專利名稱：一種α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆與表達的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種a-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(簡稱a-CGT酶)基因的克隆與表達，本發(fā) 明屬于酶基因工程和酶工程領(lǐng)域。具體地說涉及一種編碼軟化類芽孢桿菌 CPeam'6^77/ws附acerara) JFB05-01 a-CGT酶的DNA序列及其表達。
背景技術(shù)：
CGT酶是一個多功能型的酶，它能催化四種不同的反應(yīng)三種轉(zhuǎn)糖基化反
應(yīng)(歧化反應(yīng)、環(huán)化反應(yīng)和偶合反應(yīng))和水解反應(yīng)。CGT酶通過環(huán)化反應(yīng)能利用 淀粉生產(chǎn)環(huán)糊精，這是其工業(yè)應(yīng)用的基礎(chǔ)。除了通過環(huán)化反應(yīng)生產(chǎn)環(huán)糊精，最 近也用CGT酶催化偶合和歧化反應(yīng)，轉(zhuǎn)移供體如淀粉或環(huán)糊精上的低聚糖到各 種受體分子上，得到各種特殊的低聚糖。通過催化不同受體分子的糖基化反應(yīng)， 對諸如甜菊苷、橘皮苷、蕓香苷、維生素C、鼠李糖、抗壞血酸等進行糖基化， 能顯著提高受體分子的功能性、水溶性、對化學(xué)物質(zhì)的穩(wěn)定性。另外，CGT酶 極限糊精的應(yīng)用也被發(fā)現(xiàn)，它可應(yīng)用于造紙工業(yè)中的表面施膠和涂布，能改善 紙張的書寫性能并具有光滑且適于印刷的表面。CGT酶也可用來處理生面團， 通過CGT酶的歧化反應(yīng)，能增加該面團所制作的焙烤產(chǎn)品的體積。
生產(chǎn)CGT酶的微生物種類眾多，有芽孢桿菌、放線菌、微球菌、短桿菌、 曲霉、古細菌等?，F(xiàn)在工業(yè)上生產(chǎn)環(huán)糊精所使用的CGT酶主要來自芽孢桿菌屬。 根據(jù)環(huán)化反應(yīng)在起始階段所生成環(huán)糊精的主要類型不同，CGT酶可分為ou卩和 Y型CGT酶，即a-、 P-和Y-CGT酶。大部分CGT酶為卩型。
目前，許多CGT酶已經(jīng)得到了純化，相應(yīng)的CGT酶的編碼基因(^基因) 得到了克隆。由于能分泌CGT酶的野生菌株的生產(chǎn)能力普遍較低，為了克服野 生菌株的低生產(chǎn)能力，重組大腸桿菌在工業(yè)化生產(chǎn)CGT酶中己經(jīng)在國外得到了
極大的重視。目前，誘導(dǎo)型啟動子P^、 Ptae、 Ptrp和PL已經(jīng)廣泛應(yīng)用于在重組大
腸桿菌中過量生產(chǎn)CGT酶，但是有關(guān)利用適宜載體和宿主對CGT酶進行胞外 表達的報道不多，重組CGT酶大多是作為一種包涵體在細胞內(nèi)部進行積累的， 因此，這種包涵體的活化需要復(fù)雜的變性和重折疊等關(guān)鍵過程，不利于工業(yè)化 生產(chǎn)。在國內(nèi)，CGT酶的克隆與表達迄今為止鮮有報道，國內(nèi)大部分研究者主 要致力于提高原始菌株的酶產(chǎn)量。
環(huán)糊精是由六個以上葡萄糖連結(jié)而成的具有環(huán)狀疏水圓錐形結(jié)構(gòu)的低聚糖 非還原性化合物系列，其中最常用的是a-、 P-、 Y-環(huán)糊精，它們分別由6、 7、 8 個葡萄糖單元構(gòu)成。目前，環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)均采用酶法合成，即在CGT酶催化作用下，通過環(huán)化反應(yīng)轉(zhuǎn)化淀粉及相關(guān)基質(zhì)合成環(huán)糊精。由于環(huán)糊精能與 許多客體分子形成包合物，從而改變客體分子的物理和化學(xué)性質(zhì)如溶解度、穩(wěn)
定性等，因此在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、紡織、環(huán)保、化妝品、生物技術(shù)和分析化 學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。國際市場對環(huán)糊精的年需求已達到IO萬噸以上，國 內(nèi)也已接近萬噸；僅制備醫(yī)藥片劑一項需求就達數(shù)千噸，而目前環(huán)糊精總產(chǎn)量 僅萬噸左右，國內(nèi)僅700余噸，而且絕大部分是P-環(huán)糊精，同時有少量的a-環(huán) 糊精和混合環(huán)糊精。隨著應(yīng)用領(lǐng)域的不斷拓展，環(huán)糊精的需求量一直在逐年大 幅度增長，目前，環(huán)糊精的年增長率達到20% 30%。環(huán)糊精在各個工業(yè)領(lǐng)域中 的應(yīng)用比例大致為食品工業(yè)80%、醫(yī)藥10%、農(nóng)藥5~10%。
和P-環(huán)糊精、Y-環(huán)糊精結(jié)構(gòu)相比，ct-環(huán)糊精最大的特點是具有更小的環(huán)結(jié)構(gòu) 和更小的空腔，因此具有獨特的性質(zhì)和特有的用途。 一般來說，a-環(huán)糊精可以復(fù) 合具有低分子量的分子或者包接脂肪族的側(cè)鏈。在食品工業(yè)上，能作為天然色 素、香料和維生素等的載體；能穩(wěn)定食品中的某些成分，防止其揮發(fā)，抗氧化、 抗光和熱分解等；除去食品中的臭味和苦澀味；使某些食品形成長期穩(wěn)定的乳 狀液等。特別值得注意的是，a-環(huán)糊精具有抗過敏作用，可抑制IgE抗體， 一些 含(x-環(huán)糊精的保健食品已經(jīng)面市。食用該類產(chǎn)品可消除過敏，預(yù)防支氣管哮喘、 過敏性皮炎、鼻炎等癥；(x-環(huán)糊精也是一種難消化膳食纖維，食后有降血糖的作 用。目前，由于P-環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)比較成熟，價格較低，因此應(yīng)用面最廣， 但是，許多研究證實，在一些場合(x-環(huán)糊精的使用效果明顯好于|3-環(huán)糊精。但 由于ct-環(huán)糊精的價格較高，限制了其廣泛的應(yīng)用。
