專利名稱：：新構(gòu)建的高產(chǎn)蘋果酸基因工程菌及其生產(chǎn)蘋果酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一抹高產(chǎn)蘋果酸重組菌抹的構(gòu)建，還涉及利用該菌林發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸的方法。
背景技術(shù)：
：蘋果酸是人體內(nèi)部循環(huán)的重要中間產(chǎn)物，易被人體吸收，因此作為優(yōu)異的食品添加劑和功能性食品廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療和保健等領(lǐng)域。目前蘋果酸生產(chǎn)以富馬酸或馬來酸為原料，加壓與水蒸汽共熱形成DL-蘋果酸，也可以糠醛為原料，經(jīng)雙氧水處理，在超聲波作用下轉(zhuǎn)變而成。化學(xué)法由于生產(chǎn)工藝比較復(fù)雜，工藝條件要求高，分離精制技術(shù)難度大，加之原料為化工產(chǎn)品，成本高和環(huán)境污染等原因使得蘋果酸的應(yīng)用受到限制。蘋果酸的生物合成法包括Sim化轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵法。20世紀(jì)卯年代中期出現(xiàn)的酶催化轉(zhuǎn)化法一般都是以富馬酸為底物，利用具有高活性富馬酸酶的微生物細(xì)胞或富馬酸酶，采用細(xì)胞反應(yīng)器或固定化酶，將富馬酸轉(zhuǎn)化成L-蘋果酸。但原料富馬酸供應(yīng)不足，且價(jià)格昂貴，限制了該方法的應(yīng)用前景。隨著石油危機(jī)的出現(xiàn)，使得人們加大了對微生物發(fā)酵法制備蘋果酸的研究力度，這一時(shí)期人們用來發(fā)酵制備蘋果酸的微生物主要是霉菌，其中黃曲霉^a/^v"為重點(diǎn)研究的對象，具體包括黃曲霉^yA/7flvw,末曲霉爿平oo^"e,寄生曲霉y^.戸m礎(chǔ)dTakao等報(bào)道先用少糾艮霉(///邵"5fl/h'/r/認(rèn))或華根霉(及Wzo/7mc/u'"e"j&)把糖質(zhì)原料轉(zhuǎn)化成富馬酸，然后利用膜醭畢赤酵母(i^c/ia附e附6roweflcybc/giw々c/ew力、普通變形軒菌(pro&"j1vw/gar/5)及宛氏4以青審(pacc/o附y(tǒng)cesvan'o")之一，把富馬酸轉(zhuǎn)化成L-蘋果酸的研究，但轉(zhuǎn)化率不高(J.Ferment.Techno,1983，61:643-645)。山東食品發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室等人多年來致力于直接發(fā)酵法生產(chǎn)L-蘋果酸的研究，并且從土壤中分離篩選、誘變獲得一林直接利用淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)L-蘋果酸的高產(chǎn)菌林^perg/〃^y7aviwHA5800,經(jīng)條件優(yōu)化，7000升發(fā)酵罐產(chǎn)酸達(dá)8.68%,糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)83.5%，發(fā)酵周期112小時(shí)，為L-蘋果酸產(chǎn)業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。(中國食品添加劑，2003，3:52-56)。發(fā)酵法生產(chǎn)蘋果酸可以利用可再生資源(葡萄糖，淀粉等)和二氧化碳，不僅擺脫了對石化原料的依賴，而且開辟了溫室氣體二氧化碳利用的新途徑。因此，以微生物發(fā)酵法生產(chǎn)蘋果酸的研究與開發(fā)正在美國、日本等國家深入地進(jìn)行著。但霉菌生長速度慢，產(chǎn)品生產(chǎn)強(qiáng)度偏低，開發(fā)對營養(yǎng)條件需求簡單、生長迅速、收率高的蘋果酸酸生產(chǎn)菌抹是加速生物法替代石化法生產(chǎn)的關(guān)鍵。利用大腸桿菌來發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸，是利用了大腸桿菌生長快速、培養(yǎng)條件簡單、安全性好、易操作易改造等諸多優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)蘋果酸優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)工業(yè)化生產(chǎn)的方向。