專利名稱：一種構(gòu)建和生產(chǎn)限制性內(nèi)切酶Ecop15I的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組III型限制性Ecop151內(nèi)切酶共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、表達(dá)與純 化，屬于生物工程領(lǐng)域。通過(guò)本發(fā)明所提供的方法，獲得了純度較高、活力較 好的重組型Ecopl5I限制性內(nèi)切酶，為大規(guī)模生產(chǎn)提供了有效的途徑。同時(shí)，所 述的Ecopl51內(nèi)切酶可以作為基因表達(dá)序列分析和相關(guān)基因識(shí)別的工具，具有很 好的應(yīng)用價(jià)值。
背景技術(shù)：
"限制性內(nèi)切酶" 一般認(rèn)為是能識(shí)別雙鏈DNA上4到8個(gè)核苷酸的特異性 序列，且能切割該序列的內(nèi)切酶的總稱。目前，已報(bào)道有2900余種限制一修飾 (R/M)系統(tǒng)被鑒別，根據(jù)其亞基組成、催化機(jī)制、酶切位置、識(shí)別序列、輔助 因子等因素，限制性內(nèi)切酶可分為三大類。I型限制性內(nèi)切酶是一類兼有限制性 和甲基化活性的多亞基蛋白復(fù)合體，可以在遠(yuǎn)離其識(shí)別位點(diǎn)處任意切割DNA鏈。 II型限制性內(nèi)切酶是獨(dú)立于對(duì)應(yīng)甲基化酶的一種限制酶，其在識(shí)別位點(diǎn)之中或臨 近的確定位點(diǎn)特異性地切開DNA鏈，產(chǎn)生確定的序列末端、限制片段，II型限 制性內(nèi)切酶大部分都具有嚴(yán)格的底物特異性，識(shí)別4 6bp的回文序列。III型限 制性內(nèi)切酶是兼有限制、修飾兩種功能的酶，主要識(shí)別反向重復(fù)序列，在識(shí)別 位點(diǎn)之外不完全地切開DNA鏈。
限制性內(nèi)切酶Ecopl51是大腸桿菌P15質(zhì)粒編碼的III型限制性內(nèi)切酶，是 由2個(gè)Mod亞基和2個(gè)Res亞基折疊形成407KDa大小的低聚復(fù)合酶。Mod亞 基通過(guò)限制與修飾的競(jìng)爭(zhēng)作用來(lái)實(shí)現(xiàn)識(shí)別和修飾雙重功能，其識(shí)別未甲基化的、 反向的、非回文結(jié)構(gòu)的序列(5'-CAGCAG-3，)。Ecopl5I在識(shí)別位點(diǎn)下游上鏈(Top strand) 25 26nt位置和下鏈(Bottom strand) 27或28位置，在輔助因子Mg2+ 和ATP的作用下，酶切DNA序列。特別對(duì)DNA具有一對(duì)未甲基化的、反向的、 且具有一定空間距離的、對(duì)立位置的識(shí)別位點(diǎn)，酶切最為有效。其主要用途是 在基因表達(dá)分析(Serial Analysis of Gene Expression, SAGE )中具有重要作用， 傳統(tǒng)的SAGE僅能標(biāo)簽14個(gè)堿基序列，而在改進(jìn)的"longSAGE "方案中也只有21個(gè)堿基序列的標(biāo)簽，而Ecopl51可以標(biāo)簽超過(guò)25個(gè)堿基序列，提高 了鑒定基因的效率和正確率。Ecopl51對(duì)基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)的修飾發(fā)揮了很大的 作用，從而為各種醫(yī)學(xué)、藥物和農(nóng)業(yè)應(yīng)用提供了巨大的潛力。
III型限制性內(nèi)切酶Ecopl51在基因表達(dá)系列分析具有重要作用，但是目前 缺少實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的表達(dá)和純化的方法。目前生產(chǎn)這種酶的方式和一般限制性內(nèi) 切酶并無(wú)不同，其步驟一般是
1、 通過(guò)重組DNA技術(shù)，從微生物中獲得目的基因并加以克隆。 常使用噬菌體感染用于識(shí)別和選擇限制性酶的克隆，但此法成功率較低。
這種方法是以包含轉(zhuǎn)移限制一修飾系統(tǒng)為最初特征，由質(zhì)粒裝載到大腸桿菌克 隆載體上。此法通過(guò)克隆不斷增加的限制一修飾系統(tǒng)，包含通過(guò)選擇有甲基酶 基因活性地克隆，但這一選擇系統(tǒng)并不總是得到完全的限制系統(tǒng)，而是只產(chǎn)生 出甲基化酶基因。在構(gòu)建質(zhì)粒庫(kù)后，然后將其在適用宿主上轉(zhuǎn)化，制備含內(nèi)切 酶的粗提物，通過(guò)活性分析篩選出所需的克隆。
2、 采用一些工藝技術(shù)對(duì)含有限制性內(nèi)切酶基因的克隆進(jìn)行過(guò)表達(dá)。 這些技術(shù)能夠被單獨(dú)或結(jié)合使用以獲得限制性酶最大量的表達(dá)，主要有
(1)、啟動(dòng)子通過(guò)大腸桿菌能夠被很好的識(shí)別，直接插入到上游起始部分；(2)、 插入一個(gè)位于基因上游的核糖體結(jié)合位點(diǎn)；(3)、通過(guò)定向誘變或使用密碼子自 身合成基因從而改變基因的DNA序列；(4)、使用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和 合成基因5'端和3'端的雜交引物而放大表達(dá)。