為了降低a-環(huán)糊精的商業(yè)成本，首先必須降低cc-CGT酶的生產(chǎn)成本。 尸eam'^d〃ws maceraws是最常用于a-CGT酶的工業(yè)化生產(chǎn)，但同樣存在生產(chǎn)能 力較低的缺陷。在以前的報道中，重組(x-CGT酶在大腸桿菌中一般定位于胞內(nèi) 形成包涵體或存在于周質(zhì)中，不利于重組a-CGT酶的回收與使用。因此，如何 使a-CGT酶基因在大腸桿菌中得到高效的胞外表達，對降低a-CGT酶的生產(chǎn)成 本顯得非常重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種a-CGT酶，其具有SEQ ID NO: 2所示的氨基 酸序列。本發(fā)明的另一個目的是提供一種編碼該a-CGT酶的DNA分子，所述 的DNA分子具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
本發(fā)明的再一個目的是提供包含本發(fā)明基因的表達載體。 本發(fā)明的又一個目的是提供包含本發(fā)明表達載體的宿主細胞。 本發(fā)明的技術(shù)方案 一種a-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，縮寫為a-CGT酶，其 氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
所述的a-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的基因，縮寫為c^基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示。
所述的基因的表達方法由軟化類芽孢桿菌CPeam'6ac/〃w wacerara) JFB05-01總DNA獲得cgf基因SEQ ID NO:l ， eg/基因以質(zhì)粒pET20b(+)為表達 載體，以￡. cc^BL21(DE3)為表達宿主，實現(xiàn)cg基因的高效表達；
(1 )軟化類芽孢桿菌CPea"沾"c/〃usJFB05-01總DNA的提取。
P附acerara JFB05-01菌株在LB液體培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L， NaC110g/L)中培養(yǎng)2天，10000rpm離心收集菌體，無菌水洗滌，收集沉淀懸 浮于500pL Tris-EDTA (三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸)緩沖液，加入15pL 溶菌酶，37。C下保溫30 min，再加入5^iL RNA酶，37。C下保溫30 min，加入30pL 10%SDS (十二烷基硫酸鈉)和15^L蛋白酶K, 37。C下保溫60 min，加入100pL NaCl (5M)和80mLCTAB (十六烷基三甲基溴化銨)，65。C下保溫20 min，用 700(iL的酚氯仿異戊醇體積比25 : 24 : 1混合溶劑抽提，10000rpm離心， 上清液用700pL的氯仿異戊醇體積比24 : 1抽提，10000rpm離心，上清液用 1400nL體積的冰異戊醇混合，-2(TC沉淀30min， 10000rpm離心，沉淀加200pL 70%乙醇清洗，10000rpm離心，沉淀用Tris-EDTA緩沖液溶解，即得到/1 macerara JFB05-01總DNA。
(2) a-CGT酶編碼基因的克隆
以P wacerara JFB05-01總DNA為模版，以下列核苷酸序列作為引物，下
劃線為酶切位點7Vco I和￡coR I， PCR擴增cgf基因。
弓I物1: 5 ， -CCATATgTCCATggATTCACCCgATACgAgC - 3'
引物2: 5 ， -CTCgAgAgAATTCggATTTTgCCAgTCCAC 一 3 ，
pcr反應(yīng)在50pL體系中進行5xPCR緩沖液10 mL， 2.5 mmol/L dNTPs 4
^L， lOpmol/L上下游引物各lpL，模板DNAlpL， Taq酶0.5 (iL，加雙蒸水
至總體系50pL;
反應(yīng)條件為在94 'C變性4min后開始循環(huán)，然后94 'C變性lmin， 55 °C 退火lmin， 72。C延伸2min，共35個循環(huán)后，再于72 T延伸10min，擴增得到 2061 bp的PCR片段，割膠回收，回收片斷與pMD18-T simple載體連接，連接 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含100 mg/L氨芐青霉素的LB平板， 經(jīng)37"C培養(yǎng)過夜，挑選菌落，接入LB液體培養(yǎng)基，8 10h后提取質(zhì)粒。命名 為cg/pMD18-Tsimple,將此質(zhì)粒進行序列測定。
(3) c^基因的改造
以c^/pMD18-T simple為模板進行定點突變PCR，以消除基因內(nèi)部的臉o I 位點，設(shè)計引物
