專利名稱：一種用于恢復(fù)紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的生物技術(shù)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于恢復(fù)紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能 的生物技術(shù)方法。
背景技術(shù)：
紅細(xì)胞的主要功能是運(yùn)輸氧氣和二氧化碳，這一功能的實(shí)現(xiàn)必須依賴其正 常的細(xì)胞形態(tài)和流變學(xué)特性。紅細(xì)胞膜表面的有關(guān)特性,包括細(xì)胞的表面形態(tài)、 細(xì)胞表面的帶電特性等，不僅直接影響細(xì)胞的粘附、聚集、代謝和免疫等作用， 也影響紅細(xì)胞的變形能力及其在毛細(xì)血管內(nèi)的流動(dòng)，從而影響紅細(xì)胞運(yùn)輸氧氣 和其它養(yǎng)分的功能，并影響血液整體的有關(guān)特性。有關(guān)研究表明，細(xì)胞的表面 形態(tài)以至細(xì)胞膜的力學(xué)特性都與細(xì)胞表面的帶電特性密切相關(guān)。人紅細(xì)胞通常在體內(nèi)的壽命約120天左右，有研究表明，老齡的紅細(xì)胞其表面電荷會(huì)因其細(xì) 胞膜的唾液酸殘基的脫落而減少，從而引起整個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生變化。所 引發(fā)的變化包括使跨膜蛋白發(fā)生聚集導(dǎo)致質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的重排，影響細(xì)胞的形態(tài) 使之從正常的雙凹形變成近球型；使細(xì)胞間的相互作用增強(qiáng)，導(dǎo)致紅細(xì)胞與毛 細(xì)管壁的粘附作用及紅細(xì)胞間的聚集性增加；使細(xì)胞的剛性增強(qiáng)變形能力降 低；甚至還會(huì)使其血紅蛋白的帶氧能力降低等。在血庫(kù)中儲(chǔ)存一段時(shí)間的紅細(xì) 胞，也會(huì)發(fā)生類似的變化。從而影響其儲(chǔ)存壽命。 一些有病的紅細(xì)胞如貧血紅 細(xì)胞，也發(fā)現(xiàn)有類似的變化。到目前為止，世界上對(duì)于紅細(xì)胞表面帶電狀態(tài)對(duì)其結(jié)構(gòu)與功能影響的研究 主要是考慮各種因素，包括因細(xì)胞老化、儲(chǔ)存時(shí)間以及人為以胰蛋白酶等酶切 作用下使其細(xì)胞膜的唾液酸殘基脫落導(dǎo)致紅細(xì)胞表面電荷減少情況下，對(duì)紅細(xì) 胞結(jié)構(gòu)與功能等生命狀態(tài)帶來(lái)的影響，而沒有見如何釆取有關(guān)技術(shù)方法使紅細(xì) 胞表面帶電狀態(tài)恢復(fù)從而使其結(jié)構(gòu)與功能得到修復(fù)的研究。而在實(shí)際應(yīng)用中， 血庫(kù)中儲(chǔ)存的紅細(xì)胞如何能較長(zhǎng)時(shí)間保持其正常的結(jié)構(gòu)與功能，確保所儲(chǔ)存的紅細(xì)胞不致變質(zhì)減效，在目前血源比較緊張的情況下，更顯得重要。此外，如200810026282.7 說(shuō)明書第2/10頁(yè)能通過(guò)使老齡的或有病的紅細(xì)胞表面帶電狀態(tài)恢復(fù)從而使其結(jié)構(gòu)與功能得到 修復(fù)，對(duì)于延長(zhǎng)紅細(xì)胞的壽命，及改善病態(tài)紅細(xì)胞的狀況，都具有重要作用。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種用于恢復(fù)紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)與 功能的生物技術(shù)方法。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種用于恢復(fù)紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的 生物技術(shù)方法，其特征在于以抗氧化物或唾液酸作用于老化或病態(tài)紅細(xì)胞后 得到結(jié)構(gòu)與功能都恢復(fù)到正常青齡紅細(xì)胞水平的紅細(xì)胞。