專利名稱：黃曲霉h4在降解甲醛中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甲醛降解菌技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黃曲霉H4在降 解甲醛中的應(yīng)用。
技術(shù)背景關(guān)于甲醛降解菌的甲醛降解能力的研究很早以前就有報(bào)道，早期 人們著手于低濃度降解甲醛的研究，近年來高濃度降解甲醛時有報(bào) 道。無論是低濃度還是高濃度，Adroer等(1990)分離的Pseudomonas putida A2能降解甲醛250mg'L"; Azachil等(1995)分離了的 Halomonas sp. MAC僅能耐受甲醛75-100 mg,1/1;Doronina等(1997) 分離的Pseudomonas. alcaligenes能降解甲醛200 mg，L"，菌株 Pseudomonas putida J3倉g降解甲醛450 mg L-1， Methylobacterium extorquens能降解甲醛500-1000 mg.L1; —株P(guān)seudomonas alcaligenes 培養(yǎng)3天后能降解甲醛2000mg*L"。 Mirdamadi等(2005)報(bào)道 Methylobacterium extorquens (ESS 禾口 PSS)禾口四株P(guān)seudomonas pseudoalcaligenes (LSW， SSW, NSW， OSS)能降解甲醛1850 mg'L—1， 其中菌株P(guān)seudomonas pseudoalcaligenes OSS培養(yǎng)24 h3700 mg*L"甲 醛被100%消耗，培養(yǎng)72h消耗5920 mg'L"甲醛70%， Methylobacterium extorquens ESS禾卩Metiiylobacterium extorquens PSS 還能完全降解甲醛2960 mg'L-1。 Bonastre等(1986)報(bào)道在C甲醛為2300mg*dm-3的活性污泥做基質(zhì)的實(shí)驗(yàn)里能部分的降解甲醛，甲醛能 在好氧條件下被好氧菌降解；當(dāng)以甲醛為碳源時降解甲醛400 mg，dm—3，在活性污泥廠的廢水處理中完全降解甲醛2300mg，dm—s和 苯酚2400mg'dm—3(Zagomayaetal， 1990)。 Yamazaki等(2001)從海水 里分離了一株甲醛耐受細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)它在3%的氯化鈉里能降解甲醛400 mg，dm—3，在Eiroa等(2004)設(shè)計(jì)的模型里，指出硝化作用可以降解甲 醛，當(dāng)以甲醛為碳源、甲醇為伴生碳源時，硝化細(xì)菌可以降解甲醛的 濃度是30-3890 mg，dm—3，而反硝化細(xì)菌在有甲醛和甲醇存在時可以 降解1360mg，dm—3甲醛(Eiroaetal， 2006)。然而大部分是降解甲醛細(xì) 菌和降解甲醛酵母菌的研究，霉菌的研究報(bào)道很少，Kondo等(2002) 從土壤中分離了一株甲醛耐受真菌Aspergillus nomius IRI013，它能生 長在最高w(鴨尸0.45免里并把它完全消耗掉。有關(guān)黃曲霉H4的報(bào)道，最早出自Nikkuni，S.， Kosaka，N.， Suzuki, C. and Mori,K. Comparative sequence analysis on the 18S rRNA g ene of AspergillusOryzae, A. Sojae， A. Flavus， A. Parasiticus, A. Niger, A. Awamori and A. Tamarii. J. Gen. Appl. Microbiol. 42， 181-187 (1996)。但是有關(guān)黃曲霉H4能降解甲醛的研究并未見有報(bào) 道。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種黃曲霉H4在降解甲醛中的應(yīng)用，其可 有效、快速地降解甲醛。