專利名稱：食蟹猴的p450 2c9藥物代謝酶及其與食蟹猴p450氧化還原酶的共表達(dá)重組載體的制作方法
食蟹猴的P450 2C9藥物代謝酶及其與食蟹猴P450氧化還原酶的共表達(dá)重組載體 駄領(lǐng)域本發(fā)明涉及基因工程研究領(lǐng)域，具體涉及一種食蟹猴(Cynomolgus Monkey, Macaca /asda//aris)的P450 2C9藥物代謝酶(Cytochrome P450 2C9)及其與P450氧化還原酶 (NADPH"Cytochrome P450 oxidoreductae)的共表達(dá)重組載體。背景駄細(xì)胞色素P450是重要的藥物代謝I相酶，市場上80%以上的藥物是通過細(xì)胞色素P450代謝的。 2C亞家族是細(xì)胞色素P450基因家庭的主要成員，主要包括2C8、 2C9及2C18幾個成員。細(xì)胞色素 P450 2C9能夠代謝多種藥物如雙氯芬酸(Diclofenac)、甲苯磺丁脲(Tolbutamide)、華法林 ((s)-(+warfarin)等。目前，包括人，狗，大鼠，小鼠等多種動物的細(xì)胞色素P450基因序列已經(jīng)被 克隆，各種細(xì)胞色素P450也已經(jīng)在大腸桿菌，酵母，哺乳動物細(xì)胞等宿主中表達(dá)。異源表達(dá)的細(xì) 胞色素P450是研究藥物代謝，進(jìn)行體外藥物篩選的重要手段。食蟹猴是常用的臨床前安全性評價 實驗大動物，其與人的親緣關(guān)系非常接近，因而在代謝上表現(xiàn)出較高的相似性。到目前為止，仍 未見，猴與人P450 2C9亞型相應(yīng)的基因的克隆的報道。因此，克,蟹猴P450 2C9基因并進(jìn) 行異源表達(dá)對于體外藥物篩選有重要意義。P450酶在催化反應(yīng)中需要兩個電子和兩個質(zhì)子，其中的電子由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的NADPH(還原型煙酰 胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鹽，還原型輔酶II)-細(xì)胞色素P450氧化還原酶(NADPH-cytochrome P450 oxidoreductae)提供。在體外反應(yīng)中，缺少NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原酶的系統(tǒng)不具有催化 活性。到目前為止，將，猴P450 2C9與食蟹猴P450氧化還原酶基因共表達(dá)還未見報道。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于llt共一種食蟹猴的P450 2C9藥物代謝酶及其與食蟹猴P450氧化還原酶的 共表達(dá)重組載體。克隆食蟹猴P450 2C9基因(cj^2C9)并在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行異源表達(dá)；還包括克隆 猴NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原酶基因，構(gòu)建包含NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原酶的食 蟹猴P450 2C9(c/p 2C9)的昆蟲表達(dá)載體，并將此載體用于大難U備，猴P450 2C9的代謝物。 本發(fā)明通過以下方式達(dá)到該目的本發(fā)明的食蟹猴(Cynomolgus Monkey, Macaca加cfcM/oris)的P450 2C9藥物代謝酶 (Cytochrome P450 2C9)，能催化雙氯芬酸(Diclofenac)的4'-羥基化(4'-hydroxy )、甲苯磺丁脲 (Tolbutamide)的4'-羥基化(4'-hydroxy)和華法彬(s)-(-)-warfarin)的7'-羥基化(7，-hydroxy)。根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的人P450基因序列(Genebank， Accession NO. : NM—000771)，以逆轉(zhuǎn)錄自食 蟹 RNA的cDNA為模板，ffiii聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增食蟹猴P450 2C9的編碼區(qū)序列(cj^ 2C9)，擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與pMD 18-T載體連接得到pT-cynoP2C9質(zhì)粒。其中，設(shè)計的弓吻不包 含除起始密碼(ATG)夕卜的食蟹猴P450 2C9的編碼區(qū)序列(c^2C9)。經(jīng)測序，得到的編碼區(qū)序列 全長1473 M對，編碼491個氨基酸。即P450 2C9藥物代謝酶的基因序列或其互補(bǔ)序列是與SEQ ID NO: 1的突變率為0-1%的序列。