專利名稱：發(fā)酵法生產(chǎn)多肽類抗生素安來霉素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種發(fā)酵法生產(chǎn)多肽類抗生素安來霉素的方法， 屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)、工業(yè)生物技術(shù)、發(fā)酵工程領(lǐng)域。
技術(shù)背景抗生素添加于飼料中用以促進畜禽生長發(fā)育和提高飼料報導已有近60年的歷史，許多國家都長期應(yīng)用抗生素添加劑。然而，伴隨 著抗生素類促生長劑的廣泛使用， 一系列問題也逐漸顯露，主要是藥 物殘留和耐藥性問題。長期、廣泛、不加選擇地使用抗生素飼料給細 菌性疾病的控制和治療帶來了極大的麻煩和困難，同時也給人類的健 康帶來潛在的威脅。目前雖然關(guān)于是否應(yīng)該在飼料中使用抗生素存在 眾多的爭議，但實踐證明，合理地使用抗生素添加劑能促進畜禽生長， 提高飼料轉(zhuǎn)化率。同時也有報告顯示，禁止在詞料中添加抗生素或其 他抗菌促生長劑的國家會造成畜牧業(yè)生產(chǎn)成本增加、盈利減少，同時 也有可能引發(fā)諸如生態(tài)環(huán)境及國家之間的貿(mào)易戰(zhàn)等問題。事實上，抗 生素添加劑仍在大量使用，只有對它們進行全面的認識及合理的應(yīng) 用，才能充分發(fā)揮其有利作用，并避免對人類健康造成危害。當務(wù)之 急便是針對微生物的耐藥性，研究和開發(fā)廣譜、高效、安全的新型飼 料添加劑，這不僅能帶來顯著的經(jīng)濟效益，還具有極其重要的社會意 義。安來霉素(Enramycin)，是一種廣譜、高效、安全的新型飼料添 加劑。它又名恩來霉素、恩霉素、持久霉素，是由鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的 一種多肽類抗生素。作為一種全新的飼料專用添加劑，具有以下特點 ①飼料中添加微量的安來霉素就能促進對畜禽的增重。②具有對革蘭 氏陽性菌的強烈的抗微生物活性，特別能夠大力抑制腸內(nèi)的有害菌 (梭菌)。③由于不吸收性,只在消化管內(nèi)發(fā)揮其效果，不會殘留于畜禽 體內(nèi)。④與臨床上現(xiàn)有的抗生素或抗菌藥之間不存在交叉耐藥性。敏 感菌幾乎不對安來霉素產(chǎn)生耐藥性，在實驗條件下，耐藥性的產(chǎn)生也 非常緩慢，即使出現(xiàn)，耐藥性也不穩(wěn)定，而且極易丟失。因此長期續(xù)用 時，其效果也不會受到任何影響。⑤在飼料中有良好的穩(wěn)定性。此外， 安來霉素對乙肝病毒(HBV)抗原和乙肝e抗原(HBeAg)也有較好的抑制 效果。正因為有如此多的優(yōu)點，安來霉素已經(jīng)成為抗菌促生長飼料添 加劑的一線產(chǎn)品。專家預(yù)測，作為一種動物專用抗生素，安來霉素還會在相當長的時間內(nèi)充當促生長劑的主角，因為它既可以滿足人們對安全性的要求，又可顯著降低動物產(chǎn)品成本。但目前安來霉素工藝過程復雜，發(fā) 酵時間長，生產(chǎn)成本高，單位效價低。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對上述不足之處，篩選了一株安來霉素生 產(chǎn)菌，并提供一種發(fā)酵法生產(chǎn)多肽類抗生素安來霉素的方法，根據(jù) 菌株生長代謝過程中對氧需求量的不同，進行分階段控制溶氧，這是 一個有氧、微氧等多階段集成發(fā)酵，并采用流加碳源的方法，實現(xiàn)了安來霉素生產(chǎn)菌鏈霉菌的高密度培養(yǎng)。本發(fā)明發(fā)酵法生產(chǎn)多肽類抗生素安來霉素的方法工藝過程簡單，生產(chǎn)成本低，單位體積發(fā)酵液中 安來霉素效價高。本發(fā)明發(fā)酵法生產(chǎn)多肽類抗生素安來霉素的方法中采用鏈霉菌分re/ to/^ca5 sp. NJWGY3665，該菌在起始低葡萄糖濃度(1%)發(fā) 酵、生產(chǎn)過程中通過流加葡萄糖等營養(yǎng)物質(zhì)，并根據(jù)發(fā)酵不同階段對 溶氧的需求差異的情況下實現(xiàn)了高效率的發(fā)酵，單位體積發(fā)酵液中安 來霉素效價達6100ug/mL。鏈霉菌^r印^忍7c" sp. NJWGY3665菌株是從南京工業(yè)大學江 浦校區(qū)土壤中分離得到。