專利名稱：副溶血弧菌恒溫基因擴增快速檢測試劑盒及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物檢測試劑與使用方法，具體涉及一種副溶血弧菌恒溫基因擴增快速檢測試 劑細(xì)頓方法。
背景技術(shù)：
副溶血性弧菌是一種嗜鹽性細(xì)菌。人由于生吃或食用未煮熟的海產(chǎn)品常引起^^源性感染，導(dǎo)致 急性胃腸炎。因此，需要建立一種安全可靠、簡便快速的檢測方法來保證食品的安全。常規(guī)檢測 副溶血性弧菌的方法大多要經(jīng)過增菌、選擇性培養(yǎng)、生化鑒定和血清學(xué)反應(yīng)等過程，操作繁瑣、耗 時長、檢出率低，不利于及時診斷和流行病爭溯源，費時而且費力，已經(jīng)不能滿足食品生產(chǎn)的控制 要求。
近年來，有大量的報道證實基于PCR的方法已經(jīng)成功用于檢測副溶血弧菌，PCR方法在操作 時間上以及檢測的特異性和靈 方面較常規(guī)方法有較大提高，但是，PCR方法必須有精密的溫 度循環(huán)裝置，而且它的檢領(lǐng)附間也還是比較長(4 8h)，并且反應(yīng)過程很容易受污斜勿的影響， 從而使得這種方法不能滿足實地檢測的需要。因此，需要開發(fā)一種靈敏度高并且反應(yīng)鵬的方法， 在一定纟1^上可以取代PCR檢測方法。除了PCR方法以外，還有其他核酸擴增方法，比如核, 列擴增法(NASBA)、自序列復(fù)制法(3SR)和鏈置換復(fù)制法(SDA)。 ^H種方法的檢測水平都 不少于10個拷貝，耗時lh左右就可以將目標(biāo)核酸擴增到相似的范圍內(nèi)，盡管如此，它們對目標(biāo) 序列的擴增特異性不強，使得擴增后還需要詳盡的實驗操作手段來檢測擴增產(chǎn)物。免疫學(xué)檢測技 術(shù)快速簡便成本低廉，但要求高質(zhì)量高穩(wěn)定性的單克隆抗體，否則因準(zhǔn)確性不夠，目前只能是輔 助檢測手段。所以，將生物技術(shù)發(fā)展的最新成果應(yīng)用于病原微生物檢測，具有重要意義。
DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification of DNA， LAMP)克服 以往基因擴增方法的不足，在等溫條件下能夠特異性、高效、快速i腿行核酸的擴增，具有很多 的7^1^^4，見文獻Notomi T， Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K Amino N， Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA， Nucleic Acids Res. 2000 Jun 15;28(12):E63.。該方法 通常是按如下步驟進行步驟一、對被檢標(biāo)本進fi^頁處理，快速提取被檢標(biāo)本的DNA或RNA;
步驟二特異性弓嫩的制備確定待測標(biāo)本的耙基因后，取得特異性引物2對，內(nèi)引物和外引物 各一對；步驟三、進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)反應(yīng)將經(jīng)前處理的樣品、弓嫩、反應(yīng)緩沖
液與BWDNA聚合酶混合，在63 65°0保溫0.5至1.511進行循環(huán)鏈置換反應(yīng)；步驟四、分析判斷 反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果。雖然已公開的LAMP技術(shù)具有高靈敏性，能在等溫條件下高效地擴增核酸，但是 現(xiàn)有技術(shù)也有不足之處，主要是1.特殊引物要求極為苛刻限制該方法的廣泛應(yīng)用；2.需要對細(xì) 胞或組織破碎以提取DNA或RNA，不能夠直接對細(xì)胞或組織中的病毒或基因進行定位；3.為了 滿足擴增所需要的DNA量，必須增殖病原菌的數(shù)量；4.僅憑反應(yīng)生成的乳白色沉淀物判斷結(jié)果，
