專利名稱：：一種新的10個y染色體短串聯(lián)重復(fù)序列位點及其分型方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種核酸檢測方法，涉及檢測人體基因組中具有多態(tài)性的遺傳標記，特別涉及一種新的IO個Y染色體STR基因位點及其分型方法。適用于法醫(yī)學(xué)、人類學(xué)、遺傳學(xué)和疾病等領(lǐng)域的個體識別、親子鑒定以及基因診斷等方面研究，同時也為遺傳制圖、基因分離、疾病連鎖分析及法醫(yī)學(xué)個體識別和親權(quán)鑒定等領(lǐng)域的理論與應(yīng)用研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
背景技術(shù)：
：短串聯(lián)重復(fù)序列(ShortTandemR印eat，STR)由26個堿基重復(fù)排列組成特異序列，STR是一類在人類基因組中分布廣泛并且具有高度多態(tài)性的遺傳標記。短串聯(lián)重復(fù)序列在研究與應(yīng)用中具有以下顯著的優(yōu)點片段長度小，易通過PCR擴增及電泳分型；分型檢測靈敏度高、所需檢材量少，尤其適合各種陳舊、降解檢材的檢測；PCR擴增結(jié)果穩(wěn)定，產(chǎn)生的附加帶及影子帶少；分型方法簡便、快速，重復(fù)性好等優(yōu)點，是繪制人類遺傳圖、疾病基因連鎖分析、遺傳病診斷、個體識別及親權(quán)鑒定等分析工作的重要工具。目前，STR是法醫(yī)DNA分析中最常用的一類遺傳標記。STR主要由于核心重復(fù)單位數(shù)目的變化形成了STR基因位點的遺傳多態(tài)性。STR等位基因片段可采用PCR技術(shù)擴增，其等位基因可用銀染、熒光標記和放射自顯影等技術(shù)分型。人類基因組中，平均每6-10kb就存在有一個STR基因位點，為法醫(yī)個人識別和親子鑒定提供了高信息基因位點的豐富來源。Y染色體為男性所特有的染色體，在減數(shù)分裂的過程中不與X染色體發(fā)生重組交換，遺傳物質(zhì)由父親毫無變化(除突變外)的傳遞給兒子，即具有單倍體父系遺傳的特點。以往Y染色體僅被用在性別鑒定，直到二十世紀九十年代，才對Y染色體特有的STR序列及多態(tài)性進行了較深入的研究,人們對Y染色體遺傳標記的遺傳多態(tài)性和應(yīng)用有了新的認識。研究Y染色體的兩個主要原因在于其一，Y染色體遺傳標記對混合DNA中男性成分的鑒定有獨特的優(yōu)勢；其二，通過Y染色體遺傳標記可以追溯父系袓先。由于Y染色體STR位點具有擴增片段短、等位基因多、分型方法簡單和多態(tài)信息含量高的優(yōu)點，有些Y-STR位點已被列入常規(guī)法醫(yī)檢驗項目，用于個體識別和親子鑒定。Y染色體STR的應(yīng)用主要有以下幾個方面(1)用于大量人群的個人識別，其中包括性侵犯案件中混合斑的DNA分析、走失人員的尋找以及親子鑒定，特別適用于法醫(yī)學(xué)實踐中父方缺(如去世或失蹤)情況下的親權(quán)鑒定和強(輪)奸案中混合斑的個人認定，尤其對認定患無精癥或少精癥的犯罪嫌疑人更具有獨到之處；(2)用于研究人類起源、進化、遷移及部族關(guān)系、作為家系研究的有機補充；(3)用于臨床醫(yī)學(xué)疾病關(guān)聯(lián)分析，相關(guān)基因的定位和發(fā)病的分子遺傳機理的闡明以及環(huán)境因子易感基因的檢出等；(4)用于研究男性不育的遺傳學(xué)原因；對異性別及非血緣的供、受者異基因骨髓移植進行植活診斷的監(jiān)測。由于Y染色體遺傳標記自身的遺傳特點，要提高Y染色體的鑒別能力，就需要不斷地增加新的Y染色體遺傳標記，尋找更多的能應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的Y染色體STR位點并進行群體遺傳學(xué)研究，是本領(lǐng)域亟待解決的問題。STR的分型，目前最常用的是應(yīng)用PCR擴增STR，將擴增產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacryamidegelelectropHoresis，PAGE),根據(jù)片段的大小決定基因型并計算等位基因頻率及遺傳距離并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。