所述抗氧化物優(yōu)選維生素E或7V-乙酰半胱氨酸等抗氧化物；其它抗氧化 物也可產(chǎn)生類似的作用。一種用于恢復(fù)紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的生物技術(shù)方法，具體包括下述步驟首 先取一定量老化或病態(tài)紅細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋制成濃度為5xl()S個(gè)/毫升 7><108個(gè)/毫升的紅細(xì)胞懸浮液，然后按每毫升紅細(xì)胞懸浮液加入1.5 10|ig的 維生素E或7V-乙酰半胱氨酸或唾液酸的比例，加入含維生素E或7V-乙酰半胱 氨酸或唾液酸的作用液，在 37'C溫度下共育30 240分鐘，然后用磷酸鹽緩 沖液(PBS)洗滌，將洗后的紅細(xì)胞懸浮于等滲磷酸鹽緩沖液中即可得到結(jié)構(gòu) 與功能都恢復(fù)到正常青齡紅細(xì)胞水平的紅細(xì)胞。所述老化紅細(xì)胞包括老齡紅細(xì)胞或在體外儲(chǔ)存超過(guò)5天的紅細(xì)胞。所述病態(tài)紅細(xì)胞包括各種貧血型紅細(xì)胞。所述細(xì)胞培養(yǎng)液為含體積分?jǐn)?shù)為7 12%小牛血清的1640液。所述含維生素E的作用液為將維生素E用生理鹽水稀釋至濃度為 100|ig/ml 200|ig/ml的溶液。所述含7V-乙酰半胱氨酸的作用液是濃度為100^ig/ml 200ng/ml的AT-乙酰 半胱氨酸水溶液。所述含唾液酸的作用液是濃度為30pg/ml 45ng/ml的唾液酸水溶液。 所述洗滌是在離心機(jī)中在1500 2500轉(zhuǎn)/分鐘條件下洗滌3 6分鐘。 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及有益效果 (1)本發(fā)明可使老齡或存儲(chǔ)較久的紅細(xì)胞或病態(tài)紅細(xì)胞的表面電荷恢復(fù)至正常青年人的青齡紅細(xì)胞的水平，從而恢復(fù)其結(jié)構(gòu)與功能。包括恢復(fù)雙凹型 的細(xì)胞形態(tài)及大小，細(xì)胞的變形能力以至其胞內(nèi)血紅蛋白的帶氧能力也恢復(fù)至 正常青齡紅細(xì)胞的水平。(2) 本發(fā)明方法步驟簡(jiǎn)單，操作安全方便。(3) 本發(fā)明所使用的唾液酸是紅細(xì)胞細(xì)胞膜本身荷電物質(zhì)分子的主要成 分，維生素E是人體必需的維生素，M乙酰半胱氨酸也是證明對(duì)人體安全的 物質(zhì)，它們的作用不會(huì)對(duì)紅細(xì)胞產(chǎn)生不良影響。


圖1是正常青齡紅細(xì)胞(a)、老齡紅細(xì)胞(b)、用維生素E處理后的老 齡紅細(xì)胞(c)、用7V-乙酰半胱氨酸處理后的老齡紅細(xì)胞(d)和用唾液酸SA處 理后的老齡紅細(xì)胞(e)的顯微鏡圖象。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但發(fā)明的實(shí)施方式 不限于此。 實(shí)施例1(1) 制備老齡紅細(xì)胞樣品。從年輕健康無(wú)吸煙史、無(wú)近期服藥史的男性 志愿者身上抽取靜脈血2ml，用肝素抗凝。用等滲PBS緩沖液洗滌(2000r/min， 5min) 3次。把洗后的紅細(xì)胞(20倍稀釋)放到已形成的非連續(xù)密度梯度液上， 2700r/min離心30min，取最底層紅細(xì)胞(即老齡紅細(xì)胞)，用PBS洗滌三次(2000r/min， 5min)后懸浮于等滲PBS緩沖液中4。C保存?zhèn)溆谩?2) 以維生素E作用液作用老齡紅細(xì)胞。取O.lml經(jīng)(1)所制備并洗 滌過(guò)的老齡紅細(xì)胞，用含體積分?jǐn)?shù)為10%小牛血清1640液稀釋到lml，濃度 約為6xl()S個(gè)/ml。再加入50nl濃度為160ng/ml的維生素E作用液(即將維生 素E用生理鹽水稀釋至濃度為160pg/ml的溶液)，在37。C溫度下共育200分 鐘。