本發(fā)明的上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一、甲醛降解菌一黃曲霉H4的分離與鑒定1、 培養(yǎng)基配方基本培養(yǎng)基配方為1.0免(wv")葡萄糖，0.2免(w一)NaN03， 0.1%(w.v")K2HPO4， 0.05%(w.v-1)MgSO4.7H2O ， 0.05%(w.v-1)KCl ， 0.001呢(w.v")FeS04,7H20， 0.019Kw.v力酵母膏，0.1呢(w.v")甲醛(甲 醛用市售甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液)，培養(yǎng)基最終pH為6.0。(如沒有特別說 明，以下基本培養(yǎng)基均為此配方培養(yǎng)基)察氏培養(yǎng)基配方3.0免(w.v—1)蔗糖，0.39Kw-v")NaN03 ， 0.1%(w.v-i)K2HP04 ， 0.05%(w.v-1)MgSO4.7H2O ， 0.05%(w-v")KCl ， 0.001免(w.一)FeS04.7H20, 1.5—2'0免(w.v")瓊脂。麥芽汁培養(yǎng)基配方2.0呢(wv力麥芽浸膏，0.1呢(wv")蛋白胨， 2.09Kw.v")葡萄糖，1.5—2.0免(w.一)瓊脂。 'PDA培養(yǎng)基配方20免(w.v")土豆(去皮)，2.0呢(w.一)葡萄糖， 1.5—2.0% (w.v")瓊脂。(土豆切碎，加水煮沸30min，用雙層紗布過 濾，取其濾液。)2、 分離純化與結(jié)果分析樣品采自未經(jīng)過處理的家具廠出水口的淤泥，其甲醛氣味濃烈， 甲醛污染嚴(yán)重，從而保證了甲醛降解目的菌的存在。將上述樣品接種于基本培養(yǎng)基里，搖床上160r.min"3(TC培養(yǎng)5d， 生長起來的霉菌再多次用PDA培養(yǎng)基平板畫線，經(jīng)多次純化，分離 到一株霉菌，編號H4。然后將菌株H4分別接種于察氏培養(yǎng)基、麥 芽汁培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基上，25。C培養(yǎng)8d，觀察其菌落特征。同時，顯微鏡下觀察顯微結(jié)構(gòu)，并記錄好結(jié)構(gòu)特征，結(jié)合提取DNA，檢測 DNA濃度和純度，PCR 18S rDNA擴(kuò)增等一系列的分子鑒定手段得出 結(jié)論本發(fā)明分離純化得到的降解甲醛菌的18SrDNA序列與已報(bào)道 的黃曲霉H4 (Aspergillus flavus)同源率達(dá)99.8%，其培養(yǎng)特征及顯 微特征也與黃曲霉H4 (Aspergillus flavus)最相似。有關(guān)黃曲霉H4的資料出自Nikkuni，S.， Kosaka，N.， Suzuki,C. and Mori,K. Comparative sequence analysis on the 18S rRNA gene of Aspergillus Oiyzae, A. Sojae， A. Flavus, A. Parasiticus, A. Niger, A. Awamori and A. Tamarii. J. Gen. Appl. Microbiol. 42, 181-187 (1996)。由此可見，本發(fā)明篩選到的降解甲醛菌是黃曲霉H4， 18SrDNA 序列長度為1661bp，上傳GenBank申請?zhí)柎a為bankit890511。二、黃曲霉H4的最佳生長pH值霉菌一般喜好生長在偏酸的環(huán)境里，但其嗜酸性的程度差別很 大，因此了解其最佳生長的pH，有利于對其進(jìn)行快速培養(yǎng)和應(yīng)用。