本發(fā)明的食蟹猴的P450 2C9藥物代謝酶與P450氧化還原酶(NADPH《ytochrome P450 oxiteductae)共表達(dá)的重組載體包含上述食蟹猴的P450 2C9藥物代謝酶序列的開放閱讀框和食蟹 猴P450氧化還原酶序列的開放閱讀框。以戰(zhàn)克隆的條猴P450 2C9的基因(wp2C9)為模板， 以包含RsrII及HindIII限制性內(nèi)切酶位點的引物擴(kuò)增食蟹猴P450 2C9的編碼區(qū)序歹ij(cyp 2C9) 并定向插入昆蟲表達(dá)載體pFastBac-Dual的RsrII及HindIII酶切位點之間，得到pFB-cynoP2C9 表達(dá)載體。按照Bac-to-Bac中表達(dá)食蟹猴P450 2C9蛋白。異源表達(dá)的食蟹猴P450 2C9蛋白可以 用作體外篩選，測試藥物的代謝性質(zhì)。根據(jù)己經(jīng)發(fā)表的人NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原酶基因序列(Genebank， Accession N0.: NM_000941)，以逆轉(zhuǎn)錄自食蟹MRNA的cDNA為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)從擴(kuò)增食蟹 猴P450氧化還原麟因的編碼區(qū)序列。其中，設(shè)計的弓卿不包含除起始密碼(ATG)外的錢猴 P450 2C9的編碼區(qū)序列。經(jīng)測序，得到的編碼區(qū)序列錄2034個堿基對，編碼677個氨基酸。 即所述P450氧化還原酶的序列或其互補(bǔ)序列如SEQ ID N0: 2。以上述克隆的食蟹猴NADPH-細(xì)胞 色素P450氧化還原,因為模板，以包含BbsI及NsiI限制性內(nèi)切酶位點的引物擴(kuò)增食蟹猴NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原酶的編碼區(qū)序列并定向插入昆蟲表達(dá)載體pFastBac-Dual的Bbsl及Nsil 酶切位點之間，得到pFB-cynoP0R表達(dá)載體。在sf_9昆蟲細(xì)胞中表達(dá)^S猴NADPH-P450氧化還 原酶。異源表達(dá)的食蟹猴NADPH-P450氧化還原酶可以用作體外篩選，測試藥物的代謝性質(zhì)。所述的重組載體還含有桿狀病毒基因，能感染包括sf-9在內(nèi)的昆蟲細(xì)胞，被感染的昆蟲細(xì)胞 至少倉,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上異源表達(dá)權(quán)利要求1所述的P450 2C9藥物代謝酶。本發(fā)明的有益效果在于，分離的食蟹猴P450 2C9基因(^々2C9)可以MM基因工程的手段在多 種宿主中異源表達(dá)。異源表達(dá)的蛋白僅代表2C9這一亞型，因此其代謝活性也僅反映該亞型的活 性。此外，本發(fā)明提供同是來源于^II猴的NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原酶，與使用其他種屬的 氧化還原酶構(gòu)建的體外檢測系統(tǒng)相比，用這一氧化還原酶構(gòu)建的系統(tǒng)顯然更接近于食蟹猴體內(nèi)代 謝的真實情況。


圖1是食蟹猴P450 2C9基因(c/p 2C9)的RT-PCR結(jié)果圖。 圖2是pFB-cynoP2C9的PCR鑒定結(jié)果圖。 圖3是重組，猴P450 2C9桿狀病毒的PCR鑒定結(jié)果圖。 圖4是食蟹猴P450氧化還原酶的RT-PCR結(jié)果圖。 圖5是pFB-DU-cynoP2C9-0R重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果圖。 圖6是pFB-DU-cynoP2C9-0R重組bacmid的PCR鑒定結(jié)果圖。 圖7是食蟹猴P450 2C9體外催化雙氯芬酸反應(yīng)LC/MS圖譜圖。 具體實 式實施例1.食蟹猴藥物代謝酶P450 2C9基因(c/p 2C9)的克隆根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的人P450 2C9基因序列(Genebank, Accession NO. :NM_000771)，設(shè)計引物 引物l: 5' -ATGGATTCTCTTGTGGTC-3' 引物2: 5, "CTTCMACAGGAATGMGCAC-3'以逆轉(zhuǎn)錄自食蟹猴肝RNA的cDNA為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)從擴(kuò)增食蟹猴P450 2C9 的編碼區(qū)序列(cyp 2C9)，擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與pMD 18-T載體連接得到pT-cynoP2C9質(zhì)粒。其 中，設(shè)計的引物不包含除起始密碼(ATG)外的，猴P450 2C9的編碼區(qū)序歹iKcp2C9)。