專利名稱：：一種地衣芽孢桿菌及其利用污泥為原料生產(chǎn)堿性蛋白酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新菌種篩選以及酶制劑生產(chǎn)領(lǐng)域，具體來說，涉及一種地衣芽孢桿菌及其利用城市污泥作為發(fā)酵原料生產(chǎn)堿性蛋白酶的方法。技術(shù)背景城市污泥是污水處理過程中產(chǎn)生的沉淀物，含有大量的有機物、豐富的氮磷等物質(zhì)以及病原菌等，是重要的環(huán)境污染源。目前，我國城市污泥年產(chǎn)生量約800萬噸干重，并且隨著污水處理廠的增加和污水處理率的提高，產(chǎn)生量將日益龐大。如何妥善地處置污水廠污泥，防止其二次污染，并將其作為一種有用資源加以利用，變廢為寶，具有十分重要的意義。目前，城市污泥的處置途徑主要有填埋、焚燒和土地利用等。但它們都存在著各自難以克服的弱點。事實上，污泥中含有大量的有機質(zhì)和豐富的氮、磷等營養(yǎng)元素，可以滿足微生物生長和增殖的需要。據(jù)檢索，已有利用城市污泥為原料發(fā)酵生產(chǎn)微生物農(nóng)藥、生物氫與乳酸等的報道。堿性蛋白酶是目前世界上最重要的工業(yè)酶制劑，主要用于加酶洗滌劑工業(yè)，在制革、絲綢、伺料、醫(yī)藥與環(huán)保等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，其產(chǎn)量約占整個酶制劑的25%。堿性蛋白酶主要生產(chǎn)方式是微生物發(fā)酵，主要生產(chǎn)菌株是短小芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌等芽孢桿菌。目前，堿性蛋白酶的主流生產(chǎn)工藝為液體深層發(fā)酵，一般采用黃豆粉、淀粉、礦物質(zhì)等作為發(fā)酵原料，這些原料價格昂貴，導(dǎo)致產(chǎn)品價格較高。迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)利用城市污泥為發(fā)酵原料生產(chǎn)堿性蛋白酶的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于彌補現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，而提供一種適于城市污泥發(fā)酵的堿性蛋白酶生產(chǎn)菌株一地衣芽孢桿菌。本發(fā)明的另一個目的是提供利用上述地衣芽孢桿菌，以污泥為原料生產(chǎn)堿性蛋白酶的方法。本發(fā)明所得菌株為地衣芽孢桿菌CB""7/mfe/^m;/^m&)HM-3，為革蘭氏陽性菌，直桿狀，分離于廣州市獵德污水處理廠的濃縮污泥。2007年3月12日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCC1970。g/L是指每1L培養(yǎng)基液體中加入的目標(biāo)物的克數(shù)；%是指每100份質(zhì)量的培養(yǎng)基液體中接入接種物的質(zhì)量份數(shù)；一.本發(fā)明所得地衣芽孢桿菌由如下方法篩選得到稱取10克濃縮污泥放入裝有90mL無菌水的三角瓶中(內(nèi)有玻璃珠)，28°C、150轉(zhuǎn)/分鐘搖床振蕩培養(yǎng)15分鐘，無菌水稀釋到適當(dāng)濃度，吸取0.1mL稀釋液均勻涂布于干酪素培養(yǎng)基平板，28。C恒溫箱培養(yǎng)。待菌落長出后，在培養(yǎng)基平板上均勻涂布三氯乙酸溶液，挑取有明顯水解圈的菌落在干酪素平板反復(fù)培養(yǎng)并驗證，并進行分離純化與保存。所用干酪素培養(yǎng)基成分為干酪素20g，瓊脂粉20g，pH9.0，蒸餾水1L。此培養(yǎng)基為選擇性培養(yǎng)基，用于堿性蛋白酶菌株的篩選。