專利名稱：一種體外擴增自然殺傷細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種體外大量優(yōu)勢擴增人或 動物外周血自然殺傷細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
自然殺傷細(xì)胞(natural killer cells, NK細(xì)胞)是一類不依賴于抗原刺 激，能夠自發(fā)地溶解多種腫瘤細(xì)胞和被病毒感染細(xì)胞的一類淋巴細(xì)胞，其細(xì)胞 表面的標(biāo)志分子是CD3—， CD56+。 NK細(xì)胞存在于外周血和脾臟中，在外周血中占 淋巴細(xì)胞的15%-20% 。 NK細(xì)胞具有抗腫瘤、抗感染和免疫調(diào)節(jié)等作用，是機體 免疫監(jiān)視的第一道防線，對機體抵抗腫瘤和感染具有重要作用。研究NK細(xì)胞迅 速擴增的方法，是臨床免疫學(xué)實踐應(yīng)用十分重要的課題。由于外周血中NK細(xì)胞 含量不高，要獲得大量高純度的NK細(xì)胞是困難的。雖然已有的技術(shù)通過免疫磁 珠或流式細(xì)胞術(shù)分選能夠獲得高純度的NK細(xì)胞，但要獲得一定的數(shù)量則需要大 量的血液和抗體，這無疑會增加獲得NK細(xì)胞的成本；現(xiàn)有的方法通過使用IL-2 等淋巴因子能夠在體外誘導(dǎo)NK細(xì)胞增殖，產(chǎn)生淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞
(lymphokine activated killer cells, LAK細(xì)胞)，但這種方法也會同時擴增 其他的淋巴細(xì)胞，LAK細(xì)胞中自然殺傷細(xì)胞的比例仍處于較低的水平。經(jīng)廣泛査 閱國內(nèi)外專利文獻和各種出版物，迄今為止，均未見有實用、高效的體外大量 優(yōu)勢擴增NK細(xì)胞方法的發(fā)明和報道。因此發(fā)明一種實用、高效、快速體外大量 優(yōu)勢擴增人外周血NK細(xì)胞的方法，用于對自然殺傷細(xì)胞的免疫功能機制的實驗 研究，以及用于臨床提高人、動物免疫調(diào)節(jié)力，抵抗腫瘤、抗感染是非常重要 的；對于攻克人類長期渴望解決的惡性腫瘤疾病的難題是十分有價值的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種實用有效的體外大量擴增自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì) 胞)的方法。
本發(fā)明體外擴增NK細(xì)胞的方法，包括以下步驟(1) 從人、動物外周血分離單個核細(xì)胞；
(2) 單個核細(xì)胞懸浮在含5% 15%自體血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，經(jīng)有 效濃度為1 4 mmol/L的甲基-P -環(huán)糊精(M P CD)預(yù)處理36 60小時；
(3) 加入重組人白細(xì)胞介素2，在含5%新生牛血清與5%自體血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中擴增培養(yǎng)10天以上。
單個核細(xì)胞采用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心方法分離獲得。 MP CD的最佳有效濃度為2 3 mmol/L。 重組人白細(xì)胞介素2有效濃度為20 50 U/ml。
在RPMI1640中添加25 mmol/L HEPES、 2 mmol/L L-谷氨酰胺、50 jig/ml鏈 霉素、50 U/ml青霉素。
單個核細(xì)胞在含有10%自體血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，經(jīng)甲基-環(huán)糊 精預(yù)處理48小時；再加重組人白細(xì)胞介素2。
將上述處理的細(xì)胞在體外擴增10 13天。
狐細(xì)胞的比例檢測采用流式細(xì)胞術(shù)，CD37CD56+的細(xì)胞即為NK細(xì)胞，NK細(xì) 胞擴增的絕對值通過計數(shù)擴增細(xì)胞總數(shù)結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測NK細(xì)胞比例計算獲 得。
本發(fā)明體外優(yōu)勢擴增NK細(xì)胞的方法，要點在于采用最佳的MPCD濃度預(yù) 處理單個核細(xì)胞。
脂筏(Lipid rafts)是指細(xì)胞膜上富含膽固醇和鞘酯的微區(qū)，濃集有GPI-連接的蛋白以及參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號分子，如LCK、 LAT、 Ras和G蛋白等。淋 巴細(xì)胞激活過程的早期，細(xì)胞膜上出現(xiàn)脂筏聚集或形成功能性脂筏，也是抗原 遞呈細(xì)胞與T細(xì)胞相互接觸時形成免疫突觸的平臺。在研究脂筏功能的實驗中 通常用高濃度(10 15 nimol/L)的MeCD預(yù)處理細(xì)胞，可去除細(xì)胞膜膽固醇，以 干擾脂筏形成。本發(fā)明研究證明低濃度和高濃度的MP CD對細(xì)胞膽固醇的影響 明顯不同。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)中有血清存在時，低濃度MgCD可作為膽固醇的穿梭載 體，加速游離膽固醇在細(xì)胞和脂蛋白之間的交換。我們發(fā)現(xiàn)用低濃度的 M3CD(l 4mmol/L)預(yù)處理人外周血單個核細(xì)胞能夠明顯地促進NK(CD37CD56+) 細(xì)胞的增殖，從而發(fā)明了體外大量優(yōu)勢擴增NK細(xì)胞的有效的方法。