3、 在合適的培養(yǎng)基中，用發(fā)酵器增值攜帶該內(nèi)切酶修飾性和限制性的克隆， 以生產(chǎn)該限制性核酸內(nèi)切酶，然后經(jīng)離心收獲細(xì)胞并經(jīng)超聲振蕩破壞之，制得 含限制性內(nèi)切酶活性的細(xì)胞粗提物；
4、 用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)如親和層析或離子交換層析法純化含限制性內(nèi) 切酶活性的細(xì)胞粗提物。
采用上述傳統(tǒng)方法，對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)III型限制性內(nèi)切酶EcoP15I存在以下問(wèn)
題
1. Ec叩15I限制性內(nèi)切酶是野生型大腸桿菌P15質(zhì)粒編碼的，在沒(méi)有EcoP151 基因克隆來(lái)源或來(lái)源較困難的情況下，需要人工合成來(lái)獲得目的基因。
2. Ecopl5I是一個(gè)407KDa大小的低聚復(fù)合酶，具有Mod和Res2段基因。在E.coli pl5質(zhì)粒中，具有Mod和Res兩個(gè)開放閱讀框(ORF)，具有活性的限制性 內(nèi)切酶實(shí)質(zhì)上是Mod2Res2這樣一個(gè)四聚體。而采用上述技術(shù)無(wú)法有效表達(dá)III型 限制酶Ecopl5I這樣一種結(jié)構(gòu)的酶，因此需要新方法改進(jìn)表達(dá)系統(tǒng)。
3.采用傳統(tǒng)方法對(duì)EcoP15I進(jìn)行純化，產(chǎn)物一般是DNA轉(zhuǎn)甲基酶(Mod2)和限 制性內(nèi)切核酸酶(Mod2Res2)的混合物。純化lmg酶， 一般需要7-8升細(xì)菌培養(yǎng)液， 并且整個(gè)純化過(guò)程需要10-14天，由此得到的產(chǎn)量是0.1mg/g細(xì)胞。另一個(gè)問(wèn)題 是，有限的保存穩(wěn)定性，尤其是工藝上冰凍的EcoP15I融化后是無(wú)活性的。
較之上述傳統(tǒng)方法，本發(fā)明具有以下特色
本發(fā)明首先利用重疊PCR的方法，人工合成長(zhǎng)片段基因，獲得目的基因。 該方法能用于一些來(lái)源困難的基因，或來(lái)源危險(xiǎn)(諸如病毒基因)的基因的人 工合成。Ecopl5I限制性內(nèi)切酶是大腸桿菌P15質(zhì)粒編碼的，在沒(méi)有基因克隆來(lái) 源或來(lái)源較困難的情況下，采用了人工合成的方法，獲得目的基因。并且分析 了Ec叩15I基因編碼的密碼子頻率，與大腸桿菌BL21(DE3)密碼子頻率比較，稀 有密碼子出現(xiàn)的頻率比較低。
其次，本發(fā)明最主要的特色是選擇了大腸桿菌共表達(dá)的方式，以表達(dá) Ecopl51酶這樣具有2個(gè)及2個(gè)以上單體的蛋白復(fù)合體。III型限制性酶Ecopl51 是一個(gè)407KDa大小的復(fù)合酶，具有2個(gè)Mod亞基和2個(gè)Res亞基。若單純?nèi)?合2段基因，表達(dá)較高分子量的融合蛋白，表達(dá)效果不好，且可能由于2段蛋 白單體的融合，引起了折疊結(jié)構(gòu)的改變，影響了蛋白復(fù)合體的生物學(xué)活性。而 本發(fā)明利用共表達(dá)的方法可以解決這一問(wèn)題，并且操作簡(jiǎn)便易行。
純化效率較高，純化lmg酶僅僅需36ml細(xì)菌培養(yǎng)液，整個(gè)純化時(shí)間需要5-7 天，EcoP15I產(chǎn)量約為5.6-6.6mg/g細(xì)胞，產(chǎn)量較高。此夕卜，本發(fā)明生產(chǎn)的EcoP151, 放置于4。C和-20T長(zhǎng)時(shí)間活力保持不變，穩(wěn)定性較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種有效的方法和表達(dá)系統(tǒng)，可用于大規(guī)模生產(chǎn)m型限制性
內(nèi)切酶Ecopl51。本發(fā)明利用生物工程的方法，根據(jù)Genebank中的Ecopl5I基因序 列，設(shè)計(jì)數(shù)十對(duì)引物，利用重疊延伸PCR的方法(OverlappingPCR)，人工合成 獲得了目標(biāo)序列(見附圖l)。合成好的兩段基因再分別亞克隆到具有兩個(gè)獨(dú)立
6T7啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)的共表達(dá)載體pACYCDuet-l中，在Res亞基C端和Mod 亞基N端分別各融合了6XHisTag。通過(guò)鎳親和層析、離子交換層析方法，制備 了純度高達(dá)95%以上、活力與商業(yè)化Ecopl5I相似的重組型限制性內(nèi)切酶。
本法明的主要特色就是構(gòu)建III型內(nèi)切酶Ecopl51共表達(dá)質(zhì)粒。目前共表達(dá) 的實(shí)現(xiàn)途徑主要有雙/多載體共轉(zhuǎn)化法，雙/多順?lè)醋臃ê碗p/多啟動(dòng)子載體法等。 對(duì)于雙/多載體共轉(zhuǎn)化法，尋找具備用不同的抗生素標(biāo)記、質(zhì)粒兼容性好的表達(dá) 載體較為困難，并且很難有有效的方法來(lái)維持質(zhì)粒間的拷貝數(shù)平衡，難于控制 不同亞基的表達(dá)量多少。選擇利用多順?lè)醋訂钨|(zhì)粒表達(dá)，雖然在基因轉(zhuǎn)錄時(shí) mRNA是等量的，但是翻譯過(guò)程卻是相對(duì)對(duì)立的；而在雙順?lè)醋虞d體中，有研 究表明，翻譯水平并不能夠平衡，置于IRES (internal ribosome entry site，內(nèi)部 核糖體進(jìn)入位點(diǎn))下游的外源基因的表達(dá)量是其上游帽啟動(dòng)翻譯基因的20。％ 50% ，即以IRES啟動(dòng)的翻譯效率沒(méi)有帽依賴的翻譯效率高。
