專利名稱：一種產(chǎn)紅霉素c的糖多孢紅霉菌突變體的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種產(chǎn)紅霉素c的糖多孢紅霉菌突變體的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
紅霉素(ery仇romycin， Er)是由革蘭氏陽性菌糖多孢紅霉菌 (AiccA<wv/w/"/wra e/y狄raefl)合成的次生代謝產(chǎn)物，為一類大環(huán)內(nèi)酯類抗生 素，包括紅霉素A (ErA)、紅霉素B (ErB)、紅霉素C (ErC)、紅霉素D (ErD)等。這四種紅霉素均有抑菌活性，但在臨床上具有廣泛用途的是ErA, 它的抑菌活性最高。紅霉素的生物合成分為兩大部分紅霉素母核(6-dEB)的合成和6-dEB 的后修飾。前者由一分子丙酸和六分子甲基丙二酸在聚酮合成酶(PKS)復(fù)合 體的催化作用下完成；隨后6-dEB在C-6位羥基化酶及在C-3位和C-5位羥基 糖基化酶作用下形成了第一個(gè)有活性的中間產(chǎn)物ErD;接著，ErD可以先在C-12 位羥基化酶EiyK作用下形成ErC，再在3"-0-甲基轉(zhuǎn)移酶EryG作用下形成 ErA，這是一條主要途徑；然而在體內(nèi)還有另一條次要途徑，即ErD先在EiyG 作用下形成ErB，再在EryK作用下形成ErA。紅霉素生物合成基因以單一拷貝、成簇存在于糖多孢紅霉菌染色體上，質(zhì) 粒不參與紅霉素的生物合成。糖多孢紅霉菌紅霉素3"-0-甲基轉(zhuǎn)移酶是一種S-腺 苷甲硫氨酸(SAM)依賴的甲基化酶，在降低紅霉素的毒性和提高紅霉素的活 性方面起著重要的作用。糖多孢紅霉菌紅霉素3"-0-甲基轉(zhuǎn)移酶ei^G基因開放閱讀框(ORF)由921 對核苷酸組成，編碼產(chǎn)物EryG有306個(gè)氨基酸。通過比對EryG和其它幾種甲基 轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)在氨基末端都有一個(gè)富含甘氨酸(Gly)的S-腺苷甲硫 氨酸(SAM)結(jié)合位點(diǎn)基序，保守區(qū)序列為VLE/DXGXGXG。本研究構(gòu)建的糖多孢紅霉菌A226G—突變體不再合成ErA，表明刪除突變后的eo;G基因表達(dá)產(chǎn)物不再有甲基轉(zhuǎn)移酶活性。巨大霉素和紅霉素A的生物合成有 著共同的中間體紅霉素C，所以本發(fā)明構(gòu)建的缺失紅霉素^v( 基因的糖多孢紅霉 菌A226G—突變體，不但為進(jìn)一步深入研究EryG相關(guān)的酶學(xué)性質(zhì)奠定了基礎(chǔ)，而 且也為研究巨大霉素生物合成中紅霉素C之后的修飾酶提供了一個(gè)系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)紅霉素C的糖多孢紅霉菌突變體的構(gòu)建方法，不 但為進(jìn)一步深入研究EryG相關(guān)的酶學(xué)性質(zhì)奠定了基礎(chǔ)，而且也為研究巨大霉素 生物合成中紅霉素C之后的修飾酶提供了 一個(gè)系統(tǒng)。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種產(chǎn)紅霉素C的糖多孢紅霉菌突變體的構(gòu)建方法，其特征在于利用染色體 同源重組的性質(zhì)，將糖多孢紅霉菌染色體上紅霉素3"-0-甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因 eiy(7刪除，或?qū)⒑蠩ryG S-腺苷甲硫氨酸SAM結(jié)合位點(diǎn)對應(yīng)的DNA序列在內(nèi)的 一DNA片段刪除，或?qū)v(7基因插入失活，得到產(chǎn)紅霉素C的糖多孢紅霉菌突變 體。所述的一種產(chǎn)紅霉素C的糖多孢紅霉菌突變體的構(gòu)建方法，其特征在于所 述的刪除或插入失活方法是指下列方法之一(1)先用重疊PCR方法從糖多孢 紅霉菌基因組中擴(kuò)增出紅霉素3"-0-甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因ei^ 缺失或部分缺失 的重疊DNA片段，將其克隆到質(zhì)粒pWHM3上構(gòu)建成同源重組質(zhì)粒，再將此質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化到糖多孢紅霉菌中，使其發(fā)生染色體同源重組，篩選出^vG基因失活的 