然后以PBS液彎曲彈性模量Kc;另取部分樣品，以Zeta PALS電位分析儀測(cè)定紅細(xì)胞表面 Zeta電位，以反映紅細(xì)胞的帶電狀態(tài)。再另取部分經(jīng)(2)作用的紅細(xì)胞樣品， 以激光共焦拉曼散射顯微鏡檢測(cè)其血紅蛋白結(jié)構(gòu)與帶氧能力。如圖1所示，圖1 (c)為本實(shí)施例處理的老齡紅細(xì)胞的顯微鏡圖象，從 圖中可以看出其細(xì)胞大小及形態(tài)結(jié)構(gòu)已恢復(fù)成與正常青齡細(xì)胞(圖1 (a))相 似，為標(biāo)準(zhǔn)的雙凹形結(jié)構(gòu)，其截面積為28.94±2.80pm2 (正常青齡細(xì)胞為 29.86士2.81pm2)，而未經(jīng)處理的老齡紅細(xì)胞(圖1 (b))，其細(xì)胞明顯比青齡細(xì) 胞小(截面積為27.56士2.26nm2)，且部分細(xì)胞有變形。本實(shí)施例處理的老齡紅細(xì)胞，以ZetaPALS電位分析儀測(cè)定的其表面Zeta 電位為-30.5mV，與正常青齡細(xì)胞的-30.2mV相近，明顯好于未處理老齡紅細(xì) 胞的-23.2mV。本實(shí)施例處理的老齡紅細(xì)胞，室溫下以動(dòng)態(tài)圖像分析法測(cè)定的其抗彎曲彈 性模量Kc為1.48xlO"9J，與正常青齡細(xì)胞的L46xlO^J相近，明顯好于未處 理老齡紅細(xì)胞的2.22xl(T19J。經(jīng)本實(shí)施例處理的老齡紅細(xì)胞，以激光共焦拉曼散射顯微鏡測(cè)得的血紅蛋 白結(jié)構(gòu)和帶氧能力與正常青齡細(xì)胞的相同，其帶氧能力比未處理老齡紅細(xì)胞的 好50%。經(jīng)上述結(jié)構(gòu)功能參數(shù)檢測(cè)表明，經(jīng)(2)所作用的老齡紅細(xì)胞，結(jié)構(gòu)與功 能都恢復(fù)到正常青齡紅細(xì)胞的水平。實(shí)施例2(1) 制備老齡紅細(xì)胞樣品。從年輕健康無(wú)吸煙史、無(wú)近期服藥史的男性 志愿者身上抽取靜脈血2ml，用肝素抗凝。用等滲PBS緩沖液洗漆(2000r/min， 5min) 3次。把洗后的紅細(xì)胞(20倍稀釋)放到己形成的非連續(xù)密度梯度液 上，2700r/min離心30min，取最底層紅細(xì)胞(即老齡紅細(xì)胞)，用PBS洗滌三 次(2000r/min， 5min)后懸浮于等滲PBS緩沖液中4"C保存?zhèn)溆谩?2) 以7V-乙酰半胱氨酸作用液作用老齡紅細(xì)胞。取0.1ml經(jīng)(1)所制 備洗滌過(guò)的老齡紅細(xì)胞，用含體積分?jǐn)?shù)為7%小牛血清的1640液稀釋到lml， 濃度約為7xl()S個(gè)/ml。再加入5(^1濃度為140pg/ml的iV-乙酰半胱氨酸作用 液(即濃度為140pg/ml的叢乙酰半胱氨酸水溶液)，在37"溫度下共育240分鐘。然后以PBS液洗滌三次(2500轉(zhuǎn)/分鐘，3分鐘)，再懸浮于等滲PBS 緩沖液中4"C保存?zhèn)溆谩?3)細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能參數(shù)檢測(cè)。取經(jīng)(2)作用的紅細(xì)胞適量，室溫下置于玻璃玻片上以顯微鏡觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)，并以動(dòng)態(tài)圖像分析法測(cè)定紅細(xì)胞的抗彎 曲彈性模量Kc;另取部分樣品，以ZetaPALS電位分析儀在37i:下測(cè)定紅細(xì) 胞表面Zeta電位，以反映紅細(xì)胞的帶電狀態(tài)。再另取部分經(jīng)(2)作用的紅細(xì) 胞樣品，以激光共焦拉曼散射顯微鏡檢測(cè)其血紅蛋白結(jié)構(gòu)與帶氧能力。如圖1所示，圖1 (d)為本實(shí)施例處理的老齡紅細(xì)胞的顯微鏡圖象，從 圖中可以看出本實(shí)施例處理的老齡紅細(xì)胞其細(xì)胞大小及形態(tài)結(jié)構(gòu)已恢復(fù)成與 正常青齡細(xì)胞(圖l(a))相似，為標(biāo)準(zhǔn)的雙凹形結(jié)構(gòu)，其截面積為28.82士2.43pm2 (青齡細(xì)胞為29.86士2.81pm2)，而未經(jīng)處理的老齡紅細(xì)胞(圖1 (b))，其細(xì) 胞明顯比青齡細(xì)胞小(截面積為27.56士2.26pm2)，且部分細(xì)胞有變形。