目前該鏈霉菌菌種保藏在中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心，本保藏中心登記入冊編號是CGMCC NO. 2410,分類命名鏈霉菌，菌種的拉丁學名是6Yrepto/z^ces sp.， 參據(jù)的微生物(株)NJWGY3665，保藏日期是2008年3月21日。發(fā)酵法生產(chǎn)多肽類抗生素安來霉素的方法是采取以下方式實現(xiàn)發(fā)酵法生產(chǎn)多肽類抗生素安來霉素的方法為1、 斜面培養(yǎng)將鏈霉菌6Yr印toT yces sp. NJWGY3665菌種接到 葡萄糖營養(yǎng)培養(yǎng)基中，進行斜面培養(yǎng)，葡萄糖營養(yǎng)培養(yǎng)基的重量百分 配比為葡萄糖0. 5 1%、牛肉膏0. 5 1%、蛋白胨0. 5 l%、NaC10. 3 0. 5%或K2HP04 0. 1 0. 2%、瓊脂1.5 2%、水余量，pH 6.0 -9.0， 培養(yǎng)溫度28-37°C ，培養(yǎng)時間2天-6天；2、 種子培養(yǎng)用無菌水將斜面上培養(yǎng)的孢子制成單孢子懸液，并 接種到50 ml種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，種子培養(yǎng)基的重量百分配比為葡糖1 3. 0%、玉米漿1 3%、 CaC03l 2%、酵母粉0. 5%、 NaClO. l 0.8%、水余量，pH為6.0-9.0，溫度為28 32。C，轉(zhuǎn)速為200rpm， 培養(yǎng)2天-6天；3、發(fā)酵培養(yǎng)將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基的 重量百分配比為葡萄糖2. 0-5. 0%、淀粉0. 5-2. 0%、玉米漿0. 5-3. 0%、 酵母膏O. 1 0. 5%、黃豆餅粉0. 5 2% 、NaC10. 5-1.0%、 CaC03 l 2%、 NH4C1 0. 5%、磷酸二氫鉀0. 2%、硫酸銨0. 3%、水余量，溫度 控制在28-37。C， pH控制在6. 0-9. 0，轉(zhuǎn)速180-220rpm，發(fā)酵5-9天， 得到鏈霉菌5^r印t，yces sp. NJWGY3665，采用離心分離的方法將 菌絲體用甲醇或乙醇進行提取分離，再采用離子交換樹脂方法進行精 制分離，獲得多肽類抗生素安來霉素。采用HPLC進行定量分析，可以得知樣品中安來霉素的濃度。單 位體積發(fā)酵液中安來霉素為3630嗎/ml 6630嗎/ml。鏈霉菌S^/7tomycas sp. NJWGY3665在葡萄糖營養(yǎng)瓊脂平板上 培養(yǎng)后，大量的無色的營養(yǎng)菌絲體平鋪于培養(yǎng)基表面，氣生菌絲呈現(xiàn) 白色至微灰色。本發(fā)明發(fā)酵法生產(chǎn)多肽類抗生素安來霉素的方法中采用鏈霉 菌5Yreptoffl/ces sp. NJWGY3665，該菌在實現(xiàn)了高效率的轉(zhuǎn)化，安 來霉素產(chǎn)率為6630ii g/mL。鏈霉菌S^e/^o/^ce5" sp. NJWGY3665菌 株是經(jīng)自主篩選分離到的一株產(chǎn)抗菌物質(zhì)的菌株，其發(fā)酵產(chǎn)物安來霉 素具有強烈的抗微生物活性，且敏感菌幾乎不對安來霉素產(chǎn)生耐藥 性。本發(fā)明發(fā)酵法生產(chǎn)多肽類抗生素安來霉素的方法工藝過程簡單，生產(chǎn)成本低，單位效價高。本發(fā)明發(fā)酵法生產(chǎn)多肽類抗生素安來霉素的方法生產(chǎn)的多肽類 抗生素安來霉素可以作為一種廣譜、高效、安全的新型飼料添加劑。
具體實施方式
