專利名稱：結(jié)合藻紅膽素的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)中色素蛋白質(zhì)材料領(lǐng)域，具體涉及新型的結(jié)合藻紅膽素(PEB)的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法。
背景技術(shù)：
藻膽蛋白(phycobiliprotein)是藍(lán)藻和紅藻光合作用捕光復(fù)合物的功能組分。根據(jù)其吸收光譜和熒光光譜特征，藻膽蛋白可以分為藻紅蛋白(phycoerythrin，簡(jiǎn)稱CPE)、藻紅藍(lán)蛋白(phycoerythrocyanin，簡(jiǎn)稱PEC)、藻藍(lán)蛋白(phycocyanin，簡(jiǎn)稱CPC)和變?cè)逅{(lán)蛋白(all叩hycocyanin，簡(jiǎn)稱APC)。 CPE、 PEC、 CPC和APC含alpha和beta亞基，每個(gè)亞基中藻膽色素(phycobilin)通過硫醚鍵與藻膽蛋白脫輔基蛋白(apo-phycobiliprotein)半胱氨酸殘基的巰基共價(jià)結(jié)合，其種類及其與脫輔基蛋白的相互作用決定藻膽蛋白的光譜性質(zhì)。藻膽色素與脫輔基蛋白共價(jià)結(jié)合形成特定的構(gòu)象，使得CPE主要吸收約560nm的可見光，發(fā)射約 580nm的熒光；PEC吸收約570nm的可見光，發(fā)射約630nm的熒光；CPC吸收約620nm的可見光，發(fā)射約640nm的熒光；APC吸收約650 660nm的可見光，發(fā)射約660 670nm的熒光。CPE結(jié)合的輔基色素為藻紅膽素(phycoerythrobilin，簡(jiǎn)稱PEB); PEC的alpha亞基結(jié)合的輔基色素為藻紫膽素(phycoviolobilin，簡(jiǎn)稱PVB); PEC的beta亞基結(jié)合的輔基色素為藻藍(lán)膽素(phycocyanobilin，簡(jiǎn)稱PCB); CPC和APC結(jié)合的輔基色素都為藻藍(lán)膽素PCB。
CPC的alpha亞基可以通過大腸桿菌基因工程菌來生產(chǎn)(Tooley A J, Cai Y A, GlazerA N. Biosynthesis of a fluorescent cyanobacterial C-phycocyanin holo-alpha subunitin a heterologous host [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001， 98 (19) : 10560 10565)。與前人的方法不同，我們發(fā)現(xiàn)Anabaena sp. PCC7120中a"M朋基因編碼betal55裂合酶，在其它藍(lán)藻中也存在同源的betal55裂合酶。這類betal55裂合酶不僅能催化藻藍(lán)膽素PCB與CPC的beta亞基及其同源蛋白質(zhì)的155位半胱氨酸巰基(或同源的半胱氨酸巰基)共價(jià)結(jié)合生成藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)，還能催化藻紅膽素PEB與CPC的beta亞基及其同源蛋白質(zhì)的155位半胱氨酸巰基(或同源的半胱氨酸巰基)共價(jià)結(jié)合生成一種新型的結(jié)合了PEB的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。藻紅膽素PEB可由H01、 PebA、 PebB協(xié)同催化生成
(Alvey， R. M., Karty, J. A. etc丄esions in Phycoerythrin Chromophore Biosynthesis inFremyella diplosiphon Reveal Coordinated Light Regulation of Apoprotein and PigmentBiosynthetic Enzyme Gene Expression. Plant Cell 15 (10)， 2448-2463 (2003))。在絕大部分的藍(lán)藻和紅藻中，都存在有編碼CPE脫輔基蛋白、CPC脫輔基蛋白、APC脫輔基蛋白、betal55裂合酶以及PEB生物合成所需的酶的基因，其中某些缺乏PE而具有異形胞的藍(lán)藻中存在PEC;隱藻中沒有藻膽體，不存在上述基因中的APC的基因。
藻膽蛋白類熒光蛋白質(zhì)可以應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥和生物工程領(lǐng)域。目前使用的藻膽蛋白類熒光蛋白質(zhì)主要從藍(lán)藻和紅藻中提取(高純度藻膽蛋白的分離方法，CN1344723，2002.04.17。 一種水華藍(lán)藻制備藻藍(lán)蛋白的方法，CN1563083, 2005.01.12)。本方法不利用藻類作為原料，而是利用基因工程方法生產(chǎn)新型的藻藍(lán)蛋白。藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)具有優(yōu)良的熒光性質(zhì)，這種結(jié)合PEB的新型藻藍(lán)蛋白，為開發(fā)新型熒光探針提供了更多的選擇。本方法為藻藍(lán)蛋白類色素蛋白質(zhì)功能材料應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥和生物工程領(lǐng)域奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種結(jié)合藻紅膽素的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法，它是應(yīng)用betal55裂合酶催化PEB與藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白共價(jià)結(jié)合，從而制備新型藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)(天然狀態(tài)下藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白是與PCB結(jié)合)。將含有betal55裂合酶基因、藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因和PEB生物合成酶基因的表達(dá)質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入宿主菌，得到相應(yīng)的工程菌，通過如此設(shè)計(jì)的基因工程菌生產(chǎn)新型藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣的 一種結(jié)合藻紅膽素的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法，包括下述步驟
(1) 用基因工程方法，將betal55裂合酶基因或其同源基因克隆于表達(dá)載體中，得到betal55裂合酶表達(dá)質(zhì)粒；
(2) 用基因工程方法，將藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因或其同源基因克隆于第二個(gè)表達(dá)載體中，得到脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒；
(3) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因力o7和peZ^或其同源基因克隆于第三個(gè)表達(dá)載體中，得到力o7和pe/^表達(dá)質(zhì)粒；
(4) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因peM或其同源基因克隆于第四個(gè)表達(dá)載體中，得到pe^表達(dá)質(zhì)粒；
(5) 將betal55裂合酶表達(dá)質(zhì)粒、脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒、力o7和pe力5表達(dá)質(zhì)粒及peW表達(dá)質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當(dāng)這些表達(dá)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應(yīng)的工程菌，應(yīng)用此工程菌通過發(fā)酵工程生產(chǎn)結(jié)合藻紅膽素的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)；發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，提純得到相應(yīng)的結(jié)合藻紅膽素的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的技術(shù)方案也可以是這樣的 一種結(jié)合藻紅膽素的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備
