專利名稱::一種胞二磷膽堿的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明屬于生物制藥
技術(shù)領(lǐng)域:
,具體涉及一種胞二磷膽堿的制備方法。技術(shù)背景胞二磷膽堿,又稱胞磷膽堿鈉,是腦代謝激活劑,可促進神經(jīng)細胞膜卵磷脂的合成,具有修復(fù)腦損傷,抗缺氧,改善記憶,增強智力的作用,臨床應(yīng)用較廣。所以,胞二磷膽堿的合成技術(shù)是人們比較關(guān)心的研究課題。與CMP可廉價地制造和供應(yīng)相比,雖然報導(dǎo)胞二磷膽堿有化學(xué)合成法、酶法和微生物轉(zhuǎn)化合成等方法,但是前兩種方法成本太高,現(xiàn)在已不再采用。目前常用的方法是微生物轉(zhuǎn)化法,利用微生物的細胞酶系合成,但是由于工藝原因,轉(zhuǎn)化率普遍偏低,發(fā)酵周期太長,致使轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)品濃度較低。目前,全世界使用微生物細胞作酶源進行酶催化反應(yīng)來生產(chǎn)胞二磷膽堿。由于細胞具有維持其生命活動的完整的多酶系統(tǒng),各種酶又保持著原有生活細胞所處的狀態(tài)和特定位置,因此能夠迅速有效地完成多步酶催化反應(yīng)。1970年,Tochikura等人(JFermentTechnol.1970,48:769—773)采用風(fēng)干面包酵母(Sflcc/wfrawycescarMerge朋&)作酶源,在磷酸緩沖液中,以葡萄糖酵解提供能量,CMP和磷酸膽堿作底物,合成了胞二磷膽堿。其后他們還研究了43株菌株產(chǎn)胞二磷膽堿的能力,獲得了兩株菌株(SacctoromycesIAM4309和Sacctoromyce;yraww7IFO0495),轉(zhuǎn)化率可達80%。我國從1975年開始陸續(xù)報道,利用啤酒生產(chǎn)中的下腳料濕酵母等為原料,催化CMP與磷酸膽堿或氯化膽堿轉(zhuǎn)化生產(chǎn)胞二磷膽堿,轉(zhuǎn)化率在80%左右。1992年邱蔚然等首次報道了采用K-卡拉膠固定化酵母生物合成胞二磷膽堿,轉(zhuǎn)化率為40%-60%。徐仁華等(徐仁華,蘇州天馬醫(yī)藥集團天吉生物制藥有限公司,中國,C12P19/30,CN1944661A,2007)利用啤酒酵母合成胞二磷膽堿,轉(zhuǎn)化率達到65%,產(chǎn)品濃度最高只有4g/L。張劍(張劍,CN101130797A,2008)利用啤酒廠廢酵母將CMP和磷酸膽堿合成胞二磷膽堿,轉(zhuǎn)化率達到80%,產(chǎn)品濃度未提及。這種工藝采用的磷酸膽堿需要由氯化膽堿與無水磷酸在高溫下縮合形成,工藝更復(fù)雜,污染與副產(chǎn)物更多,設(shè)備成本和操作成本也很高。鑒于胞二磷膽堿的制備過程中,需要消耗大量的能量(ATP),因此在胞二磷膽堿的制備過程中需要兩個酶系即ATP的再生體系和胞二磷膽堿合成酶系。ATP的再生體系以廉價的葡萄糖為底物,通過糖酵解途徑(EMP)來實現(xiàn),該途徑是能量再生的最經(jīng)濟的途徑之一;胞二磷膽堿合成酶系由核苷酸激酶、核苷二磷酸激酶、膽堿激酶和磷酸膽堿胞苷轉(zhuǎn)移酶構(gòu)成,供體ATP在胞二磷膽堿合成過程中作為磷酸供體和能量而存在,該酶系在釀酒酵母和面包酵母中比較發(fā)達,胞二磷膽堿的產(chǎn)品濃度主要取決于能量原位再生的效率,胞二磷膽堿合成酶系的效率以及兩者原位耦聯(lián)的效率。目前國內(nèi)外胞二磷膽堿轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)品濃度普遍不高的一個重要原因就在于效率低下的ATP再生體系與高效的胞二磷膽堿合成酶系之間的不匹配。