不夠清楚準(zhǔn)確，也不易實現(xiàn)反應(yīng)小型化，限制其進一步發(fā)展。為了克服這些缺點有必要對現(xiàn)有的
LAMP技術(shù)進行艦。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)缺陷，提供一種副溶血弧菌恒溫基因擴增快速檢測試劑M 頓方法。
為達到本發(fā)明的目的，采用以下技術(shù)方案-
按下列配方制備副溶血弧菌等溫基因擴增決速檢測試劑盒
(D引物混合液混合液中四條引物濃度均為10pmol4d，，引物序列如下 外引物l: CGCACCAGCTACTCGAAAG; 外引物2: CGGCGAAGAACGTAATGTCT;
內(nèi)引物1: cy3-CCACCAGTAGCCGTCAATGGTGGVGACCGATTGGGAATGG;
內(nèi)引物2: ACACCAACACGTCGCAAAACGTGCGTTCTCGTTCGCCAAAT; ②bwdna聚合酶(嗜熱脂肪芽胞桿菌DNA酶大片段)濃度為8U/m1; (D蛋白酶K:濃度為0.1-0.2ng/ml; (3)RNA酶濃度為0.4-0.6mg/ml; (D溶菌酶溶液濃度為0.2-0.4mg/ml;
樣品預(yù)處理液pH 7.0-9.0、 lOOmMTris-HCl (三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽)，50mMEDTA (乙二胺四乙酸)；
⑦ LAMP反應(yīng)緩沖液lOmMdNTP (脫氧核糖核苷酸)10xThermoPd (耐熱聚合酶)反應(yīng) 緩沖液150mMMgSO4:5mMBetina (甜，)=8:5:2:10 #^、；
⑧ 磷酸緩沖液；
⑨ M性處理試劑1:為3-5%質(zhì)量的多聚甲醛；
⑩ ilil性處理試劑2:為0.02-0.04%質(zhì)量的多聚賴氨酸；
系列濃度乙醇溶液為30-60%體積乙醇、60-80%體積乙醇、80-100%體積乙醇； 復(fù)染劑熒光染料l-2mg/mlDAPI (4，6- ^-2-苯基吲哚二鹽酸鹽)； 陽性對照副溶血弧菌基因組DNA。
所述的磷酸緩沖液組分為137mMNaCl， 2.7mMKCl， 8.1mMNa2HP04， 1.5mMKH2P04。
用上述試劑盒檢測副溶血弧菌的方跑括以下步驟
(1) 被檢樣品的預(yù)處理將待檢測樣品懸浮于磷酸緩沖液中，離心，取上清；離心，沉淀上 清中的細(xì)胞，然后用磷酸緩沖液沖洗細(xì)胞兩次，3-5%多聚甲醛固定；細(xì)脫懸浮液1040nl 滴加到用0.02-0.04%多娜氨酸處理過的玻璃板 沖，風(fēng)干；
(2) 細(xì)胞壁iliS性處理將固定好的細(xì)胞分別置于30-60%， 60-80%, 80-100%濃度的乙醇液 中各處理l-3min，進行^7jC;用0.2-0.4mg/ml濃度的溶菌酶溶液室溫下處理細(xì)胞8-12min;其中溶菌酶用樣品預(yù)處理液溶解；然后用0.1-0.2pg/ml的蛋白酶K室溫下處理細(xì)胞 2-5min，最后用0.4-0.6mg/ml的RNA酶處理12-17min;
(3) 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)；在50-200plPCR管配置反應(yīng)體系加入3-12pl引物混合液，反應(yīng) 緩沖液4.75-19pl， BW DNA聚合酶0.25-1 nl，模板DNAl-4pl，加水至12.5-50pl;將配
置好的反應(yīng)混合液滴加至睏定有細(xì)胞的玻板孔中，聚酯封層；恒溫反應(yīng)l-2h; 所用陽性對照副溶血弧菌基因組DNA;