方法，包括下述步驟(1) 用基因工程方法，將betal55裂合酶基因或其同源基因和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基 因或其同源基因同時(shí)克隆于表達(dá)載體中，得到betal55裂合酶和脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒；
(2) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因力o7和/^力5或其同源基因克隆于第 三個(gè)表達(dá)載體中，得到Z o7和； e/^表達(dá)質(zhì)粒；
(3) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因peW或其同源基因克隆于第四個(gè)表 達(dá)載體中，得到peW表達(dá)質(zhì)粒；
(4) 將betal55裂合酶和脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒、力o7和pe65表達(dá)質(zhì)粒及/ eM表達(dá)質(zhì)粒 依次轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當(dāng)這些表達(dá)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應(yīng)的工程菌，應(yīng)用此工程 菌通過發(fā)酵工程生產(chǎn)結(jié)合藻紅膽素的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)；發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技 術(shù)，提純得到相應(yīng)的結(jié)合藻紅膽素的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。
上述結(jié)合藻紅膽素的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法中，所述的宿主菌為大腸桿；所 述的betal55裂合酶基因是指與^a/ ae朋sp. PCC7120中3"MW基因同源的基因；所述的 藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因是指與^afee朋sp. PCC7120或M J柳i/ os"s sp. PCC7603中 M"基因同源的基因。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)
1、 不使用藻類為原料而是利用大腸桿菌生產(chǎn)藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)，大腸桿菌繁殖快， 可以大大縮短周期；
2、 與藻類相比，大腸桿菌細(xì)胞壁容易破碎，純化過程中可節(jié)省能源；
3、 通過大腸桿菌生產(chǎn)，目標(biāo)蛋白含量高，有His-tag標(biāo)記，且體系中幾乎沒有性質(zhì)類似 的蛋白，提取方便；
4、 生成結(jié)合PEB的新型藻藍(lán)蛋白，具有與天然藻藍(lán)蛋白不同的光譜特性，為發(fā)展熒光藻 膽蛋白類色素蛋白質(zhì)功能材料提供更多選擇。


圖l為本發(fā)明中A115339催化下生成的結(jié)合PEB的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的吸收與熒光 光譜；其中實(shí)線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。 實(shí)施例1
實(shí)施例1:
(1)從GeneBank中可以査到，藻種力朋&e朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測(cè)定完成， h肌V70s〃s sp. PCC7603和CaJ"力ri;f sp. PCC7601部分序列己經(jīng)測(cè)定。力/ a6a朋a sp, PCC7120在GeneBank中編號(hào)為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因(c/ c5、 a〃5"JJ久Z o7); M Ja/w'/7as"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(cpci9); CW"力r^ sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(pe似和peZ^)。通過基因工程方法，將勘s&e朋 sp.PCC7120中的a^5^J9基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-aJ^5J3A在大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將」朋6朋朋sp.PCC7120中的藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因c/ c^克隆于Novagen公 司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-cpM，在大腸桿菌中能表達(dá)脫輔基蛋白藻藍(lán)蛋白 B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-peZ^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-pe似，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因c; "在pET30中是在fcoRV和i7 o I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因 W7MW在pETDuet-l中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)勘/II和J力o I之間；PEB合成酶基因是3 個(gè)(力o厶peM和peM)，力o7和/ eZ^在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個(gè)多克隆位 點(diǎn)7Vfco I和尸W I之間，/ eM在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)A^e I和J力o I之間，在pACYCDuet-1 中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)5g7II和Wol之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5) 將pETDuet-a^53J久pET30-c; c仏pCDFDuet-力o7-; eZ^和pACYCDuet-; e似轉(zhuǎn)入大 腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7.0的 LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0仏。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡(jiǎn)稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 2CTC至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過狙2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B。其吸收與熒光光譜見附圖1中所示，其中實(shí)線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式如下
從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種于5mLLB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)過夜;取100pL飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mL LB培養(yǎng)基，37。C振蕩培養(yǎng)至0D6。。=0. 3 0.4時(shí)，將菌液轉(zhuǎn)移至5mL無菌離心管中，冰上放置10min;離心lniin (10000g， 4'C)棄去上清，收集沉淀菌體；用lmL預(yù)冷的O. lmol/LCaCl2無菌溶液重懸菌體，離心30s(10000g， 4°C)去上清，菌體沉淀用10(^L預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2重懸，放置于冰上，加入一定量的構(gòu)建好的質(zhì)粒，混勻后冰浴放置30min， 42'C熱休克90s，冰浴5min后加入300nL LB培養(yǎng)基，37°C低速振蕩培養(yǎng)45min，無菌涂布在含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基平板上，倒置于37。C培養(yǎng)箱至形成可見的單克隆菌斑。
