA片段；商品名為M-CTG和E-AGC的引物組合M2-E2擴增出2條雌性特異DNA片段，一條為460-468bp;另一條為130-136bp。將只在雌性個體中出現(xiàn)，而在雄性個體中不出現(xiàn)的片段作為雌性特異DNA標記。二、半滑舌鰨雌性特異分子標記的克隆與序列它的技術內(nèi)容包括1)半滑舌鰨雌性特異AFLP片段的回收；2)雌性特異AFLP片段的克??；3)雌性特異分子標記的序列1)、雌性特異AFLP標記的回收選取能擴增出130-136bp、460-468bp和781-791bp雌性特異分子標記的2個引物組合M-CTG和E-AGC以及M-CAA和E-ACT，進行AFLP擴增，擴增產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，用刀片分別切下含有130-136bp、460-468bp和781-791bp雌性特異DNA條帶的聚丙烯酰胺凝膠，溶解后回收目的片段備用。2)、AFLP標記的克隆將回收的上述3個雌性特異AFLP標記，克隆到商業(yè)上獲得的pMD18-T載體中，采用標準方法進行連接和轉化，釆用常規(guī)PCR法篩選含有目的片段的克隆，用瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物的長度，符合預期長度的樣品可以視為陽性克隆。3)、雌性特異標記的序列選取陽性克隆，釆用ABI3730序列分析儀進行雌性特異DNA片段的序列分析，結果表明這3個雌性特異標記的長度分別為134bp、468bp及791bp(圖子的序列進行比對，結果表明它們均為同一個序列。另外，對這3個標記的序列進行兩兩比對，發(fā)現(xiàn)并無同源性，表明它們?yōu)?個不同的序列。最后，利用BLASTn軟件在GenBank數(shù)據(jù)庫中對這3個標記進行同源性搜索，結果表明并無同源序列存在，說明這3個序列為半滑舌鰨的新序列。三、半滑舌鰨雌性特異分子標記的應用包括1、基因組DNA的提?。?、遺傳性別鑒定的PCR方法的建立分述如下1.基因組DNA的提取釆集半滑舌鰨魚苗或鰭條，采取高鹽法提取基因組DNA。首先將固定于純酒精中的魚苗或魚鰭條置于1.5ml離心管中，剪碎后加入400(^1TENS裂解液(10mMTris-HCl,pH7.5,400(^MNaCl,100mMEDTA,0.6%SDS10mMTris-HC1，PH7.5,400pMNaCU00mMEDTA,0.6%SDS)和10fJ蛋白酶K(10mg/ml),然后至于55。C消化。消化完全后，加入140pl飽和氯化鈉，混勻，12000rpm/min4。C離心30min。取上清加入兩倍體積預冷的無水乙醇沉淀，然后將絮狀沉淀挑出后用70%的酒精洗滌兩次，待酒精揮發(fā)干后，用TE(10mMTris-HCl,pH8.0,10mMEDTA)〉容解DNA。2.半滑舌鰨遺傳性別鑒定的PCR方法的建立根據(jù)獲得的3個半滑舌鰨雌性特異分子標記的序列，分別設計3對特異引物，其引物序列分別為CseF136Nl(5'-AAGTAACGACACGAAGGG-3，)和CseF136Cl(5'-AACCGAGTGAAATGTGATAG-3，)；CseF464Nl(5，-CACAGCCAGGATGAGGAT隱3，)禾口CseF464Cl(5'-TCAGTTGGAAAACGGAGAA-3，)；CseF783Nl(5，-AGATTCAAGCATGACGGT-3，)和CseF783Cl(5，-GATTTTGGACAGAGGAGC-3，)。PCR反應體系為DNA模板100ng;上下游引物濃度均為0.4(iM;dNTP濃度為0.2mM;lxPCRbuffer;MgCl2濃度為1.5mM;Ta《DNA聚合酶0.75unit;補充滅菌雙蒸水至終體積為25|il。PCR反應程序為94"預變性4min，之后94。C50s，退火(溫度分別為57，56和52。C)50s，72。C延伸50s，30個循環(huán)；再于72t:延伸7min。擴增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用D2000marker作參照。CseF136Nl和CseF136Cl引物可以從雌性個體基因組中擴增出一條84-94bp的特異DNA片段,CseF464Nl和CseF464Cl引物可以從雌性個體基因組中擴增出一條306-316bp的特異DNA片段，而CseF783Nl和CseF783Cl引物可以從雌性個體基因組中擴增出248-258bp的特異DNA片段，而這些引物從雄性個體基因組中則不能擴增出這樣的特異DNA片段。提取30個雌性個體和30個雄性個體的基因組DNA，用上述特異引物進行PCR擴增。如果某個個體產(chǎn)生了這樣的特異DNA片段，即可認為這些魚為遺傳上的雌性個體，而沒有這些片段的個體則被認為是遺傳上的雄性個體。結果表明30個雌性個體都含有這樣的雌性特異的DNA片段，而30個雄性個體都不含有這樣的DNA片段(圖2),由此，建立了半滑舌鰨遺傳性別鑒定的PCR方法，該方法鑒定半滑舌鰨遺傳性別的準確率為100%。