針對(duì)Ecopl51這樣的III型限制性內(nèi)切酶，選擇多啟動(dòng)子共表達(dá)載體可以同 時(shí)表達(dá)2個(gè)或多個(gè)蛋白單體的特點(diǎn)，將限制性內(nèi)切酶兩個(gè)單體分別克隆到其兩 個(gè)獨(dú)立的表達(dá)單元中，同時(shí)表達(dá)所需蛋白的2個(gè)亞基。在表達(dá)的過(guò)程中2個(gè)亞 基互相作用，折疊成具有生物活性的四級(jí)結(jié)構(gòu)，這種共表達(dá)方式具有無(wú)可比擬 的優(yōu)勢(shì)。因Ecopl5I區(qū)別于II型限制性內(nèi)切酶，單獨(dú)的Res亞基是沒(méi)有酶切活 性，需和Mod形成四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白復(fù)合體才能行使其生物學(xué)功能。這就要求必 須同時(shí)表達(dá)和純化這個(gè)蛋白兩個(gè)亞基，并且控制和保持2個(gè)亞基的表達(dá)量的相 對(duì)平衡。由于大腸桿菌本身對(duì)于Ecopl51共表達(dá)的這2個(gè)亞基不存在翻譯的偏好 性，因而不管其基因順序如何，均可以平衡二者之間的表達(dá)量。
這樣的表達(dá)方式在其它II型限制性內(nèi)切酶克隆與表達(dá)中，也具有很多優(yōu)點(diǎn) 在之前的II型限制性內(nèi)切酶克隆與表達(dá)中，需提前篩選具有抗此限制酶的，含 有同源甲基化酶的宿主菌。若利用多表達(dá)載體，同時(shí)表達(dá)R-M系統(tǒng)中的2個(gè)酶， 表達(dá)出的甲基化酶就修飾了宿主菌和質(zhì)粒的DNA，防止表達(dá)出的限制酶對(duì)宿主 菌的毒性作用。將其中限制酶融合純化標(biāo)簽，便能夠方便的分離純化出所需的 酶。
本發(fā)明提供了III型限制性內(nèi)切酶Ecopl5I共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、表達(dá)與純化的 方法，其基本步驟是(見附圖2):1. 基因的合成和克隆
(1)設(shè)計(jì)融合表達(dá)序列從NCBI網(wǎng)站上獲得Ecopl5I基因序列(Genbank 號(hào)AJ634453)，考慮到方便下游酶蛋白純化要求，Res亞基C端和Mod亞基N 端各自分別融合帶有了 6 X His Tag,并在每段序列兩端添加特異酶切位點(diǎn)；
(2 )設(shè)計(jì)引物根據(jù)Overlapping Oligo皿cleotides的原理設(shè)計(jì)數(shù)十對(duì)引物，
(3) 合成全長(zhǎng)基因并克隆OverlappingPCR的方法人工合成全長(zhǎng)基因，分 別平端克隆到pUC57質(zhì)粒中，測(cè)序后選擇序列完全正確的全長(zhǎng)基因克??；
(4) 基因的亞克隆將Res和Mod亞基分別先后裝到pACYCDuet-l中的 兩個(gè)表達(dá)調(diào)控區(qū)中，獲得了pACYC—P15共表達(dá)質(zhì)粒。
2. Ecopl51的轉(zhuǎn)化和表達(dá)
(1) 將pACYC一P15共表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)BL21(DE3)中，涂 布于含有氯霉素抗性的LB平皿中，挑菌培養(yǎng)，誘導(dǎo)后離心收菌；
(2) 全菌蛋白電泳分析，通過(guò)比較電泳條帶，選擇正確表達(dá)Ecopl5I酶條 帶并且表達(dá)量相對(duì)較好的單克隆，作為擴(kuò)大培養(yǎng)的工程菌；
(3) 優(yōu)化表達(dá)，通過(guò)菌濃度(OD600)梯度，IPTG誘導(dǎo)濃度梯度，誘導(dǎo)時(shí) 間梯度等作為優(yōu)化因素，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)；
(4) 通過(guò)SDS-PAGE電泳，比較不同參數(shù)下可溶性蛋白的表達(dá)量，以確定 大批量純化的參考條件。
3. Ecopl5I擴(kuò)大培養(yǎng)和純化
(1) 接Ecopl5I工程菌，培養(yǎng)于帶有氯霉素抗性的LB液體試管中，振蕩 培養(yǎng)過(guò)夜；
(2) 將過(guò)夜菌液轉(zhuǎn)接至2L三角瓶中培養(yǎng)至OD-0.6左右，加入IPTG誘 導(dǎo)，最后離心收集菌體；
(3) Ni柱結(jié)合緩沖液重懸菌體，超聲波破碎菌體；離心取上清粗蛋白；將 上清粗蛋白溶液過(guò)鎳親和層析純化柱，分步收集。取純度和濃度較高的收集樣 混合、透析；
(4) 將透析好的蛋白溶液過(guò)陰離子DEAE離子交換層析柱，步進(jìn)式洗脫， 分步收集。取純度和濃度較高的收集樣混合、透析。并用Bradford法，測(cè)Ecopl51 總濃度。


圖1 .用重疊PCR方法合成Ecop151目標(biāo)序列。
圖2.生產(chǎn)III型限制性內(nèi)切酶Ecop 151工藝流程圖。
圖3. Ecopl5IMod和Res亞基的合成與克隆。
圖4. Ecop 15I的亞克隆獲得共表達(dá)載體pACYC—P15質(zhì)粒。