而提高大腸桿菌的發(fā)酵產(chǎn)酸能力，可以用多種方法，包括重新篩選優(yōu)良菌^f朱、通過傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法進(jìn)行菌種誘變以及用現(xiàn)代遺傳育種技術(shù)、基因工程方法來提高菌種的產(chǎn)酸能力等。SoonHoHong等人報(bào)道了構(gòu)建產(chǎn)琥珀脧基因工程菌的方法，原理是敲除野生大腸桿菌中的丙酮酸甲酸裂解酶基因(PFL)和乳酸脫氫酶基因(LDH)，減少甚至不產(chǎn)副產(chǎn)物曱酸、乳酸、乙酸以及乙醇等，使更多的代謝流流向琥珀酸(BiotechnolBioeng，2001，74:89-95)。在此基礎(chǔ)下，如果能夠敲除FUM,則可以阻斷蘋果酸到富馬酸的反應(yīng)，使產(chǎn)物以蘋果酸的形式積累。采用基因工程手段構(gòu)建高產(chǎn)蘋果酸的大腸桿菌以及利用該基因工程菌用于厭氧發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸的方法未見公開，而這種應(yīng)用將大大推進(jìn)蘋果酸產(chǎn)業(yè)的進(jìn)步和發(fā)展。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種能高產(chǎn)蘋果酸的基因工程菌抹及其構(gòu)建方法，并利用該菌抹厭氧發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸，達(dá)到菌林的構(gòu)建方法簡單方便，構(gòu)建得到的菌林發(fā)酵方法簡單可行，易于工業(yè)化，產(chǎn)酸能力強(qiáng)的目的，從而大大降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案1、高產(chǎn)蘋果酸基因工程菌抹Esc/ze/7'cWaco/ZJM127的構(gòu)建本發(fā)明構(gòu)建到的基因工程菌林，分類命名為埃希氏菌屬大腸埃希氏菌EscAm'c/^co//JM127，其保藏號登記號為CGMCCNo.2300。本發(fā)明以缺乏乳酸脫氫酶基因(LDH)，丙酮酸甲酸裂解酶基因(PFL)活性的菌抹NZNlll為出發(fā)菌抹，利用同源重組技術(shù)敲除富馬酸酶FUM基因，并過量表達(dá)蘋果酸酶后，恢復(fù)其在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，獲得￡sc;lmcWflco//JM127,重組菌林的代謝途徑如圖1所示。具體步驟如下(1)利用同源重組技術(shù)敲除富馬酸酶FUM基因本發(fā)明以兩側(cè)帶有FRT位點(diǎn)的安普霉素抗性基因?yàn)槟０?，利用高保真PCR擴(kuò)增系統(tǒng)，并設(shè)計(jì)兩端帶有FUM同源片段的擴(kuò)增引物，成功擴(kuò)增出線性DNA同源片段；同時(shí)，在出發(fā)菌林中導(dǎo)入能夠誘導(dǎo)表達(dá)X重組酶的質(zhì)粒，使在電轉(zhuǎn)入線性DNA片段后，可以抑制菌體內(nèi)部的核酸外切酶，防止線性片段的分解，同時(shí)進(jìn)行同源重組，通過抗性篩選獲得陽性重組子；然后，利用FRT位點(diǎn)的存在，敲除抗性基因。本發(fā)明利用諸導(dǎo)表達(dá)FLP重組酶后成功將抗性基因敲除，達(dá)到無痕敲除的目的，其中實(shí)現(xiàn)過程如下導(dǎo)入能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生FLP重組酶的質(zhì)粒，在誘導(dǎo)后，利用一對平板，進(jìn)行平行點(diǎn)樣，能夠在無抗性平板上生長，但不能在抗性平板上生長的菌即為已經(jīng)敲除抗性的菌抹；(2)過量表達(dá)蘋果酸酶，恢復(fù)其在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，獲得Ey^e/7'c;^co//JM127:合成一對5，端帶有酶切位點(diǎn)的引物，以大腸桿菌K12基因組DNA為模板，純化擴(kuò)增出的#」基因后，表達(dá)質(zhì)粒pTrc99a用與引物所設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)一致的酶雙酶切、連接獲得重組質(zhì)粒pTrc99a-s/";將質(zhì)粒pTrc99a"/d導(dǎo)入之前消除安普霉素抗性菌抹的感受態(tài)，獲得的陽性轉(zhuǎn)化子即為Esr/jer/c/j/aco/z'JM127;在成功敲除FUM基因后，超量表達(dá)蘋果酸酶，恢復(fù)在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力。