專利名稱：：一種無(wú)抗性標(biāo)記營(yíng)養(yǎng)缺陷型光滑球擬酵母的構(gòu)建方法一種無(wú)抗性標(biāo)記營(yíng)養(yǎng)缺陷型光滑球擬酵母的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種無(wú)抗性標(biāo)記營(yíng)養(yǎng)缺陷型光滑球擬酵母的構(gòu)建方法，本發(fā)明利用融合PCR、高效率酵母電轉(zhuǎn)化感受態(tài)制備、制霉菌素富集和限制性培養(yǎng)基篩選構(gòu)建大片段缺失的無(wú)抗性標(biāo)記營(yíng)養(yǎng)缺陷型光滑球擬酵母，屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。技術(shù)背景光滑球擬酵母是一種單倍體酵母，沒有有性生殖階段。光滑球擬酵母被廣泛用于丙酮酸和oc-酮戊二酸的生產(chǎn)。某些光滑球擬酵母菌株還是臨床上的機(jī)會(huì)致病菌。光滑球擬酵母的基因工程研究目前還處于起步階段。在酵母中最常用的遺傳標(biāo)記是可以完成互補(bǔ)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記。目前國(guó)內(nèi)研究光滑球擬酵母分子生物學(xué)的機(jī)構(gòu)較少，仍處于研究的初步階段。篩選光滑球擬酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株是對(duì)其進(jìn)行深入研究的重要基礎(chǔ)工作之
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種無(wú)抗性標(biāo)記營(yíng)養(yǎng)缺陷型光滑球擬酵母的構(gòu)建方法，并使用其構(gòu)建了三株?duì)I養(yǎng)缺陷型菌株。本發(fā)明的技術(shù)方案的詳細(xì)描述一種無(wú)抗性標(biāo)記營(yíng)養(yǎng)缺陷型光滑球擬酵母的構(gòu)建方法，該方法有機(jī)的結(jié)合了融合PCR技術(shù)，酵母高效率感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化技術(shù)，制霉菌素富集技術(shù)及限制性培養(yǎng)基篩選技術(shù)；(1)融合PCR技術(shù)根據(jù)融合PCR技術(shù)，使用4條引物，使用/^高保真DNA聚合酶從基因組上PCR得到待敲除基因的左右兩臂，再進(jìn)一步進(jìn)行融合PCR將左右臂連接起來(lái);(2)酵母高效率感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化技術(shù)a)挑單菌落接種于5mLYPD培養(yǎng)基中，30。C過(guò)夜培養(yǎng)至飽和；b)0.1。/。接種至100mLYPD培養(yǎng)基中，30。C培養(yǎng)10h,細(xì)胞密度為1X108細(xì)胞/mL;c)培養(yǎng)物分裝至兩個(gè)50mL預(yù)冷的無(wú)菌離心管中，5000rpm、5min離心去上清，每管加入8mL無(wú)菌水重懸，合并成一管；d)加入2mLpH7.5的IO倍TE緩沖液，搖動(dòng)混勻，加入2mL1mol七-1醋酸鋰和0.5mLlmol'L"二硫代蘇糖醇，旋轉(zhuǎn)混勻，30°C，50rpm，搖45min;e)菌懸液稀釋至50mL水中，5000rpm、5min沉淀細(xì)胞，去上清，重復(fù)一次；f)用適量預(yù)冷的1mol/L山梨醇重懸，使最終菌懸液OD,-200;按每份80pL分裝于1.5mL離心管中，直接轉(zhuǎn)化或保存于-80。C;g)將20)iL的PCR片段/質(zhì)粒，與80pL的上述步驟f)所得的菌體混勻，轉(zhuǎn)至0.2cm冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中，冰浴5min;h)采用電穿孔儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)化電壓1.5kV;電容25^F;電阻200Q;電擊時(shí)間為5ms;i)電擊完畢后，加入1mL冰預(yù)冷的1moll'1山梨醇溶液將菌體混勻，轉(zhuǎn)移至1.5mL的離心管中；(3)制霉菌素富集技術(shù)及限制性培養(yǎng)基篩選技術(shù)j)將步驟i)所得菌懸液轉(zhuǎn)入YPD液體培養(yǎng)基中24h后，離心；k)所得菌體用NFMM洗滌后繼續(xù)在NFMM中培養(yǎng)6h，用NFMM離心洗滌后，再加入MM培養(yǎng)2h;1)MM離心洗滌后，分別加入制霉菌素和蔗糖至終濃度10pg.L"和170g.L"，培養(yǎng)30-120min;m)將菌體懸液稀釋10，100，IOOO倍分別涂布于LM平板上；n)將平板置于30。C培養(yǎng)，直至單個(gè)菌落出現(xiàn)；o)小菌落為可能的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株；p)挑取平板上的小菌落進(jìn)一步在MM平板相應(yīng)的SM平板上進(jìn)行劃線分離確認(rèn)；q)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株進(jìn)一步用菌落PCR進(jìn)行驗(yàn)證。