提取3個(gè)左右菌落，分別接種到5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至飽和；分別從中取lOO)aL轉(zhuǎn)接至5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中；37°0振蕩培養(yǎng)至0D6。。=0. 5-0. 7時(shí)，冰浴約30min，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；避光、2CTC、 150轉(zhuǎn)/分，表達(dá)約12小時(shí)。離心收集細(xì)胞，細(xì)胞加入緩沖液重懸；通過光譜儀測(cè)其產(chǎn)物熒光量，選取熒光產(chǎn)量高的菌株進(jìn)行大量表達(dá)。
實(shí)施例2
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種^ a6ae朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測(cè)定完成，yK ^7M'/7oms sp. PCC7603和CW"/ r"sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測(cè)定。sp. PCC7120在GeneBank中編號(hào)為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(cpc仏W7MJ義力o/);M 7a/77i/70ws sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254,可從所查到序列中找到所需基因(cpc^); CW"Ari;f sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為AY363679,可從所査到序列中找到所需基因(pe^和pe/^)。通過基因工程方法，將力朋6朋朋sp.PCC7120中的a775^39基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-aL 533仏在大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將^a&e朋sp.PCC7120中的藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因cpc5(C84S)克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-cpc^(C84S)，在大腸桿菌中能表達(dá)脫 輔基蛋白藻藍(lán)蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和pe/^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-pe65，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(pe似)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-pe^，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因c;x^(C84S)在pET30中是在ScoRV和Z力o I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合 酶基因a^5JJ^在pETDuet-l中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)5g7II和i7wl之間；PEB合成酶基 因是3個(gè)(力o厶peM和/ eM), Z o7和； e/^在同一個(gè)載體pCDFDuet-l中，力o7在第一個(gè)多 克隆位點(diǎn)餘ol和尸WI之間，在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)7fefel禾[]J7 oI之間，pe似在 pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)餘JII和化ol之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5) 將pETDuet-aWMW、 pET30-cpc饑C84S) 、 pCDFDuet-Z o7-pe/^和pACYCDuet-peW 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0Ds。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (is叩r叩hyl thio-p-D-galactoside，簡(jiǎn)稱IPTG)至終濃度為1畫1/L， 20。C至37。C振蕩表 達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B;離心收集菌體細(xì)胞，加入 緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的藻藍(lán)蛋白類 熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例3
(1)從GeneBank中可以査到，藻種勘a/w， sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測(cè)定完成， ^ Ja/zuV7as〃ssp. PCC7603和Ca〗"/ r^sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測(cè)定。^ aZ ae朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號(hào)為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(cpc仏a775^3久 M7a/wV os〃ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(cpc5); Ca7oz^ri義sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(pe/^和peZ^)。通過基因工程方法，將^^&e/7a sp.PCC7120中的a775JJ9基因和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因c/7c5克隆于Novagen公司的 pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-c/x^"W^^郛，在大腸桿菌中能表達(dá)藻藍(lán)蛋白類脫輔基 蛋白B和betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W和peZ^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-Z o7-pe/^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(z eM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-peW，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因c;x^和裂合酶基因aWMJ9在pETDuet-l中，cpc^處于第一個(gè)多克 隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是￡coR I和尸"I ， a^5^J^處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)^gill和i7w I之間； PEB合成酶基因是3個(gè)(力o入peM和； eZ^)，力o7和pe/^在同一個(gè)載體pCDFDuet-l中，/ o7 在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)辰o I和尸sU之間，peM在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)AWe I和J/ o I之間，pe似 在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)勘JII和/力o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(4) 將pETDuet-cpc&aWSJJA pCDFDuet-力o7-peZ^和pACYCDuet-peZ^轉(zhuǎn)入大腸桿菌， 當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7.0的LB培養(yǎng)基 中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-p-D-galactoside，簡(jiǎn)稱IPTG)至終濃度為lmraol/L， 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)， 生產(chǎn)藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì) 胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅 膽素-藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例4(1) 從GeneBank中可以査到，藻種力朋力朋朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測(cè)定完成， yK sp. PCC7603和CaJ"力W;rsp. PCC7601部分序列已經(jīng)測(cè)定。