(4) 反應(yīng)結(jié)束后，將玻片置于l-2mg/mlDAPI染料中染色5-10min，無菌水中漂洗，自然干；
(5) 將干燥的玻片置于熒光顯微鏡下觀察，調(diào)整焦距，打開熒光，在MW中看到激發(fā)熒光的 細(xì)胞就是陽性結(jié)果，細(xì)胞形態(tài)以陽t^寸照為準(zhǔn)，反之，紫外光下可以看到而綠色光激發(fā) 下看不到的細(xì)胞即為陰性結(jié)果；
步驟(3)所述的恒溫反應(yīng)溫度在63-65。C范圍。
步驟(1)所述的多聚甲醛固定時間為8-12h。
步驟(1)所述的離心^li:清液的椅速為1000-2000 rpm，時間為l-2min。
步驟(1)所述的離心沉淀上清液中細(xì)胞的糊為10000-15000ipm，時間為l-3min。
步驟(4)所述的漂洗次數(shù)為2次以上，,2次，時間為每次12-15min。
本發(fā)明的一種副溶血弧菌恒溫基因擴增快速檢測試劑皿使用方法有以下有益效果 1、高特異性本發(fā)明根據(jù)副溶血弧菌欣基因保守區(qū)設(shè)計了四雑異性引物
外引物l: CGCACCAGCTACTCGAAAG ;外引物2: CGGCGAAGAACGTAATGTCT;
內(nèi)引物1: cy3-CCACCAGTAGCCGTCAATGGTGGVGACCGATTGGGAATGG;
內(nèi)引物2: ACACCAACACGTCGCAAAACGTGCGTTCTCGTTCGCCAAAT;
應(yīng)用上述四條引物，根據(jù)是否擴增就能判斷耙標(biāo)物質(zhì)的存在與否，陽性率可達大于99% 假陽性率小于1%;
2、 無需增菌檢測之前不需要對待檢菌進行培養(yǎng)；
3、 實現(xiàn)樣品原位檢測在不增菌的條件下，直接X才樣本中的病原菌微生物進行原位基因擴增;
4、 快速、高效擴增擴增在不到2h即可完成，且產(chǎn)率高；
5、 靈敏度高在復(fù)雜體系中可檢觀倒單個細(xì)胞的靶目標(biāo)，最低檢測極限達到10CFU/ml，標(biāo) 本的檢出率達到99%;
6、 鑒定簡便M31熒光顯微傲見察細(xì)胞是否發(fā)熒光進行鑒定，無需電泳等其他{摘分析步驟。
具體實肺式 實施例1
按下列配方制備副溶血弧菌恒溫基因擴增快速檢測試劑盒 引物混合液混合液中四條引物濃度均為10pmoVMl，引物序列如下
外引物l: CGCACCAGCTACTCGAAAG; 外弓胸2: CGGCGAAGAACGTAATGTCT;
內(nèi)引物1: cy3-CCACCAGTAGCCGTCAATGGTGGVGACCGATTGGGAATGG; 內(nèi)引物2: ACACCAACACGTCGCAAAACGTGCGTTCTCGTTCGCCAAAT; BrfDNA聚合酶濃度為8U4il; 蛋白酶K:濃度為0.1ng/ml; RNA酶濃度為0.4mg/ml; 溶菌酶溶液濃度為0.2mg/ml;
樣品預(yù)處理液..pH=7.0、 lOOmMTris-HCl， 50mMEDTA;
LAMP反應(yīng)緩沖液80nllOmMdNTP， lOxThemoPol Buffer, 20nl 150MmMgSO4, lOOpl 5mM Betina;
磷酸緩沖液；137mMNaCl， 2.7mMKCl， 8.1mMNa2HP04， 1.5mMKH2P04; M性處理試劑l:為3%質(zhì)量的多聚甲醛； 驗性處理試劑2:為0.02%質(zhì)量的多聚賴氨酸；
系列濃度乙醇溶液為30%體積乙醇、60%體積乙醇、80%體積乙醇；
復(fù)染劑熒光染料lmg/mlDAPI; 陽性對照副溶血弧菌基因組DNA。
用上述試劑盒按以下方法對副溶血弧菌進行檢測
1、 被檢樣品的菌體固定處理
(1) 取a5ml細(xì)胞懸浮液于離心管中，1000rpm離心2min，取上清；
(2) 1000(hpm離心3min沉淀上清中的細(xì)胞，然后用磷酸緩沖液沖洗細(xì)胞兩次，3%多聚甲醛 固定12h; ,