因此胞二磷膽堿合成的關(guān)鍵就在于如何提高ATP再生的速率即提高EMP途徑的通量,而在現(xiàn)有技術(shù)中,葡萄糖通過EMP途徑生成ATP的效率很低,只能維持酵母細胞一般的生命代謝,要打破原有的平衡,加大EMP途徑的通量,超量表達底物磷酸化水平,只有通過基因工程技術(shù)或采用小分子化學(xué)效應(yīng)物質(zhì)(鎂離子和鉀離子的組合)改變代謝流量的方法來實現(xiàn),其中采用后者更方便快捷,易于實現(xiàn)。經(jīng)小分子化學(xué)效應(yīng)物調(diào)節(jié)后,可使EMP途徑的代謝流量發(fā)生明顯改變,對于底物的利用效率和利用速率(葡萄糖、磷酸鹽)明顯上升,ATP再生的速率也得到了很大的提高。當其速率與胞二磷膽堿合成體系的速率相匹配時,能量的利用效率和胞二磷膽堿的轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)品濃度才能達到較高的水平,從而實現(xiàn)胞二磷膽堿的超量生產(chǎn)。另一方面,由于膽堿激酶在常規(guī)反應(yīng)條件下活性較低,不能有效地合成磷酸膽堿,這樣減緩了胞二磷膽堿合成的速率。所以現(xiàn)有工藝通常使用磷酸膽堿。磷酸膽堿是通過氯化膽堿與無水磷酸在高溫條件下脫水縮合而成,這樣使得設(shè)備增多,流程變得復(fù)雜,操作強度也大大增加,成本也隨之提高。而利用小分子效應(yīng)物(甘露醇、半胱氨酸或精胺)調(diào)節(jié)并提高膽堿激酶的活性使直接利用氯化膽堿作為轉(zhuǎn)化原料成為可能。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種胞二磷膽堿的廉價高效的制備方法。為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明的思路是通過以氯化膽堿、磷酸根離子和胞苷一磷酸(CMP)或其前體物質(zhì)為底物,采用酵母細胞全細胞催化法制備胞二磷膽堿,合理的運用全細胞催化和代謝工程的原理,通過建立代謝網(wǎng)絡(luò)模型和代謝流量分析、采用小分子化學(xué)效應(yīng)物質(zhì)調(diào)控代謝流量從而提高能量自耦聯(lián)及膽堿磷酸化效率的方法,利用有透性的酵母細胞來高效制備胞二磷膽堿,從而使產(chǎn)率大幅提高,底物(如葡萄糖等)的利用率也有所提高。發(fā)明的關(guān)鍵在于1)本發(fā)明直接利用了微生物體內(nèi)的酶系EMP途徑酶系(己糖激酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、磷酸果糖激酶、醛縮酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸變位酶、烯醇酶、丙酮酸激酶、丙酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶)和胞二磷膽堿合成酶系(核苷酸激酶、核苷二磷酸激酶、膽堿激酶和磷酸膽堿胞苷轉(zhuǎn)移酶)進行催化反應(yīng),由于細胞具有維持其生命活動的完整的多酶系統(tǒng),各種酶又保持著原有生活細胞所處的狀態(tài)和特定位置,反應(yīng)所需要的能量和輔酶因子不需要外界供給,直接由細胞產(chǎn)生,因此能夠迅速有效地完成多步酶催化反應(yīng),在大規(guī)模生產(chǎn)方面,有轉(zhuǎn)化效率高、成本低,以及污染小的優(yōu)點。2)本發(fā)明是建立在全細胞催化的基礎(chǔ)上的,其特點在于克服了其它方法底物轉(zhuǎn)化率不高、難于實現(xiàn)能量和輔酶再生的種間耦合,不易改變細胞膜的通透性等缺陷。特別是與酶催化相比,由于使用的是全細胞,胞內(nèi)的酶受細胞壁、細胞膜的保護,酶穩(wěn)定性更好,半衰期更長,更易實現(xiàn)能量和輔酶的再生;胞內(nèi)多種酶系的存在以實現(xiàn)酶的級聯(lián)反應(yīng)可以彌補酶法催化中級聯(lián)催化不易實現(xiàn)的不足,同時省去酶的純化過程,制備簡單,成本低廉。