專利名稱：：一種含cmp激酶和cdp激酶的啤酒酵母菌的篩選及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種含高活力CMP激酶和CDP激酶的啤酒酵母菌的篩選以及該啤酒酵母菌在生產(chǎn)胞苷三磷酸中的應(yīng)用，屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：胞苷三磷酸(簡稱CTP)是機體細胞內(nèi)的一種正常成分，它在體內(nèi)參與核酸和磷脂類的合成代謝，促進蛋白質(zhì)的合成，并提供能量，還可以調(diào)節(jié)和促進神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞及血管壁細胞膜性結(jié)構(gòu)的合成與構(gòu)建，能夠?qū)褂膳d奮性氨基酸、自由基引起的神經(jīng)細胞損傷，從而起到抗血管硬化的作用。而胞苷一磷酸激酶(CMPkinase)和胞苷二磷酸激酶(CDPkinase)的主要作用是負責(zé)激活胞苷三磷酸合成酶(CTPsynthetase),激活胞苷三磷酸合成酶能降低胞苷一磷酸(簡稱CMP)水平，使CMP合成CTP。目前已有廠家生產(chǎn)CTP注射液制劑，臨床上主要用于治療多種原因引起的神經(jīng)系統(tǒng)及心血管類疾病，如腦血管意外及其后遺癥；腦震蕩、外傷性昏迷、顱腦手術(shù)后功能障礙；神經(jīng)官能癥；腦血管硬化、老年性癡呆；外周神經(jīng)損傷；兒童腦發(fā)育不全等。(IshigeKazuya，2002)枯草芽孢桿菌jofC編碼CMP激酶，啤酒酵母中URA6編碼CMP激酶(ShinyaKaneko，1998)。大腸桿菌中mssA基因編碼CMP激酶已被Fricke等人證實，雖然CMP激酶不是大腸桿菌所必需，但CMP激酶在ATP提供磷?；闆r下，可逆催化CMP轉(zhuǎn)化CDP,進而生成CTP:ATPMg2++CMP—ADPMg2++CDPATP-Mg2++CDP—ADPMg2++CTPCTP的合成工藝方法主要包括化學(xué)法、生物合成法、光合磷酸法等。由于底物價格的原因，國內(nèi)外對CTP工業(yè)化生產(chǎn)的研究甚少，在我國真正生產(chǎn)CTP的企業(yè)基本上沒有，但自發(fā)現(xiàn)可作為藥物以后，市場需求逐年增大，隨著CMP價格的逐年下降，生產(chǎn)前景十分看好。CTP在上世紀80年代國內(nèi)的生產(chǎn)方法主要都是通過分離出酵母體內(nèi)的自身酶系對CMP進行轉(zhuǎn)化，生產(chǎn)工藝比較成熟，但該工藝不能完全分離出糖酵解系統(tǒng)中的所有酶，酶失活率高，轉(zhuǎn)化率低，(EthanSSimon，1990)。應(yīng)國清等人(2004)利用游離的啤酒酵母將CMP合成為CTP，CTP的轉(zhuǎn)化率可維持在80。/。左右，詹谷字等人(1997)用菠菜葉綠體通過光合磷酸化反應(yīng)將CMP合成為CTP,轉(zhuǎn)化率為85%。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是公開一種含高活力CMP激酶和CDP激酶的啤酒酵母菌。本發(fā)明的另一個目的是提供篩選該啤酒酵母菌的方法。本發(fā)明的再一個目的是公開該啤酒酵母菌在生產(chǎn)胞苷三磷酸中的應(yīng)用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案達到以上目的一種含有CMP激酶和CDP激酶的啤酒酵母菌(^cc力"湖/cescei"en、/ae)菌才朱，菌落為乳白色，有光澤，平坦，邊緣整齊，其在2008年4月IO日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號是CGMCCNO.2448。