引物3: 5 ， -C認gTgggTCCCAC認g四CCAgCC - 3 ， 弓I物4: 5 ， —ggCTggCCCATJg!gggACCCACATTg — 3'PCR反應(yīng)在50^L體系中進行，5xPCR緩沖液10 fxL， 2.5 mmol/L dNTPs 4 ^L， 10 pmol/L上下游引物各1 nL，模板cgf/pMD18-T simple 1 (iL，Taq酶0.5 (iL， 加雙蒸水至總體系50pL;
反應(yīng)條件為在94 'C變性4min后開始循環(huán)，然后94 'C變性lmin， 55 "C退 火lmin， 72 "C延伸5min，共35個循環(huán)后，再于72 t:延伸10min，將PCR產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化E.co// JM109感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化后的菌體涂布100 mg/L氨節(jié)青霉素LB 平板，培養(yǎng)挑選單菌落接入100mg/L氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基，經(jīng)37'C培養(yǎng) 過夜，抽提質(zhì)粒，將突變后的質(zhì)粒進行序列測定。
(4) cg基因在表達載體上的構(gòu)建 用于構(gòu)建表達載體的質(zhì)粒是pET20b(+)，帶有評/B信號肽和His-tag標(biāo)記，
將pET20b(+)質(zhì)粒和擴增的基因進行iVco I和五coR I雙酶切，酶切產(chǎn)物割膠 回收后，再用T4連接酶16。C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化五.co/z'JM109感受態(tài)細胞， 經(jīng)37'C培養(yǎng)過夜，挑選轉(zhuǎn)化子于100mg/L氨芐青霉素LB進行液體培養(yǎng)，然后 抽提質(zhì)粒，得到富集的cg/pET20b(+)質(zhì)粒(圖l)。
(5) 大腸桿菌宿主轉(zhuǎn)化和篩選重組菌
將質(zhì)粒cgf/pET20b(+)熱擊轉(zhuǎn)化co//BL21 (DE3)宿主菌，再100 mg/L氨芐 青霉素-LB平板上經(jīng)37。C培養(yǎng)過夜，挑選含質(zhì)粒cgf/pET20b(+)的￡. co// BL21 (DE3)轉(zhuǎn)化子在LB培養(yǎng)基中37'C液體培養(yǎng)過夜，后接入TB發(fā)酵液體培養(yǎng)基(甘 油5g/L，蛋白胨12g/L,酵母膏24g/L， K2HP04 12.54 g/L， KH2P042.31 g/L)， 3(TC培養(yǎng)至OD達0.6后用終濃度O.Ol一IPTG (異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷)誘 導(dǎo)，降溫至25。C培養(yǎng)，90h時產(chǎn)a-CGT酶達22.5U/mL。
(6) 重組a-CGT酶的純化和特性。 將上述a-CGT酶發(fā)酵液于4 。C、 10000 rpm離心20min除菌體；上清液中
加入70%固體硫酸銨鹽析過夜，4 。C、 10000 rpm離心20min，取沉淀物用適量 含20mM磷酸鈉、0.5M氯化鈉、20mM咪唑、pH7.4的緩沖液A溶解，并在緩 沖液A中透析過夜后，通過0.22(im膜過濾后制成上樣樣品；Ni親和柱用緩沖液A 平衡后，將上樣樣品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分別用緩沖液A、含20-480mM 咪唑的緩沖液A、含480mM咪唑的緩沖液A洗脫，流速l mL/min，檢測波長為280 nm，分部收集含a-CGT酶酶活的洗脫液；活力組分在50 mM磷酸鈉緩沖液(p1^6) 中透析過夜后，得純化a-CGT酶酶制品。純化后重組a-CGT酶達到電泳純，表觀 分子量70000道爾頓。純化過程電泳圖見圖2。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了 基因的高效表達方法。提取P wacera"s JFB05-01總DNA，設(shè)計引物PCR得到編碼a-CGT酶的基因，它具有 SEQIDNO:l所示的核苷酸序列，全長2061個核苷酸，編碼687個氨基酸。以 質(zhì)粒pET20b(+)為表達載體，以五.co/ZBL21(DE3)為表達宿主，可實現(xiàn)cgf基因的高效表達，重組酶具有環(huán)化活性。該a-CGT酶的最適溫度為40~45°C，最適 pH5.5，在4(TC下具有較高的熱穩(wěn)定性，在5(TC以上熱穩(wěn)定性較差。此酶適合 食品、醫(yī)藥等工業(yè)應(yīng)用的需要，能用于a-環(huán)糊精和卩-環(huán)糊精的工業(yè)生產(chǎn)。 生物材料樣品保藏
軟化類芽孢桿菌CPeam'Z)a"7/w wacerara) JFB05-01已保藏于中國典型培養(yǎng) 物保藏中心，簡稱CCTCC，保藏日期2008年4月24日，保藏編號CCTCCNO: M 208063 。


圖1用于生產(chǎn)重組a-CGT酶的c^/pET20b(+)質(zhì)粒。
圖2重組a-CGT酶分離純化SDS-PAGE圖譜。
1、發(fā)酵上清液；M、標(biāo)準蛋白分子量；2、通過Ni柱純化后樣品。
圖3重組a-CGT酶最適溫度(以可溶性淀粉為底物)。
圖4重組a-CGT酶最適pH (以可溶性淀粉為底物)。
pH3-6，使用檸檬酸緩沖液；pH6-8，使用磷酸鈉緩沖液；pH8-11,使用甘 氨酸/氫氧化鈉緩沖液。
圖5重組a-CGT酶在40°C ( )， 45°C O)和50°C (A)下的穩(wěn)定性研究(以可 溶性淀粉為底物)。
具體實施例方式
實施例1