經(jīng)測序， 得到的編碼區(qū)序列全長1473堿基對，編碼491個氨基酸。圖1是食蟹猴P450 2C9基因(c// 2C9) 的RT-PCR結(jié)果圖，Lane 1: Marker DL2000 (由上至下條帶大小分別為；2000bp， 1000bp， 750bp， 500bp， 200bp， 100bp)， Lane 2: RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其大小約為1520bp。圖2是pFB-cynoP2C9 的PCR鑒定結(jié)果圖，Lane 1， 2， 4, 5: 4個pFB-cynoP2C9單皿，主帶大小約為1520bp;Lane 3: Marker DL2000。實施例2.，猴藥物代謝酶P450 2C9昆蟲表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu),表達(dá)以上述克隆的食蟹猴P450 2C9的基因(c^ 2C9)為模板，設(shè)計包含RsrII及HindIII限制性 內(nèi)切謝立點的引物引物3: 5， - TGTCGGTCCGATGGATTCTCTTGTGGTC _3， 引物4: 5， — CGCMGCTTCAAACAGGAATGMGCAC -3，PCR擴(kuò)增，猴P450 2C9的編碼區(qū)序列(cyp 2C9)并定向插入昆蟲表達(dá)載體pFastBac-Dual 的RsrII及HindIII酶切位點之間，得到pFB-cynoP2C9表達(dá)載體。測序以確定基因正確插入載體 中o按照Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Instruction Manual (由irwitrogen公司 Jli共)操作，在sf-9昆蟲細(xì)胞中表達(dá)食蟹猴P450 2C9蛋白。簡單來說，用，構(gòu)建的pFB-cynoP2C9 質(zhì)粒轉(zhuǎn)DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，PCR鑒定陽性克隆，從陽性克隆中提取重組桿狀病泉用Cellfectin 試劑轉(zhuǎn)染sf-9昆蟲細(xì)胞獲得重組病毒，在多次反復(fù)感染后獲得高滴度的病毒，病毒感染的sf-9 細(xì)胞即能皿食蟹猴P450 2C9蛋白。圖3是重組食蟹猴P450 2C9桿狀病毒的PCR鑒定結(jié)果圖， Lane 1: Marker DL15000(由上至下條帶的大小依次為15000bp, 10000bp， 7500bp, 5000bp， 2500bp， 1000bp, 250bp); Lane 2-4: 3個轉(zhuǎn)化單菌落的PCR結(jié)果，條帶的大小約為4000bp。實施例3.食蟹猴NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原^S因的克隆根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的人NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原酶基因序列(Genebank， Accession NO.:NM—000941)，設(shè)計如下引物(引物5和引物6): 引物5: 5， - ATGATCAACATGGGAGACTCCC -3， 引物6: 5， - CTAGCTCCACACGTCCAGGG -3，以逆轉(zhuǎn)錄自食蟹 RNA的cDNA為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從擴(kuò)增，猴NADPH-細(xì)胞色素 P450氧化還原麟因的編碼區(qū)序歹i」。將得到的PCR產(chǎn)物與pMD 18-T載體連接得到pT-cynoPOR質(zhì) 粒。經(jīng)測序，得到的編碼區(qū)序列全長2034個堿基對，編碼677個氨基酸。圖4是維猴P450氧 化還原酶的RT-PCR結(jié)果圖，Lanel:MarkerDL2000 (由上至下條帶大小分別為；2000bp， 1000bp, 750bp， 500bp， 200bp， 100bp); Lane 2: RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，條帶的大小約為2100bp。實施例4.共表達(dá)食蟹猴P450 2C9及其NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原酶的表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建以上述克隆的食蟹猴NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原HS因為模板，設(shè)計包含Bbsl及Nsil限制性 內(nèi)切^^立點的引物(弓卿7和引物8):引物7: 5， - GMGACTTGATCATGATCMCATGGGAGACTC-3，引物8: 5' -TTATGCATCTAGCTCCACACGTCCAG-3'PCR擴(kuò)增維猴NADPH-細(xì)胞色素P450氧艦原麟因的編碼區(qū)序列并定向插入昆蟲表達(dá)載體 pFastBac Dual的Bbsl及Nsil酶切位點之間，得到pFB-Du-OR重組質(zhì)粒。