2、基因工程菌林^c/ier/c/n'aco//JM127的發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸厭氧發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量諸如乙酸等對菌林有毒害作用的副產(chǎn)物，因此考慮采用兩階段發(fā)酵方式，有氧階段提高生物量，厭氧階段進(jìn)行產(chǎn)酸發(fā)酵。也可選擇性地采用膜分離技術(shù)，達(dá)到分離菌體的目的，再進(jìn)而用于厭氧發(fā)酵。具體步驟為采用兩階段發(fā)酵模式，按1%(v/v)接種量從凍存管接入三角瓶中，當(dāng)有氧培養(yǎng)菌體OD柳至0.8~1.0左右用0.7mM的IPTG誘導(dǎo)至OD6(M)=3左右時(shí)，按接種量10%轉(zhuǎn)接至血清瓶中厭氧發(fā)酵。或者，采用兩階段發(fā)酵模式，按1%(v/v)接種量從凍存管接入三角瓶中，當(dāng)有氧培養(yǎng)菌體OD柳至0.8~1.0左右用0.7mM的IPTG誘導(dǎo)至OD600=3左右時(shí)，經(jīng)膜處理后，按接種量10%轉(zhuǎn)接至血清瓶中厭氧發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)果表明新構(gòu)建的重組大腸桿菌Esc/^WcWaco/z'JM127能大量積累蘋果酸，富馬酸、丁二酸積累較少，相比出發(fā)菌林的終產(chǎn)物為丁二酸，且無蘋果酸積累的特征，新構(gòu)建的重組大腸桿菌Esc/er/c/H'flJM127產(chǎn)酸特征變化巨大。而采用膜過濾后轉(zhuǎn)接厭氧發(fā)酵48h,17.5g/L初始葡萄糖可產(chǎn)9.7g/L蘋果酸。未經(jīng)膜處理的也能達(dá)到8.1g/L的蘋果酸，得率46%，生產(chǎn)強(qiáng)度0.17g/(L'h)。當(dāng)以80g/L葡萄糖為初始糖濃度時(shí)，蘋果酸產(chǎn)量最高，為29.5g/L。本發(fā)明的有益效果在于利用代謝工程手段，對大腸桿菌進(jìn)行目標(biāo)產(chǎn)物途徑的強(qiáng)化，以及切斷副產(chǎn)物的生成途徑，使代謝流更多地流向蘋果酸。并利用該菌林進(jìn)行兩階IL^酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示可生產(chǎn)較高濃度的蘋果酸，為利用大腸桿菌工業(yè)化生產(chǎn)蘋果酸打下基礎(chǔ)0圖1￡^m-c/.flco//JM127的代謝途徑圖2線性DNA片段的電泳鑒定圖圖3同源重組陽性重組子的電泳鑒定圖圖4NZN111(pTrc99a-s/d)敲除富馬酸酶前后的有沖幾酸產(chǎn)物比較本發(fā)明的微生物保藏日期為2007年12月25日，保藏單位全稱為中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡稱CGMCC，保藏編號CGMCCNo.2300。具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例對本發(fā)明作詳細(xì)說明，但對本發(fā)明沒有限制。實(shí)施例1本實(shí)施例說明利用同源重組技術(shù)敲除親本大腸桿菌NZN111中富馬酸酶/ww基因，得到消除安普霉素抗性菌林的過程。1、利用LB培養(yǎng)基，于37°C、有氧條件下培養(yǎng)大腸桿菌NZN111至OD60o=0.4~0.6，制備成電轉(zhuǎn)感受態(tài)。2、將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入感受態(tài)的大腸桿菌NZNlll。電擊條件為200Q,25jiF，電擊電壓2.3kV，電擊時(shí)間4~5ms。電擊后迅速將菌體加入預(yù)冷1mL的SOC培養(yǎng)基，150r/min、30'C培養(yǎng)1h之后涂布于帶氨節(jié)青霉素(amp)的LB培養(yǎng)基平板篩選出陽性轉(zhuǎn)化子NZNlll(pKD46)。3、在LB培養(yǎng)基中加入10mM的L-阿拉伯糖，于30'C下誘導(dǎo)質(zhì)粒pKD46表達(dá)出X重組酶，制成電轉(zhuǎn)感受態(tài)。