1、 一級種子的制取選取產(chǎn)孢良好的黃曲霉H4，接種在基本培養(yǎng)基中，搖床 160rmin—1， 3(TC培養(yǎng)2 3d，當(dāng)霉菌進(jìn)入快速生長期時，定時測定 OD475值，當(dāng)0/)475值快速上升時，此菌液即可作為一級種子2、 樣品制備選取大口 150mL三角瓶，配制pH分別為4.0， 4.5， 5.0， 5.5，6.0的液體基本培養(yǎng)基，瓶口用無菌封口培養(yǎng)膜封口 (無菌封口培養(yǎng) 膜是環(huán)凱公司生產(chǎn)的雙層膜，上有直徑0.6cm的圓孔兩個，中間有直徑3cm的、孔徑小于0.2p的無菌濾紙片，多用于組培生產(chǎn))，培養(yǎng) 一級種子(0仏75值為0.212)，除空白外接入一級種子5mL，置搖床 上30。C160r.min"培養(yǎng)，在接種的第0， 24， 48， 72， 96， 120， 144h 取樣，每次取2瓶測量菌絲干重，OZ)值測定用北京普析通用儀器有 限責(zé)任公司TU-1800型紫外可見分光光度計(jì)，菌絲干重用重量法測 量，結(jié)果取其平均值作圖。 3、結(jié)果分析黃曲霉H4在5種不同pH培養(yǎng)基中培養(yǎng)144h，菌絲干重分別 從0.0035、0.0033、0.0034、0.0035、0.0034 mg.1/1上升到0.0832、0.0955、 0.1010、 0.1120、 0.1020mg.L—1，菌絲干重最大的是pH5.5。所以黃曲 霉H4的最適生長pH為5.5。三、黃曲霉H4對甲醛的降解能力選取大口 150mL三角瓶，配制基本培養(yǎng)基，C(TO)按約0.1免、 0.15%、 0.2%、 0.25% (w.v")加入，pH分別選取已經(jīng)測得的最適pH (pH5.5)，瓶口用無菌封口培養(yǎng)膜封口，培養(yǎng)一級種子(0￡>475值為 0.178)，除空白外每瓶接入5mL，置搖床上3(TC160r.min—1培養(yǎng)，并 在接種的第0， 24， 48， 72， 96， 120， 144h取樣，每次取3瓶，其 中一瓶為空白，取樣后先7000X離心15min、過濾，濾液用AHMT 分光光度法檢測C(￥K)，濾紙和菌一起轉(zhuǎn)入已稱至恒重的燒杯中測菌 絲干重，菌絲干重用重量法測量，結(jié)果取其平均值作圖。C(w)的檢測用AHMT分光光度法，結(jié)果以實(shí)際測量數(shù)據(jù)為準(zhǔn)， 并取其平均值作圖。黃曲霉H4接種后144h，處理0.1呢C(甲薛)從1241 mg.L—1下降到 4.0mg.L1，降解率為99.7%，實(shí)驗(yàn)空白在1247-1318 mg.L"，揮發(fā)損 失很少，96h內(nèi)，C(甲酵)下降迅速，菌絲增長緩慢，96h后，菌絲干 重增長迅速，但C(甲醛)下降緩慢；處理0.15呢C(甲瞎)從1465mg.l/下 降到28mg-L—、降解率為98.1%，實(shí)驗(yàn)空白在1516-1598 mg.L—1，揮 發(fā)損失很少，120h內(nèi)，C(申瞎)下降迅速，菌絲增長緩慢，120h后， 菌絲干重增長迅速，但C(申酸)下降緩慢；處理0.20免Cw醒)從2333mg.L—1 下降到628mg丄—、降解率為73.1%，實(shí)驗(yàn)空白在2494-258lmg丄—1， 揮發(fā)損失可忽略，2他內(nèi)，C(甲醛)下降緩慢，24h后，C(甲酸)下降迅速， 菌絲干重增長緩慢；處理0.25免C,)從2922mg.L—1下降到949mg.L"， 降解率為67.5%，實(shí)驗(yàn)空白在3199-324211^丄-1，揮發(fā)很少，48h內(nèi)， C(甲酸)下降緩慢，48h后，C(甲醒)下降迅速，菌絲干重增長緩慢。在4 個不同濃度的處理中，菌絲干重分別從0.0032、0.0033、0.0031、0.0031g 'I^上升為0. 1110、 0.0844、 0.0183、 0.0157g*L—、黃曲霉H4的降解曲線總的規(guī)律是由慢到快，再由快到慢，降解 曲線有兩個閾值。在高濃度甲醛里曲線從緩慢下降轉(zhuǎn)入到快速下降， 這個閾值大約是2300mg.L"左右；在低濃度甲醛里曲線從快速下降解 轉(zhuǎn)入到緩慢下降，這個閾值大約是50mg丄—工左右。黃曲霉H4的降解過程都有兩個拐點(diǎn)， 一個是當(dāng)甲醛濃度為50 mg，L"時，黃曲霉H4從快速降解甲醛轉(zhuǎn)為緩慢降解甲醛；另一個是 當(dāng)甲醛濃度為2800mg-U1時，黃曲霉H4從緩慢降解甲醛轉(zhuǎn)為快速降 解甲醛。