(3) 細(xì)胞懸浮液10n摘加至傭0.02。/。多聚賴氨酸處理過的玻璃板孔中，生物安全柜中自然風(fēng) 干。
2、 被檢樣品的細(xì)胞壁M性處理
(1) 將固定好的細(xì)胞分別置于30%， 60%， 80Q/。體積的乙lM中各處理3min，進行脫水；
(2) 用0.2mg/ml濃度的溶菌酶溶液室溫下處理細(xì)胞12min;
(3) 用0.1ng/ml的蛋白酶K室溫下處理細(xì)胞5min;
(4) 用0.4mg/ml的RNA酶處理17min，。 3、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)反應(yīng)；
(1) 在50WPCR管配置反應(yīng)體系加入3pl弓l物混合液，反應(yīng)緩沖液4.75W ， BW DNA聚合 酶0.25W，模板DNA1W，加水至12.5W;
(2) 將配置好的反應(yīng)混合液滴加至睏定有細(xì)胞的玻板孔中，聚酯封層；
(3)置于63'C恒溫反應(yīng)2h。
4、 樣品復(fù)染
反應(yīng)結(jié)束后，將玻片置于lmg/mlDAPI染料中染色10min，然后在無菌水中漂洗兩次，每 次12min，自然干。
5、 分析判斷反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果
將干燥的玻片置于熒光顯微鏡下觀察，調(diào)整焦距，打開熒光，在視野中看到激發(fā)熒光的 細(xì)胞就是陽性結(jié)果，細(xì)胞形態(tài)以陽性對照為準(zhǔn)，反之，紫外光下可以看到而熒光激發(fā)下看不 到的細(xì)胞即為陰性結(jié)果。 實施例2
按下列配方制備副溶血弧菌恒溫基因擴增快速檢測試劑盒 引物混合液混合液中四條引物濃度均為10pmol4d，引物序列如下 外引物l: CGCACCAGCTACTCGAAAG; 外引物2: CGGCGAAGAACGTAATGTCT;
內(nèi)引物1: cy3-CCACCAGTAGCCGTCAATGGTGGVGACCGATTGGGAATGG; 內(nèi)引物2: ACACCAACACGTCGCAAAACGTGCGTTCTCGTTCGCCAAAT; BrfDNA聚合酶濃度為8乖 蛋白IIK:濃度為0.1pg/ml; RNA酶濃度為0.5111^1111; 溶菌酶溶液濃度為03mg/ml ;
樣品預(yù)處理液pH8.0、 100mMTris-HCl， 50mMEDTA;
LAMP反應(yīng)緩沖液80pll0mMdNTP， 50|ul lOxThemoPol Buffer, 20^1150MmMgSO4,100^1 5mM Betina;
磷酸緩沖液137mMNaCl， 2.7mMKCl， 8.1mMNa2HP04， 1.5mMKH2P04;
M性處理試劑l:為4%質(zhì)量的多聚甲醛； M性處理試劑2:為0.03%質(zhì)量的多聚賴氨酸；
系列濃度乙醇溶液為30%體積乙醇、70%體積乙醇、95%體積乙醇；
復(fù)染劑熒光染料lmg/mlDAPI;
陽性對照副溶血弧菌基因纟IDNA。
用上述試劑盒按以下方法對副溶血弧菌進行檢測
1、被檢樣品的菌體固定處理
(1) 取lml細(xì)胞懸浮液于離心管中，1 OOOrpm離心2min，取上清；
(2) 12000rpm離心2min沉淀上清中的細(xì)胞，然后用磷酸緩沖液沖洗細(xì)胞兩次，4%多聚甲醛 固定10h;(3)細(xì)脫懸浮液2(^1滴加至傭0.03。/。多聚賴氨酸處理過的玻璃板 L中，生物安全柜中自然風(fēng) 干。
2、 被檢樣品的細(xì)胞壁M性處理
(1) 將固定好的細(xì)胞分別置于30%， 70%， 95。/。體積的乙醇液中各處理2min，進行脫7K;
(2) 用0.3mg/ml濃度的溶菌酶溶液室、溫下處理細(xì)胞10min;