所用斜面保藏培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，成分為(g/L):胰蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaC110g，pH7.4，蒸餾水1L，用于斜面菌種的保藏。二.本發(fā)明菌株具有如下形態(tài)和生理、生化特性1.形態(tài)特征地衣芽孢桿菌HM-3菌體短小、直桿狀，寬0.1-0.3,，長0.5-1.0pm;菌落為乳白色、疏松、易挑取，不透明，表面粗糙，邊緣不整齊。芽孢端生，形狀橢圓或柱狀，芽孢囊無明顯膨大。2.生理生化特性丑/z'c/^m7^7^HM-3嚴(yán)格好氧，具有運動性，革蘭氏反應(yīng)陽性，M.R和V.P反應(yīng)陽性，能水解淀粉，液化明膠；能產(chǎn)生蛋白酶，可利用丙二酸鹽，能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。經(jīng)BIOLOG微生物鑒定儀鑒定為地衣芽孢桿菌。三、本發(fā)明菌株以城市污泥培養(yǎng)基為發(fā)酵原料生產(chǎn)堿性蛋白酶，步驟如下(1)培養(yǎng)基調(diào)理調(diào)節(jié)污泥含固率為25%，加入0.10.3%泡敵，用酸或堿調(diào)pH為7.07.5，攪拌均勻，滅菌，冷卻備用；(2)搖瓶培養(yǎng)挑取一環(huán)地衣芽孢桿菌接種到裝有LB液體培養(yǎng)基中，2832°C、50250轉(zhuǎn)/分進行搖瓶培養(yǎng)1015小時；(3)發(fā)酵罐發(fā)酵按15%的接種量將搖瓶菌液移入裝有含固率為25%的污泥的發(fā)酵罐，進行發(fā)酵培養(yǎng)；(4)蛋白酶純化發(fā)酵完成后，調(diào)pH為6.07.0，濃縮制成液體劑型或凝聚、過濾制成堿性蛋白酶固體劑型；(5)產(chǎn)品質(zhì)量檢測產(chǎn)品質(zhì)量檢驗方法參照輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《洗滌劑用堿性蛋白酶制劑》(QB1806-1993)進行。在上述方法中，步驟(1)所述滅菌優(yōu)選為在0.lKPa壓力與121°C下滅菌45分鐘。在上述方法中，步驟(3)所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件優(yōu)選為罐溫2832°C、罐壓0.05MPa、通氣量1:1.0(V/V/分)、攪拌速度200轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵時間6080小時。四、本發(fā)明制備的堿性蛋白酶具有如下性質(zhì)最適作用pH為10.0，最適作用溫度40。C，在pH6.0-11.0、50r范圍內(nèi)比較穩(wěn)定；C^+能提高蛋白酶的活力，Mg2+、Na+對酶活無明顯影響，Cu2+、Hg"嚴(yán)重抑制酶活力；抑制劑EDTA對該酶酶活有明顯的抑制作用，PMSF則完全抑制該酶活性；抗氧化能力較強，與市售去污劑有較好的相容性。本發(fā)明的技術(shù)原理是從城市污泥中分離篩選的高活性堿性蛋白酶產(chǎn)生菌，利用其適于污泥生長和產(chǎn)生蛋白酶的特性，以城市污泥所含豐富的有機碳、氮和無機鹽為營養(yǎng)物質(zhì)，在適宜pH、溫度與通氣量的條件下得以生長與增殖，并向發(fā)酵液中分泌堿性蛋白酶，發(fā)酵液經(jīng)一定的處理制成堿性蛋白酶產(chǎn)品。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果(1)從城市污泥中篩選高效堿性蛋白酶產(chǎn)生菌，即地衣芽孢桿菌HM-3，該菌株直接來源于污泥，適于在污泥環(huán)境中生長增殖，在污泥中菌數(shù)多、產(chǎn)酶效率高。(2)與現(xiàn)有污泥處置技術(shù)相比，利用本發(fā)明的菌株生產(chǎn)堿性蛋白酶，不僅可處置污泥，而且可獲得附加值高、成本較低的堿性蛋白酶產(chǎn)品。