序列表<110〉中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所<120>半滑舌鰨性別特異AFLP標記序列<160>1<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>791、468、134<212>DNA<213>半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)<400>1gactgcgtaccaattcactgtctgatgacacaggatacgtctgcacgcagtttagagtgc60tggaccgtagacatgccaactacacttcaaattgtgaatgaggcttccaggtaaaatgca120cagttctttcaaagctggtgaaggctacaataggtttgatcatatgagaagcttgtcgag180aaaatagtagcagagattcaagcatgacggtgacacagagtggggagaggaggtgactgt240tccgaccaatgacattttgtgcggttctggccacagaatgtctattcgacctggacaaaa300ggaagctgttcttgtcttcgctccctggctttgatacaactctgctccaaccaaacacag360cagtgctgagccatgtattctgttgttctactctgagttcactgttgcgtgctcacagaa420tgcaatttgctcctctgtccaaaatctggtcttccctattgtgttataactaaataaata480actaataactcataactaaattataactaatcaacataacattatggttgcagcagtgat540gtgttctgattatgcagtgagccttttacattcaacatcactgaggggtgacatgtagca600cgacacacgaaaaagttgatggttacacctgcaaacacattcgcgtaaaatgaagcactt660attctgtgacacaaagtgttccgtgccacatactaaaatcatggtgtaattatcaggtgc720accattttcctctcctctcacaggc3C3cacatcccacte敏gcc3c嗎acttgttect"780caggactcatc791gactgcgtaccaattcagctggcaccttatagcggcagaacagggacgcaaacccaccac60aacaacacagccaggatgaggatcaaagtcagttacaggcggagcgacaacaatgggtct120acaccactgaatgaactcaatactccaaactcccaaacttatetaggtcagcgctgcacc180tctagacttatcccactcttttccctgccatctgattcctttgttgttgtgggtgctgat240gtaacggactgtaactttgccaggtaaccaggtagttgaagtggtgttgcagataaggca300aa昭tagaactectcatascttegccactg肌acc3a昭3ga昭cattgcataaaaattc360tccgttttccaactgacaatgtgatagaccctgaaaaacacaaacaacaacaacaacaac420tgcaa犯acaagtcagagttaaaatatttcagttactcaggactcatc468gactgcgtaccaattcagctaagtaacgacacgaaggggtggagacctagttagtgcctt60ctacccgggcttttgcattagctgtttttctatcacatttcactcggtttttcatcagtt120actcaggactcatc13權利要求1.一種半滑舌鰨雌性特異分子標記的篩選方法，包括半滑舌鰨基因組DNA的提取，基因組DNA的AFLP分析，雌性特異分子標記的篩選，其特征是1)、半滑舌鰨基因組DNA的提取血液基因組DNA的提取抽取半滑舌鰨魚血液經(jīng)離心去除上層血漿，溶解血細胞沉淀，去除上清液，清洗沉淀，用含蛋白酶-K的STE緩沖液消化血細胞直至沉淀物溶解為組織液；再依序經(jīng)飽和酚抽提；飽和酚、氯仿和異戊醇混合液抽提；以及氯仿和異戊醇混合液抽提；無水乙醇沉淀DNA；離心，去除上清液，收集DNA沉淀，經(jīng)70％乙醇洗滌和自然干燥，用TE緩沖液溶解DNA沉淀，將DNA保存在-20℃?zhèn)溆茫祸挆l基因組DNA的提取采集半滑舌鰨魚鰭條，經(jīng)剪碎后用含蛋白酶-K的TENS裂解液消化，高鹽法提取基因組DNA，收集DNA沉淀，經(jīng)70％乙醇洗滌和自然干燥，用TE緩沖液溶解DNA沉淀，將DNA保存在-20℃?zhèn)溆茫?)