然后，將pFB-cynoP2C9 載體的RsrII及HindIII酶切片段定向插入昆蟲表達(dá)載體pFastBac Dual的RsrII及HindIII位 點，得到pFB-DU-cynoP2C9-0R載體。按照操作手冊操作，獲得能感染昆蟲細(xì)胞的病毒。圖5是 pFB-DU-cynoP2C9-OR重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果圖，Lane 1: pFB-DU-cynoP2C9-OR重組質(zhì)粒經(jīng)BbsI， Nsil雙酶切產(chǎn)物;Lane 2: Marker DL2000; Lane 3: pFB-DU_cynoP2C9-OR重組質(zhì)粒經(jīng)RsrII， HindIII 雙酶切產(chǎn)物。圖6是pFB-DU-cynoP2C9-0R重組桿狀病毒的PCR鑒定結(jié)果圖，Lane 1-4: 4個 pFB-DU-cynoP2C9-OR重組桿狀病毒的PCR結(jié)果；條帶大小為6000bp， Lane 2: Marker DL15000, 由上至下條帶大小分別為(由上至下條帶的大小依次為15000bp, lOOOObp， 7500bp， 5000bp, 2500bp, lOOObp， 250bp)。實施例5. sf-9昆蟲細(xì)胞重組表達(dá)的食蟹猴P450 2C9的代謝雙氯芬酸活性領(lǐng)啶用制備的含有食蟹猴P450 2C9基因(c/p2C9)的桿狀病毒以MOI (multiplicity of infection) =3感染培養(yǎng)到指數(shù)期的sf-9細(xì)胞，并在感染后2-3日收集細(xì)胞；以磷酸鹽緩沖液將收集的sf-9 細(xì)胞勻漿；以差速離心法離心制 [粒體；以磷酸鹽緩沖液t懸微粒鄉(xiāng)淀，用BCA法測定蛋白 含量，用一氧化碳結(jié)合法測定P450含量;將上述微粒與系列稀釋的雙氯芬酸混合物置于反應(yīng)管中， 同時加入相應(yīng)量的NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原酶，水浴。力卩40 10 mM NADPH溶液啟動 反應(yīng)。8辦巾反應(yīng)后加0.8 mL含內(nèi)標(biāo)的反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，混勻后置于冰水；上述各反應(yīng)管離 心，^Lb凊加入到96孔板進(jìn)樣板，g^S用HPLC和LC-MS測定代謝物的生成或減少，建立實 驗方法，定量分析和數(shù)據(jù)處理，計算得到昆蟲細(xì)胞重組皿的食蟹猴P450 2C9代謝雙氯芬酸的活 性，使其酶活指標(biāo)Km和Vmax值處于理想范圍，通過食蟹猴P450 2C9有效的代謝雙氯芬酸的可 以產(chǎn)生4，-羥基{槐氯芬酸(4'-hydroxydiclofenac)。圖7是食蟹猴P450 2C9體夕M對^又氯芬酸 反應(yīng)LC/MS圖譜圖，底物濃度雙氯芬酸100 uM，反應(yīng)^f牛37。C， 10min;色譜柱ZorbaxSB-C18 (2.1咖ID X100 mm， 3. 5-Micro);流動相A組成為CH30H/H20 (10: 90， v/v，含0.1%HC00H)， B組成為CH30H/H20 (90: 10， v/v，含0.腦C00H);梯度(min, B%): 0， 30%— 0.2, 30%— 1.6， 95%— 2.6， 95%— 2.8, 30%— 4.0, 30%;采用TurboIonSpray離子源，在正離子檢測方式 下，選擇醒工作方式進(jìn)行二級質(zhì)譜分析。實施例6.化^tl體外抑制sf-9昆蟲細(xì)胞重組表達(dá)的條猴P450 2C9的活性觀啶 如實施方案5中制備sf-9昆蟲細(xì)胞重組表達(dá)的食蟹猴P450 2C9的微粒體；4 粒體與固定 濃度的雙氯芬酸以及系列稀釋的待測化合物的混^)置于反應(yīng)管中，同時加入相應(yīng)量的NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原酶，水浴。加40 nL 10 mMNADPH溶液啟動反應(yīng)。8射中反應(yīng)后加0.8 mL 含內(nèi)標(biāo)的反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，混勻后置于冰水；上述各反應(yīng)管離心，取上清加入到96孑L縱樣 板，齢運用HPLC和LC-MS測定代謝物的生成或減少，建立實驗方法，定量分析和數(shù)據(jù)處理， 通過化合物體外抑制實驗，測得化合物體外抑制有效的抑制了食蟹猴P450 2C9的活性。