專利名稱：一種分離純化Cr⁶⁺還原的Ochrobactrum sp.菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物培養(yǎng)方法，特別是用于Cr"還原的OAra^"n/m W.細(xì)菌純培養(yǎng)物的分離純化方法。
技術(shù)背景礦山、冶煉、無(wú)機(jī)鹽及鉻鹽廠等排放的廢水中六價(jià)鉻的含量高，毒性大。 近年來(lái)，利用微生物處理含Cr"廢水的方法十分引人注目，生物法具有簡(jiǎn)單， 廉價(jià)、效果好的特點(diǎn)。各種微生物不斷地被開(kāi)發(fā)利用，例如含糊假單胞菌、 熒光假單胞菌、乳鏈球菌等，這些菌株雖然對(duì)鉻(VI)有一定的抗性，但卻不能 改變鉻(VI)的價(jià)態(tài)，不能還原鉻(VI)而降低其毒性，達(dá)不到治理含鉻(VI)廢水 的目的。而對(duì)鉻(VI)有還原能力的細(xì)菌如陰溝腸桿菌、鉻酸鹽還原菌的作用時(shí) 間長(zhǎng)，還原率低。目前國(guó)內(nèi)外用于處理含06+廢水的微生物如￡^"http://01;*/0、 尸se"(icwo"as 、五"fera6"cfer c/oacae Mra 'w、 v47C"C 35J豐6、 57 5等幾乎都集 中于對(duì)中性或偏酸性的電鍍廢水的處理，而對(duì)于堿性含鉻廢水、鉻渣滲濾液 尤其是鉻渣的有關(guān)微生物處理的研究鮮有報(bào)道。這些廢水往往濃度高，呈堿 性， 一般微生物難以適應(yīng)該體系。此外，培養(yǎng)這些處理含C一+廢水的微生物所 用的培養(yǎng)基，大部分營(yíng)養(yǎng)成分復(fù)雜，有的需要生長(zhǎng)因子、微量元素等輔助分 離，或要求雙層平板、厭氧條件等，這增加了操作難度和費(fèi)用的開(kāi)支。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于解決目前微生物處理堿性含Cr"廢水時(shí)微生物難以分 離培養(yǎng)的問(wèn)題，提供了一種用單層平板和改良的固體培養(yǎng)基分離純化得到能 還原Cr"的Oc/2ra^crfTM附^.細(xì)菌純培養(yǎng)物方法，它能適用于堿性含鉻廢水、 鉻渣滲濾液尤其是鉻渣等的處理，且方法簡(jiǎn)便，菌落形成率較高。本發(fā)明的詳細(xì)技術(shù)方案為將采集的堿性含Cr"廢棄樣品用有機(jī)LB培養(yǎng) 基富集培養(yǎng)一代，然后用選擇性液體培養(yǎng)基Cr-G傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)基Cr-G的 組分為蛋白胨10.0g/L;酵母浸出粉5g/L; NaC15g/L; MgS04'7H20 0.2g/L; K2HPO40.05g/L， K2Cr2O70.8~1.2g/L，調(diào)整培養(yǎng)基的pH為7.5 10.0，培養(yǎng)溫 度為30 37°C;傳代培養(yǎng)2 4次，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)物取適量稀釋20 100倍， 在固體平板上劃線培養(yǎng)。固體平板培養(yǎng)基的配方為A:蛋白胨10.0g/L、酵 母浸出粉5g/L、 NaC15g/L、 MgS04，7H20 0.2g/L和K2HP04 0.05g/L溶于蒸餾 水，再加入質(zhì)量百分比濃度為1.0 1.2%的瓊脂粉，搖勻；B: K2Cr2O70.8~1.2g/L 溶于蒸餾水；A和B分別滅菌；混合，調(diào)pH至7.5 10.0，培養(yǎng)溫度為30 37°C。固體培養(yǎng)基顏色為淺灰綠色通明狀，2 3天后在培養(yǎng)基表面形成一些中 間灰白色，有透明邊，邊緣整齊，表面光滑，凸起的圓形菌落。本發(fā)明采用單層的固體培養(yǎng)基以及優(yōu)化的培養(yǎng)條件實(shí)現(xiàn)了堿性環(huán)境中還 原Cr"的C^rak^r訓(xùn)平細(xì)菌的分離純化。培養(yǎng)成分簡(jiǎn)單，無(wú)需添加任何其 他的細(xì)菌、微量元素、生長(zhǎng)因子等輔助分離；僅用普通的瓊脂粉作凝膠劑， 菌落形成率較高。該方法大大降低了工作量和費(fèi)用，且較其他方法更簡(jiǎn)單易 行，針對(duì)性強(qiáng)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1:分離還原Cr"的Oc/2ra6a"nw7取菌株Cr-l 。 