當(dāng)甲醛與一級種子幾乎同時加入分離基本培養(yǎng)基時，Oh時取樣加有甲醛和5mL —級種子的C(申船都比只加甲醛不加菌的空白要低 4% 10%左右，這就說明有少量的甲醛剛和菌絲體接觸就被黃曲霉 H4吸收或吸附。四、黃曲霉H4的碳源代謝及最佳碳源選取4種常用碳源葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉，按 培養(yǎng)基體積的10免添加(wv-、設(shè)置5種不同處理的碳源，分別為 0.1%甲醛、0.1%甲醛+10%蔗糖、0.1%甲醛+10%麥芽糖、0.1%甲醛 +10%淀粉、0.1%甲醛+10%葡萄糖，其余成分同基本培養(yǎng)基，pH值 為5.5，選用大口 150mL三角瓶分裝，瓶口用無菌封口培養(yǎng)膜封口， 接入一級種子5mL ((92)475值為0.187)，置搖床上3(TC160r.min—1培 養(yǎng)，并在接種的第0， 24， 48， 72， 96， 120， 144h取樣，每次取2 瓶，測CV甲醒)和菌絲干重值，H4培養(yǎng)基里有葡萄糖的處理，加測C ■)，并帶只加葡萄糖不加菌的培養(yǎng)基空白。OZ)值測定用北京普析通 用儀器有限責(zé)任公司TU-1800型紫外可見分光光度計(jì)，取樣后7000 X離心15min、過濾，濾液用來測量C 和C f葡萄糖)？ L伸醛) 用AHMT 分光光度法檢測，Cm萄糖)用蒽酮比色法檢測，濾紙和菌一起轉(zhuǎn)入已 稱至恒重的燒杯中測菌絲干重。結(jié)果以實(shí)際測量數(shù)據(jù)為準(zhǔn)，并取其平 均值作圖。黃曲霉H4在5種不同的碳源里都能有效的降解甲醛，菌絲干重 分別從0.0038、 0.0037、 0.0039、 0.0037、 0.0038 g'L1上升到0.0038、 0.1210、 0. 1110、 0. 1080、 0. 1250g'L"，在處理0.1%甲醛+10%蔗糖、0.1%甲醛+10%麥芽糖、0.1%甲醛+10%淀粉、0.1%甲醛+10%葡萄糖 中，CV甲瞎)分別從1169、 1189、 1209、 123lmg'L—1下降到4.20、 7.80、 8.20、 2.80mg'L1，降解率分別為99.6、 99.3、 99.3、 99.8%， 96h內(nèi)，C(甲整)下降迅速，菌絲增長較慢，96h后，菌絲干重增長較快，但C(甲 瞎)下降緩慢。在只有甲醛作為碳源的處理中，培養(yǎng)144h時H4的C押酸)從1238 mg'L"降到458 mg，L—1，降解率為63.0%，降解曲線24h后下降速度 漸快，后期沒有出現(xiàn)緩慢下降期，菌絲干重增長緩慢，沒有出現(xiàn)快速 增長期。所以黃曲霉H4能單獨(dú)利用甲醛為碳源并降解甲醛，但降解 效果不如加復(fù)合碳源，菌絲干重幾乎增長很少。葡萄糖的加入量為13383 mg'L—1， C滯萄糖)呈直線加速度下降，每 隔24h消耗的量為1414、 1672、 1928、 2090、 2881mg'L1，到l楊C ffl萄糖)是683 mg，L—1。只加葡萄糖沒加菌的空白，C^萄糖)穩(wěn)定，計(jì)算 葡萄糖消耗量時可忽略此空白。黃曲霉H4以0.1%甲醛和葡萄糖為碳源的的利用規(guī)律是前期， CV甲醒)下降快，C麵糖)下降比后期慢，此時甲醛還能抑制菌體的繁殖， 黃曲霉H4先以甲醛和葡萄糖同時為碳源，并優(yōu)先利用甲醛；當(dāng)C^ s)減少到不足以抑制黃曲霉H4生長時，黃曲霉H4則主要以葡萄糖 為碳源，C，)下降速度比前期慢。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果l.本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn) 已有菌種黃曲霉H4具有降解甲醛的能力，同時提供了黃曲霉H4在 降解甲醛的應(yīng)用中的一系列數(shù)據(jù)，如最適生長pH、碳源和甲醛降解能力等，極大地補(bǔ)充了降解甲醛菌的資料庫，并且填補(bǔ)了國內(nèi)降解甲醛菌研究的空白；2.本發(fā)明提供黃曲霉H4在甲醛降解中的應(yīng)用，為甲醛污染的生物處理工程，提供了強(qiáng)有力的幫助。