、基因組DNA的AFLP分析主要包括如下步驟第一步對DNA模板進行酶切；第二步是將特異接頭連接到酶切片段上；第三步是進行預擴增；第四步是進行選擇性擴增；第五步是電泳分析；所述的對DNA模板進行酶切的方法是先用EcoRI/MseI酶混合物消化80-110ng模板DNA4-6小時，用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切是否充分，將充分酶切的DNA溶液置于70℃孵育15分鐘滅活限制性內(nèi)切酶；所述的特異接頭連接到酶切片段上的方法是向上面的酶切反應混合液中加入12.0μl接頭混合物和0.5μlT4DNA連接酶，20℃孵育12-20小時；所述的預擴增的方法是將上述連接產(chǎn)物稀釋10倍，作為PCR預擴增的模板；PCR引物是3’末端帶有一個A或者C的選擇性堿基的引物混合物，進行PCR預擴增；所述的選擇性擴增的方法是將預擴增產(chǎn)物稀釋30-50倍，作為選擇性擴增的模板；用熒光標記的MseI引物和EcoRI引物進行選擇性PCR擴增，這兩種引物3’末端帶有三個選擇性堿基；向PCR擴增產(chǎn)物中加入適量的上樣液，于94℃變性3分鐘后立即置于冰上待用；總共用了64個引物組合進行選擇性擴增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)94℃變性后用6.5％聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離；所述的電泳分析的方法是將變性好的擴增產(chǎn)物用5.5-6.5％的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳；電泳條件電壓1500V，功率40W，電流40mA，溫度45℃，時間3.5小時；然后對電泳后產(chǎn)生的DNA條帶進行觀察，照相和分析；3)、雌性特異分子標記的篩選用從商業(yè)公司購買的8個M序列和8個E序列AFLP引物，形成64個引物組合對15個半滑舌鰨雌性個體和13個半滑舌鰨雄性個體的基因組DNA進行了AFLP-PCR擴增，其中2個引物組合產(chǎn)生了3條雌性特異的DNA片段，這些DNA片段在雄性個體基因組中不存在其中，序列為5’-GATGAGTCCTGAGTAACAA-3’和5’-GACTGCGTACCAATTCACT-3’的引物組合M-CAA和E-ACT擴增出1條長度為781-791bp的雌性特異DNA片段；序列為5’-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3’和5’-GACTGCGTACCAATTCAGC-3’的引物組合M-CTG和E-AGC擴增出2條雌性特異DNA片段，一條為460-468bp，另一條為130-136bp；將只在雌性個體中出現(xiàn)，而在雄性個體中不出現(xiàn)的DNA片段作為雌性特異分子標記。2)、基因組DNA的AFLP分析主要包括如下步驟第一步對顧A模板進行酶切；第二步是將特異接頭連接到酶切片段上；第三步是進行預擴增；第四步是進行選擇性擴增；第五步是電泳分析；所述的對DNA模板進行酶切的方法是先用EcoRI/Msel酶混合物消化80-110ng模板DNA4-6小時，用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切是否充分，將充分酶切的顧A溶液置于7(TC孵育15分鐘滅活限制性內(nèi)切酶；所述的特異接頭連接到酶切片段上的方法是向上面的酶切反應混合液中加入12.0pl接頭混合物和0.5(ilT4DNA連4妻酶，20。C孵育12-20小時；所述的預擴增的方法是將上述連接產(chǎn)物稀釋10倍，作為PCR預擴增的模板；PCR引物是3，末端帶有一個A或者C的選擇性堿基的引物混合物，進行PCR預擴增；所述的選擇性擴增的方法是將預擴增產(chǎn)物稀釋30-50倍，作為選擇性擴增的模板；用熒光標記的Msel引物和5coRI引物進行選擇性PCR擴增，這兩種引物3，末端帶有三個選擇性堿基；向PCR擴增產(chǎn)物中加入適量的上樣液，于94。C變性3分鐘后立即置于冰上待用；總共用了64個引物組合進行選^t奪性擴增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)94。C變性后用6.5%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離；所述的電泳分析的方法是將變性好的擴增產(chǎn)物用5.5-6.5%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳；電泳條件電壓1500V,功率40W，電流40mA,溫度45。