專利名稱：生物發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)l-色氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物發(fā)酵法，具體涉及生物發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)L-色氨酸的方法。
技術(shù)背景目前，生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-色氨酸的研究基于實(shí)驗(yàn)室階 段，實(shí)驗(yàn)室階段的技術(shù)參數(shù)尚不能應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，尤其 是菌種的固體培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法、發(fā)酵液的提取方法、濃縮 液的精制方法將影響L-色氨酸的品質(zhì)、收率和產(chǎn)率。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種生物發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)L-色氨酸的方法，采用該方法應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)L-色氨酸，有 利于提高L-色氨酸的產(chǎn)率、收率和品質(zhì)。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是該發(fā)酵法依次包括以下步驟 菌種固體菌種培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)、發(fā)酵液提取和精制。其中，菌種固體培養(yǎng)首先，菌種培養(yǎng)基用2mo1/1的 NaOH調(diào)pH為7.0分裝于10ml斜面試管或50ml茄子瓶中， 加塞包牛皮紙，121。C滅菌15分鐘，冷卻至50-60。C，傾斜45°攤平，待凝固放置恒溫箱培養(yǎng)；然后，用接種環(huán)劃一環(huán) 菌種直接均勻涂布在試管或茄子瓶空白斜面上，放置37°C ± 1.0的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，長好后直接上罐或放置2-5°C 水箱中備用。其中，菌種在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌種來源浙江大學(xué)， 菌株是一種Escherichia coli K-12 W3110變種；菌種固體培養(yǎng) 基由TC溶液中加入胰蛋白胨、酵母浸出粉、氯化鈉、瓊脂 組成，最終濃度為20mg/l，培養(yǎng)基中的胰蛋白胨1%、酵母 浸出粉0.5%、氯化鈉0.5%、瓊脂2.0%，其中濃度為20g/l 的TC溶液由鹽酸四環(huán)素溶解于濃度50%的乙醇溶液中制 得。其中，發(fā)酵培養(yǎng)首先是菌種在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到成 熟的種子，然后，成熟的種子移入發(fā)酵罐的發(fā)酸培養(yǎng)基中發(fā) 酵代謝產(chǎn)生的L-色氨酸；其中，2.4T液體種子培養(yǎng)基由水中 加入以下組份組成酵母浸出粉18kg、檸檬酸三鈉3.6kg、 MgS04.7H20 7.56kg、 (NH4) 2S04 4.8kg、 KH2P04 1.8kg、 KC14.56kg、 FeS04.7H20 6.72kg、鉬酸銨0.672g、硼酸12g、 CoCl2.6H20 3.36g、 MnS04.H20 1.2g、 CuS04.7H20 1.2g、 ZnS04.7H20 1.44g、 Na2S04 1.2g、 VB! 57.6g、消泡劑0.72kg、 TC 6g、糖96kg;其中，22T發(fā)酵培養(yǎng)基由水中加入以下組 份組成酵母浸出粉22kg、檸檬酸三鈉.H2022kg、檸檬酸 22kg、 MgS0469.3kg、(麗4) 2S04 66kg、 KH2P04 33kg、KC1 41.8kg、 FeS04.7H20 1.66kg、鉬酸銨6.16kg、 H3B03 110g、 CoCl2.6H20 61.6g、 CuS04.5H20 22g、 MnS04.H20 22g、 ZnS04.7H20 26.4g、 Na2S04 110g、消泡劑6.6kg、糖330kg;其中，成熟種子的培養(yǎng)方法包括以下步驟①空罐滅菌0.15-0.2Mpa，保壓30分鐘；②實(shí)罐滅菌液體種子 培養(yǎng)基投入罐，4T種子罐配2.4T種子培養(yǎng)基，調(diào)pH至7.0， 關(guān)閉罐蓋，夾套加熱至90°C，直接進(jìn)蒸汽加熱到121°C， 0.1Mpa壓力保溫10分鐘；③冷卻滅菌完畢冷卻降溫至36°C，待接種；④接種采用壓差法將菌液接入罐內(nèi)，接種溫度35-36。