糖多孢紅霉菌突變體，其發(fā)酵產(chǎn)物為紅霉素C; (2)用PCR方法擴(kuò)增出紅霉 素^G基因部分DNA片段，將其克隆到質(zhì)粒pWHM3上，構(gòu)建成同源重組質(zhì) 粒，將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到糖多孢紅霉菌中，使其經(jīng)染色體同源重組插入到eo^基因 上，從而使其蛋白產(chǎn)物EiyG失活，得到產(chǎn)紅霉素C的糖多孢紅霉菌突變體；(3) 用限制酶酶切的方法從糖多孢紅霉菌基因組文庫中將紅霉素基因的部分 DNA片段亞克隆到質(zhì)粒pWHM3上，構(gòu)建成同源重組質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到糖多 孢紅霉菌中，使其經(jīng)染色體同源重組插入到e/jG基因上，從而使其蛋白產(chǎn)物 EiyG失活，得到產(chǎn)紅霉素C的糖多孢紅霉菌突變體；(4)先用PCR方法從糖多孢紅霉菌基因組中擴(kuò)增出紅霉素基因全部或部分DNA片段，將其克隆 到質(zhì)粒pWHM3上，接著將選擇標(biāo)記基因(如抗性基因)克隆到質(zhì)粒pWHM3 插入片段中間的合適位置上，構(gòu)建成同源重組質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到糖多孢紅霉 菌中，使其發(fā)生染色體同源重組，篩選出e/jG基因失活的糖多孢紅霉菌突變體， 其發(fā)酵產(chǎn)物為紅霉素C。所述的一種產(chǎn)紅霉素C的糖多孢紅霉菌突變體的構(gòu)建方法，其特征在于具體 做法是用重疊PCR方法從糖多孢紅霉菌基因組中擴(kuò)增出缺失e/j(7基因起始密 碼子下游343-632nt的同源DNA片段Zi( ，將其克隆到同源重組質(zhì)粒pWHM3上， 構(gòu)建了pWHMAG。將pWHMAG質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到糖多孢紅霉菌中，使其與染色體 發(fā)生同源重組，篩選出e/y(7基因失活的糖多孢紅霉菌突變體。以糖多孢紅霉菌A226基因組DNA為模版，用重疊PCR方法擴(kuò)增出去除EryG S-腺苷甲硫氨酸(SAM)結(jié)合位點(diǎn)DNA序列在內(nèi)290bp的約1600bpDNA片段， 克隆于同源重組質(zhì)粒pWHM3，構(gòu)建了同源重組質(zhì)粒pWHMAG。 PEG介導(dǎo)原生 質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將pWHMAG轉(zhuǎn)入糖多孢紅霉菌A226，通過同源重組整合到紅霉素合 成基因位點(diǎn)上。整合體在無抗R3M斜面培養(yǎng)基上連續(xù)生長三代后，制備原生質(zhì) 體涂R3M平板。利用薄層層析(TLC)， PCR和質(zhì)譜(MS)方法篩選出一株ei^G 基因失活的糖多孢紅霉菌A226G—突變體r此A226G—突變體只能積累中間產(chǎn)物紅 霉素C而不再合成紅霉素A。通過引入正常eiyG基因表達(dá)質(zhì)?？苫謴?fù)A226G—突變 體紅霉素A的合成能力，但產(chǎn)量比出發(fā)菌株A226要低。


圖1 pWHMAG質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證 1: DNAMarkerl5 000;2: pWHMAG質(zhì)粒五co R I和fi/"d III酶切產(chǎn)物 圖2整合體I和II的PCR驗(yàn)證1: DNA Marker 2 000;2:整合體I的ter基因PCR產(chǎn)物；3:整合體II的ter基因PCR產(chǎn)物 圖3整合體I和II中質(zhì)粒整合位點(diǎn)的確定1:紅霉素A (ErA)標(biāo)準(zhǔn)品；2:糖多孢紅霉菌A226發(fā)酵液；3:整合體I發(fā)酵液；4:整合體II發(fā)酵液 圖4糖多孢紅霉菌A226G—突變體的TLC鑒定1:紅霉素A (ErA)標(biāo)準(zhǔn)品；2:糖多孢紅霉菌A226發(fā)酵液；3: A226G—突變體發(fā)酵液；4:整合體I發(fā)酵液 圖5 A226G-突變體的PCR驗(yàn)證1: DNA Marker 2 000;2: A226G-突變體的e/yG的PCR產(chǎn)物；3: A226野生菌的e/yG的PCR產(chǎn)物 圖6 A226G—突變體發(fā)酵產(chǎn)物的MS鑒定1: 720.17為[ErC]H+;2: 702.17為￡|><:-1120111+ 圖7 pZMWG質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證1: DNAMarkerl5 000;2: pZMWG質(zhì)粒7Vrfe I和RV酶切產(chǎn)物 圖8互補(bǔ)測驗(yàn)1:紅霉素A (ErA)標(biāo)準(zhǔn)品；2:糖多孢紅霉菌A226發(fā)酵液；3:工程菌A226G—G+發(fā)酵液；4:整合體I發(fā)酵液