3)本發(fā)明主要涉及葡萄糖的底物水平磷酸化。在現(xiàn)有技術(shù)中,葡萄糖通過EMP途徑生成ATP的效率很低,只能維持酵母一般生命代謝。而在本發(fā)明利用代謝工程及全細胞催化技術(shù),加入鉀離子,鎂離子等無機離子,使得FDP的累積速率明顯加快,刺激丙酮酸激酶活性,加速了磷酸烯醇式丙酮酸的分解,產(chǎn)生更多的ATP,使葡萄糖的磷酸化速率加快;另一方面是由于磷酸烯醇式丙酮酸的分解,使得原來由甘油磷酸脫氫酶催化磷酸二羥丙酮引起的NAD的再生,仍由乙醇脫氫酶擔當,系統(tǒng)內(nèi)的代謝途徑流量發(fā)生明顯改變,流向甘油的代謝流量大幅減小,使得每分子葡萄糖產(chǎn)生的ATP的利用率因此得到了很大的提升。ATP的再生速率的加快,有利于更快更多的生成CTP和磷酸膽堿。這樣使得低成本、高轉(zhuǎn)化率地由CMP及其前體物質(zhì)和氯化膽堿一次轉(zhuǎn)化生產(chǎn)胞二磷膽堿成為可能,開辟了胞二磷膽堿生產(chǎn)的新的、可行途徑。一般情況下,產(chǎn)生的ATP供給酵母的生命代謝,ATP無法有效積累,但在有大量的無機磷酸鹽和Mg^存在的情況下,一方面由于大量Mg^的存在,刺激了己糖激酶的活性;另一方面由于大量無機磷酸鹽的存在,可部分解除由ATP引起的抑制,使EMP通量明顯增大,從而導(dǎo)致能量ATP合成速率增大,高效地耦聯(lián)了消耗ATP的CTP合成與磷酸膽堿的合成。4)通過大量的研究工作發(fā)現(xiàn)細胞膜的結(jié)構(gòu)特性決定了細胞膜一般不允許極性分子通過,而胞二磷膽堿帶有約一個極性負電荷,因此欲使胞二磷膽堿通過細胞膜積累于反應(yīng)液中,必須改變細胞膜的透性。細胞膜通透性的改變是胞二磷膽堿積累于胞外的前提條件。對微生物用表面活性劑進行預(yù)處理,改善了微生物細胞壁的通透性,加速反應(yīng)組分向微生物細胞的擴散、滲透,促進底物和酶系的接觸,可使最大轉(zhuǎn)化率以及最大產(chǎn)品濃度出現(xiàn)的時間在一定限度內(nèi)縮短。5)代謝通量經(jīng)調(diào)節(jié)因子鎂離子和鉀離子調(diào)節(jié)后,代謝途徑流量分配發(fā)生了重大改變,EMP的支路途徑被強烈抑制,使得EMP主途徑得以加強。從而提高了對能量的利用率,能量的實際利用率從54.2%提高到62%左右,而胞二磷膽堿的積累正需要ATP供給能量與磷酸根,胞二磷膽堿進而得以大量積累。6)膽堿激酶的活性經(jīng)調(diào)節(jié)因子(甘露醇、半胱氨酸或精胺)調(diào)節(jié)提高后,磷酸膽堿的合成速率大大提高,而CTP積累所導(dǎo)致的對膽堿激酶的抑制也有效地被解除,從而胞二磷膽堿合成的兩個底物的合成速率也得到匹配,胞二磷膽堿得到快速而大量的積累。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下一種胞二磷膽堿的制備方法,以氯化膽堿、磷酸根離子和胞苷一磷酸或其前體為底物,以葡萄糖、果糖、蔗糖或麥芽糖為能量供體,加入小分子化學(xué)效應(yīng)物質(zhì),利用有透性的酵母細胞全細胞催化制備胞二磷膽堿。其中,胞二磷膽堿,即CDP-choline,其結(jié)構(gòu)式如下其中,所述的胞苷一磷酸前體為乳清酸或胞苷。其中,磷酸離子可選自正磷酸、焦磷酸、三聚磷酸等多磷酸,磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等無機磷酸鹽。底物中,胞苷一磷酸或其前體的起始反應(yīng)濃度為2050mM;氯化膽堿的起始反應(yīng)濃度為40150mM;磷酸根離子的起始反應(yīng)濃度為0.012M,優(yōu)選0.020.5M。能量供體可選擇葡萄糖、果糖、蔗糖或麥芽糖中的任意一種,起始反應(yīng)濃度為0.10———0—If—0—CH2CH2N+(CH3):其中,胞苷一磷酸即CMP,其結(jié)構(gòu)式如下:61M。