實施例7. sf-9昆蟲細(xì)胞重組共表達(dá)的食蟹猴P450 2C9和NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原 酶的代謝雙氯芬酸活性測定8用制備的含有食蟹猴P450 2C9基因(《r/ 2C9)和NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原酶的桿狀病 毒以MOI (multiplicity of infection) =3感染培養(yǎng)到指數(shù)期的sf_9細(xì)胞，并在感染后2-3日 收集細(xì)胞；以磷酸鹽緩沖液將收集的sf-9細(xì)胞勻漿；以差速離心法離心制備微粒體；以磷酸鹽緩 沖液重懸微粒艦淀，用BCA法測定蛋白含量，用一氧化碳結(jié)合、法測定P450含量；將上述微粒與 系列稀釋的雙氯芬酸混合物置于反應(yīng)管中，水浴。加40 10 mMNADPH溶液啟動反應(yīng)。8射中 反應(yīng)后加0.8mL含內(nèi)標(biāo)的反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，混勻后置于冰水；上述各反應(yīng)管離心，取上清加 入到96 L鵬樣板，齢運用HPLC和LC-MS測定代謝物的生成或減少，建立實驗方法，定量 分析和數(shù)據(jù)處理，計算得到昆蟲細(xì)胞重組共表達(dá)的食蟹猴P450 2C9和NADPH-細(xì)胞色素P450氧化 還原酶代謝雙氯芬酸的活性，使其酶活指標(biāo)Km和Vmax值處于理想范圍，通過昆蟲細(xì)胞重組共 表達(dá)的，猴P450 2C9和NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原酶有效的代謝雙氯芬酸可以產(chǎn)生4'-羥 基《槐氯芬酸(4' -hydroxydiclofenac) 0實施例8.化合物體外抑制sf-9昆蟲細(xì)胞重組共表達(dá)的食蟹猴P450 2C9和NADPH-細(xì)胞色素 P450氧化還原酶的活性測定如實施方案7中制備sf-9昆蟲細(xì)胞重組表達(dá)的食蟹猴P450 2C9的微粒體；將微粒體與固定 濃度的雙氯芬酸以及系列稀釋的待測化合物的混合物置于反應(yīng)管中,水浴。加40pL 10 mM NADPH 溶液啟動反應(yīng)。8分鐘反應(yīng)后加0.8mL含內(nèi)標(biāo)的反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，混勻后置于冰水；上述各 反應(yīng)管離心，取上清加入到96孔板進(jìn)樣板，進(jìn)行LC/MSMS定量分析和數(shù)據(jù)處理，通過化^f勿體 外抑制實驗，測得化合物體外抑制有效的抑制了，猴P450 2C9的活性。實施例9.雙氯芬酸的維猴P450 2C9代謝物的大量制備按技術(shù)方案所述，用制備的同時含有食蟹猴P450 2C9(cyp 2C9)及其氧化還原酶基因的桿狀病 毒以MOI (multiplicity of infection) =3感染培養(yǎng)到指數(shù)期的sf-9細(xì)胞；在感染3天后，將 溶解的雙氯芬酸加入感染的細(xì)胞中；在加A^氯芬酸2-3天后，離心鐘，棄去細(xì)胞碎處，保留上 清；用制備HPLC純化雙氯芬酸被食蟹猴P450 2C9代謝的主要產(chǎn)物4'-羥基化雙氯芬酸 (4' -hydroxydi c1ofenac) 0序歹據(jù) SEQ ID N0:1〈iio>中科KT州生物醫(yī)藥與健康研究院〈120〉食蟹猴的P450 2C9藥物代謝酶〈130> 1<160〉 1<170〉 Patentln version 3.2〈210〉 1〈211〉 1473 〈212〉腿<213> ^H猴Macaca fascicularis〈 1atggattctc ttgtggtcct tgtgctctgt ctctcctgttagacagagat ctgggagagg aaaattccct cctggcccca aatatcctac agatagatat taaggacgtc agcaaatcct tatggccctg tgttcactct gtattttggc ctggaacgca gaagcagtga aggaagccct gattgatctt ggagaggagt ccattggctg acagagctaa cagaggattt ggaatcgttt aaggagatcc ggcgtUttc cctcatgaca ctgcggaatt attgaggatc gtgttcaaga ggaagcccgc tgccttgtgg ggctcaccct gtgatcccac tttcatcctg ggctgtgctc attattttcc ataaacgttt tgattataaa gatcagcaat Ugaatgaaa acgtcaagat tttgagcagc ccctggatcctgcttctcct ttcactctgg 60ctcctctccc agtgattgga 120taaccaacct