圖5. Ecopl5I鎳親和柱純化后電泳圖。
圖6. Ecopl51 DEAE離子交換純化后電泳圖。
圖7. Ecopl5I酶切pUC19質(zhì)粒電泳圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l、材料和試劑
1. 材料
質(zhì)粒和細(xì)胞株pUC19、 pUC57為百奧生物技術(shù)(南通)有限公司(南通百 奧)產(chǎn)品，共表達(dá)載體pACYCDuet-l購(gòu)于Novagen公司，克隆菌株ToplO與表 達(dá)菌株BL21 (DE3)均購(gòu)于北京天根生物技術(shù)有限公司，根據(jù)分子克隆CaCl2 法自制感受態(tài)，保證效價(jià)在106 (CFU/ugpUC19)以上。
2. 試劑-
(1) 工具酶TaqDNA聚合酶，Pfb DNA聚合酶(南通百奧)；限制性酶 類，Smal、 BamHI等(New England Biolabs); T4 DNA連接酶(New England Biolabs);
(2) 生化試劑Yeast、 Typtone、 Tris堿、甘氨酸、SDS、瓊脂糖等(上海 生工)；
(3) DNA純化試劑盒普通型質(zhì)?；厥赵噭┖校傊悄zDNA回收試 劑盒(南通百奧)；
(4) 層析填料Ni瓊脂糖凝膠親和填料；DEAE瓊脂糖凝膠陰離子交換填 料；CM瓊脂糖凝膠陰離子交換填料(北京韋氏博慧)。
實(shí)施例2、實(shí)驗(yàn)方法 1.基因的人工合成從NCBI網(wǎng)站上獲得Ecopl51基因序列(Genbank號(hào)AJ634453)，設(shè)計(jì)融合 表達(dá)序列?？紤]到方便下游酶蛋白純化要求，在Ec叩151的Res亞基C端和Mod 亞基N端各自分別融合帶有了 6 X His Tag。
根據(jù)overlapping oligonucleotides的原理設(shè)計(jì)數(shù)十對(duì)引物，兩端引物的Res 和Mod片段頭尾兩端分別添加了KpnI、 XhoI和Bamffl、 Sail的酶切位點(diǎn)，并 在BamHI酶切位點(diǎn)后添加一個(gè)G堿基，以確保酶序列在翻譯過(guò)程中閱讀框的正 確。對(duì)近3kbRes基因片段，通過(guò)中間唯一的BglII酶切位點(diǎn)，將Res片段分為 2段，再用KpnI和BglII和酶切后，用T4連接酶連接，完整的Res基因片段。 兩段基因分別合成后，平端克隆到載體pUC57中，42"C熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌 TOP10感受態(tài)，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，再通過(guò)菌檢PCR方法，初步獲得陽(yáng)性克隆， 進(jìn)一步利用堿裂解法抽提試劑盒抽提陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，對(duì)于基因的點(diǎn)突 變和堿基缺失，進(jìn)行PCR修復(fù)，以獲得測(cè)序結(jié)果完全正確的質(zhì)粒。
2. 基因的亞克隆
利用設(shè)計(jì)好的酶切位點(diǎn)，采用雙酶切的方法，將Res和Mod亞基先后分別 裝到pACYCDuet-l中的兩個(gè)表達(dá)調(diào)控區(qū)中，獲得了 pACYC-P15共表達(dá)質(zhì)粒。
3. Ecopl51的表達(dá)與純化
(1) Ecopl51轉(zhuǎn)化與優(yōu)化表達(dá) 將pACYC—P15共表達(dá)質(zhì)粒用42r熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)BL21(DE3) 中。涂布于含有氯霉素抗性的LB平皿中，37'C倒置培養(yǎng)過(guò)夜。6小時(shí)后分別挑 取8個(gè)單菌落于4ml含有氯霉素抗性的LB試管中，同時(shí)轉(zhuǎn)接未轉(zhuǎn)化BL21(DE3) 于無(wú)氯霉素抗性的LB中，37°C、 220rpm振蕩培養(yǎng)。6小時(shí)后，待菌長(zhǎng)到一定濃 度后，吸0.8ml菌液，與0.21111滅菌甘油(80%)混合保存菌種。剩余約3ml的 菌液用終濃度為lmMIPTG誘導(dǎo)3小時(shí)后(同時(shí)留一管不誘導(dǎo)作為對(duì)照)。2個(gè) 對(duì)照和誘導(dǎo)菌同時(shí)離心收菌，用原菌液量的1/10體積的20mMTris-Cl (pH8.0) 重懸離心洗滌沉淀，重復(fù)一次。取懸液20ul加入5ul SDS-PAGE上樣緩沖液， 煮沸10分鐘后電泳。比較電泳表達(dá)條帶，進(jìn)而確定正確表達(dá)Ecopl5I酶并且表 達(dá)量相對(duì)較好的單克隆，作為擴(kuò)大培養(yǎng)的工程菌。進(jìn)而再通過(guò)菌濃度(OD600) 梯度，IPTG誘導(dǎo)濃度梯度，誘導(dǎo)時(shí)間梯度等作為優(yōu)化因素，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。通 過(guò)SDS-PAGE電泳，比較不同參數(shù)下可溶性蛋白的表達(dá)量，以確定大批量純化的條件。
(2) Ecopl51的擴(kuò)大培養(yǎng)和純化
吸40ul (1%接菌量)保存在甘油中的工程菌，培養(yǎng)于4ml帶有氯霉素抗性 的LB液體試管中。37°C、 220rpm振蕩過(guò)夜。