將在鉻鹽廠采集的鉻渣樣品3.0 g加入到已滅菌的LB培養(yǎng)基100mL中， 在30'C， 160 r/min條件下富集培養(yǎng)一代，取上清液2 ml接種到新的選擇性 液體培養(yǎng)基Cr-G (100ml)培養(yǎng)，選擇性液體培養(yǎng)基Cr-G培養(yǎng)基的成分為 蛋白胨10.0 g/L;酵母浸出粉5.0 g/L; NaCl 5.0 g/L; MgS04*7H20 0.2 g/L; K2HP04 0.05 g/L; K2Cr207 0.8 g/L。用NaOH溶液調(diào)pH=7.5，培養(yǎng)溫度為30 °C，傳代培養(yǎng)3次，每次的接種量為2ml (2%)。最后將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培 養(yǎng)物取適量稀釋20倍，用接種環(huán)沾取適量的稀釋液在固體平板上劃線。固體 平板培養(yǎng)基配方由A和B兩個(gè)部分組成。A成分為蛋白胨5.0g;酵母浸出粉 2.5 g; NaC12.5g; MgS04*7H20 0.1 g; K2HP04 0.025 g，溶于400ml蒸餾水， 再加入瓊脂粉4.8 g搖勻；B成分K2Cr207 0.4 g溶于100ml蒸餾水；將A 和B部分分別在12rC蒸汽滅菌，時(shí)間為25分鐘，最后將A和B兩個(gè)部分混 合，調(diào)pH=7.5，在無(wú)菌臺(tái)上倒平板，待平皿凝固后即可劃線。將劃線的平皿 先正置10分鐘，待菌液吸收后倒置于3(TC恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。固體培養(yǎng)基顏色 為淺綠色通明狀，3天后在培養(yǎng)基表面形成十幾個(gè)大小不一灰白色，中間凸起 的圓形單菌落。所得到的單菌落挑到選擇性液體培養(yǎng)基Cr-G中培養(yǎng)。然后進(jìn)行的理化特 性研究發(fā)現(xiàn)菌株Cr-l能在20 45'C， pH為7 11， ^20207為0-1.6 g/L范 圍內(nèi)生長(zhǎng)繁殖，最適條件為35。C、 pH=10、 K2Cr2O70.6g/L， 6天后，其中Cr6 +的還原效率達(dá)80%。實(shí)施例2:分離還原Cr"的Oc/zra^c^wm ^.菌株Cr-2從富集培養(yǎng)到選擇性液體培養(yǎng)基Cr-G傳代，步驟同實(shí)施例l，K2Cr207為 0.9g/L，培養(yǎng)基pH:9.0,其培養(yǎng)溫度依然為3(TC，傳代培養(yǎng)了2次，最后將 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)液稀釋了 60倍，同實(shí)施例1步驟進(jìn)行固體培養(yǎng)基平板涂 布分離，K2Cr207依然為0.4g，瓊脂粉濃度為1.1%，調(diào)pH-9.0，培養(yǎng)溫度設(shè) 為30'C。將A和B部分分別在121 125'C蒸汽滅菌，時(shí)間為20分鐘。用玻 璃棒均勻涂布稀釋的菌液，劃線培養(yǎng)2天左右培養(yǎng)基表面形成60多個(gè)灰色、 中間凸起、圓形菌落，但此次的菌落直徑較實(shí)施例1的小。將所得到的單菌落挑到選擇性液體培養(yǎng)基Cr-G中培養(yǎng)。然后進(jìn)行的理化 特性研究發(fā)現(xiàn)菌株Cr-2能在20~45°C, pH為7~11， &0"207為0-1.6 g/L 范圍內(nèi)生長(zhǎng)繁殖，最適條件為35'C、 pH=10、 K2Cr207 0.6 g/L， 5天后，其中 Cr"的還原效率達(dá)78%。實(shí)施例3:分離還原Cr"的Oc/2raki"n/m平菌株Cr-3從富集培養(yǎng)到選擇性液體培養(yǎng)基Cr-G傳代，步驟同例l，但采集的樣品 為鉻渣堆邊緣約0.5米處，10cm深的土樣4.0 g，并且將選擇性液體培養(yǎng)基Cr-G 中的1^20"207調(diào)整為1.0g/L，培養(yǎng)基pH-9.0，其培養(yǎng)溫度為3(TC，傳代培養(yǎng) 3次，接種量為2mL (2%)，最后將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)液稀釋了 80倍，同 實(shí)施例1方式進(jìn)行固體培養(yǎng)基平板劃線分離，&2&207設(shè)定為0.5 g，瓊脂粉濃 度為1.1%，調(diào)pH-9.0，培養(yǎng)溫度設(shè)為37'C。將A和B部分分別在121 125 'C蒸汽滅菌，時(shí)間為20分鐘，劃線培養(yǎng)2 3天左右培養(yǎng)基表面形成幾十個(gè) 灰色，中間凸起的圓形單菌落。所得到的單菌落挑到選擇性液體培養(yǎng)基Cr-G中培養(yǎng)。然后進(jìn)行理化特性 研究發(fā)現(xiàn)菌株Cr-3能在20 45。