圖1為黃曲霉H4在察氏培養(yǎng)基(25°C， 7d)上的菌落形態(tài)； 圖2為黃曲霉H4在在麥芽汁培養(yǎng)基(25°C， 7d)上的菌落形態(tài); 圖3為黃曲霉H4在PDA培養(yǎng)基(加有孟加拉紅，25°C， 7d)上的菌落形態(tài)；圖4為黃曲霉H4的球形分生孢子囊；圖5為黃曲霉H4在不同pH時的生長曲線；圖6為黃曲霉H4在不同C甲醒時的降解曲線；圖7為黃曲霉H4在不同C申薛時的生長曲線；圖8為黃曲霉H4在不同碳源里的C f￥ 的降解曲線；圖9為黃曲霉H4在不同復(fù)合碳源里的生長曲線；圖10為黃曲霉H4的C^萄糖)的下降曲線；圖11為黃曲霉H4C押瞎)和C 萄糖)的下降曲線比較；其中，l為甲醛，2為甲醛+蔗糖，3為甲醛+麥芽糖，4為甲醛+淀粉，5為甲醛+葡萄糖，6為葡萄糖，ck為空白對照。通過借助以下實(shí)施例將更詳細(xì)說明本發(fā)明。以下實(shí)施例僅是說明性的，本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的限制。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1甲醛降解菌的分離與鑒定1、 培養(yǎng)基的配制基本培養(yǎng)基配方1.0呢(w.v")葡萄糖，0.2%(w.v")NaNO3 ， 0.1免(w'v")K2HP04， 0.05免(w.v"MgS04.7H20 ， 0.05免(w'v")KCl ， 0.001呢(w.v")FeS04.7H20， 0.01呢(w.v")酵母膏，0.1免(w.v")的甲醛(甲 醛用市售甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液)，培養(yǎng)基最終pH為6.0。察氏培養(yǎng)基配方3.0%(\^.一)蔗糖，0.3免(w.v力NaN03 ， 0.1免(w.v")K2HP04， 0.05呢(w.一)MgS04.7H20 ， 0.059Kw.v")KCl ， 0.001%(w.v—丄)FeS(V7H20， 1.5 2.0呢(w.v")瓊脂。麥芽汁培養(yǎng)基配方2.0%(w-v—b麥芽浸膏，0.1免(wv")蛋白胨， 2.0免(w.v")葡萄糖，1.5 2.0免(w.v")瓊脂。PDA培養(yǎng)基配方20% (w-v")土豆，2.0呢(w.v—"葡萄糖，1.5 2.0% (w.v")瓊脂。(土豆去皮切碎，加水煮沸30，用雙層紗布過濾，取其 濾液。)2、 分離樣品采自未經(jīng)過處理的家具廠出水口的淤泥，其甲醛氣味濃烈， 甲醛污染嚴(yán)重，從而保證了甲醛降解目的菌的存在。在超凈工作臺上，取10g上述淤泥樣置于90mL無菌水中，振蕩 15 min，放置20秒，取lmL上清液接種于培養(yǎng)液里，在搖床上 160r.min^(TC培養(yǎng)5d，生長起來的真菌再多次用PDA培養(yǎng)基平板畫 線，經(jīng)過多次純化，分離到一株霉菌，編號H4。3、 鑒定(1) 平板觀察選取察氏培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基，將接種針經(jīng)火 焰滅菌并冷卻后，蘸取極少量的孢子，點(diǎn)植于平板的中間位置，將平 板置于25'C培養(yǎng)8d，觀察菌落的特征并記錄。(2) 顯微觀察用解剖針從培養(yǎng)皿的菌落上，挑取少許菌體，置載玻片的水滴中， 于顯微鏡下觀察其形態(tài)特征并記錄。(3) 分子鑒定DNA的提取參照CTAB法進(jìn)行，DNA濃度和純度的檢測，采用核 酸/蛋白分析儀于Nucleic Acid程序下測定。PCR采用真菌18S rDNA擴(kuò) 增通用引物(上游引物GATCCTGCCAGTAGTCATATGC;下游引 物GCTGCGTTCTTCATCGATGC)，反應(yīng)條件為94。C 5min， 30個 循環(huán)(94°C 1 min、 56°C lmin、 72°C lmin) ， 72。C反應(yīng)7min。用l.O % 的瓊脂糖凝膠電泳40min，于UVI凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。