C， pH6.8曙7.0，壓力O.lMpa，打開接種口防護(hù)蓋， 用浸泡過95%乙醇的棉花圈圈住接種口，點(diǎn)燃棉花圈，接種 瓶移至點(diǎn)燃棉花圈接種口旁，慢慢旋開接種瓶針頭保護(hù)塞， 迅速將接種瓶針頭插入接種口，移開棉花圈并熄滅，緩緩打 開罐上排氣閥，調(diào)壓0.05-0.1Mpa，接種量10%，接種結(jié)束 后，用浸過75%乙醇的棉花球放置在接種口上，撥出接種針 頭，旋上接種口防護(hù)蓋，開始培養(yǎng)； 培養(yǎng)培養(yǎng)溫度36 °C、罐壓0.03Mpa、風(fēng)量0.6-1.2m3/h、 pH6.5、攪拌轉(zhuǎn)速 400-700rpm、溶氧20%以上、培養(yǎng)時(shí)間12-18小時(shí)、最終 OD660nm: 15-20、最終葡萄糖含量小于10g/l;其中，發(fā)酵 培養(yǎng)包括以下步驟①空罐滅菌0.15-0.17Mpa壓力、溫度 128。C滅菌30分鐘；②實(shí)罐滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基投入罐中，30T 罐加22T培養(yǎng)基，關(guān)閉罐蓋，夾套預(yù)熱到95-105。C，直接進(jìn)蒸流加熱到12rC，壓力O.lMpa，保溫IO分鐘，冷卻降溫 至36。C，氨調(diào)pH6.5等接種；③接種采用壓差法將種子液 壓入罐內(nèi)培養(yǎng)； 培養(yǎng)培養(yǎng)溫度36。C，罐壓0.03Mpa，風(fēng) 量0.6-1.lm3/h， pH6.5，攪拌轉(zhuǎn)速400-700rpm，發(fā)酵結(jié)束時(shí) 色氨酸生成濃度在20-60g/l、糖濃度L2g/l;⑤發(fā)酵結(jié)束后， 放罐前在發(fā)酵罐內(nèi)加千分之一的明礬，發(fā)酵液加熱至80°C， 立即降溫至37T:，用壓縮空氣壓至發(fā)酵液儲(chǔ)存罐。其中，發(fā)酵液提取依次包括以下步驟首先發(fā)酵液微濾， 儲(chǔ)罐中的發(fā)酵液用泵打入加熱罐中，加熱并保溫55土5。C， 開啟膜過濾器對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行過濾，微濾溫度35-5(TC，微濾 壓力0.30Mpa，微濾流速80-1001/m2'l，膜孔徑0.05-1.OPm， 膜厚度10-150Wn;然后，微濾后的濾液it一步超濾，超濾溫 度55-6(TC，超濾壓力l.OMpa，超濾流速30-351/m2.h，膜孔 徑0.015-0.1Wn，膜厚度150-250Wn，非對(duì)稱性膜；最后，超 濾后的提純液進(jìn)一步納濾得濃縮液，納濾溫度55-60°C，納 濾壓力0.5-3.5Mpa，納濾流速2.5-4.01/m2.h，膜孔徑l-2nm， 膜厚度150Pm，非對(duì)稱性膜。其中，精制依次包括粗結(jié)晶和精制過程，其中，粗結(jié)晶 過程為①將濃縮液打入結(jié)晶罐中，迅速攪拌降溫至5-15 。C， 5土3。C靜止結(jié)晶4小時(shí)；②離心甩干，冰水淋洗，60°C 下進(jìn)熱循環(huán)干燥箱干燥6小時(shí)，控制水份《5.0%得粗品；其 中，精制過程為①在攪拌下將粗品加入20倍重量的60°C純水中，升溫至75。C完全溶解，按粗品重量O. 1%加入明礬； ②按粗品重量的30%加入303射舌性碳，在75。C脫色15分鐘， 過濾；③脫色液經(jīng)冷盤管降溫至5-15°C，按體積比15%加入 濃度80°/。工業(yè)醋酸，攪拌有大量晶體折出后停，保溫5土3。C 結(jié)晶4小時(shí)，結(jié)晶結(jié)束時(shí)母液濃度2-3g/l;④將結(jié)晶液轉(zhuǎn)入 離心機(jī)離心，冰水淋洗，濕粉在雙錐干燥器8(TC下真空干燥 4-6小時(shí)得精品。本發(fā)明選用生物發(fā)酵法經(jīng)菌種培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)、發(fā)酵液 提取和精制工藝化生產(chǎn)L-色氨酸，有利于L-色氨酸的產(chǎn)率、 收率和品質(zhì)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體的實(shí)施例，進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng) 理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方 式限制本發(fā)明的范圍。