ctcaaaagtc 180tggtggtgct gcatggatac 240tttctggaag aggacatttt 300tcagcaatgg aaag卿tgg 360ttgggatggg gaagaggagc 400aggagttgag aaaaaccaag 柳cctgcaatgt gatctgctcc 520ttcttaaagt gatggaaaaa 580agatatgcaa taattttcct 640 10cctttcattg attatttccc gggagcccat aaaagttata ttttggagaa agtaaaagaa cgggacttta ttgattgctt cctgatgaaa gaatttacta ttgaaaactt ggaaaacact acgacaagca caaccctgag atatgctctc gctaaagtcc aggaagagat tgaacgtgtg gacaggagcc acatgcccta cacagatgct cttctcccca ccaacctgcc ccatgcagtg atccccaagg gcacaaccat attaatttcc tttcccaacc cagagatgtt tgacccttgt aaaagtaact acttcatgcc tttctcagca gcccgcatgg agctgttttt atccttgacc ctggttgacc caaaggacct tgacaccact cccttctacc agctgtgctt cattcctgttaacaaattac ttaaaaacat tgcttttttg 700caccaagaat caatggacat gaacaaccct 760atggagaaag aaaagcacaa ccaacagtct 820gcagttgact tgtttggagc tgggac卿g 880cttctcctgc tgaagcaccc卿ggtcata 940attggcagaa atcggagccc ctgcatgcag 1000gtggtgcacg agatcc卿g atacattgac 1060acctgtgatg ttaaattcag aaactacctc 1120ctgacttctg tgctacatga caacaaagaa 1180cactttctgg acgaaggtgg caattttaag 1240ggaaaacgga tttgtgtggg agaagccctg 1300tccgttUac agaactttaa cctgaaatct 1360ccagttgtca atgggtttgc ctctgtgcca 1420tga 1473SEQ ID N0:2〈110〉中科院廣州生物醫(yī)藥與健藤if究院 〈120〉錢猴的P450氧艦原酶〈130〉 1<160〉 1〈170〉 Patentln version 3. 2〈210〉 1〈211〉 2034〈212〉 DNA<213〉 ^fi猴Macaca fascicularis 〈400〉 1atggg卿ct cccacgtgga caccagctcc accgtgtccg aggcggtggc cgaagaagta 60tctcttttca gcatgacgga cgtgattctg ttttcagtca tcgtgggcct cctaacctac 120tggttcctct ttagaaagaa aaaagaagaa gtccctgagt tcaccaaaat tcagacattg 180accagctctg tc卿gagag cggcttcgtg gaaaagatga agaaaacggg gaggaacatc 240atcgtgttct acggctccca gacggggact gcagaggagt ttgccaaccg cctgtccaag 300gacgcccacc gctatgggat gcgaggcatg tcagcggacc ccgaggagta tgacttggcg 360gacctgagca gcctgccgga gatcgacaac gccctggtgg ttttctgcat ggccacctac 420ggcgaggggg accccaccga caatgcccag gacttctacg actggctcca ggagacggac ■gtggatctct ctggggtcaa gtttgcggtg Utggtcttg ggaacaaaac ctacgagcac 540ttcaatgcca tgggcaagta cgtggacaag cggctggagc agctcggcgc ccagcgcatc 600tttgagctgg gcttgggcga cgacgatggg aacttggagg aggacttcat cacctggcga ,gagcagttct ggccggccgt gtgcgagcac tttggggtgg aagccactgg cgaggagtcc 720agcattcgcc agtacgagct tgtggtccac actgacatag acgcggccaa ggtgtacgtg 780ggggagatgg gccggctgaa gagctacgag aaccagaagc