擴(kuò)增產(chǎn)物測序由上海英俊生物技術(shù)有限公司完成，測序結(jié)果在 Genbank數(shù)據(jù)庫內(nèi)進(jìn)行同源序列搜索，找出該菌株與數(shù)據(jù)庫中同源性 最高的模式菌株。4、 結(jié)果與分析經(jīng)平板觀察和顯微觀察，菌株H4在察氏培養(yǎng)基上，直徑可達(dá) 52mm，平薄，粗糙或稍呈顆粒狀，最外緣為白色，內(nèi)部為黃色，后 期稍呈綠色，干燥無滲出液，表面無輻射狀紋，反面蛋殼黃色，基質(zhì)有不規(guī)則的輻射皺折溝紋(圖1);在麥芽汁培養(yǎng)基上菌絲生長旺盛， 呈棉絮狀，較厚，產(chǎn)孢后稍呈粗棉絨狀，接種點(diǎn)附近下沉，呈圓形圍 湖溝，產(chǎn)孢后呈橄欖綠色，有同心環(huán)狀，無滲出液，無輻射紋，反面淡黃色，有輻射皺折溝紋(圖2)。在加了孟加拉紅的PDA培養(yǎng)基 上呈環(huán)狀生長(圖3)，菌絲綠色，反面無色，直接鏡檢孢子著生成 葡萄狀(圖4);鏡檢分生孢子囊初為球形，后呈輻射狀，200-500^m， 或裂成幾個疏松的柱狀體，分生孢子梗大多自基質(zhì)伸出，壁厚，粗糙; 頂囊近球形，直徑23-50^im，大部分表面可育，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層，也有 單雙層者；分生孢子球形，直徑2.4-4.1111111，壁稍粗糙(圖4)。經(jīng)分子鑒定，菌株的18SrDNA序列已報(bào)道的黃曲霉H4 (Aspergillus flavus)同源率達(dá)99.8%，其培養(yǎng)特征及顯微特征也與黃 曲霉H4 (Aspergillus flavus)最相似。結(jié)合上述的平板觀察、顯微觀察和分子鑒定結(jié)果，得出如下結(jié)論 本發(fā)明篩選到的降解甲醛菌H4是黃曲霉，18SrDNA序列長度為 1661bp，上傳GenBank申請?zhí)柎a為bankit890511。實(shí)施例2黃曲霉H4的最佳生長pH值霉菌一般喜好生長在偏酸的環(huán)境里，但其嗜酸性的程度差別很 大，因此了解其最佳生長的pH，有利于對其進(jìn)行快速培養(yǎng)和應(yīng)用。 1、 一級種子的制取選取產(chǎn)孢良好的黃曲霉H4，接種在基本培養(yǎng)基中，搖床 160r.min—、 3(TC培養(yǎng)2 3d，當(dāng)霉菌進(jìn)入快速生長期時，定時測定6>1)475值，當(dāng)(9/)475值快速上升時，此菌液即可作為一級種子2、 樣品制備選取大口 150mL三角瓶，配制pH分別為4.0， 4.5， 5.0， 5.5，6.0的液體基本培養(yǎng)基，瓶口用無菌封口培養(yǎng)膜封口 (無菌封口培養(yǎng) 膜是環(huán)凱公司生產(chǎn)的雙層膜，上有直徑0.6cm的圓孔兩個，中間有直 徑3cm的、孔徑小于0.2|i的無菌濾紙片，多用于組培生產(chǎn))，培養(yǎng) 一級種子(0仏75值為0.212)，除空白外接入一級種子5mL，置搖床 上30。C160r.min"培養(yǎng)，在接種的第0， 24， 48， 72， 96， 120， 144h 取樣，每次取2瓶測量菌絲干重，OD值測定用北京普析通用儀器有 限責(zé)任公司TU-1800型紫外可見分光光度計(jì)，菌絲干重用重量法測 量，結(jié)果取其平均值作圖。3、 菌絲干重的測量燒杯在105'C烘lh至恒重，記錄稱量結(jié)果，將菌液用濾紙過濾 后，連同濾紙一起轉(zhuǎn)入已恒重的燒杯中，于8(TC烘至恒重，每次帶 空白兩個以上。菌絲干重(g.L—1)=[(燒杯+菌的重量+紙)-(燒杯+紙)]*1000/ 樣品量。菌絲干重取其平均值作圖。4、 結(jié)果與分析黃曲霉H4在5種不同pH培養(yǎng)基中培養(yǎng)144h (見圖5)，菌絲 干重分別從0.0035、 0.0033、 0.0034、 0.0035、 0.0034 mg.L"上升到 0.0832、 0.0955、 0.1010、 0.1120、 0.1020mg.L—1，菌絲干重最大的是pH5.5。