實施例1-將鏈霉菌6Yrepto/^ce5" sp. NJWGY3665菌種接到葡萄糖0. 5%， 牛肉膏O. 5%，蛋白胨O. 5%， NaClO. 5%，瓊脂1. 5%、水96. 5%， p朋.0 的葡萄糖營養(yǎng)培養(yǎng)基中，進行斜面培養(yǎng)，在28"C下培養(yǎng)2天。取斜 面菌種，加入2-3ml無菌水(每18X180mm的試管斜面菌種)，用接種 環(huán)輕輕將菌苔洗下，制成孢子懸液，取0. 5ml孢子懸液接種到含40ml 葡萄糖1.0%，玉米漿3%， CaC03l%、酵母膏0.5%、 NaClO. 1%、水 94.4%， pH7.0的液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天，培養(yǎng)溫度為28'C，轉(zhuǎn) 速為200rpm。再將5ml種子液接入到裝液量為100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的 500ml搖瓶中，在28°C， 180rpm， p朋.0的條件下?lián)u床發(fā)酵培養(yǎng)5天， 得到鏈霉菌5"^印to/^c" sp. NJWGY3665，采用離心分離的方法將 菌絲體用甲醇或乙醇進行提取分離，再采用離子交換樹脂方法進行精 制分離，獲得多肽類抗生素安來霉素。采用HPLC進行定量分析，可以得知樣品中安來霉素的濃度。單 位體積發(fā)酵液中安來霉素為363(^g/ml。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的配比為葡萄糖4. 0%，淀粉2. 0%，玉米漿2. 0%、 酵母膏0.1%、黃豆餅粉2% 、 NaCl 0. 5%、 CaC03 1. 5%、 NH4C1 0. 5%、 磷酸二氫鉀O. 2%、硫酸銨O. 3%、水86i鏈霉菌及w/ towjcay sp. NJWGY3665在葡萄糖營養(yǎng)瓊脂平板上 培養(yǎng)后，大量的無色的營養(yǎng)菌絲體平鋪于培養(yǎng)基表面，氣生菌絲呈現(xiàn) 白色至微灰色。 實施例2:將鏈霉菌5Yr印to/^ces sp. NJ￥GY3665菌種接到葡萄糖0. 5%， 牛肉膏O. 8%、蛋白胨0.8%、 K2HP040. 1%、瓊脂1.8%、水96%， pH7. 0 的葡萄糖營養(yǎng)培養(yǎng)基中，進行斜面培養(yǎng)，在37t:下培養(yǎng)3天。取斜 面菌種，加入2-3ml無菌水(每18X 180mm的試管斜面菌種)，用接種 環(huán)輕輕將菌苔洗下，制成孢子懸液，取0. 5ml孢子懸液接種到孢子懸 液接種到含40ml葡萄糖2. 0%、玉米漿2. 0%、 CaC03l. 5%、酵母粉0. 5 %、 NaClO. 5%、水93. 5%, pH7. 0的液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天，培 養(yǎng)溫度為3(TC，轉(zhuǎn)速為200rpm。再將10ml種子液接入到裝液量為 100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，在32。C， 220rpm， pH7. 0的條件 下?lián)u床發(fā)酵培養(yǎng)6天，得到鏈霉菌5Yre/^咖yces sp. NJWGY3665， 采用離心分離的方法將菌絲體，用乙醇進行提取分離，再采用離子交 換樹脂方法進行精制分離，獲得多肽類抗生素安來霉素。采用HPLC進行定量分析，可以得知樣品中安來霉素的濃度。單 位體積發(fā)酵液中安來霉素為4630pg/ml。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的配比為葡萄糖2.0%，淀粉1.5%，玉米漿 0.5%、酵母膏0.3%、黃豆餅粉1.5% 、 NaCl 0.8%、 CaC03 1.5%、 NH4C1 0. 5%、磷酸二氫鉀0. 2%、硫酸銨0. 3%、水90. 9%。鏈霉菌及 ;7towycay sp. NJWGY3665在葡萄糖營養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)后，大量的無色的營養(yǎng)菌絲體平鋪于培養(yǎng)基表面，氣生菌絲呈現(xiàn)白 色至微灰色。采用肉湯培養(yǎng)基將鏈霉菌分7^^，7C" sp. NJWGY3665菌種接 到葡萄糖1%，牛肉膏1%，蛋白胨1%， NaClO. 5%，瓊脂2%、水94.5%， pH9.0的葡萄糖營養(yǎng)培養(yǎng)基中，進行斜面培養(yǎng)，在32"C下培養(yǎng)5天。 取斜面菌種，加入2-3ml無菌水(每18X180mm的試管斜面菌種)，用 接種環(huán)輕輕將菌苔洗下，制成孢子懸液，取lml孢子懸液接種到含 50ml葡萄糖3. 0%，玉米漿1%， CaC032%、酵母粉O. 5%、 NaClO. 8%、 水92. 7%， pH 9. 