ccccctttga tgccaagaat 840ccattcctgg ctgcagtcac caccaaccgg aagctgaacc agggaaccga gcgccacctc 900atgcacctgg aattggacat ctcggactcc aaaatc郷t atgaatctgg ggaccacgtg 960gctgtgtacc cagccaacga ctctgctctc gtcaaccagc tgggcaaaat cctgggtgcc 1020gacctggacg tcgtcatgtc cctgaacaac ctggatgagg agtccaacaa gaagcaccca 1080ttcccgtgcc ctacgtccta ccgcacggcc ctcacctact acctggacat caccaacccg 1140ccgcgtacca acgtgctgta cgagctggcg ctgctgcgca卿tggcctc ctcctccggc gtgg郷ccc gg鄉(xiāng)caceit cctggccatc attgaccacc tgtgtgagct gctgccgcgc tcctccaagg tccatcccaa ctctgtacac 肪ggccggcc gcatcaacaa gggcgtggcc ggggagaacg gcggccgcgc gctggtgccc cccttcaagg ccaccacacc tgtcatcatg at鄉(xiāng)cttca tccaggagcg ggcctggctg ctgctgtact acggctgccg ccgctcggat cagttccaca gggacggcgc gctcacccag cacaaggtct acgtccagca cctgctaaag gaaggcggcg cccacatcta tgtctgtggg aacaccttct atgacatcgt ggctgagctc tatgtcaaga agctgatgac caagggccgccagtacgcct cggagccctc ggagcaggag 1200g鄉(xiāng)gcaagg agctgtacct gagctgggtg 1260ctgcaggact gcccgtcctt 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1. 一種食蟹猴的P450 2C9藥物代謝酶，能催化雙氯芬酸的4’-羥基化、甲苯磺丁脲的4’-羥基化和華法林的7’-羥基化。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的食蟹猴的P450 2C9藥物代謝酶，其特征在于，所述P450 2C9藥物 代謝酶的基因序列或其互補(bǔ)序列是與SEQ ID NO: 1的突變率為0-1%的序列。
3. —種食蟹猴的P450 2C9藥物代謝酶與食蟹猴的P450氧化還原酶的共表達(dá)重組載體，其特 征在于，含有權(quán)利要求2所述的食蟹猴的P450 2C9藥物代謝酶序列的開放閱讀框和食蟹猴的P450 氧化還原酶序列的開放閱讀框。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體，其特征在于，所述食蟹猴的P450氧化還原酶的序列或 其互補(bǔ)序列如SEQ ID NO: 2。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體，其牛寺征在于，還含有桿狀病毒基因，能感染包括sf-9 在內(nèi)的昆蟲細(xì)胞，被感染的昆蟲細(xì)胞至少能夠在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上異源表達(dá)權(quán)利要求1所述的，猴的P450 2C9藥物代謝酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種食蟹猴P450 2C9藥物代謝酶及其與食蟹猴P450氧化還原酶的共表達(dá)重組載體。食蟹猴P450 2C9藥物代謝酶能催化雙氯芬酸的4’-羥基化、甲苯磺丁脲的4’-羥基化和華法林的7’-羥基化；其基因序列或其互補(bǔ)序列是與SEQ ID NO1的突變率為0-1％的序列。食蟹猴P4502C9藥物代謝酶與食蟹猴P450氧化還原酶的共表達(dá)重組載體包含食蟹猴的P450 2C9藥物代謝酶序列和食蟹猴P450氧化還原酶序列的開放閱讀框。食蟹猴P450氧化還原酶的序列或其互補(bǔ)序列如SEQ ID NO2。本發(fā)明異源表達(dá)的蛋白僅代表食蟹猴P450 2C9，其系統(tǒng)更接近于食蟹猴體內(nèi)代謝的真實情況。
文檔編號C12N15/866GK101250505SQ20081002705
公開日2008年8月27日 申請日期2008年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月27日
發(fā)明者佘妙琴, 戴仁科, 溫鼎聲, 王海濤, 楊 白 申請人:中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院