(3) 用0.1pg/ml的蛋白酶K室溫下處理細(xì)胞5min;
(4) 用0.5mg/ml的RNA酶處理15min，。
3、 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)反應(yīng)；
(1) 在50nlPCR管配置反應(yīng)體系lOpmol^l四種弓l物各加lpl， LAMP反應(yīng)緩沖液12.5^1， B對DNA聚合酶lpl (8U)，加水至25pl;
(2) 將配置好的反應(yīng)混合液滴加到固定有細(xì)胞的玻板 L中，聚酯封層；
(3) 置于63。C恒溫反應(yīng)2h。
4、 樣品復(fù)染
反應(yīng)結(jié)束后，將玻片置于lmg/mlDAPI染料中染色10min，然后在無菌水中漂洗兩次， 每次15min，自然干。 5、分析判斷反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果
將干燥的玻片置于熒光顯微鏡下觀察，調(diào)整焦距，打開熒光，在視野中看到激發(fā)熒光的 細(xì)胞就是陽性結(jié)果，細(xì)胞形態(tài)以陽性對照為準(zhǔn)，反之，紫外光下可以看到而熒光激發(fā)下看不 到的細(xì)胞即為陰性結(jié)果。 實施例3
引物混合液混合液中四條引物濃度均為10pmol/nl，引物序列如下 外引物l: CGCACCAGCTACTCGAAAG; 外引物2: CGGCGAAGAACGTAATGTCT;
內(nèi)引物1: cy3-CCACCAGTAGCCGTCAATGGTGGVGACCGATTGGGAATGG; 內(nèi)引物2: ACACCAACACGTCGCAAAACGTGCGTTCTCGTTCGCCAAAT; BrfDNA聚合酶濃度為8U妙 蛋白酶K:濃度為0.2ng/ml; RNA酶濃度為0.6mg/ml; 溶菌酶溶液濃度為0.4mg/ml;
樣品預(yù)處理液pH9.0、 10QmMTris-HCl， 50mMEDTA;
LAMP反應(yīng)緩沖液80^ill0mMdNTP， 50nl lOxThemoPol Buffer, 150MmMgSO4， lOOpl 5mM Betina;
磷酸緩沖液；137mMNaCl， 2.7mMKCl， 8.1mMNa2HP04， 1.5mMKH2P04;
M性處理試劑l:為5%質(zhì)量的多聚甲醛； M性處理試劑2:為0.04%質(zhì)量的多聚賴氨酸；
系列濃度乙醇溶液為60%體積乙醇、80%體積乙醇、100%體積乙醇；
復(fù)染劑熒光染料2mg/mlDAPI; 陽性對照副溶血弧菌基因組DNA。
用上述試劑盒按以下方法對副溶血弧菌進行檢測 1、被檢樣品的菌體固定處理
(1) 取2ml細(xì)胞懸浮液于離心管中，2000rpm離心lmin，取上清；
(2) 15000ipm離心lmin沉淀上清中的細(xì)胞，然后用磷酸緩沖液沖洗細(xì)胞兩次，5%多聚甲醛固 定8h;
(3) 細(xì)胞懸浮液40nl滴加至,0.04%多聚賴氨酸處理過的玻璃板孔中，生物安全柜中自然風(fēng) 干。
2、 被檢樣品的細(xì)胞壁M性處理
(1) 將固定好的細(xì)胞分別置于60%， 80%， 100n/。體積的乙醇液中各處理lmin，進行^7jC;
(2) 用0.4mg/ml濃度的溶菌酶溶液室溫下處理細(xì)胞8min;
(3) 用0.2ng/ml的蛋白酶K室溫下處理細(xì)胞2min;
(4) 用0.6mg/ml的RNA酶處理12min，。
3、 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)反應(yīng)；
(1) 在200nlPCR管配置反應(yīng)體系加入12^1弓嫩混合液，LAMP反應(yīng)緩沖液19^1， B對DNA 聚合酶ltil(8U)，模板DNA4nl，加水至5(Hd;