例1:菌種固體培養(yǎng):首先，菌種培養(yǎng)基用2mo1/1的NaOH 調(diào)pH為7.0分裝于10ml斜面試管或50ml茄子瓶中，加塞 包牛皮紙，121。C滅菌15分鐘，冷卻至50。C，傾斜45°攤 平，待凝固放置恒溫箱培養(yǎng)；然后，用接種環(huán)劃一環(huán)菌種直 接均勻涂布在試管或茄子瓶空白斜面上，放置37°C±1.0的 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，長好后直接上罐或放置2。C水箱中備 用。其中，菌種在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌種來源浙江大學(xué)，菌株是一種Escherichia coli K-12 W3110變種；菌種固體培養(yǎng) 基由TC溶液中加入胰蛋白胨、酵母浸出粉、氯化鈉、瓊脂 組成，最終濃度為20mg/l，培養(yǎng)基中的胰蛋白胨1%、酵母 浸出粉0.5%、氯化鈉0.5%、瓊脂2.0%，其中濃度為20g/l 的TC溶液由鹽酸四環(huán)素溶解于濃度50%的乙醇溶液中制 得。其中，發(fā)酵培養(yǎng)首先是菌種在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到成 熟的種子，然后，成熟的種子移入發(fā)酵罐的發(fā)酸培養(yǎng)基中發(fā) 酵代謝產(chǎn)生的L-色氨酸；其中，2.4T液體種子培養(yǎng)基由水中 加入以下組份組成酵母浸出粉18kg、檸檬酸三鈉3.6kg、 MgS04.7H20 7.56kg、 (NH4) 2S04 4.8kg、 KH2P04 1.8kg、 KC14.56kg、 FeS04.7H20 6.72kg、鉬酸銨0.672g、硼酸12g、 CoCl2.6H20 3.36g、 MnS04.H20 1.2g、 CuS04.7H20 1.2g、 ZnS04.7H20 1.44g、 Na2S04 1.2g、 VBi 57.6g、消泡劑0.72kg、 TC 6g、糖96kg;其中，22T發(fā)酵培養(yǎng)基由水中加入以下組 份組成酵母浸出粉22kg、檸檬酸三鈉.H2022kg、檸檬酸 22kg、 MgS0469.3kg、(麗4) 2S04 66kg、 KH2P04 33kg、 KC1 41.8kg、 FeS04.7H20 1.66kg、鉬酸銨6.16kg、 H3B03 110g、 CoCl2.6H20 61.6g、 CuS04.5H20 22g、 MnS04.H20 22g、 ZnS04.7H20 26.4g、 Na2S04 110g、消泡劑6.6kg、糖330kg;其中，成熟種子的培養(yǎng)方法包括以下步驟①空罐 滅菌:0.15Mpa，保壓30分鐘；②實(shí)罐滅菌液體種子培養(yǎng)基投入罐，4T種子罐配2.4T種子培養(yǎng)基，調(diào)pH至7.0，關(guān) 閉罐蓋，夾套加熱至9(TC，直接進(jìn)蒸汽加熱到121°C， O.lMpa 壓力保溫10分鐘；③冷卻滅菌完畢冷卻降溫至36r，待 接種； 接種采用壓差法將菌液接入罐內(nèi)，接種溫度35 °C， pH6.8，壓力O.lMpa，打開接種口防護(hù)蓋，用浸泡過95% 乙醇的棉花圈圈住接種口，點(diǎn)燃棉花圈，接種瓶移至點(diǎn)燃棉 花圈接種口旁，慢慢旋開接種瓶針頭保護(hù)塞，迅速將接種瓶 針頭插入接種口，移開棉花圈并熄滅，緩緩打開罐上排氣閥， 調(diào)壓0.05Mpa，接種量10%，接種結(jié)束后，用浸過75%乙醇 的棉花球放置在接種口上，撥出接種針頭，旋上接種口防護(hù) 蓋，開始培養(yǎng)； 培養(yǎng):培養(yǎng)溫度36。C、罐壓0.03Mpa、風(fēng) 量0.6m3/11、 pH6.5、攪拌轉(zhuǎn)速400rpm、溶氧20%以上、培養(yǎng) 時(shí)間12小時(shí)，最終OD660nm: 15、最終葡萄糖含量小于10g/l; 其中，發(fā)酵培養(yǎng)包括以下步驟①空罐滅菌0.15Mpa壓力、溫度128。C滅菌30分鐘；②實(shí)罐滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基投入罐中，30T罐加22T培養(yǎng)基，關(guān)閉罐蓋，夾套預(yù)熱到95。C，直接進(jìn) 蒸流加熱到121°C，壓力O.lMpa，保溫10分鐘，冷卻降溫 至36。C，氨調(diào)pH6.5等接種；③接種采用壓差法將種子液 壓入罐內(nèi)培養(yǎng)； 培養(yǎng)培養(yǎng)溫度36。