4、以兩側(cè)帶有FRT位點(diǎn)的安普霉素抗性基因?yàn)?莫板，利用高保真PCR擴(kuò)增系統(tǒng)，以質(zhì)粒pIJ773為模板，并設(shè)計(jì)兩端帶有FUM同源片段的擴(kuò)增引物，擴(kuò)增出線性DNA同源片^殳，引物序列如下上游帶同源臂引物Hl-Pl,下劃線為同源片段5'-CGGCACGCCATTTTCGAATAACAAATACAGAGTTACAGGCTGGAAGCTATTCCGGGGATCCGTCGACC-3'下游帶同源臂引物H2-P2，下劃線為同源片段5，-TTACTTAGTGCAGTTCGCGCACTGTTTGTTGACGATTTGCTGGAAGAATGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'反應(yīng)體系帶同源臂的上下游引物(100pmol4iL)各0.5^L;模板DNA(100ng4iL)0.5nL;10xbuffer5dNTPs(10mM)各1DMSO(100%)2.5^L;PyrobestDNA聚合酶(2.5U/pL)1ddH2036/35.5總體積50^L。反應(yīng)條件94°C,2min;(94°C，45sec;50°C，45sec;72°C，90sec;IO個(gè)循環(huán))；(94°C,45sec;55°C,45sec;72。C,卯sec;15個(gè)循環(huán))；72X:,5min。線性DNA片段的鑒定如圖2。5、電轉(zhuǎn)線性DNA片段至已誘導(dǎo)表達(dá)X重組酶的NZNUl(pKD46)感受態(tài)，并涂布于帶安普霉素的LB平板篩選出陽性重組子，并進(jìn)行了PCR鑒定，電泳圖如圖3所示。6、陽性重組子制備成感受態(tài)后倒入能誘導(dǎo)表達(dá)FLP重組酶的質(zhì)粒pCP20,于42'C熱激表達(dá)FLP重組酶后即可消除安普霉素抗性。利用一對平板，進(jìn)行平行點(diǎn)樣，能夠在無抗性平板上生長，但不能在抗性平板上生長的菌即為已經(jīng)敲除抗性的菌株。敲除了富馬酸酶后的有>^酸產(chǎn)物比4交如圖4所示。實(shí)施例2本實(shí)施例說明構(gòu)建超量表達(dá)蘋果酸酶的表達(dá)質(zhì)粒，恢復(fù)重組菌林在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，得到菌林^c/er/cWaco//JM127的過程。1、構(gòu)建超量表達(dá)蘋果酸酶的表達(dá)質(zhì)粒，其過程包括(i)合成帶有ivcoi和/z/mnn酶切位點(diǎn)的引物，上游引物5'-CATGCCATGGATATTCAAAAAAGAGTGAGTG誦3，下游引物5，-CCCAAGCTTTTAGATGGAGGTACGGC-3，(2)以大腸桿菌K12為模板，菌落PCR，反應(yīng)條件為95。C，1.5min，63。C，l.Omin,72°C，1.5min，共35個(gè)循環(huán)。純化擴(kuò)增出的s/"基因后，表達(dá)質(zhì)粒pTrc99a分別用iVcoI和歷m/HI雙酶切、連接獲得重組質(zhì)粒pTrc99a-s/c丄2、將質(zhì)粒pTrc99a-s/d導(dǎo)入實(shí)施例1中消除安普霉素抗性菌抹的感受態(tài)。獲得的陽性轉(zhuǎn)化子即為本發(fā)明的新構(gòu)建菌抹EscAen'cWaco//JM127。實(shí)施例3本實(shí)施例說明新構(gòu)建的重組大腸桿菌JM127與NZN111(pTrc99a-s/d)發(fā)酵產(chǎn)酸能力的對比。大腸桿菌NZN111(CGSC7726)當(dāng)導(dǎo)入質(zhì)粒pTrc99a-s/d，過量表達(dá)蘋果酸酶基因，恢復(fù)了NZN111在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，且有高產(chǎn)量的琥珀酸積累。構(gòu)建的重組大腸桿菌￡^^/^/00)//1^127，在無氧條件下生長時(shí)，它產(chǎn)蘋果酸，富馬酸，琥珀酸，乙酸的混合酸，其中蘋果酸是主要產(chǎn)物。為了考察富馬酸酶活性降低后對產(chǎn)酸的影響，采用兩階段發(fā)酵模式，按1%(v/v)接種量從凍存管接入三角瓶中，當(dāng)有氧培養(yǎng)菌體OD柳至0.8~1.0左右用0.7mM的IPTG誘導(dǎo)至OD600=3左右時(shí)，按接種量10%轉(zhuǎn)接至血清瓶中厭氧發(fā)酵，發(fā)酵48h。