具體實(shí)施例方式
1材料與方法 1.1材料l丄l菌種和質(zhì)粒糖多孢紅霉菌A226、大腸桿菌ET12567、同源重組質(zhì)粒pWHM3、糖多孢紅 霉菌染色體整合型表達(dá)載體pZMW、大腸桿菌DH5ou克隆質(zhì)粒pUC18為本室保存；質(zhì)粒pUCAG、 pWHMAG、糖多孢紅霉菌突變體A226G-、質(zhì)粒pZMWG、糖多孢紅霉菌工程菌A226G—G+為本研究構(gòu)建。1.1.2培養(yǎng)基、緩沖液和試劑LB培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基、R3M培養(yǎng)基、PEG3350-T緩沖液和改進(jìn)P緩沖液。 硫鏈絲菌肽(Thiostrepton，Tsr)、氯樸霉素(Apramycin， Am) 、 PEG3350為Sigma公司產(chǎn)品，溶菌酶為Fluka公司產(chǎn)品，蛋白酶K為AMRESCO公司產(chǎn)品，TSB為DIFCO公司產(chǎn)品，限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker (DL2 000和DL15 000)為大連寶生物公司產(chǎn)品，RNaseA、 dNTP、 pfu和TaqDNA聚合酶為上海生工公司產(chǎn)品，質(zhì)粒提取試劑盒和PCR產(chǎn)物回收試劑盒為道普生物科技(北京)有限公司產(chǎn)品，其它試劑為分析純。1.2方法1.2.1大腸桿菌的培養(yǎng)、感受態(tài)細(xì)胞的制備、質(zhì)粒的酶切、連接、轉(zhuǎn)化；質(zhì)粒提 取、PCR產(chǎn)物純化按道普生物科技(北京)有限公司產(chǎn)品說明書進(jìn)行 1.2.2糖多孢紅霉菌A226的培養(yǎng)和基因組DNA的提取 1.2.3 AG DNA片段重疊PCR弓|物的設(shè)計(jì)為刪除糖多孢紅霉菌染色體上紅霉素3"-0-甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因(《j(7)中 間部分290bp DNA序列(對應(yīng)于Genbank Accession No. AM420293序列中的 823972-824261nt)，在刪除位點(diǎn)兩側(cè)各擴(kuò)增一段同源片段。為了兩同源片段間進(jìn) 行重疊PCR擴(kuò)增，上游片段Fral的反向引物和下游片段Fra2的正向引物完全互 補(bǔ)，這樣經(jīng)重疊PCR擴(kuò)增的DNA片段不含SAM結(jié)合位點(diǎn)DNA在內(nèi)的2卯bp DNA 片段(相對于e/jG基因起始密碼子下游的343-632nt)。上游片段Fral:Pll: 5'-accGAATTCtgtacaacctggcggtccggcacg (大寫字母表示Eco R I識別 位點(diǎn))，P12: 5'-ctccaccgggatgccgccggacagcggtcaggtcgacgccgacgatcctggcc 下游片段Fra2:P21s 5，-ggccaggatcgtcggcgtcgacctgaccgctgtccggcggcatcecggtggag，P22: 5'-gaAAGCTTgggcaccgccggcgagatcg (大寫字母表示好/"d III識別位點(diǎn))1.2.4糖多孢紅霉菌紅霉素ei^G基因PCR引物的設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank公布的糖多孢紅霉菌紅霉素ei^G基因序列(Genbank Accession No. AM420293)，設(shè)計(jì)并合成了l對引物上游引物P1: 5'-cggCATATGagcgtgaagcagaagtcagc (大寫字母表示iVrfe I 識別位點(diǎn))下游引物P2: 5'-gtgAAGCTTGATATCtacgcgccgggcttg(大寫字母表示HZ"d