C，罐壓0.03Mpa，風(fēng) 量0.6m3/11， pH6.5，攪拌轉(zhuǎn)速400rpm，發(fā)酵結(jié)束時(shí)色氨酸生 成濃度在20g/1、糖濃度L2g/l; 發(fā)酵結(jié)束后，放罐前在發(fā) 酵罐內(nèi)加千分之一的明礬，發(fā)酵液加熱至80。C，立即降溫至37°C，用壓縮空氣壓至發(fā)酵液儲(chǔ)存罐。其中，發(fā)酵液提取依次包括以下步驟首先發(fā)酵液微濾，儲(chǔ)罐中的發(fā)酵液用泵打入加熱罐中，加熱并保溫55±5°C， 開啟膜過濾器對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行過濾，微濾溫度35i:，微濾壓力 0.30Mpa，微濾流速801/m2.l，膜孔徑0.05Wn，膜厚度lOWn; 然后，微濾后的濾液進(jìn)一步超濾，超濾溫度55。C，超濾壓力 l.OMpa，超濾流速301/m2.h，膜孔徑0.015Wn，膜厚度150^n， 非對(duì)稱性膜；最后，超濾后的提純液進(jìn)一步納濾得濃縮液， 納濾溫度55°C，納濾壓力0.5Mpa，納濾流速2.51/m2.h，膜 孔徑lnm，膜厚度150Pm，非對(duì)稱性膜。其中，精制依次包括粗結(jié)晶和精制過程，其中，粗結(jié)晶 過程為①將濃縮液打入結(jié)晶罐中，迅速攪拌降溫至5。C， 5 土3。C靜止結(jié)晶4小時(shí)；②離心甩干，冰水淋洗，6(TC下進(jìn) 熱循環(huán)干燥箱干燥6小時(shí)，控制水份《5.0%得粗品；其中， 精制過程為①在攪拌下將粗品加入20倍重量的6CTC純水 中，升溫至75X:完全溶解，按粗品重量0. 1%加入明礬；② 按粗品重量的30%加入303tt活性碳，在75。C脫色15分鐘， 過濾；③脫色液經(jīng)冷盤管降溫至5°C，按體積比15%加入濃 度80%工業(yè)醋酸，攪拌有大量晶體折出后停，保溫5土3。C結(jié) 晶4小時(shí)，結(jié)晶結(jié)束時(shí)母液濃度2g/l;④將結(jié)晶液轉(zhuǎn)入離心 機(jī)離心，冰水淋洗，濕粉在雙錐干燥器8(TC下真空干燥4小 時(shí)得精品o例2:其中，菌種固體培養(yǎng)首先，菌種培養(yǎng)基用2mo1/1 的NaOH調(diào)pH為7.0分裝于10ml斜面試管或50ml茄子瓶 中，加塞包牛皮紙，121。C滅菌15分鐘，冷卻至55。C，傾斜 45°攤平，待凝固放置恒溫箱培養(yǎng)；然后，用接種環(huán)劃一環(huán) 菌種直接均勻涂布在試管或茄子瓶空白斜面上，放置37°C± 1.0的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，長好后直接上罐或放置4。C水 箱中備用。其中，菌種在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌種來源浙江大學(xué)， 菌株是一種Escherichia coli K-12 W3110變種；菌種固體培養(yǎng) 基由TC溶液中加入胰蛋白胨、酵母浸出粉、氯化鈉、瓊脂 組成，最終濃度為20mg/l，培養(yǎng)基中的胰蛋白胨1%、酵母 浸出粉0.5%、氯化鈉0.5%、瓊脂2.0°/0，其中濃度為20g/l 的TC溶液由鹽酸四環(huán)素溶解于濃度50%的乙醇溶液中制 得。其中，發(fā)酵培養(yǎng)首先是菌種在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到成 熟的種子，然后，成熟的種子移入發(fā)酵罐的發(fā)酸培養(yǎng)基中發(fā) 酵代謝產(chǎn)生的L-色氨酸；其中，2.4T液體種子培養(yǎng)基由水中 加入以下組份組成酵母浸出粉18kg、檸檬酸三鈉3.6kg、 MgS04.7H20 7.56kg、(麗4) 2S04 4.8kg、 KH2P04 1.8kg、 KCl 4.56kg、 FeS04.7H20 6.72kg、鉬酸銨0.672g、硼酸12g、 CoCl2.6H20 3.36g、 MnS04.H20 1.2g、 CuS04.7H20 1.2g、 ZnS04.7H20 1.44g、 Na2S04 1.2g、 VBi 57.6g、消泡劑0.72kg、TC 6g、糖96kg;其中，22T發(fā)酵培養(yǎng)基由水中加入以下組 份組成酵母浸出粉22kg、檸檬酸三鈉.H2022kg、檸檬酸 22kg、 MgS0469.3kg、(麗4) 2S04 66kg、 KH2P04 33kg、 KC1 41.8kg、 FeS04.7H20 1.66kg、鉬酸銨6.16kg、 H3B03 110g、 CoCl2.6H20 61.6g、 CuS04.5H20 22g、 MnS04.H20 22g、 ZnS04.7H20 