本實(shí)施例處理的老齡紅細(xì)胞，以ZetaPALS電位分析儀測(cè)定的其表面Zeta 電位為-30.0mV，與正常青齡細(xì)胞的-30.2mV相近，明顯好于未處理老齡紅細(xì) 胞的-23.2mV。本實(shí)施例處理的老齡紅細(xì)胞，以動(dòng)態(tài)圖像分析法測(cè)定的其抗彎曲彈性模量 Kc為1.51xl(T19J，與正常青齡細(xì)胞的1.46xl(X19J相近，明顯好于未處理老齡 紅細(xì)胞的2.22xl0"9j。經(jīng)本實(shí)施例處理的老齡紅細(xì)胞，以激光共焦拉曼散射顯微鏡測(cè)得的血紅蛋 白結(jié)構(gòu)和帶氧能力與正常青齡細(xì)胞的相同，其帶氧能力比未處理老齡紅細(xì)胞的 好47%。經(jīng)上述結(jié)構(gòu)功能參數(shù)檢測(cè)表明，(2)所作用的老齡紅細(xì)胞，結(jié)構(gòu)與功能都 恢復(fù)到正常青齡紅細(xì)胞的水平。實(shí)施例3(1)制備老齡紅細(xì)胞樣品。從年輕健康無(wú)吸煙史、無(wú)近期服藥史的男性 志愿者身上抽取靜脈血2ml，用肝素抗凝。用等滲PBS緩沖液洗滌(2000r/min， 5min) 3次。把洗后的紅細(xì)胞(20倍稀釋)放到已形成的非連續(xù)密度梯度液上， 2700r/min離心30min，取最底層紅細(xì)胞(即老齡紅細(xì)胞)，用PBS洗滌三次 (2000r/min， 5min)后懸浮于等滲PBS緩沖液中4'C保存?zhèn)溆谩?2) 以唾液酸作用液作用老齡紅細(xì)胞。取0.1ml經(jīng)(1)所制備洗滌過(guò)的 老齡紅細(xì)胞，用含體積分?jǐn)?shù)為10%小牛血清的1640液稀釋到lml,濃度約^ 5xl()S個(gè)/ml。再加入50(xl濃度為40pg/ml的唾液酸作用液(即濃度為40ng/扭 的唾液酸水溶液)，在37。C溫度下共育30分鐘。然后以PBS液洗滌三次(1500 轉(zhuǎn)/分鐘，6分鐘)，再加懸浮于等滲PBS緩沖液中4"C保存?zhèn)溆谩?3) 細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能參數(shù)檢測(cè)。取經(jīng)(2)作用的紅細(xì)胞適量，室溫下置于 玻璃玻片上并以顯微鏡觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)，并以動(dòng)態(tài)圖像分析法測(cè)定紅細(xì)胞的抗 彎曲彈性模量Kc;另取部分樣品，以測(cè)定其變形濾過(guò)毛細(xì)血管的能力；再另 取部分樣品，以Zeta PALS電位分析儀測(cè)定紅細(xì)胞表面Zeta電位，以反映紅 細(xì)胞的帶電狀態(tài)。再另取部分經(jīng)(2)作用的紅細(xì)胞樣品，以激光共焦拉曼散 射顯微鏡檢測(cè)其血紅蛋白結(jié)構(gòu)與帶氧能力。如圖1所示，圖1 (e)為本實(shí)施例處理的老齡紅細(xì)胞的顯微鏡圖象，從 圖中可以看出本實(shí)施例處理的老齡紅細(xì)胞其細(xì)胞大小及形態(tài)結(jié)構(gòu)已恢復(fù)成與 正常青齡細(xì)胞(圖l(a))相似，為標(biāo)準(zhǔn)的雙凹形結(jié)構(gòu)，其截面積為30.01±3.03|mi2 (青齡細(xì)胞為29.86士2.81nm2)，而未經(jīng)處理的老齡紅細(xì)胞(圖1 (b))，其細(xì) 胞明顯比青齡細(xì)胞小(截面積為27.56士2.26pm2)，且部分細(xì)胞有變形。本實(shí)施例處理的老齡紅細(xì)胞，以ZetaPALS電位分析儀測(cè)定的其表面Zeta 電位為-30.4mV，與青齡細(xì)胞的-30.2111￥相近，明顯好于未處理老齡紅細(xì)胞的 -23.2 mV。本實(shí)施例處理的老齡紅細(xì)胞，以動(dòng)態(tài)圖像分析法測(cè)定的其抗彎曲彈性模量 Kc為1.45xlO—19J，與正常青齡細(xì)胞的1.46xl0—wj相近，明顯好于未處理老齡 紅細(xì)胞的2.22x1 (T19J。