有氧階段培養(yǎng)基為LB+kan(卡那霉素30pg/mL)+amp(氨節(jié)青霉素100ng/mL)厭氧階段培養(yǎng)基為LB+葡萄糖(20g/L)+碳酸鎂(15g/L)十kan(30pg/mL)+amp(100ng/mL)發(fā)酵結(jié)果見表l。表l敲除富馬酸酶對NZNlll(pTrc99a-sfcA)發(fā)酵產(chǎn)酸的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注ND表示未檢測到實(shí)施例4本實(shí)施例說明將膜處理方法應(yīng)用到新構(gòu)建的重組大腸桿菌Esd^/"/cWaco//JM127發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸的產(chǎn)酸能力比較。大腸桿菌￡^^/￡^"0/〃1^127,在有M酵階段產(chǎn)生一定量乙酸，會(huì)影響第二階段厭氧發(fā)酵過程菌體的生長，因此采用膜過濾處理，截流下菌體后，經(jīng)洗脫后作為接種物進(jìn)行厭氧發(fā)酵。為了考察其對菌體生物量及產(chǎn)物的影響，采用兩階段發(fā)酵模式，按l。/。(v/v)接種量從凍存管接入三角瓶中，當(dāng)有氧培養(yǎng)菌體OD柳至0.8~1.0左右用0.7mM的IPTG誘導(dǎo)至OD6(wr3左右時(shí)，經(jīng)膜處理后，轉(zhuǎn)接至血清瓶中厭氧發(fā)酵，發(fā)酵48h，并以不經(jīng)膜處理的接種物作為對照。有氧階段培養(yǎng)基為LB+kan(30pg/mL)+amp(100pg/mL)厭氧階段培養(yǎng)基為LB+葡萄糖(20g/L)+碳酸鎂(15g/L)十kan(30pg/mL)+amp(100pg/mL)發(fā)酵結(jié)果見表2。表2膜處理后對JM127發(fā)酵產(chǎn)酸及菌體生物量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注ND表示未檢測到實(shí)施例5本實(shí)施例中考察了大腸桿菌Eyc/ieWcWaco//JM127對葡萄糖耐受性。隨著起始葡萄糖濃度的提高，80g/L葡萄糖下，單位體積的菌體量基本不變，進(jìn)一步提高葡萄糖濃度，菌體生長受到抑制，見表3。同時(shí)對不同濃度下蘋果酸的產(chǎn)量進(jìn)行了考察。采用兩階段發(fā)酵模式，按l。/o(v/v)接種量從凍存管接入三角瓶中，當(dāng)有氧培養(yǎng)菌體OD6oo至0.8-1.0左右用0.7mM的IPTG誘導(dǎo)至OD600=3左右時(shí)，按接種量10%轉(zhuǎn)接至血清瓶中厭氧發(fā)酵，發(fā)酵48h。有氧階段培養(yǎng)基為LB+kan(30ng/mL)+amp(100pg/mL)厭氧階段培養(yǎng)基為LB+葡萄糖(20g/L)+碳酸鎂(15g/L)十kan(30pg/mL)+amp(100pg/mL)發(fā)酵結(jié)果見表3。表3不同葡萄糖濃度下JM127的產(chǎn)蘋果酸能力<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權(quán)利要求1、一種高產(chǎn)蘋果酸的基因工程菌，其分類命名為埃希氏菌屬大腸埃希氏菌EscherichiacoliJM127，其保藏號登記號為CGMCCNo.2300。2、一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述高產(chǎn)蘋果酸的基因工程菌的方法，其特征在于以缺乏乳酸脫氫酶基因(LDH),丙酮酸曱酸裂解酶基因(PFL)活性的菌抹NZNlll為出發(fā)菌林，利用同源重組技術(shù)敲除蘋果酸酶(FUM)基因，并過量表達(dá)蘋果酸酶后，恢復(fù)其在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，獲得大腸桿菌五jc/m'c//"co//JM127。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建大腸桿菌￡^/jer/c//aco//JM127的方法，其特征包括以下構(gòu)建步驟1)利用同源重組技術(shù)敲除蘋果酸酶(FUM)基因以兩側(cè)帶有FRT位點(diǎn)的安普霉素抗性基因?yàn)槟０?