26.4g、 Na2S04 110g、消泡劑6.6kg、糖330kg;其中，成熟種子的培養(yǎng)方法包括以下步驟①空罐 滅菌0.18Mpa，保壓30分鐘；②實(shí)罐滅菌液體種子培養(yǎng) 基投入罐，4T種子罐配2.4T種子培養(yǎng)基，調(diào)pH至7.0，關(guān) 閉罐蓋，夾套加熱至90°C，直接進(jìn)蒸汽加熱到121°C， O.lMpa 壓力保溫10分鐘；③冷卻滅菌完畢冷卻降溫至36t:，待 接種；④接種采用壓差法將菌液接入罐內(nèi)，接種溫度35 °C， pH6.9，壓力O.lMpa，打開接種口防護(hù)蓋，用浸泡過95% 乙醇的棉花圈圈住接種口，點(diǎn)燃棉花圈，接種瓶移至點(diǎn)燃棉 花圈接種口旁，慢慢旋幵接種瓶針頭保護(hù)塞，迅速將接種瓶 針頭插入接種口，移開棉花圈并熄滅，緩緩打開罐上排氣閥， 調(diào)壓0.75Mpa，接種量10%，接種結(jié)束后，用浸過75°/。乙醇的棉花球放置在接種口上，撥出接種針頭，旋上接種口防護(hù) 蓋，開始培養(yǎng)； 培養(yǎng)培養(yǎng)溫度36"C、罐壓0.03Mpa、風(fēng) 量0.9m3/h、 pH6.5、攪拌轉(zhuǎn)速550rpm、溶氧20%以上、培養(yǎng) 時(shí)間15小時(shí)、最終OD660nm: 18、最終葡萄糖含量小于10g/l; 其中，發(fā)酵培養(yǎng)包括以下步驟①空罐滅菌0.16Mpa壓力、溫度128。C滅菌30分鐘；②實(shí)罐滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基投入罐中，30T罐加22T培養(yǎng)基，關(guān)閉罐蓋，夾套預(yù)熱淚盈眶到IO(TC， 直接進(jìn)蒸流加熱到121°C，壓力O.lMpa，保溫10分鐘，冷 卻降溫至36。C，氨調(diào)pH6.5等接種；③接種:采用壓差法將 種子液壓入罐內(nèi)培養(yǎng);④培養(yǎng):培養(yǎng)溫度36°C ，罐壓0.03Mpa， 風(fēng)量0.8m3/11， pH6.5，攪拌轉(zhuǎn)速550rpm，發(fā)酵結(jié)束時(shí)色氨酸 生成濃度在40g/1、糖濃度1.2g/l; 發(fā)酵結(jié)束后，放罐前在 發(fā)酵罐內(nèi)加千分之一的明礬，發(fā)酵液加熱至80。C，立即降溫 至37°。用壓縮空氣壓至發(fā)酵液儲(chǔ)存罐。其中，發(fā)酵液提取依次包括以下步驟首先發(fā)酵液微濾， 儲(chǔ)罐中的發(fā)酵液用泵打入加熱罐中，加熱并保溫55±5°C， 開啟膜過濾器對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行過濾，微濾溫度43。C，微濾壓力 0.30Mpa，微濾流速901/m2.1，膜孔徑0.75Wn，膜厚度80toi; 然后，微濾后的濾液進(jìn)一步超濾，超濾溫度58。C，超濾壓力 l.OMpa，超濾流速331/m2.h，膜孔徑0.75Pm，膜厚度200Wn， 非對(duì)稱性膜；最后，超濾后的提純液進(jìn)一步納濾得濃縮液， 納濾溫度58°C，納濾壓力2.0Mpa，納濾流速3.31/m2.h，膜 孔徑1.5nm，膜厚度150Pm，非對(duì)稱性膜。其中，精制依次包括粗結(jié)晶和精制過程，其中，粗結(jié)晶過程為①將濃縮液打入結(jié)晶罐中，迅速攪拌降溫至icrc，5土3。C靜止結(jié)晶4小時(shí)；②離心甩干，冰水淋洗，60。C下進(jìn) 熱循環(huán)干燥箱干燥6小時(shí)，控制水份《5.0%得粗品；其中，精制過程為①在攪拌下將粗品加入20倍重量的6(TC純水 中，升溫至75。C完全溶解，按粗品重量0. 1%加入明礬；② 按粗品重量的30%加入303射舌性碳，在75。C脫色15分鐘， 過濾；③脫色液經(jīng)冷盤管降溫至10。C，按體積比15%加入濃 度80%工業(yè)醋酸，攪拌有大量晶體折出后停，保溫5土3i:結(jié) 晶4小時(shí)，結(jié)晶結(jié)束時(shí)母液濃度2.5g/l;④將結(jié)晶液轉(zhuǎn)入離 心機(jī)離心，冰水淋洗，濕粉在雙錐干燥器8(TC下真空干燥5 小時(shí)得精品0例3:其中，菌種固體培養(yǎng)首先，菌種培養(yǎng)基用2mo1/1 的NaOH調(diào)pH為7.0分裝于10ml斜面試管或50ml茄子瓶 中，加塞包牛皮紙，12rC滅菌15分鐘，冷卻至6(TC，傾斜 45°攤平，待凝固放置恒溫箱培養(yǎng)；然后，用接種環(huán)劃一環(huán) 菌種直接均勻涂布在試管或茄子瓶空白斜面上，放置37°C± 1.0的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，長好后直接上罐或放置5。