本發(fā)明提出一種用低濃度的MP CD預(yù)處理外周血單個核細(xì)胞后加白細(xì)胞介素2培養(yǎng)優(yōu)勢擴增NK細(xì)胞的技術(shù)方法，實現(xiàn)了大量體外優(yōu)勢擴增NK細(xì)胞，為免疫， 學(xué)研究領(lǐng)域的實驗研究人員對NK細(xì)胞的免疫功能機制的基礎(chǔ)研究，以及及臨床 應(yīng)用提供了細(xì)胞基礎(chǔ)，在抗腫瘤的生物治療領(lǐng)域中具有重要的應(yīng)用價值。 本發(fā)明體外擴增外周血NK細(xì)胞的方法，包括以下三個步驟 第一步從人、動物外周血分離單個核細(xì)胞；單個核細(xì)胞采用聚蔗糖-泛影 葡胺密度梯度離心方法分離獲得。
第二步單個核細(xì)胞懸浮在含5°/。 15%自體血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中， 經(jīng)有效濃度為1 4 mmol/L的MP CD預(yù)處理36 60小時。過少使用自體血清或 用其他動物血清替代將不能達(dá)到理想效果；MP CD最佳有效濃度為2 3 mmol/L; 經(jīng)MP CD預(yù)處理最佳時間為48小時。
第三步加入重組白細(xì)胞介素2，在含5。/。新生牛血清與5y。自體血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中擴增培養(yǎng)10天以上。加入的重組人白細(xì)胞介素2有效濃度為20 50 U/ml;在RPMI1640中添加25 mmol/L HEPES、 2 mraol/L L-谷氨酰胺、50 pg/ml 鏈霉素、50U/ml青霉素。NK細(xì)胞在體外培養(yǎng)擴增時間一般為10 13天，少于 10天，則繁殖倍數(shù)低；至少10天以后才可檢測到明顯的自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì) 胞)比例增加。延長培養(yǎng)時間能夠獲得更多的NK細(xì)胞數(shù)量，但是最長也不得高 于15天，高于15天，部分細(xì)胞衰老死亡，也會造成NK細(xì)胞增殖倍數(shù)低和絕對 數(shù)量減少。
NK細(xì)胞的比例檢測采用流式細(xì)胞術(shù)，表面標(biāo)志分子CD3—, CD56+的細(xì)胞為NK 細(xì)胞。NK細(xì)胞擴增的絕對值通過計數(shù)擴增細(xì)胞總數(shù)結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測NK細(xì)胞 比例計算獲得。
本發(fā)明中一般采用20 35歲年輕健康志愿者的外周血單個核細(xì)胞。 MeCD預(yù)處理48小時后再加rhlL-2。在誘導(dǎo)后的擴增階段，細(xì)胞的分孔視細(xì)
胞長勢而定， 一般于6 8天進行第一次分孔，隨后間隔2 3天分孔，因此，每
次分孔均需補充rhlL-2。后續(xù)的培養(yǎng)所用的培養(yǎng)液可添加自體血清，也可用5%新
生牛與5%自體血清的混合成分。
本發(fā)明中，MPCD的濃度選擇有一定的個體差異， 一般在l 4mmol/L的范
圍內(nèi)。對同一個個體而言，較低的濃度有利于細(xì)胞增殖，而較高的濃度則利于
獲得更高的NK細(xì)胞比例?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，NK細(xì)胞對于提高人、動物免疫調(diào)節(jié)力，抵抗腫瘤、抗 感染是非常重要的，但較為經(jīng)濟有效，快速大量體外擴增NK細(xì)胞，仍然是一個 難題。本發(fā)明通過低濃度MPCD預(yù)處理外周血單個核細(xì)胞后，再加入普通濃度 的白細(xì)胞介素2培養(yǎng)擴增一段時間，使NK細(xì)胞得以快速大量優(yōu)勢擴增，繁殖倍 數(shù)高達(dá)392 1752倍，取得了出人意料的效果。這種方法在國內(nèi)外醫(yī)學(xué)文獻和 專利文件中尚未見報道。因此，本發(fā)明是在NK細(xì)胞研究領(lǐng)域中解決了如何即經(jīng) 濟便利，又能高效優(yōu)勢擴增NK細(xì)胞的技術(shù)難題的發(fā)明，為研究NK細(xì)胞的生物 學(xué)特性提供了一種獲取細(xì)胞來源的方法，以及在腫瘤的生物治療方面有重要的 應(yīng)用前景。
本發(fā)明體外擴增自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)的方法優(yōu)點在于l.使用血樣少、 試劑成本低；2.操作比較方便；3.擴增倍數(shù)高，能夠在短期內(nèi)將NK細(xì)胞擴增 392-1752倍；4.本發(fā)明方法可用于人和各種動物的NK細(xì)胞擴增。


圖1不同濃度MeCD處理外周血單個核細(xì)胞對擴增細(xì)胞中NK細(xì)胞比例的 影響(『8);服細(xì)胞(CD37CD16+56+細(xì)胞)在MP CD處理組明顯升高，并隨濃度 增加而升高，特別濃度為3 mmol/L和4 mmol/L處理組可達(dá)到65%。.