其中,所述的小分子化學(xué)效應(yīng)物質(zhì)為鎂離子、鉀離子、甘露醇、半胱氨酸和精胺中的任意一種或幾種的組合物;Mg^可選自硫酸鎂、硝酸鎂、氯化鎂等無機鹽,其起始反應(yīng)濃度為1200mM,優(yōu)選250mM;K+起始反應(yīng)濃度為lmM2M,優(yōu)選0.11M;甘露醇起始反應(yīng)濃度為120mM,優(yōu)選510mM;半胱氨酸起始反應(yīng)濃度為110mM,優(yōu)選38mM;精胺起始反應(yīng)濃度為120mM,優(yōu)選210mM。其中,所述的酵母細胞是指從酵母屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬、球擬酵母屬、德巴利酵母屬、接合酵母屬、克魯維酵母屬、漢遜酵母屬和酒香酵母屬中任意一種能夠利用胞苷一磷酸或胞苷前體合成胞二磷膽堿的酵母;優(yōu)選的例子可舉,屬于酵母屬的微生物釀酒酵母,面包酵母等;屬于假絲酵母屬的微生物近平滑假絲酵母;屬于畢赤酵母屬的奧默列氏畢赤酵母;屬于球擬酵母屬的微生物白色球擬酵母;屬于德巴利酵母屬的類球形德巴利酵母;屬于接合酵母屬的魯氏接合酵母;屬于克魯維酵母屬的馬克斯克魯維酵母;屬于漢遜酵母屬的杰丁漢遜酵母;屬于酒香酵母屬的異酒香酵母等。酵母的使用量為按濕菌體100800g/L,優(yōu)選200600g/L。其中,所述的有透性的酵母細胞是指通過化學(xué)、物理或生物方法處理過的細胞膜的通透性改變過的酵母細胞,具體方法包括表面活性劑法、有機溶劑法、凍融法、超聲波處理法、風(fēng)干法、冷凍干燥法或溶菌酶法。表面活性劑法中使用的表面活性劑為非離子型表面活性劑聚環(huán)氧乙烷胺或曲拉通X—100、陽離子型表面活性劑十六烷基三甲胺'溴化物,或者陰離子表面活性劑月桂酰-肌氨酸鹽,使用量為0.150g/L,優(yōu)選l20g/L,即表面活性劑法處理酵母細胞時,將表面活性劑直接加入反應(yīng)液,對于總體積為1L的反應(yīng)液,加入0.150g,優(yōu)選加入l~20g。有機溶劑法中使用的有機溶劑為二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮或乙酸乙酯,使用量為0.150mL/L,優(yōu)選l20mL/L,即有機溶劑法處理生產(chǎn)菌株時,將有機溶劑直接加入反應(yīng)液,對于總體積為1L的反應(yīng)液,加入0.150mL,優(yōu)選加入l20mL。上述酵母的利用形式可以是酵母細胞的干燥物、經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)分離離心得到的細胞、細胞的凍干物、市售酵母粉、風(fēng)干酵母或廢酵母泥。胞二磷膽堿的生成反應(yīng)在水溶液中進行,在pH510,2050'C條件下反應(yīng)220小時。優(yōu)選反應(yīng)條件是pH68,溫度為2540°C。本發(fā)明的制備胞二磷膽堿的主要代謝途徑如圖1所示。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明者們研究了通過以氯化膽堿、磷酸根離子和CMP或其前體物質(zhì)為底物的酵母全細胞催化制備胞二磷膽堿的方法,合理的運用全細胞催化和代謝工程的原理,通過建立代謝網(wǎng)絡(luò)模型和代謝流量分析、采用小分子化學(xué)效應(yīng)物質(zhì)調(diào)控代謝流量從而提高能量自耦聯(lián)及膽堿磷酸化效率的方法,利用有透性的酵母細胞來高效制備高能磷酸化合物,轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)品濃度大幅提高,底物及其他原料(如葡萄糖等)的利用率也有所提高,并且采用氯化膽堿為反應(yīng)原料,避免了額外設(shè)備投入,降低了生產(chǎn)成本。利用本發(fā)明的方法生產(chǎn)胞二磷膽堿的反應(yīng)結(jié)果見表1。