III和EcoRV識別位點(diǎn)) 1.2.5 AG DNA片段和eijG基因片段的PCR擴(kuò)增 1.2.6糖多孢紅霉菌A226原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化1.2.7糖多孢紅霉菌A226::pWHMAG整合體I和1I及糖多孢紅霉菌A226G-突變 體的篩選1.2.8 A226::pWHMAG整合體I和II及A226G-突變體發(fā)酵液中紅霉素成分的薄 層層析(TLC)分析1.2.9 A226::pWHMAG整合體I和II的PCR鑒定1.2.10A226G—突變體PCR鑒定的引物序列設(shè)計(jì)按1.2.4節(jié)中設(shè)計(jì)的引物序列 1.2.11 A226G突變體發(fā)酵液中紅霉素成分的質(zhì)譜(MS)分析 2結(jié)果與分析2.1同源重組質(zhì)粒pWHMAG的構(gòu)建以糖多孢紅霉菌A226基因組DNA為模板，PCR先擴(kuò)增出上游片段Fral和 下游片段Fra2，再以Fral和Fra2為模版、P11和P22為引物，用重疊PCR擴(kuò)增 出全長約l 600bp的DNA片段AG，克隆到pUC18載體上構(gòu)建了質(zhì)粒pUCAG。 序列分析表明，所克隆的AG DNA片段序列與GenBank公布的序列完全一致(預(yù) 期的290bp DNA片段已被刪除)。pWHM3質(zhì)粒為穿梭型質(zhì)粒，在糖多孢紅霉菌中不能穩(wěn)定存在，故可作為糖 多孢紅霉菌的同源重組質(zhì)粒。pUCAG質(zhì)粒中外源DNA用五co R I和H/wd m酶切 后連于pWHM3質(zhì)粒相應(yīng)酶切位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a獲得了pWHMAG質(zhì)粒 (圖l)。為避免糖多孢紅霉菌對外源基因甲基化特異的限制性作用，將pWHMAG質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌ET12567，得到了無甲基化修飾的pWHMAG質(zhì)粒。2.2糖多孢紅霉菌A226::pWHMAG整合體I和II的篩選將糖多孢紅霉菌A226制成原生質(zhì)體，用pWHMAG質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，在含30ng/mL Tsr的R3M固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。因pWHMAG質(zhì)粒在糖多孢紅霉菌中不能復(fù) 制，只有整合到染色體上才能賦予菌體Tsr抗性。從轉(zhuǎn)化平皿中挑取110個(gè)單菌落 涂含30ng/mL Tsr的R3M斜面，有2個(gè)菌落可正常生長，分別命名為 A226::pWHMAG整合體I和II 。提取整合體I和II基因組DNA做模板，PCR擴(kuò) 增pWHMAG質(zhì)粒上Tsr抗性基因ter進(jìn)行鑒定。1.2。/。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示， PCR產(chǎn)物位于768bp附近(圖2)，表明pWHMAG質(zhì)粒已整合到A226的染色體 上。2.3整合體I和II中質(zhì)粒整合位點(diǎn)的確定糖多孢紅霉菌紅霉素生物合成基因在染色體上以單一拷貝、成簇形式存在， 其中eovl /、 e/yv4//、 eijv4iZr、 eijC//、 eiyC2ZT、 e/j5Zr和ei3;G為一條多順反子， 共同受到e/^4 /啟動(dòng)子的控制。若pWHMAG質(zhì)粒與A226染色體在同源片段Fral 內(nèi)發(fā)生同源重組，那么e/yG基因的表達(dá)將會(huì)受到阻斷，整合體發(fā)酵液就會(huì)積累紅 霉素A生物合成的中間產(chǎn)物紅霉素C;若在同源片段Fra2內(nèi)發(fā)生同源重組，那么 e/3;G基因的表達(dá)將不會(huì)受到影響，整合體仍然可以合成紅霉素A。為了確定pWHMAG質(zhì)粒的整合位置，提取整合體I和II發(fā)酵液中的紅霉素 做薄層層析(TLC) ， TLC結(jié)果顯示整合體I是在同源片段Fral內(nèi)發(fā)生同源重 組的，而整合體II是在同源片段Fra2內(nèi)發(fā)生同源重組的(圖3)。在整合體I紅霉素發(fā)酵液中仍有少量的紅霉素A，說明即使是在同源片段 Fral內(nèi)發(fā)生同源重組也沒有完全阻斷e/5;G基因的表達(dá)，這暗示著e/j(7基因可能 有單獨(dú)的啟動(dòng)子。