本實施例說明軟化類芽孢桿菌(尸eam'k cz7/w macerara) JFB05-01總DNA的提取。
wacerara JFB05-01菌株在LB液體培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L， NaCUOg/L)中培養(yǎng)2天，10000rpm離心收集菌體，無菌水洗滌，收集沉淀懸 浮于500nL Tris-EDTA (三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸)緩沖液，加入15pL 溶菌酶，37。C下保溫30 min，再加入5pLRNA酶，37匸下保溫30 min，加入30pL 10%SDS (十二烷基硫酸鈉)和15pL蛋白酶K， 37t:下保溫60min，加入lOO^L NaCl (5M)和80^iLCTAB (十六烷基三甲基溴化銨)，65。C下保溫20 min，用 700pL的酚氯仿異戊醇體積比25 : 24 : 1混合溶劑抽提，10000rpm離心， 上清液用700nL的氯仿異戊醇體積比24 : 1抽提，10000rpm離心，上清液用 1400nL體積的冰異戊醇混合，-20°(:沉淀301^11， 10000rpm離心，沉淀加200|iL 70%乙醇清洗，10000rpm離心，沉淀用Tris-EDTA緩沖液溶解，即為P JFB05-01總DNA。 實施例2
本實施例說明a-CGT酶編碼基因的克隆程序。
以P Amjrcerara JFB05-01總DNA為模版，以下列核苷酸序列作為引物，下劃線為酶切位點iVco I和￡coR I， PCR擴增eg基因。
引物1: 5 ， -CCATATgTCCATggATTCACCCgATACgAgC - 3 ， 引物2: 5 ， "CTCgAgAgMEIQggATTTTgCCAgTCCAC — 3 ，
PCR反應(yīng)在50^L體系中進行5xPCR緩沖液10 pL， 2.5 mmol/L dNTPs 4 pL，
10 (imol/L上下游引物各1 pL,模板DNA 1 (iL， Taq酶0.5 pL，加雙蒸水至總
體系50 ^L;
反應(yīng)條件為在94'C變性4min后開始循環(huán)，然后94'C變性lmin， 55 "C退 火lmin， 72'C延伸2min，共35個循環(huán)后，再于72 。C延伸10min。擴增得到大 約2100bp的PCR片段，割膠回收?；厥掌瑪嗯cpMD18-T simple載體連接，連 接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含100 mg/L氨節(jié)青霉素的LB平板。 經(jīng)37。C培養(yǎng)過夜，平板上長了大約十幾個菌落，挑四個菌落，接入LB液體培 養(yǎng)基，10h后提取質(zhì)粒。將此質(zhì)粒進行序列測定，結(jié)果表明插入片段含有一個 長2061bp的開放閱讀框(ORF)，編碼一個由687個氨基酸編碼的蛋白質(zhì)。
實施例3
本實施例說明c^基因的改造程序。
由于在目標(biāo)基因內(nèi)部存在一個^co I酶切位點，而基因兩端分別為iVco I和 五"RI位點，所以設(shè)計引物將iVcoI位點突變?nèi)コ?，以方便下步的克隆表達。 以連接了 c^基因的pMD18-T simple載體為模板進行定點突變PCR，設(shè)計引物
引物3: 5 ， ~CAATgTgggTCCCAQAATgggCCAgCC _ 3 ，
弓l物4: 5,-ggCTggCCCATIglgggACCCACATTg- 3'
PCR反應(yīng)在50nL體系中進行，5xPCR緩沖液10|iL， 2.5 mmol/L dNTPs 4 HL， 10 pmol/L上下游引物各1 &，模板cg/pMD18-T simple 1 |iL，Taq酶0.5 jiL， 加雙蒸水至總體系50piL;
反應(yīng)條件為在94。C變性4min后開始循環(huán)，然后94 。C變性lmin， 55 。C退 火lmin， 72。C延伸4min，共35個循環(huán)后，再于72"C延伸10min。將PCR產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化Eco// JM109感受態(tài)細胞。轉(zhuǎn)化后的菌體涂布100 mg/L氨芐青霉素LB 平板，挑選單菌落接入100 mg/L氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基經(jīng)37"C過夜培養(yǎng)， 抽提質(zhì)粒，將突變后的質(zhì)粒進行序列測定，結(jié)果正確，驗證了已經(jīng)成功突變?nèi)?除WcoI位點。
實施例4
本實施例說明cg基因在表達載體上的構(gòu)建程序。
用于構(gòu)建表達載體的質(zhì)粒是pET20b(+)，帶有pe氾信號肽和His-tag標(biāo)記。 將pET20b(+)質(zhì)粒和cg 基因進行AAco I和&oR I雙酶切，酶切產(chǎn)物割膠回收后， 再用T4連接酶16。C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，經(jīng)37 'C培養(yǎng)過夜，挑選轉(zhuǎn)化子于100mg/L氨芐青霉素LB進行液體培養(yǎng)，然后抽提質(zhì)粒，得到富集的c^/pET20b(+)質(zhì)粒(圖l)。 實施例5
本實施例說明大腸桿菌宿主轉(zhuǎn)化和篩選重組菌的程序。