對于PCR產(chǎn)物的檢測可用自顯影技術(shù)，PAGE結(jié)合銀氣以及熒光標記序列儀自動分析系統(tǒng)等方法。Y染色體STR基因位點的研究在國內(nèi)還處于初期，目前國際上科學(xué)家們對Y-STR的研究形成了一個新的高潮，尤其在法醫(yī)遺傳學(xué)方面，已發(fā)現(xiàn)200多Y染色體STR和SNP遺傳標記，已有商品化試劑盒研制成功，并已在歐洲廣泛應(yīng)用。目前國際上Y-STR商品化檢測試劑盒多由生物公司研制生產(chǎn)，試劑盒名稱、生產(chǎn)廠家及所包括Y-STR基因位點信息如下(1)Y-PLEX12kit(ReliageneTechnologiesInc.,NewOrleans,LA):DYS19,DYS389I，DYS389II，DYS390,DYS391,DYS392,DYS393,DYS385a，b，DYS438,DYS439;(2)Y-PLEX6kit(ReliageneTechnologiesInc.,NewOrleans,LA):DYS19,DYS389II，DYS390,DYS391,DYS393,andDYS385;(3)Y-PLEX5kit(ReliageneTechnologiesInc.，NewOrleans,LA):DYS389I,DYS389II，DYS438,DYS439,DYS392;(4)PowerPlex吸YSystemkit((Promega，USA):DYS19,DYS389I,DYS389II,DYS390,DYS391,DYS392,DYS393,DYS385a，b，DYS437,DYS438andDYS439。(5)AmpFLSTRY-filerkit(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA，USA):DYS456,DYS389I,DYS390'DYS389II,DYS458,DYS19，DYS385a，b:DYS393，DYS391，DYS439'DYS635，DYS392'YGATAHA,DYS437,DYS438,DYS448)。但是，該類試劑盒在法醫(yī)學(xué)應(yīng)用實踐中存在以下問題(1)商品化試劑盒僅包括了既定的Y-STR位點，采用這類試劑盒需要增加遺傳標記時遇到困難；(2)這些Y-STR基因位點都是基于中國群體以外的群體(主要是白種人群體)資料而開發(fā)的，其中有些基因位點，在中國群體的基因頻率分布較表三。表三名稱類別加入量(質(zhì)量百分比)萘磺酸鈉減水劑0.5%聚磷酸鈉分散劑0.04%娃統(tǒng)慣"W絡(luò)合劑0.04%腐植酸鈣穩(wěn)定劑0.02%對所制得的水煤焦?jié){的質(zhì)量指標進行檢測，各質(zhì)量指標如下:漿濃度63-68%(以質(zhì)量計)；細度平均粒度50um:粘度600-lOOOmpa.s:穩(wěn)定性在正常條件下，3個月不發(fā)生硬沉淀。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>上述新的10個Y-STR位點，除DYS392位點的核心重復(fù)序列是三核苷酸，DYS438位點的核心重復(fù)序列是五核苷酸外，其余位點的核心重復(fù)序列均是四核苷酸。其中，擴增片段最小的是DYS459位點，片段長度為140-152bp，擴增片段最大的位點是DYS38911，片段長度為359-383bp，所有位點片段長度均適宜PCR擴增。上述新的IO個Y染色體STR基因位點的分型方法，其特征在于，包括下列步驟1.采用PCR分別擴增10個Y染色體STR基因位點的DNA，并設(shè)計位點的上下游引物序列，將上下游引物稀釋成100pM0L/L，作為母液，取出10"l稀釋到5uMOL/L，作為工作液；PCR擴增體系的體積為20pL，含1X反應(yīng)緩沖液，1.5mMOL/LMgcl2，0.5UTaq酶，0.25uMOL/L引物，200uM0L/LdNTP，DNA20200ng。2.PCR擴增參數(shù)為94"預(yù)變性3min，94"C變性lmin，根據(jù)位點的不同復(fù)性溫度進行30秒、72。C延伸lmin，共計30個循環(huán)，最后72。C延伸15min;3.擴增產(chǎn)物使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，采用銀染顯色方法，結(jié)合等位基因分型標準物進行標準化分型。