所以黃曲霉H4的最適生長pH為5.5。實(shí)施例3黃曲霉H4對甲醛的降解能力1、 樣品制取選取大口 150mL三角瓶，配制基本培養(yǎng)基，C(TO)按約0.1免、 0.15%、 0.2%、 0.25% (wv、加入，pH分別選取已經(jīng)測得的最適pH (pH5.5)，瓶口用無菌封口培養(yǎng)膜封口，培養(yǎng)一級種子(<9/)475值為 0.178)，除空白外每瓶接入5mL，置搖床上3(rC160r.min—1培養(yǎng)，并 在接種的第O， 24， 48， 72， 96， 120， 144h取樣，每次取3瓶，其 中一瓶為空白，取樣后先7000X離心15min、過濾，濾液用AHMT 分光光度法檢測C(ra)，濾紙和菌一起轉(zhuǎn)入已稱至恒重的燒杯中測菌 絲干重，菌絲干重用重量法測量，結(jié)果取其平均值作圖。C(to)的檢測用AHMT分光光度法，結(jié)果以實(shí)際測量數(shù)據(jù)為準(zhǔn)， 并取其平均值作圖。2、 檢測C(w)的檢測用AHMT分光光度法，原理為甲醛與4-氨基-3聯(lián) 氨-5-巰基-l，2，4-三氮雜茂(簡稱AHMT)在堿性條件下縮合，然后經(jīng) 高碘酸鉀氧化成6-巰基-5-三氮雜茂[4,3-b]-S-四氮雜苯紫紅色化合物， 其色澤深淺與甲醛含量成正比。上述樣品經(jīng)7000X離心15min并過濾后，濾紙和菌一起轉(zhuǎn)入已 稱至恒重的燒杯中測菌絲干重，取其平均值作圖；濾液用AHMT分 光光度法檢測C(,)，具體步驟如下取100ml容量瓶，吸取1.0ml稀釋了 100倍的上述濾液，加入 5mol'L"氫氧化鉀溶液1.0ml， 0.5%AHMT溶液l.Oml，蓋上管塞， 顛倒混勻三次，放置20min，加入1.5呢高碘酸鉀0.3ml，充分振搖， 放置5min，定容至100ml。用lcm比色皿，波長550nm，隨樣品帶空白，測量吸光值，甲醛標(biāo)液購自百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司。甲醛標(biāo)線 的操作步驟，跟樣品的相同，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出標(biāo)線方程，樣品含 量由標(biāo)線方程換算得出。 3、結(jié)果與分析如圖6、 7所示，黃曲霉H4接種后144h，處理0.1%C( )從1241 mg.L—1下降到4.0 mg.L—1，降解率為99.7%，實(shí)驗(yàn)空白在1247-1318 mg.L—1，揮發(fā)損失很少，96h內(nèi)，C(甲薛)下降迅速，菌絲增長緩慢，96h 后，菌絲干重增長迅速，但C(鴨)下降緩慢；處理0.:i5呢C(TO)從1465 mgl—1下降到28mg.L1，降解率為98.1%，實(shí)驗(yàn)空白在1516-1598 mg.L—1，揮發(fā)損失很少，120h內(nèi)，C(甲醛)下降迅速，菌絲增長緩慢， 120h后，菌絲干重增長迅速，但C(鴨)下降緩慢；處理0.20呢C(甲^ 從2333mg.L—1下降到628mg.L—1，降解率為73.1%，實(shí)驗(yàn)空白在 2494-2581mg丄—1，揮發(fā)損失可忽略，24h內(nèi)，C(甲醛)下降緩慢，24h 后，C(申醒)下降迅速，菌絲干重增長緩慢；處理0.25免C(甲船從2922mg.L—1 下降到949mg.L"，降解率為67.5%，實(shí)驗(yàn)空白在3199-3242mg.L—1， 揮發(fā)很少，48h內(nèi)，C(申酸)下降緩慢，48h后，Cwk)下降迅速，菌絲 干重增長緩慢。黃曲霉H4的降解曲線總的規(guī)律是由慢到快，再由快到慢，降解曲線有兩個閾值。在高濃度甲醛里曲線從緩慢下降轉(zhuǎn)入到快速下降，這個閾值大約是2300mg.L—1左右；在低濃度甲醛里曲線從快速下降解 轉(zhuǎn)入到緩慢下降，這個閾值大約是50mg丄—]左右。