2.4糖多孢紅霉菌A226G—突變體的篩選質(zhì)粒pWHMAG在染色體上不穩(wěn)定，在無抗生素選擇壓力時(shí)會(huì)自動(dòng)經(jīng)染色體 二次重組脫落。若第二次重組與第一次重組發(fā)生在同一同源片段內(nèi)，質(zhì)粒脫落 后染色體會(huì)回復(fù)到質(zhì)粒整合前狀態(tài)，菌株恢復(fù)紅霉素A合成能力；若第二次重組 與第一次重組發(fā)生在不同的同源片段內(nèi)，質(zhì)粒脫落后e^G基因DNA序列中預(yù)期 的2卯bpDNA片段會(huì)發(fā)生刪除突變，突變株將失去紅霉素A合成能力，發(fā)酵液中 會(huì)有紅霉素C的積累。糖多孢紅霉菌A226::pWHMAG整合體I在無Tsr的R3M斜面上連續(xù)傳三代 后，將制得的原生質(zhì)體不同濃度稀釋液涂無Tsr的R3M平皿。從平皿中挑取約l 000個(gè)單菌落，各連續(xù)涂含3(Hig/mLTsr的R3M斜面和無Tsr的R3M斜面，其中有 5個(gè)菌落僅可以在無Tsr的R3M斜面上生長。提取這5個(gè)克隆的紅霉素做TLC， 結(jié)果表明只有4號克隆僅可以積累紅霉素C，此克隆命名為A226G—(圖4)。其余 4個(gè)克隆都為回復(fù)突變。將A226G突變體進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取基因組DNA,以eo^基因上游引物 Pl和下游引物P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，與野生菌基因組的PCR產(chǎn)物相比較，A226G— 突變體的PCR產(chǎn)物已發(fā)生刪除突變(圖5)。對PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行序列分析 也表明此突變株岬G基因中間部分預(yù)期的290bp已被刪除。 2.5糖多孢紅霉菌A226G-突變體發(fā)酵產(chǎn)物的質(zhì)譜(MS)鑒定將糖多孢紅霉菌A226G-突變體的50mL發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取，水浴濃縮 后用質(zhì)譜儀檢測A226G突變體發(fā)酵液的紅霉素成分。MS鑒定結(jié)果顯示A226G— 突變體發(fā)酵液中僅積累紅霉素C，而且也沒有檢測到上一步中間產(chǎn)物紅霉素D (圖6)，說明糖多孢紅霉菌紅霉素C-12位羥基化酶EryK可以完全把其底物紅 霉素D轉(zhuǎn)化成紅霉素C。 2.6A226G—突變體中e/jG基因的功能補(bǔ)償 2.6.1糖多孢紅霉菌表達(dá)質(zhì)粒pZMWG的構(gòu)建以糖多孢紅霉菌A226總DNA為模板,上游引物Pl和下游引物P2進(jìn)行PCR 擴(kuò)增出efj( 基因，克隆到pUC18載體上構(gòu)建了質(zhì)粒pUCG。序列分析表明，所 克隆的e/^G片段序列與GenBank公布的序列完全一致。將pUCG中的eijGDNA片段亞克隆至糖多孢紅霉菌表達(dá)載體pZMW中， 構(gòu)建了質(zhì)粒pZMWG。 iVrfe I和￡a> RV酶切pZMWG質(zhì)粒后獲得預(yù)期大小的 兩個(gè)片段(圖7)。 2.6.2互補(bǔ)測驗(yàn)將糖多孢紅霉菌突變體A226G—制成原生質(zhì)體，用pZMWG質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，在含 125fig/mLAm的R3M固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。從轉(zhuǎn)化平皿中挑取6個(gè)單菌落涂含 125fig/mL Am的R3M斜面，這6個(gè)克隆均可正常生長，命名為^266《+ I 、 II 、 m、 IV、 V、 VI。接種^2601+ I和A226于100mL TSB培養(yǎng)基/500mL三角燒瓶，30。C振蕩培養(yǎng)96h，提取紅霉素，TLC結(jié)果顯示A226GXT I恢復(fù)了紅霉素A 的生產(chǎn)能力，但產(chǎn)量比野生菌A226要低(圖8)。
權(quán)利要求