0的液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天，培養(yǎng)溫度為32°C， 轉(zhuǎn)速為200rpm。再將將50ml種子液接種到裝液量為1. 5L發(fā)酵培養(yǎng) 基的2L發(fā)酵罐中，在37°C，空氣以總流速為l.OL/min流入，并以 400rpm攪拌混合，維持溶氧濃度(DO)為60—100%。用20% (w/v) NaOH將pH值維持在8.5—9.0，適量補糖，當細胞濃度光密度(O. D.) 水平達到32時，轉(zhuǎn)入微氧，維持溶氧濃度(DO)為5—10%，發(fā)酵培 養(yǎng)9天，得到鏈霉菌5z^印t咖/ces sp. NJWGY3665，采用離心分離 的方法將菌絲體，用乙醇進行提取分離，再采用樹脂進行精制，獲得 多肽類抗生素安來霉素。采用HPLC進行定量分析，可以得知樣品中安來霉素的濃度。單 位體積發(fā)酵液中安來霉素為5630pg/ml。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的配比為葡萄糖5. 0%，淀粉0. 5%，玉米漿3. 0%、 酵母膏0. 5%、黃豆餅粉0. 5% 、 NaCl 1. 5%、 CaC03 1. 5%、 NH4C1 0. 5%、磷酸二氫鉀O. 2%、硫酸銨0.3%、水95%。鏈霉菌S/r甲tow;;c" sp. NJWGY3665在葡萄糖營養(yǎng)瓊脂莉子瓶上 培養(yǎng)后，大量的無色的營養(yǎng)菌絲體平鋪于培養(yǎng)基表面，氣生菌絲呈現(xiàn) 白色至微灰色。 實施例4:采用肉湯培養(yǎng)基將鏈霉菌分repto邁yce5 sp. NJWGY3665菌種接 到葡萄糖0. 8%，牛肉膏1%、蛋白胨1%、 K2HP040. 2°/。、瓊月旨2%、水95%， pH8.0的葡萄糖營養(yǎng)培養(yǎng)基中，進行斜面培養(yǎng)，在37'C下培養(yǎng)6天。 取斜面菌種，加入2-3ml無菌水(每18X180,的試管斜面菌種)，用 接種環(huán)輕輕將菌苔洗下，制成孢子懸液，取0. 5ml孢子懸液接種到孢 子懸液接種到含50ml葡萄糖3. 0%、玉米漿3. 0%、 CaC032°/。、酵母粉 0.5%、 NaClO. 8%、水90. 7%， pH9. 0的液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h， 培養(yǎng)溫度為32r，轉(zhuǎn)速為200rpm。將50ml種子液接種到裝液量為 1.5L發(fā)酵培養(yǎng)基的2L發(fā)酵罐中，在33'C，空氣以總流速為1.5L/min 流入，并以350rpm攪拌混合，維持溶氧濃度(DO)為60—100%。 20% (w/v) NaOH將pH值維持在8.0—8.5，流加葡萄糖等營養(yǎng)物， 當細胞濃度光密度(O.D.)水平達到38時，轉(zhuǎn)入微氧，維持溶氧濃 度(DO)為5—10%，發(fā)酵培養(yǎng)9天，得到鏈霉菌5Yz^^o那ces sp. NJWGY3665，采用離心分離的方法將菌絲體，用乙醇進行提取分離， 再采用樹脂方法進行精制，獲得多肽類抗生素安來霉素?？梢圆捎肏PLC進行定量分析，可以得知樣品中安來霉素的濃 度。單位體積發(fā)酵液中安來霉素為6630pg/ml。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的配比為葡萄糖5. 0%，淀粉2%，玉米槳1. 5%、酵母膏O. 5%、黃豆餅粉2% 、 NaC10.8%、 CaC03 1.5%、 NH4C1 0. 5%、 磷酸二氫鉀0. 2°/。、硫酸銨O. 3%、水85. 7%。鏈霉菌6^wtom_ycas sp. NJWGY3665在葡萄糖營養(yǎng)瓊脂茄子瓶上 培養(yǎng)后，大量的無色的營養(yǎng)菌絲體平鋪于培養(yǎng)基表面，氣生菌絲呈現(xiàn) 白色至微灰色。
權(quán)利要求