經(jīng)本實(shí)施例處理的老齡紅細(xì)胞，以微管吸吮實(shí)驗(yàn)測(cè)得的通過(guò)l拜內(nèi)徑微 管的時(shí)間與青齡細(xì)胞的無(wú)顯著性差異，比未處理老齡紅細(xì)胞的要快22%;其 以激光共焦拉曼散射顯微鏡測(cè)得的血紅蛋白結(jié)構(gòu)和帶氧能力與正常青齡細(xì)胞 的相同，其帶氧能力比未處理老齡紅細(xì)胞的好50%。經(jīng)上述結(jié)構(gòu)功能參數(shù)檢測(cè)表明，(2)所作用的老齡紅細(xì)胞，結(jié)構(gòu)與功能都 恢復(fù)到正常青齡紅細(xì)胞的水平。實(shí)施例4(1) 制備老化紅細(xì)胞(在體外儲(chǔ)存超過(guò)5天的紅細(xì)胞)樣品。將一從年 輕健康無(wú)吸煙史、無(wú)近期服藥史的男性志愿者身上抽取的全血樣品2ml，在4 'C下保存6天后，用肝素抗凝。用等滲PBS緩沖液洗滌(2000r/min， 5min) 3次備用。(2) 以唾液酸作用液作用老化紅細(xì)胞。取0.1ml經(jīng)(1)所制備洗滌分離 得到的老化紅細(xì)胞，用含體積分?jǐn)?shù)為12%小牛血清的1640液稀釋到lml，濃 度約為5xl()S個(gè)/ml。再加入濃度為30|ig/ml的唾液酸作用液。在37°。溫 度下共育30分鐘。然后以PBS液洗滌三次(1500轉(zhuǎn)/分鐘，6分鐘)，再加懸 浮于等滲PBS緩沖液中4"C保存?zhèn)溆谩?3) 細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能參數(shù)檢測(cè)。取經(jīng)(2)作用的紅細(xì)胞樣品適量，室溫下 置于玻璃玻片上并以顯微鏡觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)，并以動(dòng)態(tài)圖像分析法測(cè)定紅細(xì)胞 的抗彎曲彈性模量Kc;另取部分樣品，以Zeta PALS電位分析儀測(cè)定紅細(xì)胞 表面Zeta電位，以反映紅細(xì)胞的帶電狀態(tài)。再另取部分經(jīng)(2)作用的紅細(xì)胞 樣品，以激光共焦拉曼散射顯微鏡檢測(cè)其血紅蛋白結(jié)構(gòu)與帶氧能力。本實(shí)施例處理的在體外儲(chǔ)存超過(guò)5天的紅細(xì)胞，以ZetaPALS電位分析儀 測(cè)定的其表面Zeta電位為-30.2 mV，與同一全血樣品在新鮮未經(jīng)儲(chǔ)存情況下 分離的紅細(xì)胞的-30.2mV相近，明顯好于未經(jīng)處理的本實(shí)施例(1)制得的在 體外儲(chǔ)存超過(guò)5天的紅細(xì)胞的-26.1 mV。本實(shí)施例處理的在體外儲(chǔ)存超過(guò)5天的紅細(xì)胞，以動(dòng)態(tài)圖像分析法測(cè)定的 其抗彎曲彈性模量Kc為1.44xl(T19J，與同一全血樣品在新鮮未經(jīng)儲(chǔ)存情況下 分離的紅細(xì)胞的1.45xlO^J相近，明顯好于未經(jīng)處理的本實(shí)施例(1)制得的 在體外儲(chǔ)存超過(guò)5天的紅細(xì)胞的1.91xlO—19J。本實(shí)施例處理的在體外儲(chǔ)存超過(guò)5天的紅細(xì)胞，以激光共焦拉曼散射顯微 鏡測(cè)得的血紅蛋白結(jié)構(gòu)和帶氧能力與同一全血樣品在新鮮未經(jīng)儲(chǔ)存情況下分 離的紅細(xì)胞的相同，其帶氧能力比未處理的本實(shí)施例(1)制得的在體外儲(chǔ)存 超過(guò)5天的紅細(xì)胞的好20%。經(jīng)上述結(jié)構(gòu)功能參數(shù)檢測(cè)表明，(2)所作用的在體外儲(chǔ)存超過(guò)5天的紅細(xì) 胞，結(jié)構(gòu)與功能都恢復(fù)到新鮮紅細(xì)胞的水平。實(shí)施例5本實(shí)施例除下述特征外同實(shí)施例4:步驟(2)中以5(Hil濃度為100pg/ml 的維生素E作用液(即將維生素E用生理鹽水稀釋至濃度為100pg/ml的溶液) 代替唾液酸作用液。