，利用高保真PCR擴(kuò)增系統(tǒng)，并設(shè)計(jì)兩端帶有FUM同源片段的擴(kuò)增引物，成功擴(kuò)增出線性DNA同源片段；在出發(fā)菌抹中導(dǎo)入能夠誘導(dǎo)表達(dá)X重組酶的質(zhì)粒,使在電轉(zhuǎn)入線性DNA片段后，可以抑制菌體內(nèi)部的核酸外切酶，防止線性片段的分解，同時(shí)進(jìn)行同源重組，通過抗性篩選獲得陽性重組子；導(dǎo)入能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生FLP重組酶的質(zhì)粒，在誘導(dǎo)后，利用一對平板，進(jìn)行平行點(diǎn)樣，能夠在無抗性平板上生長，但不能在抗性平板上生長的菌即為已經(jīng)敲除抗性的菌林。2)過量表達(dá)蘋果酸酶，恢復(fù)其在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，獲得大腸桿菌■Esc/zm'c/j/aco//JM127。合成一對5'端帶有酶切位點(diǎn)的引物，以大腸桿菌K12基因組DNA為模板，純化擴(kuò)增出的基因后，表達(dá)質(zhì)粒pTrc99a用與引物所設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)一致的酶雙酶切、連接獲得重組質(zhì)粒pTrc99a-s/cA將質(zhì)粒pTrc99a"/"導(dǎo)入之前消除安普霉素抗性菌林的感受態(tài)，獲得的陽性轉(zhuǎn)化子即為Esc/eWc/z/flco//JM127;在成功敲除FUM基因后，超量表達(dá)蘋果酸酶，恢復(fù)在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力。4、一種利用權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)蘋果酸的基因工程菌五sc^n'c/n'aco"JM127發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸的方法，其特征在于采用兩階段發(fā)酵方式，有氧階段提高生物量，厭氧階段發(fā)酵產(chǎn)酸。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的采用兩階段發(fā)酵方式，其特征在于按1%(v/v)接種量從凍存管接入三角瓶中，當(dāng)有氧培養(yǎng)菌體OD6oo至0.8~1.0左右用0.7mM的IPTG談導(dǎo)至OD60o=3左右時(shí)，按接種量10%轉(zhuǎn)接至血清瓶中厭氧發(fā)酵。6、一種利用如權(quán)利要求4所述的高產(chǎn)蘋果酸的基因工程菌J^c/zen'c//aco//JM127發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸的方法，其特征在于發(fā)酵在經(jīng)歷有氧發(fā)酵階段后采用膜分離過程，再進(jìn)而用于厭氧發(fā)酵。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的采用兩階段發(fā)酵方式，其特征在于按1%(v/v)接種量從凍存管接入三角瓶中，當(dāng)有氧培養(yǎng)菌體OD600至0.8~1.0左右用0.7mM的IPTG誘導(dǎo)至OD6o。-3左右時(shí)，經(jīng)膜處理后，按接種量10%轉(zhuǎn)接至血清瓶中厭氧發(fā)酵。8、根據(jù)權(quán)利要求6和7所述的膜分離過程，其特征在于采用的膜為微濾膜。全文摘要本發(fā)明公開了一種構(gòu)建高產(chǎn)蘋果酸基因工程菌株EscherichiacoliJM127的方法及其產(chǎn)酸的方法，其構(gòu)建過程主要包括失活或敲除兼性微生物中具有使蘋果酸脫水反應(yīng)和降解丙酮酸能力的酶，并超量表達(dá)NAD再生的酶。利用已構(gòu)建的一株大腸桿菌進(jìn)行兩階段發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，其步驟如下(1)將活化的大腸桿菌接種于富集培養(yǎng)基，好氣培養(yǎng)，提高生物量；(2)將有氧培養(yǎng)得到的菌液膜處理后，轉(zhuǎn)接于含有20～100g/L葡萄糖，一定濃度碳酸鹽的LB培養(yǎng)基中，厭氧發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸。文檔編號C12N9/04GK101255405SQ200810023410公開日2008年9月3日申請日期2008年4月11日優(yōu)先權(quán)日2008年4月11日發(fā)明者麗于,岷姜,歐陽平凱,王益娜,陳可泉,萍韋,馬江鋒,黃秀梅申請人:南京工業(yè)大學(xué)