所述菌^^朱的篩選方法的步驟包括(1)制作酵母菌懸液，將酵母經(jīng)培養(yǎng)基活化后放入搖床振蕩培養(yǎng)到細胞處于對數(shù)生長期后離心回收菌體，加入磷酸鹽緩沖液制成菌懸液；(2)將上述菌懸液與誘變劑按l:l容量比混合，3(TC恒溫水浴10-50分鐘后，混合液稀釋至10—3倍-10—6后涂布平板，得到抗性菌抹；(3)將上述抗性菌抹經(jīng)搖床培養(yǎng)24-36小時，用高效液相色譜法檢測并篩選出含高活力CMP激酶和CDP激酶的啤酒酵母菌抹；其中，搖床的溫度為26-36°C，轉(zhuǎn)速為160-300rpm，所述步驟(2)中的誘變劑是2mg/ml的亞硝基胍；所述平板中的培養(yǎng)基含有300]ug/ml胞苷三磷酸結(jié)構(gòu)類似物胞苷二磷酸-乙醇胺，所述抗性菌株為胞普二磷酸-乙醇胺抗性突變抹，。本發(fā)明的啤酒酵母菌菌抹在生產(chǎn)胞苷三磷酸中的應(yīng)用包括利用包埋法以卡拉膠-魔芋多糖復(fù)配膠為載體將所述菌種制成固定化細胞后加入合成胞苦三磷酸的反應(yīng)體系中，再利用離子交換分離純化的方法分離純化反應(yīng)液，最后結(jié)晶得到胞苷三磷酸。其具體步驟是(1)將卡拉膠鈉鹽和魔芋粉溶于去離子水中，蒸汽加熱到121°C后保溫4070分鐘，倒入反應(yīng)釜中自然冷卻到40°C,膠液保溫，其中k-卡拉膠鈉鹽與魔芋粉的重量比為2:1;(2)將生理鹽水加入洗滌好的啤酒酵母濕菌體中攪拌均勻制成酵母懸液，35。C保溫，其中生理鹽水和啤酒酵母濕菌體的重量比為1:4;(3)將步驟(2)中的酵母懸液倒入步驟(1)的膠液中，于40°C下攪拌20~40分鐘，使之混勻得到混合物；(4)在帶攪拌的反應(yīng)釜中加入溶劑預(yù)熱至4(TC，將步驟(3)得到的混合物倒入反應(yīng)蚤，攪拌2G~40分鐘待混合物形成顆粒，過濾，其中攪拌速度為50-150rpm;(5)將步驟(4)中過濾后的顆粒在氯化鉀溶液中浸泡30~90分鐘，過濾，再用戊二醛浸泡30~90分鐘，用篩網(wǎng)瀝盡顆粒表面水分后，裝袋至冰箱冷藏。其中步驟(4)中采用的溶劑為豆油，所述固定化細胞為球狀。所述離子交換分離純化的方法分離純化反應(yīng)液的步驟中釆用HZ-1離子交換樹脂進行離子交換色譜，并用1.Omol/L氯化鈉溶液每小時以0.2-0.5柱體積進行梯度洗脫，得到胞苷三磷酸洗脫液。所述結(jié)晶的步驟中將洗脫液在50-7(TC水浴下減壓濃縮，加入3倍體積的95%乙醇，于冰箱靜置過夜后抽濾，將濾餅干燥得到胞苷三磷酸。本發(fā)明采用包埋法以卡拉膠為載體自動生成球形顆粒固定化細胞，可以方便的制備各種粒徑的球形顆粒，與手工切割相比，細胞滲漏少，顆粒規(guī)則，強度高，勞動強度小，造粒程序簡單，無須復(fù)雜的設(shè)備和儀器。其優(yōu)點在于所使用的溶劑為豆油，安全無毒，獲取方便，適合各種要求，并且易于回收；該工藝穩(wěn)定，操作簡便，產(chǎn)品后處理簡單，易于工業(yè)化生產(chǎn)。應(yīng)用本發(fā)明球形固定化酵母顆粒催化反應(yīng)合成CTP，維持時間長，并可以方便固液快速分離，降低所生成的CTP進一步降解；球形顆?？梢苑磸?fù)使用十批以上且不降低CTP轉(zhuǎn)化率，其反應(yīng)液清亮，無須進一步復(fù)雜的顆?；厥詹僮鳎磻?yīng)批次明顯高于游離酵母和手工切割顆粒；反應(yīng)液經(jīng)離子交換分離，所得CTP濃溶液純度達到94%以上，柱上收率均在80%以上；而游離酵母反應(yīng)液所得的CTP離子交換液純度差，收率低；結(jié)晶后，由于CTP濃溶液純度高，所得晶體結(jié)晶容易，晶體純度達到97%以上，晶體含量達到94%以上，明顯高于游離酵母和手工切割的顆粒反應(yīng)，CTP轉(zhuǎn)化率可達到97%。以下結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的說明。圖1為本發(fā)明啤酒酵母菌抹。圖2為本發(fā)明制備的球形固定化顆粒的重復(fù)反應(yīng)示意圖，圖中-令_表示球形顆粒；-〇-表示游離酵母；-a-表示手工切割。圖3為CTP標準品的HPLC圖譜。圖4為CTP樣品的HPLC圖譜。具體實施方式材料和儀器市售的啤酒酵母、搖瓶培養(yǎng)基、斜面培養(yǎng)基、亞硝基胍(簡稱NTG)溶液、底物溶液、搖床、20L帶攪拌反應(yīng)釜、100L帶攪拌反應(yīng)釜、高效液相色譜儀。