本實(shí)施例處理的在體外儲(chǔ)存超過(guò)5天的紅細(xì)胞的表面Zeta電位為-30.1 mV，抗彎曲彈性模量Kc為1.46xlO—19J，其帶氧能力比未處理的在體外儲(chǔ)存超 過(guò)5天的紅細(xì)胞的好25%，表明經(jīng)過(guò)本實(shí)施例處理的儲(chǔ)存一定時(shí)間的紅細(xì)胞 的結(jié)構(gòu)與功能都恢復(fù)到新鮮青齡紅細(xì)胞的水平。實(shí)施例6本實(shí)施例除下述特征外同實(shí)施例4:步驟(2)中50^1濃度為120pg/ml 的7V-乙酰半胱氨酸作用液(即濃度為120^ig/ml的7V-乙酰半胱氨酸水溶液)。本實(shí)施例處理的在體外儲(chǔ)存超過(guò)5天的紅細(xì)胞的表面Zeta電位為-30.3 mV，抗彎曲彈性模量Kc為1.47xl(T19J，其帶氧能力比未處理的在體外儲(chǔ)存超 過(guò)5天的紅細(xì)胞的好35%，表明經(jīng)過(guò)本實(shí)施例處理的儲(chǔ)存一定時(shí)間的紅細(xì)胞 的結(jié)構(gòu)與功能都恢復(fù)到新鮮青齡紅細(xì)胞的水平。實(shí)施例7本實(shí)施例除下述特征外同實(shí)施例1:步驟(2)中維生素E作用液濃度為 180嗎/ml的(即將維生素E用生理鹽水稀釋至濃度為18(Hig/ml的溶液)。本實(shí)施例處理的老齡紅細(xì)胞的表面Zeta電位為-30.3 mV，抗彎曲彈性模 量Kc為1.46xl(T19J，其帶氧能力比未處理的老齡紅細(xì)胞的好50%，表明經(jīng)過(guò) 本實(shí)施例處理的老齡紅細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能都恢復(fù)到正常青齡紅細(xì)胞的水平。實(shí)施例8本實(shí)施例除下述特征外同實(shí)施例2:步驟(2)中AT-乙酰半胱氨酸作用液 的濃度為150|ug/ml (即濃度為150|ig/ml的7V-乙酰半胱氨酸水溶液)。本實(shí)施例處理的老齡紅細(xì)胞的表面Zeta電位為-29.9 mV，抗彎曲彈性模 量Kc為1.50xlO"9J，其帶氧能力比未處理的老齡紅細(xì)胞的好45%，表明經(jīng)過(guò) 本實(shí)施例處理的老齡紅細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能都恢復(fù)到正常青齡紅細(xì)胞的水平。實(shí)施例9本實(shí)施例除下述特征外同實(shí)施例3:步驟(2)中唾液酸作用液的濃度為 45pg/ml (即濃度為45pg/ml的唾液酸水溶液)。本實(shí)施例處理的老齡紅細(xì)胞的表面Zeta電位為-30.1 mV，抗彎曲彈性模 量Kc為1.46xl(T19J，其帶氧能力比朱處理的老齡紅細(xì)胞的好50%，表明經(jīng)過(guò) 本實(shí)施例處理的老齡紅細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能都恢復(fù)到青齡紅細(xì)胞的水平。實(shí)施例10(1) 制備貧血紅細(xì)胞樣品。從臨床診斷為貧血的男性志愿者身上抽取靜 脈血2ml，用肝素抗凝。用等滲PBS緩沖液洗滌(2000r/min， 5min) 3次后備用。(2) 以唾液酸作用液作用老齡紅細(xì)胞。取0.1ml經(jīng)(1)所制備洗滌過(guò)的 貧血紅細(xì)胞，用含體積分?jǐn)?shù)為10%小牛血清的1640液稀釋到lml，濃度約為 5xl()S個(gè)/ml。再加入50fxl濃度為50pg/ml的唾液酸作用液(即濃度為50ng/ml 的唾液酸水溶液)，在37。C溫度下共育30分鐘。然后以PBS液洗滌三次(1500 轉(zhuǎn)/分鐘，6分鐘)，再加懸浮于等滲PBS緩沖液中4"C保存?zhèn)溆谩?3) 細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能參數(shù)檢測(cè)。取經(jīng)步驟(2)作用的紅細(xì)胞適量，室溫下 置于玻璃玻片上并以顯微鏡觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)，并以動(dòng)態(tài)圖像分析法測(cè)定紅細(xì)胞 的抗彎曲彈性模量Kc;再另取部分樣品，以Zeta PALS電位分析儀測(cè)定紅細(xì) 胞表面Zeta電位，以反映紅細(xì)胞的帶電狀態(tài)。