專利名稱：一種病毒或細(xì)菌的濃縮方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)菌和病毒的濃縮方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景殼聚糖(Chitosan)又名脫乙酰甲殼素，分子式是[CeHuN04]n,是甲殼 素上的乙酰胺基脫去乙酰基而形成的，同時(shí)聚合度降低。殼聚糖來(lái)源豐富， 成本低廉，且有良好的吸附性能和生物相容性，安全無(wú)毒，在醫(yī)藥、化工 和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。殼聚糖用脫除乙酰基的鏈節(jié)數(shù)占總鏈節(jié)數(shù)的百分 數(shù)表示它的脫乙酰度， 一般大于70%，其脫乙酰度與其吸附特性相關(guān)。殼聚糖經(jīng)交聯(lián)劑作用后易形成微球，常用的制備方法有乳化交聯(lián)法， 即將原料品溶解或分散于殼聚糖醋酸溶液中，混勻后加入到含有表面活性 劑的油相中，經(jīng)攪拌或超聲處理，形成W/0型乳劑，用戊二酸等進(jìn)行化學(xué) 交聯(lián)，通過(guò)離心，純化制得；溶劑蒸發(fā)法，即將溶有原料品的殼聚糖醋酸 溶液加入到甲苯中，經(jīng)超聲處理，形成W/0型乳劑，加入含戊二醛的甲苯， 室溫下攪拌，離心后蒸發(fā)溶劑制得微球；復(fù)乳法，即將原料品溶于有機(jī)溶 液中，然后再分散于殼聚糖醋酸溶液中，形成0/W型乳劑，再滴加到油相 中制成W/0/W型復(fù)乳，通過(guò)常壓加熱(或減壓)或透析方法除去有機(jī)溶劑 制得微球；凝聚法，即將硫酸鈉或硫酸氨或三聚磷酸鈉溶液滴入攪拌著的 含吐溫-80的殼聚糖醋酸溶液中，經(jīng)超聲或攪拌處理制得。前三種方法都要 應(yīng)用有機(jī)溶劑，對(duì)多肽等生物活性物質(zhì)的活性影響大，而第四種方法因不 使用有機(jī)溶劑，可克服其它方法的缺點(diǎn)，所用交聯(lián)劑亦為無(wú)毒無(wú)害物質(zhì)，安全性好。應(yīng)用凝聚法制備殼聚糖微球的方法己有數(shù)項(xiàng)專利申請(qǐng)，因所載原料品 物質(zhì)不同和制備工藝不同而有多種不同用途。如名為"離子交聯(lián)制備藥 物緩釋用殼聚糖微球的方法"的99121128. 6號(hào)申請(qǐng)專利是將1 8 %含藥 物的殼聚糖溶液，再加入1 8%明膠或瓊脂糖或者瓊脂，攪拌均勻，然 后在3 0 6 0 。C恒溫2 5小時(shí)，通過(guò)針頭滴加入一 1 0 1 5 T冷的 植物油中，2 0 4 0分鐘后，加入0 . 1 5%冷的三聚磷酸鈉或硫酸 鈉或檸檬酸鈉交聯(lián)離子溶液，輕微攪拌2 0 4 O分鐘后過(guò)濾，水洗干燥 即可，此發(fā)明使制備的大粒徑殼聚糖微球的機(jī)械性能得到顯著的提高，并 能方便地制備形態(tài)好、粒徑小的殼聚糖微球。名為"一種殼聚糖微球/微囊 及其制備方法"的200510055380. X號(hào)申請(qǐng)專利是將油相和占其0. l 4v% 的表面活性劑一起攪拌；加入O. 5 5X(w/v)的殼聚糖溶液(水相)，殼聚糖 溶液與油相的體積比是1 : 2 20，繼續(xù)攪拌；再加入濃度為l 65%(w/v) 的硫酸銨溶液，硫酸銨溶液與殼聚糖溶液的體積比為l : 1 20，繼續(xù)攪拌； 離心分離，分出沉淀物經(jīng)洗滌干燥，即得微球。名為"一種具有生物活性 藥物的殼聚糖微球及其制備方法"的200510055381. 