上述等位基因分型標準物的制備方法包括下列步驟1)將具有不同基因型的純合子PCR產(chǎn)物分別與載體pGEM—T進行連接反應(yīng)。2)連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5a;3)涂布在氨芐青霉素瓊脂平板上，過夜培養(yǎng)；4)挑菌，大搖，提取質(zhì)粒DNA，備用；5)以質(zhì)粒DNA為模板，作PCR擴增，對各等位基因分型標準物進行鑒定；注意同時用25bpDNA標準參照物、測序樣本及標準細胞株GM9947A作對照，以確定標準片段大??；6)確定片段大小后大量擴增，將不同大小片段的等位基因混合即成等位基因分型標準物。本發(fā)明所需儀器和設(shè)備簡單，是一種簡便、快速、靈敏、經(jīng)濟的可行方法，適合在基層單位普及，對于中國目前的情況可以得到良好的效果。本發(fā)明所述技術(shù)方法可填補國內(nèi)沒有實用化的Y-STR檢測技術(shù)和方案的空白，并在中國多個民族的遺傳多態(tài)性研究中獲得了滿意的結(jié)果。利用這種技術(shù)制備的Y染色體段串聯(lián)重復(fù)序列分型試劑盒，可進行商業(yè)化生產(chǎn)并推廣為國內(nèi)各個實驗室使用，該技術(shù)克服了使用國外試劑盒無法反映中國多民族遺傳特點的缺陷，可應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)、人類學(xué)、遺傳學(xué)和疾病等領(lǐng)域的個體識別、親子鑒定以及基因診斷等方面，具有廣泛的應(yīng)用前景。特別適用于法醫(yī)學(xué)實踐中父方缺如(去世或失蹤)情況下的親權(quán)鑒定和強(輪)奸案中混合斑的個人認定，對患有無精癥或少精癥的犯罪嫌疑人的認定更具獨到之處。具體實施方式本發(fā)明提供的10個新的Y染色體STR基因位點，分別為DYS459、DYS456、DYS460、DYS461、DYS462、DYS438、DYS439、DYS389I、DYS389II和DYS392;上述10個Y染色體STR基因位點采用PCR擴增樣本DNA，擴增產(chǎn)物使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染顯色技術(shù)，結(jié)合等位基因分型標準物進行標準化分型。1.引物序列DYS460、DYS461、DYS462、DYS438、DYS439、DYS389I、DYS389II和DYS392八個位點的引物序列設(shè)計參照Genebank(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)，DYS456和DYS459兩個位點的引物序列設(shè)計參考AlanJRedd等的報道，10個Y-STR基因位點上下游引物序列見表2。將5.00D的上下游引物稀釋成100uMOL/L，作為母液；取出10u1稀釋到5"M0L/L，作為工作液，備用。表2IO個Y-STR位點的引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>2.PCR擴增PCR擴增體系推薦體積為20(iL，含IX反應(yīng)緩沖液，1.5mM0L/LMgcl2，0.5UTaq酶，0.25uMOL/L引物，200uMOL/LdNTP，DNA20200ng。使用PE9600擴增儀，PE9700擴增儀。目前各種方法提取的DNA模板，均適合Y染色體STR的擴增。PCR擴增參數(shù)為94"C預(yù)變性3min，94'C變性lmin，不同的復(fù)性溫度進行30秒、72。C延伸lmin，共計30個循環(huán)，最后72。C延伸15min。相關(guān)參考文獻中復(fù)性溫度多為57°C，申請人在實踐摸索中發(fā)現(xiàn)并證實了IO個Y-STR位點應(yīng)選用不同的復(fù)性溫度(見表3)。本實驗PCR反應(yīng)試劑均為國產(chǎn)試劑，結(jié)果均取得了滿意的效果，為試劑的國產(chǎn)化進行了有益的探索。表310個Y-STR位點不同的復(fù)性溫度<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>3.