C,時間3.5小時；然后對電泳后產(chǎn)生的DNA條帶進行觀察，照相和分析；3)、雌性特異分子標記的篩選用從商業(yè)/>司購買的8個M序列和8個E序歹'JAFLP引物，形成64個引物組合對15個半滑舌鰨雌性個體和13個半滑舌鰨雄性個體的基因組DNA進行了AFLP-PCR擴增，其中2個引物組合產(chǎn)生了3條雌性特異的DNA片段，這些DNA片段在雄性個體基因組中不存在其中，序列為5'-GATGAGTCCTGAGTAACAA-3，和5'-GACTGCGTACCAATTCACT-3，的引物組合M-CAA和E-ACT擴增出1條長度為781-791bp的雌性特異DNA片段；序列為5'-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3，和5'隱GACTGCGTACCAATTCAGC-3，的引物組合M-CTG和E-AGC擴增出2條雌性特異DNA片段，一條為460-468bp,另一條為130-136bp;將只在雌性個體中出現(xiàn)，而在雄性個體中不出現(xiàn)的DNA片段作為雌性特異分子標記。2、一種半滑舌鰨雌性特異分子標記的克隆與序列，其特征在于包括如下三個方面1)雌性特異分子標記的回收；2)雌性特異分子標記的克?。?)雌性特異分子標記的序列；其中1)、雌性特異分子標記的回收選取能擴增出130-136bp、460-464bp和780-783bp雌性特異分子標記的2個引物組合M-CTG和E-AGC以及M-CAA和E-ACT,進行AFLP擴增，擴增產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，用刀片分別切下含有130-136bp、460-468bp和781-791bp雌性特異DNA條帶的聚丙烯酰胺凝膠，溶解后回收目的片段備用；2)、雌性特異分子標記的克隆將回收的雌性特異分子標記，克隆到pMD18-T載體中，采用標準的方法進行連接和轉化，采用常規(guī)PCR法篩選含有目的片段的克隆，用瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物的長度，符合預期長度的樣品可以視為陽性克??；3)、雌性特異分子標記的序列選取陽性克隆，用DNA測序儀進行序列分析，獲得半滑舌鰨3個雌性特異分子標記的序列分別為CseF783<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>CseF464CseF136AGTTACTCAGGACTCATC3.—種雌性特異分子標記的應用，其特征是該標記應用于無損傷鑒別半滑舌鰨的遺傳性別，具體方法是采集待測半滑舌鰨魚基因組DNA,根據(jù)獲得的3個半滑舌鰨雌性特異分子標記的序列，分別設計3對特異引物，其引物序列分別為CseF136Nl(5'-AAGTAACGACACGAAGGG-3，)和CseF136C1(5'-AACCGAGTGAAATGTGATAG-3');CseF464N1(5，-CACAGCCAGGATGAGGAT陽3，)和CseF464C1(5'-TCAGTTGGAAAACGGAGAA-3');CseF783Nl(5'國AGATTCAAGCATGACGGT-3，)禾口CseF783Cl(5'-GATTTTGGACAGAGGAGC-3，)；采用其中任意1對雌性特異引物進行PCR擴增，就可以對半滑舌鰨魚進行遺傳性別鑒定；當使用CseF136Nl和CseF136Cl引物時，從半滑舌鰨個體基因組DNA中擴增出一條84-94bp的特異DNA片段的為遺傳上的雌性個體；當使用CseF464Nl和CseF464Cl引物時，從半滑舌鰨個體基因組DNA中擴增出一條306-316bp的特異DNA片段的為遺傳上的雌性個體；當使用CseF783Nl和CseF783Cl引物時，從半滑舌鰨個體基因組DNA中擴增出一條248-258bp的特異DNA片段的為遺傳上的雌性個體。ccAAAccAGGGAcAAGAPwGGAGT「AG斑緣TAcwcGGATcGAcTAccGcGTcAGAcGTcGAAGAGAAAccAcccAGGAcTGAcTTATGAGAcTGAAcAAAAAcGTcAAcAATc全文摘要一種半滑舌鰨雌性特異分子標記及其應用，包括篩選方法，含半滑舌鰨基因組DNA的提取，基因組DNA的AFLP分析和雌性特異分子標記的篩選；還包括半滑舌鰨雌性特異分子標記的克隆與序列，含雌性特異分子標記的回收，雌性特異分子標記的克隆和雌性特異分子標記的序列；再包括一種雌性特異分子標記的應用，應用于無損傷鑒別半滑舌鰨的遺傳性別，即采集待測半滑舌鰨魚基因組DNA，根據(jù)獲得的3個半滑舌鰨雌性特異分子標記的序列，分別設計3對特異引物，采用其中任意1對雌性特異引物進行PCR擴增，就可以對半滑舌鰨魚進行遺傳性別鑒定。具有先進、高效、準確、可靠的特點，在半滑舌鰨單性苗種生產(chǎn)中具有重要應用價值，并在其它魚類遺傳性別鑒定和性別控制研究中也具有廣闊應用前景。文檔編號C12N15/10GK101270389SQ20081001598公開日2008年9月24日申請日期2008年5月9日優(yōu)先權日2008年5月9日發(fā)明者靜李,沙珍霞,田永勝,鄧思平,陳松林,馬洪雨申請人:中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所