搖瓶培養(yǎng)基的配制40g葡萄糖、15g硫酸銨、9g磷酸二氫鉀、3g磷酸氫二鉀、3g七水硫酸鎂、0.03g七水硫酸亞鐵、3g酵母膏、3g玉米漿,溶于1000ml蒸餾水中，pH4.0-6.5,115。C滅菌20min。斜面培養(yǎng)基的配制40g葡萄糖、15g硫酸銨、9g磷酸二氫鉀、3g磷酸氫二鉀、3g七水硫S吏鎂、0.03g七水硫酸亞鐵、3g酵母膏、3g玉米漿、20瓊脂，溶于1000ml蒸餾水中，pH4.0-6.5。實施例一(1)將待篩選的市售啤酒酵母經(jīng)斜面培養(yǎng)基活化后轉(zhuǎn)入搖床培養(yǎng)，搖床溫度30°C，轉(zhuǎn)速200rpm培養(yǎng)2化后，再取lml培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于搖瓶培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心回收菌體，加入5ml、pH7.0的磷酸鹽緩沖液，制成菌懸液。(2)稱取20mg的NTG,用丙酮溶解后，加入蒸餾水定容至10ml，即為2mg/ml的NTG溶液，將lml菌懸液和lml亞硝基胍(NTG)溶液混合，振蕩混勻后，在30。C恒溫水浴鍋水浴30min，然后將混合液稀釋至10_3終止誘變。誘變終止后再將終止液稀釋成l(T5、l(T后涂布加有胞苷三磷酸結(jié)構(gòu)類似物胞苷二磷酸-乙醇胺(3GGng/ml)平板，篩選出胞苷二磷酸-乙醇胺抗性突變株。(3)將篩選出的抗性突變株接入斜面培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)24h做為斜面活化種子。將斜面活化種子接入搖瓶，3(TC，200rpm搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心回收菌體，并將該菌抹轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)基，3(TC培養(yǎng)24小時后至4。C冰箱保存。在25g酵母量中加入20ml底物溶液，其中包括CMP60mmol/L、葡萄糖150mmol/L、磷酸鹽緩沖液(鈉鹽)250mmol/L、氯化4美8mmol/L、pH為6.0，溫度35。C，通過添加O.15ml吐溫80，ATP濃度為3mmol/L，反應(yīng)時間20h，在此反應(yīng)體系下，篩選出含高活力CMP激酶、CDP激酶的啤酒酵母菌菌株，見圖l，并用高效液相色譜法檢測。其中，高效液相色譜法的色譜條件為色譜柱漢邦LichrospherO(250mmx4.6mmi.d.，5jum);流動相曱醇6%。(體積分數(shù))，磷酸水溶液(用三乙胺調(diào)節(jié)pH值至6.6)(體積比為11:89);流速l.OmL/min;4企測波長271nm;柱溫為室溫；進樣體積20)iL。實施例二(1)稱取200gK-卡拉膠鈉鹽，100g精制魔芋粉，溶于5L去離子水中，通蒸汽加熱至12rC,保溫60min后，倒入20L帶攪拌的反應(yīng)釜中，自然冷即到40°C，膠液保溫備用。(2)稱取洗滌好的啤酒酵母濕菌體4kg并加入lkg生理鹽水，攪拌均勻，35"C保溫備用。(3)將保溫好的酵母懸液傾入膠液中，于40。C攪拌半小時使混合均勻后備用。(4)在100L帶攪拌的反應(yīng)釜中加入60L大豆油，預(yù)熱至4(TC,控制攪拌速度125rpm，將酵母與膠液的混合物倒入大豆油中，攪拌半小時待顆粒成形，過濾，豆油回收后靜置，棄去下層水份后可重復(fù)使用。(5)將步驟(4)中過濾后的顆粒用3%的氯化鉀溶液浸泡一小時，過濾，再用1%的戊二醛浸泡一小時，用篩網(wǎng)瀝盡顆粒表面的水份，裝袋置冰箱冷藏備用。本實施例可以根據(jù)需要控制攪拌轉(zhuǎn)速制備各種粒徑的球形顆粒，攪拌轉(zhuǎn)速與球形顆粒直徑關(guān)系見表1表l<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>其中，*表示要求的直徑顆粒重量比上總顆粒重量不小于90%，由表1可知，該方法可以方^f更的制備顆并立直徑l-5mm的J泉形顆粒，無需復(fù)雜的設(shè)備及操作條件。