將質(zhì)粒cg/pET20b(+)熱擊轉(zhuǎn)化co// BL21 (DE3)宿主菌，再氨芐青霉素 (100 mg/L)-LB平板上經(jīng)37。C培養(yǎng)過夜，挑選轉(zhuǎn)化子(含c^/pET20b(+)的五.co// BL21 (DE3))在LB培養(yǎng)基中37'C液體培養(yǎng)過夜，后接入TB發(fā)酵液體培養(yǎng)基(甘 油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L, K2HP04 12.54 g/L， KH2P042.31 g/L) 30。C培養(yǎng)至OD達0.6后用終濃度0.01 ^MIPTG (異丙基硫代-P-D-半乳糖苷) 誘導(dǎo)，降溫至25-C培養(yǎng)，90h時產(chǎn)酶達22.5U/mL。
實施例6
本實施例說明a-CGT酶的純化和特性。
將上述a-CGT酶發(fā)酵液于4 'C、 10000 rpm離心20 min除菌體；上清液中 加入70%固體硫酸銨鹽析過夜，4 °C、 10000 rpm離心20min,取沉淀物用適量 含20mM磷酸鈉、0.5M氯化鈉、20mM咪唑、pH 7.4的緩沖液A溶解，并在緩 沖液A中透析過夜后，通過0.22pim膜過濾后制成上樣樣品；Ni親和柱用緩沖液A 平衡后，將上樣樣品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分別用緩沖液A、含20-480mM 咪唑的緩沖液A、含480mM咪唑的緩沖液A洗脫，流速l mL/min，檢測波長為280 nm，分部收集含a-CGT酶酶活的洗脫液；活力組分在50 mM磷酸鈉緩沖液(p1^6) 中透析過夜后，得純化a-CGT酶酶制品。純化后重組a-CGT酶達到電泳純，表觀 分子量70000道爾頓。純化過程電泳圖見圖2。
以可溶性淀粉為底物時，a-CGT酶的最適溫度為40 45'C (圖3)，最適pH 5.5 (圖4),在4(TC下具有較高的熱穩(wěn)定性，在50°C以上熱穩(wěn)定性較差(圖5)。序歹寸表
SEQIDNO: 1
tcacccgatacgagcgtggacaacaaggtc￡L￡LtttC￡Lgta<cggacgtcatctatcaigatt60
gtgaccgaccgcttcgcggacggggacaggacgaacaatccggcgggggatgcgttcagc120
ggcgaccgatcc犯tttgaagctctatttcggggg卿ctggcaggggattatcgacaag180
attaacgacggttatttgaccggcatgggcgtcaccgccctctggatatcccagcctgtg240
gaa犯t8tcEicctccgtcatcaagtattccggcgtt已已caatacgtcttatcacggttac300
tgggcgagggattttaagcagctttcggggattttgccgattttcaaaat360
ctgattgatacggctcacgctC3t犯C3tC卿gtcgtg已tcgacttcgcCCCC38CCEIC420
acgtctccggccgacagggacaaccccggcttcgccgagaacggtgcgctgtstgataac480
ggttcgctgctcggcgcctacagcaalgatacggccggccttttccatcataacgggggg540
accgatttttccacgattga3gacggtatttaca^gaacctctacgacctggcggacatc600
aaccataacaac犯cgctatggacgcttatttt犯a3gcgctatcgacctttggctcggc660
atgggtgtggacgggattcgttttgacgcggtg犯gcatatgcctttcggctggcaaaaa720
agcttcgtttcctcgatttacggcggcgatcatccggtatttacgttcggggaatggtat780
cttggcgcggatcaaaccga3tt犯attcgccaacgaaagcgggatgaac840
ctgctggactttgaatacgcgc已gg鄉(xiāng)tgcgcgaagtgttccgggacaaaacggaaeicg900
atgaaggatctctatgaggtgctggccagcacggagtcgcaatacgactscatcaacaat960
stggtgaccttcatcgscaaccatgatatggaccggttccaggttgccggttccggtacg1020
cgggcgaccgagcaagcgttggcgctgacgctgacttcccgcggcgtgccagccatctac1080
t￡lCggC3Cgg￡LgC￡LgtELC3tgaccggcgstggcgacccca3caaccgggcg3tg3tg3CC1140
tcgtttaataccgggacgacggctt3ta^gtgattcaggcattggcgccgctgcgtaaa1200
tccaatccggccatcgcttatgggacgacgacagagcgctgggttaacaacgatgtgttg1260
eittgittg^cgC肪3ttCggcagcagcgccgctttggtggcgattaatcgaaactcgtcc1320
gccgcttatccgatttcgggtctgttgagttcgctgccggcgggcacttattcggatgta1380
ttgaacggactctt犯eicggc已actccattaccgtgggcagcggcggcgccgtcaccaac1440
tttacgctggcggccggcggcacggcggtatggcagtacacagcgccggaaacgtcgccg1500
gcgatcggca3tgtgggtCCcaccatgggccagccggggaatateigtgacgattgacggc1560
cgcggctttggcggcacggcgggcacggtttatttcgggacgacggcggtgaccggctcc1620
ggcatcgtaagctgggaggacacgcagatt33ggCggtC3t3CCg33ggtcgcggcgggc1680