C水 箱中備用。其中，菌種在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌種來源浙江大學(xué)， 菌株是一種Escherichia coli K-12 W3110變種；菌種固體培養(yǎng) 基由TC溶液中加入胰蛋白胨、酵母浸出粉、氯化鈉、瓊脂 組成，最終濃度為20mg/l，培養(yǎng)基中的胰蛋白胨1%、酵母 浸出粉0.5%、氯化鈉0.5%、瓊脂2.0%，其中濃度為20g/l 的TC溶液由鹽酸四環(huán)素溶解于濃度50%的乙醇溶液中制 得。其中，發(fā)酵培養(yǎng)首先是菌種在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到成 熟的種子，然后，成熟的種子移入發(fā)酵罐的發(fā)酸培養(yǎng)基中發(fā)酵代謝產(chǎn)生的L-色氨酸；其中，2.4T液體種子培養(yǎng)基由水中 加入以下組份組成酵母浸出粉18kg、檸檬酸三鈉3.6kg、 MgS04.7H20 7.56kg、 (NH4) 2S04 4.8kg、 KH2P04 1.8kg、 KC14.56kg、 FeS04.7H20 6.72kg、鉬酸銨0.672g、硼酸12g、 CoCl2.6H20 3'36g、 MnS04.H20 1.2g、 CuS04.7H20 1.2g、 ZnS04.7H20 1.44g、 Na2S04 1.2g、 VB! 57.6g、消泡劑0.72kg、 TC 6g、糖96kg;其中，22T發(fā)酵培養(yǎng)基由水中加入以下組 份組成酵母浸出粉22kg、檸檬酸三鈉.H2022kg、檸檬酸 22kg、 MgS0469.3kg、(麗4) 2S04 66kg、 KH2P04 33kg、 KC1 41.8kg、 FeS04.7H20 1.66kg、鉬酸銨6.16kg、 H3B03 110g、 CoCl2.6H20 6L6g、 CuS04.5H20 22g、 MnS04.H20 22g、 ZnS04.7H20 26.4g、 Na2S04 110g、消泡劑6.6kg、糖330kg;其中，成熟種子的培養(yǎng)方法包括以下步驟①空罐 滅菌0.2Mpa，保壓30分鐘；②實(shí)罐滅菌液體種子培養(yǎng) 基投入罐，4T種子罐配2.4T種子培養(yǎng)基，調(diào)pH至7.0，關(guān) 閉罐蓋，夾套加熱至90。C，直接進(jìn)蒸汽加熱到121°C， O.lMpa 壓力保溫10分鐘；③冷卻滅菌完畢冷卻降溫至36°C，待 接種；④接種采用壓差法將菌液接入罐內(nèi)，接種溫度36 °C， pH0.8-7.0，壓力0.1Mpa，打開接種口防護(hù)蓋，用浸泡過 95%乙醇的棉花圈圈住接種口，點(diǎn)燃棉花圈，接種瓶移至點(diǎn)燃棉花圈接種口旁，慢慢旋開接種瓶針頭保護(hù)塞，迅速將接 種瓶針頭插入接種口，移開棉花圈并熄滅，緩緩打開罐上排氣閥，調(diào)壓0.1Mpa，接種量10%，接種結(jié)束后，用浸過75% 乙醇的棉花球放置在接種口上，撥出接種針頭，旋上接種口 防護(hù)蓋，開始培養(yǎng)； 培養(yǎng)培養(yǎng)溫度36"C、罐壓0.03Mpa、 風(fēng)量1.2m3/h、 pH6.5、攪拌轉(zhuǎn)速700rpm、溶氧20%以上、培 養(yǎng)時(shí)間18小時(shí)、最終OD660nm: 20、最終葡萄糖含量小于10g/h其中，發(fā)酵培養(yǎng)包括以下步驟①空罐滅菌0.17Mpa壓力、溫度128r滅菌30分鐘；②實(shí)罐滅菌發(fā)酵 培養(yǎng)基投入罐中，30T罐加22T培養(yǎng)基，關(guān)閉罐蓋，夾套預(yù) 熱淚盈眶到105°C，直接進(jìn)蒸流加熱到121°C，壓力O.lMpa， 保溫10分鐘，冷卻降溫至36。C，氨調(diào)pH6.5等接種；③接 種采用壓差法將種子液壓入罐內(nèi)培養(yǎng)； 培養(yǎng)培養(yǎng)溫度 36°C，罐壓0.03Mpa，風(fēng)量l.lm3/h， pH6.5，攪拌轉(zhuǎn)速700rpm， 發(fā)酵結(jié)束時(shí)色氨酸生成濃度在60g/l、糖濃度L2g/l; 發(fā)酵 結(jié)束后，放罐前在發(fā)酵罐內(nèi)加千分之一的明礬，發(fā)酵液加熱 至8(TC，立即降溫至37t:，用壓縮空氣壓至發(fā)酵液儲(chǔ)存罐。 其中，發(fā)酵液提取依次包括以下步驟首先發(fā)酵液微濾， 儲(chǔ)罐中的發(fā)酵液用泵打入加熱罐中，加熱并保溫55±5°C， 開啟膜過濾器對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行過濾，微濾溫度5(TC，微濾壓力 0.30Mpa，微濾流速1001/m2.1，膜孔徑l.OWn，膜厚度150Pm; 然后，微濾后的濾液進(jìn)一步超濾，超濾溫度60。