4號(hào)申請(qǐng)專利是將生物 活性藥物溶解或分散于殼聚糖的溶液中，與加有表面活性劑的油相物質(zhì)混 合，經(jīng)攪拌形成穩(wěn)定的乳液后加入一定濃度的硫酸銨水溶液，攪拌沉淀一 定時(shí)間后分離洗滌，真空干燥后即得到包埋了生物活性藥物的粒徑均一的 殼聚糖微球控釋載體。微球亦不關(guān)注其成球性狀。其安全性好，操作簡(jiǎn)便，成本低廉。 液體培養(yǎng)的細(xì)菌產(chǎn)物濃縮技術(shù)通常采用離心沉淀和靜置沉淀的方法。離心沉淀法一般采取3500-5000rpm離心15-25分鐘，傾去上清取沉淀，可 將培養(yǎng)物濃縮10倍以上，但需消耗大量電能，且受機(jī)械限制，難于大規(guī)模 生產(chǎn)。靜置沉淀法是將培養(yǎng)物于室溫或低溫(4-10°C)下靜止放置，讓菌 體自然沉淀，吸出上清達(dá)到濃縮的目的， 一般需放置5天以上，最大濃縮 比例難于超過(guò)3倍。病毒的濃縮技術(shù)通常采用高速離心法和超濾法。高速離心法一般采取 12000-15000rpm離心20-30分鐘，傾去上清取沉淀，可將培養(yǎng)物濃縮10 倍以上，但需消耗大量電能，且受機(jī)械限制，難于大規(guī)模生產(chǎn)。超濾法是 應(yīng)用專門設(shè)備，將病毒培養(yǎng)物中的水份除去，將病毒顆粒濾下達(dá)到濃縮目 的，可將培養(yǎng)物濃縮10倍以上，缺點(diǎn)是生產(chǎn)成本高，生產(chǎn)速度和效率易受 機(jī)械限制。 發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的是用一種安全、廉價(jià)且高效的方法將懸浮于 培養(yǎng)液中的細(xì)菌或病毒濃縮5倍以上。技術(shù)方案具體步驟是，將0.1 1% (W/V)的殼聚糖溶液(殼聚糖脫 乙酰度為75 90%，分子量3000-300000)加入5 15倍量的細(xì)菌或病毒培 養(yǎng)液中，在100~300rpm攪拌下室溫作用5~30分鐘，再加入1~30%的三聚 磷酸鈉或硫酸鈉或檸檬酸鈉或硫酸氨交聯(lián)吸附了細(xì)菌或病毒的殼聚糖，繼 續(xù)攪拌15 50分鐘使其充分作用形成微球，自然靜置2 10小時(shí)待其自然沉 淀至1/6以下時(shí)將上清吸去，收取沉淀即得濃縮的細(xì)菌或病毒。有益效果與現(xiàn)有申請(qǐng)專利不同的是本發(fā)明的目的是用于細(xì)菌和病毒 的濃縮，而不是制備微球作為載體或直接制備載藥微球。所用試劑僅為殼聚糖和三聚磷酸鈉或硫酸鈉或擰檬酸鈉或硫酸氨兩種。將懸浮的細(xì)菌或病 毒沉淀后，僅需吸出上清達(dá)到濃縮的效果，并不需分離微球亦不關(guān)注其成 球性狀。其安全性好，成本低廉。整個(gè)工藝流程簡(jiǎn)便，成本低廉，效率高， 易于大規(guī)模生產(chǎn)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、 無(wú)毒無(wú)害，安全性好本發(fā)明的方法中所用殼聚糖和三聚磷酸鈉或硫 酸鈉或檸檬酸鈉或硫酸氨對(duì)細(xì)菌和病毒的蛋白成份都沒(méi)有破壞作用，在濃 縮過(guò)程中能將病毒和細(xì)菌的抗原性保持完好。2、 成本低廉本發(fā)明的方法中所用原材料來(lái)源廣泛，成本低廉，所用設(shè) 菌簡(jiǎn)單，能耗極低，所費(fèi)成本是傳統(tǒng)方法的1/3以下。3、 操作簡(jiǎn)便本發(fā)明的操作流程極其簡(jiǎn)便，所用試劑僅兩種，僅需在一 般性容器中慢速攪拌，微球形成后能快速自然沉淀，將上清吸出后即達(dá)到 濃縮的效果。4、 吸附沉淀效率高本發(fā)明的方法能將培養(yǎng)液中的細(xì)菌或病毒吸附95% 以上，形成微球后能沉淀至原液體積的1/5~1/10，達(dá)到高效濃縮的效果。5、 易于大規(guī)模生產(chǎn)傳統(tǒng)的離心法或超濾法等常受限于設(shè)備和能耗， 大規(guī)模生產(chǎn)難度大，本發(fā)明的方法能克服這些缺點(diǎn)，非常便于大規(guī)模生產(chǎn)。