aa,gggcgtatcggtcaaaacgtcgtccggcaccgccagcaatacattcaaaagcttc1740
aatgtactgacgggggatcaggtcacggtgcgtttcctggtcaatcaagccaataccaat1800
tacggaacaaatgtttatcttgtcggcaacgccgccgagctcggctcctgggacccgaac1860
aaagcgattgggccgatgtacaatcaggtgatcgccaagtacccgtcctggtattacgat1920gtcagcgtgc cggcggggac aaagctggat gtgacttggg aaggcggggg caaccatacg gtgacggtgg actggcaaaa t
tttaaattta ttaaaaaggg cggcggtacg 1980 tacacgacgc cggccagcgg cgtagggacg 2040
2061
SEQ ID NO: 2
Ser Pro Asp Thr Ser 5
Val lie Tyr Gin lie 20
Thr Asn Asn Pro Ala 35
Leu Lys Leu Tyr Phe 50
lie Asn Asp Gly Tyr 65
lie Ser Gin Pro Val 80
Gly Val Asn Asn Thr 95
L>ys Gin Thr Asn Asp 110
Leu lie Asp Thr Ala 125
Phe Ala Pro Asn His 140
Phe Ala Glu Asn Gly 155
Ala Tyr Ser Asn Asp 170
Thr Asp Phe Ser Thr 185
Asp Leu Ala Asp lie 200
Phe Lys Ser Ala lie 215
Val Asp Asn Lys Val 10
Val Thr Asp Arg Phe 25
Gly Asp Ala Phe Ser 40
Gly Gly Asp Trp Gin 55
Leu Thr Gly Met Gly 70
Glu Asn lie Thr Ser 85
Ser Tyr His Gly Tyr 100
Ala Phe Gly Asp Phe 115
His Ala His Asn lie 130
Thr Ser Pro Ala Asp 145
Ala Leu Tyr Asp Asn 160
Thr Ala Gly Leu Phe 175
lie Glu Asp Gly lie 190
Asn His Asn Asn Asn 205
Asp. Leu Trp Leu Gly 220
Asn Phe Ser Thr Asp 15
Ala Asp Gly Asp Arg 30
Gly Asp Arg Ser Asn 45
Gly lie lie Asp Lys 60
Val Thr Ala Leu Trp 75
Val lie Lys Tyr Ser 90
Trp Ala Arg Asp Phe 105
Ala Asp Phe Gin Asn 120
Lys Val Val lie Asp 135
Arg Asp Asn Pro Gly 150
Gly Ser Leu Leu Gly 165
His His Asn Gly Gly 180
Tyr Lys Asn Leu Tyr 195
Ala Met Asp Ala Tyr 210
Met Gly Val Asp Gly 225
12lie Arg Phe Asp Ala 230Ser Phe Val Ser Ser 245Phe Gly Glu Trp Tyr 260lie Lys Phe Ala Asn 275Tyr Ala Gin Glu Val 290Met Lys Asp Leu Tyr 305Asp Tyr lie Asn Asn 320Asp Arg Phe Gin Val 335Ala Leu Ala Leu Thr 350Tyr Gly Thr Glu Gin 365Arg Ala Met Met Thr 380Val lie Gin Ala Leu 395Ala Tyr Gly Thr Thr 410lie lie Glu Arg Lys 425Asn Arg Asn Ser Ser 440Ser Leu Pro Ala Gly 455Asn Gly Asn Ser lie 470Val Lys His Met Pro 235lie Tyr Gly Gly Asp 250Leu Gly Ala Asp Gin 265Glu Ser Gly Met Asn 280Arg Glu Val Phe Arg 295Glu Val Leu Ala Ser 310Met Val Thr Phe lie 325Ala Gly Ser Gly Thr 340Leu Thr Ser Arg Gly 355Tyr Met Thr Gly Asp 370Ser Phe Asn Thr Gly 385Ala Pro Leu Arg Lys 400Thr Glu Arg Trp Val 415Phe Gly Ser Ser Ala 430Ala Ala Tyr Pro lie 445Thr Tyr Ser Asp Val 460Thr Val Gly Ser Gly 475Phe Gly Trp Gin Lys 240His Pro Val Phe Thr 255Thr Asp Gly Asp Asn 270Leu Leu Asp Phe Glu 285Asp Lys Thr Glu Thr 300Thr Glu Ser Gin Tyr 315Asp Asn His Asp Met 330Arg Ala Thr Glu Gin 345Val Pro Ala lie Tyr 360Gly Asp Pro Asn Asn 375Thr Thr Ala