C，超濾壓力l.OMpa，超濾流速30-351/m2.h，膜孔徑O.lWn，膜厚度250Pm，非對(duì)稱性膜；最后，超濾后的提純液進(jìn)一步納濾得濃縮液， 納濾溫度6(TC，納濾壓力60。C,納濾壓力3.5Mpa，納濾流 速4.01/m2.11，膜孔徑2nm，膜厚度150Pm，非對(duì)稱性膜。其中，精制依次包括粗結(jié)晶和精制過程，其中，粗結(jié)晶 過程為①將濃縮液打入結(jié)晶罐中，迅速攪拌降溫至15"C， 5土3。C靜止結(jié)晶4小時(shí)；②離心甩干，冰水淋洗，6(TC下進(jìn) 熱循環(huán)干燥箱干燥6小時(shí)，控制水份《5.0%得粗品；其中， 精制過程為①在攪拌下將粗品加入20倍重量的6(TC純水 中，升溫至75。C完全溶解，按粗品重量0. 1%加入明礬；② 按粗品重量的30%加入303tt活性碳，在75。C脫色15分鐘， 過濾；③脫色液經(jīng)冷盤管降溫至15r，按體積比15%加入濃 度80%工業(yè)醋酸，攪拌有大量晶體折出后停，保溫5土3t:結(jié) 晶4小時(shí)，結(jié)晶結(jié)束時(shí)母液濃度3g/l;④將結(jié)晶液轉(zhuǎn)入離心 機(jī)離心，冰水淋洗，濕粉在雙錐干燥器8(TC下真空干燥6小時(shí)得精 叩o
權(quán)利要求
1.生物發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)L-色氨酸的方法，該方法依次包括菌種固體培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)、發(fā)酵液提取和精制；其特征在于菌咱固體培養(yǎng)首先，菌種培養(yǎng)基用2mol/l的NaOH調(diào)pH為7.0分裝于10ml斜面試管或50ml茄子瓶中，加塞包牛皮紙，121℃滅菌15分鐘，冷卻至50-60℃，傾斜45°攤平，待凝固放置恒溫箱培養(yǎng)；然后，用接種環(huán)劃一環(huán)菌種直接均勻涂布在試管或茄子瓶空白斜面上，放置37℃±1.0的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，長好后直接上罐或放置2-5℃水箱中備用；其中，菌種在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌種來源浙江大學(xué)，菌株是一種Escherichia coli K-12 W3110變種；菌種固體培養(yǎng)基由TC溶液中加入胰蛋白胨、酵母浸出粉、氯化鈉、瓊脂組成，最終濃度為20mg/l，培養(yǎng)基中的胰蛋白胨1％、酵母浸出粉0.5％、氯化鈉0.5％、瓊脂2.0％，其中濃度為20g/l的TC溶液由鹽酸四環(huán)素溶解于濃度50％的乙醇溶液中制得；其中，發(fā)酵培養(yǎng)首先是菌種在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到成熟的種子，然后，成熟的種子移入發(fā)酵罐的發(fā)酸培養(yǎng)基中發(fā)酵代謝產(chǎn)生的L-色氨酸；其中，2.4T液體種子培養(yǎng)基由水中加入以下組份組成酵母浸出粉18kg、檸檬酸三鈉3.6kg，MgSO4.7H2O 7.56kg、(NH4)2SO4 4.8kg、KH2PO4 1.8kg、KCl 4.56kg、FeSO4.7H2O 6.72kg、鉬酸銨0.672g、硼酸12g、CoCl2.6H2O 3.36g、MnSO4.H2O 1.2g、CuSO4.7H2O 1.2g、ZnSO4.7H2O 1.44g、Na2SO4 1.2g、VB1 57.6g、消泡劑0.72kg、TC 6g、糖96kg；其中，22T發(fā)酵培養(yǎng)基由水中加入以下組份組成酵母浸出粉22kg、檸檬酸三鈉.H2O22kg、檸檬酸22kg、MgSO4 69.3kg、(NH4)2SO4 66kg、KH2PO4 33kg、KCl 41.8kg、FeSO4.7H2O 1.66kg、鉬酸銨6.16kg、H3BO3110g、CoCl2.6H2O 61.6g、CuSO4.5H2O 22g、MnSO4.H2O22g、ZnSO4.7H2O 26.4g、Na2SO4 