^朋Z ae/ a sp. PCC7120 在GeneBank中編號(hào)為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(c/7c5、 aL^ J久力o7); 尨"/m'770s"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(cpc5); C3J"/ n';r sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(pe似和々eM)。通過基因工程方法，將」朋力ae朋 sp. PCC7120中的a775^J9基因和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因cpc5(C84S)克隆于Novagen公 司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-c々c5 (C84S) -a^MJA在大腸桿菌中能表達(dá)藻藍(lán) 蛋白類脫輔基蛋白B和betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和； eM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o -pei^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-peW，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因(C84S)和裂合酶基因a"M39在pETDuet-l中，c; c^處于第 一個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是^coR I和尸"I , a^5J滯處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)^71I和J力o I之間；PEB合成酶基因是3個(gè)(力o入peM和pe/^)，力o7和； eZ^在同一個(gè)載體pCDFDuet-l 中，力o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Abo I和I之間，； eM在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)yWe I和J力o I 之間，/ e^在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)份JII和J力o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(4) 將pETDuet-cpc5 (C84S) -a^55J久pCDFDuet-Z o -peM和pACYCDuet-pe^轉(zhuǎn)入 大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH7.0的 LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡(jiǎn)稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例5
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種^ a力ae朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測(cè)定完成，vK 7朋w'"osiAS sp. PCC7603和CW"/ rj>sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測(cè)定。J"a6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號(hào)為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因(cpc仏a^5^J久力o7);J/.^/w'/7oms sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254,可從所查到序列中找到所需基因(cpc必；CaJ"力riz sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(pe^和/ eM)。通過基因工程方法，將^ 3力ae朋sp.PCC7120中的3丑5"^基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-a7753J9，在大腸桿菌中能表達(dá)betal 55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將^7a6ae朋sp. PCC7120中的藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因cpc^克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pCOLADuet-l中，所得質(zhì)粒叫pC0LADuet-cpc5，在大腸桿菌中能表達(dá)脫輔基蛋白藻藍(lán)蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o 和/^6幼克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-pe/^,在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-peM,在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因cpc^在pCOLADuet-l第一個(gè)多克隆位點(diǎn)^coR I和Pst I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因a^5J3^在pETDuet-l中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)^^1I禾[！ i7 oI之間；PEB合成酶基因是3個(gè)(力o入pe^和pe/^)，力o7和pe力5在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，力o/在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Afco I和尸W I之間，peM在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)AWe I和/力o I之間，pe^在pACYCDuet-l中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)設(shè)JII和之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把
所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同
11樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5)將pETDuet-aW5"M久pCOLADuet-cpc厭pCDFDuet-力o7-; e/^和pACYCDuet-peW轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0D6。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡(jiǎn)稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過附2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例6