1. 一種產(chǎn)紅霉素C的糖多孢紅霉菌突變體的構(gòu)建方法，其特征在于利用染色體同源重組的性質(zhì)，將糖多孢紅霉菌染色體上紅霉素3″-O-甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因eryG刪除，或?qū)⒑蠩ryG S-腺苷甲硫氨酸SAM結(jié)合位點(diǎn)對應(yīng)的DNA序列在內(nèi)的染色體片段刪除，或?qū)ryG基因插入失活，得到產(chǎn)紅霉素C的糖多孢紅霉菌突變體。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)紅霉素C的糖多孢紅霉菌突變體的構(gòu) 建方法，其特征在于所述的刪除或插入失活方法是指下列方法之 一(1)先用重疊PCR方法從糖多孢紅霉菌基因組中擴(kuò)增出紅霉 素3"-0-甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因ei^G缺失或部分缺失的重疊DNA片 段，將其克隆到質(zhì)粒pWHM3上構(gòu)建成同源重組質(zhì)粒，再將此質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化到糖多孢紅霉菌中，使其發(fā)生染色體同源重組，篩選出ei^G 基因失活的糖多孢紅霉菌突變體，其發(fā)酵主要產(chǎn)物為紅霉素C; (2) 用PCR方法擴(kuò)增出紅霉素e/jG基因部分DNA片段，將其克隆到 質(zhì)粒pWHM3上，構(gòu)建成同源重組質(zhì)粒，將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到糖多孢紅 霉菌中，使其經(jīng)染色體同源重組插入到eo^基因上，從而使其蛋白 產(chǎn)物EryG失活，得到產(chǎn)紅霉素C的糖多孢紅霉菌突變體；(3)用 限制酶酶切的方法從糖多孢紅霉菌基因組文庫中將紅霉素e/jG基 因的部分DNA片段亞克隆到質(zhì)粒pWHM3上，構(gòu)建成同源重組質(zhì) 粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到糖多孢紅霉菌中，使其經(jīng)染色體同源重組插入到 ei^7基因上，從而使其蛋白產(chǎn)物EryG失活，得到產(chǎn)紅霉素C的糖 多孢紅霉菌突變體；(4)先用PCR方法從糖多孢紅霉菌基因組中 擴(kuò)增出紅霉素e/j( 基因全部或部分DNA片段，將其克隆到質(zhì)粒 pWHM3上，接著將選擇標(biāo)記基因(如抗性基因)克隆到質(zhì)粒 pWHM3插入片段中間的合適位置上，構(gòu)建成同源重組質(zhì)粒，將質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化到糖多孢紅霉菌中，使其發(fā)生染色體同源重組，篩選出eo^ 基因失活的糖多孢紅霉菌突變體，其發(fā)酵產(chǎn)物為紅霉素C。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種產(chǎn)紅霉素C的糖多孢紅霉菌突變體的構(gòu) 建方法，其特征在于具體做法是用重疊PCR方法從糖多孢紅霉菌基因組中擴(kuò)增出缺失e/yG基因起始密碼子下游343-632nt的同源 DNA片段」G，將其克隆到同源重組質(zhì)粒pWHM3上，構(gòu)建了 pWHMAG。將pWHMAG質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到糖多孢紅霉菌中，使其與染 色體發(fā)生同源重組，篩選出e7G基因失活的糖多孢紅霉菌突變體。
全文摘要
本發(fā)明公開一種產(chǎn)紅霉素C的糖多孢紅霉菌突變體的構(gòu)建方法，利用染色體同源重組的性質(zhì)，將糖多孢紅霉菌染色體上紅霉素3″-O-甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因eryG起始密碼子下游的343-632nt的290bp DNA序列(對應(yīng)于GenbankAccession No.AM420293序列中的823972-824261nt)刪除，利用薄層層析、PCR和質(zhì)譜方法篩選出一株eryG基因失活的糖多孢紅霉菌突變體，此突變體主要積累中間產(chǎn)物紅霉素C，而不再合成紅霉素A。
文檔編號C12N15/09GK101255413SQ200810019010
公開日2008年9月3日 申請日期2008年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月8日
發(fā)明者張部昌, 華 袁 申請人:安徽大學(xué)