圖2流式細(xì)胞術(shù)檢測MP CD (4 mmol/L)處理單個核細(xì)胞培養(yǎng)擴增10天 后淋巴細(xì)胞的表型。外周血單個核細(xì)胞用MgCD (4 mmol/L)處理48小時后再 加IL-2培養(yǎng)擴增10天，用流式細(xì)胞術(shù)檢測分析擴增的淋巴細(xì)胞亞群的比例。左 圖顯示CD3+CD4+和CD3+CD8+細(xì)胞分別為12%和18. 5% ;右圖顯示CD37CD16+56+ 細(xì)胞占有68.5%。
圖3外周血單個核細(xì)胞經(jīng)MP CD (2 mmol/L)處理后培養(yǎng)不同時間后NK 細(xì)胞擴增的數(shù)量。
具體實施例方式
以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳細(xì)描述。
本實施例包括以下步驟 ' 1.外周血單個核細(xì)胞(PBMC)的分離本例選擇8例健康成年志愿者(20 35歲)，抽取外周血于肝素抗凝試管中，加等量培養(yǎng)液稀釋，置于Ficoll-Hypaque淋巴細(xì)胞分離液上，常規(guī)密度梯度離心分離獲取PBMC，洗滌2次后用含10%自體 血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2X107ml。
2. M 3 CD的預(yù)處理及細(xì)胞擴增把PBMC懸液放入24孔培養(yǎng)板中，lml/孔； 加入MPCD (含lCm自體血清的RPMI1640配置)至終濃度0 4 mmol/L。另外設(shè) 立LAK細(xì)胞對照組(加rhlL-2 1000 U/ml)， 48 h后，分別加入rhlL-2 50 U/ 孔，37°C、 5%(:02溫箱中培養(yǎng)。6 8天后分孔擴大培養(yǎng)，并補充含5y。NBS和59() 自體血清的RPMI 1640培養(yǎng)液及rhlL-2 50 U/孔。以后每隔2-3天根據(jù)細(xì)胞增 殖情況對細(xì)胞分孔培養(yǎng)，并補充上述培養(yǎng)液及rhIL-2。定期計數(shù)觀察細(xì)胞增殖 情況；IO天時收集細(xì)胞進行細(xì)胞亞群。
3. 流式細(xì)胞儀分析取上述擴增10天后的細(xì)胞，置于流式測定管中，約l X107管。用染色緩沖液(PBS-5%NBS-0. l%NaN3) lml，離心1600 r/min， 5min， 離心后棄上清，使殘留細(xì)胞懸液S50ul/管。加雙熒光標(biāo)記抗體 CD3-FITC/CD4-PE、 CD3-FITC/CD8-PE、 CD3-FITC/CD16+CD56-PE染色，置4°C30 min后，加染色緩沖液lml/管，離心洗兩次；加固定劑(1%PFA-PBS) 400 y 1， 在流式細(xì)胞儀(FACSCalibur)上檢測，數(shù)據(jù)文件用CellQuest軟件或WinMDI 軟件分析。
4. 結(jié)果
(1) 不同濃度M P CD處理的PBMC與LAK細(xì)胞增殖能力比較 PBMC加不同濃度MPCD (1畫1/L 5廳1/L)培養(yǎng)，加rhIL-2 (50U/ml)
維持生長，1 mmol/L 3 mmol/L MPCD處理的PBMC均有明顯增殖，4 mmol/L 濃度MP CD處理的PBMC也有增殖，但較前者弱，而4咖ol/L以上濃度MP CD 處理的PBMC均全部裂解死亡。于培養(yǎng)的10天及13天分別計數(shù)增殖的各組細(xì)胞， 觀察增殖情況，結(jié)果2mmol/LM后CD濃度組PBMC增殖最快，第10天擴增31. 2 倍，第13天達(dá)182. 37倍；3咖ol/L MP CD濃度組與2咖ol/L MP CD濃度組相 似；4 mmol/L MP CD濃度組的PBMC增殖最慢，第10天擴增僅15倍，第13天 僅32倍；作為對照的LAK細(xì)胞擴增也只有51. 2倍；其它各組亦有不同倍數(shù)的 擴增。
(2) MeCD濃度對擴增細(xì)胞亞群的影響PBMC分別加rhIL-2( 1000 U/ml)、 M3CD (1腿ol/L 4 mmol/L)誘導(dǎo)培養(yǎng)擴增10天后收集細(xì)胞進行分型，結(jié)果 發(fā)現(xiàn)CD37CD56+細(xì)胞在M 3 CD處理組明顯升高，在3 4 mmol/L組可達(dá)65%左右，各組均明顯高于IL-2組和新鮮PBMC。在各MP CD處理組中，CD3—A:D56+細(xì)胞的 百分率隨著MP CD濃度的增加而增加，CD3+T細(xì)胞則相反。