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種/!朋/ a謹(jǐn)sp. PCC7120的全序列己經(jīng)測(cè)定完成，#."肌'"os"s sp. PCC7603和<^J"/ rj>sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測(cè)定。力朋6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號(hào)為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(cpc5、 3L^ J義力oO;# 7ayw'/ os"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254,可從所査到序列中找到所需基因(cpcv9); Ca"t力n'x sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(peM和pe/^)。通過基因工程方法，將^a&e朋印.PCC7120中的a77MJ9基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-a^5JJA在大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將^7a力朋朋sp.PCC7120中的藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因cp"(C84S)克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pC0LADuet-1中，所得質(zhì)粒叫pC0LADuet-cpc5(C84S),在大腸桿菌中能表達(dá)脫輔基蛋白藻藍(lán)蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-Z o卜peZ^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-peM，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因cpc5(C84S)在pC0LADuet-1第一個(gè)多克隆位點(diǎn)化oR I和Pst I兩個(gè)酶
12切位點(diǎn)之間；裂合酶基因a^MW在pETDuet-1中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)^^711和J/w I之間；PEB合成酶基因是3個(gè)(力o厶和peZ^)，力o7和/ eM在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)I和尸"I之間，peM在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)M/e I和J力o I之間，； e/^在pACYCDuet-l中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)和I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5 ) 將 pETDuet-aW5^3P 、 pC0LADuet-cpc^(C84S) 、 pCDFDuet-Z o7-peZ^和pACYCDuet-;^W轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至OD柳為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡(jiǎn)稱IPTG)至終濃度為1腸1/L， 20。C至37t:振蕩表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni"親和層析，可提純得到相應(yīng)的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例7
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種^a/ ae朋sp.PCC7120的全序列己經(jīng)測(cè)定完成，必7a/w'/ os"s sp. PCC7603和CWotArixsp. PCC7601部分序列已經(jīng)測(cè)定?！古?amp;e朋sp. PCC7120在GeneBank中編號(hào)為BA000019,可從所查到序列中找到所需基因(cpc5、 a^5^3久
J柳i/ owAS sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254,可從所查到序列中找到所需基因(cpt^); CW"Ar^ sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(peM和pe^^)。通過基因工程方法，將力朋tee/7asp.PCC7120中的s775339基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-W753J9，在大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將髮J柳i/7awssp. PCC7603中的藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因cpc5克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-c/^A在大腸桿菌中能表達(dá)脫輔基蛋白藻藍(lán)蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W和peM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-/ eM，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因cpcA在pET30中是在fcoRV和iT oI兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因a^MW在pETDuet-l中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)A^II和i7 o I之間；PEB合成酶基因是3個(gè)(力o7、 / e/^禾n/ eZ^)，力o7和pe/^在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)I和尸st I之間，peM在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)AWe I和i7 o I之間，； e/^在pACYCDuet-l中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)％711和化ol之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5) 將pETDuet-aWMJA pET30-cpc厭pCDFDuet-Z o卜; eZ^和pACYCDuet-pe^轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7.0的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isopr叩hylthio-(3-D-galactoside，簡(jiǎn)稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 2CTC至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。實(shí)施例8
(1)從GeneBank中可以査到，藻種^7a&e朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測(cè)定完成，7柳i/ os"s sp. PCC7603和CaJ"/ r&sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測(cè)定。力朋6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號(hào)為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(cpc從a"53J義力o/);必7a77i/3os^ sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254,可從所查到序列中找到所需基因(c/ c)9); 6^"/ n';r sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為
14AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(pe似和； eM)。通過基因工程方法，將力朋6ae朋sp.PCC7120中的a^5J滯基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-a^5^JA在大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將必^/w'/7M^ sp. PCC7603中的藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因cpcMC84S)克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-"cMC84S)，在大腸桿菌中能表達(dá)脫輔基蛋白藻藍(lán)蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和pe/^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-/ o7-peZ^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因。e^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-; eZ^，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因cpc5(C84S)在pET30中是在fcoRV和J力o I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因a"M滯在pETDuet-1中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)處7II和J/ oI之間；PEB合成酶基因是3個(gè)(力o厶peM和peM)，力o7和peM在同一個(gè)載體pCDFDuet-l中，Z o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)vVcoI和尸WI之間，peM在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)M/el和Z力ol之間，在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)5^11和之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5) 將pETDuet-a^5^3義pET30-c/ c5(C84S) 、 pCDFDuet-力W-peZ^和pACYCDuet-/ e^轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡(jiǎn)稱IPTG)至終濃度為1畫1/L, 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過附2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例9
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種^/7a6ae朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測(cè)定完成， 7a/M'"aszAssp. PCC7603和"Joz^ri義sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測(cè)定。力/7a力ae/7a sp. PCC7120
在GeneBank中編號(hào)為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(cpc仏a7^^^久力o7); M 7a/w'/ os"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254,可從所查到序 列中找到所需基因(cpc5); sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為
AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(; eM和peZ^)。通過基因工程方法，將^7a力ae"a sp. PCC7120中的a^5JJ9基因和7a肌'/ ostAS sp. PCC7603中的藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因 cpc^克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-cpc5"aL^5^J"在大腸桿菌 中能表達(dá)藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白B和betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和peM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o/-peZ^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-peM，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因cpc5和裂合酶基因a7^^39在pETDuet-1中，cpc^處于第一個(gè)多克 隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是^boR I和At I ， a^MW處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)^WII和Z力o I之間； PEB合成酶基因是3個(gè)(力o7、 peM和peM)， 7 o7和； eM在同一個(gè)載體pCDFDuet-l中，力o/ 在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Abo I和尸"I之間，peM在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)AWe I和J力o I之間，pe^ 在pACYCDuet-l中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)^^1I和i7 o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(4) 將pETDuet-c; c&aW5^3久pCDFDuet-力o卜pe/^和pACYCDuet-/ e/W轉(zhuǎn)入大腸桿菌，
當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isopr叩hylthio-(3-D-galactoside，簡(jiǎn)稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 2(TC至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例10
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測(cè)定完成，;K 7a/MV7a Ay sp. PCC7603和CaJot力ri;f sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測(cè)定。^朋Z ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號(hào)為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因(cpc仏a7753J久力o7);
7a/M'/70幼s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254,可從所查到序列中找到所需基因(c/7C歷；C3J"/ r& sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(/ eM和peM)。通過基因工程方法，將力朋6ae朋sp. PCC7120中的a^5"JJ^基因和尨^肌V70s"s sp. PCC7603中的藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因cpc沃C84S)克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-cpc沃C84S)-a^5^W，在大腸桿菌中能表達(dá)藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白B和betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o/和pe力歷克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力W-在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-peW，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因cpc5 (C84S)和裂合酶基因aL M滯在pETDuet-1中，cpc^處于第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是&dU和尸"I ， s^M滯處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)^71I和i7wI之間；PEB合成酶基因是3個(gè)(力o入paM和peM)， Z