(3)與現(xiàn)有的堿性蛋白酶生產(chǎn)技術(shù)相比，本發(fā)明以廢棄物——城市污泥代替?zhèn)鹘y(tǒng)的糧食培養(yǎng)基生產(chǎn)堿性蛋白酶產(chǎn)品，不僅為城市污泥的資源化處置提供了嶄新的途徑，而且可以大幅度降低產(chǎn)品的價格，促進蛋白酶制劑的工業(yè)化生產(chǎn)與應(yīng)用。所得的堿性蛋白酶產(chǎn)品可應(yīng)用于洗滌、制革等行業(yè)，對環(huán)境安全無害。圖1為地衣芽孢桿菌HM-3掃描電鏡照片。具體實施方式實施例1.菌種的分離、純化稱取10克濃縮污泥放入裝有90mL無菌水的三角瓶中(內(nèi)有玻璃珠)，28°C、150轉(zhuǎn)/分鐘搖床振蕩培養(yǎng)15分鐘，無菌水稀釋到10—5，吸取O.lmL稀釋液均勻涂布于干酪素培養(yǎng)基平板，28'C恒溫箱培養(yǎng)3天。在培養(yǎng)基平板上均勻涂布三氯乙酸溶液，挑取有明顯水解圈的單菌落在干酪素平板反復(fù)培養(yǎng)，并進行分離純化與保存。所用干酪素培養(yǎng)基成分為干酪素20g，瓊脂粉20g，pH9.0，蒸餾水1L。所用斜面保藏培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，成分為(g/L):胰蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaC110g，pH7.4，蒸餾水1L。實施例2.菌種鑒定(一)生理生化特性鑒定A//c/^m/onm;HM-3生理生化特性鑒定結(jié)果見表1。表1.HM-3菌株的生理生化特性檢測項目結(jié)果檢測項目結(jié)果革蘭氏染色陽性龍膽二糖+細(xì)胞形狀直桿狀麥芽糖+細(xì)胞大小0.1-0.3x0.5-1.0,麥芽三糖+產(chǎn)色素-3-甲基-D-葡萄糖+運動性+異麥芽酮糖/帕拉金糖+菌落形態(tài)圓形D-核糖菌落大小l-2mm蔗糖+產(chǎn)氣+D-海藻糖+菌落顏色乳白色松二糖+氧化酶反應(yīng)+D-木糖+厭氧情況嚴(yán)格好氧甘油/丙三酸+a-環(huán)式糊精+胸苷+e-環(huán)式糊精+葡萄糖+注+表示可以利用；-表示不能利用(二)BIOLOG鑒定自動微生物鑒定儀(BIOLOG)的鑒定結(jié)果表明，HM-3為地衣芽孢桿菌(S""7/船ftc&m/wm&)。地衣芽孢桿菌HM-3掃描電鏡照片見圖1。實施例3.地衣芽孢桿菌HM-3以污泥為原料發(fā)酵生產(chǎn)堿性蛋白酶(1)培養(yǎng)基調(diào)理調(diào)節(jié)城市污泥含固率為3%，加入0.2%泡敵，并用NaOH調(diào)pH為7.0，攪拌均勻，O.lKPa壓力與12rC下滅菌45分鐘，冷卻備用。(2)搖瓶培養(yǎng)從HM-3斜面培養(yǎng)基上挑取一環(huán)菌苔接種到裝有LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30°C、100轉(zhuǎn)/分進行搖瓶培養(yǎng)12h。(3)發(fā)酵以3%的接種量將搖瓶菌液移入裝有含固率為3%的污泥的發(fā)酵罐，進行發(fā)酵培養(yǎng)。條件為罐溫3(TC、罐壓0.005MPa、通氣量1:1.0(V/V/分)、攪拌速度200轉(zhuǎn)/分、發(fā)酵時間64小時。(4)蛋白酶純化發(fā)酵完成后，調(diào)pH為7.0，通過凝聚、過濾制成堿性蛋白酶固體劑型。(5)產(chǎn)品質(zhì)量檢測產(chǎn)品質(zhì)量檢驗方法參照輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《洗滌劑用堿性蛋白酶制劑》(QB1806-1993)進行。檢驗結(jié)果表明，該蛋白酶制劑符合符合堿性蛋白酶的質(zhì)量要求，產(chǎn)品合格。