本發(fā)明造粒方法與手工切割方法形成顆粒的比較見表2表2<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*表示顆粒與生理鹽水的比例為1:1。由表2可知本發(fā)明造粒方法制得的顆粒球形均勻，強度高，細胞滲透少。實施例三固定化酵母合成CTP的反應(yīng)體系中，除生成大量的CTP外，還存在未反應(yīng)的CMP及副產(chǎn)物CDP、磷酸鹽等雜質(zhì)，為將CTP從反應(yīng)液中分離，采用HZ-1離子交換樹脂進行離子交換色譜，并先用0.4mol/L氯化鈉，再用1.0mol/L氯化鈉溶液每小時以0.2-0.5柱體積進行梯度洗脫。將洗脫液在506(TC水浴下減壓濃縮，加入3倍體積的95%乙醇，于水箱靜置過夜，抽濾，濾餅干燥，成品用高效液相色譜法檢測，色譜條件與實施例一相同。固定化酵母對CTP的連續(xù)反應(yīng)情況見圖2，由圖可知應(yīng)用固定化球形顆粒可以連續(xù)反應(yīng)十批以上，反應(yīng)液清亮，無明顯的細月包脫漏現(xiàn)象；而應(yīng)用同樣方法手工切割的無定形小方塊，雖然可以連續(xù)反應(yīng)，但第4次以后，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率明顯降低，且反應(yīng)液中酵母滲漏嚴重，溶液混濁；游離酵母只能反應(yīng)一次，第二次以后反應(yīng)轉(zhuǎn)化率顯著降低。本實施例中得到CTP的檢測結(jié)果見圖3、圖4。離子交換法和結(jié)晶方法為實驗室常規(guī)方法，此處不再贅述。CTP收率見表3。結(jié)晶數(shù)據(jù)見表4表3<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>其中，*表示游離細胞反應(yīng)，**表示手工切割顆粒催化反應(yīng);表4<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>其中，*表示游離細胞反應(yīng)，**表示手工切割顆粒催化反應(yīng);結(jié)果與討論由表3可知，應(yīng)用球形顆粒催化的反應(yīng)，CMP和CDP雜質(zhì)含量少，離子交換收率高，且洗脫液純度很高；而采用游離細胞或手工切割顆粒催化的反應(yīng)，收率低，且洗脫液純度只有85%左右。由表4可知，應(yīng)用球形顆粒催化的反應(yīng)，結(jié)晶收率可在90%以上，且晶體的純度高達94%以上，完全符合國家的要求；而采用游離細胞的反應(yīng)，晶體收率低，結(jié)晶過程困難，有較多的油狀物出現(xiàn)；手工切割顆粒催化的反應(yīng)，雖然結(jié)晶不困難，但是因洗脫液中純度本來就不高，造成晶體的純度低下，需要反復(fù)結(jié)晶才能達到90%以上。除上述實施例外，本發(fā)明還可以有其他實施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護范圍。權(quán)利要求1.一種含有CMP激酶和CDP激酶的啤酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)菌株，其在中國普通微生物菌種保藏管理中心的保藏號是CGMCCNO.2448。2.才艮據(jù)權(quán)利要求1所述菌株的篩選方法，其特征是所述方法的步驟包括(l)制作酵母菌懸液，將酵母經(jīng)培養(yǎng)基活化后放入搖床振蕩培養(yǎng)到細胞處于對數(shù)生長期后離心回收菌體，加入磷酸鹽緩沖液制成菌懸液；(2)將上述菌懸液與誘變劑按1:1容量比混合，3(rC恒溫水浴10-50分鐘后，混合液稀釋至10—3倍~l(T后涂布平板，得到抗性菌抹；(3)將上述抗性菌株經(jīng)搖床培養(yǎng)24-36小時，用高效液相色譜法檢測并篩選出含高活力CMP激酶和CDP激酶的啤酒酵母菌抹。