約4小時(shí)后將過(guò)夜菌按1%的接菌量，轉(zhuǎn)接至含氯霉素抗性的LB液體的三 角瓶中，37°C、 220rpm振蕩培養(yǎng)，待生長(zhǎng)至OD600二0.6左右時(shí)，加入IPTG 使其終濃度為0.5mM，誘導(dǎo)4小時(shí)，將菌液置于冰水混合物中冷卻30分鐘；4 °C 、6000rpm離心15分鐘，收集的沉淀菌體，用1/10體積4。C預(yù)冷的20mM Tris-Cl (pH8.0)重懸洗滌菌體，重復(fù)一次后將菌體保存于-20度。
用80ml Ni柱結(jié)合緩沖液(50mM Tris-HCl， 500mM NaCl， 1 OmM 2-巰基乙 醇，0.1%TritonX-100， 20mM咪唑，pH8.0)重懸菌體，在4。C條件下超聲波破 碎，工作2秒暫停6秒持續(xù)30min。 4°C、 13000rpm離心20分鐘后，留取上清。 將上清液過(guò)Ni結(jié)合緩沖液平衡好的Ni柱；用10倍柱床體積的Ni洗滌緩沖液 (含50mM咪唑)洗滌；Ni洗脫緩沖液(含150mM咪唑)洗脫，用1.5ml離心 管分管收集后電泳。選取濃度較高的4管混合。用DEAE結(jié)合緩沖液(50mM Tris-HCl， 10mM 2-巰基乙醇，pH8.0)透析過(guò)夜。
將透析好的8.7ml蛋白樣過(guò)平衡好的DEAE陰離子交換柱，用10倍柱床體 積的DEAE洗滌緩沖液洗滌。步進(jìn)式洗脫，分管收集后電泳。選取濃度高且純 度較好的3管混合。用保存緩沖液(10mMTris-HCl， 100mMNaCl， lmMDTT， O.lmMEDTA， 50%甘油，pH7.4)透析，獲得3.7ml蛋白收集液，保存于-2(TC。 并用Bradford法，樣品稀釋30倍，BSA作為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)Ecopl5I總濃度。
實(shí)施例3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
(1) pACYC_P15共表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果
Ecopl 51的Res亞基和Mod亞基共人工PCR合成3段基因，分別為Eco一Mod、 Eco—Resl和Eco—ResII (見附圖3所示)。三段基因分別通過(guò)平端克隆，裝載到 pUC57中，獲得pMod， pRes_I和pRes一II三個(gè)質(zhì)粒；將pRes」和pRes—II用 BglII和NotI雙酶切后，T4連接酶酶連，獲得完整的Res片段的質(zhì)粒。
將pMod質(zhì)粒與pACYCDuet-1質(zhì)粒BamHI和Sail雙酶切后酶連，獲得包
li含Mod亞基的pACYC_Mod質(zhì)粒，再與pRes—All質(zhì)粒Kpnl和Xhol雙酶切后 酶連，獲得包含完整的Ecopl5I兩個(gè)亞基pACYC—P15質(zhì)粒(見附圖4所示)。
(2) Ecopl5I表達(dá)與純化
利用誘導(dǎo)時(shí)間梯度，IPTG誘導(dǎo)濃度梯度，菌濃度梯度，培養(yǎng)溫度等作為優(yōu) 化表達(dá)因素，正交實(shí)驗(yàn)，獲得了培養(yǎng)及誘導(dǎo)溫度為37°C，誘導(dǎo)菌濃度為對(duì)數(shù)生 長(zhǎng)期中期，即OD600二0.6左右時(shí)，以IPTG終濃度為0.5mM誘導(dǎo)，3小時(shí)后離 心收菌。
經(jīng)過(guò)Ni親和層析，將單管收集的蛋白液進(jìn)行SDS-PAGE電泳得到了 Ecopl51 的較好的純化效果(見附圖3)。由附圖5可知，2條表達(dá)條帶的分子量在74KDa 和110Kda左右，與預(yù)計(jì)結(jié)果一致，證明該條帶是純化的Ecop151。其中泳道l 4蛋白量要普遍高于其他泳道，選取這4管混合透析，進(jìn)一步進(jìn)行DEAE離子交 換層析層析純化(見附圖4)。由附圖6可知，3 5泳道的蛋白量和蛋白純度要 高于其他泳道，選擇這3管用保存緩沖液透析后-2(TC保存。利用Bandscan軟件 對(duì)SDS-PAGE圖片進(jìn)行分析，Ecopl51的表達(dá)量(兩個(gè)亞基總量)約占E.coli總蛋 白的15%左右。經(jīng)過(guò)第一次Ni親和層析純化后，就已經(jīng)達(dá)到了 95%以上的純 度，再經(jīng)過(guò)DEAE陰離子交換層析純化后，2個(gè)亞基的純度均在97%以上。
用Bradford法，Ni親和層析后蛋白收集液的濃度在6.6mg/ml,總蛋白量近 60mg; DEAE離子交換層析后蛋白收集液的濃度在5.6mg/ml。 800ml菌液共獲 得22mg左右的蛋白。
(3) Ecopl51的活性檢測(cè)
將純化的Ecopl51梯度酶切pUC19質(zhì)粒，37。C酶切30min后，65°C20min 滅活。NEB的Ecopl51作為正對(duì)照，如附圖7所示，純化的Ecopl51酶與NEB 的酶，在0.5ul時(shí)，具有同樣的酶活力。
(4) Ecopl5I穩(wěn)定性分析 將保存于儲(chǔ)存緩沖液中的Ecopl5I酶，放置于4。C和-20。C， 4周后，經(jīng)蛋白
SDS-PAGE電泳，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)降解。酶切pUC19檢測(cè)，活力基本保持不變。氨基酸序列表SEQUENCE LISTING
<110>百奧生物技術(shù)(南通)有限公司