表l本發(fā)明方法與現(xiàn)有方法產(chǎn)量對比<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*文獻是指顧復(fù)昌,楊亮懿.胞二磷膽堿的生產(chǎn).發(fā)酵科技通訊(2007)圖1是本發(fā)明中胞二磷膽堿的合成途徑。具體實施例方式實施例1:酵母培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖40,尿素2.0,磷酸二氫鉀1.5,七水合硫酸鎂0.5,七水合硫酸鋅4.0xl(T3,七水合硫酸亞鐵3.0xl0—3,四水合氯化錳0.3xl(T3,無水氯化鈣l.Oxl(T3,生物素0.05xl(T3。釀酒酵母接種量10%,于30。C下120rpm搖床培養(yǎng)24小時,離心4000rpm,20分鐘。取酵母泥,一7'C保藏備用。實施例2:以CMP和氯化膽堿為底物,葡萄糖為能量供體,制備胞二磷膽堿在容量為15L的反應(yīng)槽中,調(diào)制由60mM氯化膽堿、0.20M磷酸二氫鈉、30mMCMP、0.3M葡萄糖、50mM硫酸鎂、lmM氯化鉀、2mM半胱氨酸、利用實施例1所述的方法培養(yǎng)的2800克釀酒酵母泥、十六垸基三甲胺.溴化銨10克和水組成的反應(yīng)液IOL,用氫氧化鈉調(diào)pH至6.8,于37'C條件下低速攪拌反應(yīng)10h,反應(yīng)結(jié)束后,離心沉淀,對上清液進行胞二磷膽堿定量分析,轉(zhuǎn)化液中含胞二磷膽堿14.9克/升,胞二磷膽堿的轉(zhuǎn)化率達到97.4%(mol計)。實施例3:以胞苷和氯化膽堿為底物,葡萄糖為能量供體,制備胞二磷膽堿在容量為15L的反應(yīng)槽中,調(diào)制由150mM氯化膽堿、0.5M磷酸二氫鉀、50mM胞苷、0.5M葡萄糖、2mM硫酸鎂、5mM甘露醇、利用實施例1所述的方法培養(yǎng)的2700g面包酵母泥、10g曲拉通X—100和水組成的反應(yīng)液12L,用氫氧化鈉調(diào)pH至6.0,于32'C條件下低速攪拌反應(yīng)15h,反應(yīng)結(jié)束后,離心沉淀,對上清液進行胞二磷膽堿定量分析,轉(zhuǎn)化液中含胞二磷膽堿22.95克/升,胞二磷膽堿的轉(zhuǎn)化率達到90%(mol計)。實施例4:以CMP和氯化膽堿為底物,葡萄糖為能量供體,制備胞二磷膽堿在容量為1500升的反應(yīng)槽中,調(diào)制由60mM氯化膽堿、2M磷酸二氫鉀、20mMCMP、1M葡萄糖、200mM硫酸鎂,10mM半胱氨酸、利用實施例1所述的方法培養(yǎng)的250kg奧默列氏畢赤酵母泥、500mL二甲苯和水組成的反應(yīng)液1000升,用氫氧化鈉調(diào)pH至8,于40'C條件下低速攪拌反應(yīng)20h,反應(yīng)結(jié)束后,離心沉淀,對上清液進行胞二磷膽堿定量分析,轉(zhuǎn)化液中含胞二磷膽堿10.12克/升,胞二磷膽堿的轉(zhuǎn)化率達到99.2%(mol計)。實施例5:以乳清酸和氯化膽堿為底物,麥芽糖為能量供體,制備胞二磷膽堿在容量為15升的反應(yīng)槽中,調(diào)制由50mM氯化膽堿、0.01M磷酸二氫鉀、20mM乳清酸、0.1M麥芽糖、20mM硫酸鎂、lmM精胺、利用實施例1所述的方法培養(yǎng)的2000g經(jīng)風(fēng)千的白色球擬酵母和水組成的反應(yīng)液10升,用氫氧化鈉調(diào)pH至10,于25'C條件下低速攪拌反應(yīng)18h,反應(yīng)結(jié)束后,離心沉淀,對上清液進行胞二磷膽堿定量分析,轉(zhuǎn)化液中含胞二磷膽堿9.18克/升,胞二磷膽堿的轉(zhuǎn)化率達到90%(mol計)。