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述菌林的篩選方法，其特征在于搖床的溫度為26~36°C，轉(zhuǎn)速為160-300rpm;所述步驟(2)中的誘變劑是2mg/ml的亞硝基胍；所述平板中的培養(yǎng)基含有300jug/ml胞苷三磷酸結(jié)構(gòu)類似物胞苷二磷酸-乙醇胺，所述抗性菌林為胞苷二磷酸-乙醇胺抗性突變抹。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌林在生產(chǎn)胞苷三磷酸中的應(yīng)用，其特征在于首先利用包埋法以卡拉膠-魔芋多糖復(fù)配膠為載體將所述菌種制成固定化細胞后加入合成胞苷三磷酸的反應(yīng)體系中，再利用離子交換分離純化的方法分離純化反應(yīng)液，結(jié)晶得到胞苷三磷酸。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的菌株在生產(chǎn)胞苷三磷酸中的應(yīng)用，其特征在于所述包埋法以卡拉膠-魔芋多糖復(fù)配膠為載體將所述菌種制成固定化細胞的具體步驟是(i)將卡拉膠鈉鹽和魔芋粉溶于去離子水中，蒸汽加熱到i2rc后保溫40~70分鐘，倒入反應(yīng)蒼中自然冷卻到40°C，膠液保溫，其中k-卡拉膠鈉鹽與魔芋粉的重量比為2:1;(2)另將生理鹽水加入洗滌好的哞酒酵母濕菌體中攪拌均勻制成酵母懸液，35。C保溫，其中生理鹽水和啤酒酵母濕菌體的重量比為1:4;(3)將步驟(2)中的酵母懸液倒入步驟(1)的膠液中，于40°C下攪拌20~40分鐘，使之混勻得到混合物；(4)在帶攪拌的反應(yīng)釜中加入溶劑預(yù)熱至4(TC,將步驟(3)得到的混合物倒入反應(yīng)釜，攪拌20-40分鐘待混合物形成顆粒，過濾，其中攪拌速度為50-150rpm;(5)將步驟(4)中過濾后的顆粒在氯化鉀溶液中浸泡30~90分鐘，過濾，再用戊二醛浸泡30-90分鐘，用篩網(wǎng)瀝盡顆粒表面水分后，裝袋至水箱冷藏。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的菌抹在生產(chǎn)胞苷三磷酸中的應(yīng)用，其特征在于所述步驟(4)中采用的溶劑為豆油，所述固定化細胞為球狀。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的菌株在生產(chǎn)胞苷三磷酸中的應(yīng)用，其特征在于所述離子交換分離純化的方法分離純化反應(yīng)液的步驟中采用HZ-1離子交換樹脂進行離子交換色譜，并用0.4~1.0mol/L氯化鈉溶液每小時以G.2-0.5柱體積進行梯度洗脫，得到胞苷三磷酸洗脫液。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的菌抹在生產(chǎn)胞苷三磷酸中的應(yīng)用，其特征在于所述結(jié)晶的步驟中將洗脫液在50-7(TC水浴下減壓濃縮，加入3倍體積的95%乙醇，于水箱靜置過夜后抽濾，將濾餅干燥得到胞苷三磷酸.全文摘要本發(fā)明涉及一種含高活力CMP激酶和CDP激酶的啤酒酵母菌的篩選以及該啤酒酵母菌在生產(chǎn)胞苷三磷酸中的應(yīng)用，屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明啤酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)菌株，其在中國普通微生物菌種保藏管理中心的保藏號是CGMCCNO.2448。是利用亞硝基胍(NTG)誘變手段篩選出含高活力CMP激酶，CDP激酶的啤酒酵母菌菌株；在生產(chǎn)胞苷三磷酸的應(yīng)用中，通過包埋法控制不同攪拌速度，制備各種粒徑的以卡拉膠為載體的固定化細胞，與手工切割相比，細胞滲漏少，顆粒規(guī)則，強度高，勞動強度小，造粒程序簡單，無須復(fù)雜的設(shè)備和儀器，所使用的豆油為安全無毒的溶劑，適合各種要求，易于回收，適合工業(yè)化生產(chǎn)。文檔編號C12Q1/04GK101265453SQ20081002390公開日2008年9月17日申請日期2008年4月18日優(yōu)先權(quán)日2008年4月18日發(fā)明者周長林,羅眾球,邱蔚然,閆蓬勃申請人:中國藥科大學(xué);南通秋之友生物科技有限公司