o7和peZ^在同一個(gè)載體pCDFDuet-l中，力o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Afco I和戶"I之間，peM在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)M/e I和J力o I之間，peZ^在pACYCDuet-l中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)和屈o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致h l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(4)將pETDuet-c/ c5 (C84S) -W75^3R pCDFDuet-力o7-pe/^和pACYCDuet-pe/W轉(zhuǎn)入 大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的 LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0D,為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-(5-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡(jiǎn)稱IPTG)至終濃度為l腿ol/L， 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)， 生產(chǎn)藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì) 胞后，離心收集上清液，通過附2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅 膽素-藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例11
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種力朋力ae/ a sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測(cè)定完成， ;K 7a肌V os"ssp. PCC7603和CaJ"力ri義sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測(cè)定。力朋6ae朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號(hào)為BA000019,可從所査到序列中找到所需基因(c/ c仏aW5J^^、 Z o7); 必7a肌V70s"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254,可從所查到序 列中找到所需基因(cpc^); CaJ"/ ri義sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(/ eM和peM)。通過基因工程方法，將^3&e朋 sp.PCC7120中的aL 5JJ9基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-a^5J^^，在大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將M7柳j'/ omssp. PCC7603中的藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因cpc^克隆于Novagen 公司的表達(dá)載體pCOLADuet-l中，所得質(zhì)粒叫pC0LADuet-c;x^，在大腸桿菌中能表達(dá)脫輔基 蛋白藻藍(lán)蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-z eZ^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-/ e似，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因"c5在pC0LADuet-1第一個(gè)多克隆位點(diǎn)fcoR I和Pst I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因a775"JJ^在pETDuet-1中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)《^HI和i7 o I之間；PEB合成酶基因是3個(gè)(力o入/5eM和peZ^)，力o7和peM在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，力o/在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Afco I和尸W I之間，; eM在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)7W/e I和義力o I之間，peM在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)5Wn和之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5)將pETDuet-aW5"息pC0LADuet-，仏pCDFDuet-力。7-peM和pACYCDuet-peM轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡(jiǎn)稱IPTG)至終濃度為l腿ol/L， 2(TC至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni"親和層析，可提純得到相應(yīng)的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例12
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種」朋6a, sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測(cè)定完成，M 7a肌'/7os"s sp. PCC7603和CaJ"力n;sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測(cè)定?！?a/ ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號(hào)為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(c/ c仏3775^3義力o/);M 7a肌V o^As sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254,可從所查到序列中找到所需基因(cpc5); C^"Ark sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(peW和peM)。通過基因工程方法，將^s力ae朋sp.PCC7120中的W75^J9基因克隆于Novagen公司的pETDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-a77533義在大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將必^肌'/7o^s sp. PCC7603中的藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因c/x^(C84S)克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pCOLADuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCOLADuet-cpc5(C84S)，在大腸桿菌 中能表達(dá)脫輔基蛋白藻藍(lán)蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和peM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-; eZ^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)HOI和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因。