110g、消泡劑6.6kg、糖330kg；其中，成熟種子的培養(yǎng)方法包括以下步驟①空罐滅菌0.15-0.2Mpa，保壓30分鐘；②實(shí)罐滅菌液體種子培養(yǎng)基投入罐，4T種子罐配2.4T種子培養(yǎng)基，調(diào)pH至7.0，關(guān)閉罐蓋，夾套加熱至90℃，直接進(jìn)蒸汽加熱到121℃，0.1Mpa壓力保溫10分鐘；③冷卻滅菌完畢冷卻降溫至36℃，待接種；④接種采用壓差法將菌液接入罐內(nèi)，接種溫度35-36℃，pH0.8-7.0，壓力0.1Mpa，打開接種口防護(hù)蓋，用浸泡過95％乙醇的棉花圈圈住接種口，點(diǎn)燃棉花圈，接種瓶移至點(diǎn)燃棉花圈接種口旁，慢慢旋開接種瓶針頭保護(hù)塞，迅速將接種瓶針頭插入接種口，移開棉花圈并熄滅，緩緩打開罐上排氣閥，調(diào)壓0.05-0.1Mpa，接種量10％，接種結(jié)束后，用浸過75％乙醇的棉花球放置在接種口上，撥出接種針頭，旋上接種口防護(hù)蓋，開始培養(yǎng)；⑤培養(yǎng)培養(yǎng)溫度36℃、罐壓0.03Mpa、風(fēng)量0.6-1.2m3/h、pH6.5、攪拌轉(zhuǎn)速400-700rpm、溶氧20％以上、培養(yǎng)時(shí)間12-18小時(shí)、最終OD660nm15-20、最終葡萄糖含量小于10g/l；其中，發(fā)酵培養(yǎng)包括以下步驟①空罐滅菌0.15-0.17Mpa壓力、溫度128℃滅菌30分鐘；②實(shí)罐滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基投入罐中，30T罐加22T培養(yǎng)基，關(guān)閉罐蓋，夾套預(yù)熱淚盈眶到95-105℃，直接進(jìn)蒸流加熱到121℃，壓力0.1Mpa，保溫10分鐘，冷卻降溫至36℃，氨調(diào)pH6.5等接種；③接種采用壓差法將種子液壓入罐內(nèi)培養(yǎng)；④培養(yǎng)培養(yǎng)溫度36℃，罐壓0.03Mpa，風(fēng)量0.6-1.1m3/h，pH6.5，攪拌轉(zhuǎn)速400-700rpm，發(fā)酵結(jié)束時(shí)色氨酸生成濃度在20-60g/l、糖濃度1.2g/l；⑤發(fā)酵結(jié)束后，放罐前在發(fā)酵罐內(nèi)加千分之一的明礬，發(fā)酵液加熱至80℃，立即降溫至37℃，用壓縮空氣壓至發(fā)酵液儲(chǔ)存罐；其中，發(fā)酵液提取依次包括以下步驟首先發(fā)酵液微濾，儲(chǔ)罐中的發(fā)酵液用泵打入加熱罐中，加熱并保溫55±5℃，開啟膜過濾器對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行過濾，微濾溫度35-50℃，微濾壓力0.30Mpa，微濾流速80-100l/m2.l，膜孔徑0.05-1.0μm，膜厚度10-150μm；然后，微濾后的濾液進(jìn)一步超濾，超濾溫度55-60℃，超濾壓力1.0Mpa，超濾流速30-35l/m2.h，膜孔徑0.015-0.1μm，膜厚度150-250μm，非對(duì)稱性膜；最后，超濾后的提純液進(jìn)一步納濾得濃縮液，納濾溫度55-60℃，納濾壓力0.5-3.5Mpa，納濾流速2.5-4.0l/m2.h，膜孔徑1-2nm，膜厚度150μm，非對(duì)稱性膜；其中，精制依次包括粗結(jié)晶和精制過程，其中，粗結(jié)晶過程為①將濃縮液打入結(jié)晶罐中，迅速攪拌降溫至5-15℃，5±3℃靜止結(jié)晶4小時(shí)；②將粗品離心甩干，冰水淋洗，60℃下進(jìn)熱循環(huán)干燥箱干燥6小時(shí)，控制水份≤5.0％得粗品；其中，精制過程為①在攪拌下將粗品加入20倍重量的60℃純水中，升溫至75℃完全溶解，按粗品重量0.1％加入明礬；②按粗品重量的30％加入303#活性碳，在75℃脫色15分鐘，過濾；③脫色液經(jīng)冷盤管降溫至5-15℃，按體積比15％加入濃度80％工業(yè)醋酸，攪拌有大量晶體折出后停，保溫5±3℃結(jié)晶4小時(shí)，結(jié)晶結(jié)束時(shí)母液濃度2-3g/l；④將結(jié)晶液轉(zhuǎn)入離心機(jī)離心，冰水淋洗，濕粉在雙錐干燥器80℃下真空干燥4-6小時(shí)得精品。
全文摘要
本發(fā)明公開了生物發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)L-色氨酸的方法，該方法依次包括菌種固體培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)、發(fā)酵液提取和精制。本發(fā)明選用微生物發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)L-色氨酸，有利于L-色氨酸的產(chǎn)率、收率和品質(zhì)。
文檔編號(hào)C12R1/19GK101323868SQ200810019959
公開日2008年12月17日 申請(qǐng)日期2008年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月14日
發(fā)明者李英輝 申請(qǐng)人:江蘇誠意藥業(yè)有限公司