實施例6:以CMP和氯化膽堿為底物,果糖為能量供體,制備胞二磷膽堿在容量為15升的反應(yīng)槽中,調(diào)制由100mM氯化膽堿、0.02M磷酸二氫鉀、40mMCMP、0.2M果糖、lOmM精胺、利用實施例1所述的方法培養(yǎng)的1000g經(jīng)凍融處理的近平滑假絲酵母和水組成的反應(yīng)液10升,用氫氧化鈉調(diào)pH至5,于2(TC條件下低速攪拌反應(yīng)10h,反應(yīng)結(jié)束后,離心沉淀,對上清液進行胞二磷膽堿定量分析,轉(zhuǎn)化液中含胞二磷膽堿19.18克/升,胞二磷膽堿的轉(zhuǎn)化率達到94%(mol計)。實施例7:以CMP和氯化膽堿為底物,蔗糖為能量供體,制備胞二磷膽堿在容量為15升的反應(yīng)槽中,調(diào)制由80mM氯化膽堿、0.1M磷酸二氫鉀、40mMCMP、0.2M蔗糖、lmM硫酸鎂、20mM精胺、利用實施例1所述的方法培養(yǎng)的6000g經(jīng)超聲波處理的類球形德巴利酵母和水組成的反應(yīng)液10升,用氫氧化鈉調(diào)pH至7,于50'C條件下低速攪拌反應(yīng)2h,反應(yīng)結(jié)束后,離心沉淀,對上清液進行胞二磷膽堿定量分析,轉(zhuǎn)化液中含胞二磷膽堿19.38克/升,胞二磷膽堿的轉(zhuǎn)化率達到95%(mol計)。實施例8:以CMP和氯化膽堿為底物,蔗糖為能量供體,制備胞二磷膽堿在容量為15升的反應(yīng)槽中,調(diào)制由60mM氯化膽堿、1M磷酸二氫鉀、30mMCMP、0.5M蔗糖、20mM甘露醇、lmM半胱氨酸、利用實施例1所述的方法培養(yǎng)的80000g杰丁漢遜酵母、500mL丙酮和水組成的反應(yīng)液10升,用氫氧化鈉調(diào)pH至7,于35°C條件下低速攪拌反應(yīng)15h,反應(yīng)結(jié)束后,離心沉淀,對上清液進行胞二磷膽堿定量分析,轉(zhuǎn)化液中含胞二磷膽堿14.54克/升,胞二磷膽堿的轉(zhuǎn)化率達到95%(mol計)。實施例9:以胞苷和氯化膽堿為底物,葡萄糖為能量供體,制備胞二磷膽堿在容量為15升的反應(yīng)槽中,調(diào)制由80mM氯化膽堿、0.5M焦磷酸、35mM胞苷、0.8M葡萄糖、O.OIM氯化鉀、lmM甘露醇、3mM半胱氨酸、利用實施例1所述的方法培養(yǎng)的4000g異酒香酵母、lmL乙酸乙酯和水組成的反應(yīng)液10升,用氫氧化鈉調(diào)pH至7,于38。C條件下低速攪拌反應(yīng)5h,反應(yīng)結(jié)束后,離心沉淀,對上清液進行胞二磷膽堿定量分析,轉(zhuǎn)化液中含胞二磷膽堿16.07克/升,胞二磷膽堿的轉(zhuǎn)化率達到90%(mol計)。實施例10:以胞苷和氯化膽堿為底物,葡萄糖為能量供體,制備胞二磷膽堿在容量為15升的反應(yīng)槽中,調(diào)制由40mM氯化膽堿、0.2M焦磷酸、20mM胞苷、0.5M葡萄糖、5mM硫酸鎂、lOmM甘露醇、8mM半胱氨酸、2mM精胺、利用實施例1所述的方法培養(yǎng)的2000g釀酒酵母、500g月桂酰'肌氨酸鹽和水組成的反應(yīng)液10升,用氫氧化鈉調(diào)pH至8,于38'C條件下低速攪拌反應(yīng)8h,反應(yīng)結(jié)束后,離心沉淀,對上清液進行胞二磷膽堿定量分析,轉(zhuǎn)化液中含胞二磷膽堿9.8克/升,胞二磷膽堿的轉(zhuǎn)化率達到96%(mol計)。權(quán)利要求1、一種胞二磷膽堿的制備方法,其特征是以氯化膽堿、磷酸根離子和胞苷一磷酸或其前體為底物,以葡萄糖、果糖、蔗糖或麥芽糖為能量供體,加入小分子化學(xué)效應(yīng)物質(zhì),利用有透性的酵母細胞全細胞催化制備胞二磷膽堿。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的胞二磷膽堿的制備方法,其特征是所述的胞苷一磷酸前體為乳清酸或胞苷。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的胞二磷膽堿的制備方法,其特征是底物中,胞苷一磷酸或其前體的起始反應(yīng)濃度為2050mM;氯化膽堿的起始反應(yīng)濃度為40150mM;磷酸根離子的起始反應(yīng)濃度為0.012M;。