eM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-/ e^，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因cpcS(C84S)在pC0LADuet-l第一個(gè)多克隆位點(diǎn)￡boR I和Pst I兩個(gè)酶 切位點(diǎn)之間；裂合酶基因a"5^39在pETDuet-1中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)5《71I和J力o1 之間；PEB合成酶基因是3個(gè)(力o厶； e^和/ eM)，力o/和/ e/^在同一個(gè)載體pCDFDuet-1 中，力o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)tVco I和尸st I之間，/ eM在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)We I和J力o I 之間，在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)5《JII和J力o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5 ) 將 pETDuet-aW5JJ9 、 pCOLADuet-cpcS(C84S) 、 pCDFDuet-力o7-peZ 5和 pACYCDuet-pe/^轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工 程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0D卿為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡(jiǎn)稱IPTG)至終濃度為1畫1/L， 2(TC至37 'C振蕩表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B;離心收集菌體細(xì) 胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的藻 藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
上述制備方法適用于采用各種藍(lán)藻中的betal55裂合酶、藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白、藻紅 膽素生物合成酶基因或其同源基因來制備藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)，但涉及到微生物菌種公開 的問題，本發(fā)明只選用了 GenBank中已公開全序列的藍(lán)藻」朋6朋朋sp. PCC7120和已經(jīng)部分 測(cè)序的M ^3肌'/7os^ sp. PCC7603和CsJ"力r^ sp. PCC7601為例對(duì)本發(fā)明方法加以說明，本 領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)上述公開的內(nèi)容采用其它原料實(shí)施本發(fā)明。
權(quán)利要求
1. 一種結(jié)合藻紅膽素的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于包括下述步驟(1)用基因工程方法，將beta155裂合酶基因或其同源基因克隆于表達(dá)載體中，得到beta155裂合酶表達(dá)質(zhì)粒；(2)用基因工程方法，將藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因或其同源基因克隆于第二個(gè)表達(dá)載體中，得到脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒；(3)用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因ho1和pebB或其同源基因克隆于第三個(gè)表達(dá)載體中，得到ho1和pebB表達(dá)質(zhì)粒；(4)用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因pebA或其同源基因克隆于第四個(gè)表達(dá)載體中，得到pebA表達(dá)質(zhì)粒；(5)將beta155裂合酶表達(dá)質(zhì)粒、脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒、ho1和pebB表達(dá)質(zhì)粒及pebA表達(dá)質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當(dāng)這些表達(dá)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應(yīng)的工程菌，應(yīng)用此工程菌通過發(fā)酵工程生產(chǎn)結(jié)合藻紅膽素的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)；發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，提純得到相應(yīng)的結(jié)合藻紅膽素的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。
2. —種結(jié)合藻紅膽素的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于包括下述步驟(1) 用基因工程方法，將betal55裂合酶基因或其同源基因和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基 因或其同源基因同時(shí)克隆于表達(dá)載體中，得到betal55裂合酶和脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒；(2) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因力W和pe/^或其同源基因克隆于第 三個(gè)表達(dá)載體中，得到/ o7和pe6^表達(dá)質(zhì)粒；(3) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因/^M或其同源基因克隆于第四個(gè)表 達(dá)載體中，得到pe^表達(dá)質(zhì)粒；(4) 將betal55裂合酶和脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒、力o 和pe/^表達(dá)質(zhì)粒及表達(dá)質(zhì)粒 依次轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當(dāng)這些表達(dá)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應(yīng)的工程菌，應(yīng)用此工程 菌通過發(fā)酵工程生產(chǎn)結(jié)合藻紅膽素的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)；發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技 術(shù)，提純得到相應(yīng)的結(jié)合藻紅膽素的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的宿主菌為大腸桿菌。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的betal55裂合酶基因是指與 力朋6ae朋sp. PCC7120中a^^JJ^基因同源的基因。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因是 指與力朋6朋77a sp. 0:7120或?qū)?<3^'"0 ^ sp. PCC7603中c; t^基因同源的基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種結(jié)合藻紅膽素(PEB)的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法，是通過應(yīng)用藻膽蛋白beta155裂合酶催化藻紅膽素與藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白共價(jià)結(jié)合，制備結(jié)合PEB的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。本發(fā)明的方法應(yīng)用生物過程生產(chǎn)藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)，是一種環(huán)境友好的生產(chǎn)方法，藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)能應(yīng)用于食品、保健與醫(yī)藥功能材料領(lǐng)域，特別是應(yīng)用為生物和醫(yī)學(xué)分子監(jiān)測(cè)領(lǐng)域的熒光探針。
文檔編號(hào)C12N15/60GK101475950SQ20081002562
公開日2009年7月8日 申請(qǐng)日期2008年1月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月3日
發(fā)明者佟順剛, 明 周, 坤 夏, 趙開弘 申請(qǐng)人:廣州天寶頌原生物科技開發(fā)有限公司;華中科技大學(xué)