C， pH為7 11， &20*207為0 1.6g/L范圍 內(nèi)生長(zhǎng)繁殖，最適條件為35。C、 pH=ll、 K2Cr207 0.6 g/L， 5天后，其中Cr6+ 的還原效率達(dá)85%。實(shí)施例4:分離還原Cr"的Oc/zrak^ram平菌株Cr-4從富集培養(yǎng)到選擇性液體培養(yǎng)基Cr-G傳代，步驟同例l，但采集的樣品 為鉻渣堆邊緣約0.5米處，10cm深的土樣4.0g，并且選擇性液體培養(yǎng)基Cr-G 中的K2Cr207為1.0 g/L，培養(yǎng)基pH-9.5，其培養(yǎng)溫度為30°C，傳代培養(yǎng)3 次，接種量為lmL(l。/c))，最后將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)液稀釋了40倍，同實(shí) 施例1方式進(jìn)行固體培養(yǎng)基平板劃線分離，K2Cr207設(shè)定為0.5 g，瓊脂粉濃 度為1.2%，調(diào)pH-9.5，培養(yǎng)溫度設(shè)為37'C。將A和B部分分別在121 125 t:蒸汽滅菌，時(shí)間為20分鐘，劃線培養(yǎng)2 3天左右培養(yǎng)基表面形成20多個(gè) 大小不一的灰色，中間凸起的，表面光滑，圓形單菌落，菌落直徑較大，最 大的可達(dá)2.5mm。將所得單菌落挑到選擇性液體培養(yǎng)基Cr-G中培養(yǎng)。然后進(jìn)行的理化特性 研究發(fā)現(xiàn)菌株Cr-4能在20 45。C， pH為7 11， &2&207為0~1.6 g/L范圍 內(nèi)生長(zhǎng)繁殖，最適條件為35。C、 pH=ll、 K2Cr207 0.8 g/L， 5天后，其中Cr6+ 的還原效率達(dá)75%。
權(quán)利要求
1.一種分離純化Cr6+還原的Ochrobactrum sp.菌的方法，其特征在于包括以下步驟(1)將采集的堿性含Cr6+廢棄樣品用有機(jī)LB培養(yǎng)基富集培養(yǎng)一代，然后用選擇性培養(yǎng)基Cr-G傳代培養(yǎng)；所述培養(yǎng)基Cr-G的組分為蛋白胨10.0g/L，酵母浸出粉5g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，K2HPO4 0.05g/L，K2Cr2O70.8～1.2g/L，調(diào)整培養(yǎng)基的pH為7.5～10，培養(yǎng)溫度為30～37℃；(2)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)物取適量稀釋20～100倍，在固體平板上劃線培養(yǎng)；所述的配方為A蛋白胨10.0g/L、酵母浸出粉5g/L、NaCl 5g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L和K2HPO4 0.05g/L溶于蒸餾水，再加入質(zhì)量百分比濃度為1.1～1.2％的瓊脂粉，搖勻；BK2Cr2O7 0.8～1.2g/L溶于蒸餾水；A和B分別滅菌，混合，調(diào)pH至7.5～10，培養(yǎng)溫度為30～37℃。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中的液體培養(yǎng)基 Cr-G和步驟(2)中的固體平板培養(yǎng)基中的K2Cr2O7的加入量分別為0.8g/L。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種分離純化Cr⁶⁺還原的Ochrobactrum sp.菌的方法，解決了目前微生物處理堿性含Cr⁶⁺廢水時(shí)微生物難以分離培養(yǎng)的問(wèn)題。將采集的堿性含Cr⁶⁺廢棄土壤樣品用有機(jī)LB培養(yǎng)基富集培養(yǎng)一代，將其傳代后用發(fā)明人改良的選擇性液體培養(yǎng)基Cr-G傳代培養(yǎng)；再用單層平板和改良的固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)。本發(fā)明能實(shí)現(xiàn)堿性環(huán)境中還原Cr⁶⁺的Ochrobactrum sp.細(xì)菌的分離純化，采用單層的固體培養(yǎng)基以及優(yōu)化的培養(yǎng)條件，培養(yǎng)成分簡(jiǎn)單，菌落形成率較高。
文檔編號(hào)C12N1/02GK101215522SQ200810030410
公開(kāi)日2008年7月9日 申請(qǐng)日期2008年1月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月2日
發(fā)明者超 何, 胡岳華, 賀治國(guó), 高鳳玲 申請(qǐng)人:中南大學(xué)