實施例4.堿性蛋白酶性質(zhì)測定采用實施例3發(fā)酵方法進行發(fā)酵。發(fā)酵完成后，取樣，3000-6000轉(zhuǎn)/分離心15min，上清液即為粗酶液。用pH10.5的硼砂-NaOH緩沖液稀釋酶液，加入各種金屬離子及抑制劑混勻，使金屬離子及抑制劑達(dá)到所需的濃度，于4(TC水浴保溫10min，測定剩余蛋白酶酶活。以不加金屬離子為對照。結(jié)果見表2，表明<^2+能提高蛋白酶的活力，Mg2+、Na+對酶活無明顯影響，Cu2+、Hg"嚴(yán)重抑制酶活；抑制劑EDTA對酶活有明顯的抑制作用，PMSF則完全抑制酶活性。表2金屬離子及抑制劑對酶活力的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>權(quán)利要求1.一種地衣芽孢桿菌，為革蘭氏陽性菌，直桿狀，于2007年3月12日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCC1970。2.利用權(quán)利要求1所述地衣芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶的方法，其特征在于包括如下步驟(1)培養(yǎng)基調(diào)理調(diào)節(jié)污泥含固率為25%，加入0.10.3%泡敵，用酸或堿調(diào)pH為7.07.5，攪拌均勻，滅菌，冷卻備用；(2)搖瓶培養(yǎng)挑取一環(huán)地衣芽孢桿菌接種到裝有LB液體培養(yǎng)基中，2832°C、50250轉(zhuǎn)/分搖瓶培養(yǎng)1015小時；(3)發(fā)酵罐發(fā)酵按15%的接種量將搖瓶菌液移入裝有含固率為25%的污泥的發(fā)酵罐，進行發(fā)酵培養(yǎng)；(4)蛋白酶純化發(fā)酵完成后，調(diào)pH為6.07.0，濃縮制成液體劑型或凝聚、過濾制成堿性蛋白酶固體劑型。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)所述滅菌為在O.lKPa壓力與121。C下滅菌45分鐘。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)所述LB液體培養(yǎng)基配方為酵母浸膏5g，胰蛋白胨10g，NaC15g，水1000mL，pH7.27.6。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件為罐溫2832。C，發(fā)酵時間6080小時。全文摘要本發(fā)明公開了一種地衣芽孢桿菌及其利用污泥為原料生產(chǎn)堿性蛋白酶的方法。地衣芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，直桿狀，保藏編號為CGMCC1970。利用地衣芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶的方法，包括(1)培養(yǎng)基調(diào)理；(2)搖瓶培養(yǎng)；(3)發(fā)酵罐發(fā)酵；(4)蛋白酶純化。利用本發(fā)明的菌株生產(chǎn)堿性蛋白酶，不僅可處置污泥，而且可獲得附加值高、成本較低的堿性蛋白酶產(chǎn)品。本發(fā)明以廢棄物城市污泥代替?zhèn)鹘y(tǒng)的糧食培養(yǎng)基生產(chǎn)堿性蛋白酶產(chǎn)品，不僅為城市污泥的資源化處置提供了嶄新的途徑，而且可以大幅度降低產(chǎn)品的價格，促進蛋白酶制劑的工業(yè)化生產(chǎn)與應(yīng)用。文檔編號C12N1/20GK101245327SQ20081002681公開日2008年8月20日申請日期2008年3月14日優(yōu)先權(quán)日2008年3月14日發(fā)明者周順桂,王躍強,雷發(fā)懋申請人:廣東省生態(tài)環(huán)境與土壤研究所