變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴增產(chǎn)物A:玻璃板的處理1)電泳所用長板42.0x30.5cm;短板39.0x30.5cm;2)戴好乳膠手套，將清洗干凈的長板放置在水平臺上，用一水平儀將水平臺調(diào)水平。將0.03ml親水劑倒在玻璃板中央，取適量脫脂棉球，將整塊玻璃板涂勻，在兩邊放好夾條(spacer),放置備用。3)將短玻璃板放置在另一水平臺上，取0.2ml配制好的疏水劑倒在玻璃板中央，用適量脫脂棉球，將整塊玻璃板涂勻，然后將玻璃板放置一邊晾干備用。B:聚丙烯酰胺凝膠的制備(6%)1)用100ml的小燒杯稱取42克超純的尿素，依次加入54ml的lx丁BE溶液、12ml40%丙烯酰胺和亞甲基雙丙稀酰胺膠液(19:1)，放在磁力加熱攪拌器上，56'c促進尿素完全溶解。2)尿素完全溶解冷卻至室溫后，加350|il的10%APS和35pl的TEMED，搖勻后開始灌膠。3)將膠液快速倒在長玻璃板上，短玻璃板置長玻璃板上水平推動膠液，使膠液流動充滿兩塊玻板，避免j^^^m:灌好膠后，將鯊魚齒梳反向插入膠板之間封口，注意封膠梳插入的深度(約6mm左右)。用六個燕尾夾將兩塊玻璃板一起固定住。灌好的膠室溫聚合約2小時待用。C:預(yù)電泳、上樣和電泳1)凝膠聚合后將梳子取出，用水沖洗膠板去除多余的凝膠碎片，用純水將加樣槽沖洗干凈。將膠板加到電泳槽上，短板向里，向下壓緊海綿墊，將四個螺旋鈕扭緊固定住膠板，關(guān)閉上槽電極液排放開關(guān)。在上槽倒入適量電極液(lxTBE)沒過短板，在下電泳槽中倒人適量電極液，將梳子用純水沖洗干凈插入加樣槽中(梳子尖插入凝膠約12mm)，關(guān)閉上下電泳槽蓋，接通電流，預(yù)電泳約l小時，使凝膠溫度達到5(TC左右。2)將PCR管做好標記，每管加入3.(^1的2x加樣緩沖液(2xloadingsolution),然后分別加入3.0^1擴增好的樣品(包括待檢樣本和標準細胞株GM9947A)及等位基因分型標準物，混勻后放入PE9600型擴增儀中95°C變性10分鐘，取出后立即放入冰浴中，準備上樣。3)結(jié)束預(yù)電泳后，用5ml吸管吹打加樣槽，去除氣泡。然后取3.0|_il制備好的樣品加到鯊魚齒梳子中，加樣過程應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡并盡可能減少加樣時間。4)樣品加完后，立即接通電流，40W恒功率進行電泳。電泳時間根據(jù)不同擴增產(chǎn)物大小而定，大約2小時到4小時(具體電泳時間可參考染料移動的位置確定)。4、凝膠的銀染及顯色1)電泳結(jié)束后，取出膠板，將梳子取出，用適當?shù)墓ぞ邔刹ＡО宸珠_，將粘有膠的長板放入水平搖床上的染色盤中。2)向染色盤中加入1000ml固定液(10%乙酸)，沒過凝膠，室溫搖動20分鐘。將固定液倒出并回收，加入純水，沒過凝膠洗三次，每次2-5分鐘。3)加人1000ml染色液，室溫下避光搖動30分鐘。將染色液倒出，加入純水，10秒鐘后將膠板取出，用純水沖洗膠板的背面，倒掉純水，將膠板重新放入染色盤中。4)加入1000ml顯色液(預(yù)冷至41(TC)，用肉眼進行觀察，直到電泳條帶清晰后，倒去顯色液，加入1000ml停顯液(10%乙酸)，IO分鐘后取出膠板，晾干，放在X光觀片燈上觀察并記錄結(jié)果，用掃描儀將結(jié)果保存到計算機中。5.等位基因分型標準物的制備利用基因克隆(Clone)方法制備包括下列步驟1)將具有不同基因型的純合子PCR產(chǎn)物分別與T-載體(pGEM—T)進行連接反應(yīng)。2)連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5a。3)涂布在氨芐青霉素瓊脂平板(60ug/ml)上，過夜培養(yǎng)。4)挑菌，大搖，提取質(zhì)粒DNA，備用。5)以質(zhì)粒DNA為模板，作PCR擴增，對各等位基因分型標準物進行鑒定。注意同時用25bpDNA標準參照物、測序樣本及標準細胞株GM9947A作對照，以確定標準片段大小。6)確定片段大小后大量擴增，將不同大小片段的等位基因混合即成等位基因分型標準物。本發(fā)明選用的10個Y-STR基因位點，采用PCR擴增樣本DNA，擴增產(chǎn)物使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染顯色技術(shù)，結(jié)合等位基因分型標準物進行標準化分型，所需儀器和設(shè)備簡單，操作方便，適合在基層單位普及，對于中國目前的情況有良好的推廣應(yīng)用效果。