Tyr Lys 390Ser Asn Pro Ala lie 405Asn Asn Asp Val Leu 420Ala Leu Val Ala lie 435Ser Gly Leu Leu Ser 450Leu Asn Gly Leu Leu 465Gly Ala Val Thr Asn 480Phe Thr Leu Ala Ala 485Pro Glu Thr Ser Pro 500Gin Pro Gly Asn lie 515Thr Ala Gly Thr Val 530Gly lie Val Ser Trp 545Lys Val Ala Ala Gly 560Gly Thr Ala Ser Asn 575Asp Gin Val Thr Val 590Tyr Gly Thr Asn Val 605Ser Trp Asp Pro Asn 620lie Ala Lys Tyr Pro 635Gly Thr Lys Leu Asp 650Val Thr Trp Glu Gly 665Ser Gly Val Gly Thr 680Gly Gly Thr Ala Val 490Ala lie Gly Asn Val 505Val Thr lie Asp Gly 520Tyr Phe Gly Thr Thr 535Glu Asp Thr Gin lie 550Lys Thr Gly Val Ser 565Thr Phe Lys Ser Phe 580Arg Phe Leu Val Asn 695Tyr Leu Val Gly Asn 610Lys Ala lie Gly Pro 625Ser Trp Tyr Tyr Asp 640Phe Lys Phe lie Lys 655Gly Gly Asn His Thr 670Val Thr Val Asp Trp 685Trp Gin Tyr Thr Ala 495Gly Pro Thr Met Gly 510Arg Gly Phe Gly Gly 525Ala Val Thr Gly Ser 540Lys Ala Val lie Pro 555Val Lys Thr Ser Ser 570Asn Val Leu Thr Gly 585Gin Ala Asn Thr Asn 600Ala Ala Glu Leu Gly 615Met 'Tyr Asn Gin Val 630Val Ser Val Pro Ala 645Lys Gly Gly Gly Thr 660Tyr Thr Thr Pro Ala 675Gin Asn 68權(quán)利要求
1. 一種α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，縮寫為α-CGT酶，其氨基酸序列如SEQID NO2所示。
2、 一種編碼權(quán)利要求1所述的a-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的基因，縮寫為 基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示。
3、 一種如權(quán)利要求2所述的a-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達方法，其 特征是由軟化類芽孢桿菌CPeam'6acz'〃w macerara) JFB05-01總DNA獲得c^基 因SEQ ID NO: 1 ， 基因以質(zhì)粒pET20b(+)為表達載體，以co// BL21 (DE3) 為表達宿主，實現(xiàn)c^基因的高效表達；(1) 軟化類芽孢桿菌CPeam'6a"7/w w"cerara) JFB05-01總DNA的提取尸macera似JFB05-01菌株在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天，10000rpm離心收 集菌體，無菌水洗滌，收集沉淀懸浮于50(HiLTris-EDTA緩沖液，加入15pL溶 菌酶，37。C下保溫30min，再加入5^iLRNA酶，37。C下保溫30 min，加入30pL 10%十二垸基硫酸鈉溶液和15i!L蛋白酶K,37-C下保溫60min，加入100pL5M 的NaCl溶液和80^L十六烷基三甲基溴化銨，65'C下保溫20 min，用700pL的 酚氯仿異戊醇體積比25 : 24 : 1混合溶劑抽提，10000rpm離心，上清液用 700pL的氯仿異戊醇體積比24 : 1混合溶劑抽提，10000rpm離心，上清液用 1400pL體積的冰異戊醇混合，-20°(:沉淀301^11， 10000rpm離心，沉淀加200(iL 70%乙醇清洗，10000rpm離心，沉淀用Tris-EDTA緩沖液溶解，即得到P wacerara JFB05-01總DNA;(2) a-CGT酶編碼基因的克隆以P macerara JFB05-01總DNA為模版，以下列核苷酸序列作為引物，下劃線為酶切位點7Vco I和五coR I， PCR擴增cg基因；引物1: 5 ， -CCATATgTCCATggATTCACCCgATACgAgC — 3 ，引物2: 5 ， "CTCgAgAgMIICggATTTTgCCAgTCCAC - 3 ，PCR反應(yīng)在50^L體系中進行5xPCR緩沖液10 pL， 2.5 mmol/L dNTPs 4HL， 10 ^irnol/L上下游引物各1 ^L，模板DNA 1 ^L， Taq酶0.5 pL，加雙蒸水至總體系50 ^L;反應(yīng)條件為在94。C變性4min后開始循環(huán)，然后94 。