再另取部分經(jīng)步驟(2)作用的 紅細(xì)胞樣品，以激光共焦拉曼散射顯微鏡檢測(cè)其血紅蛋白結(jié)構(gòu)與帶氧能力。本實(shí)施例處理的貧血紅細(xì)胞，以ZetaPALS電位分析儀測(cè)定的其表面Zeta 電位為-29.6mV，與正常紅細(xì)胞的-30.2mV相近，明顯好于未經(jīng)處理的本實(shí)施 例1制得的貧血紅細(xì)胞的-21.3mV。本實(shí)施例處理的貧血紅細(xì)胞，以動(dòng)態(tài)圖像分析法測(cè)定的其抗彎曲彈性模量 Kc為1.49xl(T19J，與正常紅細(xì)胞的1.45xl(T19J相近，明顯好于未經(jīng)處理的本 實(shí)施例1制得的貧血紅細(xì)胞的1.88xl(T19J。本實(shí)施例處理的貧血紅細(xì)胞，以激光共焦拉曼散射顯微鏡測(cè)得的血紅蛋白 結(jié)構(gòu)和帶氧能力與正常紅細(xì)胞的相同，其帶氧能力比未處理的本實(shí)施例1制得 的貧血紅細(xì)胞的好32%。經(jīng)上述結(jié)構(gòu)功能參數(shù)檢測(cè)表明，經(jīng)步驟(2)所作用的貧血紅細(xì)胞，結(jié)構(gòu) 與功能都恢復(fù)到正常青齡紅細(xì)胞的水平實(shí)施例11本實(shí)施例除下述特征外同實(shí)施例10:但步驟(2)中采用7V-乙酰半胱氨酸 作用液，其濃度為14(Hig/ml (即濃度為140ng/ml的7V-乙酰半胱氨酸水溶液)。本實(shí)施例處理的貧血紅細(xì)胞的表面Zeta電位為-29.2 mV，抗彎曲彈性模 量Kc為1.51xl(T19J，其帶氧能力比未處理的貧血紅細(xì)胞的好30%，表明經(jīng)過(guò) 本實(shí)施例處理的貧血紅細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能都恢復(fù)到正常青齡紅細(xì)胞的水平。實(shí)施例12本實(shí)施例除下述特征外同實(shí)施例10:步驟(2)中采用維生素E作用液， 其濃度為45|ug/ml (即濃度為45pg/ml的維生素E水溶液)。本實(shí)施例處理的貧血紅細(xì)胞的表面Zeta電位為-30.1 mV，抗彎曲彈性模 量Kc為1.48xl(T19J，其帶氧能力比未處理的貧血紅細(xì)胞的好33%，表明經(jīng)過(guò) 本實(shí)施例處理的貧血紅細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能都恢復(fù)到正常青齡紅細(xì)胞的水平。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí) 施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、 替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1、一種用于恢復(fù)紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的生物技術(shù)方法，其特征在于以抗氧化物或唾液酸作用于老化或病態(tài)紅細(xì)胞后得到結(jié)構(gòu)與功能都恢復(fù)到正常青齡紅細(xì)胞水平的紅細(xì)胞。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于恢復(fù)紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的生物技術(shù)方法， 其特征在于所述抗氧化物為維生素E或W-乙酰半胱氨酸。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所迷的用于恢復(fù)紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的生物技術(shù)方法，其特征在于具體包括下述步驟首先取一定量老化或病態(tài)紅細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋制成濃度為5"08個(gè)/毫升 7><108個(gè)/毫升的紅細(xì)胞懸浮液，然后按每毫 升紅細(xì)胞懸浮液加入1.5 10|ig的維生素E或iV-乙酰半胱氨酸或唾液酸的比 例，加入含維生素E或7V-乙酰半胱氨酸或唾液酸的作用液，在 37"C溫度下共 育30 240分鐘，然后用磷酸鹽緩沖液洗滌，將洗后的紅細(xì)胞懸浮于等滲磷酸 鹽緩沖液中即可得到結(jié)構(gòu)與功能都恢復(fù)到正常青齡紅細(xì)胞水平的紅細(xì)胞。