(2) 將配置好的反應(yīng)混合液滴加至睏定有細(xì)胞的玻板孔中，聚酯封層；
(3) 置于65'C恒溫反應(yīng)lh。
4、 樣品復(fù)染
反應(yīng)結(jié)束后，將玻片置于2mg/mlDAPI染料中染色5min，然后在無菌水中漂洗兩次，每次 15min，自然干。
5、 分析判斷反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果
將干燥的玻片置于熒光顯微鏡下觀察，調(diào)整焦距，打開熒光，在視野中看到激發(fā)熒光的細(xì)胞 就是陽性結(jié)果，細(xì)胞形態(tài)以陽性對照為準(zhǔn)，反之，紫外光下可以看到而熒光激發(fā)下看不到的細(xì)胞 即為陰性結(jié)果。
權(quán)利要求
1、一種副溶血弧菌恒溫基因擴增快速檢測試劑盒，其特征在于，其試劑包括①引物混合液混合液中四條引物濃度均為10pmol/μl，，引物序列如下外引物1CGCACCAGCTACTCGAAAG；外引物2CGGCGAAGAACGTAATGTCT；內(nèi)引物1cy3-CCACCAGTAGCCGTCAATGGTGGVGACCGATTGGGAATGG；內(nèi)引物2ACACCAACACGTCGCAAAACGTGCGTTCTCGTTCGCCAAAT；②Bst DNA聚合酶濃度為8U/μl；③蛋白酶K濃度為0.1-0.2μg/ml；④RNA酶濃度為0.4-0.6mg/ml；⑤溶菌酶溶液濃度為0.2-0.4mg/ml；⑥樣品預(yù)處理液pH 7.0-9.0、100mM Tris-HCl，50mM EDTA；⑦LAMP反應(yīng)緩沖液10mM dNTP∶10×ThermoPol反應(yīng)緩沖液∶150mM MgSO4∶5mMBetina＝8∶5∶2∶10體積；⑧磷酸緩沖液；⑨通透性處理試劑1為3-5％質(zhì)量的多聚甲醛；⑩通透性處理試劑2為0.02-0.04％質(zhì)量的多聚賴氨酸； id="icf0001" file="A2008100303400002C1.tif" wi="4" he="5" top= "149" left = "22" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>系列濃度乙醇溶液為30-60％體積乙醇、60-80％體積乙醇、80-100％體積乙醇； id="icf0002" file="A2008100303400002C2.tif" wi="4" he="5" top= "156" left = "22" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>復(fù)染劑熒光染料1-2mg/ml DAPI； id="icf0003" file="A2008100303400002C3.tif" wi="4" he="5" top= "164" left = "22" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>陽性對照副溶血弧菌基因組DNA。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于，所述的磷酸緩沖液組分為137mMNaCl， 2.7mM KC1， 8.1mMNa2HP04， 1.5mMKH2P04。