1、一種發(fā)酵法生產(chǎn)多肽類抗生素安來霉素的方法，其特征在于方法為(1)斜面培養(yǎng)將鏈霉菌Streptomyces sp.NJWGY3665菌種接到葡萄糖營養(yǎng)培養(yǎng)基中，進行斜面培養(yǎng)，葡萄糖營養(yǎng)培養(yǎng)基的重量百分配比為葡萄糖0.5～1％、牛肉膏0.5～1％、蛋白胨0.5～1％、NaCl 0.3～0.5％或K2HPO4 0.1～0.2％、瓊脂1.5～2％、水余量，pH 6.0-9.0，培養(yǎng)溫度28-37℃，培養(yǎng)時間2天-6天；(2)種子培養(yǎng)用無菌水將斜面上培養(yǎng)的孢子制成單孢子懸液，并接種到40ml種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，種子培養(yǎng)基的重量百分配比為葡萄糖1～3.0％、玉米漿1～3％、CaCO3 1～2％、酵母粉0.5％、NaCl 0.1～0.8％、水余量，pH為6.0-9.0，溫度為28～32℃，轉(zhuǎn)速為200rpm，培養(yǎng)時間2天-6天；(3)發(fā)酵培養(yǎng)將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基的重量百分配比為葡萄糖2.0-5.0％、淀粉0.5-2.0％、玉米漿0.5-3.0％、酵母膏0.1～0.5％、黃豆餅粉0.5～2％、NaCl 0.5-1.5％、CaCO3 1.5％、NH4Cl 0.5％、磷酸二氫鉀0.2％、硫酸銨0.3％、水余量，溫度控制在28-37℃，pH控制在6.0-9.0，轉(zhuǎn)速180-220rpm，發(fā)酵5-9天，得到鏈霉菌Streptomyces sp.NJWGY3665，采用離心分離的方法將菌絲體用甲醇或乙醇進行提取分離，再采用樹脂方法進行精制分離，獲得多肽類抗生素安來霉素。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵法生產(chǎn)多肽類抗生素安來霉素的方 法，其特征在于所述的鏈霉菌菌種保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，本保藏中心登記入冊編號是CGMCC NO. 2410， 分類命名鏈霉菌，菌種的拉丁學名是5Yrep^/^ces sp.，參據(jù)的 微生物(株)NJWGY3665，保藏日期是2008年3月21日。
3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵法生產(chǎn)多肽類抗生素安來霉素的 方法，其特征在于所述的鏈霉菌5^epto^yc" sp. NJWGY3665在葡萄糖營養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)后，大量的無色的營養(yǎng)菌絲體平鋪于培養(yǎng) 基表面，氣生菌絲呈現(xiàn)白色至微灰色。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是一種發(fā)酵法生產(chǎn)多肽類抗生素安來霉素的方法，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)、工業(yè)生物技術(shù)、發(fā)酵工程領(lǐng)域。其方法為(1)斜面培養(yǎng)將鏈霉菌Strrptomyces sp.NJWGY3665菌種接到葡萄糖營養(yǎng)培養(yǎng)基中，進行斜面培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28-37℃，培養(yǎng)時間2-6天；(2)種子培養(yǎng)用無菌水將斜面上培養(yǎng)的孢子制成單孢子懸液，并接種到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度為28～32℃，轉(zhuǎn)速為200rpm，培養(yǎng)2-6天；(3)發(fā)酵培養(yǎng)將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度控制在28-37℃，pH控制在6.0-9.0，轉(zhuǎn)速180-220rpm，發(fā)酵5-9天，得到鏈霉菌，采用離心分離的方法將菌絲體用甲醇或乙醇進行提取分離，再采用樹脂方法進行精制，獲得多肽類抗生素安來霉素。
文檔編號C12R1/465GK101245362SQ200810024429
公開日2008年8月20日 申請日期2008年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月24日
發(fā)明者楊文革, 胡永紅 申請人:南京工業(yè)大學