本發(fā)明填補了國內(nèi)沒有實用化的Y-STR檢測技術(shù)和方案的空白，申請人己應(yīng)用該發(fā)明所述的10個Y-STR基因位點在中國多個民族遺傳多態(tài)性研究中獲得滿意結(jié)果，利用這種技術(shù)制備的Y染色體短串聯(lián)重復(fù)序列分型試劑盒，可進行商業(yè)化生產(chǎn)并推廣，為國內(nèi)各實驗室及研究機構(gòu)使用該技術(shù)提供標準化的技術(shù)和方案，同時克服了使用國外試劑盒無法反映中國多民族遺傳特點的缺陷。權(quán)利要求1.一種新的10個Y染色體STR基因位點，其特征在于，該10個Y染色體STR基因位點分別為DYS459、DYS456、DYS460、DYS461、DYS462、DYS438、DYS439、DYS389I、DYS389II和DYS392；上述STR基因位點，除DYS392位點的核心重復(fù)序列是三核苷酸，DYS438位點的核心重復(fù)序列是五核苷酸外，其余位點的核心重復(fù)序列均是四核苷酸。其中，擴增片段最小的是DYS459位點，片段長度為140-152bp，擴增片段最大的位點是DYS389II，片段長度為359-383bp，所有位點片段長度均適宜PCR擴增。2.權(quán)利要求1所述的新的10個Y染色體STR基因位點的分型方法，其特征在于，包括下列步驟采用PCR分別擴增10個Y染色體STR基因位點的DNA，并設(shè)計位點的上下游引物序列，將上下游引物稀釋成100uMOL/L，作為母液，取出lOyl稀釋到5uM0L/L，作為工作液；PCR擴增體系的體積為20pL，含1X反應(yīng)緩沖液，1.5mM0L/LMgcl2，0.5UTaq酶，0.25uMOL/L引物，200uMOL/LdNTP，DNA20200ng。PCR擴增參數(shù)為94"C預(yù)變性3min，94"C變性lmin，根據(jù)位點的不同復(fù)性溫度進行30秒、72'C延伸lmin，共計30個循環(huán)，最后72。C延伸15min;擴增產(chǎn)物使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，采用銀染顯色方法，結(jié)合等位基因分型標準物進行標準化分型。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的等位基因分型標準物的制備包括下列步驟1)將具有不同基因型的純合子PCR產(chǎn)物分別與載體pGEM—T進行連接反應(yīng)。2)連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5a;3)涂布在氨芐青霉素瓊脂平板上，過夜培養(yǎng)；4)挑菌，大搖，提取質(zhì)粒DNA，備用；5)以質(zhì)粒DNA為模板，作PCR擴增，對各等位基因分型標準物進行鑒定；注意同時用25bpDNA標準參照物、測序樣本及標準細胞株GM9947A作對照，以確定標準片段大?。?)確定片段大小后大量擴增，將不同大小片段的等位基因混合即成等位基因分型標準物。全文摘要本發(fā)明公開了一種新的10個Y染色體STR基因位點及其分型方法，用聚丙烯酰胺凝膠電泳分型，結(jié)合銀染顯色方法篩選出可應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的10個Y染色體STR位點，并制備了各位點等位基因分型標準物(AllelicLadder)，對Y染色體STR位點的PCR引物和擴增條件進行了優(yōu)化，其中對PCR引物和擴增條件的優(yōu)化和等位基因分型標準物的制備，可以做到標準化和簡單化并適合基層單位普及?？蓱?yīng)用于法醫(yī)學(xué)、人類學(xué)、遺傳學(xué)和疾病等領(lǐng)域的個體識別、親子鑒定以及基因診斷等方面，具有廣泛的應(yīng)用前景。特別適用于法醫(yī)學(xué)實踐中父方缺失(如去世或失蹤)情況下的親權(quán)鑒定和強(輪)奸案中混合斑的個體認定，對患有無精癥或少精癥的犯罪嫌疑人的認定更具獨到之處。文檔編號C12N15/12GK101225386SQ200810017379公開日2008年7月23日申請日期2008年1月22日優(yōu)先權(quán)日2008年1月22日發(fā)明者李生斌,麗楊,沈春梅,賴江華,駿馬申請人:西安交通大學(xué)