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的用于恢復(fù)紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的生物技 術(shù)方法，其特征在于所述老化紅細(xì)胞包括老齡紅細(xì)胞或在體外儲(chǔ)存超過(guò)5天 以上的紅細(xì)胞。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的用于恢復(fù)紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的生物技 術(shù)方法，萁特征在于所述病態(tài)紅細(xì)胞為各種貧血紅細(xì)胞。
6、 裉裙權(quán)利要求3所述的用于恢復(fù)紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的生物技術(shù)方法， 其特征在于所述細(xì)胞培養(yǎng)液為含體積分?jǐn)?shù)為7 12%小牛血清的1640液。
7、 根據(jù)fe利要求3所述的用于恢復(fù)紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的生物技術(shù)方法， 其特征在于所述含維生素E的作用液為將維生素E用生理鹽水稀釋至濃度為 100pg/ml 200iLig/ml的溶液。
8、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于恢復(fù)紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的生物技術(shù)方法， 其特征在于所述含W-乙酰半胱氨酸的作用液是濃度為100pg/ml 20(^g/ml 的AA-乙酰半胱氨酸水溶液。
9、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于恢復(fù)紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的生物技術(shù)方法， 其特征在于所述含唾液酸的作用液是濃度為30|ig/ml 45ng/ml的唾液酸水溶 液。
10、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于恢復(fù)紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的生物技術(shù)方法，其特征在于所述洗滌是在離心機(jī)中在1500 2500轉(zhuǎn)/分鐘條件下洗滌3 6分 姊
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于恢復(fù)紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的生物技術(shù)方法，主要是以抗氧化物或唾液酸作用于老化或病態(tài)紅細(xì)胞后得到結(jié)構(gòu)與功能都恢復(fù)到正常青齡紅細(xì)胞水平的紅細(xì)胞。本發(fā)明方法步驟簡(jiǎn)單，操作安全方便，可使老化或病態(tài)紅細(xì)胞的表面電荷恢復(fù)至正常青年人的青齡紅細(xì)胞的水平，從而恢復(fù)其結(jié)構(gòu)與功能而不會(huì)對(duì)紅細(xì)胞產(chǎn)生不良影響。
文檔編號(hào)C12N5/08GK101230332SQ20081002628
公開日2008年7月30日 申請(qǐng)日期2008年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月3日
發(fā)明者黃耀熊 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)