(3) 2 mmol/L MP CD處理組中CD37CD56+細(xì)胞的絕對擴增倍數(shù) 在實驗的0、 8、 10及13天，用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD37CD56+細(xì)胞的比例， 同時用苔盼藍(lán)染色計數(shù)活細(xì)胞的總數(shù)。結(jié)合二者結(jié)果計算出各個體CD37CD56+ 細(xì)胞的絕對擴增倍數(shù)。如表1所示，在8個個體中，CD37CD56+細(xì)胞的基數(shù)在5 25X 104。 8天后，各組細(xì)胞開始以指數(shù)方式擴增。但在8個個體中，擴增的倍 數(shù)變化很大，10天時擴增倍數(shù)為23 97，而至13天時則達(dá)392 1752倍。
權(quán)利要求
1.一種體外擴增自然殺傷細(xì)胞的方法，包括以下步驟(1)從人、動物外周血分離單個核細(xì)胞；(2)單個核細(xì)胞懸浮在含5％～15％自體血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，經(jīng)有效濃度為1～4mmol/L的甲基-β-環(huán)糊精預(yù)處理36～60小時；(3)加入重組白細(xì)胞介素2，在含5％新生牛血清與5％自體血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中擴增培養(yǎng)10天以上。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述體外擴增自然殺傷細(xì)胞的方法單個核細(xì)胞采 用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心方法分離獲得。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述體外擴增自然殺傷細(xì)胞的方法-環(huán)糊 精最佳濃度為2 3mmol/L。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述體外擴增自然殺傷細(xì)胞的方法重組白細(xì)胞介 素2有效濃度為20 50 U/ml。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述體外擴增自然殺傷細(xì)胞的方法在RPMI 1640 中添加25 mraol/L HEPES、 2 mmol/L L-谷氨酰胺、50 pg/ml鏈霉素、 50 U/ml青霉素。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述體外擴增自然殺傷細(xì)胞的方法單個核細(xì)胞在 含有10y。自體血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，經(jīng)甲基-e-環(huán)糊精預(yù)處理48 小時；再加重組白細(xì)胞介素2繼續(xù)培養(yǎng)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述體外擴增自然殺傷細(xì)胞的方法自然殺傷細(xì)胞 在體外擴增10 13天。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述體外擴增自然殺傷細(xì)胞的方法自然殺傷細(xì)胞 的比例檢測采用流式細(xì)胞術(shù)，CD3—/CD56+的為自然殺傷細(xì)胞，自然殺傷細(xì) 胞擴增的絕對值通過計數(shù)細(xì)胞總數(shù)結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測自然殺傷細(xì)胞比 例計算獲得。
全文摘要
本發(fā)明屬于細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種體外大量優(yōu)勢擴增外周血自然殺傷細(xì)胞的方法。本發(fā)明包括以下步驟(1)從人、動物外周血分離單個核細(xì)胞；(2)單個核細(xì)胞懸浮在含5％～15％自體血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，經(jīng)有效濃度為1～4mmol/L的甲基-β-環(huán)糊精預(yù)處理36～60小時；(3)加入重組白細(xì)胞介素2，在含5％新生牛血清與5％自體血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中擴增培養(yǎng)10天以上。本發(fā)明的優(yōu)點在于使用血樣少、成本低；操作方便；擴增倍數(shù)高，能夠在短期內(nèi)將自然殺傷細(xì)胞擴增392-1752倍。
文檔編號C12N5/06GK101314764SQ200810016899
公開日2008年12月3日 申請日期2008年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月24日
發(fā)明者呂合作, 李柏青 申請人:蚌埠醫(yī)學(xué)院