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的胞二磷膽堿的制備方法,其特征是能量供體的起始反應(yīng)濃度為0.11M。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的胞二磷膽堿的制備方法,其特征是所述的小分子化學(xué)效應(yīng)物質(zhì)為鎂離子、鉀離子、甘露醇、半胱氨酸和精胺中的任意一種或幾種的組合物;Mg^起始反應(yīng)濃度為1200mM,K+起始反應(yīng)濃度為lmM2M,甘露醇起始反應(yīng)濃度為120mM,半胱氨酸起始反應(yīng)濃度為110mM,精胺起始反應(yīng)濃度為120mM。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的胞二磷膽堿的制備方法,其特征是所述的酵母細胞是指從酵母屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬、球擬酵母屬、德巴利酵母屬、接合酵母屬、克魯維酵母屬、漢遜酵母屬和酒香酵母屬中任意一種能夠利用胞苷一磷酸或胞苷前體合成胞二磷膽堿的酵母,酵母的使用量為按濕菌體100800g/L。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的胞二磷膽堿的制備方法,其特征是所述的有透性的酵母細胞是指通過化學(xué)、物理或生物方法處理過的細胞膜的通透性改變過的酵母細胞,具體方法包括表面活性劑法、有機溶劑法、凍融法、超聲波處理法、風(fēng)干法、冷凍干燥法或溶菌酶法。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的胞二磷膽堿的制備方法,其特征是表面活性劑法中使用的表面活性劑為非離子型表面活性劑聚環(huán)氧乙烷胺或曲拉通X—IOO、陽離子型表面活性劑十六垸基三甲胺-溴化物,或者陰離子表面活性劑月桂酰-肌氨酸鹽,使用量為0.150g/L。9、根據(jù)權(quán)利要求7所述的胞二磷膽堿的制備方法,其特征是有機溶劑法中使用的有機溶劑為二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮或乙酸乙酯,使用量為0.150mL/L。10、根據(jù)權(quán)利要求l、6、7、8或9所述的胞二磷膽堿的制備方法,其特征是酵母的利用形式可以是酵母細胞的干燥物、經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)分離離心得到的細胞、細胞的凍干物、市售酵母粉、風(fēng)干酵母或廢酵母泥。11、根據(jù)權(quán)利要求1~9中任意一項所述的胞二磷膽堿的制備方法,其特征是胞二磷膽堿的生成反應(yīng)在水溶液中進行,在pH510,2050'C條件下反應(yīng)220小時。全文摘要本發(fā)明公開了一種胞二磷膽堿的制備方法,以氯化膽堿、磷酸根離子和胞苷一磷酸或其前體為底物,以葡萄糖、果糖、蔗糖或麥芽糖為能量供體,加入小分子化學(xué)效應(yīng)物質(zhì),利用有透性的酵母細胞全細胞催化制備胞二磷膽堿。本發(fā)明通過建立代謝網(wǎng)絡(luò)模型和代謝流量分析、采用小分子化學(xué)效應(yīng)物質(zhì)調(diào)控代謝流量從而提高能量自耦聯(lián)及膽堿磷酸化效率的方法,利用有透性的酵母細胞來高效制備胞二磷膽堿,產(chǎn)品濃度大幅提高,底物的利用率也有提高。文檔編號C12P19/00GK101538598SQ20081001985公開日2009年9月23日申請日期2008年3月19日優(yōu)先權(quán)日2008年3月19日發(fā)明者應(yīng)漢杰,磊張,李振江,柏建新,歐陽平凱,湯佳鵬,健熊申請人:南京工業(yè)大學(xué)