<120> —種構(gòu)建和生產(chǎn)限制性內(nèi)切酶Ecop151的方法
<130> 無(wú)
<160> 2
< 170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 658
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223>人工序列描述重組Ecopl5IMod亞基
<220>
<221〉 DOMAIN <222> (5)..(10)
<223> 6個(gè)組氨酸鎳親和層析標(biāo)簽 <400> 1
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Gin Asp Pro Met Lys15 10 15
Lys Glu Thr He Phe Ser Glu Val Glu Thr Ala Asn Ser Lys Gin Leu 20 25 30
Ak Val Leu Lys Ala Asn Phe Pro Gin Cys Phe Asp Lys Asn Gly Ala
35 40 45
Phe lie Gin Glu Lys Leu Leu Glu lie lie Arg Ala Ser Glu Val Glu
50 55 60
Leu Ser Lys Glu Ser Tyr Ser Leu Asn Trp Leu Gly Lys Ser Tyr Ala 65 70 75 80
Arg Leu Leu Ala Asn Leu Pro Pro Lys Thr Leu Leu Ala Glu Asp Lys
85 卯 95
Thr His Asn Gin Gin Glu Glu Asn Lys Asn Ser Gin His Leu Leu lie 訓(xùn) 105 110
Lys Gly Asp Asn Leu Glu Val Leu Lys His Met Val Asn Ala Tyr Ala
115 120 125
Glu Lys Val Lys Met lie Tyr lie Asp Pro Pro Tyr Asn Thr Gly Lys
130 135 140
Asp Gly Phe Val Tyr Asn Asp Asp Arg Lys Phe Thr Pro Glu Gin Leu 145 150 155 160
Ser Glu Leu Ala Gly lie Asp Leu Asp Glu Ala Lys Arg lie Leu Glu
165 170 175
Phe Thr Thr Lys Gly Ser Ser Ser His Ser Ala Trp Leu Thr Phe lie
180 185 190
Tyr Pro Arg Leu Tyr lie Ala Arg Glu Leu Met Arg Glu Asp Gly Thr
195 200 205
He Phe lie Ser lie Asp His Asn Glu Phe Ser Gin Leu Lys Leu Val
210 215 220
Cys Asp Glu He Phe Gly Glu Gin Asn His Val Gly Asp Leu Val Trp 225 230 235 240Lys Asn Ala Thr Asp Asn Asn Pro Ser Asn lie Ala Val Glu His Glu
245 250 255
Tyr lie lie Val Tyr Thr Lys Asn Lys Glu Gin Leu lie Ser Glu Trp
260 265 270
Lys Ser Asn lie Ser Asp Val Lys Asn Leu Leu Val Asn lie Gly Glu
275 280 285
Glu Phe Ala Ser Lys Tyr Thr Gly Asn Glu Leu Gin Glu Lys Tyr Thr
290 295 300
Gin Trp Phe Arg Glu His Arg Ser Glu Leu Trp Pro Leu Asp Arg Tyr 305 310 315 320
Lys Tyr lie Asp Lys Asp Gly lie Tyr Thr Gly Ser Gin Ser Val His
325 330 335
Asn Pro Gly Lys Glu Gly Tyr Arg Tyr Asp lie lie His Pro Lys Thr
340 345 350
Lys Lys Pro Cys Lys Gin Pro Leu Met Gly Tyr Arg Phe Pro Leu Asp
355 360 365
Thr Met Asp Arg Leu Leu Ser Glu Glu Lys lie lie Phe Gly Asp Asp
370 375 380
Glu Asn Lys lie lie Glu Leu Lys Val Tyr Ala Lys Asp Tyr Lys Gin 385 3卯 395 400
Lys Leu Ser Ser Val He His Leu Asp Gly Arg Val Ala Thr Asn Glu
405 410 415
Leu Lys Glu Leu Phe Pro Glu Met Thr Gin Pro Phe Thr Asn Ala Lys 420 425 430
Thr lie Lys Leu Val Glu Asp Leu lie Ser Phe Ala Cys Asp Gly Glu
435 440 445
Gly lie Val Leu Asp Phe Phe Ala Gly Ser Gly Thr Thr Ala His Thr
450 455 460