具體實(shí)施方式
實(shí)例1、新城疫病毒濃縮將0. 5。/。(W/V)的殼聚糖溶液(殼聚糖脫乙酰度為90%，分子量約200000) 加入8倍量的新城疫病毒雞胚尿囊液中，在200rpm攪拌下室溫作用15分 鐘，再加入16%的三聚磷酸鈉溶液交聯(lián)吸附了新城疫病毒的殼聚糖，繼續(xù)攪拌20分鐘使其充分作用形成微球，自然靜置5小時(shí)待其自然沉淀至1/5以 下時(shí)將上清吸去，收取沉淀即得濃縮5倍的新城疫病毒，通過(guò)檢測(cè)上清中 殘余新城疫病毒的HA效價(jià)證明其吸附率達(dá)97%以上。實(shí)例2、大腸桿菌濃縮將0. 69fe(W/V)的殼聚糖溶液(殼聚糖脫乙酰度為85%，分子量約250000) 加入10倍量的大腸桿菌培養(yǎng)液中，在200rpm攪拌下室溫作用15分鐘，再 加入25%的硫酸鈉交聯(lián)吸附了細(xì)菌的殼聚糖，繼續(xù)攪拌20分鐘使其充分作 用形成微球，自然靜置6小時(shí)待其自然沉淀至1/6以下時(shí)將上清吸去，收 取沉淀即得濃縮6倍的細(xì)菌，通過(guò)對(duì)上清中的大腸桿菌的計(jì)數(shù)檢測(cè)證明吸 附率達(dá)95%。


圖1為病毒或細(xì)菌的濃縮操作流程圖。
權(quán)利要求
1、一種細(xì)菌或病毒的濃縮方法，具體步驟是，將質(zhì)量體積比為0.1～1％的殼聚糖溶液加入5～15倍量體積的細(xì)菌或病毒培養(yǎng)液中，室溫下100～300rpm攪拌5～30分鐘，再加入1～30％的三聚磷酸鈉或硫酸鈉或檸檬酸鈉或硫酸氨，繼續(xù)攪拌15～50分鐘，自然靜置2～10小時(shí)待其自然沉淀至1/6以下時(shí)將上清吸去，收取沉淀即得濃縮的細(xì)菌或病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種細(xì)菌和病毒的濃縮方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。將0.1～1％的殼聚糖溶液加入5～15倍量體積的細(xì)菌或病毒培養(yǎng)液中，室溫下100～300rpm攪拌5～30分鐘，再加入1～30％的三聚磷酸鈉或硫酸鈉或檸檬酸鈉或硫酸氨，繼續(xù)攪拌15～50分鐘，自然靜置2～10小時(shí)待其自然沉淀至1/6以下，收取沉淀即得濃縮的細(xì)菌或病毒。本發(fā)明所用試劑僅為殼聚糖和三聚磷酸鈉或硫酸鈉或檸檬酸鈉或硫酸氨兩種。將懸浮的細(xì)菌或病毒沉淀后，僅需吸出上清達(dá)到濃縮的效果，并不需分離微球亦不關(guān)注其成球性狀。其安全性好，成本低廉。整個(gè)工藝流程簡(jiǎn)便，成本低廉，效率高，易于大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N7/00GK101245326SQ20081002079
公開(kāi)日2008年8月20日 申請(qǐng)日期2008年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月27日
發(fā)明者侯繼波, 王繼春 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院