構(gòu)建了3種營(yíng)養(yǎng)缺陷型光滑球擬酵母菌株分別是精氨酸缺陷型光滑球擬酵母菌株，尿嘧啶缺陷型光滑球擬酵母菌株，精氨酸/尿嘧啶雙缺陷型光滑球擬酵母菌株。相關(guān)培養(yǎng)基IO倍TE:將100mMTris-Hcl(pH=8.0)6.057g與10mMEDTA(pH=8.0)1.8612g溶于ddH20中，調(diào)pH-7.5，定容到500mL。酵母膏蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基(YPD):酵母抽提物10gl—1，胰蛋白胨2.0g，L—1，葡萄糖20g丄—1。無(wú)氮源基本培養(yǎng)基(NFMM):葡萄糖20g.L"，KH2P041.0g.L"，MgS04.7H200.5g.L"?；九囵B(yǎng)基(MM):NFMM中加入(NH4)2S0410g丄"。限制性培養(yǎng)基(LM):MM中加入0.5。/。的YPD。各種補(bǔ)充培養(yǎng)基(SM):MM中加入相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)80mg，L-1精氨酸(SM-ARG),80mgl"尿嘧啶(SM-URA)，80mgl"精氨酸和80mgl'1尿嘧啶(SM畫ARG/URA);維生素溶液煙酸1.0gl"，生物素5.0mg.L'1，維生素B!5.0mg.U1，維生素B650mg.lA以上所有培養(yǎng)基中每升均加入10mL維生素溶液和1mL100g.U1氨芐青霉素，pH均調(diào)節(jié)至6，并在115'C滅菌10min.相應(yīng)的YPD，MM和SM平板均加入20g1—1瓊脂粉。而LM平板僅加入15g丄'1瓊脂粉。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明為一種選育大片段缺失的無(wú)抗性標(biāo)記營(yíng)養(yǎng)缺陷型光滑球擬酵母的系統(tǒng)方法，主要包括融合PCR方法得到大片段缺失的同源重組片段，高效率酵母電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備，制霉菌素富集和限制性培養(yǎng)基篩選。通過(guò)一整套系統(tǒng)方法，可以在3-5天內(nèi)快速的得到目的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。大片段的缺失，有效的避免了回復(fù)突變和與外源質(zhì)粒的同源重組。此外，由于在整個(gè)過(guò)程中未使用任何抗性標(biāo)記，使用該方法還可以在同一出發(fā)菌株上使用多次，得到多重營(yíng)養(yǎng)缺陷型，供后續(xù)基因工程研究使用。具體實(shí)施方式實(shí)施例1按照上文所述方法，用引物P1/P2和P3/P4，以基因組DNA作為模板，用p/"高保真DNA聚合酶，分別得到了^GS基因的左右臂，PCR條件為95°C，3min;{95。C，50s;55。C，50s;72。C，lmin}，循環(huán)30次；72。C,15min;-2(TC保存。將所得左右臂分別割膠回收后，再分別作為模板，以P1/P4為引物，得到大片段缺失的J"rgS片段。PCR條件如下94°C，4min;{94°C，50s;55°C，50s;72°C,3min}，循環(huán)30次；72°C，12min，-20。C保存?zhèn)溆谩⑺脄lagS片段電轉(zhuǎn)化光滑球擬酵母CCTCCNO:M202019，按后續(xù)富集步驟進(jìn)行培養(yǎng)，得到了一株精氨酸缺陷型光滑球擬酵母菌株。并用引物P1/P4進(jìn)一步進(jìn)行了菌落PCR驗(yàn)證。引物編號(hào)引物引物序列(5'-3')PIP2ARG8國(guó)leftSARG8-leftAGAACAATACCACCGTAAGTGAGTAATTTTGGTTAACGCTTAGGGAAAACAGATP3P4ARG8腸rightSARG8-rightATAAGCGTTAACCAAAATTACAGTACCCAAGCCGATAATAACATAGATGCCGACA實(shí)施例2按照上文所述方法，用引物P5/P6和P7/P8，以基因組DNA作為模板，用p/"高保真DNA聚合酶，分別得到了WL43基因的左右臂，PCR條件為95°C，3min;{95。C，50s;55。C，50s;72。C，2min}，循環(huán)30次；72。C，15min;-20°(:保存。將所得左右臂分別割膠回收后，再分別作為模板，得到大片段缺失的z/w"3片段。PCR條件如下:94°C，4min;{94°C,50s;55°C，50s;72°C，3min}，循環(huán)30次；72°C，12min;-20°(:保存。將所得z/wra3片段電轉(zhuǎn)化光滑球擬酵母CCTCCNO:M202019，按后續(xù)富集步驟進(jìn)行培養(yǎng)，得到了一株尿嘧啶缺陷型光滑球擬酵母菌株。并用引物P5/P8進(jìn)一步進(jìn)行了菌落PCR驗(yàn)證。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例3將實(shí)施例2中所得zl"ra3片段電轉(zhuǎn)化實(shí)施例1中所得的精氨酸缺陷型菌株，按后續(xù)富集步驟進(jìn)行培養(yǎng)，得到了一株精氨酸/尿嘧啶雙缺陷型光滑球擬酵母菌株。并分別用引物Pl/P4和P5/P8進(jìn)一步進(jìn)行了PCR驗(yàn)證。