Val Phe Asn Leu Asn Asn Lys Asn Lys Thr Ser Tyr Gin Phe lie Thr
15465 470 475 480
Val Gin Leu Asp Glu Pro Thr Lys Asp Lys Ser Asp Ala Met Lys His
485 490 495
Gly Tyr Asn Thr lie Phe Asp Leu Thr Lys Glu Arg Leu lie Arg Ala
500 505 510
Ser Lys Lys Asn Arg Asp Gin Gly Phe Lys Val Tyr Gin Leu Met Pro
515 520 525
Asp Phe Arg Ala Lys Asp Glu Ser Glu Leu Thr Leu Ser Asn His Thr
530 535 540
Phe Phe Asp Asp Val Val Leu Thr Pro Glu Gin Tyr Asp Thr Leu Leu 545 550 555 560
Thr Thr Tip Cys Leu Tyr Asp Gly Ser Leu Leu Thr Thr Pro lie Glu
565 570 575
Asp Val Asp Leu Gly Gly Tyr Lys Ala His Leu Cys Asp Gly Arg Leu 580 585 590
Tyr Leu lie Ala Pro Asn Phe Thr Ser Glu Ala Leu Lys Ala Leu Leu
595 600 605
Gin Lys Val Asp Ser Asp Lys Asp Phe Ala Pro Asn Lys Val Val Phe
610 615 620
Tyr Gly Ser Asn Phe Glu Ser Ala Lys Gin Met Glu Leu Asn Glu Ala 625 630 635 640
Leu Lys Ser Tyr Ala Asn Lys Lys Ser lie Glu Leu Asp Leu Val Val
645 650 655
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<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223>人工序列描述重組Ecopl5IRes亞基 <220>
<221> DOMAIN
<222> (989)..(994)
<223> 6個(gè)組氨酸鎳親和層析標(biāo)簽
<400> 2
Met Ala Asp Leu Asn Tip lie Ser Ala Gly His Ala lie Ala Asp Val 15 10 15
Gly Thr Met Ser Lys Gly Phe Thr Leu Glu Lys Asn Leu Pro His Gin 20 25 30
Lys Ala Gly Val Asp Ala Val Met Asn Val Phe Val Ser Ala Thr Pro
35 40 45
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50 55 60
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180 185 190
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210 215 220
Asn Gin Phe Asn Thr Pro Val Asp Ala Leu Arg Ala Val Lys Pro Phe 225 230 235 240
He He lie Asp Glu Pro His Arg Phe Pro Thr Gly Lys Lys Thr Tip
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Asp Ala Phe Asn Asp Asp Leu Val Lys Gly lie Asp Ala Tyr lie Glu
290 295 300
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325 330 335
Phe Lys Leu Ala Lys Gly Glu Ser Leu Ser Lys Thr His Ser Ala He
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355 360 365
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515 520 525
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Glu Ser Ser Phe Lys Glu Arg Val Pro Ser Lys Phe Thr Gin Glu Leu
595 600 605
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Phe Pro lie Gly Val Lys Pro Gly Lys lie Lys Lys Ala Thr Asp Gly
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Leu Trp Asp Leu lie Asn Gin Lys Ala Val lie Glu Tyr Lys lie Asn