C變性lmin， 55 °C 退火lmin， 72T:延伸2min,共35個循環(huán)后，再于72'C延伸10min，擴增得到 2061 bp的PCR片段，割膠回收，回收片斷與pMD18-T simple載體連接，連接 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含100 mg/L氨芐青霉素的LB平板， 經(jīng)37'C培養(yǎng)過夜，挑選菌落，接入LB液體培養(yǎng)基，8 10h后提取質(zhì)粒，命名 為cg/pMD18-T simple,將此質(zhì)粒進行序列測定；(3) C^基因的改造以cg/pMD18-T simple為模板進行定點突變PCR，以消除基因內(nèi)部的7Vco I位點，設(shè)計引物引物3: 5，—CAATgTgggTCCCACAATgggCCAgCC —3，弓l物4: 5， -ggCTggCCCATIglgggACCCACATTg- 3'PCR反應(yīng)在50nL體系中進行，5xPCR緩沖液10 pL， 2.5 mmol/L dNTPs 4 ^iL， 10 )imol/L上下游引物各1〖iL，模板cgf/pMD18-T simple 1 |iL，Taq酶0.5 )iL， 加雙蒸水至總體系50 ^L;反應(yīng)條件為在94 。C變性4min后開始循環(huán)，然后94 。C變性lmin， 55 'C退 火lmin， 72 。C延伸5min，共35個循環(huán)后，再于72 。C延伸10min，將PCR產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化五.co" JM109感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化后的菌體涂布100 mg/L氨芐青霉素LB 平板，培養(yǎng)挑選單菌落接入100mg/L氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基，經(jīng)37i:培養(yǎng) 過夜，抽提質(zhì)粒，將突變后的質(zhì)粒進行序列測定；(4) c-基因在表達載體上的構(gòu)建 用于構(gòu)建表達載體的質(zhì)粒是pET20b(+)，帶有pe/B信號肽和His-tag標(biāo)記，將pET20b(+)質(zhì)粒和擴增的基因進行7Vco I和￡coR I雙酶切，酶切產(chǎn)物割膠 回收后，再用T4連接酶16"C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化五.co//JM109感受態(tài)細胞， 經(jīng)37'C培養(yǎng)過夜，挑選轉(zhuǎn)化子于100mg/L氨芐青霉素LB進行液體培養(yǎng)，然后 抽提質(zhì)粒，得到富集的cg/pET20b(+)質(zhì)粒；(5) 大腸桿菌宿主轉(zhuǎn)化和篩選重組菌將質(zhì)粒cg/pET20b(+)熱擊轉(zhuǎn)化￡. co// BL21 (DE3)宿主菌，再100 mg/L氨芐 青霉素-LB平板上經(jīng)37。C培養(yǎng)過夜，挑選含質(zhì)粒crg/pET20b(+)的co// BL21 (DE3)轉(zhuǎn)化子在LB培養(yǎng)基中37'C液體培養(yǎng)過夜，后接入TB發(fā)酵液體培養(yǎng)基， 3CTC培養(yǎng)至OD達0.6后用終濃度0.01 異丙基硫代-P-D-半乳糖苷誘導(dǎo)，降溫 至25。C培養(yǎng)，90h時產(chǎn)a-CGT酶達22.5 U/mL;(6) 重組a-CGT酶的純化和特性 將上述a-CGT酶發(fā)酵液于4。C、 10000 rpm離心20min除菌體；上清液中加入70%固體硫酸銨鹽析過夜，4'C、 10000 rpm離心20min，取沉淀物用適量 含20mM磷酸鈉、0.5M氯化鈉、20mM咪唑、pH 7.4的緩沖液A溶解，并在 緩沖液A中透析過夜后，通過0.22pm膜過濾后制成上樣樣品；Ni親和柱用緩 沖液A平衡后，將上樣樣品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分別用緩沖液A、含 20-480 mM咪唑的緩沖液A、含480mM咪唑的緩沖液A洗脫，流速1 mL/ min， 檢測波長為280 nm，分部收集含a-CGT酶酶活的洗脫液；活力組分在pH-6、 50 mM磷酸鈉緩沖液中透析過夜后，得純化a-CGT酶酶制品。
全文摘要
一種α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(簡稱α-CGT酶)基因的克隆與表達，屬于酶基因工程和酶工程領(lǐng)域。本發(fā)明由軟化類芽孢桿菌(Peanibacillus macerans)JFB05-01總DNA獲得cgt基因SEQ ID NO1，cgt基因以質(zhì)粒pET20b(+)為表達載體，以E.coli BL21(DE3)為表達宿主，實現(xiàn)cgt基因在胞外的高效表達；該cgt基因全長2061個核苷酸，編碼687個氨基酸，構(gòu)建了原核表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達α-CGT酶。重組酶具有環(huán)化活性，能轉(zhuǎn)化淀粉及相關(guān)基質(zhì)成環(huán)糊精。該重組α-CGT酶的最適溫度為40～45℃，最適pH 5.5，在40℃下具有較高的熱穩(wěn)定性，在50℃以上熱穩(wěn)定性較差。此酶適合食品、醫(yī)藥等工業(yè)應(yīng)用的需要，能用于α-環(huán)糊精和β-環(huán)糊精的工業(yè)生產(chǎn)。
文檔編號C12N9/10GK101294149SQ20081002416
公開日2008年10月29日 申請日期2008年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月14日
發(fā)明者敬 吳, 成 成, 彬 李, 李兆豐, 堅 陳 申請人:江南大學(xué)