實(shí)施例4黃曲霉H4的碳源代謝及最佳碳源 選取4種常用碳源葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉，按培養(yǎng)基體積的10免添加(W.V—、設(shè)置5種不同處理的碳源，分別為0.1%甲醛、0.1%甲醛+10%蔗糖、0.1%甲醛+10%麥芽糖、0.1%甲醛 +10%淀粉、0.1%甲醛+10%葡萄糖，其余成分同基本培養(yǎng)基，pH值 為5.5，選用大口 150mL三角瓶分裝，瓶口用無菌封口培養(yǎng)膜封口， 接入一級種子5mL (OZ)475值為0.187)，置搖床上3(rC160r.min—1培 養(yǎng)，并在接種的第0， 24， 48， 72， 96， 120， 144h取樣，每次取2 瓶，測C灘)和菌絲干重值，H4培養(yǎng)基里有葡萄糖的處理，加測C溜 萄糖)，并帶只加葡萄糖不加菌的培養(yǎng)基空白。OD值測定用北京普析通 用儀器有限責(zé)任公司TU-1800型紫外可見分光光度計(jì)，取樣后7000 X離心15min、過濾，濾液用來測量C押薛)和C 萄糖)，C伸醛)用AHMT 分光光度法檢測，C^萄糖)用蒽酮比色法檢測，濾紙和菌一起轉(zhuǎn)入已 稱至恒重的燒杯中測菌絲干重。結(jié)果以實(shí)際測量數(shù)據(jù)為準(zhǔn)，并取其平 均值作圖。如圖8、 9所示，黃曲霉H4在5種不同的碳源里都能有效的降 解甲醛，在處理0.1%甲醛+10%蔗糖、0.1%甲醛+10%麥芽糖、0.1% 甲醛+10%淀粉、0.1%甲醛+10%葡萄糖中，C押醛)分別從1169、 1189、1209、 1231mg，l/下降到4.20、 7.80、 8.20、 2.80mg，L1,降解率分別 為99.6、 99.3、 99.3、 99.8%， 96h內(nèi)，C(甲薛)下降迅速，菌絲增長較 慢，96h后，菌絲干重增長較快，但C(鴨)下降緩慢。葡萄糖的加入量為13383 mg'L1， Cm萄糖)呈直線加速度下降，每 隔24h消耗的量為1414、 1672、 1928、 2090、 2881mg'L1，到l楊C m萄糖)是683 mg'L—1 (圖IO)。只加葡萄糖沒加菌的空白，C 萄糖)穩(wěn) 定，計(jì)算葡萄糖消耗量時可忽略此空白。黃曲霉H4以0.1%甲醛和葡萄糖為碳源的的利用規(guī)律是如圖 ll所示，前期，C,)下降快，C,糖)下降比后斯侵，此時甲醛還能 抑制菌體的繁殖，黃曲霉H4先以甲醛和葡萄糖同時為碳源，并優(yōu)先 利用甲醛；當(dāng)C順)減少到不足以抑制黃曲霉H4生長時，黃曲霉H4 則主要以葡萄糖為碳源，CVto)下降速度比前期慢。在只有甲醛作為碳源的處理中，培養(yǎng)144h時H1的Cw酵)從1238 mg L—i降到458 mg"I/1，降解率為63.0%，降解曲線24h后下降速度 漸快，后期沒有出現(xiàn)緩慢下降期，菌絲干重增長很緩慢，沒有出現(xiàn)快 速增長期。所以黃曲霉H4能單獨(dú)利用甲醛為碳源并降解甲醛，但降 解效果不如加復(fù)合碳源，菌絲干重幾乎增長很少。
權(quán)利要求
1、黃曲霉H4在降解甲醛中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供黃曲霉H4在降解甲醛中的應(yīng)用。關(guān)于降解甲醛菌的研究很早以前就有報(bào)道，然而大部分是關(guān)于降解甲醛細(xì)菌和降解甲醛酵母菌的研究，卻無降解甲醛霉菌的研究報(bào)道，本發(fā)明公開了已有菌株——黃曲霉H4在降解甲醛中的應(yīng)用，同時提供了黃曲霉H4降解甲醛的應(yīng)用中的一系列數(shù)據(jù)，如最適生長pH、碳源和甲醛降解能力等，極大地補(bǔ)充了降解甲醛菌的資料庫，填補(bǔ)了國內(nèi)甲醛降解菌研究資料的空白，此外，黃曲霉H4在自然界中分布范圍廣，繁殖迅速，生長能力強(qiáng)，本發(fā)明提供的黃曲霉H4在降解甲醛中的應(yīng)用，為甲醛污染的生物處理工程，提供了強(qiáng)有力的幫助。
文檔編號C12R1/67GK101250486SQ200810027398
公開日2008年8月27日 申請日期2008年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月14日
發(fā)明者周建民, 畢鴻亮, 陳能場, 黃賽花 申請人:廣東省生態(tài)環(huán)境與土壤研究所