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1、一種構(gòu)建III型限制性內(nèi)切酶EcoP15I共表達(dá)質(zhì)粒(pACYC_P15)的方法，步驟包括(1)人工合成包含Res亞基和Mod亞基的3段基因，分別為Eco_Mod、Eco_ResI和Eco_ResII，3段基因分別通過(guò)平端克隆，裝載到pUC57中，獲得pMod，pRes_I和pRes_II三個(gè)質(zhì)粒；將pRes_I和pRes_II用BglII和NotI雙酶切后，T4連接酶酶連，獲得完整的Res片段的pRes_All質(zhì)粒；(2)將pMod質(zhì)粒與pACYCDuet-1質(zhì)粒BamHI和SalI雙酶切后酶連，獲得包含Mod亞基的pACYC_Mod質(zhì)粒，再與pRes_All質(zhì)粒KpnI和XhoI雙酶切后酶連，獲得包含完整的Ecop15I兩個(gè)亞基pACYC_P15質(zhì)粒。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，亞基的末端(N端或C端)各融合了層析標(biāo)簽。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2，融合的層析標(biāo)簽是組氨酸鎳(Ni+)親和層析標(biāo)簽(6XHisTag)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，質(zhì)粒為過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1或4， 一種包含質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。
6、 一種生產(chǎn)III型限制性內(nèi)切酶EcoP15I的方法，步驟包括(1) 用重疊PCR方法合成EcoP15I基因；(2) 構(gòu)建EcoP15I共表達(dá)質(zhì)粒pACYC—P15;(3) Ecopl51的轉(zhuǎn)化和表達(dá)；(4) Ecopl5I大規(guī)模培養(yǎng)和表達(dá)；(5) Ecopl5I純化。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6，合成EcoP15I基因根據(jù)步驟(1)包括(1) 設(shè)計(jì)表達(dá)序列，融合純化標(biāo)簽，并在序列兩端添加酶切位點(diǎn)；(2) 設(shè)計(jì)引物，合成Res和Mod全長(zhǎng)基因，分別克隆到pUC57質(zhì)粒中；(3) 亞克隆到過(guò)表達(dá)載體pACYCDuet-l中，獲得表達(dá)Ecop151的全長(zhǎng)基因。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6，純化EcoP15I蛋白根據(jù)步驟(5)包括(1)鎳柱結(jié)合緩沖液重懸離心后菌體，超聲波破碎菌體，離心取上清粗蛋白；(2) 過(guò)鎳親和層析純化柱，分步收集；(3) 取純度和濃度較高的收集樣混合、透析；(4) 過(guò)陰離子DEAE離子交換層析柱，步進(jìn)式洗脫，分步收集；(5) 取純度和濃度較高的收集樣混合，透析，測(cè)EcoplSI總濃度。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項(xiàng)，利用Ecopl5I作為DNA分析，基因表達(dá)的 序列分析和/或相關(guān)基因的識(shí)別。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9，基因表達(dá)可用來(lái)描述細(xì)胞，組織，器官和/或生物體。
11、 根據(jù)權(quán)利要求IO，生物體為宿主或病原體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種構(gòu)建和生產(chǎn)重組III型限制性內(nèi)切酶Ecop15I的方法。III型限制性內(nèi)切酶Ecop15I在基因表達(dá)系列分析具有重要作用，而傳統(tǒng)方法難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的表達(dá)和純化。本發(fā)明利用基因重組的方法，人工合成融合有純化標(biāo)簽的Ecop15I的2個(gè)亞基片段，分別克隆到原核共表達(dá)載體pACYCDuet-1的兩個(gè)獨(dú)立表達(dá)單元中。在IPTG誘導(dǎo)下，具有獨(dú)立的T7啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子和終止密碼子表達(dá)單元在大腸桿菌中，同時(shí)獨(dú)立表達(dá)酶的2個(gè)亞基，并折疊成具有生物學(xué)活性的復(fù)合結(jié)構(gòu)。再通過(guò)Ni親和層析和DEAE離子交換層析的方法進(jìn)行純化。最終得到了產(chǎn)量較高，活力和穩(wěn)定性較好的重組型Ecop15I內(nèi)切酶，從而為大規(guī)模生產(chǎn)提供了有效的途徑。
文檔編號(hào)C12N15/55GK101538579SQ200810019839
公開日2009年9月23日 申請(qǐng)日期2008年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月19日
發(fā)明者孫云成, 雪 戴, 朱遠(yuǎn)源, 陸毅祥, 莉 陳, 兵 黃 申請(qǐng)人:百奧生物技術(shù)(南通)有限公司