3、 權(quán)禾腰求l戀戶腿的試劑維測副溶血弧菌的方法，其特征在于，包括以下步驟(1) 被檢樣品的預(yù)處理將待檢測樣品懸浮于磷酸緩沖液中，離心，取上清；離心，沉淀上清中的 細(xì)胞，然后用磷酸緩沖液沖洗細(xì)胞兩次，3-5%多聚甲醛固定；細(xì)胞懸浮液10-40|al滴加到用 0.02-0.04%多聚賴氨酸處理過的玻璃板孔中，風(fēng)干；(2) 細(xì)胞壁M性處理將固定好的細(xì)胞分別置于30-60%， 60-80%, 80-100%濃度的乙醇液中各 處理l-3min，進行脫水；用0.2-0.4mg/ml濃度的溶菌酶溶液室溫下處理細(xì)胞8-12min;其中溶 菌酶用樣品預(yù)處理液溶解；然后用0.1-0.2pg/ml的蛋白酶K室溫下處理細(xì)胞2-5min，最后用 0.4-0.6mg/ml的RNA酶處理12-17min;(3) 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)；在50-200nlPCR管配置反應(yīng)體系加入3-12^1弓嫩混合液，反應(yīng)緩沖 液4.75-19^1， BWDNA聚合酶0.25-1 (il，模板DNA14nl，加水至12.5-50nl;將配置好的反應(yīng) 混合液滴加至睏定有細(xì)胞的玻板孔中，聚酯封層；恒溫反應(yīng)l-2h; 所用陽性對照副溶血弧菌基因組DNA;(4) 反應(yīng)結(jié)束后，將玻片置于l-2mg/mlDAPI染料中染色5-10min，無菌水中漂洗，自然干；(5) 將干燥的玻片置于熒光顯微鏡下觀察，調(diào)M距，打開熒光，在l鵬中看到激發(fā)熒光的細(xì)脫就 是陽性結(jié)果，細(xì)胞形態(tài)以陽性X寸照為準(zhǔn)，反之，紫外光下可以看到而纟絶光激發(fā)下看不到的細(xì) 胞即為陰性結(jié)果；
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方、法，其特征在于步驟(3)所述的恒溫反應(yīng)溫度在63-65。C范圍。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3戶;M的方法，其特征在于步驟(1)所述的多聚甲醛固定時間為8-12h。
6、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟(1)所述的離心取上清液的轉(zhuǎn)速為1000-2000rpm， 時間為l-2min。
7、 根據(jù)權(quán)禾腰求3戶腿的方法，其特征在于步驟(1)所述的離心沉淀上清液中細(xì)胞的魏為 10000-15000rpm，時間為l-3min。
8、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟(4)所述的漂洗次數(shù)為2次，每次12-15min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種副溶血弧菌恒溫基因擴增快速檢測試劑盒及使用方法，試劑盒包括引物混合液，其序列為外引物1CGCACCAGCTACTCGAAAG；外引物2CGGCGAAGAACGTAATGTCT；內(nèi)引物1cy3-CCACCAGTAGCCGTCAATGGTGGVGACCGATTGGGAATGG；內(nèi)引物2ACACCAACACGTCGCAAACGTGCGTTCTCGTTCGCCAAAT；Bst DNA聚合酶、蛋白酶K、RNA酶、溶菌酶溶液、LAMP反應(yīng)緩沖液、磷酸緩沖液、通透性處理試劑、乙醇溶液、復(fù)染劑、陽性對照。利用該試劑盒通過副溶血弧菌菌體固定處理、細(xì)胞通透性處理、恒溫基因擴增反應(yīng)、判斷反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果實現(xiàn)對副溶血弧菌高特異性、快速、高效、高靈敏度、簡便的原位檢測。
文檔編號C12Q1/04GK101358235SQ200810030340
公開日2009年2月4日 申請日期2008年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月22日
發(fā)明者常彥磊, 琳 李, 王秋艷, 磊 石, 帆 黃 申請人:華南理工大學(xué)