權(quán)利要求1、一種無(wú)抗性標(biāo)記營(yíng)養(yǎng)缺陷型光滑球擬酵母的構(gòu)建方法，其特征是有機(jī)的結(jié)合了融合PCR技術(shù)，酵母高效率感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化技術(shù)，制霉菌素富集技術(shù)及限制性培養(yǎng)基篩選技術(shù)；(1)融合PCR技術(shù)根據(jù)融合PCR技術(shù)，使用4條引物，使用pfu高保真DNA聚合酶從基因組上PCR得到待敲除基因的左右兩臂，再進(jìn)一步進(jìn)行融合PCR將左右臂連接起來(lái)；(2)酵母高效率感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化技術(shù)a)挑單菌落接種于5mLYPD培養(yǎng)基中，30℃過(guò)夜培養(yǎng)至飽和；b)0.1％接種至100mLYPD培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)10h，細(xì)胞密度為1×108細(xì)胞/mL；c)培養(yǎng)物分裝至兩個(gè)50mL預(yù)冷的無(wú)菌離心管中，5000rpm、5min離心去上清，每管加入8mL無(wú)菌水重懸，合并成一管；d)加入2mLpH7.5的10倍TE緩沖液，搖動(dòng)混勻，加入2mL1mol·L-1醋酸鋰和0.5mL1mol·L-1二硫代蘇糖醇，旋轉(zhuǎn)混勻，30℃，50rpm，搖45min；e)菌懸液稀釋至50mL水中，5000rpm、5min沉淀細(xì)胞，去上清，重復(fù)一次；f)用適量預(yù)冷的1mol·L-1山梨醇重懸，使最終菌懸液OD＝200；按每份80μL分裝于1.5mL離心管中，直接轉(zhuǎn)化或保存于-80℃；g)將20μL的PCR片段/質(zhì)粒，與80μL的上述步驟f)所得的菌體混勻，轉(zhuǎn)至0.2cm冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中，冰浴5min；h)采用電穿孔儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)化電壓1.5kV；電容25μF；電阻200Ω；電擊時(shí)間為5ms；i)電擊完畢后，加入1mL冰預(yù)冷的1mol·L-1山梨醇溶液將菌體混勻，轉(zhuǎn)移至1.5mL的離心管中；(3)制霉菌素富集技術(shù)及限制性培養(yǎng)基篩選技術(shù)j)將步驟i)所得菌懸液轉(zhuǎn)入YPD液體培養(yǎng)基中24h后，離心；k)所得菌體用NFMM洗滌后繼續(xù)在NFMM中培養(yǎng)6h，用NFMM離心洗滌后，再加入MM培養(yǎng)2h；l)MM離心洗滌后，分別加入制霉菌素和蔗糖至終濃度10μg·L-1和170g·L-1，培養(yǎng)30-120min；m)將菌體懸液稀釋10，100，1000倍分別涂布于LM平板上；n)將平板置于30℃培養(yǎng)，直至單個(gè)菌落出現(xiàn)；o)小菌落為可能的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株；p)挑取平板上的小菌落進(jìn)一步在MM平板相應(yīng)的SM平板上進(jìn)行劃線分離確認(rèn)；q)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株進(jìn)一步用菌落PCR進(jìn)行驗(yàn)證。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種無(wú)抗性標(biāo)記營(yíng)養(yǎng)缺陷型光滑球擬酵母的構(gòu)建方法，其特征是構(gòu)建了3種營(yíng)養(yǎng)缺陷型光滑球擬酵母菌株分別是精氨酸缺陷型光滑球擬酵母菌株，尿嘧啶缺陷型光滑球擬酵母菌株，精氨酸/尿嘧啶雙缺陷型光滑球擬酵母菌株。全文摘要一種無(wú)抗性標(biāo)記營(yíng)養(yǎng)缺陷型光滑球擬酵母的構(gòu)建方法，屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明為一種選育大片段缺失的無(wú)抗性標(biāo)記營(yíng)養(yǎng)缺陷型光滑球擬酵母的系統(tǒng)方法，主要包括融合PCR方法得到大片段缺失的同源重組片段，高效率酵母電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備，制霉菌素富集和限制性培養(yǎng)基篩選。通過(guò)一整套系統(tǒng)方法，可以在3-5天內(nèi)快速的得到目的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。大片段的缺失，有效的避免了回復(fù)突變和與外源質(zhì)粒的同源重組。此外，由于在整個(gè)過(guò)程中未使用任何抗性標(biāo)記，使用該方法還可以在同一出發(fā)菌株上使用多次，得到多重營(yíng)養(yǎng)缺陷型，供后續(xù)基因工程研究使用。文檔編號(hào)C12R1/645GK101240250SQ20081001866公開日2008年8月13日申請(qǐng)日期2008年3月7日優(yōu)先權(quán)日2008年3月7日發(fā)明者劉立明,周景文,堵國(guó)成,堅(jiān)陳申請(qǐng)人:江南大學(xué)